KR101378240B1

KR101378240B1 - 결핵 예방용 조성물

Info

Publication number: KR101378240B1
Application number: KR1020080016272A
Authority: KR
Inventors: 성영철; 곽정연; 조상래; 전보영; 안소신; 김광순
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2008-02-22
Filing date: 2008-02-22
Publication date: 2014-03-28
Anticipated expiration: 2028-02-22
Also published as: KR20090090802A

Abstract

본 발명은 분비 신호 서열을 코딩하는 핵산서열, Flt3L(fms-like tyrosine kinase 3 ligand)을 코딩하는 핵산서열, 및 마이코박테리움 투베르클로시스(Mycobacterium tuberculosis) Mtb32A 또는 Mtb32A의 활성부위 돌연변이체를 코딩하는 핵산서열을 가지는 핵산에 관한 것이다. 또한, 상기 핵산을 포함하는 결핵 예방용 약제학적 조성물을 제공하고, 보다 상세하게는 결핵을 예방하기 위한 백신 조성물을 제공한다.

tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis, Mtb32A, 돌연변이, mutant, DNA vaccine

Description

결핵 예방용 조성물{A pharmaceutical composition for preventing tuberculosis}

전세계 인구의 1/3(약 19억명)이 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)에 감염되어 있으며, 매년 약 800만명 내지 1,000만명의 새로운 환자가 발생하고 있고, 연간 약 300만명이 결핵으로 사망하는 것으로 추정되고 있다. 최근에는 AIDS 환자에게서 결핵의 발병률이 높은 것으로 나타나, AIDS 가 결핵의 새로운 유포원으로 알려지고 있어 그 심각성이 더해지고 있다. 선진국에서도 HIV 감염의 확산으로 결 핵환자가 확산되고 있는 추세이다. 결핵으로 인한 사망률은 90년대 이후 다시 증가하고 있으며, 이는 다약제내성 결핵균에 의한 감염 증가와 HIV 감염 확산으로 인한 결핵 빈도 증가가 주원인으로 판단되고 있다. 현재 전 세계적으로 약 5000 만명의 다약제내성 결핵(multi-drug resistant tuberculosis; MDR-TB) 환자가 있지만, 이에 대한 치료효율은 50% 정도 밖에 되지 않는다. 또한, 현재 전 세계적으로 약 600 만명의 HIV/TB 동시 감염환자가 있으며 대부분이 결핵환자로 이환되어 사망하는 것으로 추정되고 있다.

결핵균은 증식속도가 매우 느린 막대 모양의 간균으로 건조상태, 강산 또는 알칼리에도 잘 견디는 항산성균이다. 결핵의 감염경로는 결핵환자의 객담 방울 속에 섞여 나온 균이 공기 중에 떠다니다가 숨을 쉴 때 들여 마셔 폐 속에 들어가 감염되는 것이다. 대부분은 자연 치유되지만 감염자 중 5-10%는 결핵환자로 발전하여 과로, 영양부족, 당뇨병 등과 같은 합병증으로 몸의 면역력이 떨어졌을 때 발병하게 된다(Kochi et al., Lancet 1997, 350:142; Toossi and Ellner, Pathogenesis of tuberculosis. In: Friedman LN (ed). Tuberculosis: current concepts and treatment. CRC Press: New York, 2001, pp.19-47). 따라서, 결핵에 감염되지 않거나 결핵에 감염된 사람을 보호하는 예방용 및 치료용 백신을 개발하는 것은 매우 중요한 일이다.

BCG(bacillus Calmette-Gurin)는 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)라는 세균의 병독성을 약화시킨 약독화 생백신으로 전세계적으로 가장 많이 사용되고 있으며, 널리 퍼져 있는 결핵으로부터 어린이들을 보호하는데 효과적이다. 그러나 그 지속기간이 유년기까지로 한정되어 있으며, 성인에게는 치료 효능이 거의 없는 것으로 알려져 있다. 따라서, BCG의 단점을 극복할 수 있는 효과적이고 장기적으로 결핵을 예방할 수 있는 백신의 개발이 요구된다. 본 발명에서는 양성대조군의 하나로써 BCG를 사용하였다.

현재까지 새로운 예방용 결핵 백신으로 DNA 백신이 시도되어 왔고, 동물 모델에서 그 효능을 많이 증명하였다. 또한 많은 결핵 항원이 DNA 백신 기법을 이용해서 발굴되어 왔다. DNA 예방접종은 생쥐 및 인간에서 효과적인 항-마이코박테리아 면역성(anti-mycobacterial immunity)을 획득하는데 필수적이라고 알려진 CTL(cytotoxic T lymphocyte) 및 Th1 반응을 포함한 세포 면역 반응을 확립하는데 매우 효과적임이 증명되었다(Bonato VL et al., Infect Immun , 1998, 66: 169-175). 이렇듯 효율적인 면역화 기법의 도입에, 적합한 항원 선정의 중요성으로 인하여, 항원 발굴 또한 활발히 진행되어 왔다. 예를 들어, 항원 85A, 85B, 65 kDa 열충격단백질(heat shock protein) 또는 PstS-3을 발현하는 예방용 DNA 백신은 생쥐에서 M. 투베르클로시스의 성장을 제한하는데 효과적인 것으로 밝혀졌다(Denis O et al. Infect Immun 66: 1527-1533, 1998; Huygen K et al. Nat Med 1996; 2: 893-898; Lozes E et al. Vaccine 15: 830-833, 1997; Kamath AT et al. Infect Immun 67: 1702-1707, 1999; Tascon RE et al. Nat Med 2: 888-892, 1996; Lowrie DB et al. Vaccine 15: 834-838, 1997; Tanghe A et al. J Immunol 162: 1113-1119, 1999). 현재, 많은 동물 및 임상 모델에서 단일 항원으로 가장 그 효능을 안정적으로 인정받는 것은 Ag85A이다 (Philip O et al , Nature review microbiology. 2: 930-932, 2004). 따라서 본 발명에서는 단일 항원에 대한 양성 대조군으로 Ag85A를 사용하였다.

한편, 최근에는, 단일 항원으로 이용이 불가능하거나 효능을 보지 못하는 항원을 다른 항원과 융합하여 사용하는 경우가 있는데, 그 예로 Ag85B-ESAT6 융합 항원이 잘 알려져 있다 (Delphine Cendron et al , Eur . J. Immunol. 2007. 37: 549565). Mtb32A는 세린 단백질 분해효소(Serine protease)로서, Mtb32A 역시 항원 단백질 고유의 특성으로 인하여 단백질로 분리, 정제되기 힘들다는 이유로 지금까지 다른 항원과 결합된 형태로 이용되어 왔으며(Yasir A. W. Skeiky et al , INFECTION AND IMMUNITY , 67: 3998-4007, 1999), 그 예로 M72F (Mtb32A항원의 N 말단-Mtb39 항원-Mtb32A항원의 C 말단) 융합 항원이 잘 알려져 있다 (Yasir A. W. Skeiky et al , JI 172;7618-7628, 2004).

그러나 이러한 융합 항원은 단일 항원의 효용성이 떨어지는 것을 보충하거나(Ag85B-ESAT6), 단일 항원으로써 그 이용이 불가능할 경우에 대신하여 이용하는 것으로써(M72F의 Mtb32A) 차선책으로 선정된 것이다. 또한, 이러한 제한적인 항원의 이용은 언제나 부수적인 항원에 대한 검증을 같이 요구하므로 경제적이지 못하며, 단일 항원 자체에 의한 면역학적, 병리학적 연구 또한 효율적이지 못하다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 보다 효과적인 결핵 예방용 백신 조성물을 개발하고자 예의 노력한 결과, 유전자 개량기술을 이용해서 최초로 Mtb32A 단일 항원에 의한 결핵 면역원성 유도 및 방어효능을 입증하였다. 또한, 본 발명자들은 Mtb32A 효소 활성화에 요구되는 세 개의 아미노산을 치환함으로써 그 활성을 무력화시킨 돌연변이체가 단일 항원으로도 그 발현량이 안정적이며, 강한 면역원성을 유도하고, 또한 결핵균 동물모델에서 그 예방효과 역시 뛰어남을 증명하였다.

나아가, 본 발명자들은 항원의 강하고 지속적인 면역반응의 형성을 위하여 면역반응을 증가시킬 수 있는 항원 엔지니어링 기술을 도입하여 면역 세포간 상호 활성분자(costimulatory molecule)인 Flt3L(fms-like tyrosine kinase 3 ligand)를 Mtb32A 활성부위 돌연변이체에 융합하여 최적의 결핵 예방을 위한 면역 조성물을 제조하였고, 이를 쥐 모델에서 실험한 결과, Mtb32A 특이적 항체 반응 및 CTL 세포증식반응 등의 면역 반응이 증가하며 결핵의 예방 및 치료 활성이 예측하지 못한 수준으로 높은 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은, 분비 신호 서열을 코딩하는 핵산서열, 및 마이코박테리움 투베르클로시스(Mycobacterium tuberculosis ) Mtb32A 또는 Mtb32A의 활성부위 돌연변이체를 코딩하는 핵산서열을 가지는 핵산을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 분비 신호 서열을 코딩하는 핵산서열, Flt3L(fms-like tyrosine kinase 3 ligand)을 코딩하는 핵산서열, 및 마이코박테리움 투베르클로시스(Mycobacterium tuberculosis) Mtb32A 또는 Mtb32A의 활성부위 돌연변이체를 코딩하는 핵산서열을 가지는 핵산을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은, 상기 핵산을 포함하는 결핵 예방용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

항원으로 작용하는 마이코박테리움 투베르클로시스 Mtb32A 을 코딩하는 핵산 서열을 DNA 백신 등으로 사용할 때, 이의 효능을 증대시키기 위하여 본 발명자는 하기와 같은 특징을 가지는 핵산을 사용하였다.

즉, 하나의 양태로서, 본 발명은 (1) 분비 신호 서열을 코딩하는 핵산서열 및 (2) 상기 분비 신호 서열의 3'말단에 연결된 핵산서열로서, 마이코박테리움 투베르클로시스(Mycobacterium tuberculosis ) Mtb32A 또는 Mtb32A의 활성부위 돌연변 이체를 코딩하는 핵산서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산에 관한 것이다.

바람직하게는, 본 발명은 (1) 분비 신호 서열 (secretion signal sequence)을 코딩하는 핵산서열, (2) 상기 분비 신호 서열의 3' 말단에 연결된 핵산서열로서, Flt3L(fms-like tyrosine kinase 3 ligand)을 코딩하는 핵산서열, 및 (3) 상기 Flt3L 을 코딩하는 핵산서열의 3' 말단에 연결된 핵산서열로서, 마이코박테리움 투베르클로시스(Mycobacterium tuberculosis) Mtb32A 또는 Mtb32A의 활성부위 돌연변이체를 코딩하는 핵산서열을 가지는 핵산에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "Mtb32A" 는 마이코박테리움 투베르클로시스 내에 존재하는 32kD 의 세린 단백질 분해효소(serine protease)이다. Mtb32A 의 핵산서열 및 아미노산 서열은 Sanger ID: Rv0125 등 공공의 유전자 데이터베이스에 알려져 있고, 선행 문헌(예컨대, 미국특허출원 제60/158,585호; Skeiky et al., Infection and Immun. 67:3998-4007, 1999) 에 개시되어 있다.

본 발명에서 용어, "Mtb32A의 활성부위 돌연변이체" 는 Mtb32A 의 세린 단백질 분해효소로서의 활성부위를 돌연변이시킴으로서 세포내 독성 유발 가능성의 저지시킨 변이체이다. 구체적으로, 본 발명에서는 Mtb32A의 64번째 아미노산(Histidine)을 알라닌(Alanine)으로, 95번째 아미노산(Aspartate)을 아스파라긴(Asparagine)으로, 177번째 아미노산(Serine)을 알라닌(Alanine)으로 지령하는 코돈으로 치환시킨 돌연변이체를 사용하여, 이러한 돌연변이체가 세포내 독성 유발 가능성의 감소, 세포내 발현율 향상 및 높은 면역반응 유도, 그리고 높은 결핵 예 방효과를 유도함을 입증하였다 (도 1 내지 도 5).

본 발명에서, Mtb32A 또는 Mtb32A의 활성부위 돌연변이체는 마이코박테리움 투베르클로시스의 항원 단백질로 사용된다. 본 발명에서 용어, “항원”이란 면역 반응을 일으킬 수 있는 분자를 의미하고, 상기 항원을 사람을 포함한 동물에게 투여함으로써 면역 반응을 자극하게 된다.

본 발명에서 용어, "분비 신호 서열"은 Mtb32A 또는 Mtb32A의 활성부위 돌연변이체가 세포 밖으로 분비되도록 유도하는 분자로서, 분비 신호 서열을 코딩하는 핵산 서열은 특별히 한정되지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시에서는, tPa (tissue plasminogen activator)를 사용하였다. 상기의 분비 시그널 서열을 코딩하는 핵산서열은 유전자 코돈이 치환된 Mtb32A 또는 Mtb32A 활성부위 돌연변이체를 코딩하는 핵산서열의 상부(upstream)에 위치한다.

본 발명에서 용어, "Flt3L (fms-like tyrosine kinase 3 ligand)"는 면역 세포간 상호 활성분자(costimulatory molecule)로서, 면역반응에 관계하는 수지상 세포(dendritic cell)의 수를 증가시키는 역할을 한다. 본 발명에서는 Mtb32A 또는 Mtb32A의 활성부위 돌연변이체의 결핵 예방효과를 증진시키기 위하여 Flt3L을 융합시켜서 사용하였다. 상기의 Flt3L을 코딩하는 핵산서열은 Mtb32A 또는 Mtb32A 활성부위 변이체를 코딩하는 핵산서열의 상부(upstream)에 위치한다.

또한, 본 발명의 핵산을 구성하는, 분비 신호 서열, Flt3L 을 코딩하는 핵산서열, 및 Mtb32A 또는 Mtb32A의 활성부위 돌연변이체를 코딩하는 핵산서열은 포유 류, 예를 들어 인간 세포에서 발현 빈도가 높은 유전자 코돈으로 치환시킴으로써 세포내 발현 효율을 극대화시킬 수 있으며, 이를 "코돈 최적화"라 한다.

하나의 아미노산은 1 이상의 유전자 코돈에 의해 코딩되고 이를 특이적으로 인지하는 tRNA에 의해 번역된다. 그런데, 동일 아미노산을 코딩하는 유전자 코돈이라고 하더라도 세포 내에서 이를 인지하는 tRNA의 이용 빈도는 상당하게 차이가 난다. 예를 들어, Ala의 경우, GCC, GCT, GCA 및 GCG에 의해 코딩되나 이들 코돈이 인간 세포의 tRNA에 의해 인지되는 확률은 상당히 차이가 난다. 구체적으로, GCC 코돈이 이를 인지하는 tRNA에 의해 인식될 확률은 약 53% 이지만, GCT(17%), GCA(13%), GCG(17%) 코돈이 이를 인지하는 tRNA에 의해 인식될 확률은 매우 낮다. 따라서 본 발명의 핵산을 구성하는 핵산 서열의 유전자 코돈을 인간 세포에서 tRNA에 의해 높은 빈도로 인지되는 유전자 코돈으로 치환시킬 경우, 세포 내에서 핵산의 발현 정도는 월등히 증가될 수 있다.

따라서, 바람직하게 본 발명은 (1) 코돈 최적화된 분비 신호 서열을 코딩하는 핵산서열, (2) 코돈 최적화된 Flt3L을 코딩하는 핵산서열, 및 (3) 코돈 최적화된 마이코박테리움 투베르클로시스 Mtb32A 또는 Mtb32A의 활성부위 돌연변이체를 코딩하는 핵산서열을 가지는 핵산을 포함한다.

구체적으로, 본 발명에서 분비 신호 서열을 코딩하는 핵산서열은 코돈 최적화되어 사용될 수 있고, 바람직하게는 서열번호 1의 핵산서열을 가진다. 또한, Mtb32A 활성부위 돌연변이체을 코딩하는 핵산서열은 서열번호 2과 같이 코돈 최적화하여 사용되는 것이 바람직하다. 또한, Flt3L 을 코딩하는 핵산서열은 서열번호 3과 같이 코돈 최적화하여 사용되는 것이 바람직하다.

본 발명에서는 상기와 같이 코돈 최적화된 Mtb32A 또는 Mtb32A 활성부위 돌연변이체의 전체 아미노산 서열뿐만 아니라 항원으로서의 활성을 가지는 범위 내에서 이의 단편을 항원으로 사용할 수 있다.

또한, 상기 핵산은 인위적으로 합성 또는 유전적 재조합 방법을 통하여 제조할 수 있으며, 이를 발현할 수 있는 벡터에 작동적으로 연결시켜 제공된다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 핵산을 포함하는 결핵 예방용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서 용어, “예방”이란 상기 핵산을 포함하는 조성물의 투여로 결핵 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

바람직하게는, 본 발명에서 상기 핵산을 포함하는 결핵 예방용 약제학적 조성물은 발현 벡터의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명에서 “발현 벡터”란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 본 발명에서 용어, “작동가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질을 코딩하는 핵산서열이 작동가능하게 연결되어 코딩하는 핵산서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와 의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트를 포함한다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 핵산서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우, 복제가 개시되는 특정 핵산서열인 복제기원(replication origin)을 포함한다. 게놈 자체에 통합될 수 있는 벡터도 사용 가능하다.

본 발명의 조성물은 허용 가능한 약제학적 담체와 함께 적절한 제제로 제형화되어 다양한 경로로 투여된다. 투여 경로는 경구 투여, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 될 수 있다. 바람직하게는, 주사제로 제형화하여 정맥주사, 근육주사, 피하주사, 피내주사 등의 방법으로 투여하는 것이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스텔(예, 올레인산에칠 등), 알코 올류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트퓸, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약제학적 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 구체적 양태에서는, 주사제로 근육투여하였다.

본 발명의 조성물은 면역학적 유효량으로 투여한다. 용어 "면역학적 유효량"이란 결핵 예방효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 투여될 특정 면역원에 따라 달라지며, 예방접종 대상자의 연령, 체중, 건강, 성별 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 1회 내지 수회 투여가능하다.

본 발명의 조성물은 바람직하게는 백신 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 예방용 백신 조성물은 단독으로 투여 가능하지만 바람직하게는, 애쥬번트와 함께 투여한다.

애쥬번트는 면역세포의 초기 활성화 과정에서 비특이적으로 항원에 대한 면역 반응을 촉진하는 물질로, 숙주에게 면역원은 아니지만 면역계의 세포의 활성을 증대시킴으로써 면역을 강화하는 제제, 분자 등을 의미한다(Warren et al., 1986, Annu.Rev.Immunol,. 4:369). 본 발명의 조성물과 함께 투여되어 면역 반응을 증강 시킬 수 있는 애쥬번트는 임의의 다양한 애쥬번트를 포함하며, 전형적인 애쥬번트로는 프로인트 애쥬번트((Freund adjuvant), 알룸 화합물(aluminum compound), 무라밀 디펩타이드(muramyl dipeptide), 리포폴리싸카라이드(LPS), 모노포스포릴 리피드 A, 또는 쿠일 A 등이 알려져 있다. 본 발명에서는, 모노포스포릴 리피드 A를 애쥬번트로 사용하였다. 상기 애쥬번트는 백신 예방용 조성물과 동시에 투여되거나 시간 간격을 두고 순차적으로 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 INF-γ의 생성량과 결핵균 수에서의 감소에 탁월한 효과를 보이면서 예방 백신으로서 매우 우수한 효과를 나타내었다. 구체적으로, 본 발명에서는 tPa 분비 신호 서열과, Flt3L 을 코딩하는 핵산서열, 및 Mtb32A의 64, 95 및 177번째 아미노산이 치환된 Mtb32A 돌연변이체을 코딩하는 핵산서열이 작동 가능하게 연결된 발현벡터가 포함된 조성물로 생쥐를 면역화시키고 12주 후에 쥐의 폐 및 비장을 꺼내 항원 특이적 면역반응을 알아본 결과, 기존에 알려진 결핵 항원인 Ag85A와 Flt3L의 융합 펩타이드보다도 INF-γ의 생성량이 많아, 높은 항원 특이적 면역반응을 유도시키는데 효과적임을 입증하였다 (도 3). 또한, 상기 조성물로 생쥐를 면역화시키고 4주와 16주 후에 결핵균을 감염시킨 후 쥐의 폐와 비장에서의 결핵균 수를 비교한 결과, Ag85A와 Flt3L의 융합 펩타이드 또는 BCG 백신과 비교해 볼 때 가장 뚜렷한 균수의 감소를 나타내었다. 결핵 예방 백신은 접종의 목적이 단기적 예방이 아닌 장기적으로 지속적인 예방을 요하므로, 본 발명의 조성물은 결핵의 예방에 유용하게 사용될 수 있다 (도 4 및 도 5).

상기에서 기술한 바와 같이, 분비 신호 서열을 코딩하는 핵산서열, Flt3L을 코딩하는 핵산서열, 및 Mtb32A 또는 Mtb32A 활성부위 변이체를 코딩하는 핵산서열을 포함하는 핵산을 투여함으로써, Mycobacterium tuberculosis 감염에 의해 유발되는 질환인 결핵을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

실시예 1: pGX10/tMtb32Amut DNA의 구성

서열번호 1의 핵산서열을 가지는 코돈 최적화된 tPa 분비 신호 서열은 화학적으로 합성하였다. 말단에 KpnI(5')과 Eco47III-NheI(3') 사이트를 첨가하였다. 서열번호 2의 핵산서열을 가지는 코돈 최적화된 Mtb32Amut은 화학적으로 합성하였으며, 벡터에 삽입하기 용이하게 하기위해 말단에 NheI-EcoRV(5'), SpeI-AscI-XbaI(3') 사이트를 첨가하였다. Mtb32A의 세포내 독성 유발 가능성을 저지하기 위하여 Mtb32A의 64번째 아미노산(Histidine)을 알라닌(Alanine)으로, 95번째 아미노 산(Aspartate)을 아스파라긴(Asparagine)으로, 177번째 아미노산(Serine)을 알라닌(Alanine)으로 지령하는 코돈으로 바꾸었다. 서열번호 4의 핵산서열을 가지는 N-termina HA(hemagglutinin) tag는 화학적으로 합성하였다. 말단에 AscI(5')과 NotI-BstXI-XbaI(3') 사이트가 첨가되었다. Mtb32A의 발현확인을 용이하게 하기 위해 Mtb32A 항원 말단에 융합되었으며, 코돈은 두 번 반복되었다.

DNA 백신제조용 벡터인 pGX10 (특허번호 : 2003-0047667)을 KpnI과 NheI 효소 (enzyme)로 처리한 후 합성한 분비 신호 서열인 tPa을 리가아제 (ligase)로 연결하였다. 이를 다시 NheI 과 XbaI 효소로 자른 후 합성한 Mtb32A을 리가아제로 연결하였다. 이를 다시 AscI 과 XbaI 효소로 자른 후 합성한 HA tag를 리가아제로 연결하여 pGX10/tMtb32Amut를 제작하였다.

실시예 2: pGX10/tFMtb32Amut DNA의 구성

서열번호 3의 핵산서열을 가지는 코돈 최적화된 Flt3L는 화학적으로 합성하였다. 벡터에 삽입하기 용이하게 하기 위해 말단에 Eco47III(5') 및 NotI-EcoRV(3')사이트를 첨가하였다. 실시예 1에서 제조한 pGX10/tMtb32Amut를 Eco47III과 EcoRV 효소로 처리하여 F를 리가아제로 연결하여 pGX10/tFMtb32Amut를 제작하였다.

실시예 3: pGX10 / tMtb32Amut 및 pGX10 / tFMtb32Amut DNA 의 발현 확인

Mtb32Amut, FMtb32Amut 유전자가 단백질로 발현되는지 여부를 확인하기 위하 여, pGX10/tMtb32Amut 및 pGX10/tFMtb32Amut DNA 벡터를 COS7 세포에 일반적인 방법으로 트랜스펙션한 후 통상적인 방법에 따라 HA 태그를 이용하여 웨스턴 블랏팅을 수행하였다.

그 결과, Mtb32Amut 유전자가 포함되지 않은 빈 벡터(empty vector)인 pGX10 벡터를 형질도입한 세포에서는 Ag85A 단백질이 발현되지 않은 반면 Mtb32Amut 및 FMtb32Amut 유전자를 삽입한 pGX10/tMtb32Amut 및 pGX10/tFMtb32Amut 벡터를 형질도입한 세포에서는 HA tag에 의해서 예상되는 크기에 단백질의 밴드가 확인되었다.

본 발명을 통해서 기존에 알려진 Mtb32A의 특성과는 다르게 세린 단백질 분해효소의 활성 부위를 돌연변이시킴으로써 세포 내에서 그 발현률을 높일 수 있음이 확인할 수 있다. 따라서 높은 예방효과를 보이는 결핵 항원을 보다 손쉽게 활용가능한 형태로 구축하였으며, 이는 생산 비용의 절감 및 효소 독성에 의한 위험도 감소할 수 있으므로 결핵 예방에 유용하게 사용될 수 있다 (도 1).

실시예 4: pGX10 / tFMtb32Amut 의 면역반응 확인

pGX10/tFMtb32Amut의 면역화에 의한 결핵 예방효과를 확인하기 위해 5-6주령의 암컷 C57BL/6J 생쥐(SLC 사, Shijuoka, Japan)에 4주 간격으로 세 번에 걸쳐 50㎍씩 근육주사 (intra-muscular injection)후 전기 충격(Electroporation)을 가하였고 대조군으로 pGX10(mock) 및 pGX10/tFAg85A을 같은 투여량과 간격으로 근육 주사하였다. 또 하나의 대조군으로는 BCG를 두 번째 근육 주사 2주 후에 한차례 피하주사 (subcutaneous injection) 하였다 (도 2).

pGX10/tFMtb32Amut에 의해서 생성되는 항원 특이적 면역반응을 확인하기 위하여, 세포 내 싸이토카인 염색을 통한 FACS 분석을 수행하였다. 최초 근육주사한 날로부터 12주 후 쥐의 폐(lung) 및 비장(spleen)을 꺼내고 1X10⁶ cells을 재조합 Ag85A 단백질, 또는 Mtb32A CD8 T 세포 항원결정기(epitope)와 함께 넣고 96 well round bottm plate에서 37℃ 5% CO₂ 배양기(incubator)에서 배양하였다. 최초 배양 6시간 후, BFA(Brefeldin A, 10 /㎖; Sigma, Deisenhofen, Germany)를 첨가하였으며 12시간의 추가 배양 후 FACS 분석을 위하여 배양한 세포를 1×10⁷ cells/㎖의 농도로 FACS 버퍼(1% FCS, 0.02% sodium azide를 PBS에 용해)에 수확하였다. 먼저 세포 표면 인식 항체로 염색한 후, permeabilized 버퍼(FACS 버퍼에 saponin을 0.5% 로 용해)로 표면에 투과성을 높인 후 싸이토카인 인식 항체로 염색하였다. 염색이 완료된 후, 세포를 1% 포름알데히드로 고정하였다. 유세포 분석(Flow cytometry)은 CellQuest software 프로그램을 이용하여 FACScalibur BD (Biosciences, Mountain View, Calif.)에서 수행하였다. 각 면역화한 항원에 대응 하는 항원 결정기 (epitope) 또는 재조합 단백질을 이용하여 특이적 T 세포 면역반응을 세포내 사이토카인 염색(Intracellular cytokine staining)으로 측정한 결과, pGX10/tFMtb32Amut는 이미 잘 알려진 결핵 항원인 Ag85A와 그것의 Flt3L와의 융합 형태의 펩타이드를 발현하는 pGX10/tFAg85A와 마찬가지로 높은 항원 특이적 면역 반응을 유도하고 있으며, 이는 효소의 돌연변이화 및 Flt3L 융합을 통한 Mtb32A의 개량형태가 항원 특이적 면역반응을 유도시키는 데 효과적이라는 것은 보여주고 있 다. Mtb32A 항원 단독으로 발현 및 면역 반응을 유도한 사례는 본 발명에 의해서 최초이다 (도 3).

실시예 5: 결핵균 준비

잠복 감염 모델에 사용할 감염용 항원은 결핵균인 마이코박테리움 투베르클로시스(M. tuberculosis)를 이용하여 제조하였다. 구체적으로, M 투베르클로시스 H37Rv(ATCC 27294)를 사우톤 배지(Sauton medium) 위의 표면 균막(pellicles)으로 10일 동안 성장시켰고, 표면 균막을 수집하여 3 ㎜ 글래스 비드로 천천히 흔들어 파쇄하였다. 응집이 정착된 후 상층액을 수집하고, 분주액을 -70℃에 보관하였다. 상기 보관된 분주액을 용해시킨 후, 생존 생물체를 미들브룩(Middlebrook) 7H11 아가(Difco, Detroit, Mich.)에서 연속 희석 플레이팅으로 계산하였다. M. 투베르클로시스를 생쥐에 접종하기 위하여, 상기 과정으로 준비한 균주의 현탁액을 간단히 초음파 처리하고 PBS을 이용하여 250,000 pfu/㎖로 희석하였다.

실시예 6: pGX10 / tFMtb32Amut 의 결핵 예방효과 확인

pGX10/tFMtb32Amut에 의한 결핵 예방 효과는 면역화 후 결핵을 유발하는 결핵균을 생쥐에 에어로졸 감염시킴으로써 확인하였다.

본 발명자들은 결핵 예방효과를 확인하기 위해서 두 가지 모델이 사용되었는데 하나는 단기 예방 모델로써 마지막 면역화 4주 후 결핵균을 감염시켰으며, 또 하나는 장기 예방 모델로써 마지막 면역화 16주 후 결핵균을 감염시켰다. 구체적으 로, 면역화 된 생쥐 및 같은 주령의 대조군 생쥐를 공수 감염 기구의 흡입 챔버(Glas-Col, Terre Haute, Ind.)에 놓아둔 후 상기 실시예 <실시예 5>에서 준비한 M. 투베르클로시스 H37Rv 250,000 pfu/㎖로 10 ㎖을 60분 동안 노출시켰다. 상기와 같은 과정을 수행하면 공기를 통하여 인간 결핵균이 자연적으로 동물에게 전달된다.

결핵균이 생쥐에게 감염되었는지 확인하기 위해 결핵균의 노출 하루 뒤에 하기와 같은 방법으로 비면역화 된 대조군 생쥐의 M. 투베르클로시스를 계수하였다. 이산화탄소를 이용하여 생쥐를 안락사시킨 후, 0.05% Tween 90이 용해된 식염수에서 폐 및 비장을 균질화시켰다. 조직 현탁액을 10배 희석하여 각각의 희석액 100 ㎕를 M7H11 아가 플레이트(Difco, Detroit, Mich.)에 도말한 후 37℃에서 3-4주 동안 배양하였다. 각각의 플레이트에서 M. 투베르클로시스 콜로니를 계수한 후, 그 결과를 log₁₀ CFU(colony forming unit)/기관으로 나타내었다. 그 결과 약 200개의 M. 투베르클로시스가 폐로 전달되는 것을 확인하였다.

본 발명자들은 pGX10/tFMtb32Amut DNA 백신의 결핵 예방 효과를 박테리아 계수를 통해 알아보았다. 박테리아 계수는 각 모델에서 지정한 시기의 결핵균 감염 후 생쥐의 조직으로부터 결정하였다

그 결과, 결핵 항원이 없는 음성대조군(mock; pGX10)의 폐 및 비장에서 가장 높은 박테리아의 잔존량을 보였으며, 양성대조군(BCG, pGX10-tF-Ag85A)은 그보다 낮은 박테리아 잔존량을 보임으로써, 실험 조건의 타당성을 제공하였다. 특히, 현 재 사용중인 BCG에 의한 박테리아 잔존량이 통상의 양성 대조군의 기준선으로 받아들여진다. 실험군(pGX10/tFMtb32Amut)으로 면역화된 생쥐의 경우, 폐와 비장, 단기와 장기 모델 모두에서 같은 단독 결핵 항원으로 구성된 양성 대조군인 pGX10-tAg85A보다 높은 예방 효과를 보이는 것으로 확인 되었다. 특히 현재 상용중인 BCG와 비교하였을 때, 장기 모델에서는 폐와 비장에서 비슷한 수치의 예방 효과를 보이고 있음을 알 수 있다. 결핵 예방 백신은 접종의 목적이 단기적 예방이 아닌 장기적으로 지속적인 예방을 요하므로, 본 발명은 결핵의 예방에 유용하게 사용될 수 있다 (도 4 및 도 5).

약어는 다음과 같이 정의한다. "tPa"또는 "t" 는 조직 플라스미노겐 활성화인자(tissue plasminogen activator)의 분비 신호 서열(secretory signal sequence), "mut"는 활성부위의 돌연변이, "Co" 는 코돈 최적화된 핵산서열, "F"는 Flt3L 를 의미한다.

도 1은 도 1은 pGX10-tFMtb32mut 벡터를 COS7 세포에 형질 도입한 후의 FMtb32mut 단백질의 발현 여부를 웨스턴 블랏팅으로 분석한 전기영동 사진이다.

도 2는 결핵균 감염 생쥐 모델에 있어서 단기 예방모델(A) 및 장기 예방모델(B)에서 DNA 백신 처리시기 및 에어로졸 감염 후 박테리아 계수 시기를 나타낸 모식도이다.

도 3은 3차례의 DNA 백신 접종 후 4주째에 생쥐의 폐(A) 및 비장(B)에 존재하는 면역세포에 의한 각 항원 단백질 특이적 IFN-γ 생산 여부를 나타낸 그래프이다.

도 4는 결핵의 단기 예방 모델에서 DNA 백신을 투여하였을 때의 면역치료 효과를 박테리아 계수를 통해 나타낸 그래프이다 (A: 에어로졸 감염 후 4주째 생쥐의 폐, B: 에어로졸 감염 후 4주째 생쥐의 비장).

도 5는 결핵의 장기 예방 모델에서 DNA 백신을 투여하였을 때의 면역치료 효과를 박테리아 계수를 통해 나타낸 그래프이다 (A: 에어로졸 감염 후 4주째 생쥐의 폐, B: 에어로졸 감염 후 4주째 생쥐의 비장).

<110> POSTECH FOUNDATION <120> A pharmaceutical composition for preventing tuberculosis <130> PA080056/KR <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized signal sequence of tissue plasminogen activator <400> 1 ggtaccatgg acgccatgaa gcgcggcctg tgctgcgtgc tgctgctgtg cggcgccgtg 60 tttgtgagcc ccagcgctag c 81 <210> 2 <211> 1005 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized mycobacterium tuberculosis Mtb32Amut <400> 2 gctagcgata tcatggcccc tcccgccctg agccaggaca gatttgccga ctttcctgcc 60 ctgcccctgg accctagcgc cttggtggcc caggtgggac cccaggtggt gaacatcaac 120 accaagctgg gctacaacaa cgccgtgggc gctggcacag gcatcgtgat cgaccccaat 180 ggcgtggtgc tgaccaacaa cgccgtgatc gccggagcca cagacatcaa cgcctttagc 240 gtgggcagcg gccagaccta cggcgtggac gtggtgggct acgatagaac ccagaacgtg 300 gccgtgctgc agctgagagg cgctggcgga ctgcccagcg ccgccatcgg aggcggcgtg 360 gccgtgggcg agcccgtggt ggccttgggc aacagcggag gccagggcgg aacccctaga 420 gccgtgcctg gcagagtggt ggccctgggc cagaccgtgc aggccagcga cagcctgaca 480 ggcgccgagg agaccctgaa tggcctgatc cagtttgacg ctgccatcca gcctggcgat 540 gccggcggac ccgtggtgaa tggcctgggc caggtggtgg gcatgaacac agccgccagc 600 gacaactttc agctgagcca gggcggccag ggctttgcca tccccatcgg ccaggccttg 660 gccatcgccg gccagatcag aagcggcgga ggcagcccca ccgtgcacat cggccccaca 720 gcctttctgg gcctgggcgt ggtggacaac aacggcaacg gcgctagagt gcagagagtg 780 gtgggcagcg cccctgctgc cagcctgggc atcagcaccg gcgacgtgat cacagccgtg 840 gacggagccc ccatcaacag cgctaccgcc ttggccgatg ccctgaacgg ccatcaccct 900 ggcgacgtga tcagcgtgac ctggcagacc aagagcggcg gaacaagaac cggcaacgtg 960 accctggccg agggccctcc cgctactagt ggcgcgccat ctaga 1005 <210> 3 <211> 516 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized Flt3L <400> 3 agcgctatga ccgtgctggc ccccgcctgg agccccaaca gcagcctgct gctgctgctg 60 ctgctgctga gcccctgcct gaggggcacc cccgactgct acttcagcca tagccccatc 120 agcagcaact tcaaggtgaa gttcagggag ctgaccgacc atctgctgaa ggactacccc 180 gtgaccgtgg ccgtgaacct gcaggacgag aagcattgca aggccctgtg gagcctgttc 240 ctggcccaga ggtggatcga gcagctgaag accgtggccg gcagcaagat gcagaccctg 300 ctggaggacg tgaacaccga gatccatttc gtgaccagct gcaccttcca gcccctgccc 360 gagtgcctga ggttcgtgca gaccaacatc agccatctgc tgaaggacac ctgcacccag 420 ctgctggccc tgaagccctg catcggcaag gcctgccaga acttcagcag gtgcctggag 480 gtgcagtgcc agcccgacag cgcggccgca gatatc 516 <210> 4 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HAtag <400> 4 ggcgcgccct acccatacga tgttccagat tacgcttacc cctacgacgt gcccgactac 60 gcctaagcgg ccgccacgat cgtggtctag a 91

Claims

(1) 분비 신호 서열을 코딩하는 서열번호 1의 핵산서열 및 (2) 상기 분비 신호 서열의 3'말단에 연결된 Flt3L(fms-like tyrosine kinase 3 ligand)을 코딩하는 서열번호 3의 핵산서열, 및 (3) 상기 Flt3L의 3'말단에 연결된 마이코박테리움 투베르클로시스(Mycobacterium tuberculosis)의 Mtb32A의 활성부위 돌연변이체를 코딩하는 서열번호 2의 핵산서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산.
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제1항의 핵산을 포함하는 결핵 예방용 약제학적 조성물.
제10항에 있어서, 상기 핵산이 발현 벡터의 형태로 제공되는 것인 약제학적 조성물.
제11항에 있어서, 상기 발현 벡터는 바이러스, 플라스미드, 박테리오파아지 또는 코즈미드 유래의 발현 벡터인 약제학적 조성물.
제10항에 있어서, 상기 조성물이 백신의 형태인 것인 약제학적 조성물.