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KR101364374B1 - 생활성 ｆｕｓ1 펩티드 및 나노입자-폴리펩티드 복합체 - Google Patents

생활성 ｆｕｓ1 펩티드 및 나노입자-폴리펩티드 복합체 Download PDF

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KR101364374B1
KR101364374B1 KR1020077023123A KR20077023123A KR101364374B1 KR 101364374 B1 KR101364374 B1 KR 101364374B1 KR 1020077023123 A KR1020077023123 A KR 1020077023123A KR 20077023123 A KR20077023123 A KR 20077023123A KR 101364374 B1 KR101364374 B1 KR 101364374B1
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Abstract

나노입자-폴리펩티드 복합체는 나노입자에 연합된 생활성 폴리펩티드로 구성되는데, 이때 생활성 폴리펩티드는 단백질의 세포 취입을 실행하는 화학 모이어티를 추가하여 변형된다. 폴리펩티드는 단백질 또는 펩티드가 될 수 있다. 일부 구체예에서, 단백질 또는 펩티드의 아미노산 서열은 종양 억제물질 유전자 산물의 아미노산 서열에서 유도된다.

Description

생활성 ＦＵＳ1 펩티드 및 나노입자-폴리펩티드 복합체{Bioactive FUS1 peptides and nanoparticle-polypeptide complexes}
본 출원은 2005년 12월 22일자 출원된 미국 예비 출원 No. 60/753,632 및 2005년 3월 14일자로 제출된 미국 예비 출원 No. 60/661,680의 장점을 청구하며, 이들은 참고문헌으로 첨부한다. 정부는 NIH의 승인 번호 P50CA70907-07와 DOD의 승인번호 DAMD17002-1-0706에 따라 본 발명의 권리를 보유한다.
1. 발명의 분야
본 발명은 분자 생물학 및 암 치료법에 관계한다.
세포내에서 작용할 수 있는 단백질 및 펩티드의 치료요법적 용도에는 암 및 다른 질환 치료에 많은 전망을 가진다. 그러나, 세포내로 폴리펩티드를 효과적으로 도입시키는 것이 어렵다. 따라서, 세포내로 폴리펩티드를 도입시키는 새로운 방법이 필요하다.
암은 여러 인자에 의해 발생된다. 돌연변이는 세포 증식을 증가시키는 프로토-온코겐(proto-oncogenes)에서 발생될 수 있다. 돌연변이체는 정상 억제 물질에서 발생될 수 있는데, 종양 억제물질의 정상적인 기능은 세포 증식을 조절하는 것이다. DNA 복구 효소에서 돌연변이는 증식전에 세포가 손상을 복구하는 능력에 손 상을 준다.
종양 억제물질 유전자는 정상 유전자이나, 이것이 없는 경우(상실 또는 비활성화) 암으로 이어질 수 있다. 종양 억제물질 유전자는 세포 생장 및 분할을 느리게 하는 단백질을 인코드한다. 종양 억제물질 유전자의 야생형 대립형질( Wild-type alleles)는 비정상적인 세포 증식을 억제하는 단백질을 발현시킨다. 종양 억제물질 단백질을 인코드 하는 유전자가 돌연변이되거나 결손되면, 생성된 돌연변이된 단백질 또는 종양 억제물질 단백질 발현이 완전히 결손되면 세포 증식을 정확하게 조절하지 못하고, 특히 세포 조절 기전에 손상이 있는 경우에는 비정상적인 세포 증식이 발생된다. 사람 종양 및 종양 세포에 관한 많은 연구에서 손실된 또는 정상적인 기능을 하지 못하는 종양 억제물질 유전자를 가지는 것으로 나타났다. 종양 억제물질 유전자에는 망막모세포종(retinoblastoma) 민감성 유전자 또는 RB 유전자, p53 유전자, 결장 암종 유전자에 결손(DDC) 유전자, 신경섬유종증 타입 1(NF-1) 종양 억제물질 유전자(Weinberg, 1991)등이 포함되나 이에 국한되지는 않는다. 종양 억제물질 유전자의 기능 상실 또는 비활성화는 상당수의 인체 암의 개시 및 진행에 주요 역할을 할 수 있다.
현재, 많은 흔한 암 타입을 치료하는데 효과적인 선택사항이 많지 않다. 주어진 개체의 치류 과정은 진단, 질병 발생 단계, 나이, 성별, 환자의 전반적인 건강 상태에 따라 달라진다. 암 치료의 가장 흔한 방법은 외과수술, 방사선 요법 및 화학요법이다. 이들 방법 각각은 다양한 부장용이 수반되며, 효과 또한 다양하다. 따라서, 종양 억제물질 폴리펩티드에 근거한 요법을 포함하는 암 치료법을 지속적 으로 개발할 필요가 있다.
발명의 요약
한 측면에서, 본 발명은 나노입자-폴리펩티드 복합체를 제공하는데, 이 복합체는 생활성 폴리펩티드와 이에 연합된 나노입자로 구성되는데, 이때 생활성 폴리펩티드는 단백질의 세포 취입(uptake)를 실시할 수 있는 화학 모이어티(chemical moiety)를 추가하여 변형될 수 있다. 폴리펩티드는 단백질 또는 펩티드가 된다. 일부 구체예에서, 단백질 또는 펩티드의 아미노산 서열은 종양 억제물질 유전자 산물의 아미노산 서열에서 유도된다. 예를 들면, 종양 억제물질 단백질은 표 4에 나열된 종양 억제물질 유전자에서 유도될 수 있는데, CACNA2D2, PL6, 101F6, NPR1.2, BLU, RASSF1, FUS1, HYAL2, HYAL1을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 펩티드는 종양 억제물질 유전자 산물의 예상 기능 도메인 또는 이와 같은 도메인의 생물학적 활성 변이체로 구성될 수 있다. 예상 기능 도메인은 종양 억제물질 유전자 산물의 컴퓨터를 이용한 서열 분석에 의해 확인할 수 있으며, 이는 미리스로일화 부위 모티프(myristoylation site motif), PKA 카이나제 모티프, AKAP 결합 모티프, PDZ Class II 도메인 모티프와 같은 도메인이 될 수 있다.
나노입자는 지질계 나노입자, 초상자성(superparamagnetic) 나노입자, 나노쉘(nanoshell), 반도체 나노크리스탈(nanocrystal), 양자점(quantum dot), 폴리머계 나노입자, 실리콘계 나노입자, 실리카계 나노입자, 금속계 나노입자, 풀러렌(fullerene) 또는 나노튜브가 될 수 있다. 적절한 구체예에서, 나노입자는 지질계 나노입자 또는 초상자성 나노입자이다. 지질계 나노입자로는 리포좀 및 DOTAP:콜레스테롤 소포를 포함한다.
일부 구체예에서, 화학 모이어티(chemical moiety)는 지방산이다. 바람직하게는 지방산은 C4-C18지방산이다. 좀더 바람직하게는 지방산은 스테아레이트 또는 미리스테이트다. 다른 구체예에서, 화학 모이어티는 세포 침투성 펩티드, 예를 들면, HIV Tat, 허피스 바이러스 VP22, 드로소필라 안테나페디아 호모박스(Drosophila Antennapedia homeobox) 유전자 산물, 시그날 서열, 융합 서열 도는 프로테그린 (protegrin I)으로부터 유도된 것들이다.
나노입자-폴리펩티드 복합체는 나노입자와 연합된 제 2 생활성 폴리펩티드를 포함한다. 이들 두가지 폴리펩티드는 단백질이거나 둘다 펩티드이거나 또는 하나는 단백질이고, 하나는 펩티드이다. 특정 구체예에서, 제1, 제2 폴리펩티드는 생활성 펩티드이며, 각각은 상이한 종양 억제물질 유전자 산물에서 유도된 아미노산 서열로 구성된다. 나노입자-폴리펩티드 복합체에는 임의 단백질 및 폴리펩티드의 복합으로 세 개 또는 그이상의 생활성 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
또한, 일부 구체예에서, 초상자성 나노입자로 구성된 나노입자-폴리펩티드 복합체를 리포좀 또는 DOTAP:콜레스테롤 소포에 포집시킨다.
다른 측면에서, 본 발명은 항암 성질을 가지는 분리된 펩티드를 제공하는데, 이는 아미노산 서열 KLRRVHKNLIPQGIVKLDHPR (SEQ ID NO:1) 또는 이의 생물학적 활성 변이체로 구성된다.
분리된 펩티드는 길이가 바람직하게는 10 - 100개 아미노산 잔기이며, 좀더 바람직하게는 10 - 75개 잔기이며, 더욱 바람직하게는 10 50개 잔기이며, 더욱 적절하게는 10 - 25개 잔기이며, 10개인 것도 바람직하다. 임의 분리된 펩티드는 여기에서 설명하는 펩티드의 세포 취입을 실행하는 화학 모이어티를 추가시킴으로써 변형시킬 수 있다. 또한, 임의 분리된 펩티드를 여기에서 설명하는 것과 같이 임의 나노입자-폴리펩티드 복합체에 결합시킬 수 있다.
본 발명은 또한 약학 조성물을 제공한다. 약학 조성물은 약학적으로 수용가능한 희석제내에 여기에서 설명하는 임의 나노입자-폴리펩티드 복합체, KLRRVHKNLIPQGIVKLDHPR (SEQ ID NO:1)의 펩티드로 구성된다.
본 발명은 세포로 단백질을 운반하는 방법을 제공한다. 이 방법은 여기에서 설명하는 임의 나노입자-폴리펩티드 복합체를 준비하고, 세포가 생활성 폴리펩티드를 취입시킬 수 있는 조건하에 나노입자-폴리펩티드 복합체를 세포에 접촉시키는 단계로 구성된다. 특정 구체예에서, 세포는 사람 세포이다.
개체에서 종양을 치료하는 방법도 제공한다. 이 방법은 개체에 여기에서 설명하는 나노입자-폴리펩티드 복합체 또는 다음의 아미노산 서열로 된 펩티드 KLRRVHKNLIPQGIVKLDHPR (SEQ ID NO:1) 효과량을 투여하고, 이때, 나노입자 복합체의 폴리펩티드는 종양 억제물질 유전자 산물의 아미노산 서열에 근거한다. 치료는 화학요법제, 방사능 또는 제2 생활성 폴리펩티드를 개체에 투여하는 단계가 추가 포함된다.
본 발명은 나노입자-폴리펩티드 복합체를 만드는 방법도 제공한다. 특정 구 체예에서, 이 방법은 a) 생활성 폴리펩티드의 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 기능 도메인을 확인하고, b) 최소 하나의 기능 도메인으로 구성된 펩티드를 준비하고, c) 원하는 생물학적 활성을 가지는 펩티드를 선별하고, d) 펩티드에 나노입자를 연합시켜 나노입자-폴리펩티드 복합체를 만드는 단계로 구성된다. 특정 구체예에서, 기능 도메인은 종양 억제물질 유전자 산물의 아미노산 서열을 컴퓨터를 이용하여 분석함으로써 확인한다. 특정 구체예에서, 이 방법에는 펩티드의 세포 취입을 실행할 수 있는 화학 모이어티를 추가하여 펩티드를 변형시키는 것이 포함된다.
본 발명은 단백질 티로신 카이나제를 저해하는 방법을 제공한다. 이 방법은 아미노산 서열 KLRRVHKNLIPQGIVKLDHPR (SEQ ID NO:1)로 된 펩티드중 하나를 카이나제와 접촉시키는 것으로 구성된다. 특정 구체예에서, 카이나제는 EGFR, PDGFR, cKit, cAbl, Erk이다.
본 발명은 또한 종양 세포에서 세포사멸(apoptosis)을 유도하는 방법을 제공한다. 이 방법은 여기에서 설명하는 아미노산 서열 KLRRVHKNLIPQGIVKLDHPR (SEQ ID NO:1)에 기초한 펩티드 또는 나노입자-폴리펩티드 복합체를 세포에 접촉시키는 것으로 구성된다.
본 발명은 자기공명 영상을 위한 조성물을 제공한다. 조성물은 여기에서 설명하는 임의 나노입자-폴리펩티드 복합체로 구성되며, 이때 나노입자는 초상자성 나노입자이다.
본 발명의 한 측면은 나노입자-폴리펩티드 복합체를 제공하는데, 이 복합체는 생활성 폴리펩티드와 이에 연합된 나노입자로 구성되는데, 이때 생활성 폴리펩티드는 폴리펩티드의 세포 취입(uptake)를 실시할 수 있는 화학 모이어티(chemical moiety)를 추가하여 변형될 수 있다. 폴리펩티드는 펩티드가 된다. 펩티드의 아미노산 서열은 종양 억제물질 유전자 산물의 아미노산 서열에서 유도된다. 구체예에서, 종양 억제물질 단백질은 표 4에 나열된 종양 억제물질 유전자, 프로-세포사멸 유전자, 세포독성 유전자가 된다. 생활성 펩티드는 FUS-1 펩티드, Antennapedia 호모박스 유전자 (Antp) 펩티드, HIV Tat 펩티드, 허피스 바이러스 VP22 펩티드, 모델 양친매성(amphipathic) 펩티드, 트란스포르탄(transportan) 펩티드, SV 40 T 항원 펩티드, 또는 프로테그린 I 펩티드가 될 수 있다. 특정 구체예에서, 생활성 펩티드는 FUS-1 펩티드이다. FUS-1 펩티드는 SEQ ID NO:1으로 구성된다. 특정 구체예에서, FUS-1 펩티드는 SEQ ID NO:1이다. 생활성 펩티드는 KLALKLALKALKAALKLA (SEQ ID NO:2), RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO:3), GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO:4), MGLGLHLLVLAAALQGAWSQPKKKRKV (SEQ ID NO:5), GALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV (SEQ ID NO:6), GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO:7), RGGRLSYSRRRFSTSTGR (SEQ ID NO:8) 또는 RRLSYSRRRF (SEQ ID NO:9)으로 구성된다. 생활성 펩티드는 KLALKLALKALKAALKLA (SEQ ID NO:2)으로 구성된다.
펩티드는 종양 억제물질 유전자 산물의 아미노산 서열의 기능 도메인으로 구성될 수 있다. 펩티드는 종양 억제물질 유전자 산물의 아미노산 서열의 예상 기능 도메인으로 구성된다. 예상된 기능 도메인은 종양 억제물질 유전자 산물의 아미노산 서열을 컴퓨터를 이용하여 확인한다. 폴리펩티드는 단백질이 될 수 있다. 단 백질의 아미노산 서열은 종양 억제물질 유전자 산물의 아미노산 서열에서 유도될 수 있다. 종양 억제물질 유전자는 표 4에 나열된 유전자가 될 수 있다. 특정 구체예에서, 종양 억제물질 유전자는 FUS-1이다.
나노입자는 지질계 나노입자, 초상자성(superparamagnetic) 나노입자, 나노쉘(nanoshell), 반도체 나노크리스탈(nanocrystal), 양자점(quantum dot), 폴리머계 나노입자, 실리콘계 나노입자, 실리카계 나노입자, 금속계 나노입자, 풀러렌(fullerene) 또는 나노튜브가 될 수 있다. 나노입자는 지질계 나노입자이다. 지질계 나노입자로는 리포좀, 중성 리포좀, DOPC 리포좀 또는 DOTAP:콜레스테롤 소포를 포함한다. 리포좀은 DOPC 리포좀이 될 수 있다. 특정 구체예에서, 나노입자는 초상자성 나노입자이다. 특정 구체예에서, 나노입자는 초상자성 나노입자이고, 나노입자-폴리펩티드 복합체는 리포좀 또는 DOTAP:콜레스테롤 소포내에 있다. 리포좀은 DOPC 리포좀이다. 화학 모이어티(chemical moiety)는 지방산(C4-C18지방산, 스테아레이트 또는 미리스테이트)이다. 화학 모이어티는 세포 침투성 펩티드이다. 세포 침투성 펩티드는 HIV Tat, 허피스 바이러스 VP22, 드로소필라 안테나페디아 호모박스(Drosophila Antennapedia homeobox) 유전자 산물로부터 유도된 것들이다.
특정 구체예에서, 나노입자-폴리펩티드 복합체는 나노입자와 연합된 제 2 생활성 폴리펩티드를 포함한다. 제1, 제2 폴리펩티드는 생활성 펩티드이며, 각각은 상이한 종양 억제물질 유전자 산물에서 유도된 아미노산 서열로 구성된다. 나노입자-폴리펩티드 복합체에는 조직 또는 세포로 나노입자-폴리펩티드 복합체를 표적화 하는 표적화 모이어티로 구성될 수 있다.
또한, 일부 구체예에서, 초상자성 나노입자로 구성된 나노입자-폴리펩티드 복합체에 관계하는데, 이는 나노입자와 생활성 폴리펩티드가 연합된 것으로 구성되며, 이때 생활성 폴리펩티드는 스테아레이트 모이어티를 추가하여 변형시키고, 나노입자는 DOTAP:콜레스테롤 소포, DOPC 리포좀 또는 초상자성 나노입자가 된다.
다른 측면에서, 본 발명은 분리된 펩티드를 제공하는데, 이는 아미노산 서열 KLRRVHKNLIPQGIVKLDHPR (SEQ ID NO:1) 또는 이의 생물학적 활성 변이체로 구성된다. 펩티드는 길이가 바람직하게는 10 - 100개 아미노산 잔기, 10 - 75개 잔기, 10 50개 잔기 또는 10 - 25개 잔기이다. 펩티드는 여기에서 설명하는 펩티드의 세포 취입을 실행하는 화학 모이어티를 추가시킴으로써 변형시킬 수 있다. 화학 모이어티(chemical moiety)는 지방산(C4-C18지방산, 스테아레이트 또는 미리스테이트)이다. 화학 모이어티는 세포 침투성 펩티드이다. 세포 침투성 펩티드는 HIV Tat, 허피스 바이러스 VP22, 드로소필라 안테나페디아 호모박스(Drosophila Antennapedia homeobox) 유전자 산물로부터 유도된 것들이다.
본 발명의 한 측면은 본 발명의 생활성 펩티드 및 나노입자로 구성된 나노입자-폴리펩티드 복합체에 관계한다. 나노입자는 지질계 나노입자(예를 들면, 리포좀 또는 DOTAP:콜레스테롤 소포), 초상자성 나노입자, 나노쉘, 반도체 나노크리스탈, 양자점, 폴리머계 나노입자, 실리콘계 나노입자, 실리카계 나노입자, 금속계 나노입자, 풀러렌 또는 나노튜브가 될 수 있다. 특정 구체예에서, 나노입자는 초상자성 나노입자이며, 나노입자-폴리펩티드 복합체는 리포좀 또는 DOTAP:콜레스테롤 소포내에 있다.
일부 구체예에서, 초상자성 나노입자로 구성된 나노입자-폴리펩티드 복합체에 관계하는데, 이는 나노입자와 KLRRVHKNLIPQGIVKLDHPR (SEQ ID NO:1)의 아미노산 서열로 된 생활성 폴리펩티드가 연합된 것으로 구성되며, 이때 생활성 폴리펩티드는 스테아레이트 모이어티를 추가하여 변형시키고, 나노입자는 리포좀, DOTAP:콜레스테롤 소포, DOPC 리포좀 또는 초상자성 나노입자가 된다.
본 발명의 또 다른 측면은 약학적으로 수용가능한 희석제내에 본 발명의 펩티드 또는 나노입자-폴리펩티드 복합체로 구성된 약학 조성물을 개체로 투여하는 것으로 구성된 질병 치료 방법에 관계한다. 질병은 암(예를 들면, 폐암, NSCLC)이다. 본 발명은 개체로 화학요법제(가령, 이마니티브)를 투여하는 추가 단계를 포함한다. 이 방법은 방사능 또는 제2생활성 폴리펩티드를 개체로 투여하는 단계가 추가 포함된다.
본 발명은 세포로 폴리펩티드를 운반하는 방법을 제공한다. 이 방법은 여기에서 설명하는 임의 나노입자-폴리펩티드 복합체를 준비하고, 세포가 생활성 폴리펩티드를 취입시킬 수 있는 조건하에 나노입자-폴리펩티드 복합체를 세포에 접촉시키는 단계로 구성된다.
개체에서 종양을 치료하는 방법도 제공한다. 이 방법은 개체에 여기에서 설명하는 나노입자-폴리펩티드 복합체 또는 펩티드의 효과량을 투여하고, 이때, 나노입자 복합체의 폴리펩티드는 종양 억제물질 유전자 산물의 아미노산 서열에 근거한 다. 투여는 복막 주사가 될 수 있다. 종양은 위장 종양이 될 수 있다.
본 발명은 나노입자-폴리펩티드 복합체를 만드는 방법도 제공한다. 특정 구체예에서, 이 방법은 생활성 폴리펩티드의 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 기능 도메인을 확인하고, 최소 하나의 기능 도메인으로 구성된 펩티드를 준비하고, 원하는 생물학적 활성을 가지는 펩티드를 선별하고, 펩티드에 나노입자를 연합시켜 나노입자-폴리펩티드 복합체를 만드는 단계로 구성된다. 아미노산 서열을 컴퓨터를 이용하여 분석함으로써 확인한다. 컴퓨터를 이용한 구조 분석으로 가상 단백질 카이나제 상호작용 부위, 가상 미리스토일화 반응 부위, PDZ Class II 도메인 모티프, A 카이나제 고정(anchoring) 단백질(AKAP) 모티프를 확인할 수 있다. 이 방법에는 펩티드의 세포 취입을 실행할 수 있는 화학 모이어티를 추가하여 펩티드를 변형시키는 것이 포함된다. 기능 도메인은 종양 억제물질 유전자의 아미노산 서열의 예상 기능 도메인일 수도 있다.
발명의 또 다른 측면은 단백질 티로신 카이나제를 저해하는 방법에 관계하는데, 이 방법은 본 발명의 펩티드에 카이나제(예를 들면, EGFR, PDGFR, cKit, cAbl, 또는 Erk)를 접촉시키는 것으로 구성된다.
본 발명은 종양 세포에서 세포사멸을 유도하는 방법에 관계하는데, 이 방법은 본 발명의 펩티드를 종양 세포에 접촉시키는 것으로 구성된다.
본 발명은 종양 세포에서 세포사멸을 유도하는 방법에 관계하는데, 이 방법은 본 발명의 나노입자-폴리펩티드 복합체를 종양 세포에 접촉시키는 것으로 구성된다.
본 발명은 자기공명 영상을 위한 조성물에 관계하는데, 이 조성물은 본 발명의 나노입자-폴리펩티드 복합체로 구성되고, 이때 나노입자는 초상자성 나노입자이다.
여기에서 설명하는 임의 방법 및 조성물은 여기에서 설명하는 임의 다른 방법 또는 조성물로 실행될 수 있다.
여기 명세서에서 사용된 바와 같이, "a" 또는 "an"은 한 개 또는 그이상을 의미한다. 청구항에서 사용된 바와 같이, "포함하는(comprising)"과 같이 사용된 경우에,"a" 또는 "an"은 한 개 또는 그 이상을 의미할 수 있다. "또 다른(another)"이란 최소 2개 또는 그 이상을 의미한다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 장점은 다음의 설명에서 파악할 수 있을 것이다. 그러나, 본 발명의 적절한 구체예로 설명되는 특정 예는 설명을 목적으로 제공되는 것이며, 본 발명의 범위 또는 범주내에 다양한 변화 및 수정은 본 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백한 것임을 인지해야 한다.
다음의 도면들은 본 명세서의 일부이며, 본 발명의 특정 측면들을 추가 설명하기 위해 포함된 것이다. 본 발명은 여기에서 제시하는 특정 구체예와 이들 도면을 참고하면 더욱 이해가 용이할 것이다.
도 1: Fus1 단백질 구조의 분석 및 실시예에서 사용된 Fus1 펩티드의 리스트.
도 2: 다양한 펩티드의 소수성 상수.
도 3: Fus1 펩티드의 예상 극성.
도 4: SPIO 나노입자-펩티드 복합체의 구조적 다이아그램.
도 5: 펩티드-DOTAP:콜레스테롤 나노입자, 펩티드-SPIO-DOTAP:콜레스테롤 입자를 보여주는 다이아그램.
도 6: 세포 생장에서 Fus1 펩티드의 효과.
도 7: 세포에서 Fus1 펩티드의 IC50 값.
도 8: 세포 생장 및 세포사멸에서 Fus1 펩티드의 효과.
도 9: Fus1 펩티드 및 Gefitinib의 복합 치료 효과.
도 10: Gleevec-감응성 세포 및 Gleevec-저항상 세포에서 Fus1의 효과.
도 11: 세포에서 c-Abl 활성에서의 Fus1의 효과.
도 12: 펩티드 처리된 세포에서 c-Abl의 관련 활성.
도 13: Fus1 펩티드-나노입자 복합체에 의한 종양 세포 생장의 저해.
도 14: Fus1 펩티드-나노입자 복합체 처리에 의해 세포에서 세포사멸의 유도.
도 15: 상이한 세포주에서 티로신 포스포릴화반응.
도 16: Rat-1 SH2 세포를 STI(imatinib mesylate; STI-571 또는 Gleevec으로도 공지됨)로 처리한 결과.
도 17: Rat-1 SH2 세포를 스테아레이트화된 Fus1 펩티드와 반응시킨 결과.
도 18: 연질 한천에서 세포를 STI-571으로 처리한 결과.
도 19: 연질 한천에서 세포를 STI-571으로 처리한 결과.
도 20: Fus 1 펩티드에 의한 포스포릴화반응 저해.
도 21: Fus 1 펩티드에 의한 c-Abl 카이나제의 선형 저해.
도 22: DMSO 또는 스테아린 산에 의해서는 c-Abl 카이나제에 효과 없슴.
도 23: 비소세포 폐암종 세포(H1299 세포) 생장시에 Fus1 펩티드를 포함하는 DOPC 및 DOTAP계 리포좀의 48시간 효과.
FIGS . 24A-C. 스테아린 Fus1 펩티드에 의한 Ab1 티로신 카이나제의 농도에 따른 저해. 도 24A, 스테아린산 변형된 Fus1 펩티드의 시판되는 Abl 티로신 카이나제의 저해. 도 24B, 스테아린산 Fus1 펩티드에 의한 Abl 티로신 카이나제의 선형 저해. 도 24C, 스테아린산 변형안된 Fus1 펩티드는 Abl 티로신 카이나제 활성을 저해하지 않는다.
FIGS . 25A-C. FUS1 발현으로 c-Abl 티로신 카이나제 활성을 저해한다.
FIGS. 26A-C. 도 26A,1000 H1299 세포를 35% 연질 한천(0uM, 1 uM, 5 uM 이마니티브를 포함)에 도말한다. 세포를 각 농도의 이마니티브를 포함하는 배지를 이틀마다 한번씩 교체하면서 18일간 생장시킨다. 도 26B, 이마니티브에 의해 연질 한천에서 H1299 콜로니 형성이 약량에 따라 저해된다. 도 26C, 1000 H1299 세포를 35% 연질 한천(10uM 이마니티브를 포함)에 도말하거나 처리시키지 않는다. 세포를 각 농도의 이마니티브를 포함하는 배지를 이틀마다 한번씩 교체하면서 18일간 생장시킨다.
I. 나노입자-폴리펩티드 복합체
본 발명은 세포로 폴리펩티드를 운반하기 위한 조성물 및 그 방법을 제공한다. 조성물 및 방법은 임의 생활성 단백질 또는 펩티드에 일반적인 용도를 가지며, 다양한 타입의 질환을 치료하는 치료 물질을 제공한다. 특히, 본 발명은 세포내부로 폴리펩티드를 운반하기 위한 나노입자-폴리펩티드 복합체 및 이와 같은 복합체를 이용하는 방법에 관계한다. 이 복합체는 나노입자와 연합된 생활성 폴리펩티드로 구성된다. 여기에서, "연합(association)"은 물리적, 화학적 또는 이들 두가지 모두를 말한다. 예를 들면, 연합에는 공유 결합, 소수성 상호작용, 포집( encapsulation), 표면 흡착 또는 이와 유사한 것들이 관계한다.
세포 내부에서 활성인 단백질 및 펩티드는 치료 약물로써 실질적인 가치를 가진다. 효소 상실로 인한 대사성 질환에서, 중요한 효소 활성을 공급하는 단백질 또는 펩티드의 세포내 운반으로 질환을 치료할 수 있다. 종양 세포로 단백질 또는 펩티드 약물을 도입시켜 암 치료에 유익한 장점을 얻을 수 있는데, 예를 들면, 온코진을 저해, 세포사멸을 촉진, 맥관형성을 방해 또는 종양 억제물질 유전자 산물의 기능을 복원 또는 제공하는 단백질 및/또는 펩티드를 제공한다. 세포내로 폴리펩티드를 운반하기 위한 조성물 및 방법을 제공함으로써, 본 발명은 다양한 질환 치료용 치료요법제를 제공한다.
본 발명은 단백질 활성의 부적절한 발현 또는 단백질 기능 또는 활성의 상실과 연관된 질환 또는 질병 치료용 효과적인 치료제를 제공한다. 예를 들면, 대사성 질환은 대사에 유전적 결함을 가지는 1000가지 이상의 유전 질환으로 구성된다. 대사는 신체의 필수 성분의 형성(동화작용) 또는 필수 신체 성분의 분해(이화작용)와 관계한다. 대사 경로의 각 단계는 효소에 의해 조절된다. 유전적 결함으로 효소 활성이 감소 또는 상실된다. 대사성 질환은 질병의 정도가 다양하고 예측하기 힘들지만 신체의 임의 기관 또는 세포에 질병을 유발할 수 있다. 일부 결함은 문제가 적지만, 다른 결함은 심각한 질환 및 사망에 이를 수 있다. 본 발명은 필요한 효소 활성을 병이든 세포로 공급하는 나노입자-폴리펩티드 복합체 형태의 치료요법제를 제공할 수 있으며, 따라서 질병 상태가 감소 또는 제거된다.
또는, 단백질 활성의 부적절한 발현과 관련된 질환에서, 단백질 활성의 저해물질을 이용하면 실질적인 이익을 제공할 수 있다. 예를 들면, 많은 실병 상태가 단백질 카이나제 중개된 사건에 의해 촉발되는 비정상적인 세포 반응과 연합된다. 이들 질환에는 자가면역 질환, 염증성 질환, 신경 및 신경퇴행성 질환, 암, 심혈관 질환, 알레르기 질환 및 천식, Alzheimer 질환, 호르몬 관련 질환이 포함된다. 효소 활성을 차단하는 단백질 카이나제 저해물질 또는 단백질 카이나제의 세포내 국소화 저해는 이와 같은 질환 치료에 가치있는 치료제로 예상된다. 또한, 단백질 카이나제의 촉매 활성을 저해하는 펩티드(Hvalby et al ., 1994) 및 단백질 카이나제 (Colledge and Scott, 1999)의 세포하 표적화 저해 펩티드를 확인하였다. 본 발명은 이들 물질 및 단백질 카이나제 저해 폴리펩티드를 세포로 운반하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 다양한 질병을 치료하는 일반적인 방법을 제공한다.
폴리펩티드는 일반적으로 세포 막을 통과하는데 어려움이 있다. 단백질 및 펩티드는 일반적으로 하전을 띄는 그리고 띄지 않는 아미노산 잔기를 가진다. 전하를 띄는 잔기는 막결합을 방해하여 세포로 통과하는 것을 방해한다. 본 발명은 이와 같은 곤란한 난제를 해결하기 위해 예를 들면, 화학 모이어티를 생활성 폴리펩티드에 부착시켜 세포 취입을 실행시킴으로써 가능하게 하였다. 본 발명의 특정 구체예에서, 세포 취입을 촉진시키는 펩티드에 생활성 폴리펩티드를 융합시킴으로써 이를 실행하였다.
예를 들면, 세포-침투 펩티드(또는 "단백질 형질도입(transduction) 도메인")를 Drosophila Antennapedia 호모박스 유전자(Antp)의 세 번째 나선, HIV Tat, 허피스 바이러스 VP22에서 확인하였고, 이들 각각은 아르기닌, 리신 잔기가 풍부한 양전하를 띈 도메인을 가지고 있다(Schwarze et al., 2000; Schwarze et al ., 1999). 또한, 시그날 서열에서 유도한 소수성 펩티드도 세포-침투 펩티드로 확인되었다. (Rojas et al ., 1996; Rojas et al ., 1998; Du et al ., 1998). 이와 같은 펩티드를 갈락토시다제와 같은 표식 단백질에 결합시키면 마커 단백질의 효과적인 내화(internalization) 능력을 부여하고, 이들 펩티드를 포함하는 키메라, 인-프레임 융합 단백질을 이용하면 in vitro 및 in vivo 에서 다양한 세포 유형으로 단백질을 운반할 수 있다 (Drin et al ., 2002). 본 발명에 따른 생활성 폴리펩티드에 이들 세포 침투 펩티드를 융합시키면 폴리펩티드의 세포 취입이 강화될 수 있다.
다른 구체예에서, 세포 취입은 폴리펩티드에 스테아레이트 또는 미리스틸레이트와 같은 지질을 부착시켜 실행할 수 있다. 리피데이션(Lipidation)에 의해 펩티드가 세포로 통과하는 것이 강화되었다(REF). 지질 모이어티 부착으로 세포에 의해 본 발명의 폴리펩티드 취입이 증사된다. 세포 취입에 대해서는 하기에서 더 논의할 것이다.
생활성 폴리펩티드의 취입이 강화됨으로써, 본 발명은 치료에 필요한 단백질 또는 펩티드의 양을 줄일 수 있다. 이는 치료 비용을 상당히 절감시키고 치료제의 공급을 증가시킬 수 있다. 약량을 낮추면 펩티드의 면역원성을 최소화시키고, 독성 부작용도 제한시킬 수 있다. 이와 같이 본 발명의 조성물 및 방법으로 치료상의 장점을 제공한다.
본 발명에 따르면, 생활성 폴리펩티드가 나노입자와 복합되어 나노입자-폴리펩티드 복합체를 형성한다. 일부 구체예에서, 나노입자는 리포좀 또는 지질계 소포와 같은 다른 지질계 나노입자가 될 수 있다(예를 들면, DOTAP:콜레스테롤 소포). 암 치료에 이용되는 경우, 리포좀은 종양 부위에 리포좀 농도를 강화시키기 위해 암 신형성 맥관 구조에 구멍내기(fenestration)가 증가되는 장점을 취할 수 있다. 다른 구체예에서, 나노입자는 이산화철로 된 초상자성 나노입자이다. 직경이 10 내지 100nm 범위의 초상자성 나노입자는 비장에 의해 격리되는 것을 피할 수 있을 정도의 직경이며 간에 의해 제거되는 피할 정도의 충분한 크기이다. 이 크기의 입자는 매우 작은 모세관을 침투할 수 있고 신체 조직에 효과적으로 분포할 수 있다. 초상자성 나노입자-폴리펩티드 복합체를 MRI 조영제로 이용하여 생활성 펩티드를 취입하는 세포를 확인 추적할 수 있다. 특정 구체예에서, 나노입자는 반도체 나노크리스탈 또는 반도체 양자점이 되며, 이들 모두 광학 영상에도 이용할 수 있다. 추가 구체예에서, 나노입자는 나노쉘이며, 이는 실리카 코어위에 골드 층으로 구성된다. 나노쉘의 한 가지 장점은 표준 화학에 의해 골드 층에 폴리펩티드가 콘쥬게이트될 수 있다는 것이다. 다른 구체예에서, 나노입자는 풀로렌 또는 나노튜브 (Gupta et al ., 2005)이다.
펩티드는 신장에 의해 순환계로부터 신속하게 제거되며 혈청의 프로테아제에의한 분해에 민감하다. 생활성 펩티드를 나노입자와 융합시키면 본 발명의 나노입자-폴리펩티드 복합체는 분해로부터 보호되며 및 신장에 의한 제거도 감소될 수 있다. 이는 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증가시키고 효과적인 치료에 필요한 폴리펩티드의 양을 감소시킨다. 다시, 이로써 치료 비용을 줄이고, 면역학적 문제점을 최소화하며, 요법의 독성 반응도 최소화된다.
본 발명에 따르면, 나노입자-폴리펩티드 복합체를 특정 조직 및 세포로 표적화시킬 수 있다. 나노입자에 세포 표적화 모이어티를 콘쥬게이션시키면 가능하다. 표적화 모이어티에는 단백질, 펩티드, 지질, 스테로이드, 슈가, 탄수화물 또는 합성 화합물이 포함되나 이에 국한되지는 않는다. 세포 표적화 모이어티 예를 들면 리간드는 세포 표면상에 같은 기원(cognate)의 수용체를 인지하여 이에 결합한다. 유사하게, 항체는 세포 표면상에 이들의 동기원 항원을 인지함으로써 세포 표적화 모이어티로 작용할 수 있다. 표적화된 나노입자-폴리펩티드 복합체를 제공함으로써, 본 발명은 질병 치료 특이성을 증가시키고, 표적화 세포로 들어가는 치료제의 양을 증가시킬 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드와 나노입자의 연합으로 폴리펩티드의 표적화 수송 효율을 높이고, 폴리펩티드의 강력한 세포 취입, 처리된 세포의 감응성있는 영상, 약량 감소 및 치료 비용 감소, 면역학적 문제점 최소화 및 요법의 독성 효과를 최소화시킬 수 있다. 본 발명의 나노입자-폴리펩티드 복합체는 다양한 질병의 효과적인 그리고 효율적인 치료를 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
암의 경우에, 본 발명은 암 치료용 조성물 및 방법을 제공한다.
유전적 이상에 의해 하나 또는 그이상의 유전자의 과다발현 또는 비정상 또는 돌연변이 유전자의 발현이 일어나고 다양한 암의 원인이 된다는 것은 확인된 바이다. 예를 들면, 많은 경우에, 온코진의 발현으로 암이 발생되는 것으로 알려져 있다. "온코진(Oncogenes)"은 유전적으로 변형된 유전자로, 이의 돌연변이된 산물이 정상적인 세포 기능 또는 제어를 방해한다(Spandidos et al ., 1989). 현재까지 연구된 대부분의 온코진은 정상 세포 유전자의 코딩 부분의 돌연변이체의 결과로 활성화되는 것으로 밝혀졌는데, 예를 들면, 발현된 단백질 산물에서 아미노산 서열 치환에 의해 프로토-온코진("proto-oncogene")이 되는 것이다. 이와 같은 변경된 발현 산물은 신형성 과정에 참여하는 비정상적인 기능을 발휘한다. (Travali et al ., 1990). ras, myc, neu, raf, erb, src, fms, jun, abl을 포함하는 다수의 온코진이 현재까지 확인되었으며, 다양한 정도로 특징화되었다(Travali et al ., 1990).
세포 온코진의 ras 유전자 패밀리는 작은 GTP-결합 단백질을 인코드한다. ras 유전자는 많은 다양한 인간 종양에서 돌연변이된 것으로 밝혀졌다. ras 단백질(Ras)은 raf 유전자에 의해 인코드되는 세린/트레오닌 단백질 카이나제를 통한 생장, 분화 및 작용을 유도하는 자극 유도에 관계되는 세포내 시그날 경로에서 중추 성분이다. myc는 전사 인자를 인코드하는 세포 온코겐으로, 전사 인자 Max와 DNA-결합 이형 올리고머를 형성한다. Src 및 fms은 abl과 같이 티로신 단백질 카이나제이다. 온코겐 활성을 차단 또는 간섭하는 단백질 및 펩티드는 항암제로 작용하며 본 발명에서 구체예로 들고 있다.
상기에서 언급된 바와 같이, 종양 억제물질 유전자는 정상 유전자로써 이것이 없을 경우(상실 또는 비활성화) 암을 유도할 수 있다. 종양 억제물질 유전자는 세포 생장 및 분화를 지연시키는 단백질을 인코드할 수 있다. 이의 상실로 세포 생장이 조절불가능하고 암도 조절불가능하게 된다. 따라서, 종양 억제물질 유전자 산물과 반응하거나 또는 종양 억제물질 유전자 산물과 연관된 활성을 공급하는 단백질 및 펩티드는 항암 요법제로 이용할 수 있을 것이다. 종양 억제물질 유전자 단백질 및 펩티드를 본 발명에서 이용하고 이에 포함된다.
세포사멸을 자극하는 단백질 또는 펩티드는 항암제로 작용할 수 있다. 세포사멸은는 예정된 세포 사멸이다. 세포사멸은 정상적인 배발생, 성인 조직에서 생체항상성(homeostasis) 유지 및 발암현상 억제에 필수 과정이다(Kerr et al., 1972). 암세포에서 세포사멸을 자극하는 폴리펩티드는 항암 활성을 제공하며, 본 발명의 일부가 된다.
맥관형성은 종양 진행에 필수적이다(Folkman and Shing, 1992; Fidler and Ellis, 1994; Folkman, 1995; Hanahan and Folkman, 1996) 맥관형성은 기존 혈관으로부터 새로운 모세관이 형성되는 것이다. 1-2mm 직경의 종양이 확산에 의해 모든 영양분을 공급받을 수 있지만, 추가 생장은 맥관형성을 통하여 적절한 혈액 공급이 이루어지느냐에 따라 달라진다. 따라서, 맥관형성 저해물질이 항암제로 작용할 수 있다. 맥관형성 저해물질로 작용하는 폴리펩티드는 본 발명에 포함된다.
특정 구체예에서, 본 발명은 암 치료용 펩티드 및 나노입자-폴리펩티드 복합체를 제공한다. 항암 펩티드는 경험적으로 또는 이론적 방법으로 확인될 수 있다. 항암 펩티드를 경험적으로 확인하는 예는 종양 억제물질 유전자 p53이나 이에 국한시키지는 않는다. p53 유전자는 전사 인자를 인코드한다. 활성을 파괴하는 p53 유전자에 돌연변이 발생으로 암이 된다. p53 전사 인자의 카르복시 말단의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드는 특정 p53 돌연변이체와 반응하고 세포 생장 제어를 하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, p53 카르복시-말단 펩티드와 함께 형성된 나노입자-폴리펩티드 복합체는 특정 p53 종양 치료를 위한 항암제를 제공한다.
항암 펩티드는 복합 펩티드 라이브러리를 스크리닝함으로써 실험적으로 확인될 수도 있다. 비-제한적인 실시예로써, 온코겐 단백질의 활성을 저해하는 단백질에 대해 복합 화학(combinatorial chemistry)에 근거한 펩티드-파아지 라이브러리 또는 펩티드 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 다른 항암 펩티드도 실험적으로 확인된 세포사멸 펩티드, 예를 들면, 펩티드 KLAKLAKKLAKLAK (SEQ ID NO:10) 및 다른 세포사멸성 펩티드(Ellerby et al., 1999)에 기초할 수 있다. 나노입자-폴리펩티드 복합체내에 신규한 또는 기존의 확인된 항암 펩티드는 암 치료를 위해 본 발명에 일반적인 용도를 나타낸다.
또는, 잠재적인 항-암 펩티드는 예상된 기능 도메인에 대해 종양 억제물질 유전자 산물의 아미노산 서열을 분석함으로써 확인할 수 있다. 당분야에 공지된 적절한 방법을 이용하여 예상된 기능적 도메인을 포함하는 펩티드를 항암 활성에 대해 검사할 수 있다. 이와 같은 방법의 예들이 실시예에 설명되어 있다. 발명자들은 FUS1 유전자 산물의 아미노산 서열 분석을 하고, 예측된 "카이나제 고정 단백질" (AKAP) 모티프로 확인하였다. 이와 같은 기능적 모티프를 포함하는 펩티드는 다양한 티로신 카이나제를 저해하는 능력 및 foci 형성을 차단하는 능력에 대해 테스트를 받았다. 양성 활성은 이 단백질을 항암제로 만들었다. 본 발명에 따르면, 나노입자-Fus1 펩티드 복합체는 암 치료용 치료요법제로 제공된다.
이 실시예에서 설명하는 것과 같이, 본 발명은 종양 억제물질 유전자 산물의 기능 도메인에 근거한 항암 펩티드 및 단백질을 확인하는 방법을 제공한다. 이 방법은 치료제로 이용하기 위해 항암 폴리펩티드 및 나노입자-폴리펩티드 복합체를 신속하게 수득할 수 있는 강력한 방법이다.
일단 항암 단백질 또는 펩티드가 확인되면, 단백질 또는 펩티드의 아미노산 서열에 근거하여 다양한 폴리펩티드 변이체를 만들 수 있다. 이들 폴리펩티드 및 이들의 변이체를 본 발명에서 이용할 수 있으며, 본 발명에 포함된다.
본 발명은 세포로 생활성 폴리펩티드를 운반하는데 이용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 암 치료용 방법 및 조성물을 제공한다. 암은 다음의 타입이 될 수 있다: 흑색종, 비소세포(non-small cell) 폐, 소세포 폐(small-cell lung), 간암종, 망막아세포종, 성상세포종, 교아종, 점성, 혀, 백혈병, 신경아세포종, 머리, 목, 유방, 췌장, 전립선, 뼈, 고환, 난소, 중피종, 경부, 위장, 임파, 뇌, 결정 또는 방광. 특정 구체예에서, 암은 상피 암세포와 연관된다. 특정 구체예에서, 암은 폐암이다.
A. 폴리펩티드
여기에서 사용된 바와 같이, "폴리펩티드"는 단백질 또는 펩티드이다. 펩티드는 3 내지 100개 아미노산을 가진다. 단백질은 100개 이상의 아미노산을 가진다.
특정 구체예에서, 폴리펩티드 분자의 크기는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 가지나 이에 국한되지는 않는다.
특정 구체예에서, 본 발명의 생활성 폴리펩티드는 3 내지 2500개, 좀더 바람직하게는 3 내지 1000개, 더욱 바람직하게는 3 내지 500개, 좀더 바람직하게는 5 내지 250개, 좀더 바람직하게는 7 내지 250개, 좀더 바람직하게는 10 내지 100개, 더욱 바람직하게는 10 내지 50개, 더욱 바람직하게는 10 내지 40개, 가장 바람직하게는 10 내지 35개 아미노산로 구성된다.
여기에서 사용된 바와 같이, "아미노 분자"는 당업자에 공지된 바와 같이 임의 아미노산, 아미노산 유도체 또는 아미노산 모방체를 말한다. 특정 구체예에서, 폴리펩티드 잔기는 아미노산 서열의 임의 비-아미노 분자의 간섭없이 연속될 수 있다. 다른 구체예에서, 서열은 한 개 또는 그 이상의 비-아미노 분자 모이어티로 구성될 수 있다. 특정 구체예에서, 폴리펩티드의 서열 잔기는 하나 또는 그이상의 비-아미노 분자 모이어티에 의해 중단될 수 있다.
따라서, ‘폴리펩티드"는 자연적으로 합성된 단백질내에 20개 아미노산 서열중 최소 하나를 포함하는 아미노산 분자 서열을 포함하거나 하기 표1에서 나타난 것을 포함하나 이에 국한되지 않는 적어도 한 개 변형된 또는 흔하지 않는 아미노산을 포함하는 아미노산 분자 서열로 구성될 수 있다.
TABLE 1
변형된 그리고 특이( Unusual ) 아미노산
Abbr. Amino Acid Abbr. Amino Acid
Aad 2acid EtAsn N
Baad 3Aminoadipic acid Hyl Hydroxylysine
Bala alanine, Aminoacid AHyl allo
Abu 2acid 3Hyp 3
4Abu 4Aminobutyric acid, piperidinic acid 4Hyp 4
Acp 6acid Ide Isodesmosine
Ahe 2acid AIle allo
Aib 2acid MeGly Nsarcosine
Baib 3acid MeIle Nhylisoleucine
Apm 2acid MeLys 6
Dbu 2,4acid MeVal N
Des Desmosine Nva Norvaline
Dpm 2,2'acid Nle Norleucine
Dpr 2,3acid Orn Ornithine
EtGly N
특정 구체예에서, 나노입자-폴리펩티드 복합체는 생체적합성(biocompatible) 폴리펩티드이다. 여기에서 사용된 바와 같이, "생체적합성"은 여기에서 설명하는 방법 및 양에 준하여 주어진 유기체에 제공 또는 투여되었을 때 부적절한 부작용이 거의 없거나 심각하지 않는 물질을 말한다. 이와 같은 부적절한 또는 바람직하기 않은 부작용은 심각한 독성 또는 면역학적 부작용이다. 적절한 구체예에서, 생체적합성 폴리펩티드 또는 나노입자-폴리펩티드 복합체는 일반적으로 포유류 단백질 또는 펩티드 또는 합성 단백질 또는 펩티드인데, 이들 각각에는 독소, 병인물질 또는 유해한 면역원이 없다.
단백질 및 펩티드는 당분야에 공지된 임의 다른 기술에 의해 만들 수 있는데, 표준 분자 생물학적 기술을 통하여 단백질 및 펩티드의 발현, 자연 소스로부터 단백질 및 펩티드의 분리 또는 단백질 및 펩티드의 화학적 합성을 통하여 만들 수 있다. 다양한 유전자의 뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열이 이미 공개되어 있고, 당분야에 공지된 컴퓨터화된 데이터베이스에서 찾을 수도 있다. 이와 같은 데이터베이스중에 하나가 National Center for Biotechnology Information's Genbank and GenPept databases(www.ncbi.nlm.nih.gov)이다. 이들 공지 유전자의 코딩 부분을 여기에서 공지된 기술을 이용하여 또는 당분야에 공지된 증폭시키거나 발현시킨다. 또는, 다양한 시판되는 단백질 및 펩티드 조제물도 당분야에 공지되어 있다.
특정 구체예에서, 폴리펩티드는 분리되거나 정제될 수 있다. 일반적으로, "분리되거나" 또는 "정제된"은 다양한 다른 폴리펩티드를 제거하기 위해 분별법(fractionation)에 의해 처리된 특정 폴리펩티드 조성물로써, 특정 또는 원하는 단백질 또는 펩티드에 대해 당분야에 공지된 단백질 검사를 통하여 검사한 경우에 이 조성물은 실질적인 활성을 유지하고 있다.
특정 구체예에서, 폴리펩티드 또는 나노입자-폴리펩티드 복합체의 효과량을 이용하여 개체에서 종양을 치료한다. 치료요법적 효과량은 활성 성분이 투여되는 조건에서 투여 직후 또는 일정 시간 경과후에 개선 또는 변화를 이끌 수 있는 양을 말한다. 공지된 바와 같이, 이 양은 치료될 상태의 유형, 특정 활성 성분, 상태의 심각성, 환자의 특징과 같이 다양한 인자에 따라 달라진다.
1. 변이체
"폴리펩티드", "단백질" 및 "펩티드"에는 단백질 또는 펩티드의 아미노산 서열 변이체도 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체는 치환, 삽입 또는 결손이 될 수 있다. 결손 변이체는 막통과 서열이 없은 인테그랄 막 단백질 변이체로 예를 드는 것과 같이 기능 또는 면역원성 활성에 필수적이지 않은 고유 단백질의 한 개 또는 그이상의 잔기가 부족하다. 다른 타입의 결손 변이체는 세포의 특정 부분에 결합하기 위해 단백질을 향하는 분비성 시그날 서열 또는 시그날 서열이 부족한 것이다. 삽입성 돌연변이는 일반적으로 폴리펩티드에 비-말단 부위에 물질이 추가되는 것과 관련된다. 여기에는 면역반응성 에피토프 삽입 또는 단순히 단일 잔기 삽입이 포함된다. 융합 단백질이라고도 불리는 말단 추가는 하기에서 논의하겠다.
치환 변이체에는 일반적으로 폴리펩티드내에 한 개 또는 그 이상의 부위에서 한 개 아미노산이 다른 아미노산으로 교환되는 것이 포함되고, 이는 다른 기능 또는 성질의 상실없이 단백질 분해성 절단에 대항하는 안정성과 같이 폴리펩티드의 한가지 또는 그이상의 성질을 조절하도록 고안될 수 있다. 이와 같은 종류의 치환은 보존성으로써 한 개 아미노산이 유사한 모양 및 전하를 가지는 다른 것으로 교체된다. 보존성 치환은 당분야에 공지된 것으로 예를 들면, 다음과 같은 교환이 포함된다: 알라닌이 세린으로; 아르기닌이 리신으로; 아스파라진이 글루타민 또는 히스티딘으로; 아스파라테이트가 글루타메이트로; 시스테인이 세린으로; 글루타민이 아스파라진으로; 글루타메이트가 아스파라테이트로; 글리신이 프롤린으로; 히스티딘이 아스파라진 또는 글루타민으로; 이소루이신이 루이신 또는 발린으로; 루이신이 발린 또는 이소루이신으로; 리신이 아르기닌으로; 메티오닌이 루이신 또는 이소루이신으로; 페닐알라닌이 티로신, 루이신 또는 메티오닌으로; 세린이 트레오닌으로; 트레오닌이 세린으로; 트립토판이 티로신으로; 티로신이 트립토판 또는 페닐알라닌으로; 그리고 발린이 이소루이신 또는 루이신으로 교환된다.
"생물학적 기능 등가체"는 당업자에 공지된 것으로 추가 정의한다. 생활성 폴리펩티드의 아미노산 서열과 동일한 또는 약 70% 내지 약 80% 사이, 좀더 적절하게는 약 81% 내지 약 90% 사이, 좀더 적절하게는 약 91% 내지 약 99% 사이의 기능적으로 등가의 아미노산의 서열은 폴리펩티드의 생물학적 활성이 유지된다는 조건하에 본 발명의 범위내에 있다.
"기능적으로 등가의 코돈"은 아르기닌 또는 세린의 경우 6개 코돈과 같이 동일한 아미노산을 인코드하는 코돈을 말하고, 생물학적으로 등가의 아미노산을 인코드하는 코돈을 말한다(표 2, 하기).
Figure 112007072522751-pct00001
아미노산 서열에는 추가 N- 또는 C-말단 아미노산과 같은 추가 잔기가 포함될 수 있고, 이들은 여기에서 제시된 서열과 같이, 생물학적 활성을 유지하는 것을 포함하는 상기에서 제시한 기준에 부합한다면 필수적인 것이 될 수도 있다.
다음은 등가의 또는 개선된 2세대 분자를 만들기 위해 단백질의 아미노산을 교환하는 것을 논의한다. 예를 들면, 항체의 항원 결합 부분 또는 기질 분자상의 결합 부분과 같은 구조와 상호작용 결합 능력의 손실없이 단백질 구조에서 특정 아미노산은 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 단백질의 상호작용 능력 및 특징은 단백질의 생물학적 기능 활성을 정의하기 때문에, 특정 아미노산 치환은 단백질 서열내에서 만들어질 수 있지만 유사한 성질을 가지는 단백질이 생성된다. 생물학적 유용성 또는 활성의 손실없이 여기에서 설명하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 다양한 변화가 일어날 수 있으며 이 또한 발명자들이 고려한 것이다. 표 2에서는 특정 아미노산 서열을 인코드하는 코돈을 나타낸다.
이와 같은 변화를 만드는데 있어서, 아미노산의 수치요법 지수(hydropathic index)를 고려할 수 있다. 단백질상에 상호작용성 생물학적 기능을 부여함에 있어서 수치요법 아미노산 지수의 중요성은 당분야에서 일반적으로 인지된다(Kyte & Doolittle, 1982). 아미노산의 상대적 수치요법 특징은 생성 단백질의 2차 구조에 기여하여, 단백질과 다른 분자 예를 들면, 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 및 기타 다른 분자와 상호작용을 특징짓는다는 것이다.
또한 유사 아미노산 치환은 친수성(hydrophilicity)에 근거하여 효과적으로 만들 수 있다는 것도 인지할 것이다. 미국 특허 4,554,101에서 인접 아미노산 서열의 친수성에 의해 지배를 받는 단백질의 최대 국소 평균 친수성은 단백질의 생물학적 성질과 관련있다. U.S. 특허 4,554,101에서 상세하게 설명되는 것과 같이, 아미노산 잔기에 다음의 친수성 수치가 할당된다: 아르기닌(+3.0); 리신(+3.0); 아스파라테이트(+3.0 ± 1); 글루타메이트 (+3.0 ± 1); 세린 (+0.3); 아스파라진 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글리신 (0); 트레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ± 1); 알라닌 (0.5); 히스티딘( *-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신 (-1.8); 이소루이신 (-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4).
아미노산은 유사한 친수성 값을 가지는 다른 아미노산으로 치환될 수 있으며, 생물학적 등가 및 면역학적 등가 폴리펩티드를 생산할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 이와 같은 변화에서, 친수성 수치가 ±2이내의 아미노산 치환이 바람직하지만, ±1 이내의 것들이 특별히 바람직하고, ±0.5이내의 아미노산 치환이 더욱 바람직하다.
상기에서 제시한 바와 같이, 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환체의 상대적 유사성에 근거하는데, 예를 들면, 소수성, 친수성, 전하, 크기 및 이와 유사한 것에 근거한다. 다양한 상기 특징을 고려한 예시적인 치환체는 당분야에 공지된 것으로 다음을 포함한다: 아르기닌과 리신; 글루타메이트와 아스파르테이트; 세린과 트레오닌; 글루타민과 아스파라진; 발린, 루이신 및 이소루이신.
본 발명에 따른 폴리펩티드를 준비하는 다른 구체예는 펩티드 모방체(Mimetic)를 이용하는 것이다. 모방체는 단백질 2차 구조의 요소를 모방하는 펩티드를 포함하는 분자이다(Johnson et al ., 1993). 펩티드 모방체의 이용에 대해 숨어있는 이론적 근거는 단백질의 펩티드 기본 구조가 분자 상호작용 예를 들면 항체와 항원과 같은 작용을 실행하는 방식으로 아미노산 체인이 위치하도록 존재한다는 것이다. 펩티드 모방체는 고유 분자와 유사한 분자 상호작용을 허용하는 것으로 기대된다. 이와 같은 원리를 상기 제시한 원리와 함께 이용하면 여기에서 설명하는 많은 자연적 성질을 가지면서 변형된 또는 개선된 성질을 가지는 제2세대 분자를 만들 수 있다.
다른 구체예에서, 펩티드는 생물학적 단백질에서 주로 발현되는 L-아미노산 보다는 D-아미노산을 포함한다. D-아미노산은 펩티드의 화학적 합성동안에 치환될 수 있다. 또한 역(reverse)-D 펩티드도 고려할 굿 있다. 역(Reverse)-D 펩티드는 동일한 3차 형태를 유지하여 L-아미노산 펩티드와 같이 동일한 활성을 가지지만 in vitro 및 in vivo,에서 효소 분해에 대해 더욱 안정적이어서, 고유 펩티드보다 치료 효과가 더 크다(Brady and Dodson, 1994; Jameson et al ., 1994).
감지를 위해, 당분야에 공지된 바와 같이, 단백질 및 펩티드에 형광물질, 화학적 발광 물질 또는 다른 유형의 테그 또는 라벨을 콘쥬게이트시킬 수 있다.
2. 융합 단백질
삽입용 변이체의 특별한 종류가 융합 단백질이다. 이 분자는 일반적으로 제2 폴리펩티드의 전부 또는 일부에 N- 또는 C-말단에 연결된 고유 분자의 전부 또는 일부를 가진다. 예를 들면, 융합은 다른 종으로부터 리더 서열을 이용하여 이형성 숙주에서 단백질의 재조합 발현을 허용할 수 있다. 또 다른 유용한 융합에는 항체 에피토프와 같은 면역학적 활성 도메인을 추가하여 융합 단백질의 정제를 실행할 수 있다. 융합 부위에서 또는 그 주변에 절단 부위를 포함시키면 정제후에 외생성 (extraneous) 폴리펩티드를 제거할 수 있을 것이다. 다른 유용한 융합에는 가수분해효소와 같은 효소로부터 활성 부위, 글리코실화 도메인, 세포 표적화 시그날 또는 막통과 부분과 같은 기능적 도메인을 연결하는 것이 포함된다. 특히 적절한 융합은 세포에 의한 폴리펩티드의 취입을 촉진시키기 위해 세포-침투성 펩티드를 연결시키는 것과 관련된다.
예를 들면, HIV Tat 폴리펩티드의 펩티드, Drosophila Antennapedia 호모박스 유전자의 세 번째 나선(Antp), 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌, 또는 허피스 바이러스 VP22 폴리펩티드를 이용하여 융합 단백질을 만들 수 있다. 이들 단백질에는 아르기닌 및 리신 잔기가 풍부한 양전하를 띈 도메인과 시그날 서열에서 유도된 소수성 펩티드를 포함하는데, 융합 서열은 세포-침투성 펩티드로 확인되었다. 이들 펩티드를 이용하여 in vitro 및 in vivo에서 광범위한 세포 유형에 단백질을 운반한다. 본 발명에서 이들 펩티드를 이용하여 생활성 단백질 및 펩티드의 세포 취입을 촉진할 수 있다.
3. 폴리펩티드 정제
여기에서 설명하는 폴리펩티드를 정제 또는 분리시키는 것이 바람직할 수 있다. 단백질 정제 기술은 당업자에 공지되어 있다. 이들 기술은 한 레벨에서 세포 중간(milieu)을 폴리펩티드 및 비-폴리펩티드 분취물로 분별하는 것과 연관된다. 다른 단백질 및 펩티드로부터 폴리펩티드를 분리시키면, 소요의 폴리펩티드는 크로마토그래피 및 전기영동 기술을 이용하여 추가로 부분적인 또는 완벽한 정제(또는 균질성 정제)를 할 수 있다. 순수 펩티드를 준비하는데 적합한 분석 방법은 이온-교환 크로마토그래피, 압출 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 등전점 포커스 등이 있다. 펩티드를 정제하는데 특히 효과적인 방법은 신속한 단백질 액체 크로마토그래피 및 HPLC이다.
"실질적으로 정제된" 또는 "실질적으로 분리된"이란 용어를 이용할 때, 이와 같은 명칭은 조성물에서 단백질 또는 펩티드가 주요 성분을 이룬다는 것으로, 약50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 또는 그이상의 단백질이 조성물에 포함된다는 것을 의미한다.
4. 세포 취입 실행
일부 구체예에서, 폴리펩티드의 세포 취입을 할 수 있는 화학 모이어티를 추가하여 폴리펩티드를 변형시킬 수 있다. 세포 취입을 강화하는 모이어티의 예로는 소수성 기(예를 들면 지질 또는 지방산), 세포-침투 펩티드(U.S. Patent 6,610,657; Drin, et al ., 2002), 그리고 특정 금속 킬레이트 등이 포함되나 이에 국한되지는 않는다.
일반적으로 지방산은 산성 모이어티(카르복실산)이 사슬의 단부에 있는 탄소 사슬로 구성된 분자이다. 탄소 사슬은 임의 길이의 지방산이 될 수 있으나, 탄소 사슬의 길이는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그이상의 탄소수를 가지거나 이 범위내에 있을 수 있다. 특정 구체예에서, 탄소 사슬의 수는 4 내지 18개 탄소원자로 지방산의 사슬 부분에 있다. 특정 구체예에서, 지방산 탄소 사슬은 홀수 탄소 원자로 구성되나 특정 구체예에서 짝수의 탄소 원자가 적절할 수도 있다. 탄소 사슬에서 한 개 결합만으로 된 지방산을 포화 지방산이라고 하고, 사슬내에 최소 한 개의 이중 결합을 가지는 지방산을 불포화 지방산이라고 한다. 본 발명의 구체예에서 지방산은 분지쇄를 가질 수도 있고 다른 구체예에서는 분지쇄를 가지지 않을 수도 있다. 특정 지방산에는 리놀레산(linoleic acid), 올레산(oleic acid), 팔미트산(palmitic acid), 리놀렌산(linolenic acid), 스테아르산(stearic acid), 라우린산(lauric acid), 미리스티산(myristic acid), 아라키돈산(arachidic acid), 팔미토레산(palmitoleic acid), 아라키도닌산(arachidonic acid)이 있으나 이에 국한시키지는 않는다.
상기에서 설명한 바와 같이, 다양한 세포-침투성 펩티드가 확인되었다. 표 3에서는 이들 펩티드 및 아미노산 서열의 일부를 제공한다. 특정 구체예에서, 세포-침투는 다중 양성 전하를 가지고 크기는 10-27개 아미노산 잔기를 가진다. 이들 펩티드의 일부를 본 발명에서 이용할 수 있을 것이다.
펩티드 이름 서열
MAP (model 양친매성 펩티드) KLALKLALKALKAALKLA (SEQ ID NO:2)
pAntp 43-58 (또는 페네트라틴(penetratin)) RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO:3)
Transportan GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO:4)
SBP (SV40 T 항원의 펩티드에 기초한 시그날 서열) MGLGLHLLVLAAALQGAWSQPKKKRKV (SEQ ID NO:5)
FSB (SV40 T 항원의 펩티드에 기초한 융합서열) GALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV (SEQ ID NO:6)
Tat (HIV Tat 펩티드) GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO:7)
SynB1 (Protegrin I로부터) RGGRLSYSRRRFSTSTGR (SEQ ID NO:8)
SynB3 (Protegrin I로부터) RRLSYSRRRF (SEQ ID NO:9)
특정 구체예에서, 융합 단백질은 폴리펩티드의 생활성 성질(예를 들면 치료)을 담당하는 부분 및 단백질의 세포 취입을 개선시키는 부분을 모두 포함하도록 만들 수 있다. 예를 들면, 특정 구체예에서, 융합 단백질은 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 단백질의 일부 또는 전부를 포함한다.
B. 나노입자
여기에서 사용된 바와 같이, "나노입자"는 1-1,000 nm 범위의 직경을 가지는 일부 물질을 말한다. 일부 구체예에서, 나노입자는 2-200nm 범위의 직경, 적절하게는 2-150nm 범위의 직경, 좀더 적절하게는 2-100nm 범위의 직경을 가진다. 본 발명에 이용된 나노입자는 지질계 나노입자, 초상자성 나노입자, 나노쉘, 반도체 나노크리스탈, 양자점, 폴리머계 나노입자, 실리콘계 나노입자, 실리카계 나노입자, 금속계 나노입자, 풀러렌 또는 나노튜브가 될 수 있다(Ferrari, 2005). 폴리펩티드를 나노입자에 결합시키면 표적 운반, 방출 조절, 세포 취입 강화, 세포내 트래피킹(trafficking), in vitro 및 in vivo 에서 치료 단백질의 분자 영상 등의 잠재적 분야에 이용할 수 있는 구조를 제공한다. (West, 2004; Stayton et al ., 2000; Ballou et al ., 2004; Frangioni, 2003; Dubertret et al., 2002; Michalet et al ., 2005; Dwarakanath et al ., 2004.
1. 초상자성 이산화철 (" SPIO ") 나노입자
초상자성 이산화철 ("SPIO") 나노입자를 자기공명영상 ("MRI") 조영 강화, 조직 손상, 면역검사, 세포 분리 및 약물 운반에 실험적으로 이용하였다(Gupta, 2004; Sestier et al ., 1998; Wilhelm et al., 2003).
본 발명에 이용되는 SPIO 나노입자는 당분야에 공지된 방법에 의해 준비 및 보관할 수 있다(Gupta et al ., 2005). 시판되는 SPIO 나노입자를 이용할 수도 있다. 폴리펩티드 부착을 위해, SPIO 나노입자에 폴리에틸렌 글리콜 또는 덱스트란과 같은 폴리머 물질을 피복시킬 수 있고, 아미드 또는 에스테르 결합을 통하여 폴리머 표면에 폴리펩티드을 결합시킬 수 있다. 다양한 화학적 과정을 이용하여 폴리펩티드를 부착시키는데, 예를 들면, 카르보디이미드 화학물질, 디이소시아네이트 링커, 숙시니미딜 에스테르를 포함한다. 폴리펩티드를 부착하는데 이용되는 링커에는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 하이드로클로라이드, N-숙시니미딜 3-(2 피리딜디티오)프로피오네이트, N-하이드록시숙시니미드, N,N’메틸렌 비스 아크릴아미드(Lewin et al ., 2000; Roberts et al., 2002)를 포함한다.
예를 들면, SPIO 나노입자-펩티드 복합체는 이형이가기능기 링커를 이용한 두단계 과정을 통하여 펩티드를 나노입자에 콘쥬게이트 시켜 만들 수 있다. 우선, 시판되는 덱스트란 피복된 SPIO 입자("Feridex I.V" 또는 "Combidex", Advanced 자기s Inc., Cambridge, MA 제조, 또는 "Endorem", Guerbet, Aulnaysous-Bois, France)는 에피클로로하이드린(epichlorohydrin)과 교차연결시키고, 암모니아와 반응시켜 덱스트란 코팅에 아미노산기를 만들어서 유도할 수 있다. 그 다음 나노입자를 SMCC으로 변형시켜 말레이미드 모이어티를 만든다(SPIO-SMCC). 둘째, 펩티드-하이드라존 유도체는 TCEP에 의해 디설파이드 환원후에 수득되는 펩티드 유도체의 티올기와 SPIO-SMCC의 말레이미드 기를 반응시켜 SPIOSMCC에 콘쥬게이트시킨다. 생성된 펩티드-SPIO 콘쥬게이션 비율은 UV가시광선 스펙트로포토미터를 이용하여 결정하고, G-25 겔 여과 컬럼으로 크기 압출 크로마토그래피를 이용하여 추가 정제한다. 정제된 콘쥬게이트는 농축시키고, 추가 사용할 때 까지 20℃에서 보관한다. 약물 유도체도 유사한 화학물질로 SPIO에 콘쥬게이트시킨다. SPIO의 형광 라벨링을 위해 상기 SPIO 덱스트란 유도체의 1차 아민에 DTPA 이소티오시아네이트 킬레이트(I-24221, Molecular Probes)와 결합시켜 다양한 금속이온에 대한 고친화성 결합 부위를 도입시키고, Fluo-3 potassium(Orange-red)(F-3715, Molecular Probes)으로 라벨시킨다. 형광 라벨된 FP-SPIO 나노입자를 이용하여 공촛점 형광 영상 또는 FACS 분석을 통하여 세포 취입, 세포내 트라피킹, in vitro 및 in vivo 생체 분포를 모니터한다.
폴리펩티드의 카르복시-말단에 리신 또는 시스테인을 추가하여 변형시킴으로써 SPIO 나노입자에 콘쥬게이트을 위한 자유 1차 아민 또는 티올 기능기를 제공한다. 유사하게, 변형된 폴리펩티드는 나노쉘, 양자점, 풀러렌 및 나노튜브와 같은 다른 나노입자에 콘쥬게이트될 수 있다.
예를 들면, 자동 합성기에서 표준 Fmoc 펩티드 합성 화학을 이용하여 합성하는 동안에 펩티드에 리신 잔기를 추가할 수 있다. 시스테인 잔기를 동일한 방법으로 추가할 수 있다. 재조합 방법에 의해 준비된 폴리펩티드의 경우에, 리신 또는 시스테인을 폴리펩티드를 인코드하는 DNA 서열에 추가할 수 있으며, 생성된 폴리펩티드는 재조합 발현 시스템에서 발현될 수 있다.
2. 지질계 나노입자
지질계 나노입자에는 리포좀, 지질 준비물 및 지질계 소포(예를 들면, DOTAP:콜레스테롤 소포)가 포함된다. 지질계 나노입자는 양전하, 음전하 또는 중성일 수 있다. 특정 구체예에서, 지질계 나노입자는 중성 전하일 수 있다(예를 들면, DOPC 리포좀).
a. 리포좀
"리포좀"은 포집된 지질 이중층 또는 응집체를 형성하여 만들어진 다양한 단일 및 다중라멜라 지질 소포를 포함하는 일반 용어이다. 리포좀는 이중층 막을 가지는 소포 구조로 특징되는데, 일반적으로 인지질로 구성된 이중층, 내부 매체는 수용성 조성물로 구성된다. 본 발명의 리포좀은 단층라멜라 리포좀, 다층라멜라 리포좀 및 다중소포 리포좀이 포함된다. 본 발명의 리포좀은 양전하, 음전하 또는 중성일 수 있다. 특정 구체예에서, 리포좀은 중성 전하를 가진다.
다중라멜라 리포좀은 수용성 매체에 의해 분리된 다중 지질을 가진다. 인지질로 구성된 지질이 과다 수용액에 현탁되면 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 닫힌 구조를 형성하기 전에 자체적으로 재배열하여 지질 이중층사이에 물과 용해된 용질을 포집한다(Ghosh and Bachhawat, 1991). 친지성 분자 또는 친지성 부분이 있는 분자는 지질 이중층에 용해되거나 연합될 수 있다.
특정 측면에서, 폴리펩티드는 리포좀 내 수용성 부분에 포집되고, 리포좀의 지질 이중층내에 산재되고, 리포좀 및 리포좀에 포집된 폴리펩티드에 연합된 링크 분자를 통하여 리포좀에 부착되고, 리포좀과 복합된다.
본 발명에 따라 이용되는 리포좀은 당분야에 공지된 다른 방법으로도 만들 수 있다. 예를 들면, 인지질(Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL), 가령, 중성 인지질 디올레일포스파티딜콜린(DOPC)을 tert-부탄올에 용해시킨다. 그 다음 지질을 생활성 폴리펩티드, 또는 다른 성분과 혼합한다. 지질 혼합물에 Tween 20을 첨가하는데, Tween 20은 조성물 중량의 약 5%가 된다. 과량의 tert-부탄올을 이 혼합물에 첨가하여 tert-부탄올의 용적이 적어도 95%가 된다. 혼합물을 볼텍스하고, 건조 아이스/아세톤 욕조에서 냉동시키고, 하룻밤동안 동결건조시킨다. 동결 건조된 준비물을 -20℃에 용해시키고, 3개월까지 사용할 수 있다. 필요한 경우, 동결 건조된 리포좀을 0.9% 염에서 재구성시킨다.
또는, 유리, 복숭아형 플라스크(pear shaped flask)와 같은 용기내 용매에 지질을 혼합하여 리포좀을 만든다. 용기는 예상 리포좀 현탁액 용적의 10배 이상 큰 용적을 가져야 한다. 회전 기화기를 이용하여 용매는 네가티브 압력하에 약 40℃에서 제거한다. 용매는 정상적으로 약 5분 내지 2시간내에 제거되는데 원하는 리포좀 용적에 따라 달라진다. 조성물은 진공에서 데시케이트에서 추가 건조될 수 있다. 건조된 지질은 기간에 따라 악화되는 경향이 있기 때문에 약 1주일 후에는 버리게 된다.
건조된 지질은 멸균, 발열 물질이 없는 물에서 약 25-50mM 인지질에서 지질 막이 재현탁될 때까지 흔들어서 수화시킬 수 있다. 수용성 리포좀을 한방울씩(aliquot)로 분리하여 각 바이알에 두고, 동결건조시키고, 진공에서 밀봉할 수 있다.
상기에서 설명한 바와 같이 만들어진 건조된 지질 또는 동결건조된 리포좀을 탈수시키고 단백질 또는 펩티드 용액에서 재구성하고 적절한 용매 예를 들면 DPBS에서 적절한 농도로 희석시킨다. 그 다음 혼합물은 볼텍스 믹서에서 강하게 교반시킨다. 호르몬, 약물, 핵산 구조체 및 이와 유사한 것을 포함하나 이에 국한되지 않는 물질과 같은 포집안된 추가 물질은 29,000xg에서 원심분리시켜 제거하고 리포좀 펠렛은 세척한다. 세척된 리포좀을 전체 인지질 농도가 약 50-200mM이 되는 적절한 농도에서 재현탁시킨다. 포집되는 추가 물질 또는 활성 물질의 양은 표준 방법에 따라 결정할 수 있다. 리포좀에 포집되는 추가 물질 또는 활성 물질의 양을 결정한 후 리포좀은 적절한 농도로 희석시키고 사용할 때 까지 4℃에 보관한다. 리포좀으로 구성된 약학 조성물에는 통상 멸균된 약학적으로 사용가능한 캐리어 또는 희석제 예를 들면 물, 염 용액을 포함할 것이다.
또 다른 방법에서, 다른 공지의 실험실 과정에 따라 리포좀을 만들 수 있다. (Banghamet al .,1965; Gregoriadis, 1979; Deamer and Uster, 1983; Szoka and Papahadjopoulos, 1978, 이들 각각의 관련 부분을 참고문헌으로 제출함). 본 발명에서 추가로 이용될 수 있는 리포좀에는 양이온성 리포좀, 예를 들면, WO02/100435A1, U.S 특허 5,962,016, U.S. 출원 2004/0208921, WO03/015757A1, WO04029213A2, U.S. 특허 5,030,453, U.S. 특허 6,680,068에서 설명하는 것들이며 이들은 전문을 참고자료로 첨부한다. 리포좀을 만드는 과정은 WO04/002453A1에서 설명한다. 중성 지질을 양이온성 리포좀에 포함시킬 수 있다(Farhood et al ., 1995). 특정 구체예에서 사용된 다양한 중성 리포좀은 U.S. 특허 5,855,911에서 설명하고 있으며, 참고문헌으로 첨부한다. 이들 방법은 수용성 물질을 포집하는 능력 및 각 수용성 공간과 지질의 비율에 있어서 상이하다.
리포좀 크기는 합성 방법에 따라 다양하다. 본 발명의 리포좀은 다양한 크기를 가질 수 있다. 특정 구체예에서, 리포좀은 외경이 100nm 미만, 약 90nm 미만, 약 80 nm 미만, 약 70nm 미만, 약 60nm 미만, 또는 약 50nm 미만으로 작다. 이와 같은 리포좀을 만드는데 있어서 여기에서 설명하는 임의 프로토콜 또는 당분야에 공지된 프로토콜을 이용할 수 있다. 리포좀을 만드는 방법은 U.S. 특허 4,728,578, 4,728,575, 4,737,323, 4,533,254, 4,162,282, 4,310,505, 4,921,706; 국제 출원 PCT/US85/01161; PCT/US89/05040; U.K. 특허 출원 GB 2193095 A; Mayer et al ., 1986; Hope et al., 1985; Mayhew et al . 1987; Mayhew et al ., 1984; Cheng et al ., 1987; Liposome Technology, 1984에서 설명하고 있으나 이에 국한시키지 않으며 이들 각각은 참고문헌으로 첨부한다.
b. 중성 리포좀
특정 구체예에서, 지질계 나노입자는 중성 리포좀(가령 DOPC 리포좀)이다. 여기에서 사용된 바와 같은 "중성 리포좀" 또는 "비-하전 리포좀"은 필수적 중선, 네트 전하(실질적으로 비-하전된)를 만들기 위해 한 개 또는 그이상의 지질 성분을 가지는 리포좀을 말한다. "기본적으로 중성" 또는 "기본적으로 비-하전된"의 의미는 주어진 집단(예를 들면 리포좀 집단)내에 지질 성분에는 다른 성분의 반대 전하에 의해 없어지지 않는 전하를 포함한다는 것이다(예를 들면 성분의 10% 미만은 사라지지 않는 전하를 가지며, 좀더 바람직하게는 5% 미만, 더욱 바람직하게는 1% 미만이 된다). 특정 구체예에서, 중성 리포좀에는 생리학적 상태(pH7)에서 그들 자체가 중성인 지질 또는 인지질을 포함할 수 있다.
본 발명의 리포좀 또는 지질계 나노입자는 인지질로 구성된다. 특정 구체예에서, 한 종류의 인지질을 리포좀을 만드는데 이용할 수도 있다(예를 들면, DOPC와 같은 중성 인지질을 이용하여 중성 리포좀을 만든다). 다른 구체예에서, 한 종류 이상의 인지질을 이용하여 리포좀을 만들 수도 있다.
인지질에는 포스파티딜콜린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜에탄올아민이 포함되는데, 포스파티딜아탄올아민 및 포스파티딜 콜린은 생리학적 상태(pH 7)에서 하전을 띄지 않기 때문에, 이들 화합물은 중성 리포좀을 만드는데 특히 유용할 것이다. 특정 구체예에서, 인지질 DOPC를 이용하여 비-전하 리포좀을 만든다. 특정 구체예에서, 인지질이 아닌 지질(예를 들면, 콜레스테롤)을 이용할 수 있다.
인지질에는 글리세로포스포리피드, 일부 스핑고리피드를 포함한다. 인지질에는 디올레일포스파티딜콜린("DOPC"), 난 포스파티딜콜린("EPC"), 디라우릴포스파티딜콜린("DLPC"), 디미리스토일포스파티딜콜린("DMPC"), 디팔리토일포스파티딜콜린("DPPC"), 디스테아로일포스파티딜콜론("DSPC"), 1-미리스토일-2-팔미토일 포스파티딜콜린("MPPC"), 1-팔미토일-2-미리스토일 포스파티딜콜린("PMPC"), 1-팔미토일-2-스테아로일 포스파티딜콜린 포스파티딜콜린 ("PSPC"), 1-스테아로일-2-팔미토일 포스파티딜콜린 ("SPPC"), 디라우릴오일포스파티딜글리세롤 ("DLPG"), 디미리스토일포스파티딜글리세롤 ("DMPG"), 디팔미토일포스파티딜글리세롤 ("DPPG"), 디스테아로일포스파티딜글리세롤 ("DSPG"), 디스테아로일 스핑고미엘린 ("DSSP"),디스테아로일포스파티딜에탄올아민 ("DSPE"), 디올레오일포스파티딜글리세롤 ("DOPG"), 디미리스토일 포스파티딕산 ("DMPA"), 디팔미토일 포스파티딕산 ("DPPA"), 디미리스토일 포스파티딜에탄올아민 ("DMPE"), 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민 ("DPPE"), 디미리스토일 포스파티딜세린 ("DMPS"), 디팔미토일 포스파티딜세린 ("DPPS"), 뇌 포스파티딜세린 ("BPS"), 뇌 스핑고미엘린 ("BSP"), 디팔미토일 스핑고미엘린 ("DPSP"), 디미리스틸 포스파티딜콜린 ("DMPC"), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린("DAPC"), 1,2-디아라키도일-sn-글리세로-3-포스포콜린("DBPC"), 1,2-디에코세노일-sn-글리세로-3-포스포콜린("DEPC"), 디올레오일포스파티딜에탄올아민 ("DOPE"), 팔미토일오에일 포스파티딜콜린 ("POPC"), 팔미토일오에일 포스파티딜에탄올아민 ("POPE"), 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민, 및 디리노레오일포스파티딜콜린을 포함한다.
인지질은 천연 또는 합성 원료로부터 만들 수 있다. 그러나 난(egg) 또는 콩 포스파티딜콜린, 뇌 포스파티딕산, 뇌 또는 식물 포스파티딜 이노시톨, 심장 카디오리핀 및 식물 또는 세균성 포스파티딜에탄올아민과 같은 천연 원료로부터 얻은 인지질을 특정 구체예에서는 1차 포스파티드(가령 전체 포스파티드 조성물이 50% 또는 그 이상을 구성하는)로 사용하지 않는데 그 이유는 이것으로 만들면 생성된 리포좀이 불안정하거나 누수가 생길 수 있다.
c. 지질계 소포
본 발명에서 이용할 수 있는 다른 타입의 지질계 나노입자는 지질계 소포이다. 지질계 소포는 상기 나열된 한 가지 이상의 지질을 이용하여 만들 수 있다.
특정 구체예에서, 지질계 소포는 DOTAP:콜레스테롤 소포이다. DOTAP:콜레스테롤 소포는 양이온성 지질 DOTAP (1,2-비스(올레오일옥시)-3-(트리메틸아미노)-프로판)과 콜레스테롤을 혼합하여 만든다. DNA로 만든 소포가 구조(“샌드위치”)를 만들고 이때 DNA는 두 개 지질 이중층 사이에서 응축되는 것으로 보인다(U.S. 특허 6,770,291 및 6,413,544).
DOTAP:콜레스테롤-폴리펩티드 복합체는 다음의 비-제한적 실시예와 같이 만들 수 있다. DOTAP:콜레스테롤(DC) 나노입자(50 내지 100nm의 크기)은 이미 설명된 바와 같이 합성한다(U.S. 특허 6,770,291 및 6,413,544; Templeton, 1997). 간단하게 설명하면, DOTAP 및 콜레스테롤을 클로로포름에서 1:1 비율(20M DOTAP 및 20M 콜레스테롤)로 혼합하고, 얼음 냉각 회전 기화기에서 기화시킨다. 생성된 혼합물은 5% 덱스트로즈에서 재현탁시키고, 55℃에서 펄스 소니케이트시키고, 동결건조시킨다. 동결건조된 산물을 5% 덱스트로즈에서 용해시키고 미니-압출기(Avanti Lipids, Al)를 통하여 크기를 감소시키면서(1.0, 0.45, 0.2, 0.1m을 평균 입자 크기 50 내지 100nm) 압축시킨다. 콜레스테롤이 없는 DOTAP도 비슷하게 준비하였다. 합성된 나노입자를 4℃에 저장하고, 나노입자 복합체를 만들 때 사용한다.
DOTAP:콜레스테롤-펩티드 나노입자를 만들기 위해, 20μg 펩티드를 100㎖ 5% 덱스트란/물("D5W")에 희석시키고, 동일한 용적의 희석된 DOTAP:콜레스테롤 또는 DOTAP 단독(40μl 20mM M DOTAP:콜레스테롤 또는 DOTAP 단독으로 희석시켜 전체 용적을 100μl D5W으로 한다)으로 부드럽게 혼합하여 최종 농도가 100mg/mL 펩티드 및4mM DOTAP:콜레스테롤 또는 DOTAP이 되도록 한다. 조제물은 DOTAP:콜레스테롤 또는 DOTAP에 대한 펩티드의 비율을 다양하게 하여 최적화시킬 수 있다. 생성된 펩티드-나노입자는 100-250nm의 평균 입자 크기를 가지고, N4 Plus Submicron Particle Sizer N4 입자 크기 분석기, Delsa 440SX Zeta Potential Analyzer (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA)를 이용하여 결정하였을 때, +50mV의 양전하를 가진다.
본 발명의 일부 구체예에서, 초상자성 나노입자로 형성된 나노입자-폴리펩티드 복합체를 DOTAP:콜레스테롤 소포에 결합시킨다. 펩티드-SPIO 콘쥬게이트를 DOTAP:콜레스테롤 소포에 어셈블시키기 위해, 각 성분의 최적화된 몰비율로 자가 어셈블링 과정에 따라 펩티드-SPIO 콘쥬게이트를 DOTAP:콜레스테롤 소포에 포집시킬 수 있다. 펩티드-SPIO 나노입자, 또는 개별 펩티드 및 SPIO 성분들을 어셈블시키는데, 우선 5-50 펩티드-SPIO 콘쥬게이트 또는 5-50 펩티드 + 0.1-1mg Fe (SPIO)/ml D5W를 1시간 동안 혼합시키고, D5W에서 동일한 용적의 40-100mM DOTAP:콜레스테롤 소포와 복합시켜 어셈블시킨다. D5W에서 펩티드-SPIO-DOTAP:콜레스테롤 입자 및 콜로이드 안정성을 스펙트로포토메터 분석 O.D.으로 400nm에서 모니터한다. 포집 과정은 FACS 분석에 의해 fluo-3-라벨된 펩티드-SPIO 콘쥬게이트로 전이감염된 종양세포에서 세포 취입을 결정하여 최적화시킨다.
3. 나노입자의 표적화
폴리펩티드 탑재(payload)물을 운반할 수 있는 능력을 가진 나노입자를 사용하지 않고도 리간드를 추가하여 표적화된 운반을 실시할 수 있다. 특정 세포, 조직 및 기관으로 운반이 가능하다. 리간드계 운반 시스템의 표적 특이성은 상이한 세포 유형상에 리간드 수용체의 분포에 근거한다. 표적화 리간드는 나노입자에 비-공유적 또는 공유적으로 결합될 수 있고, 여기에서 논의된 다양한 방법에 의해 나노입자에 콘쥬게이트될 수도 있다.
나노입자를 표적화시키는데 이용될 수 있는 단백질 또는 펩티드의 예를 들면 트란스페린, 락토페린, TGF-α, 신경 생장 인자, 알부민, HIV Tat 펩티드, RGD 펩티드, 인슐린 및 기타 다른 것들이 포함된다(Gupta et al ., 2005; Ferrari, 2005).
II . 생활성 폴리펩티드
본 발명은 나노입자-폴리펩티드 복합체와 세포로 폴리펩티드를 운반하기 위해 이와 같은 복합체를 이용하는 방법을 제공한다. 복합체는 나노입자와 연합된 생활성 폴리펩티드로 구성된다. "생활성" 폴리펩티드는 일부 원하는 생물학적 기능 또는 활성을 가지는 단백질 또는 펩티드이다. 예로써, 항암 요법을 위한 원하는 생물학적 기능에는 단백질 카이나제 저해, 세포사멸 촉진 및 이와 유사한 것들이 포함된다. 따라서, 생활성 항암 폴리펩티드는 단백질 카이나제의 저해, 세포사멸 촉진 또는 맥관형성을 저해시키는 폴리펩티드이다.
본 발명에 따르면, 나노입자-폴리펩티드 복합체는 나노입자와 연합하여 만들 수 있다. 관심대상이 되는 단백질의 한 가지 또는 그 이상의 기능 도메인을 포함하는 생활성 펩티드를 고려할 수 있다.
A. 생활성 폴리펩티드의 제조
본 발명은 생성된 생활성 폴리펩티드(예를 들면, 생활성 펩티드)를 확인하는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 생활성 폴리펩티드는 폴리펩티드에 있는 한가지 또는 그 이상의 기능 도메인을 확인하여 만들 수 있다.
단백질의 기능 도메인은 당분야에 공지된 분자 및 세포 생물학적 방법을 이용하여 구조-기능 연구를 통하여 실험적으로 결정될 수 있다. 예를 들면, 단백질의 결손 돌연변이체 또는 치환 돌연변이체는 재조합 DNA 방법에 의해 만들 수 있고, 이와 같은 돌연변이체 단백질의 생물학적 성질을 연구한다. 또는 단백질 서열에 가상 기능 도메인은 아미노산 서열 분석으로 확인되며, 이와 같은 예상 기능 도메인을 포함하는 펩티드를 고안하고, 생물학적 활성에 대해 테스트한다.
특정 구체예에서, 컴퓨터를 이용한 구조 분석을 이용하여 폴리펩티드내 기능 도메인을 확인할 수 있을 것이다. 일반적으로 컴퓨터를 이용한 구조 분석은 유전자의 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 평가하는 것과 연관된다. 컴퓨터를 이용한 구조 분석을 이용하여 단백질 카이나제(예를 들면, PKC) 활성화 또는 상호작용 부위, 미리스토일화 부위, PDZ Class II 도메인 또는 A 카이나제 고정 단백질 (AKAP) 모티프와 같은 기능 도메인을 확인할 수 있다. 컴퓨터를 이용한 구조 분석으로 가상 기능 도메인을 확인할 수 있다. 가상 기능 도메인의 확인으로 생활성 펩티드를 충분히 확인할 수 있다. 그러나, 기능 도메인의 활성을 확인하고자 하는 경우에, 당분야에 공지된 다양한 생물학적 검사를 이용하여 기능 도메인의 활성을 확인할 필요가 있다. 컴퓨터를 이용한 구조 분석을 실행할 수 있는 소프트웨어에는 Scansite 프로그램 및 ExPASy Proteomics Server에서 볼 수 있는 다른 분석 프로그램이 포함된다.
본 발명의 특정 구체예에서, 항암 성질을 가지는 펩티드를 고려한다. 이와 같은 펩티드는 종양 억제물질 유전자 산물에 근거할 수 있다.
B. 종양 억제물질 유전자
종양 억제물질 온코겐은 과다한 세포 증식을 저해하는 기능을 한다. 이들 유전자가 비활성화되면 저해 활성을 파괴하여 제어불가능한 증식이 일어난다.
연구가 잘 이루어진 종양 억제물질 유전자는 p53이다. 화학적 발암, UV 방사 및 몇가지 바이러스에 의해 형질변환된 많은 세포에서 상당 수준의 돌연변이체 p53가 발견되었다. p53 유전자는 다양한 인체 종양에서 돌연변이성 비활성화의 흔한 표적이고, 흔한 인체 암에서 가장 빈번하게 돌연변이되는 유전자로 기록되어 있다. 인체 NSCLC의 50%이상에서(Hollstein et al ., 1991) 그리고 다양한 다른 종양에서 돌연변이되었다.
p53 유전자는 큰 T-항원 및 E1B와 같은 숙주 단백질과 복합체를 형성할 수 있는 393개 아미노산 인지질 단백질을 인코드한다. 이 단백질은 정상 조직 및 세포에서 발견되지만 형질변환된 세포 또는 종양 조직과 비교하면 그 농도는 미미하다.
야생형 p53은 많은 세포 유형에서 중요한 생장 조절물질로 인식된다. 미스센스 돌연변이가 p53 유전자에서 가장 흔하고, 온코겐 형질변환 능력에 필수적이다. 점 돌연변이에 의한 단일 유전적 변화로 발암성 p53이 생성될 수 있다. 그러나, 다른 온코겐과는 달리, p53 점 돌연변이는 최소 30개 별개 코돈에서 일어나며, 동종 접합에 대한 감소없이 세포 표현형에 전이를 일으키는 우성 대립형질을 만든다. 또한, 우성 대립형질 네가티브의 대부분이 유기체에 내성을 가지며 생식계열에 전달된다. 다양한 돌연변이 대립형질은 최소 이상기능에서부터 강력한 침투성, 우성 네가티브 대립형질의 범위를 가지는 것으로 보인다 (Weinberg, 1991).
세포 증식의 또 다른 저해물질은 p16이다. 진핵 세포유형의 주요 전이는 사이클린-의존성 카이나제, 또는 CDK에 의해 촉발된다. 하나의 CDK, 사이클린-의존성 카이나제 4(CDK4)가 G1를 통하여 진행을 조절한다. 이 효소의 활성은 후기 G1에서 Rb를 포스포릴화하는 것일 수도 있다. CDK4의 활성은 활성 소단위, D-타입 사이클린에 의해 조절되고, 저해성 소단위, p16INK4에 의해 CDK4에 특이적으로 결합하여 이를 저해하는 단백질로 확인되었으며, 이는 Rb 포스포릴화반응을 조절할 수 있다(Serrano et al ., 1993; Serrano et al ., 1995). p16INK4단백질이 CDK4 저해물질(Serrano, 1993)이기 때문에 이 유전자의 결손으로 CDK4의 활성이 증가되어, Rb 단백질의 과다포스포릴화 반응이 일어난다. p16은 또한 CDK6의 기능을 조절하는 것으로 알려져있다.
p16INK4 은 CDK-저해성 단백질의 새로운 클래스에 속하는데, 여기에는 p16B, p19, p21WAF1, p27KIP1이 포함된다. p16INK4 유전자는 많은 종양 유형에서 흔히 결손되는 9p21 염색체 지도를 그린다. p16INK4 유전자의 동종접합성 결손 및 돌연변이가 인체 종양 세포주에 흔하다. 이와 같은 증거로 p16INK4 유전자가 종양 억제물질 유전자라는 것을 말한다. 그러나, 이런 해석은 배양된 세포주에서 보다 원발성 비-배양된 종양에서 p16INK4 유전자 변형 빈도가 훨씬 낮다는 관찰에 의해 의심을 받았다. (Caldas et al ., 1994; Cheng et al ., 1994; Hussussian et al ., 1994; Kamb et al ., 1994; Kamb et al ., 1994; Mori et al ., 1994; Okamoto et al ., 1994; Nobori et al ., 1995; Orlow et al., 1994; Arap et al ., 1995). 플라스미드 발현 벡터로 형질감염에 의해 야생형 p16INK4 기능 복원은 일부 인체 암 세포주에 의한 콜로니 형성을 감소시킨다(Okamoto, 1994; Arap, 1995).
본 발명에 이용될 수 있는 종양 억제물질은 표 4에 나타내었다. 표 4에 제시된 유전자는 본 발명에서 이용할 수 있는 종양 억제물질 유전자의 비-제한적인 예들이다. 또한, 현재 공지된 또는 앞으로 발견될 실질적인 임의 종양 억제물질 유전자(예를 들면, 프로-세포사멸 유전자 또는 암세포에 세포 독성이 있는 유전자) 도 본 발명에서 유용할 것이다. 종양 저해성 효과를 설명하는 임의 인간 유전자 산물도 항암 생활성 펩티드를 운반하는데 이용될 수 있다.
종양 억제물질 유전자
GENE GENE GENE GENE
101F6 DAF-18 HYAL2 PTEN
ABR D-APC IGBP7 PTPNl3
ADPRTL3 DBC2 IGSF4 PTPRG
ANP32C DCC ING1 RASSF1
ANP32D DDX26 ING1L RB1
APC2 DEC1 ING4 RBBP7
APC DLC1 l(2)tid RBM6
ARF DLEC1 l(3)mbn RBX1
ARHGAP8 DLEU1 l(3)mbt RECK
ARHI DLEU2 LAPSER1 RFP2
AT1G14320 DLG1 LATS1 RIS1
ATM DLGH1 LATS2 RPL10
ATP8A2 DLGH3 LDOC1 RPS29
AXUD1 DMBT1 LOHIICR2A RRM1
BAP1 DNAJA3 LRPIB S100A2
BECN1 DOC-1 LUCA3 SEMA3B
BIN1 DPCH MAD SF1
BRCA1 DPH2L MAP2K4 SFRP1
BRCA2 EGR1 MAPKAP3 SLC22AK
BTG1 FABP3 MCC SLC26A3
BTG2 FAT MDC SMARCA4
C1orf1 FGL1 MEN1 ST7
C5orf4 FHIT ML-1 ST7L
C5orf7 FLJ10506 MLH1 ST13
Cables FOXD1 MRVl1 ST14
CACNA2D2 FOXP1 MTAP STIM1
CAP-1 FT MXl1 TCEB2
CARS FUS1 NAP1L4 THW
CAV1 FUS2 NBR2 Timp3
CD81 GAK NF1 TP53
CDC GAS1 NF2 TP63
CDK2AP1 GAS11 NORE1 TRIM8
CDKN1A GLD-1 NPR2L Tsc2
CDKN1C GLTSCR1 NtRb1 TSG1-1
CDKN2A GLTSCR2 OVCA2 TSSC1
CDKN2B GRC5 PDGFRL TSSC3
CDKN2X GRLF1 PHEMX TSSC4
Ciao1*** HDAC3 PHyde VHL
CLCA2 HEMK PlG8 Vhlh
CREBL2 HIC1 PlK3CG WFDC1
CTNNA1 HRG22 PlNX1 WIT-1
CUL2 HSAL2 PLAGL1 WT1
CW17R HTS1 PRDM2 WWOX
DAB2 HYAL1 PTCH p53
bak MDA-7 p21 bax
fas
C. 인간 염색체 3 p21 .3으로부터 종양 억제물질 유전자.
종양 억제물질 유전자(TSGs)는 사람의 폐 암 및 다른 암의 병인성에 주요 역할을 한다. 폐 암세포는 다중 공지의 우성 및 열성 온코겐에 돌연변이 및 결손을 숨겨둔다 (Sekido et al ., 1998; Virmani et al ., 1998). Rb, p53, 가상 TSGs 와 같은 공지의 TSGs가 염색체 부위 3p, 5q, 6p, 8p, 9p, 11p 및 다른 부위에서 발견되었다(Sekido et al ., 1998; Gazdar et al ., 1994; Minna, 1997). 새로운 폐 종양 및 종양 세포의 세포 유전학 및 엘레로타이핑(allelotyping) 연구에서 다중 부위에서 종양 세포 대립형질 손실이 나타났고, 이는 하나 이상의 TSGs가 존재한다는 것을 말한다. (Sekido et al ., 1998; Virmani et al ., 1998; Gazdar et al ., 1994; Minna et al ., 1997). 그러나, 염색체 3(3p)의 short arm 상에 세포유전학적 변화 및 대립형질 손실이 소세포 폐암(SCLCs)의 약 90%에서, 그리고 비-소세포 폐암(NSCLCs)의 >50%에서 가장 빈번하게 나타나는 것으로 보인다(Sekido et al ., 1998; Gazdar et al ., 1994; Minna, 1997 Daly et al ., 1993). SCLC 및 NSCLC는 폐 종양에서 두 가지 처리 군이며 4개 조직 타입을 이룬다. 편평세포암종, 아데노세포 암종 및 거대세포 암종이 NSCLC군에 있다. 소세포폐암(Small cell lung cancer)은 SCLC 군에 있다. 폐암의 약 75%가 NSCLCs이다. 전이는 SCLS보다는 NSCLC에서 나중에 발생한다. SCLC는 충실성 종양의 가장 전이성이 있는 것 중에 하나이다(Mabry et al ., 1998). 또한, 유사한 3p 변화를 폐암 이외에, 신장, 유방, 머리, 목, 췌장, 신장, 구강, 자궁경부암에서도 볼 수 있다.(Roth, 1998; Zbar et al., 1987; Gazdar et al ., 1998; Sekido et al ., 1998; Buchhagen et al ., 1996; Gorunova et al., 1998; Hughson et al ., 1998; Uzawa et al ., 1998; Kersemaekers et al ., 1998; Wistuba et al., 1997). 또한 폐암에서 동종접합성 결손으로 정의된 TSGs군이 3p21.3의 450-kb 부분에 위치하여 분리하였다(Sekido et al ., 1998; Minna et al ., 1997 Hung et al ., 1995; Sekido et al ., 1996; Wistuba et al ., 1999). 폐암 프레-신형성 연구에서 3p21 대립형질 손상이 현재까지 감지된 폐암에서 최초 유전적 이상이었고, 과형성 병소에서 발현되었다. 이는 하나 또는 그 이상의 3p-열성 온코겐이 폐암을 포함하는 많은 인체 암의 분자 병인학에서 “문지기(gatekeeper)”로 기능을 한다는 것을 보여주며, 이는 >50%이상에서 관련되는 것으로 보인다. (Sekido et al ., 1998; Minna et al .,7 1997 Hung et al ., 1995; Sekido et al ., 1996; Wistuba et al ., 1999; Kohno et al ., 1999; Wistuba et al ., 1999).
인체 염색체 3p21.3.의 120-kb 주요 종양 동종접합성 결손 부위(폐와 유방 암에서 발견됨)에서 일군의 유전자가 확인되었다. 이들 유전자를 CACNA2D2, PL6, 101F6, NPR1.2, BLU, RASSF1, FUS1, HYAL2, HYAL1으로 지정하였다. 인간의 NSCLC 세포의 몇 가지 타입에서 세포 증식상에 이들 유전자의 일부를 발현시키는 효과를 조사하기 위한 연구가 실행되었다. 이들 연구에서, FUS1, 101F6, HYAL2 및 다른 유전자가 종양 억제물질 유전자 후보라는 것을 나타낸다(Ji et al ., 2000).
아데노바이러스 벡터 또는 DOTAP:콜레스테롤 나노입자 중개된 유전자 전달에 의해 3p21.3-결손 인체 폐암세포에서 wt-FUS1 기능 복원으로 세포사멸 유도 및 in vitro 및 in vivo 세포 역학의 변경으로 이들 세포의 생장이 저해된다(Ito et al., 2004). 이는 FUS1의 종양 억제 활성을 설명한다.
III . 약학 조성물
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 수용가능한 캐리어에 용해 또는 분산된 하나이상의 펩티드, 나노입자-폴리펩티드 복합체 또는 추가 물질로 구성된다. "약학적으로 또는 약리학적으로 수용가능한"은 사람과 같은 동물에 투여하였을 때 부작용, 알레르기 또는 다른 바람직하지 않은 반응을 일으키지 않는 분자 또는 조성물을 말한다. 적어도 한 가지 펩티드, 나노입자-폴리펩티드 복합체 또는 추가 활성 성분을 포함하는 약학 조성물은 당분야에 공지되어 있고, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990에서도 잘 설명하고 있다. 또한, 동물(사람)의 경우, 조제물은 FDA의 멸균성, 발열성, 일반적인 안정성 및 순도 기준에 부합되어야 한다는 것을 인지할 것이다.
여기에서 사용된 것과 같이, "약학적 수용가능한 캐리어"에는 모든 용매, 분산 매체, 계면활성제, 항산화제, 보존제(예를 들면 항균제, 항곰팡이제), 등장성 물질, 흡수 지연제, 염, 보존제, 약물, 약물 안정화제, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 향료, 염료 및 이와 유사한 물질 또는 이들의 복합물이 포함되며, 이는 당분야에 공지되어 있다(예를 들면, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329, incorporated herein by reference). 활성 성분과 사용할 수 없는 임의 통상의 부형제를 제외하고는 약학 조성물에 사용할 수 있다.
약학 조성물은 고체, 액체 또는 에어로졸 형태로 투여되느냐에 따라 그리고 주사로 이와 같은 경로로 투여할 때 멸균되어야 하는 지에 따라 상이한 타입의 캐리어를 포함할 수 있다. 본 발명에서는 카테테르, 위세척을 통하여 크림 또는 지질 조성물(리포좀)으로 정맥, 경피, 동맥, 복막, 병소. 뇌, 관절, 전립선, 늑막, 기관, 비강, 유리체강내, 질, 직장, 국소, 종양, 근육, 복막, 피하, 결막하, 소포내, 점막, 들문주변(pericardial), 배꼽, 안구, 구강, 국소, 흡입(에어로졸 흡입), 주사, 주입, 연속 주입, 국소화된 배스(bathing) 표적 세포로 직접 투여될 수 있거나 다른 공지의 방법을 이용하여 투여될 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, incorporated herein by reference).
특정 구체예에서, 약학 조성물은 복막내 투여된다. 다른 구체예에서, 약학 조성물은 암(예를 들면 암종 종양)을 치료하기 위해 복막으로 투여된다. 예를 들면 위암을 치료하기 위해 약학 조성물이 투여될 수 있다. 특정 구체예에서 약학 조성물을 종양내 또는 주변에 투여하는 것이 바람직할 수 있다.
특정 적절한 구체예에서, 약학 조성물은 암(예를 들면 위암)을 치료하기 위해 경구를 통하여 투여될 수 있다.
환자로 투여되는 본 발명의 조성물의 실질적인 투여량은 체중, 질병의 중증도, 치료될 질병의 유형, 기존 또는 현재 시행하고 있는 치료법, 환자의 특발증(idiopathy), 투여 경로와 같은 물리적 그리고 생리학적 인자들에 의해 결정될 수 있다. 투약을 맞은 담당의는 조성물에 활성 성분이 농도를 결정하고 개별 개체에 적합한 약량을 결정할 수 있을 것이다.
특정 구체예에서, 약학 조성물은 활성 화합물의 적어도 약 0.1%로 구성된다. 다른 구체예에서, 활성 화합물은 단위 체중의 약 2% 내지 약 75%로 구성되며 또는 약 25% 내지 약 60%로 구성되거나 이 범위에서 유도된 임의 범위가 될 수 있다. 비-제한적인 실시예로써, 약량은 체중당 약 1㎍/kg/body weight, 약 5 ㎍/kg/body weight, 약 10 ㎍/kg/body weight, 약 50 ㎍/kg/body weight, 약 100 ㎍/kg/body weight, 약 200 ㎍/kg/body weight, 약 350 ㎍/kg/body weight, 약 500 ㎍/kg/body weight, 약 1 ㎎/kg/body weight, 약 5 ㎎/kg/body weight, 약 10 ㎎/kg/body weight, 약 50 ㎎/kg/body weight, 약 100 ㎎/kg/body weight, 약 200 ㎎/kg/body weight, 약 350 ㎎/kg/body weight, 약 500 ㎎/kg/body weight, 약 1000 mg/kg/body weight 또는 그이상을 투여할 수 있거나 이 범위에서 유도된 양으로 투여될 수 있다. 상기에서 나열된 유도 범주의 비-제한적인 예로써, 약 5 mg/kg/body weight 내지 약 100 mg/kg/body weight, 약 5 ㎍/kg/body weight 내지 약 500 ㎎/kg/body weight의 범위로 투여될 수도 있다.
임의 경우에, 조성물은 하나 또는 그이상의 성분의 산화를 지연시키기 위해 다양한 항산화제를 포함할 수 있다. 또한, 파라벤(예를 들면, 메틸파라벤, 프로필파라벤), 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 또는 이의 복합물을 포함하나 이에 국한되지 않은 다양한 항균 및 항곰팡이제와 같은 보존제에 의해 미생물 작용을 방지할 수 있다.
하나 또는 그이상의 펩티드, 나노입자-폴리펩티드 복합체 또는 추가 물질은 자유 염기, 중성 또는 염 형태로 조성물내에 조제될 수 있다. 약학적으로 수용가능한 염에는 예를 들면, 단백성(proteinaceous) 조성물의 자유 아미노기로 형성된 염, 또는 염산 또는 인산과 같은 무기산 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산 또는 만델산과 같은 유기산으로 형성된 염이 된다. 자유 카르복실산으로 형성된 염은 나트륨, 칼륨, 암모니움, 칼슘 또는 철 수산화물과 같은 무기 염기에서 또는 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘 또는 프로카인과 같은 유기 염기에서 유도될 수도 있다.
조성물이 액상형인 구체예에서, 캐리어는 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 지질(예를 들면, 트리글리세리드, 식물성 오일, 리포좀 등)을 포함하나 이에 국한되지 않은 분산 매체 또는 용매가 될 수 있다. 레시틴으로 코팅하던가 또는 액체 폴리올 또는 지질과 같은 캐리어에 분산시키거나 또는 하이드록시프로필셀룰로오즈와 같은 계면활성제를 이용하거나 이들 방법을 복합하여 적절한 유동성(fluidity)을 유지시킬 수 있다. 많은 경우에, 슈가, 염화나트륨 또는 이의 복합물과 같은 등장성 물질을 포함시키는 것이 바람직하다.
다른 구체예에서, 안약, 비강 용액, 스프레이, 에어로졸 또는 흡입제로 이용할 수 있다. 이와 같은 조성물은 표적 조직 형태에 필적할 수 있도록 고안하는 것이 일반적이다. 비-제한적인 실시예에서, 비강 용액은 드롭 또는 스프레이 형태로 비강으로 투여될 수 있도록 고안되는 일반적으로 수용액이 된다. 비강 용액은 비강 분비물에 대해 매우 유사하여 정상적인 모(ciliary)의 작용이 유지된다. 따라서 적절한 구체예에서, 수용성 비강 용액은 등장성이거나 pH를 약 5.5 내지 약 6.5로 유지시키기 위해 약간 완충되기도 한다. 또한, 항균 보존액에 추가하여 안약등에 사용되는 것과 유사하게, 약물, 또는 다른 적절한 약물 안정화제를 필요한 경우에 포함시킬 수 있다. 예를 들면 다양한 시판되는 비강 조제물이 공지되어 있는데 여기에는 항생제 또는 항히스타민제와 같은 약물을 포함한다.
특정 구체예에서, 이와 같은 경로 또는 경구 섭취를 위해 한 개 또는 그 이상의 펩티드 또는 나노입자-폴리펩티드 복합체를 준비한다. 이와 같은 구체예에서, 고형 조성물은 용액, 현탁액, 에멸젼, 테블릿, 알약, 캡슐(예를 들면 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐), 서방형 조성물, 구강 조성물, 트로키, 엘륵시르, 현탁액, 시럽, 와이퍼 또는 이의 복합물로 구성될 수 있다. 경구용 조성물은 음식에 바로 결합시킬 수 있다. 경구 투여를 위한 적절한 캐리어는 비활성 희석제, 동화가능한 식용 캐리어 또는 이의 복합물로 구성될 수 있다. 본 발명의 다른 측면에서, 조성물은 시럽 또는 엘륵시르 형태로 만들 수 있다. 시럽 또는 엘륵시르는 적어도 하나의 활성 성분, 감미제, 보존제, 향료, 염료, 보존제 또는 이의 복합물이 포함될 수 있다.
특정 적절한 구체예에서, 경구 조성물은 하나 또는 그이상의 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 향료 및 이의 복합물로 구성될 수 있다. 특정 구체예에서, 조성물은 다음중 하나 또는 그 이상이 포함될 수 있다: 결합제 예를 들면, 검 트라칸트, 아카시아, 옥수수 전분 젤라틴 또는 이의 복합물; 부형제 예를 들면, 이인산칼슘, 만니톨, 락토즈, 전분, 스테아레이트 마그네슘, 사카린 나트륨, 셀룰로오즈, 탄산마그네슘 또는 이의 복합; 붕해제 예를 들면 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 또는 이의 복합; 윤활제 예를 들면, 스테아레이트 마그네슘; 감미제 예를 들면, 슈크로즈, 락토즈, 사카린 또는 이의 복합; 향료 예를 들면 페퍼민드, 윈터그린 오일, 체리향, 오렌지 향 등 또는 이의 복합물. 단위 약형이 캡슐인 경우 상기 물질에 추가하여 액체 캐리어를 포함할 수 있다. 다양한 다른 물질이 피복제로 존재하거나 단위 약형의 물리적인 형태를 변형시키기 위해 존재할 수 있다. 예를 들면, 정제, 알약 또는 캡슐이 셀락(shellac) 또는 설탕등으로 피복될 수 있다.
다른 경로의 투여에 적합한 다른 조제물에는 좌약이 포함된다. 좌약은 직장, 질, 요도로 삽입하기 위한 다양한 무게, 모양의 고형 조제물이다. 삽입 후에 좌약이 연해지거나 녹거나 강(cavity) 유체에 용해된다. 일반적으로 좌약의 경우 통상의 캐리어가 포함되는데 예를 들면, 폴리알킬렌 글리콜, 트리글리세리드 또는 이의 복합물이 포함된다. 특정 구체예에서 좌약은 약 0.5% 내지 약 10%, 바람직하게는 약 1% 내지 약 2%의 활성 성분을 포함하는 혼합물로 만든다.
필요한 양의 활성 화합물을 적절한 용매와 상기 언급된 다른 성분과 함께 결합시키고, 이어서 여과에 의해 살균하여 살균된 주사용 용액을 만든다. 일반적으로 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분을 기본적 분산 매체 또는 다른 성분을 포함하는 멸균 비이클에 결합시켜 만든다. 멸균 주사용 용액, 현탁액 또는 에멸젼을 만들기 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 조제법은 진공-건조 또는 냉동 건조 기술로써 기준의 멸균 여과된 액체 매체로부터 활성 성분 및 다른 추가 성분을 분말로 만들 수 있다. 액체 매체는 필요한 경우에 완충(버퍼)시켜, 주사하기 전에 액체 희석액을 충분한 염 또는 포도당으로 등장액을 우선 만든다. 직접 주사를 위해 고 농축 조성물을 만들 수도 있다는 DMSO를 용매로 이용하면 신속한 침투, 작은 부위에 고농도의 활성 성분 운반을 할 수 있다.
조성물은 제조 및 보관 상태에서 안정적이어야 하고, 세균 및 곰팡이와 같은 미생물 작용으로부터 보호되어야 한다. 엔도톡신 감염은 안정적인 수준 예를 들면 0.5ng/mg 단백질 미만으로 최소화시켜야 한다.
특정 구체예에서, 주사용 조성물의 연장 흡수는 조성물에 흡수 지연제 예를 들면 알루미늄 모노스테아레이트, 젤라틴 또는 이의 복합물을 이용하여 이룰 수 있다.
IV . 자기 공명 영상( Magnetic RESONANCE IMAGING )
자기 공명 영상(MRI)의 경우, 환자가 정전기 자기장에 누우면, 라디오주파수(RF) 펄스 및 공간 및 임시 자기장 그래디언트(gradient)를 이용하여 영상 결과를 얻게된다. MRI는 영상 데이터를 모으기 위해 핵 스핀 성질을 이용한다. 쌍을 이루지 않은 핵자(양성자 또는 중성자)를 가진 핵은 스핀(spin)으로 알려진 성질을 가지고 있어, 무-영점(non-zero) 자기 모멘트가 되어, 이를 이용하여 MRI를 실행한다 (U.S. Patent 5,397,987). 수소원자 핵은 하나의 양자를 가지고 있으며 많은 MRI 기술이 수소 핵을 이용하는데, 그 이유는 인체 조직으로 스며들기 때문이다. 개체가 메인 자기장에 있을 경우에, 핵은 장의 방향(예를 들면, 자기화 축(magnetization axis)으로 배열되며, 핵의 방향은 자기화 벡터로 나타낼 수 있다(Horowitz, 1995). 자기 공명의 전통적인 물리적 설명에서, 자기화 축 주변으로 원뿔 방식으로 진행되어 서로에 대해 점진적으로 상을 벗어난다.
특정 핵의 공진 주파수에서 인-페이즈(in-phase) 스피닝을 유도하기 위해, 고출력 라디오 주파수(high-powered radio frequency), 흔히 킬로왓트 범위의 주파수가 이와 같은 공진 주파수에서 퍼진다. 이와 같은 RF 펄스는 샘플(예를 들면 인산의 뇌)에서 핵이 메인 자기장에 의해 만들어지는 자기화 벡터에 대해 회전하도록 한다(Horowitz, 1995). 샘플에서 스피닝 핵이 RF 시그날을 만들고, 이는 시간이 경과 함에 따라 쇠하게 된다. 시간에 따라 다양한 그래디언트(gradient) 자기장을 RF 여기(excitation) 펄스후에 제공하여 쇠하는 RF 시그날의 공간적 분석이 가능하다. 따라서, RF 여기 펄스 및 시간에 따른 다양한 그래디언트 자기장으로 샘플에서 자유유도붕괴(free induction deca) 신호(FID)로 알려진 시간에 따른 MR RF 시그날을 방출한다. 자기 공명 (MR) 스캐너 안테나가 FID 시그날을 수신하여 이와 같은 MR 시그날이 프로세서로 전송된다. 프로세스는 이 시그날을 이용하여 MR 영상을 만들고, 이 영상은 스피닝 핵의 공간적 분포 또는 화학적 환경을 반영한다.
조영제를 이용하여 배경에 대해 관심 지역의 시그날 차를 증가시킨다. 초상자성 나노입자를 MRI에서 조영제로 이용할 수 있다(Gupta et al ., 2005; Ferrari, 2005). 입자들이 종양과 같은 조직에 수동적으로 또는 표적화 운반에 의해서 축적될 수 있다(Morawski et al ., 2005). 특정 조직에 이와 같은 입자를 국소화시키는데 자기장을 이용하는 것이 가능하다. 표적 운반은 상기에서 설명한 바와 같은 특정 단백질 가령, 트랜스페린의 결합과 연관된다.
본 발명의 초상자성 나노입자-폴리펩티드 복합체를 MRI에 이용하여 생활성 폴리펩티드를 취입하는 조직 및 세포를 확인한다.
사용하기 전에, 나노입자(펩티드-SPIO-DOTAP:콜레스테롤 압자)를 in vitro 세포 독성에 대해 평가할 수 있다. 인간 암 세포를 이용하여 in vitro 세포 생장 및 세포사멸 유도에서 펩티드-SPIO-DOTAP:콜레스테롤 입자의 효과를 평가한다. 비-제한적인 실시예로써, 세포 독성 측정은 XTT 검사를 이용하여 웰당 1X104세포로 96웰 플레이트에서 실행하였다. PBS로 세포를 세척하고, 무혈청 배지로 희석된 펩티드-SPIO-DOTAP:콜레스테롤 입자(최종 농도가 약 1-10mM 펩티드-SPIO 콘쥬게이트, 4-10 mM DOTAP:콜레스테롤)로 배양시켰다. 펩티드, SPIO, DOTAP:콜레스테롤 입자들을 이용하여 96웰 플레이트상에서 30분간 기준으로 사용하였다(Dynal Biotech Inc., Brown Deer, WI). 과량의 결합안된 입자는 PBS로 3회 세척하여 제거하였다. 드 다음 새로운 배양 배지를 웰에 추가한다. 세포 독성 및 세포사멸 유도는 처리후 24시간, 48시간 및 72시간에 결정한다. 세포 생존능은 제조업자의 지시에 따라 XTT 검사(Roche Biochemicals)를 이용하여 측정하였고, 세포사멸은 TUNEL-착색을 이용한 FACS 분석으로 측정하였다. 펩티드-DOTAP:콜레스테롤 입자를 양성 기준으로 사용할 수 있다
펩티드-SPIO 나노입자의 in vitro 세포 취입 및 트라피킹을 평가하기 위해, 상기와 같이 처리된 종양 세포를 이용하여 FACS 분석에 의해 펩티드-SPIO 농도에 대한 함수로써 플루로-3-라벨된 펩티드-SPIO 나노입자의 취입을 정량적으로 측정하였다. 세포 취입은 또한 자기 공명(MR)으로 측정하여 정량적으로 분석할 수 있다. 비-제한적인 실시예로써, 펩티드-SPIO-전이감염된 H1299 세포를 42℃ 15% 젤라틴에서, 다양한 세포 농도 0, 315, 625, 125, 2500, 5000, 10000 cells/ml로 현탁시키고, 그 다음 실온으로 냉각시켜 1.5㎖ 원심분리 플라스틱 튜브에 젤라틴 세포 블록이 형성되도록 한다. T2-가중된 MR 영상을 4.7-T Bruker MR를 이용하면 얻을 수 있다. 3D 경사 에코 연쇄(gradient echo sequence)를 이용하여 데이터 수득하였다. 연쇄 파라미터(Sequence parameters)는 TR25 msec, TE5.1 msec, AC128이다. 3D 슬랩은 FOV632.4 cm, matrix 25612896을 향한다. 기울어진 프로젝션(-자장 축에 대해)을 Paravision acquisition내에서 재구성하고, 소프트웨어 패키지(Bruker, Germany) 프로세스에 의해 자동으로 관계 면을 얻는다. 상기한 기하학, FOV6 cm, matrix 256256, 슬라이스 두께(slice thickness) 1mm의 유사 연쇄에 의해 펩티드-SPIO-전이감염된 H1299 세포를 측정하였다. 일부의 경우 팬텀 MR에서만 한 개 슬라이스가 측정된다. 세포에서 펩티드-SPIO의 농도는 MR146에 의해 용액에서 펩티드-SPIO-DOTAP:콜레스테롤 입자의 연속 희석으로부터 생성된 표준 곡선에 근거하여 계산한다. 플로오-3-라벨된 펩티드-SPIO 나노입자를 이용하여 세포외 형광을 소거하기 위해 트립판 블루 켄칭 검사를 이용하고, 펩티드-SPIO 콘쥬게이트의 내화를 시각화시키기 위해 공촛점위 형광 현미경을 이용하여 내화를 평가할 수 있다.
나노입자(펩티드-SPIO-DOTAP:콜레스테롤 또는 펩티드-SPIO-DOPC)의 자기력에 의해 구동된 표적 운반 및 나노입자의 in vivo 치료 효과를 평가하기 위해, 사람 암 생쥐를 이용하여 전신 투여에 의해 펩티드-SPIO 나노입자의 자기적 표적 운반 및 치료효과를 평가한다. 비-제한적 실시예로써, 누드 생쥐에 기존에 설명된 바와 같이 종양 세포를 흉부로 접종하였다. 종양 세포 접종후 7-10일 후, 생쥐에 100ml 펩티드-SPIO- DOTAP:콜레스테롤 입자를 약 5mM 펩티드-SPIO 콘쥬게이트, 4mM DOTAP:콜레스테롤 농도에서 주사하였고, 펩티드-DOTAP:콜레스테롤 그리고 SPIO-DOTAP:콜레스테롤 입자를 기준으로 사용하며, PBS 만은 모크(mock) 기준으로 한다. 각 처리 군에는 세 마리 동물을 이용하며 주사후 5 내지 30분후에 종양 부위를 자기장에 예정된 자장 강도, 국소 거리 및 위치로 노출시켜 폐 종양 부위에서 10-30분간 MRI한다. MRI는 펩티드-SPIO 처리 플랜, 국소화, 분포 및 4.7 T, 40 cm Bruker Biospec MR 장치를 이용하여 치료효과를 모니터링한다.
V. 복합 요법
본 발명의 펩티드 또는 나노입자-폴리펩티드 복합체의 효과를 증대시키기 위해, 원하는 질병 치료에 효과적인 다른 물질을 이들 조성물에 복합시키는 것이 바람직할 수 있다.
비-제한적인 실시예로써, 암 치료는 본 발명의 항암 생활성 펩티드 또는 나노입자-폴리펩티드 복합체와 항암제로 실행할 수 있다. 항암제는 개체에서 암세포를 죽이거나 암세포에서 세포사멸을 유도하거나 암세포 생장 속도를 줄이거나, 전이 발생 또는 횟수를 감소시키고, 종양 크기를 줄리며, 종양 생장을 저해하거나 종양 또는 암세포로 혈액 공급을 줄이거나, 암세포 또는 종양에 대한 면역 반응을 촉진시키거나 암 진행을 억제 또는 저해시키거나 암 환자에 생명을 연장시키는 것과 같은 개체에서 암에 네가티브 효과를 줄 수 있다. 좀더 일반적으로는 이들 다른 조성물을 복합 효과량으로 제공하여 세포를 사멸시키거나 증식을 저해시킬 수 있다. 이와 같은 과정은 세포를 항암 펩티드 또는 나노입자-폴리펩티드 복합체 및 다른 물질 또는 다중 인자와 동시에 접촉시키는 것과 연관이 있다. 세포를 단일 조성물 또는 이들 두가지 물질을 포함하는 약학 조제물과 접촉시키거나 또는 한 조성물에는 항암 펩티드 또는 나노입자폴리펩티드 복합체가 포함되며 다른 조성물에는 제2물질이 포함되는 경우에 두 개 별개 조성물을 동시에 세포에 접촉시키면 된다. 특정 구체예에서, 항암 펩티드가 하나의 물질이고, 항암 나노입자-폴리펩티드 복합체가 다른 물질이 될 수 있다.
항암 펩티드 또는 나노입자-폴리펩티드 복합체는 수분내지 수주 간격으로 다른 물질 치료에 선행하거나 치료후에 처리될 수 있다. 다른 물질 및 항암 펩티드 또는 나노입자-폴리펩티드 복합체가 세포에 별도로 제공되는 실시예에서, 각 운반시점사이에 간격이 오래지 않았으며, 이로써 제2물질 및 항암 펩티드 또는 나노입자-폴리펩티드 복합체가 세포상에 복합 효과를 유익하게 발휘할 수 있을 것이다. 이와 같은 경우에, 세포에 서로 약 12-24시간내에 각 양식을 접촉시키거나 좀더 바람직하게는 각 투여 사이 간격이 수일(2, 3, 4, 5, 6 또는 7일) 내지 수주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주)가 경과하는 등의 상당 시간으로 연장시키는 것이 바람직할 수 있다.
다양한 복합 방법이 이용될 수 있는데, 이중 화학요법 및 방사능 요법용 청구 물질을 유도체 "A", 임의 다른 치료제 또는 방법이 될 수 있는 제2 물질을 "B"라고 하였을때:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
환자에 본 발명의 치료 항-암 펩티드 또는 나노입자-폴리펩티드의 투여는 벡터의 임의 독성을 고려하여 화학치료제 투여를 위한 일반적인 프로토콜을 따른다. 치료 사이클은 필요에 따라 반복할 수 있을 것으로 기대한다. 다양한 표준 치료법 뿐만 아니라 외과적 중재와 같은 다양한 표준 요법을 상기에서 설명하는 과증식성 세포 요법과 복합하여 사용할 수 있다.
a. 화학요법
암 치료법은 화학적 그리고 방사능계 치료와 함께 다양한 복합요법을 포함한다. 화학요법에는 제휘티니브(gefitinub), 시스플라틴(CDDP), 카르보플라틴, 프로카르바진, 메클로레타민, 사이클로포스파미드, 캄포토테신, 이포파미드, 멜팔란, 클로람부실, 부설판, 니트로조우레아, 디악티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 블레오마이신, 플리코마이신, 미토마이신, 엑토포시드(VP 16), 타목시펜, 라옥시펜, 에스트로겐 수용체 결합 물질, 탁솔, 젬시타비엔, 나벨빈, 파르네실-단백질 전이효소 저해제, 트란스팔라티늄, 5-플로오로우라실, 빈크리스틴, 빈블라스틴, Gleevac(이마티니브 메실레이트) 및 메토트렉세이트 또는 상기 물질의 유사체 또는 유도체, 변이체를 포함하나 이에 국한시키지 않는다. 특정 구체예에서 본 발명은 제휘티니브와 복합하여 이용할 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명은 Gleevac(약 400 내지 약 800mg/day Gleevac을 환자에 투여할 수 있다)를 복합 사용할 수 있다. 특정 구체예에서, 하나 또는 그이상의 화학요법을 본 발명과 복합하여 사용할 수 있다.
b. 방사능요법
DNA 손상에 원인이 되며 상당히 광범위하게 이용된 다른 인자들은 종양세포에 γ-선, X-선, 또는 방사능동위원소를 직접 운반하는 것이다. DNA 손상시키는 다른 형태의 인자 예를 들면, 마이크로웨이브, UV-방사도 고려할 수 있다. 이들 인자들 모두 DNA, DNA 전구물질, DNA 복제 및 복구, 염색체 어셈블리 및 유지에 광범위하게 손상을 준다는 것이 일반적이다. X-선 약량 범위는 상당 시간(3 내지 4주) 매일 50 내지 200 렌트겐, 단일 투여량으로 2000 내지 6000렌트겐 범위가 된다. 방사능동위원소의 약량 범주는 상당히 가변적이며, 동위원소의 반감기, 방출되는 방사능의 타입 및 강도에 따라 달라진다.
세포에 사용할 때 “접촉” 및 “노출”은 치료 구조물 및 화학요법제 또는 방사능요법제가 표적 세포로 운반되거나 표적 세포에 나란하게 위치하는 것을 말한다. 세포를 죽이거나 정지시키기 위해 이들 물질 모두를 세포를 죽이거나 분열을 방지하는데 효과적인 복합량으로 세포로 운반한다.
c. 면역요법
면역치료요법적은 질병을 치료 또는 완화시키기 위해 일반적으로 면역 조절물질, 면역 효과물질 세포 및 분자를 이용한다. 예를 들면 면역 효과물질은 종양세포 표면상에 있는 일부 마커에 특이적인 항체가 될 수 있다. 항체 단족으로 요법의 효과물질로 작용할 수도 있고, 세포를 죽이는데 실제 효과적인 다른 세포를 모을 수도 있다. 항체는 또한 약물 또는 독소(화학치료요법제, 방사능 뉴클레오티드, 리친 A 사슬, 콜레라 독소, 백일해 독소 등)에 접합될 수도 있고, 단순히 표적화 물질로 작용할 수도 있다. 또는 효과물질은 종양세포 표적과 직간접적으로 상호작용하는 표면 분자를 운반하는 임파세포가 될 수도 있다. 다양한 효과물질 세포에는 세포독성 T 세포 및 NK 세포가 포함된다.
따라서, 면역요법은 유전자 요법과 함께 복합 요법의 일부로 사용될 수 있다. 복합 요법의 일반적인 방법은 하기에서 논의한다. 일반적으로, 종양 세포는 다른 주요 세포에서는 존재하지 않는 표적화용으로 사용될 수 있는 일부 마커를 보유해야 한다. 많은 종양 마커들이 존재하고, 이들중 일부는 본 발명에 표적화에 적합할 수 있다. 통상의 종양 마커에는 암종배아항원, 전립선 특이적 항원, 뇨 종양 관련 항원, 태아 항원, 티로시나제 (p97), gp68, 테그-72, HMFG, Sialyl Lewis 항원, MucA, MucB, PLAP, 에스트로겐 수용체, 라미닌 수용체, erb B 및 pi 55등이 포함된다.
d. 유전자 요법
또 다른 구체예에서, 제2차 치료는 본 발명의 핵산 조성물과 동시에 또는 투여전 또는 투여후에 치료요법적 폴리뉴클레오티드를 투여하는 제2차 요법이다. 유전자 산물의 발현을 위한 바이러스 벡터는 당분야에 공지되어 있는데 예를 들면, 아데노바이러스, 아데노-연합 바이러스, 레트로바이러스, 허피스바이러스, 렌티바이러스, 박시니아 바이러스를 포함하는 폭스바이러스, SV40을 포함하는 파필로마 바이러스와 같은 진핵 발현 시스템이 포함된다. 또는 발현 구조체 투여는 리포좀 또는 DOTAP:콜레스테롤 소포와 같은 지질계 벡터로 실행할 수 있다. 이런 모든 방법이 당분야에 공지되어 있다(Sambrook et al ., 1989; Ausubel et al ., 1998; Ausubel, 1996).
다음의 유전자 산물들중 하나를 인코드하는 벡터 운반으로 표적 조직에 복합된 항-과증식 효과를 가질 수 있다. 다양한 단백질이 본 발명에 포함되는데 이들중 일부는 하기에서 설명할 것이다.
ii . 세포 증식 저해물질
상기에서 설명한 것과 같이, 종양 억제물질 온코겐은 과도한 세포 증식을 저해하는 기능을 한다. 이들 유전자의 비활성화는 이들의 저해 활성을 파괴하여 제어불가능하게 증식된다.
본 발명에 따른 2차 치료로 이용될 수 있는 유전자에는 p53, p16, Rb, APC, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, zac1, p73, VHL, MMAC1 / PTEN, DBCCR-1, FCC, rsk-3, p27, p27/p16 융합, p21/p27 융합, 항-혈전 유전자(예를 들면,COX-1, TFPI), PGS, Dp, E2F, ras , myc , neu , raf , erb , fms, trk , ret , gsp , hst , abl, E1A, p300, 맥관형성 관련 유전자(예를 들면 VEGF, FGF, 트롬보스포딘, BAI-1, GDAIF, 또는 이들의 수용체), MCC 및 표 4에 나열된 다른 유전자들이 포함된다.
ii . 예정된 세포 사멸 조절물질
세포사멸 또는 예정된 세포 사멸은 정상적인 배 발생, 성인 조직의 항상상(homeostasis) 유지 및 발암성을 억제하는데 필수적인 과정이다(Kerr et al., 1972). Bcl-2 단백질 패밀리 및 ICE-유사 프로테아제가 다른 시스템에서 중요한 조절물질 및 세포사멸의 효과물질로 설명되었다. 여포형 임파종(follicular lymphoma)과 연관되어 발견된 Bcl단백질이 세포사멸 조절 및 다양한 세포사멸 자극에 반응하여 세포사멸을 조절하고 세포 생존을 강화시키는데 주요한 역할을 한다(Bakhshi et al., 1985; Cleary and Sklar, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA, 82(21):7439-43, 1985; Cleary et al., 1986; Tsujimoto et al., 1985; Tsujimoto and Croce, 1986). 진화론적으로 보존된 Bcl2 단백질은 관련 단백질 패밀리로 인지되는데, 이는 사멸 항진제 또는 사멸 길항제로 분류될 수 있다.
이와 같은 발견에 연속하여 Bcl2는 다양한 자극에 의해 촉발되는 세포 사멸을 억제하는 것으로 보인다. 또한, 공통적인 구조 및 서열 상동성을 공유하는 Bcl2 세포 사멸 조절 단백질 패밀리가 있는 것이 분명하다. 이러한 상이한 패밀리 멤버가 Bcl(예를 들면, BclXL, BclW, BclS, Mcl-1, A1, Bfl-1)에 유사한 기능 또는 Bcl-2 기능에 반작용하고 세포 사멸을 촉진시키는 것으로 나타났다(예를 들면, Bax, Bak, Bik, Bim, Bid, Bad, Harakiri).
e. 외과술
암 환자의 약 60%는 일정 형태의 외과술을 받는데, 여기에는 예방용, 진단용, 단계진단용 및 치료 또는 완화 외과술이 포함된다. 치료용 외과술은 본 발명의 치료와 같은 화학요법, 방사능요법, 호르몬 요법, 유전자 요법, 면역요법 또는 대체요법과 같은 다른 치료법과 복합되는 암 치료이다.
치료용 외과술은 종양의 전부 또는 일부를 물리적으로 제거, 절단 또는 파괴시키는 절제술이 포함된다. 종양 절제는 종양의 적어도 일부를 물리적으로 제거하는 것을 말한다. 종양 절제에 추가하여, 외과술에 의한 치료에는 레이져 외과술, 저온수술, 전기수술 및 모즈수술이 포함된다. 본 발명은 표피암, 선암 또는 지엽적인 양의 정상 조직을 제거를 함께 할 수 있다.
모든 암 세포, 조직 또는 종양의 일부 또는 전부를 제거할 때 신체에 강(cavity)가 형성될 수 있다. 치료는 추가 항암 요법과 함께 살포, 직접 주사 또는 국소 치료등으로 실행될 수 있다. 이와 같은 처리는 반복적으로 이루어지는데, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일 또는 1, 2, 3, 4, 5주 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월마다 반복될 수 있다. 이와 같은 치료는 또한 다양한 약량으로 이루어질 수 있다.
f. 다른 물질들
치료의 치료요법적 효과를 개선시키기 위해 본 발명에 다른 물질을 복합시키는 것을 고려할 수 있다. 이와 같은 추가 물질에는 세포 표면 수용체의 상형 조절에 영향을 주는 물질, GAP 졍션, 세포분열억제 및 분화 물질, 세포 흡착 저해물질 또는 세포사멸 유도물질에 과증식성 세포의 감응성을 증가시크는 물질이 포함된다. 면역조절 물질에는 종양 괴사 인자; 인터페론 알파, 베타 및 감마; IL-2 및 다른 사이토킨; F42K 및 다른 사이토킨 유사체; 또는 MIP-1, MIP-1베타, MCP-1, RANTES, 및 다른 케모킨을 포함한다. 세포 표면 수용체 또는 이의 리간드 예를 들면 Fas/Fas 리간드, DR4 또는 DR5/TRAIL와 같은 상향 조절로 과증식 세포상에 오토크린 또는 파라크린 효과를 만들어 본 발명의 세포사멸 유도 능력을 강화시키는 것도 고려할 수 있다. GAP 졍션 수를 상승시켜 세포간 시그날형성을 증가시킴으로써 인접 과증식 세포군에 항-과증식 효과를 증가시킬 수 있다. 다른 구체예에서, 세포 분열 억제 또는 분화제를 본 발명에 복합 사용하여 치료의 항-과증식 효과를 개선시킬 수 있을 것이다. 세포 흡착 저해제도 본 발명의 효과를 개선시키는데 고려할 수 있을 것이다. 세포 흡착 저해물질의 예로써 병소(focal) 흡착 카이나제(FAKs) 저해물질 및 Lovastatin이 있다. 세포사멸에 과증식 세포의 감응성을 증가시키는 다른 물질 예를 들면, 항체 c225를 본 발명에 복합 사용하여 치료 효과를 개선시킬 수 있다.
호르몬 요법을 본 발명에 복합 또는 기존에 설명된 다른 암 치료법과 복합하여 사용할 수도 있다. 호르몬을 이용하여 유방, 전립선, 난소 또는 경부 암과 같은 특정 암 치료에 사용함으로써 테스토스테론 또는 에스트로겐과 같은 특정 호르몬의 수준을 낮추거나 차단시킬 수 있다. 이와 같은 치료는 전이 위험을 감소시키는 선택 치료로 적어도 한 가지 다른 암 치료법에 복합되어 종종 사용된다.
다음의 실시예는 본 발명의 적절한 구체예를 설명하는 것이다. 당업자는 다음의 실시예에 설명된 기술들은 본 발명의 실시를 잘 하기 위해 발명자에 의해 발견된 기술이며, 실행시에 적절한 방식으로 구성될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 그러나, 당업자는 본 발명의 설명을 근거하여, 여기에서 설명되는 특정 구체예에 많은 변화가 있을 수 있으며, 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 유사 또는 비슷한 결과를 얻을 수 있다는 것을 인지할 것이다.
실시예 1
FUS1는 사람 염색체 3p21.3 부분에서 확인된 신규한 종양 억제물질 유전자 (TSG)로써 많은 사람 암에서 빈번하게 변경 또는 결손되며 Apaf1-연합된 세포사멸 경로에 주요 중개물질이며, in vitro 및 in vivo에서 강력한 종양 억제물질이다. FUS1 단백질의 발현 상실 및 해독후 변형 결손이 대부분 NSCLC 및 거의 모든 SCLC에서 발견되었다. 3p21.3-결손 인체 폐 암세포의 아데노바이러스 벡터 또는 DOTAP:콜레스테롤 나노입자 중개된 유전자 전달에 의한 wt-FUS1 기능 복원으로 in vitro 및 in vivo에서 세포사멸 유도 및 세포 역학 변경에 의해 이들 종양 세포들의 생존을 저해한다. 이와 같은 연구에서, 발명자들은 Fus1 단백질의 컴퓨터를 이용한 구조 분석을 하였으며, Fus1 단백질 서열에서 몇 가지 강력학 PKC 활성/상호작용 부위 및 카이나제 고정 단백질(AKAP) 상호작용 모티프를 발견하였다. 이들 기능적 도메인 예측에 근거하여 발명자들은 wt-Fus1 단백질 서열에서 직접 유도한 펩티드 군을 개발하였는데, wt-Fus1 아미노산 서열(wt-FP) 또는 기능적 돌연변이체 (mt-FPs)를 포함한다. 돌연변이체 Fus1 단백질중 하나에서 결손된 부분으로부터 유도된 wt-FP가 일부 폐암세포주에서 감지되었으며, 잠재적인 AKAP 시그날생성/상호작용 서열 모티프 연구를 포함한다. 생체 기능적인 주요 소수성 미소환경(micro-environment)을 변경시키기 위해 몇 가지 매우 소수성이 큰 아미노산 잔기를 친수성 잔기로 치환한 이상 기능(dysfunctional) mt-FPs를 wt-FP 활성 조절물질로 이용할 수 있다. 18-C 스테아레이트 포화된 지방산 쇄를 각 펩티드의 N-말단에 추가하여 세포를 침투성으로 하며 정상 세포에서 발견되는 고유 미이스토이로하된 wt-FUS1 단백질의 결합(integrity) 기능을 유지시킨다.
발명자들은 in vitro에서 wt-FP의 생물학적 기능을 평가하며, 스테아레이트-wt-FP(st-wt-FP)가 강력한 단백질 티로신 카이나제(PTK) 저해물질로 기능을 하며 몇가지 주요 발암성 PTKs, 예를 들면 NSCLC 및 SCLC 세포에서 EGFR, PDGFR, c-Kit, c-Abl, Erk 활성에 저해 효과를 발휘한다. st-wt-FP 러치된 폐암 세포에서 종양 세포 생장의 상당한 저해효과 및 세포사멸 유도가 확인되었는데, 동일한 농도에서 기준 펩티드로 처리된 세포와 비교하여,IC50 값이 5-20M을 가진다. 발명자들은 제휘티니브 및 Gleevec-감응성 그리고 저항성 NSCLC 및 SCLC 세포에서 화학요법적 저항성을 극복하기 위해 제휘티니브 및 Gleevec 와 같은 PTK 저해물질의 화학요법적 능력을 강화시키는 조절물질로 wt-FP을 이용하는 것에 대해 연구하였다. 발명자들은 wt-FUS1처리가 제휘티니브 또는 Gleevec 처리에 대한 반응에 상당히 민감한 것을 확인하였다. 상당한 생장 저해 및 세포사멸가 wt-FP 처리된 SCLC 세포에서 관찰되었다. 단독 처리보다는 wt-FP와 Gleevec의 복합 처리된 Gleevec 저항성 H69R 및 N417 세포에서 상당한 생장 저해가 감지되었다. 포스포릴화된 c-Abl 및 c-Kit 단백질의 활성이 wt-FP 단독으로 또는 Gleevec와 복합하여 사용된 SCLC 세포에서 상당히 저해되었는데, 이는 면역침전된 포스포 c-Abl 또는 phospho-c-Kit 단백질을 이용하여 면역-블랏 분석 및 활성 검사를 통하여 확인할 수 있다.
발명자들은 in vitro 및 in vivo에서 치료 펩티드의 운반을 위해 FP와 다른 비-특이적 제어 펩티드(NSP)를 DOTAP 또는 DOTAP:콜레스테롤 나노입자와 복합시켜 FP-나노입자를 준비하는 방법 및 프로토콜을 개발하였다. 펩티드의 세포 취입은 처리안된 세포의 것과 비교하였을 때, FP-나노입자 처리된 세포에서 급격히 증가되고, 이는 형광 라벨된 펩티드를 이용하여 형광 영상 분석으로 설명된다. 복합안된 wt-FP, NSP 또는 NSP-나노입자 기준으로 처리된 또는 처리안된 것과 비교하였을 때 wt-FP-나노입자로 처리된 NSCLC 세포에서 세포사멸가 상당히 유도되었다는 것을 볼 수 있다.
결과에서 in vitro 및 in vivo에서 NSCL 및 SCLC 상에 FP-나노입자의 치료 효과를 설명하고, 폐암 및 다른 인체 암의 효과적인 치료를 위한 FP-나노입자 단복으로 또는 다른 화학요법제와 복합하여 전신 투여 응용과 연루된다.
결과
1. FUS1 펩티드 고안 및 합성
Fus1 단백질의 컴퓨터 지원을 받은 구조 분석에서 몇가지 잠재적인 PKC 활성화/상호작용 부위 그리고 Fus1 단백질 서열에서 카이나제 고정(anchoring) 단백질 (AKAP)-상호작용 모티프 서열을 발견하였다(도 1에 표시함). Scansite 프로그램 (Obenauer et al ., 2003) 및 다른 서열 분석 프로그램(scansite.mit.edu 사이트 참고) 및 ExPASy Proteomics Server, (us.expasy.org)를 이용하여 분석하였다. 이와 같은 기능적 도메인 예측에 근거하여, 발명자는 wt-Fus 1 단백질 서열로부터 바로 유도한 일군의 펩티드를 준비하는데, 이들 펩티드에는 wt-Fus1 아미노산 서열(wt-FP) 또는 기능적 돌연변이체(mt-FPs)를 포함한다. 18-C 스테아레이트 포화 지방산 쇄를 각 펩티드의 N-말단에 추가하여 세포를 침투성으로 만들고 정상 세포에서 발견되는 고유의 미리스토일화된(14-C 포화 지방산) wt-FUS1 단백질의 기능적 통합성을 유지하게 한다. 스테아레이트 측쇄는 미리스테이트가 wt-FUS1 종양 억제 활 성을 주기 때문에 티로신 카이나제 활성 저해에 생물학적 활성에 필수적이다.
FUS1 펩티드("FP")는 University of Texas M.D. Anderson Cancer Center에서 Peptide Synthesis Core에 의해 Rainin Symphony Quartet 자동화 펩티드 합성기상에서 CLEAR 수지를 서포트로 이용하고, HBTU-HOBT를 결합 시약으로 이용하여 합성하였다. 각 결합 단계는 3 시간이며, 5배 과량의 시약으로 2회 반복하였다. CF3CO2H-아니졸 및 물(95%-2.5%-2.5%) 칵테일을 이용하여 3시간 동안 절단(cleavage)하였다. 정제안된 펩티드는 40분간 물에서 0-70% 아세토니트릴 선형 농도차를 이용하여 RP-HPLC로 정제하였다. 각 용매에는 0.1% 트리플로오르아세트산이 포함된다.
5배 과량의 시약으로 아미노산 결합시키는 동일한 과정을 이용하여 스테아르산으로 콘쥬게이트을 실행하였다. 시약을 더 잘 혼합하기 위해 쉐이커를 이용한다. 절단 조건은 FP의 것과 동일하다. 정제안된 스테아레이트-FP는 Vydac 절단 준비된 디페닐 컬럼(RP 219TP510)을 이용하여 RP-HPLC로 정제하였다.
발명자들은 돌연변이 Fus1 단백질중 하나에서 결손된 부분으로부터 유도된 wt-FP가 일부 폐암 세포주에서 감지되고, 잠재적인 단백질 카이나제(PKA, PKC, 단백질 티로신 카이나제) 시그날생성/상호작용 서열 모티프를 포함하는 것을 발견하였다. 생체 기능적인 주요 소수성 미소환경(micro-environment)을 변경시키기 위해 몇 가지 매우 소수성이 큰 아미노산 잔기를 친수성 잔기로 치환한 이상 기능(dysfunctional) mt-FPs를 wt-FP 활성 조절물질로 이용할 수 있도록 고안하나(도 2), 그러나, 이들 펩티드의 극성(polarity)은 거의 변화되지 않으며, 이는 생리학 적 조건하에 유사한 용해도 및 접근성을 보증한다(도3). 18-C 스테아레이트 포화 지방산 쇄를 각 펩티드의 N-말단에 추가하여 세포를 침투성으로 만들고 정상 세포에서 발견되는 고유의 미리스토일화된(14-C 포화 지방산) wt-FUS1 단백질의 기능적 통합성을 유지하게 한다(도1). 단백질 카이나제 활성에 효과를 보이지 않는 비-특이성 기준 펩티드 (NSP)도 합성하여 기준으로 이용한다(도1, AKAP-NSP). 미리스테이트-펩티드는 스테아레이트-펩티드와의 비교를 위해 합성하였다.
2. DOTAP : Chol -복합된 FUS1 펩티드 나노입자의 합성 및 준비.
DOTAP:콜레스테롤 ("DC") 나노입자(50 내지 100nm 크기)를 설명된 것과 같이 (Templeton, 1997) 합성한다. 간단하게 설명하면, DOTAP 및 콜레스테롤은 클로로포름에서 1:1 비율(20M DOTAP 및 20M 콜레스테롤)로 혼합하고, 얼음 냉각 회전 기화기에서 기화시킨다. 생성된 혼합물을 5% 덱스트로즈에서 재현탁시키고, 55oC에서 펄스 소니케이트시키고, 동결건조시켰다. 동결건조된 산물을 5% 덱스트로즈에 용해시키고 크기가 감소되는(1.0, 0.45, 0.2, 0.1 m) 미니-압출기(Avanti Lipids, Al)를 통하여 압출시켜 평균 입자 크기를 50 내지 100 nm. 콜레스테롤이 없는 DOTAP를 유사하게 준비하여 in vitro에서 전이감염제로 사용하고, 그 이유는 DC에 의해 중개되는 전이감염이 in vitro 에서는 효과가 없으며, DOTAP가 in vitro 전이감염에 적절하다는 것이 공지되어 있기 때문이다. 합성된 나노입자는 4℃에 보관하고, DNA-나노복합체를 만드는데 이용한다.
DC - DNA 나노입자: 유전자 발현 플라스미드 DNA를 포함하는 나노복합체를 만 들기 위해, 150μg 플라스미드 DNA를 300㎕ 용적에서 20mM DOTAP:Chol 나노입자를 혼합하여 최종 농도가 150g DNA 및 4 mM 나노입자가 되도록 한다. DNA-나노복합체의 평균 입자 크기는 N4 입자 크기 분석기(Coulter, Miami, FL)를 이용하여 +45mV 양전하로 측정하였을 때 300 내지 325nm 범위가 된다.
DC -펩티드 나노입자: 펩티드-나노입자를 준비하기 위해, 20g 펩티드를 100ℓ D5W에 희석시키고, 동량의 희석된 DOTAP:콜레스테롤(DC) 또는 DOTAP(D)(40ℓ 20mM DC 또는 D로 희석하여 전체 용적이 100ℓ D5W이 되도록 함)으로 부드럽게 혼합하고, 이렇게 되면 최종 농도가 100mg/mL 펩티드 및 4mM DC 또는 D가 된다. 조제물은 DC 또는 D에 대한 펩티드 비율을 다양하게 하여 최적화시킨다. 펩티드-나노입자의 구조는 도 4와 5에서 설명한다. 생성된 펩티드-나노입자는 평균 크기가 100-200nm이고, 양전하 +50mV을 가진다(N4 Plus SubmicronParticle Sizer, N4 입자 크기 분석기, Delsa 440SX Zeta Potential Analyzer(Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA)를 각각 이용한다).
형광 염료로 펩티드 라벨링 : 단백질-형광 라벨링 키트(Molecular Probe, Eugene, OR)를 이용하여 제조업자의 지시에 따라 펩티드에 Alex Fluor 555 (Cy3-NHS 에스테르, 오렌지-레드) 형광을 라벨시킨다. Cy3-라벨된 펩티드를 이용하여 in vitro 및 in vivo에서 형광 영상 분석을 통하여 펩티드-나노입자의 세포내 취입 및 생체 분포를 모니터한다. 간단하게 설명하면, 약 500mg 펩티드를 100㎖ 0.1M 중탄산나트륨(pH 8.3) 완충액(최종 농도가 5mg 펩티드/㎖)에 용해시킨다. Cy3-숙시니미딜 에스테르(Cy3-NHS)를 DMSO에 용해시켜 최종 농도가 10mg/㎖이 되게 한다. 100㎖ 펩티드 용액과 10㎖ Cy3-NHS 용액을 혼합하고 혼합물을 실온에서 1시간 또는 (4℃에서 하룻밤) 회전시키면서 배양한다. 콘쥬게이트된 산물을 Sephadex G-25 컬럼을 통하여 정제하고, 라벨링 효과는 OD를 280nm 및 555nm에서 측정하고, 제조업자서 제시하는 식에 따라 계산한다.
펩티드에 초상자성 이산화철 ( SPIO ) 나노입자 콘쥬게이트 :
발명자는 NHS 에스테르-아민 반응을 이용하여 펩티드에 직접 덱스트란 피복된 SPIO 나노입자를 콘쥬게이트시키고, SP-나노입자를 DC에 포집시켰다.
FP하이드라존 유도체: FP의 C말단에 카르복실기를 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) 하이드로클로라이드(Sigma, St. Louis, MO)로 활성화시키고, 그 다음 3-(2-피리디닐디티오)프로파논산 하이드라지드(PPA)(ProChem, Inc., Rockford, IL)로 3일간 반응시켜, 공지된 방법에 따라 >90% FP-하이드라존 산물을 수득한다. 반응 과정은 Zorbax RxC18 컬럼(25cm×4.6mm), 10mM (NH4)(H2PO4)/CH3OHH2O(7:3) isochratic 농도차, pH 4.7, 유속 1㎖/min을 이용하여 HPLC한다. FP하이드라진, 자유 FP, 하이드라지드는 UV(280 nm)로 감지한다. Aldrich.
FP 및 SPIO 유도체의 합성: 이형이가기능성 링커를 이용하여 두단계 과정을 통하여 FP를 FP에 콘쥬게이트시킨다. 우선, 덱스트란-피복된 SPIO 입자 Feridex I.V. 또는 Combidex(Advanced Magneticss Inc., Cambridge, MA) 또는 Endorem (Guerbet, Aulnaysous-Bois, France)는 에피클로로하이드린과 교차결합시키고, 그 다음 암모니아와 반응시켜, 덱스트란 코팅상에 아미노기를 생성시키고, SMCC으로 변형시겨 말레이미드 모이어티를 제공한다(SPIO-SMCC). 둘째, SPIOSMCC의 말레이미드 기를 TCFP에 의해 이황화결합을 환원시킨 후 수득된 FP 유도체의 티올기과 반응시켜 FP 유도체를 SPIOSMCC에 콘쥬게이트시킨다. 생성된 FP-SPIO 콘쥬게이tus 비율은 UV가시광선 스펙트로메터로 측정하고, G-25 겔 여과 컬럼에서 크기 압출 크로마토그래피를 통하여 정제한다. 정제된 콘쥬게이트는 농축시키고, -20℃에서 사용할 때 까지 보관한다. 약물 유도체를 유사한 화학물질로 SPIO에 콘쥬게이트할 것이다. SPIO의 형광-라벨을 위해, 상기 SPIO 덱스트란 유도체의 1차 아민을 DTPA 이소티오시아네이트 켈레이터(I-24221, Molecular Probes)와 결합시켜 당양한 금속이온에 대한 고친화성 결합 부위를 도입시키고, Fluo-3 칼륨(Orange-red) (F-3715, Molecular Probes)으로 라벨시킨다. 형광-라벨된 FP-SPIO 나노입자를 이용하여 공촛점 형광 영상 또는 FACS 분석으로 세포 취입, 세포내 트라피클링(intracellular trafficking) 그리고 in vitro 및 in vivo에서 생체 분포를 모니터할 수 있다.
DC-SP-나노입자(DC-SPN)는 in vivo에서 MR 조영제로 SPIP를 이용하여 MR로 비-침습성 영상 및 치료 펩티드의 전신 운반에 이용한다(도5).
3. Fus1 -유도된 펩티드 및 Gleevec 의 NSCLC 및 SCLC 세포에서 종양 세포 생장 저해
세포주.
발명자는 CDDP, 탁솔, 젬씨타블린(Gemcitabline), 제휘티니브(Gefitinib), Gleevec, 및 다른 PTK 저해물질과 같은 다양한 화학요법 약물에 감응성이 다양한 NSCLN 및 SCLC 세포주를 모았다. 이들 세포주들은 자연상태의 약물 감응성 또는 저항성을 가지거나 또는 감응성 부모로부터 특정 약물에 대해 선별하여 확립된 것이다. 각 약물에 대한 IC50 값, 3p21.3 유전자와 같은 주요 TSGs, p53, EGFR과 같은 온코젠 PTKs의 유전적 그리고 발현 상태 뿐만 아니라 이들 세포에서 in vivo (생쥐내) 종양형성능을 결정하였다. FUS1 또는 FP와 PTK 저해물질 예를 들면 Gefitinib(AstraZeneca)의 종양 세포 생장, 세포사멸에서 PI3K/Akt 저해를 위한 EGFR 및 LY294002 (ComChem)의 차단에 복합 효과를 평가하기 위해, 4개의 사람 Gefitinib-저항성 NSCLC 세포주 H1299, H460, H358, A549와 두개의 Gefitinib-감응성 NSCLC 세포주 HCC827 (EGFR의 기능 돌연변이를 얻은) 및 H1817(EGFR의 활성화된 증폭을 가지는)을 in vitro 에서 이용할 것이다. 사람 SCLC 세포주 gleevec-감응성 H69 및 H128, gleevec-저항성 H69R 및 N417를 이용하여 Fus1 펩티드, FP-나노입자 단독의 또는 gleevec 및 다른 소분자 화학요법제와 복합 치료 효과를 평가한다.
wt - FP 로 처리하여 종양 세포 생장의 저해.
wt-FP의 생물학적 활성을 평가하기 위해, 발명자들은 XTT 검사를 통하여 스테아레이트-wt-FP를 직접 사용함으로써 종양 세포 생장에 wt-FP 효과를 분석하였다. 발명자들은 기능적 돌연변이 Fus1 펩티드 mt-FP2 및 mt-FP5, 그리고 비-특이적 제어 펩티드 (NSP)와 비교하였을 때, wt-FP가 NSCLC H1299 및 A549 세포에 상당한 생장 저해 효과를 나타낸다는 것을 확인하였다(도6). 발명자들은 또한 NSCLC H1299 (IC50 = 12.7M) 및 A549(IC50 = 6.9M)에서 st-wt-FP의 IC50 값 뿐만 아니라 추가 생장 인자없이 생장할 수 있는 정상 기관지 상피 CCD16(IC50 = 60 M) 세포에서 IC50 값을 측정하였다(도7). 모든 다른 NSCLC 세포에서 IC80 약량으로 st-wt-FP로 처리된 정상 세포에서 심각한 세포 독성이 관찰되지 않았으며, 이는 치료요법적 FP의 종양 세포 선택성을 나타내는 것이다. 유사하게, mt-FP-처리된 또는 처리안된 세포 기준과 비교하였을 때, 종양 세포 생장에서의 두드러진 저해(도 8A 및 B), 세포사멸의 유도 강화(도 8C 및 D)가 wt-FP-처리된 SCLC H128 (도 8A 및 C) 및 H146 세포(도8B and D)에서 관찰되었다. 이와 같은 예비 결과에서 wt-FP의 폐 암에서의 항종양 치료제로의 이용 가능성을 설명한다.
wt - FP 와 소분자 약물 PTK 저해물질 복합 처리에 의해 종양 세포 생장에서 강화된 저해 효과.
FUS1-나노입자 또는 Fus1-펩티드와 함께 PTK 저해물질의 다양한 복합에 의한 효과를 약효등효도(isobologram) 모델링 및 우리 실험실에서 개발한 통계 방법을 이용하여 in vitro에서 정량적 그리고 통계학적으로 분석하였다. Fus1 및 PTK 저해물질의 상호 작용은 시너지 효과, 추가 효과 그리고 길항 효과에 대해 특징화시켰다. 세포를 최대 전이감염 효과가 있을 것으로 보이는 고정된 약량에서 또는 다양한 약량의 PTK저해물질과 복합된 다양한 농도의 FP에서 처리한 hTMC-FUS1-나노입자로 전이감염시켰다. 세포 생장에서 효과는 예정된 시간대에서 XTT 검사로 측정하였다. 종양 세포 생장상에 복합 요법제의 효과는 상응하는 약효등효도상에 관찰된 실험 데이터를 플롯팅하여 정량적으로 그리고 통계학적으로 분석하였다. Wilcoxon의 signed-ranks 테스트를 실행하여 추가에 대한 예상 최저 또는 최대치에서 수득된 데이터의 평균 값을 비교하였다. 관찰된 데이터의 평균 값이 예상 최대 값과 같거나 동일하나 예상 최저 값과 같거나 더 큰 경우에 복합 효과는 추가적인 것으로 간주한다. 관측된 데이터의 평균 값이 예상 최저 값보다 작은 경우에, 복합 효과는 시너지인 것으로 간주하고, 예상 최대 값보다 큰 경우에 길항성인 것으로 간주하며, P #0.05는 유의성이 있는 것으로 본다. 모든 통계학적 분석은 Statistica software(StatSoft Inc., Tulsa, Oklahoma)를 이용한다. in vitro 실험에서 찾은 발견으로 FUS1 및 PTK 저해물질 복합 치료에 의한 공조작용의 통계학적으로 테스트된 정량적 가치를 제공하고, 이는 우리의 예비임상적 그리고 임상적 시도에서 복합 치료 디자인을 안내할 데이터베이스로 작용한다.
폐 암세포에서 약물 저항성을 극복하고 화학요법 능력을 강화시키기 위해 화학요법 약물의 조절 물질로써 wt-FUS1 유전자 산물 또는 유도된 FUS1 펩티드의 능력을 조사하기 위해, 발명자는 제휘티니브-감응성 및 저항성 NSCLC 세포에서 종양 세포 생장에 wt-FP + Gefitinib의 복합 치료의 치료요법적 효과를 평가하였다. 발명자들은 3p-결손 및 Gefitinib-저항성 NSCLC H1299, H358, H460 세포에서 wt-FP의 재활성화로 이들 세포의 Gefitinib 처리 반응이 상당히 자극되었으며, 이는 종양 세포 생장에서의 추가적 저해 효과이상의 것으로 설명된다(도 9A). EGFR 발현에서 두드러진 저해가 wt-FP 및 Gefitinib 공동-처리된 H322 및 H460 세포에서 감지되었는데, 이는 Western-blot 분석으로 설명된다(도 9B). 이들 예비 결과에서, wt-FP 는 화학요법제, 예를 들면 DNA 손상 물질 시스플라틴 및 PTK EGFR 저해물질 제휘티 니브 등에 종양 세포의 감응성을 조절하는데 중요한 역할을 하며, FUS1-나노입자-중개된 분자 치료의 복합 처리가 폐 암의 효과적인 치료 전략이 될 수 있다는 것을 말한다.
또한, 발명자는 비-특이적 펩티드(NSP) 또는 mt-FP 기준으로 처리한 것과 비교하였을 때 48시간 및 96시간 동안 wt-FP로 공동 처리하면 Gleevec 처리에 대해 SCLC Gleevec-감응성 H69-S (도 10) 및 Gleevec-저항성 H69-R (도 10) 세포의 감응성이 강화된다는 것을 감지하였다(도 10). 이들 예비 발견에서 Fus1 종양 억제물질 단백질 활성중에 하나는 PTK 기능을 간섭하는 것이라는 것을 말한다. PTK 저해물질 Gleveec + FUS1-나노입자 또는 Fus1-유도된 펩티드의 복합 처리는 폐암에서 Gleveec의 항암 효과를 강화시키고, Gleveec-저항성을 극복하는 유용한 전략이 될 수 있다.
4. NSCLC 및 SCLC 세포에서 Fus1 -펩티드에 의한 PTK 활성 저해.
단백질 티로신 카이나제(PTK)는 세포 증식, 분화, 대사 및 세포사멸을 조절하는 시그날 형질도입 경로에 주요한 역할을 수행한다. PTK에 의한 단백질의 포스포릴화 반응은 이와 같은 생물학적 지전 제어에 필수적이기 때문에 이들 경로에 결함으로 암을 포함하는 여러 질환이 발생할 수 있다. 세포 조절에 이들 효소의 중요한 측면은 바이러스 온코젠 산물에 상응하는 다수의 카이나제가 확인되었다는 것으로 강조된다. 단백질 티로신 카이나제 활성은 종종 막 수용체 단백질 티로신 카이나제(예를 들면, EGF-, PDGF-, CFS-, IGF-1 및 인슐린 수용체) 그리고 가용성 비-수용체 티로신 카이나제(예를 들면 p60c-Src, yes, lck, lyn, fyn)와 연관된다. PTK 활성을 검사하면 단백질 티로신 카이나제의 특징, 이들의 생물학적 기능 확인 및 특정 PTK 저해물질 계발에 도움이 된다.
발명자들은 티로신 카이나제 활성 검사 키트(CHEMICON, Temecula, CA)를 이용하여 제조업자의 지시에 따라 FP-처리된 NSCLC H1299 및 A549 세포에서 c-Abl 티로신 카이나제 활성을 분석하였다. 간단하게 설명하면, 1 x107 NSCLC H1299 또는 A549 세포를 5M wt-FP 또는 mut-FP으로 6시간 처리하거나 또는 10g wt-FUS1 발현 플라스미드 DNA-DOTAP 나노입자로 24hr 동안 형질감염시켰다. 세포 용해물질을 RIPA 완충액(50mM Tris-HCl(pH 8.0), 150mM 염화나트륨, 1%(w/v) 데옥시콜레이트 나트륨, 1mM DTT, 1%(v/v) NP-40, 0.1%(w/v) SDS, 완전한 프로테아제 저해물질포함)(Roche)에서 준비한다. 1mg 단백질 용해물을 이용하여 생쥐 항-c-Abl 항체(BD Bioscience Pharmingen, San Diego, CA) 단백질로 면역침전(IP)를 실행하였다. 면역-침전된 복합체를 50l PTK 검사 완충액(5mM ATP, 50mM MgCl2/TBS(25mM Tris, 0.15 M NaCl) pH 7.2, 1mM DTT, 0.01% 티메로잘, 완전한 프로테아제 저해물질 포함)에 재현탁시켰다. c-Abl IP 복합체는 합성 바이오티닐화된 기질. 폴리[Glu:Tyr, 4:1]과 배양시키는데, 여기에는 다중 티로신 잔기가 포함되며, 광범위의 PTK와 45분간 30℃에서 포스포릴화될 수 있다. 500mM EDTA를 첨가하여 반응을 중단시킨다. 포스포릴화된 그리고 데포스포릴화된 기질을 스트렙타아비딘 피복된 판에 결합시켜 고정시킨다. 포스포릴화된 기질 분취물은 HRP에 콘쥬게이트된 포스포티로신 단클론 항체 및 크로마제닉(chromagenic) 기질 반응을 이용하여 눈으로 확인하였다. 티로 신 카이나제 기질에 결합된 포스페이트의 양은 인지질 표준 곡선을 이용하여 결정할 수 있다. A549 세포에서 두드러진 c-Abl 활성 저해가 감지되었는데, 이는 처리안된 기준 또는 mut-FP 또는 Gleevec으로 처리된 것과 비교하였을 때(도 11), wt-FP으로 처리 또는 wt-FUS1-나노입자로 처리된 경우에 활성화된(포스포릴화된) c-Abl 단백질 수준이 높다는 것을 말해준다(데이타 나타내지 않음). H1299 세포에서 wt-FP로 처리한 경우에도 c-Abl 단백질의 활성이 저해되었고, 이는 A549 세포에서 보다 c-Abl 단백질 발현 수준이 더 낮았다.
유사하게, 발명자는 SCLC N417에서 단클론성 항-phopho-abl(Tyr-323-p) 항체를 이용하여 최적의 티로신 카이나제 펩티드 기질의 티로신 포스포릴화 반응으로 측정하였을 때, wt-FP 펩티드에 의한 처리 및 wt-Fus1 단백질의 외생적 발현 모두 c-abl 티로신 카이나제 활성을 강력하게 저해한다는 것을 관찰하였다(도 12). 또한, c-abl 및 c-kit을 포함하는 몇 가지 PTK의 활성에 wt-FP의 저해 효과가 48시간 동안 wt-FP 단독 또는 Gleevec 복합 처리된(wt-FP + G) SCLC N417 세포 및 H69 세포에서 감지되었는데, 이는 anti-c-abl 또는 anti-c-kit 항체를 이용한 면역침전(IP) 또는 anti-phospho-Tyr (pY20) 항체를 이용한 면역-블랏(IB)를 이용한 분석에서 확인할 수 있다.
또한, Gefitinib-감응성 NCC827 및 H1819 세포에서 FUS1-나노입자 또는 wt-FP 단독 또는 gefitinib와 복합 처리된 세포에서 포스포릴화된 EGFR, ERK, Akt 단백질의 저해 효과가 감지되었는데, 이는 phospho-EGFR, ERK 또는 Akt-특이항체를 이용한 웨스턴 블럿 분석으로 설명된다. 그러나, 전체 PTK 단백질 수준에서는 효과가 감지되지 않아 FP가 활성화된 온코젠 TPK을 특이적으로 저해하여, 종양 세포 증식을 저해하고 EGFR의 돌연변이 또는 비정상적인 증식으로 인하여 매우 활성화된 PTK 활성을 가진 이들 세포에서 세포사멸을 유도하는 것으로 보인다.
5. in vitro 에서 펩티드-나노입자의 강화된 세포 취입
발명자는 NSCLC H1299 세포에서 Cy3-플로오르 라벨된 펩티드를 이용하여 형광 영상 분석으로 복합안된 펩티드와 펩티드-나노입자의 세포 취입을 비교하였다. st-P-처리된 그러나 비(non)-스테아레이트 펩티드-처리된 세포에서 1주일간 세포 취입(허구(faint) 형광)을 관찰하였다. 동일한 농도의 펩티드를 이용하여 복합안된 펩티드로 처리된 세포와 비교하였을 때 펩티드 및 스테아레이트-펩티드(st-p)-나노입자 처리된 세포에서 세포 취입이 급격히 증가되었고, 이는 펩티드-나노입자에 의해 중개되는 세포 취입 효율이 상당히 높다는 것을 말한다.
6. H1299 세포에서 FP -나노입자로 처리하면 종양 세포 생장이 저해됨.
발명자는 Fus1 펩티드 (FP)-나노입자를 이용하여 NSCLC H1299 세포에서 종양 세포 생장에 효과를 평가하였다. 기준으로 처리된 것과 비교하여 FP-나노입자 처리된 세포에서 종양 세포 생장이 상당히 저해된 것을 관찰하였다. 낮은 약량의 펩티드(IC20 수준의 FP)로 처리된 것과 비교하였을 때 FP-나노입자-처리된 세포에서 종양 세포 생장 저해가 상당히 강화된 것을 볼 수 있다.
7. FP-나노입자로 in vitro에서 처리하여 세포사멸 유도
발명자는 TUNEL 반응으로 in situ 세포사멸 분석을 이용하여 형광 영상 및 FACS 분석으로 H1299 세포에서 FP 단독 또는 FP-나노입자로 처리하여 세포사멸의 유도를 평가하였다. 비특이적 mt-FP-나노입자 기준으로 처리된 세포와 비교하였을 때 FP-나노입자 처리된 세포에서 세포사멸가 상당히 유도되었다는 것이 감지되었다(도 14). in situ TUNEL 착색(2펩티드, 72hr)으로 형광 영상 분석에 의해 FP-나노입자-처리된 H1299 세포에서 세포사멸가 유도된 것을 확인하였다. 이와 같은 결과는 in vitro에서 FP-나노입자의 생물학적 효과를 분명하게 설명한다. 전신 투여에 의한 세포 취입 평가 및 치료 효과 평가 실험을 사람의 종양을 가지는 생쥐에서 실시한다.
8. DC -나노입자에서 치료 유전자 및 펩티드의 포집화 .
발명자는 DC 또는 D 나노입자에 치료 또는 리포터 유전자 발현 플라스미드 DNA 또는 펩티드를 포집시켜 이들 나노입자를 이용한 다중 치료요법적 물질의 운반에 대한 가능성 및 능력을 조사하였다. 발명자는 GFP 발현 pDNA 및 Cy3-라벨된 FP 펩티드(GFP-FP-나노입자로 칭함)를 모두 포집시켰다. GFP 발현(Green fluorescence) 및 펩티드 취입(Orange-red)은 동일한 세포에서 동시에 감지할 수 있는데, 이는 DNA 및 펩티드 모두 단일 나노입자에 의해 효과적으로 운반되었다는 것을 나타낸다. GFP DNA/NSP 펩티드-나노입자가 H1299 세포에 취입되는 것을 2 hr 및 24 시간에 측정한다(NSP 최종 농도 = 4 ).
실시예 2
FUS1는 폐 암에 연관된 종양 억제물질이다. 발명자는 Fus1 펩티드가 c-Abl 티로신 카이나제를 in vitro 상태에서 저해한다는 것을 발견하였다. 흥이로운 것은 저해 서열을 일부 폐암 세포주에서 감지되는 돌연변이 Fus1 단백질중의 한 부분에서 결손된 부분으로부터 유도하였다는 것이다. 중요하게, 이 펩티드의 스테아린 산 변형태가 저해에 필요하다. 이와 같은 스테아린산-fus1 펩티드는 활성화된 c-Abl에 의해 온코젠 형질변환된 섬유아세포에서 병소(foci) 형성을 저해한다. 이와 같은 발견으로 Fus1 종양 억제물질 단백질의 활성중에 하나가 c-Abl 티로신 카이나제 기능을 간섭하는 것이라고 본다.
소세포 폐암(SCLC) 및 비-소세포 폐암(NSCLC) 모두에서 염색체 arm 3-p의 한 개 대립형질이 빈번히 상실되는 것은 이 염색체 부분에 종양 억제물질(TSG)이 존재 한다는 강력한 증거가 된다. 이들 TSG 후보물질 중 하나인 FUS1은 임의 공지된 유전자와 상동성을 나타내지 않았다. 폐암에는 소수의 돌연변이만 발견되었고, 폐암에서 mRNA 수준에서 통상 발현된다. 몇 가지 NSCLC는 동일한 넌센스(nonsense) 돌연변이를 가지는데, 이는 변종 mRNA 스플라이싱(splicing)으로부터 발생된다. 이와 같은 변종형은 FUS1의 C-말단 부근에 서열이 부족하여 와일드 타입 단백질의 110개 아미노산과 비교하였을 때 약 82개의 절두형(truncated) 단백질이 된다(Kondo et al ., 2001).
c-Abl 티로신 카이나제는 모든 조직에 산발적으로 발현된다. 레트로바이러스 Gag 서열 및 Bcr 서열과 융합되었을 때 온코겐 단백질이 된다(Ben-Neriah et al ., 1986). c-ABL 유전자는 티로신 카이나제를 인코드한다. c-ABL 유전자의 일부는 복제 결함 생쥐 레트로바이러스-Abelson 루키미아(leukemia) 바이러스라고 부름- 에 의해 수득된다. 정상적인 c-Abl의 티로신 카이나제 활성은 핵(Wang, 2000) 및 세포질(Butturini et al ., 1996)에 존재하는 저해물질에 의해 잘 조절된다. c-Abl 단백질은 핵 및 세포질 모두에서 발견된다. 핵 c-Abl 기능은 DNA 손상에 대한 반응과 연관된다(Wang, 2000). c-Abl의 세포질 기능은 세포 이동 및 세포 흡착 기능과 연관된다. 중요한 것은, 세포질 c-Abl 단백질의 활성화가 온코겐 활성화로 이어진다. 예를 들면, Gag-Abl 단백질은 Abelson 루키미아(leukemia) 바이러스에 감염된 생쥐에서 백혈병을 유발하는 것에 연관된 강력한 온코단백질이다. 또한, Bcr-Abl 온코단백질은 몇 가지 사람 백혈병에 원인 인자다. Gag-Abl 및 Bcr-Abl는 높은 수준의 티로신 카이나제 활성을 가진다(Kloetzer et al ., 1985).
그러나, c-ABL 유전자는 다른 유형의 암과 연루되지 않았다. 흥미로운 것은 c-Abl의 주요 기질인 c-Crk의 과다 발현이 폐 선암(adenocarcinomas)에서 공격적 표현형과 연관이 있다(Miller et al ., 2003). 또 다른 연구에서, c-Crk-ll의 면역조직학적 분석이 c-Crk-ll의 수준이 폐 및 결장 암에서 상당히 상승된 것을 알 수 있다 (Nishihara et al ., 2002). 이와 같은 발견은 종양 억제물질 단백질인 Fus1가 c-Abl를 하향 제어할 수 있다는 것을 말한다. 이와 같은 관찰은 c-Abl 경로가 특정 폐암에서 활성화될 수 있다는 것을 말한다.
방법 및 결과
c- Abl 티로신 카이나제는 Fus1 펩티드에 의해 저해된다. 발명자는 Fus1 펩티드를 이용하고, 몇 가지 검사에서 적정 기질의 포스포릴화에 의해 측정하였을 때 Abl 티로신 카이나제를 강력하게 저해한다는 것을 관찰하였다. 깊이 있는 연구에서 Fus1 펩티드는 약량 의존적인 방법으로 c-Abl를 저해한다. 시판되는 Abl에 의한 Crk 포스포릴화에 의한 Fus-1 펩티드 저해가 관찰되었고; 대조군에는 펩티드, DMSO, (DMSO + 스테아린산)이 포함된다. IC50은 30uM에서 측정하였다. 이 펩티드 는 다음의 서열을 가진다스테아린산-KLRRVHKNLIPQGIVKLDHR (SEQ ID NO:11). 발명자는 스테아린산 모이어티가 저해를 위해서 필요하나 스테아린산 자체는 저해효과가 없다는 것을 발견하였다. 비-스테아레이트 FUS1 펩티드는 시판되는 Abl에 의해 Gst-Crk 포스포릴화 반응을 저해하지 않았다.
Fus1 펩티드는 c- Abl 에 의해 Rat - 1세포에서 병소 형성을 저해한다. 발명자들은 활성화된 c-Abl 티로신 카이나제로 형질변환된 Rat-1 세포를 이용하여 병소 형성에 있어서 Fus1 펩티드의 효과를 테스트하였다. 발명자들은 스테아린산-Fus1 펩티드가 병소 형성을 차단한다는 것을 발견하였다. 스테아린산은 효과가 없었다. 흥미로운 것은, ABL 형질변환된 세포의 증식이 FUS1 펩티드에 의해 저해되지 않으며, 병소를 형성하는 온코겐 활성만 저해되었다.
사람 폐암 세포주에서 c- Abl 가 활성화된다는 증거. 발명자들은 FUS1 유전자에 변형이 있는 두 가지 폐 암 세포주를 분석하였고 이를 활성화된 c-Abl의 증거를 위해 분석하였다. 이들 실험에서, 발명자들은 사람 Abl(p6D)를 감지하는 단클론 anti-Abl 항체로 면역침전을 실행하였다. 이와 같은 단클론 항체는 아미노산 52-64를 포함하는 사람 Abl 펩티드에 대항하도록 만들었다(Sun et al ., 2001). 면역복합체는 항-포스포티로신, anti-Abl (8E9) 및 p6D 항체로 블랏팅하였다. 32D P210를 양성 기준으로 이용하고, CCD16 정상 폐 섬유아세포를 음성 기준으로 이용한다. NSCLC 세포 H1299 및 A549에서 활성 c-Abl을 보였다. 이와 같은 결과는 A549 세포주에 약 110kd의 활성화된 Abl-관련 단백질이 포함된다는 것을 보여준다. 두 가지 상이한 서열-특이적 ABL 항체, 항-Abl 8E9(SH2 도메인에 특이적) 및 p6D 항-Abl 단클론 항체로 블랏팅하여 감지하였다. 흥미로운 것은 이들 Abl-관련된 단백질이 고유 c-Abl 단백질(145 kDa)보다는 작다는 것이다. 중요한 것은 이와 같은 Abl-관련된 단백질은 항-포스포티로신으로 감지되는데, 이로써 이것이 카이나제 활성일 것이라는 것이다. 아미노 말단(p6D 항체에 의해 인지되는) 부근 서열을 포함하는 c-Abl의 짧아진 형태가 존재한다는 것은 C-말단이 절두될 수 있다는 것을 말한다. 이것은 고유 c-Abl가 C-말단 서열에 의해 악틴 필라메트와 연합되기 때문에 중요하다(Woodring et al ., 2003). 또한, 악틴 필라멘트 연합된 c-Abl는 감소된 티로신 카이나제 활성을 가지는데(Woodring et al ., J2003), 이는 악틴 필라멘트 결합이 c-Abl 티로신 카이나제를 저해한다는 것을 말한다. 따라서 c-Abl의 C-말단을 제거하는 것이 c-Abl를 활성화시키는 한 가지 방법이 될 수 있다.
도 27, 도 16, 도 17, 도 18, 도 19는 다른 실험 결과를 보여준다.
스테아레이트 Fus1 펩티드 KLRRVHKNLIPQGIVKLDHR (SEQ ID NO:11)에 의한 시판되는 c-Abl 티로신 카이나제의 저해를 설명하는 다른 실험에서, SH2 및 SH1 도메인만을 포함하는 절두형 c-Abl 티로신 카이나제(New England Bio-Labs), GST-CRK (Abl 선호 기질) 및 32P-ATP를 스테아레이트 Fus1 펩티드에 복합시켰다. 30℃에서 30분간 배양 후에, 샘플을 2x SDS 샘플 완충액으로 함께 가열하고, 8% SDS PAGE 겔상에 얹는다. 겔을 건조시키고, 포스포영상기(phosphoimager)에 노출시켰다. 라인 1은 제로 펩티드 기준이며, 라인 2-5는 10, 20, 30, 40M 펩티드를 각각 포함한다. 도 20에서는 펩티드가 GSK-CRK의 c-Abl 티오신 포스포릴화를 저해한다는 것을 보여준다. 펩티드에 의한 c-Abl 티로신 카이나제의 농도 의존성 저해를 관찰하였다. 제로 펩티드 기준, DMSO 기준, DMSO+스테아린산 기준, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55M 펩티드를 평가하였다. 도 21에서는 펩티드에 의한 c-Abl 티로신 카이나제의 선형 저해를 보여준다. 곡선은 GST-CRK 포스포릴화 저해를 나타낸다. 도 22에서는 DMSO 및 스테아닌산이 c-Abl 티로신 카이나제 활성에 영향을 주지않는다는 것을 보여준다.
다른 실험에서, 사람 폐암세포주에 Abl 관련된 티로신 포스포릴화된 단백질이 포함된다는 것을 확인하였다. Rat-1, Rat1 SH2 (활성화된 Abl 티로신 카이나제), H1299 (p53 네가티브), A549 (p53 포지티브) 사람 폐암세포주를 계면활성제 완충액에 용해시켰다. 항-Abl P6D 단클론 항체를 이용하여 Abl 단백질을 면역침전시켰다. 단백질 A Sepharose 비드를 이용하여 면역 복합체를 풀-다운(pull down)시켰다. 비드로부터 단백질을 용출시켜 SDS PAGE 겔상에 얹는다. 블랏팅 및 블록킹후에, 막은 anti-Abl 8E0(anti-Abl SH2 도메인) 항체로 처리한다. 8E9 항체, 4G10 항체, P6D 항체를 이용하여 A549세포에서 활성 Abl를 관찰하였다. 면역블랏팅은 항-포스포티로신 항체(4G10)로 실행하였다. 8E9 항체를 벗겨낸 막은 P6D anti-Abl 항체으로 다시 프로브(prob)시켰다.
추가 실험에서, c-Abl에 의해 유도된 병소 형성에 Fus1 펩티드의 효과를 연구하였다. 세포가 합류되면(병소가 형성될 때까지 이틀에 한번씩 교체한 배지와 10 M Fus1 펩티드), Rat-1 SH2 세포를 스테아레이트화된 Fus1 펩티드로 처리하였다. Rat-1 SH2 세포는 마커로써 GFP를 발현한다. 펩티드 처리된 Rat-1 SH2 세포의 그린 형광으로 형광 사진을 찍는다. 상 대비 사진을 얻는다. 처리안된 Rat-2 SH2 세포의 형광 사진을 찍고, 상 대비 사진을 만든다. (Rat-1 SH2 + M74) 및 (Rat-1 SH2 + 스테아린산)을 영상화하였다. DMSO (0.2%) 및 스테아린산(30 M)은 병소 형성에 효과가 없었다.
실시예 3
FUS1 -나노입자 및 Gefitinib 의 복합 처리에 의해 EGFR 티로신 카이나제 활성 및 NSCLC 세포 생장의 공조 저해
단백질 티로신 카이나제 저해물질(PTKIs)와 같은 “똑똑한 약물”에 의해 주요 시그날 형성 경로에 분자 변형이 특이적이고 빈번히 발생하도록 하고, 유전자 전달에 의해 종양 억제 및 세포사멸 경로에 결손 유전자 및 유전자 산물의 기능을 복원시키도록 고안된 새로운 암 치료법은 근본적인 암 치료법을 변화시키면서 폐 암 치료에 전망을 준다. FUS1는 많은 인간 암에서 변경 또는 결손된 사람 염색체 3p21.3 부분에서 확인되며, in vitro 및 in vivo에서 강력한 종양 억제물질이며, Apaf1-연합된 세포사멸 경로에 주요 중개물질로 기능을 하는 것으로 확인된 신규한 종양 억제물질 유전자(TSG)이다. FUS1-중개된 PTK 저해 및 FUS1과 PTK 및 Apaf1 단백질과의 직접적인 상호작용에 관한 우리의 최근 관찰과 함께 다른 연구에서 NSCL 환자에서 제휘티니브 반응물질에서 EGFR 유전자의 돌연변이 활성화, 세포 생존 시그날의 선택적 활성화와 프로-세포사멸 경로의 차단에 이들 돌연변이체의 역할에 대한 최근 발견으로, 발명자는 제휘티니브-감응성 및 저항성 NSCLC 세포에서 세포 생존 및 증식성 시그날생성의 비활성화와 세포사멸 경로의 활성화를 동시에 함으로써 제휘티니브의 화학요법 능력을 강화시키고, 제휘티니브 저항성을 극복하기 위한 조절물질로써 다중 기능성 FUS1의 이용 능력에 대해 조사하였다. 발명자는 3p-결손된 그리고 Gefitinib-저항성 NSCLC H1299, H358, H460 세포에서 FUS1-나노입자-중개된 유전자 전달 또는 wt-FUS1 유도된 펩티드(wt-FP)으로 처리에 의한 wt-FUS1의 재활성화는 제휘티니브 처리에 대한 이들 세포 반응을 상당히 감지하도록 한다는 것을 발견하였는데, 이는 종양 세포 생장의 추가 저해 효과 및 세포사멸의 시너지성 유도로 설명된다. FUS1-나노입자 및 매우 낮은 약량의 gefitinib( IC10수준에서)을 이용하여 공동 처리된 gefitinib-감응성 HCC827(EGFR의 활성 돌연변이를 가진) 및 H1819(EGFR의 증폭을 가지는) 세포에서 생장 저해가 강화되었다는 것을 관찰하였다. 포스포릴화된 EGFR 및 Erk 단백질 활성에 두드러진 저해가 FUS1-나노입자 또는 wt-FP 단독 또는 gefitinib와 복합 처리된 세포에서 감지되었는데, 이는 phosphor-EGFR 또는 Erk-특이적 항체를 이용한 웨스턴 블랏 분석으로 설명된다. 우리 결과에서 wt-Fus1가 PTKI와 같은 화학요법제에 종양 세포의 감응성을 조절하는데 중요한 역할을 하고, 이들 소분자 화학요법과 FUS1-나노입자-중개된 분자 요법의 복합 처리가 폐암의 효과적인 치료 전략이 될 수 있다.
실시예 4
in vitro 및 in vivo 에서 FUS1 -나노입자와 Gleevec 의 복합 처리에 의해 c- Abl 및 c- Kit 활성의 비활성화 및 SCLC 세포 생장의 저해
FUS1는 95%이상의 SCLC 세포에서 LOH를 가지는 또는 일부 SCLC에서 동종접합적으로 결손된 주요한 사람 염색체 3p21.3 부분에서 확인된 신규한 종양 억제물질 유전자이다. 테스트한 모든 SCLC 세포에서 FUS1 단백질의 발현이 상실되었고, FUS1 결손 폐 암세포에서의 wt-FUS1 비활성화는 세포사멸 유도에 의해 이들의 생장을 저해하였다. 한편, 단백질 티로신 카이나제(PTK), 예를 들면, BCR-Abl, c-Kit, PDGFR는 SCLC에서 빈번하게 변경되거나 증폭되며 중요한 치료요법적 표적이다. 소분자 약물 gleevec은 in vitro에서 c-Kit/SCF 경로를 표적화하여 SCLC 세포 생장을 저해하나 동물 모델 또는 사암의 임상 시도에서는 중요한 치료 효과를 나타내지 않는다. 발명자들은 DOTAP:Chol-복합된 FUS1-나노입자와 gleevec의 복합 치료 전략이 온코겐 PTK 시그날 행성을 비활성화시키고, 프로-세포사멸 경로를 동시에 활성화시킴으로써 SCLC 생장에서 시너지 효과의 저해를 촉진시킬 것이라고 추정한다. FUS1-나노입자 또는 wt-FUS1-유도된 펩티드(wt-FP)로 72h 처리한 그러나 FUS1 단백질 또는 펩티드의 이상 기능 돌연변이로 처리되지는 않은 SCLC H69, H128, H146, N417 세포에서 GFP-나노입자 또는 펩티드 기준으로 처리된 것과 비교하였을 때, 상당한 생장 저해 및 세포사멸가 관찰되었다. FUS1-나노입자 또는 wt-FP 복합처리된 gleevec-저항성 H69R 및 N417 세포는 단독으로 처리된 것과 비교하였을 때 생정 저해가 강화된 것으로 감지되었다. FUS1-나노입자 또는 wt-FP 단독으로 또는 gleevec와 복합 처리된 H69 및 N417 세포에서 포스포릴화된 c-Abl 및 c-Kit 단백질의 활성이 상당히 저해되었는데, 이는 면역-침전된 phosho-c-Abl 또는 phospho-c-Kit를 이용한 면역-블랏 분석 및 활성 검사로 확인할 수 있다. 발명자들은 누드 생쥐에서 흉부 SCLC N417 종양 이형이식편(xenograft) 모델을 개발하여, 비-침습성 그리고 정량적 MR 영상 분석으로 FUS1-나노입자의 전신 처리 및 Gleevec 경구 투여의 치료요법적 효과를 평가하였다. 발명자들은 MR 영상 및 용적 분석에 따르면 2주 이내의 FUS1-나노입자 단독 또는 gleevec과 복합 투여한 경우 처리된 쥐에서 N417 종양 이형이식편의 생장이 상당히 저해되었으며(P<0.001), gleevec 단독 처리한 경우에는 유익한 효과가 감지되지 않는다는 것을 발견하였다. 우리 결과에서 분명하게 설명되는 것은 SCLC 상에서 FUS1-나노입자의 in vitro 및 in vivo에서 치료 효과와 SCLC 요법으로 FUS1-나노입자 단독 투여 또는 다른 화학 요법제와 복합 투여 및 MRI을 이용한다는 것을 함축한다.
실시예 5
FUS1 반수불충분 (haploinsufficiency) 비-소세포 폐암종에서 활성화된 c- Abl
Abl 단백질은 모든 조직에서 광범위하게 발현되나 온코젠으로 활성화된 형태의 c-Abl는 조혈악성종양(hematopoietic malignancies)에 한정된다(예를 들면, Philadelphia 염색체+ BCR-ABL 융합과 연관된 만성 골수성 백혈병). c-Abl 단백질은 세포질 및 핵에 모두 위치하는 티로신 카이나제에 의해 엄격하게 제어받는다. c-Abl 단백질의 핵형은 DNA 손상에 반응하는 것으로 알려져있다. 세포질 c-Abl는 생장인자 수용체 시그날생성, 세포 운동성 및 세포 흡착과 연관된다. Bcr 단백질은 c-Abl 및 Bcr-Abl 온코단백질의 네가티브 조절물질로 알려져 있다(Lin et al ., 2001; Ling et al ., 2003). 또한, PAG는 SH3 도메인과 상호작용에 의해 c-Abl를 하향 조절한다(Wenand Van Etten, 1997). 폐암에서, 염색체 arm 3p의 한 개 대립형질의 빈번한 손실은 소세포 폐암(small cell lung cancer (SCLC)) 및 비-소세포 폐암(non-small cell lung cancer(NSCLC)) 모두에서 볼 수 있고, 이는 이 염색체 부분이 종양 억제물질 유전자(TSGs)라는 증거이다(Kondo et al ., 2001; Uno et al ., 2004). FUS1 유전자가 이런 중요한 염색체 부분에서 확인되었고 이것이 신규한 종양 억제물질 유전자로 간주된다. Fus1 종양 억제물질 활성의 기전은 아직 알려지지 않았다. 발명자들은 Fus1 펩티드가 c-Abl 티로신 카이나제를 in vitro 에서 저해한다는 것을 발견하였다(IC50 35 M). 일부 폐암 세포주에서 감지된 돌연변이체 Fus 1 단백질의 하나에서 결손되는 부분으로부터 저해 서열이 유도되었다. 중요한 것은, 이 펩티드의 스테아린산(C18 지방산) 변형된 형태가 저해에 필요하나 스테아린산 단독으로는 저해성이 없다. 흥이로운 것은 c-Abl의 아미노 말단 단편에 결합된 미리스테이트 (C14) 지방산이 c-Abl의 자동 저해에 연루된 것으로 본다 (Hantschel et al ., 2003). 발명자들은 활성화된 c-Abl 티오신 카이나제로 형질변환된 Rat-1세포를 이용하여 병소 형성에 Fus1 펩티드 효과를 태스트하였다. 발명자들은 스테아린산-Fus-1 펩티드(40μ M)이 병소 형성을 저해한다는 것을 발견하였다. 이와 같은 발견으로 Fus1 종양 억제물질 단백질의 활성중에 하나가 c-Abl 티로신 카이나제 기능을 간섭하는 것이라고 보인다. 3p21.3 부분에 대립형질 손상을 가지고, 이는 FUS1 유전자의 반수불충분(haploinsufficiency)를 유도하게 되는 두 개 폐암세포주의 분석으로 활성화된 c-Abl가 FUS1 결손된 폐 암에서 약할을 할 것이라고 본다. 면역 침전/pTyr Western 블랏 연구 및 in vitro Abl 카이나제 검사에서 A549 및 H1299 세포주는 활성화된 c-Abl 단백질을 가진다는 것이 확인되었다. 추가 연구는 Fus1/Abl 상호작용을 조사하고, FUS1내에 있는 c-Abl 티로신 카이나제 저해에 중요한 서열을 확인하는 것이다.
실시예 6
FUS1 -나노입자 및 Gefitinib 의 복합 처리에 의해 비소세포 폐암( NSCLC )에서 EGFR 티로신 카이나제 및 종양 세포 생장의 공조 저해
FUS1는 사람 염색체 3p21.3에서 확인되고 Apaf1-연합된 세포사멸 경로에서 기능을 하는 신규한 종양 억제물질 유전자(TSG)로 강력한 종양 억제물질이다. 발명자들은 FUS1를 이용하여 Gefitnib의 화학요법 성능을 강화시키는 것과 Gefitnib감응성 및 저항성 NSCLC 세포에서 모두 Gefitnib의 저항성을 극복하는 것에 대해 조사하였다.
방법 및 결과
발명자들은 FUS1-결핍 및 Gefitinib-저항성 NSCLC H1299, H358, H460 세포에서 FUS1-나노입자-중개된 유전자 전달에 의한 wt-FUS1 발현이 Gefitinib 처리에 대한 반응에 상당히 민감해졌다는 것을 발견하였는데, 이는 종양 세포 생장의 추가 저해 효과 이상의 저해 및 세포사멸의 시너지 유도로 설명된다. FUS1-나노입자 및 낮은 약량의 Gefitnib(IC10)으로 공동 처리된 Gefitnib-감응성 HCC827 (EGFR 돌연변이) 및 H1819 (EGFR 증폭) 세포에서 생장 저해가 강화되었다는 것을 관찰하였다. 포스포-EGFR-특이적 항체를 이용한 웨스턴 블랏 분석으로 볼 수 있는 바와 같이, FUS1-나노입자 단독으로 또는 Gefitnib와 복합하여 처리된 세포에서 포스포릴화된 EGFR 단백질의 두드러진 저해도 감지되었다. GFp-나노입자로 처리된 또는 처리안된 것과 비교하였을 때 2주이내 FUS1 나노입자로 처리된 동물에서 종양 생장이 상당히 저해(P<0.001)되었다는 것을 감지하였다. 냉동된 조직 샘플에서 TUNEL 착색을 이용한 in situ 세포사멸 검사에서 FUS1-나노입자 처리된 생쥐의 종양 세포에서도 세포사멸가 유도된다는 것을 감지하였다. 화학요법을 진행중인 단계 IV의 NSCLC 환자에서 정맥으로 단일 물질 FUS1-나노입자를 투여한 진행 상(ongoing phase) I 연구를 하였다. 17개월+의 중간 생존을 한 7명 환자에서 처리는 모두 잘 견딘(well-tolerated) 것으로 나타났다.
결론
우리 결과에서 wt-FUS1는 단백질 티로신 카이나제 저해물질에 대한 종양 세포의 감응성 조절에 주요한 역할을 한다는 것을 제시한다.
실시예 7
우리의 기존 실험에서 일부 폐 암 세포주에서 Fus1에서 결손된 것으로 알려진 Fus1 서열으로부터 유도된 합성 펩티드가 시판하는 Abl 의 카이나제 활성을 저해한다는 것을 보여주었다. 발명자들은 두 가지 사람의 비-소세포 폐암 (NSCLC) 세포주, A549 및 H1299를 anti-Abl 면역침전(IP)/pTyr 웨스턴 블랏팅으로 스크리닝하고, 활성화된 c-Abl 단백질을 감지하였다. FUS1 결손된 NSCLC 세포주에서 c-Abl 의 활성화를 확인하기 위해, in vitro 카이나제 검사를 c-Abl 항체 IPs를 이용하여 실시하였다. A549 및 H1299 모두 활성화된 c-Abl에 양성이나, CCD16, 정상 사람 폐 섬유아세포주는 음성이었다.
NSCLC 세포주에서 c-Abl의 활성을 추가 연구하기 위해, 이마티니브 메실레이트[imatinib mesylate]( STI-571 또는 Gleevec으로 공지됨), 공지의 저해물질 또는 c-Abl 티로신 카이나제를 H1299 세포의 한천 콜로니 검사에 이용하였다. 세포를 이마티니브(10 M)로 처리하면 처리안된 기준과 비교하였을 때 콜로니 수가 거의 완전하게 감소되었다. 이마티니브 존재하에 형성된 이들 콜로니는 처리안된 세포와 비교하였을 때 크기가 감소되었다.
c-Abl 내부 세포상에 Fus1의 직접 효과를 측정하기 위해, c-Abl cDNA와 야생형 FUS1 또는 c-말단 결손된 FUS1 또는 빈 벡터를 함께 COS-1 세포로 공동 형질감염시켰다. 우리 데이터에서 야생형 FUS1 공동 발현과 연관된 c-Abl의 티로신 포스포릴화가 감소되었으나 이와 같은 감소는 Fus1 펩티드의 저해성 펩티드 서열이 부족한 FUS1 결손 돌연변이 때문인 것으로 보이지 않는다.
여기에서 설명하는 모든 조성물 및 방법은 본 발명을 설명에서 과도한 실험없이 만들고 실행할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 적절한 구체예로 설명되나 당업자는 조성물 및 방법에 그리고 여기에서 설명하는 방법 단계에 본 발명의 개념, 범위를 벗어나지 않고 다양한 변화를 적용시킬 수 있음을 분명하게 알 수 있을 것이다. 좀더 특별히, 화학적으로 그리고 생리학적으로 연관된 특정 물질을 유사한 또는 동일한 결과를 얻는 한 여기에서 설명하는 물질에 대체될 수 있음이 명 백하다. 이와 같은 유사한 치환체 및 변화는 당업자가 청구되는 범위에서 정의하는 본원 발명의 범위에 있음을 인지할 수 있다.
실시예 8
중성 리포좀 나노입자를 통한 FUS -1 펩티드 운반
본 실시예에 이용된 운반 시스템은 중성 나노입자(1, 2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린(DOPC)(Avanti Polar lipids, Alabaster, AL)-계 리포좀 및 펩티드(Fus 1)로 구성된다. DOPC 원액(20 mg/ml)을 t-부탄올에서 준비하여 tween-20과 혼합한 다음(Fisher Scientific, Fairlawn, NJ), 증류수로 (1:1000) 90%:10%,(v/v)(DOPC:Tween 20)비율에서 희석한다. 혼합물에 과량의 순수 t-부탄올 (95% t-부탄올, 5% 지질, v/v)을 첨가하고 하룻밤동안 동결건조시켰다. 건조된 지질 혼합물을 미리 증류수에 용해시킨 펩티드와 혼합한다. 이 실험에서 이용된 DOPC 및 펩티드 비율은 10:1, 몰비율(DOPC:펩티드)이다. 이중증류수를 포함하는 100μM 펩티드를 희석시키고, 이를 폐암 세포(H1299) 처리에 이용한다. 양이온성 지질, DOTA, 펩티드를 양성 기준(DOTAP:펩티드 (1:1), M/M)으로 이용한다.
폐 암세포(5000/웰)는 빈 리포좀 및 fus 1 펩티드 (1, 5, 10, 20 μM 펩티드)를 포함하는 리포좀 또는 염료-라벨된 펩티드 1, 5, 10, 20 μM)를 포함하는 리포좀으로 약량을 증가시키면서 48시간 처리한다. 20시간 및 48시간대에 형광 현미경을 이용하여 리포좀 취입을 관찰하였다. 형태 및 생존능을 위해 처리 20시간 및 48시간에 세포 사진을 찍는다. 빈 리포좀으로 처리된 세포(기준)와 펩티드를 포함하는 리포좀으로 처리된 세포에서 48시간 후에 세포 생존에 대해 카운트하고, 파 악된 수를 플롯팅하였다(도 23).
실시예 9
선택적으로 FUS1 -펩티드를 포함하는 DOPC 및 DOTAP :콜레스테롤 나노입자의 독성 분석
C3H 생쥐에 펩티드(FUS1 펩티드 또는 비특이적 펩티드)를 포함하는 나노입자를 주사하고, 주사후 1, 2, 3주후에 다양한 독성 변수를 연속 분석하였다. 기준 생쥐(“IV 군”)에는 PBS를 주사하였다. 평가되는 독성 변수에는 혈액학적 변수(예를 들면 적혈수 수 "RBC", 백혈구수 "WBC"), 간기능 분석 (예를 들면, AST, ALT, 전체 비리루빈 분석) 및 신장 기능 분석(예를 들면 크리아티닌 수준 평가)등이 포함된다. DOTAP:콜레스테롤 나노입자 또는 DOPC (중성 리포좀) 나노입자를 이용한다. CH3 생쥐에 투여된 나노입자를 포함하는 펩티드의 양은 2mg/kg 내지 5mg/kg이다. 이 연구는 아래 표 5에 요약하였다.
Figure 112007072522751-pct00002
실시예 10
종양 억제물질 유전자 산물 Fus1 에 의한 c- Abl 의 저해; FUS1 발현이 부족한 비소세포 폐암세포에서 c-Abl의 온코겐 활성화
스테아레이트 - Fus1 펩티드는 c- Abl 의 티로신 카이나제 활성을 저해한다. Fus1는 NSCLC와 연합된 종양 억제물질 유전자이다 (Ji et al ., 2002; Lerman and Minna, 2000; Kondo et al ., 2001). FUS1 C말단 결손 돌연변이체를 폐암 종양 세포주로부터 분리했는데(Kondo et al ., 2001), 이들은 110개 아미노산의 야생형 Fus 1 단백질의 처음 80개 아미노산을 인코드한다(Kondo et al ., 2001). 발명자는 KLR서열을 제외한 Fus1(1-80)이 없는 서열에서 스테아레이트-Fus1펩티드 (KLRRVHKNLIPQGIVKLDHR; SEQ ID NO:11)을 합성하였다(표 6 참고). 이 펩티드는 세균성 정제된 Abl 카이나제를 이용한 Abl 티로신 카이나제 검사에서 강한 저해성을 나타내었다(도 24A). 놀라운 것은 스테아레이트 N-말단 모이어티가 부족한 Fus1 펩티드는 Abl 카이나제 저해물질로써는 비활성이다(도 24B). 스테아레이트 만으로는 저해성을 가지지 못한다. 스테아레이트 Bcr 펩티드는 Abl 카이나제 저해물질로써 비활성이며, 스테아레이트 Bcr 펩티드는 스테아레이트 Fus1 펩티드와 거의 동일한 수의 아미노산을 가지는데, 이는 세균성 정제된 Abl 카이나제에 저해효과를 가지지 않았다. 이와 함께, 이 결과로 스테아레이트 모이어티 및 Fus1 펩티드내 아미노산 서열은 c-Abl 카이나제 저해에 필수적이다.
도 24A에서 볼 수 있는 바와 같이, 스테아린산 Fus1 펩티드를 절두된 시판 Abl 티로신 카이나제 (45kD)(New England Bio-Labs)- SH2 및 SH1 도메인, GST-CRK (c-Abl 선호 기질), 100uM 냉각 ATP, 32P ATP 포함-와 배양시켰다. 30℃에서 30분간 배양시킨 후에, 샘플을 2x SDS 샘플 완충액과 함께 가열시키고, 8% SDS PAGE 겔에 얹는다. 이 겔을 건조시키고, 포스포이미져(phosphoimager)에 노출시켰다.
도 24B에서는 스테아린산 Fus1 펩티드에 의한 Abl 티로신 카이나제의 선형 저해를 보여준다. 곡선은 GST-CRK 포스포릴화반응의 저해를 나타낸다. 비-스테아린산 변형된 Fus1 펩티드는 Abl 티로신 카이나제 활성을 저해하지 않았다(도 24C). 45kD Abl 티로신 카이나제 (New England BioLabs)를 0-60 uM 비-스테아레이트 Fus1 펩티드, 100 uM 냉각 ATP, 32P ATP, GST-Crk와 배양시켰다. GST-Crk 포스포릴화반응을 포스포이미져(phosphoimager)를 이용하여 정량화하였다.
표 6에는 Fus1 아미노산 서열 및 스테아레이트-Fus1 펩티드 서열을 나타내었다. 밑줄친 서열은 Fus1 펩티드에서 유도된 부분이다. KLR N-말단을 제외한 펩티드 서열은 일부 NSCLC 세포주에서 발현된 돌연변이체 절두형 FUS1 [FUS1 (1-80)]에 없는 부분에 위치한다.
Figure 112007072522751-pct00003
c- Abl 티로신 카이나제는 NSCLC 세포주에서 활성이다. 몇 가지 NSCLC 세포주를 활성화된 c-Abl의 존재에 대해 검사하였다(표 VII). A549 및 H1299 세포주에는 티로신 카이나제-활성 c-Abl 단백질을 포함하는데, 이는 anti-Abl P6D을 이용한 면역 복합 카이나제 검사를 이용하여 확인하였다. 이들 세포주의 세포 용해물질의 Anti-Abl 면역복합체에도 티로신-포스포릴화된 c-Abl 단백질을 포함한다.
Figure 112007072522751-pct00004
NSCLC 세포주는 활성화된 c-Abl 티로신 카이나제를 포함하는 것으로 나타났다. Bcr-Abl 포지티브 세포주, 32D P210, 정상 폐 섬유아세포, CCD16, 및 NSCLC 세포주, H1299 및 A549로부터 전체 세포 용해물질을 anti-c-Abl 항체 P6D (Ling et al ., 2003)와 배양시켰다. P6D, 면역복합체를 단백질 A Sephorose 비드를 이용하여 풀다운(pull down)시킨다. 단백질 A 비드를 20분간 얼음위에서 2 32P ATP로 배양시켰다. 상층액을 2X SDS 샘플 완충액에서 가열하고, 8% SDS-PAGE 겔상에서 분석한다. 정상 Rat 1 세포, c-Abl 형질변환된 Rat 1 세포, ABL 형질변환된 Rat1 세포(Ling et al ., 2003), NSCLC 세포, H1299 및 A549의 전체 세포 용해물을 anti-c-Abl 항체 P6D와 함께 배양한다. P6D 면역 복합체는 단백질 A Sephorose 비드를 이용하여 회수한다. 단백질 A 비드를 2x SDS 샘플 완충액에서 가열하고 SDS-PAGEl로 분석한다. Blot은 anti-c-Abl 항체 8E9로 프로브시켰다(Guo et al ., 1994). 블랏을 스트립시키고(stripped), 포스포티로신 항체 4G10로 프로브시켰다 (Upstate).
COS1 세포에서 FUS1 및 c- ABL 의 공동 발현으로 c- Abl 티로신 카이나제 활성을 저해시킨다. 활성화된 c-Abl을 저해시키는 Fus1의 능력을 평가하기 위해, COS1 세포에서 이들 cDNAs를 공동발현시키고, 티로신-포스포릴화된 c-Abl의 수준을 측정하였다. c-ABL와 FUS1의 공동 발현으로 티로신 잔기상에서 c-Abl의 포스포릴화반응이 저해되었다(도 25A). 대조적으로, FUS(1-80)와 c-ABL의 공동 발현은 c-Abl 티로신 포스포릴화반응에 거의 효과가 없었다(도 25A). 흥미로운 것은, Fus1를 N-말단 Fus1 항체로 면역침전시키면 c-Abl와 Fus1이 공동 침전되는데, 이는 Fus1가 c-Abl와 연합된다는 것을 말한다. c-Abl의 티로신 412의 포스포릴화반응은 c-Abl 티로신 카이나제 활성의 측도이다. 따라서, 우리는 FUS1의 공동 발현후에 c-Abl에서 포스포티로신 412 서열의 수준을 측정하였다(도 25B). FUS1와 c-Abl의 공동 발현은 c-Abl 단백질에서 포스포티로신 412 수준을 강력하게 저해했다. 대조적으로, FUS (1-80)와 c-ABL의 공동 발현은 티로신 412의 포스포릴화 반응을 저해하는데 실패하였다(도 25B). 연구에서, Fus1의 미리스토일화는 NSCLC에서 종양 억제 활성에 필요하다는 것을 확인하였다. COS1 세포에서 c-ABL와 FUS1의 미리스토일화반응-결손 돌연변이체의 공동 발현으로 야생형 FUS1 및 c-ABL의 공동 발현과 비교하였을 때 포스포티로신 c-Abl에 최소한의 감소로 이어졌다(도 25C). 따라서, 이 결과로 Fus1와 c-Abl의 상호작용은 자가포스포릴화반응의 결과로 또는 다른 상류 카이나제 예를 들면 c-Src에 의한 Abl 활성화에 의해 이들 티로신 카이나제의 활성을 차단시킨다는 것을 나타낸다(Plattner et al ., 1999).
도 4a에서, COS1 세포는 c-ABL와 야생형 FUS1 또는 FUS (1-80)으로 공동 감염시켰다. 전이감염후(transfection) 48시간에, 세포를 회수하여 용해물질을 N-말단 Fus1 항체와 함께 배양시켰다. 단백질 A 비드와 함께 수득된 Fus1 면역 복합체를 2x SDS 샘플 완충액으로 가열시키고, SDS-PAGE으로 분석하였다. 블랏을 항-포스포티로신 항체 4G10 (Upstate)로 프로브시킨다. 블랏을 스트립시키고, anti-c-Abl 항체 8E9으로 다시 프로브시킨다. 도 4b에서 COS1 세포에 c-Abl와 빈 벡터, FUS (1-80), 또는 야생형 FUS1으로 공동 전이감염시켰다. 감염 후 48시간 후에, 세포를 수득하고, 용해물을 anti-c-Abl, P6D으로 배양시켰다.(도 4a). 블랏을 c-Abl 항-포스포티로신 412 (Abcam)으로 프로브시켰다. 블랏을 스트립시키고, anti-c-Abl 항체 8E9으로 다시 프로브시켰다.
이마티니브(Imatinib)는 NSCLC 세포의 콜로니 형성을 저해한다. 이마티니브메실레이트(Imatinib mesylate (Gleevec))는 Bcr-Abl의 활성화된 티로신 카이나제 활성을 저해하는 능력이 있는 것으로 널리 알려져 있다 (Druker et al ., 1996). 따라서 발명자들은 한천에서 H1299 세포의 콜로니 형성에 이마티니브의 효과를 테스트하였다(도26A-C). 이마티니브 처리로 약량 의존적인 방식으로 H1299 세포의 콜로니 형성 능력이 강력하게 저해되었다; 콜로니 수 및 크기가 모두 저해받았다(도 26A-C). 1-10uM 이마티니브를 이 검사에 이용되었고, 예전 연구에서는 이와 같은 농도에서 c-Abl 카이나제 활성이 강력하게 저해되었다는 것이 설명되었다(Zipfel et al ., 2004).
토론. 기존 연구에서 FUS1의 항종양 활성을 설명하였으나(Kondo et al ., 2001; Uno et al ., 2004), FUS1 유전자의 표적에 대해서는 지금까지 확인되지 않았다. 우리 연구에서, c-Abl는 Fus1 단백질에 의해 네가티브하게 제어된다는 것을 발견하였다. 일부 NSCLC 환자에서 볼 수 있는 돌연변이체 FUS1(1-80)에 부족한 서열로부터 유도된 FUS1 펩티드를 이용하여(Kondo et al ., 2001), 우리는 c-Abl(17)의 정상적인 Crk의 포스포릴화시키는 c-Abl 카이나제의 능력을 저해시킬 수 있었다 (도 24A-C). 흥미로운 것은 FUS1 펩티드의 스테아린산 변형태만이 c-Abl 카이나제상에 저해 효과를 가진다는 것이다(도 24A-C). FUS1의 종양 억제 효과를 만들기 위해서는 FUS1의 미리스토일화가 요구된다는 것을 확인하였다(Plattner et al ., 1999). 흥미로운 것은 c-Abl의 N-말단(등소체 1b)에도 미리스테이트 잔기를 포함하는데, 이는 c-Abl의 자가 저해를 의미한다(Hantschel et al ., 2003). COS1세포에서 공동-발현 검사를 통하여 세포 배양물에서 야생형 및 c-Abl의 상호작용을 볼 수 있었다(예를 들면, 도 25A-C). 티로신 412의 포스포릴화반응은 c-Abl 카이나제의 활성을 이끄는 주요한 단계이다(Brasher and Can Etten, 2000). 야생형 FUS1 및 c-ABL의 공동 발현으로 c-Abl를 일부 NSCLC세포에서 발현되는 절두형 FUS1(저해성 펩티드 서열이 부족한) 또는 빈 벡터로 공동 발현시켰을 때 시그날에서만 매우 소량 감소한 것과는 대조적으로 c-Abl의 전체 포스포티로신 수준과 포스포티로신 412 함량 수준에서 상당한 감소를 이끌었다(도 25A-C). 이와 같은 발현은 Fus1 단백질에 의한 c-Abl 티로신 카이나제의 직접적인 저해에 관한 확고한 증거를 제공하는 것이다.
이들 결과로 비소세포 폐암(NSCLC) 세포주는 티로신 카이나제-활성 c-Abl을 발현한다는 것을 설명할 수 있다(도 24A-C). 이 결과는 c-Abl이 엄격하게 조절되는 티로신 카이나제이며 이의 온코겐성은 백혈구세포에서 키메라 단백질, Bcr-Abl과 항상 연합된다는 흥미로운 사실이다. 이와 같이 NSCLC 세포주에서 c-Abl의 활성화를 보여주는 이러한 발견을 뒷받침하여 NSCLC 세포주를 미아티니브로 처리하면 c-Abl 티로신 카이나제를 저해하는 것으로 알려진 약량에서 약량-의존적 방식으로 한천에서 콜로니 형성이 강력하게 저해되었다(도. 26A-C). 따라서, 우리 발견은 c-Abl가 종양 억제물질 산물 FUS1의 가망 표적으로 확인되었으며, c-Abl는 일부 NSCLC의 온코겐성에 상당한 기여를 한다는 것을 암시한다. 따라서, 잘 알려진 c-Abl 저해물질, 이마티니브(imatinib)는 성공적으로 NSCLC를 처리할 수 있는 능력을 가지는 것으로 보인다.
참고문헌
다음의 참고문헌은 예시적인 과정 또는 여기에서 언급하는 것에 보충 자료를 제공하기 위해 참고문헌으로 명시한다.
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SEQUENCE LISTING <110> LIN, JACKI ARLINGHAUS, RALPH B. SUN, TONG LIN, JI OZPOLAT, BULENT BERESTEIN-LOPEZ, GABRIEL ROTH, JACK <120> BIOACTIVE FUS1 PEPTIDES AND NANOPARTICLE-POLYPEPTIDE COMPLEXES <130> UTFC:920WO <140> UNKNOWN <141> 2006-03-14 <160> 12 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 1 Lys Leu Arg Arg Val His Lys Asn Leu Ile Pro Gln Gly Ile Val Lys 1 5 10 15 Leu Asp His Pro Arg 20 <210> 2 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 2 Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ala <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 3 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 4 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 4 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu 1 5 10 15 Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 20 25 <210> 5 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 5 Met Gly Leu Gly Leu His Leu Leu Val Leu Ala Ala Ala Leu Gln Gly 1 5 10 15 Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 20 25 <210> 6 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 6 Gly Ala Leu Phe Leu Gly Trp Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly 1 5 10 15 Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 20 25 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 7 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln 1 5 10 <210> 8 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 8 Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr 1 5 10 15 Gly Arg <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 9 Arg Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe 1 5 10 <210> 10 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 10 Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys 1 5 10 <210> 11 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 11 Lys Leu Arg Arg Val His Lys Asn Leu Ile Pro Gln Gly Ile Val Lys 1 5 10 15 Leu Asp His Arg 20 <210> 12 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 12 Met Gly Ala Ser Gly Ser Lys Ala Arg Gly Leu Trp Pro Phe Ala Ser 1 5 10 15 Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ala Ala Gly Ala Glu Gln Ala Leu 20 25 30 Val Arg Pro Arg Gly Arg Ala Val Pro Pro Phe Val Phe Thr Arg Arg 35 40 45 Gly Ser Met Phe Tyr Asp Glu Asp Gly Asp Leu Ala His Glu Phe Tyr 50 55 60 Glu Glu Thr Ile Val Thr Lys Asn Gly Gln Lys Arg Ala Lys Leu Arg 65 70 75 80 Arg Val His Lys Asn Leu Ile Pro Gln Gly Ile Val Lys Leu Asp His 85 90 95 Pro Arg Ile His Val Asp Phe Pro Val Ile Leu Tyr Glu Val 100 105 110

Claims (74)

  1. KLRRVHKNLIPQGIVKLDHPR (SEQ ID NO:1); KLRRVHKNLPPQGPVKLDHPR (SEQ ID NO:13); 및 VLRRVHVNLPPQGPVVLDHPR (SEQ ID NO:14)로 구성된 집단으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고,
    N-말단 잔기에 스테아레이트 모이어티의 추가로 인하여 변형된, 단리된 펩티드.
  2. 제 1 항에 있어서, 이 펩티드는 아미노산 서열 KLRRVHKNLIPQGIVKLDHPR (SEQ ID NO:1)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 단리된 펩티드.
  3. 제 1 항에 있어서, 이 펩티드는 아미노산 서열 KLRRVHKNLPPQGPVKLDHPR (SEQ ID NO:13)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 단리된 펩티드.
  4. 제 1 항에 있어서, 이 펩티드는 아미노산 서열 VLRRVHVNLPPQGPVVLDHPR (SEQ ID NO:14)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 단리된 펩티드.
  5. 제 1 항에 있어서, 이 펩티드는 30개 이하의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는, 단리된 펩티드.
  6. 제 5 항에 있어서, 이 펩티드는 24개 이하의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는, 단리된 펩티드.
  7. 제 1 항에 있어서, 이 펩티드는 길이가 19개 내지 100개의 아미노산인, 단리된 펩티드.
  8. 제 7 항에 있어서, 이 펩티드는 길이가 21개 내지 100개의 아미노산인 것을 특징으로 하는, 단리된 펩티드.
  9. 청구항 제1항의 단리된 펩티드와 연합된 나노입자를 포함하며, 이때 연합은 물리적, 화학적 또는 물리화학적 연결을 의미하는 것을 특징으로 하는, 나노입자-폴리펩티드 복합체.
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  18. 제 9 항에 있어서, 나노입자는 지질계 나노입자, 초상자성(superparamagnetic) 나노입자, 나노쉘(nanoshell), 반도체 나노크리스탈(nanocrystal), 양자점(quantum dot), 폴리머계 나노입자, 실리콘계 나노입자, 실리카계 나노입자, 금속계 나노입자, 풀러렌(fullerene) 또는 나노튜브가 되는 것을 특징으로 하는 나노입자-폴리펩티드 복합체.
  19. 제 18 항에 있어서, 나노입자는 지질계 나노입자인 것을 특징으로 하는 나노입자-폴리펩티드 복합체.
  20. 제 19 항에 있어서, 지질계 나노입자는 리포좀, 중성 리포좀, DOPC 리포좀 또는 DOTAP:콜레스테롤 소포인 것을 특징으로 하는 나노입자-폴리펩티드 복합체.
  21. 제 20 항에 있어서, 리포좀은 DOPC 리포좀인 것을 특징으로 하는 나노입자-폴리펩티드 복합체.
  22. 제 18 항에 있어서, 나노입자는 초상자성 나노입자인 것을 특징으로 하는 나노입자-폴리펩티드 복합체.
  23. 제 18 항에 있어서, 나노입자는 초상자성 나노입자이며, 나노입자-폴리펩티드 복합체는 리포좀 또는 DOTAP:콜레스테롤 소포내에 있는 것을 특징으로 하는 나노입자-폴리펩티드 복합체.
  24. 제 23 항에 있어서, 리포좀은 DOPC 리포좀인 것을 특징으로 하는 나노입자-폴리펩티드 복합체.
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  30. 제 9 항에 있어서, 나노입자와 연합된 제 2 폴리펩티드가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 나노입자-폴리펩티드 복합체.
  31. 제 30 항에 있어서, 제2 폴리펩티드는 Fus1 이외의 종양 억제물질 유전자 산물에서 유도된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자-폴리펩티드 복합체.
  32. 제 9 항에 있어서, 조직 또는 세포에 나노입자-폴리펩티드 복합체를 표적제공하는 표적화 모이어티가 추가 포함되는 것을 특징으로 하는 나노입자-폴리펩티드 복합체.
  33. 다음을 포함하는 나노입자-폴리펩티드 복합체:
    KLRRVHKNLIPQGIVKLDHPR (SEQ ID NO:1); KLRRVHKNLPPQGPVKLDHPR (SEQ ID NO:13); 및 VLRRVHVNLPPQGPVVLDHPR (SEQ ID NO:14)로 구성된 집단으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 펩티드; 그리고
    리포좀, DOTAP:콜레스테롤 소포, DOPC 리포좀 및 초상자성 나노입자로 구성된 군으로부터 선택된 나노입자,
    이때, 이 펩티드는 N-말단 잔기에 스테아레이트 모이어티의 추가로 인하여 변형된, 나노입자-폴리펩티드 복합체.
  34. 제 33 항에 있어서, 이 펩티드는 아미노산 서열 KLRRVHKNLIPQGIVKLDHPR (SEQ ID NO:1)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 나노입자-폴리펩티드 복합체.
  35. 제 33 항에 있어서, 이 펩티드는 아미노산 서열 KLRRVHKNLPPQGPVKLDHPR (SEQ ID NO:13)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 나노입자-폴리펩티드 복합체.
  36. 제 33 항에 있어서, 이 펩티드는 아미노산 서열 VLRRVHVNLPPQGPVVLDHPR (SEQ ID NO:14)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 나노입자-폴리펩티드 복합체.
  37. 제 33 항에 있어서, 이 펩티드는 길이가 19 내지 100개 이하의 아미노산 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는, 나노입자-폴리펩티드 복합체.
  38. 제 37 항에 있어서, 이 펩티드는 길이가 21개 내지 100개의 아미노산 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는, 나노입자-폴리펩티드 복합체.
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  61. 폴리펩티드를 세포로 시험관내(in vitro)에서 운반하는 방법에 있어서,
    청구항 제9항, 제18항 내지 제24항, 제30항 내지 제38항중 임의의 어느 한 항에 따른 나노입자-폴리펩티드 복합체를 준비하고; 그리고
    세포에 의해 생활성 폴리펩티드를 취입할 수 있는 조건하에서 세포에 나노입자-폴리펩티드 복합체를 접촉시키는 단계로 구성된 방법.
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  70. 카이나제를 제1-8항중 어느 한 항에 따른 펩티드와 접촉시키는 것을 특징으로 하는 시험관내(in vitro)에서 단백질 티로신 카이나제를 저해하는 방법.
  71. 제 70 항에 있어서, 카이나제는 EGFR, PDGFR, cKit, cAbl, 또는 Erk인 것을 특징으로 하는 방법.
  72. 카이나제를 제1-8항중 어느 한 항에 따른 펩티드와 접촉시키는 것을 특징으로 하는 시험관내(in vitro)에서 종양 세포의 세포사멸을 유도하는 방법 .
  73. 종양 세포를 제9항, 제18항 내지 제24항, 제30항 내지 제38항중 어느 한 항에 따른 나노입자-폴리펩티드 복합체와 접촉시키는 것을 특징으로 하는 시험관내(in vitro)에서 종양 세포의 세포사멸을 유도하는 방법 .
  74. 제9항, 제18항 내지 제24항, 제30항 내지 제38항중 어느 한항에 따른 나노입자-폴리펩티드 복합체로 구성되며, 이때 나노입자는 초상자성 나노입자인 것을 특징으로 하는 자기공명영상용 조성물.
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