KR101346499B1

KR101346499B1 - 재조합 이합체 생식샘자극호르몬의 산화 형 준위를 감소시키기 위한 무혈청 배양 배지

Info

Publication number: KR101346499B1
Application number: KR1020087003007A
Authority: KR
Inventors: 쟝-피에르 폰타; 폴 듀코뮨; 베로니크 데파리스
Original assignee: 아레스 트레이딩 에스.에이.
Priority date: 2005-07-05
Filing date: 2006-07-04
Publication date: 2013-12-31
Anticipated expiration: 2026-07-04
Also published as: IL188558A0; KR20080036599A; US8093052B2; AU2006264917B2; WO2007003640A1; DK1899454T3; EA200800253A1; BRPI0612781A2; NO20080580L; PL1899454T3; CN101258236A; JP2008544758A; EA012840B1; US20090124006A1; AU2006264917A1; TW200732473A; TWI369401B; CY1112992T1; HRP20120486T1; BRPI0612781B8

Abstract

본 발명은 재조합 단백질 제조 분야에 속한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 재조합 이합체 생식샘자극호르몬 제조용 항산화제를 포함하는 무혈청 배양 배지의 용도에 관한 것이다. 상기 항산화제는 L-글루타티온, 2-메르캡토에탄올, L-메티오닌 및 아스코르빈산과 (+)-알파-토코페롤의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.

무혈청, 생식샘자극호르몬, 항산화제

Description

재조합 이합체 생식샘자극호르몬의 산화 형 준위를 감소시키기 위한 무혈청 배양 배지{SERUM-FREE CULTURE MEDIUM FOR REDUCING THE LEVELS OF OXIDIZED FORMS OF A RECOMBINANT DIMERIC GONADOTROPINS}

본 발명은 재조합 (recombinant) 단백질 제조 분야에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 재조합 이합체 (dimeric) 생식샘자극호르몬 (gonadotropin) 제조용 항산화제 (antioxidant)를 포함하는 무혈청 (serum-free) 배양 배지 (culture medium)의 용도에 관한 것이다. 상기 항산화제는 L-글루타티온 (glutathione), 2-메르캡토에탄올 (mercaptoethanol), L-메티오닌 (methionine) 및 아스코르빈산 (ascorbic acid)과 (+)-알파-토코페롤 (tocopherol)의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.

본 발명은 재조합 난포 자극 호르몬 (Follicle-Stimulating Hormone: FSH)의 제조에 관한 것이다. FSH는 생식샘자극호르몬류 (class)에 속한다.

FSH는 여성 및 남성 환자의 불임증 (infertility) 및 생식장애 (reproductive disorder) 치료에 사용된다. FSH는 예를 들어, 보조생식기술 (assisted reproductive technology: ART)에서 여성 환자의 배란유도 (ovulation induction: OI) 및 과배란유도 (controlled ovarian hyperstimulation: COH)에 사용된다. 배란 유도를 위한 일반적인 치료 요법에서, 약 6 내지 12일 동안 매일 환자에게 FSH 또는 그것의 유도체 (약 75 내지 300 IU RFSH/day)를 주사한다. 한편 과배란유도를 위한 일반적인 치료 요법에서는, 약 6 내지 12일 동안 매일 환자에게 FSH 또는 그것의 유도체 (약 150-600 IU RFSH/day)를 주사한다. 또한, FSH는 정자부족증 (oligospermia)을 겪고 있는 남성의 정자발생 (spermatogenesis)을 유도하기 위해 사용된다. 주 3회 150 IU FSH와 함께 주 2회 2,500 IU hCG를 사용하는 요법은 저생식샘자극호르몬 생식샘저하증 (hypogonadotrophic hypogonadism)을 겪고 있는 남성의 정자 수를 증가시키는 데 성공적이었다. 생식장애 (fertility disorder) 치료에 있어 FSH의 중요성으로 인해, 높은 안정성 및 높은 특이적 활성을 지닌 FSH를 제공하는 것이 바람직하다.

사실상, FSH는 뇌하수체 (pituitary gland)에 의해 제조된다. 약학적으로 사용하기 위해, FSH는 재조합형으로 제조되거나 (rFSH), 폐경후 (postmenopausal) 여성의 소변에서 얻을 수 있다 (uFSH). rFSH 제조 방법은 두 개의 주요 단계가 필요하다: FSH를 발현하는 유전자 조작된 세포 배양 및 단백질 정제. 그런 다음 상기 단백질을 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화하여 약학 조성물을 얻는다.

과거에는 세포를 배양하기 위해, 혈청이 추가된 배양 배지가 사용되었으며, 상기 혈청은 모든 포유류의 세포주 (cell line)의 성장 및 유지에 보편적인 영양소 역할을 하였다. 하지만 오랜 잠복기 (latency) 또는 배양기간 (incubation)을 지닌 소의 전염성 신경변성 질환 (transmissible neurodegenerative disease)인, 소해면 상뇌증 (Bovine Spongiform Encephalopathy: BSE)의 출현으로 인해, 생물학적 활성 생산물을 제조하는 데 동물-유래 혈청을 사용하는 것에 대한 규제 및 우려가 높아지고 있다. 그러므로, 현재 무혈청 배지를 사용하여 재조합 단백질을 제조하는 것이 선호된다. 그러한 배지는 당기술에 잘 알려져 있고, 예를 들어 시그마사 (Sigma), 바이오위트테이커사 (BioWhittaker), 지브코 (Gibco) BRL사, 캄브렉스사 (Cambrex) 및 JRH사와 같은 몇몇 제약회사에서 시판된다.

rFSH를 저장할 때 부딪힐 수 있는 문제들 중 하나가 FSH의 산화 형 (oxidized form)의 존재이다. 상기 문제를 부분적으로 해결하기 위하여, 항산화제를 상기 약학 조성물에 첨가하여, 치료가 필요한 환자에게 투여하기 전에 저장하는 동안 FSH 단백질을 안정화시킬 수 있다. 예를 들어, 유럽특허 제EP 0 853 945호 (Skrabanja and Van den Oetelaar, 1998)는, 25-100mM의 소듐 시트레이트 (sodium citrate) 및 1-10mM의 L-메티오닌 (methionine)과 같은 안정화제와 혼합된 액상 생식샘자극호르몬-포함 제형을 기술하고 있다. 여기서, 상기 제형으로 인해 FSH 제형이 장시간 저장될 수 있는 것을 보여준다. 또한, 국제공개공보 제WO 92/15614호 (Takruri H., 1992)는, 저장 배지 또는 수성 안과용액제 (ophthalmic solution)와 같은 액상 또는 반-액상 약학 조성물에서의 폴리펩티드 (polypeptide) 산화를 억제하기 위한 방법에 관한 것이다. 특히, 국제공개공보 제WO 92/15614호는, 농도 약 10mg/L의 L-메티오닌을 포함하는 안과용액제 또는 안연고 (ophthalmic ointment)가 인간 표피 성장 인자 (Epidermal Growth Facotr)를 안정화시키는 것을 보여준다. 하지만, 상기 공개공보들은 배양 배지에서가 아닌 단지 약학 제형에서의 항산화제 용도를 기술한다.

또한, 세포사 (cell death)에 대해 세포주 (cell line)를 보호하기 위하여 또는 영양소로써, 아미노산 및 항산화제 활성을 나타내는 화합물을 배양 배지에 첨가할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,560,655호는 약 30mg/L의 L-메티오닌을 포함하는 무혈청 배지를 기술하는데, 상기 배지는 돼지 고환 세포 (swine testicle cell), AG14 골수종 세포 및 생쥐 비장 세포 (murine spleen cell)의 배양을 위해 사용된다. 국제공개공보 제WO 95/12664호는 불충분한 양의 다양한 성장-제한 인자 (이들 중 하나가 L-메티오닌 아미노산)로 인한 손실을 특정 세포주에서 극복할 수 있는 방법을 기술한다. 특히, 상기 국제공개공보 제WO 95/12664호는 인간 M-CSF를 발현하는 CHO E5F3G 세포주를 변형하여, 증가된 세포 밀도로 성장시키는 방법을 기술한다. 이러한 방법으로, 상기 CHO E5F3G 세포가 104mg/L의 L-메티오닌을 포함하는 배지에서 성장한다 (참조: 실시예 및 표 2). Yun et al.는, 글루타티온 (gluthatione)과 철 킬레이트제 (iron chelator)의 혼합물을 상기 배양 배지에 첨가하여 CHO 세포의 세포사를 감소시키는 것을 기술한다 (Yun et al., 2003). Saito et al.는, 다양한 항산화제가 배양 배지에서 사용되어, 세포주를 세포사로부터 보호할 수 있다는 것을 기술한다 (Saito et al., 2003). 하지만, Yun et al. 및 Saito et al.의 국제공개공보 제WO 95/12664호, 미국특허 제4,560,655호는 세포주에 의해 제조된 재조합 단백질의 산화 상태에 대한 아미노산, 글루타티온 및 철 킬레이트제의 잠재적 영향에 대해서는 언급하지 않고 있다. 결론적으로, 상기 문헌들은, 배양된 세포의 생존능력 (viability) 및 성장을 증가시키기 위한 철 킬레이트 제에 결합된 글루타티온 또는 L-메티오닌의 용도만을 기술하고 있다.

국제공개공보 제WO 99/50390호는 백혈구로부터 인터페론-α 제조용 배양 배지에 관한 것인데, 상기 배양 배지는 메티오닌을 포함한다. 메티오닌을 상기 배양 배지에 첨가함에 따라, 정제 (purification) 후 상기 인터페론-α 단백질의 질 (quality)이 향상되는 것이 HPLC를 통해 증명된다. 상기 국제공개공보 제WO 99/50390호의 발명자들은, 이러한 질의 향상이 아마도 상기 인터페론-α 단백질의 산화가 감소되었기 때문일 것이라고 가정한다. 또한 상기 공개공보 제WO 99/50390호는, 너무 적은 양의 메티오닌으로 인해 영향력이 감소되고, 너무 많은 양으로 인해 인터페론 수율이 낮아진다는 것을 기술한다. 구체적으로, 상기 국제공개공보 제WO 99/50390호는, 인터페론-α를 백혈구로부터 제조할 때 약 50 내지 100mg/L이 특히 바람직하다고 기술한다. 더욱이, 상기 국제공개공보 제WO 99/50390호는 단량체 (monomeric) 단백질인 인터페론-α 제조용 배지만을 고려한다. 또한, 상기 국제공개공보 제WO 99/50390호는 예를 들어, 전적으로 이합체화 (dimerization)에 의해 분비되는 FSH와 같은 이합체 호르몬 제조용 배지를 언급하지도 암시하지도 않고 있다.

요약해서 말하면, 상기 언급된 문헌 중 어떤 것도 이합체 생식샘자극호르몬의 산화를 감소시키기 위한 무혈청 배양 배지에서의 항산화제 용도에 관한 것은 없다.

발명의 요약

본 발명은 예상하지 못한 발견에 바탕을 두고 있는데, 이러한 발견은 rFSH를 제조하는 동안 이미, rFSH의 산화 형이 세포 배양의 상청액에 나타난다는 것이다. 더욱이, 무혈청 배지에서 rFSH를 제조하는 것이, 혈청을 포함하는 배지에서 rFSH를 제조하는 것보다 더 높은 준위 (level)의 산화 형을 유도한다. 본 발명의 구성에서, rFSH의 산화 형의 준위가 저장 동안뿐만 아니라 배양 단계 동안 감소될 수 있다는 것이 놀랍게도 발견되었다. 상기 감소는 생산성을 저해하지 않으면서 이루어진다. 상기 감소는 상기 배양 배지에 항산화제를 첨가함으로써 이루어진다. 특히, rFSH를 발현하는 세포를 배양하는 동안, 무혈청 배지에 (i) 2-메르캡토에탄올, (ii) 아스코르빈산과 (+)-알파-토코페롤의 혼합물, (iii) L-메티오닌, 또는 (iv) L-글루타티온을 추가하는 것이, rFSH의 산화 형 준위를 감소시킨다는 것이 발견되었다.

따라서, 첫 번째 양태에서, 본 발명은 재조합 이합체 생식샘자극호르몬 제조용 무혈청 배양 배지의 용도에 관한 것으로, 상기 배양 배지는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항산화제를 포함하는 것을 특징으로 한다:

- 농도 약 1 내지 20mg/L의 L-글루타티온;

- 농도 약 5 내지 15mg/L의 2-메르캡토에탄올;

- 농도 약 200 내지 500mg/L의 L-메티오닌; 및

- 농도 약 10 내지 50mg/L의 아스코르빈산과 농도 약 5 내지 25mg/L의 (+)-알파-토코페롤의 혼합물.

두 번째 양태에서, 본 발명은 재조합 이합체 생식샘자극호르몬의 제조 과정 동안 그것의 산화 형 준위를 감소시키는 방법에 관한 것으로, 항산화제를 포함하는 무혈청 배양 배지에서 상기 재조합 이합체 생식샘자극호르몬을 발현하는 세포를 배양하는 것을 특징으로 한다.

세 번째 양태에서, 본 발명은 재조합 이합체 생식샘자극호르몬 제조용 무혈청 배양 배지에 관한 것으로, 상기 배양 배지는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항산화제를 포함하는 것을 특징으로 한다:

- 농도 약 1 내지 20mg/L의 L-글루타티온;

- 농도 약 5 내지 15mg/L의 2-메르캡토에탄올;

- 농도 약 200 내지 500mg/L의 L-메티오닌; 및

발명의 상세한 설명

본 발명은 항산화제를 포함하는 무혈청 배지에서 rFSH를 발현하는 세포를 배양함에 따라 rFSH의 산화 형 준위가 상당히 감소될 수 있다는 발견에 기인한다. 실시예 3에 설명된 대로, (i) 2-메르캡토에탄올, (ii) 아스코르빈산과 (+)-알파-토코페롤의 혼합물, (iii) L-메티오닌 또는 (iv) L-글루타티온이, 배양 과정 동안 rFSH의 산화 형 준위를 감소시키는데 특히 이롭다. 중요한 것은, 세포의 생존능력 및 대사 (metabolism)를 손상시키지 않고, rFSH의 역가 (titer)를 저해하지 않고 상기 감소가 달성될 수 있다는 것이다.

따라서, 본 발명의 첫 번째 양태는 재조합 이합체 생식샘자극호르몬 제조용 무혈청 배양 배지의 용도에 관한 것으로, 상기 배양 배지는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항산화제를 포함하는 것을 특징으로 한다:

- 농도 약 1 내지 20mg/L의 L-글루타티온;

- 농도 약 5 내지 15mg/L의 2-메르캡토에탄올;

- 농도 약 200 내지 500mg/L의 L-메티오닌; 및

본 발명에 따른 무혈청 배양 배지가 농도 약 1, 1.5, 2 내지 약 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20mg/L의 L-글루타티온을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 무혈청 배양 배지가 농도 2.5 또는 3mg/L의 L-글루타티온을 포함하는 것이 가장 바람직하다. 본 명세서에서 사용된 대로, "글루타티온"은 "L-글루타티온"으로 대체되어 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 무혈청 배양 배지가 농도 약 5, 6, 7, 8, 9 내지 약 11, 12, 13, 14 또는 15mg/L의 2-메르캡토에탄올을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 무혈청 배양 배지가 농도 약 10mg/L의 2-메르캡토에탄올을 포함하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명에 따른 무혈청 배양 배지가 농도 약 10 내지 50mg/L의 아스코르빈산과 농도 약 5 내지 25mg/L의 (+)-알파-토코페롤의 혼합물을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 배지가 농도 약 5, 8, 10 또는 12 내지 약 16, 18, 20, 22 또는 25mg/L의 (+)-알파-토코페롤 및 농도 약 15, 20 또는 25 내지 약 30, 40 또는 45mg/L의 아스코르빈산을 포함하는 것이 더 바람직하다. 상기 무혈청 배양 배지가 농도 약 14mg/L의 (+)-알파-토코페롤과 농도 약 30mg/L의 아스코르빈산을 포함하는 것이 가장 바람직하다. 본 명세서에 사용된 대로, "(+)-알파-토코페롤"은 "비타민 A"로, "아스코르빈산"은 "L-아스코르빈산"로 대체되어 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 무혈청 배양 배지가 농도 약 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240 또는 245mg/L 내지 약 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 또는 500mg/L의 L-메티오닌을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 무혈청 배양 배지가 농도 약 250mg/L의 L-메티오닌을 포함하는 것이 가장 바람직하다. 본 명세서에서 사용된 대로, "메티오닌"은 "L-메티오닌"으로 대체되어 사용될 수 있다.

어떠한 무혈청 배양 배지에 본 발명에 따른 항산화제가 추가될 수 있다. 다음의 시판 가능한 무혈청 배지가 본 발명에 따라 사용될 수 있다: SFM 90 (JRH사, 67350), SFM 90.1 (JRH사, 67350), Supmed 300 또는 Supmed 300 변형 (JRH사, 67350), DMEM [지브코(Gibco)사, 7490571], DMEM/F12 (지브코사, 99.5043), SFM CHO 3a [바이오위트테이크 (Biowhittaker)사], CHO PFM [시그마 (Sigma)사, C6970], EX-CELL 302 (JRH사, 목록 제14312-1000M호) 또는 EX-CELL 325 (JRH사, 목록 제14335-1000M호)와 같은 EX-CELL 배지인 ProCHO 5, CHO-CD3 (시그마사, 목록 제C-1490호), CHO lll PEM (지브코사, 목록 제96-0334SA호), CHO-S-SFM ll (지브코사, 목록 제12052-098호), CHO-DHFR (시그마사, 목록 제C-8862호), ProCHO 5 [캠브렉스 (Cambrex)사, 목록 제BE12-766Q호], SFM4CHO [하이클론 (HyClone)사, 목록 제SH30549.01호], Ultra CHO (캠브렉스사, 목록 제12-724Q호), HyQ PF CHO (하이클론, 목록 제SH30220.01호), HyQ SFX CHO (하이클론, 목록 제SH30187.01호), HyQ CDM4CHO (하이클론, 목록 제SH30558.01호), IS CHO-CD [얼바인 사이언티픽 (Irvine Scientific)사, 목록 제91119호], IS CHO-V (얼바인 사이언티픽사, 목록 제9197호) 및 그것의 유도체. SFM 90, SFM 90.1, SupMed 300, DMEM, DMEM/F12, SFM CHO 3^a 및 CHP PFM의 조성물이 본 발명에 따라 사용될 수 있으며, 하기 표 1에 기재되어 있다.

본 발명의 구성에서 사용될 수 있는 5개의 시판 가능한 무혈청 배양 배지 조성물

본 발명의 바람직한 실시예에서, 무혈청 배양 배지는 화학적으로 정의된 배지, 즉 정제된 성분으로부터 제조된 배지이므로 그것의 정확한 조성물은 알려져 있다. 특히, 화학적으로 정의된 배지는 동물에서 유래된 성분도 불명확한 가수분해물도 포함하지 않는다.

본 발명에 따라 제조될 수 있는 생식샘자극호르몬은 황체형성호르몬 (luteinizing hormone)[LH; OMIM 등록번호 (Accession) 제152780호], 난포자극호르몬 (follicle-stimulating hormone)[FSH; OMIM 제136530호], 융모성 (chorionic) 생식샘자극호르몬 [CG; OMIM 등록번호 제118860호] 및 갑상샘자극호르몬 (thyroid-stimulating hormone)[THS; OMIM 등록번호 제188540호]을 포함한다. 상기 생식샘자극호르몬은 이합체 호르몬이다. 이들 호르몬 각각은 알파 및 베타 서브유니트 (subunit)의 비공유성 (noncovalent) 이합체로 이루어진다. 상기 알파 서브유니트는 모든 4개 호르몬에 동일하고 (OMIM 등록번호 제118850호), 상기 베타 서브유니트는 상기 이합체의 내분비 (endocrine) 기능을 규정한다 (Talmadge et al., 1983).

본 발명의 가장 바람직한 실시예에서, 상기 생식샘자극호르몬은 인간 FSH이다. 본 명세서에 사용된 대로, 상기 용어 "FSH"는 SwissProt 등록번호 제P01215호에 해당하는 알파 서브유니트 및 SwissProt 등록번호 제P01225호에 해당하는 베타 서브유니트로 이루어진 이합체 단백질에 관한 것이다. FSH가 가용성 (soluble), 분비된 (secreted) 단백질이기 때문에, 그것 본래의 신호 펩티드 또는 이종유래 (heterologous) 신호 펩티드에 의해 세포 배양 상청액으로 방출되는데, 상기 이종유래 신호 펩티드는 사용된 특정 발현 시스템에서 더 효과적일 수 있는 또 다른 분비된 단백질에서 유래된 신호 펩티드이다.

상기 용어 FSH는 스플라이스 (splice) 변이체, 대립 (allelic) 변이체, 뮤테인 (mutein), 기능적 유도체, 활성 분획물, 융합 단백질 및 SwissProt 등록번호 제P01215호에 해당하는 알파 서브유니트와 SwissProt 등록번호 제P01225호에 해당하는 베타 서브유니트로 이루어진 이합체 단백질의 원형 변이 (circularly permutated) 단백질을 포함한다.

본 명세서에 사용된 대로, 상기 용어 "뮤테인"은 FSH의 유사체를 의미하는 것으로, 천연 FSH 또는 바이러스성 FSH의 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되거나, 제거되고, 또는 하나 이상의 아미노산 잔기가 FSH의 천연 서열에 첨가되나, 야생 (wild) FSH에 비하여 상기 과정에서 획득한 생산물의 활성을 크게 변화시키지 않는 유사체이다. 상기 뮤테인은 알려진 합성 및/또는 부위 유도성 (site-directed) 돌연변이 기술, 또는 그것에 적합한 다른 알려진 기술을 통해 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 뮤테인은 DNA 또는 RNA와 같은 핵산에 의해 암호화 (encoded)된 단백질을 포함하는데, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA로 혼성화 (hybridize)되어, 엄격한 (stringent) 조건 하에 FSH를 암호화한다. 상기 용어 "엄격한 조건"은 혼성화 (hybridization)와 이어서 일어나는 세척 (washing) 조건을 의미하는데, 당기술에서 통상적으로 "엄격한"이라고 불린다 (참조: Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N. Y. §§ 6.3 및 6.4, 1987, 1992). 제한 없이, 엄격한 조건의 예는 실험, 예를 들어 5분간 2 x SSC 및 0.5% SDS, 15분간 2 x SSC 및 0.1% SDS; 30-60분간 37℃에서 0.1 x SSC 및 0.5% SDS 및 그런 후 30-60분간 68℃에서 0.1 x SSC 및 0.5% SDS로 검토 후 혼성체 (hybrid)의 계산된 Tm 이하 12-20℃의 세척 조건을 포함한다. 또한 상기 엄격한 조건이 DNA 서열, 올리고 뉴클레오티드 프로브 (oligonucleotied probe)[예를 들어, 10-40 염기] 또는 혼합된 올리고 뉴클레오티드 프로브의 길이에 따라 달라진다는 것을 당업자는 알고 있다. 만일 혼합된 프로브가 사용된다면, SSC 대신 테트라메틸 암모늄 클로라이드 (tetramethyl ammonium chloride: TMAC)를 사용하는 것이 바람직하다 (참조: Ausubel, supra).

바람직한 실시예에서, FSH 뮤테인은 자연 발생적 FSH의 서열과 적어도 40% 동일성을 갖는다. 상기 동일성이 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%인 것이 더 바람직하고, 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 것이 가장 바람직하다.

동일성은 두 개 이상의 폴리펩티드 서열 또는 두 개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 관계를 나타내는데, 상기 서열들을 비교하여 결정된다. 일반적으로, 동일성은, 비교되는 서열들의 길이에 대해 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 두 개의 폴리펩티드 서열 각각의 정확한 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 또는 아미노산 대 아미노산 동일성을 의미한다.

정확한 동일성이 존재하지 않는 서열에 대해서, "% 동일성"이 결정될 수 있다. 일반적으로, 비교되는 두 개의 서열이 정렬되어, 상기 서열들 사이의 최대 상관 관계를 제공한다. 이것은 "갭 (gap)"을 하나 또는 두 개의 서열에 삽입하여, 정렬 정도를 향상시키는 단계를 포함할 수 있다. A % 동일성은 비교되는 서열 각각의 전체 길이["전체 정렬 (global alignment)"이라 불림]에 걸쳐 결정될 수 있으며, 이것은 특히 동일한 또는 매우 유사한 길이, 또는 더 짧게 정의된 길이의 서열["국부 정렬 (local alignment)"이라 불림]에 적합하며, 동일하지 않은 길이의 서열에 더 적합하다. 본 발명의 구성에서, 상기 "% 동일성"은 비교되는 서열 각각의 전체 길이에 대해 결정되는 전체 % 동일성을 의미한다.

어느 특정 폴리펩티드가 본 발명의 서열과 동일한 퍼센트인지 결정하기 위해 알려져 있는 컴퓨터 프로그램이 사용될 수 있다. 그러한 알고리즘 (algorithm) 및 프로그램은 예를 들어, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA 및 CLUSTALW (Altschul et al., 1990; Altschul et al., 1997; Higgins et al., 1996; Pearson and Lipman, 1988; Thompson et al., 1994)을 포함한다. 단백질 및 핵산 서열 상동성이 당기술에서 잘 알려진 기본 국부 정렬 검색 툴 (Basic Local Alignment Search Tool: BLAST)을 사용하여 측정되는 것이 바람직하다 (Altschul et al., 1990; Altschul et al., 1997; Karlin and Altschul, 1990).

상기 BLAST 프로그램은 비슷한 세그먼트 (segment)를 동정하여 상동 (homologous) 서열을 동정하는데, 이것은 본 명세서에서, 쿼리 (query) 아미노 또는 핵산 서열과, 바람직하게는 단백질 또는 핵산 서열 데이터베이스로부터 획득된 테스트 서열 사이의 "고득점 세그먼트 쌍 (high-scoring segment pairs)"으로 불린다. 고득점 세그먼트 쌍은 득점 매트릭스 (matrix)에 의해 동정 (즉, 정렬)되는 것이 바람직하며, 이들 중 대부분이 당기술에 알려져 있다. 상기 사용된 득점 매트릭스는 BLOSUM62 매트릭스일 수 있다 (Gonnet et al., 1992; Hnikoff and Henikoff, 1993). PAM 또는 PAM250 매트릭스 또한 사용될 수 있다 (참조: Schwartz and Dayhoff, eds, (1978) Matrices for Detecting Distance Relationships: Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington: National Biomedical Research Foundation). 상기 BLAST 프로그램은 동정된 모든 고득점 세그먼트 쌍의 통계적 유의성 (significance)을 평가하고, 사용자 특이적 (user-specified) % 상동성과 같은 사용자-특이적 역치 (threshold) 유의성을 만족시키는 세그먼트들을 선택하는 것이 바람직하다. 고득점 세그먼트 쌍의 통계적 유의성을 칼린 (Karlin)의 통계적 유의성 공식을 사용하여 평가하였다 (Karlin and Altschul, 1990). 상기 BLAST 프로그램이 디폴트 매개변수 (default parameter) 또는 사용자에 의해 제공된 변형 매개변수 (modified parameter)와 함께 사용될 수 있다.

또한, 쿼리 (query) 서열 (본 발명의 서열)과 개체 (subject) 서열 사이의 최적의 전체 일치 (match)를 결정하기 위한 바람직한 방법은, 전체 서열 정렬로 불리며, 브루트래그 (Brutlag)의 알고리즘에 바탕을 둔 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다 (Brutlag et al., 1990). 서열 정렬에서, 상기 쿼리 서열 및 개체 서열은 둘 다 아미노산 서열이다. 상기 전체 서열 정렬의 결과가 % 동일성이다. FASTDB 아미노산 정렬에 사용된 바람직한 매개변수는 다음과 같다: 매트릭스 (Matrix) = PAM 0, k-tuple = 2, 불일치 패널티 (mismatch penalty) = 1, 연결 패널티 = 20, 무작위 그룹 (randomization group) = 25, 길이 = 0, 차단 (cutoff) 점수 = 1, 윈도우 (window) 크기 = 서열 길이, 갭 (gap) 패널티 = 5, 갭 크기 패널티 = 0.05, 윈도우 크기 = 247 또는 더 짧은 개체 아미노산 서열 길이.

만일 상기 개체 서열이, 내부 결손이 아닌 N- 또는 C- 말단 결손때문에 상기 쿼리 서열보다 짧은 것이라면, 상기 FASTDB 프로그램이 전체 % 동일성을 계산할 때 상기 개체 서열의 N- 및 C- 말단 절단 (truncation)을 계산하지 않기 때문에, % 동일성에서의 결과를 수작업으로 (manually) 수정하여야만 한다. 쿼리 서열과 비교하여, N- 및 C- 말단에서 절단된 개체 서열에 대한, 상기 퍼센트 동일성은, 대응하는 개체 잔기와 일치/정렬되지 않는, 상기 개체 서열의 N- 및 C- 말단인 쿼리 서열의 잔기 수를 상기 쿼리 서열의 총 염기 %로서 계산함으로써 수정된다. 잔기가 일치/정렬되었는지의 여부는 FASTDB 서열 정렬의 결과에 의해 결정된다. 그런 다음 특정 매개변수를 사용하여 상기 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 % 동일성에서 상기 퍼센트를 뺀 후, 최종 % 동일성 점수를 얻는다. 상기 최종 % 동일성 점수는 본 발명의 목적을 위해 사용된 것이다. 상기 쿼리 서열과 일치/정렬되지 않은 상기 개체 서열의 N- 및 C- 말단에 대한 잔기만이, 상기 % 동일성 점수를 수작업으로 조정하고자 할 때 고려된다. 즉, 이러한 잔기는 상기 개체 서열의 가장 멀리 있는 N- 및 C- 말단 잔기 밖에 존재하는 쿼리 아미노산 잔기이다.

예를 들어, % 동일성을 결정하기 위하여 90 아미노산 잔기 개체 서열과 100-잔기 쿼리 서열을 정렬시킨다. 상기 개체 서열의 N-말단에서 결손이 일어나면, 상기 FASTDB 정렬은 N-말단의 첫 번째 잔기들과 일치/정렬되지 않는다. 10개의 홑 (unpaired) 잔기는 상기 서열의 10% (일치되지 않은 N- 및 C- 말단에서의 잔기 수/ 쿼리 서열 잔기의 총 수)를 의미하므로, 상기 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 % 동일성 점수에서 10%를 뺀다. 만일 남아있는 90개의 잔기가 완벽히 일치한다면, 최종 % 동일성은 90%일 것이다.

본 발명에 따른 뮤테인의 바람직한 변화는 "보존성 (conservative)" 치환으로 알려져 있는 것이다. FSH의 보존성 아미노산 치환은, 충분히 유사한 물리화학적 특성을 지닌 그룹, 상기 그룹의 구성원들 사이의 치환이 있어도 분자의 생물학적 기능을 보존하는 그룹 내 동의 아미노산 (synonymous amino acids)을 포함할 수 있는다 (Grantham, 1974). 또한, 그들의 기능을 바꾸지 않으면서도 상기 정의된 서열 내에 아미노산의 삽입 및 결손을 만들 수도 있으며, 특히 만일 상기 삽입 또는 결손이 단지 몇 개의 아미노산, 예를 들어 30개, 바람직하게는 10개 미만의 아미노산과 관련한다면, 기능적 입체형태 (conformation)에 중요한 아미노산, 예를 들어 시스테인 (cystein) 잔기를 제거하거나 치환하지 않는 것이 분명하다. 상기 결손 및/또는 삽입에 의해 제조된 단백질 및 뮤테인이 본 발명의 범위 내에 속한다.

상기 용어 FSH의 "융합 단백질"은 예를 들어, 체액 (body fluid) 에서 연장된 동거 시간 (residence time)을 가지고 있는 또 다른 단백질과 융합된 FSH, 뮤테인 또는 그것의 분절 (fragment)을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들어, FSH는 면역글로불린 (immunoglobulin) 또는 면역글로불린 Fc 부위와 같은 그것의 분절에 융합될 수 있다. 또한 성숙 (mature) FSH의 서열은 신호 펩티드 및/또는 분비를 증가시키는 선도 (leader) 서열에 융합될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 FSH 베타-서브유니트 또는 그것의 분절은 hCG 베타-서브유니트의 카복실-말단 펩티드 (CTP)에 융합된다. 그 결과에 얻어진 단백질은 FSH와 동일한 시험관 내 수용체-결합 및 생물학적 활성을 가지지만, 순환 (circulating) 반감기 (half-life)는 길다 (LaPolt el al., 1992).

FSH 또는 그것의 뮤테인의 "활성 분획물"로서, 본 발명은, 상기 단백질 분자의 폴피펩티드 사슬 (chain)의 분절 또는 전구물질 (precursor)을 단독으로, 또는 관련된 분자 또는 그것에 연결된 잔기, 예를 들어 당 (sugar) 또는 인산염 (phosphate) 잔기, 또는 단백질 분자 또는 그들 스스로에 의한 당 잔기의 응집체 (aggregate)와 함께 포함하며, 다만 상기 분획물이 FSH에 상당히 유사한 활성을 가지고 있어야 한다.

본 명세서에서 사용된 대로, FSH의 "기능적 유도체"는 FSH의 유도체 또는 그것의 뮤테인을 포함하는데, 상기 유도체는 당기술에 알려진 방법으로 상기 잔기 또는 N- 또는 C-말단기 상의 곁사슬 (side chain)로서 일어나는 기능기로부터 제조될 수 있으며, 상기 유도체가 약학적으로 허용가능한, 즉 생식샘자극호르몬의 활성과 상당히 유사한 단백질 활성을 파괴하지 않고 그것을 포함하는 구성성분에 대해 독성을 부여하지 않는 한, 본 발명에 포함된다. 예를 들어, 이들 유도체는 체액에서 FSH의 동거를 연장하고 항원 부위를 감출 수 있는 폴리에틸렌 글리콜 곁사슬을 포함할 수 있다. 다른 유도체는 카복실기의 지방족 (aliphatic) 에스테르, 암모니아 또는 일차 또는 이차 아민과의 반응에 의한 카복실기의 아미드, 아실 모이어티로 형성된 아미노산 잔기의 유리 (free) 아미노기의 N-아실 유도체 [예를 들어, 알카노일 (alkanoyl) 또는 카복시클릭 아로일기 (aroyl group)] 또는 아실 모이어티로 형성된 유리 하이드록실기의 O-아실 유도체 [예를 들어, 세릴 (seryl) 또는 트레오닐 (threonyl) 잔기의 O-아실 유도체]를 포함한다. 바람직한 실시예에서, 상기 기능적 유도체는 추가 글리코실화 (glycosilation)를 나타내는 FSH 분자에 해당한다.

본 명세서에서 사용된 용어 FSH의 "염"은 FSH의 아미노기의 산 부가 염 및 카복실기의 염 둘 다를 의미한다. 카복실기의 염은 당기술에 알려진 방법으로 형성될 수 있으며, 예를 들어 소듐, 칼슘, 암모늄, 페릭 (ferric) 또는 아연 (zinc) 염 등과 같은 무기 염, 및 예를 들어 트리에탄올아민, 아르기닌 또는 리신, 피페리딘, 프로카인 등과 같은 아민으로 형성된 유기 염기로 형성된 염을 포함한다. 산 부가 염은 예를 들어, 염산 또는 황산과 같은 무기산 (mineral acid) 염, 및 예를 들어 아세트산 또는 옥살산과 같은 유기산 염을 포함한다. 물론, 상기 염은 상기 생식샘자극호르몬의 생물학적 활성을 간직하여야만 한다.

본 명세서에 사용된 대로, 상기 용어 "재조합 이합체 샘식생자극호르몬"은 유전자 조작된 세포를 배양함에 따라 제조된 생식샘자극호르몬을 의미한다. 상기 생식샘자극호르몬은 어느 기원의 세포에서도 제조될 수 있다. 상기 이합체 생식샘자극호르몬을 발현하는 유전자 조작된 세포는 상기 이합체 생식샘자극호르몬의 양쪽 서브유니트를 발현한다.

본 명세서에 사용된 대로, 상기 용어 "유전자 조작된 세포"는, 상기 목적 생식샘자극호르몬의 양쪽 서브유니트의 발현을 허용하도록 외인성 (exogenous) DNA가 도입된 세포를 의미한다. 상기 외인성 DNA는 목적 생식샘자극호르몬의 서브유니트를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 상기 외인성 DNA는 상기 목적 생식샘자극호르몬의 서브유니트를 암호화하는 내인성 서열의 발현을 활성화시키는 서열을 포함할 수 있다 (참조: 국제공개공보 제WO91/09955호).

상기 세포는 예를 들어, 동물, 곤충 또는 미생물 기원의 세포일 수 있다. 본 명세서에 사용된 대로, 상기 용어 "동물 세포"는 인간 및 인간 이외의 포유류 세포, 포유류 이외의 세포 및 하이브리도마 (hybridoma)를 포함한다. 재조합 이합체 생식샘자극호르몬이 제조될 수 있는 포유류 세포의 예는, 3T3 세포, COS 세포, 인간 뼈육종 (osteosarcoma) 세포, MRC-5 세포, BHK 세포, VERO 세포, CHO 세포, rCHO-tPA 세포, rCHO- B형 간염표면항원세포 (Hep B Surface Antigen cell), HEK 293 세포, rHEK 293 세포, rC127 - B형 간염표면항원세포, 정상 인간 섬유모세포 (fibroblast cell), 기질 세포 (Stroma cell), 간세포 (Hepatocyte cell), PER.C6 세포 및 인간 영구 (permanent) 양막 세포 (amniocytic cell)를 포함한다. 재조합 이항체 생식샘자극호르몬이 제조될 수 있는 하이브리도마의 예는, DA4.4 세포, 123A 세포, 127A 세포, GAMMA 세포 및 67-9-B 세포를 포함한다.

본 발명의 구성에서, 중국 햄스터 난소 세포 (Chinese Hamster Ovary cell: CHO cell)를 배양하는 것이 바람직하다.

본 발명의 두 번째 양태는, 재조합 이합체 생식샘자극호르몬의 제조 과정 동안 그것의 산화 형 준위를 감소시키는 방법에 관한 것으로, 상기 재조합 이합체 생식샘자극호르몬을 발현하는 세포가 항산화제를 포함하는 무혈청 배양 배지에서 배양되는 것을 특징으로 한다.

본 명세서에서 사용된 대로, 상기 용어 "산화 형"은, 산화제가 하나 이상의 아미노산 잔기의 산화를 일으킨 폴리펩티드를 의미한다. 상기 형은 예를 들어, 실시예 2.1에 기재된 대로 FSH에 대한 HPLC로 검출될 수 있다.

상기 배양은 어느 적합한 환경, 예를 들어 페트리 접시 (Petri dishes), T-플라스크 (flask) 또는 회전병 (roller bottel), 바람직하게는 예를 들어, 생물반응기 (bioreactor)와 같은 부피가 더 큰 용기 (vessel)에서 수행될 수 있다.

상기 배양 단계는 다음을 포함한다:

- 상기 무혈청 배양 배지에 상기 세포 접종;

- 성장 단계; 및

- 제조 단계.

상기 성장 단계는 상기 세포 배양 과정의 일부인데, 여기서 과정 매개변수가 세포 성장을 지원하기 위해 설정된다. 일단 상기 목적 세포 밀도에 도달하면, 상기 세포 배양을 일반적으로 제조 단계로 전환하는데, 여기서 과정 매개변수가 세포 생산성을 지원하기 위해 설정된다. 상기 과정 매개변수는 상기 성장 단계 및 제조 단계동안 동일할 수 있다. 상기 제조 단계 동안, 세포 농도가 1.10⁶ 내지 5.10⁷ 세포/mL, 예를 들어 약 1.10⁶, 5.10⁶, 10⁷ 또는 5.10⁷ 세포/mL을 포함하는 값을 갖는 것이 바람직하다. 상기 세포가 CHO 세포인 것이 가장 바람직하다.

일 실시예에서, 항산화제를 무혈청 배양 배지에 첨가한 후, 세포를 접종한다. 또 다른 실시예에서, 상기 세포를 접종한 직후 (예를 들어, 접종 후 24시간 내), 상기 항산화제를 상기 무혈청 배양 배지에 첨가한다.

상기 제조 과정이 상기 재조합 이합체 생식샘자극호르몬을 포함하는 배지를 수집하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.

바람직한 실시예에서, 상기 제조 과정이 재조합 이합체 생식샘자극호르몬을 정제하는 단계를 더 포함한다. 생식샘자극호르몬을 정제하는 방법은 당기술에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 유럽특허 제EP 04 105 639.1호 국제공개공보 제WO 98/20039호, 제WO 00/63248호 또는 제WO 88/10270호에 기재된 대로 FSH를 정제할 수 있다.

또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 제조 과정은 상기 재조합 이합체 생식샘자극호르몬을 약학적으로 허용가능한 담체로 제형화하여 약학 조성물을 얻는 단계를 더 포함한다.

본 명세서에 사용된 대로, 상기 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 활성 성분의 생물학적 활성의 유효성을 저해하지 않고, 투여되는 숙주에 독성을 끼치지 않는 것이라면 어떤 담체라도 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 비경구 투여를 위해, 상기 활성 단백질은 예를 들어 식염수 (saline), 덱스트로스 (dextrose) 용액, 혈청 알부민 및 링거 (Ringer's) 용액으로 주사하기 위한 단위 투여량 형태로 제형화될 수 있다.

그런 후, 본 발명에 따라 제형화된 약학 조성물을 개인에세 다양한 방법으로 투여할 수 있다. 투여 경로는 진피내 (intradermal), 경피내 (transdermal)[예를 들어, 서방형 (slow release) 제형], 근육내 (intramuscular), 복막내 (intraperitoneal), 정맥내 (intravenous), 피하 (subcutaneous), 경구 (oral), 두개내 (intracranial), 경막외 (epidural), 국소 (topical), 직장 (rectal) 및 비강내 (intranasal) 경로를 포함한다. 다른 치료적으로 효과적인 투여 경로, 예를 들어 상피 (epithelial) 또는 내피 (endothelial) 조직을 통한 흡수, 또는 활성인자를 암호화하는 DNA 분자를 환자에게 투여하는 [예를 들어, 벡터 (vector)를 통해] 유전자 치료법이 사용될 수 있는데, 상기 DNA 분자에 의해 상기 활성인자가 생체내 발현 및 분비된다. 더욱이, 본 발명에 따른 단백질은, 예를 들어 약학적으로 허용가능한 계면활성제, 부형제, 담체, 희석제 및 운반체와 같은 생물학적 활성인자의 다른 구성성분과 함께 투여될 수 있다. 비경구 (예를 들어, 정맥내, 피하, 근육내) 투여를 위해, 약학적으로 허용가능한 비경구 운반체 (예를 들어, 물, 식염수, 덱스트로스 용액), 및 등장성 (isotonicity)[예를 들어, 만니톨 (mannitol)] 또는 화학적 안정성 (예를 들어, 보존제 및 완충제)을 유지하는 첨가제와 함께, 용액, 현탁액, 에멀젼 (emulsion), 동결건조 (lyophilized) 분말로 활성 단백질이 제형화될 수 있다. 상기 제형은 일반적인 기술에 의해 멸균 (sterilized)된다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 재조합 이합체 생식샘자극호르몬의 제조 과정 동안 그것의 산화 형 준위를 감소시키는 방법은, 상기 제조 과정의 적어도 두 개, 세 개, 네 개, 다섯 개 또는 여섯 개의 단계가 항산화제의 존재 하에서 수행되는 것이 특징이다. 상기 제조 과정의 모든 단계가 항산화제의 존재 하에서, 즉 전 제조 과정이 항산화제의 존재 하에서 수행되는 것이 바람직하다.

예를 들어, 재조합 이합체 생식샘자극호르몬의 제조 과정 동안 그것의 산화 형 준위를 감소시키는 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다:

- 항산화제를 포함하는 무혈청 배양 배지에서 상기 재조합 이합체 생식샘자극호르몬을 발현하는 세포 배양 단계;

- 상기 재조합 이합체 생식샘자극호르몬을 포함하는 배지 수집 단계; 및

- 항산화제의 존재 하에서 상기 재조합 이합체 생식샘자극호르몬 정제 단계.

재조합 이합체 생식샘자극호르몬의 제조 과정 동안 그것의 산화 형 준위를 감소시키는 방법이, 항산화제를 포함하는 약학 조성물로 상기 재조합 이합체 생식샘자극호르몬을 제형화하는 단계를 더 포함하는 것이 바람직하다.

상기 항산화제는, 항산화제가 사용된 상기 제조 과정의 모든 단계에서 동일할 수 있다. 대안적으로, 다른 항산화제가 배양 단계, 정제 단계 및/또는 제형화 단계에서 사용될 수 있다. 항산화 효과를 지닌 무수한 화합물들이 당기술에 알려져 있다. 이러한 화합물들은, 예를 들어 시스테인 (cystein), 아스코르빈산, L-메티오닌, L-글루타티온, 2-메르캡토에탄올, 알파-토코페롤 및 그것의 유도체, BO-653, t-부틸-4-메톡시-페놀, 2,6-bis(1,1-디메틸에틸)-4-메틸 페놀; 포타슘 또는 소듐 비메타(bimate)-비술파이트(bisulfite), 소듐 비술파이트, 히스티딘 (histidine), 타우린 (taurine), 글리신 (glycine), 알라닌 (alanine), 카르노신 (carnosine), 안세린 (anserine) 및 1-메틸히스티딘을 포함한다.

본 발명의 세 번째 양태는 재조합 이합체 생식샘자극호르몬 제조용 무혈청 배양 배지에 관한 것으로, 상기 배양 배지는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항산화제를 포함하는 것을 특징으로 한다:

- 농도 약 1 내지 20mg/L의 L-글루타티온;

- 농도 약 5 내지 15mg/L의 2-메르캡토에탄올;

- 농도 약 200 내지 500mg/L의 L-메티오닌; 및

무혈청 배양 배지는 일반적으로, 물, 오스몰농도 (osmolarity) 조절제, 완충제, 에너지원, 아미노산, 무기 또는 재조합 철원 (iron source), 재조합 또는 합성 성장 인자, 및 선택적 비철 (non-ferrous) 금속 이온, 비타민 및 보조인자 (cofactor)를 포함한다. 예를 들어, 상기 기재된 상업적으로 이용가능한 무혈청 배지가 본 발명에 따라 변형될 수 있다.

이제 본 발명을 완전히 기술함으로써, 본 발명의 기술적 사상의 범위를 벗어나지 않고도 과도한 실험 없이, 다양한 범위의 등가 매개변수, 농도 및 조건 내에서 상기 발명이 수행될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다.

본 발명이 그것의 구체적인 실시예와 관련하여 기술되지만, 더 변형될 수 있다는 것 또한 이해될 것이다. 본 발명은, 일반적으로 본 발명의 원칙에 따른 본 발명의 변형, 사용 또는 적용을 포함하며, 본 발명이 속한 당기술 내에 공지 또는 관행된 범위 내이며, 상술된 기본적 특징이 적용될 수 있는 것으로 본 발명에서 벗어난 것을 포함하는 첨부된 청구항의 범위 내에서이다.

본 명세서에 인용된 모든 참조문은 저널 (journal) 기사 또는 발췌문, 공개 또는 공개되지 않은 미국 또는 외국 특허 출원서, 발행된 미국 또는 외국 특허 또는 다른 참조문를 포함하며, 인용된 참조문에 존재하는 모든 데이터, 표, 도형 및 본문 (text)을 포함하여, 본 명세서에서 참조로 전체 통합된다. 추가적으로, 본 명세서에서 인용된 참조문 내에 인용된 참조문의 전체 내용 또한 참조로 전체 통합된다.

알려진 방법 단계, 종래의 방법 단계, 알려진 방법 또는 종래의 방법을 참조하는 것이, 본 발명의 양태, 상세한 설명 또는 실시예가 관련 기술에서 공개, 설명 또는 제시되었다는 것을 인정하는 것은 아니다.

하기 구체적인 실시예의 설명이 본 발명의 일반적인 본질을 완전히 드러냄으로써, 다른 사람이 과도한 실험 없이, 본 발명의 일반적인 개념을 벗어나지 않고, 당기술 내의 지식 (본 명세서에 인용된 참조문들의 내용을 포함)을 적용하여, 구체적인 실시예를 다양하게 응용하기 위해 손쉽게 변형 및/또는 적용할 수 있다. 따라서 상기 적용 및 변형이, 본 명세서에 존재하는 설명 및 지시를 바탕으로, 공개된 실시예의 등가 범위 내에 있다는 것을 의미하고자 한다. 본 명세서의 어구 (phraseology) 및 용어 (terminology)는 제한이 아닌, 설명을 위한 것이므로, 본 명세서의 어구 및 용어는 일반적인 당기술 중 하나의 지식과 결합하여, 본 명세서에 존재하는 설명 및 지시에 비추어서 당업자에 의해 해석될 것이라는 것 또한 이해될 것이다.

실시예 1 : 세포 배양 과정

1.1. 세포주 및 배지

인간 FSH의 양쪽 서브유니트를 발현하는 CHO 세포주로 모든 실험을 수행하였다. 제조된 단백질은 rFSH로 불리는 이합체 생식샘자극호르몬이다. 알파 서브유니트는 SwissProt 등록번호 제P01215호에 해당하고, 베타 서브유니트는 SwissProt 등록번호 제P01225호에 해당한다.

세포 배양을 위해 사용된 배지는 CHO 세포 배양을 위해 설계된 기본 무혈청 배지 (SFM)였다. 상기 SFM 배지에 항산화제가 추가되어, 실시예 3에 상세히 기재된 대로 테스트하였다. 상기 기본 SFM에서 테스트되는 상기 항산화제의 최초 농도가 표 2에 나와있다.

기본 무혈청 배지에서 항산화제의 최초 농도

1.2. 접종, 성장 및 제조 조건

배양 과정은 또한 "런 (run)"으로 불리며, 접종 단계, 성장 단계 및 제조 단계를 포함한다. 런 1, 2, 3, 4 및 5로 불리는 다섯 개의 다른 런이 수행되었다.

적어도 2.4.10⁹ 생존가능한 rFSH-제조 세포를, 미립담체 (microcarrier)를 포함하는 유효한 작용 (working) 부피 11 L (newMBR, Zurich)의 생물반응기 15 L로 옮겼다. 시드 (seeding)한 후 바로, 배취 (batch) 단계를 수행하였으며, 2일 또는 3일 동안 지속한다. 그런 후, 상기 생물반응기에 희석비율 1 day^-1 및 관류율 (perfusion rate) 11 L.day^-1까지 SFM을 계속해서 공급하였다.

성장 단계 및 제조 단계를 동일한 pH 및 온도 (37℃, pH = 7)에서 수행하였다. 용존 산소량 (Dissolved Oxygen: DO)을 전체 런 동안 공기 포화 (air saturation) 50%로 유지하였다.

실시예 2 : 분석법

2.1. rFSH 의 산화 형 결정

바세트 (Bassett) 및 드리에베르겐 (Driebergen)[Basset and Briebergen, 2005]에 의해 설명된 대로 조획득물 (crude harvest)에 대한 RP-HPLC로 산화 형을 결정하였다.

참조로서 런 2에서 280mg/L의 L-시스테인으로 획득한 산화 형의 퍼센트를 사용하여 산화 형 퍼센트를 표준화하였다 (즉, 산화 형의 퍼센트를 23.4%로 나누었다).

2.2. 총 생존가능한 세포 농도 측정

총 생존가능한 세포 농도는 미립담체에 부착된 세포 농도 및 현탁액에서 생존가능한 세포 농도의 총 합으로 정의된다. 크리스탈 바이올렛 핵 계측 방법 (crystal violet nuclei counting method)[플루카사, 61135]을 사용하여 상기 미립담체에 부착된 세포의 농도를 측정하였다. 현탁액에서 생존가능한 세포의 농도는, 트리판 블루 배제 방법 (Trypan blue exclusion method)[시그마사, T-8154]을 사용하여 결정하였다.

총 생존가능한 세포율 (Total Viable Cells Ratio: TVC율)을 다음과 같이 계산하였다: [테스트 말의 총 생존가능한 세포 농도]/[테스트 개시시 총 생존가능한 세포 농도], 여기서 상기 테스트 개시는 새로운 항산화제를 배양액에 도입하는 날로 정의되고, 상기 테스트 말은 그 다음 항산화제를 배양액에 도입하기 전 날로 정의된다.

2.3. rFSH 역가 측정

왈락 (Wallac)-ADL (cat. n°A017-201)사의 델피아 (Delphia) hFSH 키트 (kit)를 사용하여, 면역형광 분석 (immunofluorimetric assay)으로 rFSH 역가를 측정하였다.

2.4. 글루코스 소모율 ( glucose consumption rate : GCR ) 측정

리터 당 및 하루 당 그램으로 표시된 글루코스 소모율 (GCR)을 다음과 같이 계산하였다: GCR = (G_o - G_t)D_t + (G_t _-1 - G_t), 여기서, G는 "글루코스 농도"를 나타내고 D는 "희석율"을 나타내고, 지수는 다음을 나타낸다:

- O: 공급 SFM

- t: 시간 t에 측정; 및

- t-1: 시간 t-1에 측정.

실시예 3 : 다양한 항산화제 효과

무혈청 과정을 통해 획득된 산화 형 준위를 감소시키기 위해, 두 개의 15 L 런 (런 1 및 런 2)을 다양한 항산화제의 효과를 테스트하며 수행하였다. 어떠한 항산화제도 첨가하지 않은 런을 대조군 (런 3)으로서 수행하였다.

표 3에 나와있는 최종 농도에 도달하기 위해, SFM에 몇 가지 항산화제 또는 항산화제 혼합물들을 추가하였다. 각각의 항산화제 또는 항산화제 혼합물을 약 10일 동안 테스트하였다. 테스트 첫 날에, 세트포인트 (set-point)에 도달하기 위해 필요한 양의 항산화 용액을 첨가하였다. 그 후 매일, 일정량의 항산화제를 관류 (perfusion)로 생물반응기에서 씻어내리고, 한 번 첨가 (희석율 1 d^-1에 대해, 생물반응기 부피 63.2%를 매 24시간 마다 회복시켰는데, 이는 매일 대체되는 항산화제의 양을 의미함)로 대체하였다. 상기 실험 기간 말에, 상기 항산화제를 관류로 생물반응기에서 씻어내리고, 테스트될 다른 항산화제로 대체하였다.

rFSH의 산화 형 퍼센트를 각각의 테스트 말에 측정하였다 (표 3). 1.0 보다 낮은 표준값은, rFSH 산화 형 준위를 감소시키는 데 있어, 테스트된 항산화제가 L-시스테인보다 더 유효하다는 것을 나타낸다.

총 생존가능한 세포 농도, GCR 및 rFSH 역가를 매일 측정하였다. 표 3은 총 생존가능한 세포율 (TVC율)을 나타낸다. 1.0과 동일하거나 그보다 높은 TVC율은, 테스트된 항산화제가 세포에 대해서 독성 효과를 갖지 않는 것을 나타낸다.

rFSH 의 산화 형에 대한 항산화제 효과

표 3에 기재된 결과는, 2-메르캡토에탄올, 아스코르빈산과 (+)-알파-토코페롤의 혼합물, L-메티오닌, 및 L-글루타티온이 rFSH 산화 형의 낮은 준위를 얻기에 최고의 항산화제임을 보여준다.

오직 2-메르캡토에탄올의 경우에만 1.0보다 낮은 총 생존가능한 세포율, TVC율이 획득된다. 따라서, 2-메르캡토에탄올을 제외한 런 1 및 2에서 테스트된 모든 항산화제가 비-독성이다. 더욱이, GCR 및 rFSH 역가 측정에 따르면, 상기 다양한 항산화제 중 어느 것도 대사 (metabilism) 및 생산성 패턴 (productivity pattern)에 주요한 영향을 끼치지 않는다 (데이터 미도시).

제조 과정의 최적화를 위해 L-메티오닌 및 L-글루타티온을 선택하였다. 한 번의 런 (런 3)을 수행하여, 다양한 농도의 L-글루타티온 (1 내지 20mg/L)을 테스트하고, 한 번의 런 (런 4)을 수행하여 다양한 농도의 L-메티온 (0.25 내지 3mg/L)을 테스트하였다. L-글루타티온을 테스트하는 런 3을 제조 30일째에 조기 (prematurely) 중단하였는데, 이는 미립담체가 손상되었기 때문이다. 런 3 및 4 동안 L-글루타티온 또는 L-메티오닌의 테스트된 농도가 표 4에 나와있다. 작용일 0 (WD0)은, 상기 생물반응기가 시드 (seed)되는 동안의 일자로 정의된다. 제조일 0 (WD0)은, 상기 세포 배양 과정이 성장 단계에서 제조 단계로 바뀌는 동안의 일자로 정의된다. 더욱이, 상기 항산화제 농도를 변화시키지 않고 런을 수행하였다. 상기 런에서, L-메티오닌을 시작부터 250mg/L로 첨가하였다 (런 5). 모든 런에 대해, rFSH의 산화 형 퍼센트를 규칙적으로 측정하였다 (표 5).

런 3 및 4에서 항산화제 농도

rFSH 의 산화 형에 대한 항산화제의 효과

항산화제가 배양 배지에 첨가되었을 때의 산화 rFSH 형 분석은, L-메티오닌이 좋은 항산화제인 것을 보여준다. 런 5에서, 250mg/L의 L-메티오닌의 존재 하에서 세포를 배양하였는데, 산화 형의 평균 퍼센트가, 항산화제로써 L-시스테인을 사용한 런 1 및 런 2에서 획득한 결과에 비하여 약 40% 정도 감소하였다 (참조: 표 3 및 5). L-글루타티온 또한, 특히 농도 약 2.5mg/L에서 좋은 항산화제이다. 런 3에서, 상기 세포가 농도 약 2.5mg/L의 L-글루타티온의 존재 하에서 배양되었을 때, 항산화제로써 L-시스테인을 사용한 런 1 및 런 2에서 획득한 결과에 비하여, 상기 산화 형 퍼센트가 약 35% 감소하였다 (참조: 표 3 및 5).

L-메티오닌의 농도가 증가함에 따라 런 4에서 산화 형 퍼센트가 250과 2000mg/L 사이에서 감소하는 경향이 있는 것처럼 보인다. 하지만 전체 런에 대해 농도 250mg/L의 L-메티오닌 하나를 테스트하는 런 5에서 유사한 변이 (variation)가 관찰되었기 때문에, 관찰된 차이가 방법 변동성 (variability) 내에 있는 것처럼 보인다. 더욱이, L-글루타티온 및 L-메티오닌이 테스트된 농도 범위 안에서, 세포 생존능력, 대사 및 생산성 패턴에 주요한 영향을 끼치지 않는 것으로 확인되었다 (데이터 미도시).

참조

Claims

재조합 이합체 생식샘자극호르몬의 제조 과정 동안 상기 재조합 이합체 생식샘자극호르몬의 산화 형 준위를 감소시키기 위한 무혈청 배양 배지로서, 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항산화제를 포함하는 무혈청 배양배지:

- 농도 1 내지 20mg/L의 L-글루타티온;

- 농도 5 내지 15mg/L의 2-메르캡토에탄올;

- 농도 200 내지 400mg/L의 L-메티오닌; 및

- 농도 10 내지 50mg/L의 아스코르빈산과 농도 5 내지 25mg/L의 (+)-알파-토코페롤의 혼합물.
제1항에 있어서, 상기 항산화제가 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 무혈청 배양 배지:

- 농도 3mg/L의 L-글루타티온;

- 농도 10mg/L의 2-메르캡토에탄올;

- 농도 250mg/L의 L-메티오닌; 및

- 농도 30mg/L의 아스코르빈산과 농도 14mg/L의 (+)-알파-토코페롤의 혼합물.
제1항에 있어서, 상기 배양 배지가 화학적으로 정의된 배지인 것을 특징으로 하는 무혈청 배양 배지.
제1항에 있어서, 상기 배양 배지가 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 무혈청 배양 배지:

SFM 90, SFM 90.1, SupMed300, DMEM, DMEM/F12, SFM CHO 3a, CHP PFM, ProCHO 5, EX-CELL, CHO-CD3, CHO Ⅲ PFM, CHO-S-SFM Ⅱ, CHO-DHFR, SFM4CHO, Ultra CHO, HyQ PF CHO, HyQ SFX CHO, HyQ CDM4CHO, IS CHO-CD 및 IS CHO-V.
제4항에 있어서, 상기 이합체 생식샘자극호르몬이 난포자극호르몬 (FSH)인 것을 특징으로 하는 무혈청 배양 배지.
제1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 이합체 생식샘자극호르몬이 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 제조되는 것을 특징으로 하는 무혈청 배양 배지.
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