KR101339915B1 - 항당화 및 항노화 활성이 우수한 캐럽콩추출물의 제조방법 및 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 항노화 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 효소반응에 의해 생물전환된 캐럽콩 (Ceratonia Siliqua (Carob) Fruit) 추출물의 제조방법 및 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 항당화 및 항노화 화장료 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는 캐럽콩추출물에 당결합 분해 효소를 처리함으로써 사이클리톨 유도체(Cyclitol Derivatives)를 피니톨(pinitol)로 전환시키며, 추출물 내의 다른 활성성분과의 상승작용에 의하여 항당화, 항산화, 콜라게나아제 발현 저해 및 항염 활성이 우수한 추출물을 제조하며, 이를 항노화 화장료 조성물의 제조에 이용하는 기술에 관한 것이다.

Description

항당화 및 항노화 활성이 우수한 캐럽콩추출물의 제조방법 및 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 항노화 화장료 조성물{Preparation method for Ceratonia Siliqua Fruit Extract and cosmetic composition for anti-aging comprising the same}

본 발명은 효소반응에 의해 생물전환되어 항당화 및 항노화 활성이 우수한 캐럽콩(Ceratonia Siliqua(carob) Fruit) 추출물의 제조방법 및 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 항노화 화장료 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는 캐럽콩추출물에 특정한 당결합 분해 효소를 처리함으로써 생물전환시켜 항당화, 항산화, 콜라게나아제 발현 저해 및 항염 활성이 우수한 추출물을 제조하며, 이 추출물을 항노화 화장료에 이용하는 기술에 관한 것이다.

피부는 인체의 모든 장기와 기관을 싸고 있는 기관으로 체중의 15~20%를 차지할 정도로 가장 큰 기관으로 외부 침입으로부터 신체를 보호하며, 체내의 수분과 온도를 보존하여 체내의 항상성을 조절하는데 중요한 역할을 한다. 피부의 노화는 나이가 들어가면서 자연적으로 발생하는 변화이며 그 밖에도 자외선, 담배 및 환경오염 등 많은 외부적 인자에 의해서 발생한다. 피부의 노화는 크게 두 가지로 나눌 수 있는데, 하나는 나이가 들어감에 따라 collagen, ellastin 등 세포외 기질 단백질의 합성양이 줄어들고 탄력이 감소되며 피부세포 내 수분이 손실되고 각질층의 구조가 변하는 내인성 노화와 다른 하나는 태양광선의 자외선 등과 같은 외부자극이 반복되면서 활성산소종(reactive oxygen species,ROS)을 발생시키고, 사이토카인의 생성이 촉진되어 여러 가지 신호전달 체계를 활성화시킴으로써 activator protein-1(AP-1)과 nuclear factor κB(NF-κB)의 활성화에 의한 염증반응이 유도되어 피부를 구성하는 지질, 단백질, 핵산, 효소 등이 손상되어 노화가 일어나는 외인성 노화로 나눌 수 있다.

특히, 주름, 피부톤 변화, 착색 등이 피부노화와 연관된 변화이다. 나이와 연관된 피부 변화는 피부에 유전적으로 내포된 변화(내재성 요인)와 환경적인 영향(외재성 요인)의 결과이다. 그 두 가지가 피부의 구조와 기능에 대한 영향을 주는데 있어, 외재성 요인이 더 변화에 영향을 주는 원인이다. 우리가 보는 피부노화상태의 80 ~ 99%가 photoaging과 연관된 일광에 노출되어 나타난 결과들이다. photoaging의 현상들은 주름형성의 증가, 장력과 탄력의 감소, 혈관 공급과 피부두께의 변성, 과색소 침착, 다른피부변색, 모세혈관확장(모세혈관확장증), 피부의 수분결합성질의 감소 등이다.

최근 과학자들은 이 구조적 변화들에 대해 자외선의 노출을 주 요인으로 보고 있다. 최근 몇 년 동안 그들은 이러한 변화를 선동하는 실제 생화학적 계기를 이해하고 있다.

피부 내에서 발생하고 포함하는 화학 반응에는 프리 라디칼 (free radical)로 잘 알려진 활성산소종(reactive oxygen species) 생성, 콜라겐 생합성 과정에서 분해작용을 하는 메탈로프로테아제(Matrix Metalloproteinase or MMPs)의 활성화, 최종당화생성물(Advanced Glycation End-products or AGEs)을 만드는 당화 (glycation)반응이 있다.

활성산소종(Reactive Oxygen Species, ROS)은 산소이온, 프리라디칼 그리고 과산화물들을 포함한다. ROS는 일반적으로 매우 작은 분자이고 짝이 없는 전자의 존재로 인해 강렬한 반응성을 갖는다. ROS는 산소의 일반적으로 대사된 자연 부산물로 이루어진다. 환경적 스트레스를 받는 시간 동안, ROS 수위는 세포 구조의 손상을 주는 주요 원인으로, 극적으로 상승하게 된다. 이것이 노화와 질병과 연관된 퇴행성 질환의 주 원인인 산화적 스트레스로 잘 알려져 있다. 그림은 피부의 UV-유도된 손상이 활성 산소종에 의해 발생한 것을 보여준다. 또한, 세포 멤브레인에 ROS 손상의 결과인 지질과산화는 조기 노화, 피부 암, 세포 사멸 등을 초래한다.

메탈로프로테아제(Matrix Metalloproteinases)는 효소들이다. 이것이 활성화될 때, 진피 내 조직결합 분해를 조절한다. MMPs는 진피 내의 세포외교질 안에 있는 특정 콜라겐과 다른 단백질들을 특이적으로 분해하는 콜라게나제(collagenase)를 포함하고 있다. 콜라게나제(Collagenase)는 콜라겐과 엘라스틴(elastin)을 다른 형태로 분해시킬 수 있는 효소들이다. 예를 들어, collagenase-1, 또는 MMP-1은 collagen I, II, III, VII와 X에 대해 작용한다. MMP-1은 콜라겐의 3중 나선(Helix strand)을 자연스럽게 젤라틴으로 이루어진 펩타이드로 변성되는 더 작은 조각으로 분해한다. 그리고 이들 변성 펩타이드는 다른 MMPs에 의해 더 분해가 진행된다. 이런 작용들은 노화와 상처치유의 필수적 부분인 결합 조직을 재구성하는데, MMPs가 결정적 역할을 한다.

한편 콜라겐과 엘라스틴 단백질(elastin proteins)은 당화(glycation)라고 하는 신체 내부의 화학반응에 영향받을 가능성이 높다. 이것은 프로틴(proteins)이 가지고 있는 프리 아미노기(free amino groups)와 글루코즈(glucose)와 같은 당과의 결합을 가져오는 비효소적 반응이다. 세포의 에너지를 제공하는 글루코즈는 콜라겐과 같은 프로틴(proteins)과 반응을 할 수 있고, 이는 Advaned Glycation End-products와 활성산소종(Reactive Oxygen Species)을 생성하는 결과를 갖는다. 이것들은 프로틴 파이버(protein fibers)의 교차결합, 탄력의 손실, 노화과정과 연관된 진피 내의 변화 등의 영향을 미친다.

피부 내 AGEs가 생성될 때, 이것들은 receptor site에 작용하고 Receptor-AGE(R-AGE)로 알려진 complex를 형성한다. R-AGE는 염증과 후유증세와 연관된 세포 내 과정을 신호전달한다. 이것들은 염증이 노화 과정과 많은 질병에 촉매역할을 하는 주 요인이기 때문에 중요하다. 예를 들어, 당뇨병은 높은 혈중 당수치를 갖는 특징을 가지고 있고 몸 안에 AGEs의 생성에 의해 나타나는 백내장, 동맥경화증과 같은 많은 합병증이 동반된다. 이런 이유 때문에, 당뇨병은 AGEs 형성에 의해 높아진 염증 때문에 노화를 가속화하는 질병으로 보고 있다. 이것은 당뇨병에만 국한되지 않는다. 근력저하, 심장 질환과 뇌 관련 많은 질병들이 glycation과 연관되어 진다. 과학자들은 glycation을 감소시키는 것이 노화과정과 질병유발을 늦출 수 있는 의미를 가진다고 본다. Advanced Glycation End-products의 생성은 피부가 어떻게 나이를 먹는지, 우리 몸 안에 질병 생성의 메카니즘을 결정할 수 있는 가장 주목받는 연구분야 이다.

캐럽콩(Ceratonia siliqua L.)은 캐럽나무에 열린 꼬투리 안에 있는 콩으로 오랫동안 인간의 영양원으로 이용되어진 열매이다. 캐럽나무는 지중해에서 대부분 자생하는 것으로, 일부 미국, 남중아프리카, 오스트리아 지역에서도 자란다. 캐럽콩의 주요 생산국은 스페인, 이탈리아, 모로코, 포르투칼 그리고 그리스 순이다. 캐럽 열매 안에 씨로부터 추출되는 로커스트 콩검(Locust Bean Gum)을 생산하기 위해 산업적으로 이용되고 농밀화제 및 안정화제로 음식에 널리 이용되고 있다. 캐럽 열매의 90%이상을 차지하는 펄프에는 탄수화물, 미네랄, 단백질, 불용성 식이섬유 그리고 여러 가지 폴리페놀화합물들을 함유하고 있다. 캐럽의 펄프로부터 얻은 파우더는 과자류, 음료, 빵 또는 파스타의 제조에 이용된다. 캐럽파우더는 특히, 저지방, 저칼로리, 고식이섬유 그리고 고칼슘의 제품을 셍산하기 위해 코코아 대용으로 종종 이용이 된다. 또한, 무카페인, 무씨오브로민 그리고 무콜레스테롤의 원료이기도 하다. 캐럽 펄프 파우더에 대한 여러 생물활성 효능이 보고되어 있다. 이것은 특히 유아용 지사제로 이용이 되고 있다. 또한, 열수 추출물은 높은 항산화력과 자유라디칼 소거능을 가지고 있으며 간세포에서 항증식성의 효과를 갖고 있다.

이와 관련하여 대한민국 등록특허 제0753982호에는 (a) 캐롭 시럽을 적당한 농도로 희석한 후 미생물의 배양을 통하여 일반당 성분을 제거하는 공정; (b) 상기 미생물 배양에 의해 생성된 균체를 원심분리나 여과를 통해 제거시키는 전처리 공정; (c) 상기 미생물이 효모일 경우 생성된 에탄올 성분을 증류로 제거하는 공정; (d) 상기 시료로부터 활성탄 컬럼을 이용하여 피니톨을 효율적으로 회수하는 공정; 및 (e) 상기 시료를 농축한 후 에탄올을 첨가하여 피니톨의 결정을 형성시키는 공정을 포함하는 캐럽시럽으로부터의 피니톨 회수방법이 개시되어 있다.

20세기 들어 화학공업의 급속한 발전은 전자, 기계, 금속산업을 포함한 모든 산업발전에 획기적인 기여를 해왔다. 그러나 인류생활을 보다 풍요롭고 윤택하게 하기 위한 과학발달이 심각한 환경문제를 야기시키고 있다. 때문에 고온, 고압, 고독성의 시약 및 용매하의 극렬한 반응 조건을 요구하는 화학공정을 상온, 상압, 안전한 용매계를 사용하는 온화한 조건의 생물반응공정으로 대체하려는 연구가 일찍부터 시작되었고, 그 결과 많은 화학공정이 생물반응계로 대체되고 있다. 생물전환기술(biotransformation), 생물전환(bioconversion), 생합성(biosynthesis), 생촉매(bio-catalysis) 등으로 불리는 이 기술은 효소적 기능을 이용하여 전구 물질로부터 원하는 산물을 제조할 수 있다.

생물전환 기술은 여러 분야에서 폭넓게 이용되고 있는데, 유해한 물질을 비독성 물질로 바꾸는 생물학적 교정(bioremedation), 정밀 화학품 제조, 식품가공, 그리고 의약품 생산 등이 주요 응용분야이다. 특히 의약품 개발에 있어서 생물전환 공정은 여러 가지 방법으로 이용되어 의약품의 유용성 및 효과성을 향상시키는 데 기여할 수 있다. 생물전환 공정은 의약품을 광학적으로 순수한 형태로 제조할 수 있다는 이점을 가질 뿐 아니라, 기존의 베타락탐계 항생제, 싸이클로스포린 및 스테로이드와 같은 복잡한 구조를 갖는 화합물의 유도체를 만들어 물성은 물론 활성도 개선할 수 있다는 장점을 지닌다.

최근 과학기술의 발전과 함께, 화장품의 기술트랜드에 따르면, 현재 국내에서는 품목 간 크로스 오버 현상을 좀 더 강화할 것으로 전망되고 있고, 동안 열풍이 시작된 지는 오래됐으나 더 과학적이고 색다른 방법이 제시되고 있어 항산화, 항당화, 열노화 방지, 유전자 활성화 등 첨단 과학의 방법이 동원되어 노화방지 콘셉트를 포함하는 소재들이 출시되고 있다. 따라서, 생체에 안전하고 자유라티칼의 소거능 및 콜라게나제 (MMP-1)의 발현 저해와 당화반응 및 AGEs 생성을 억제하는 유효성분 개발이 절실히 요망되고 있다.

이에 본 발명자들은 천연에서 자생하는 식물들 중에서 혈당조절 효과가 우수한 캐럽콩추출물을 활용하여 피부 항노화 효능을 더욱 증대시킬 수 있는 방법을 연구한 결과, 캐럽콩추출물을 특정한 방법에 의하여 효소반응에 의해 생물전환시키는 경우 특정 유효성분이 강화되어 항당화, 항산화, 콜라게나아제 발현 저해 및 항염 효과가 현저히 증가함을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 노화로 인해 발생할 수 있는 다양한 피부 현상들을 해결하기 위하여 캐럽콩을 특정 효소와 함께 반응시킴으로서 캐럽콩추출물의 특정 활성성분을 강화시켜, 항당화, 항산화, 콜라게나아제 발현 저해 및 항염 활성이 우수한 캐럽콩추출물을 제조하는 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 이 효소처리 캐럽콩추출물을 유효성분으로 함유하여 항당화 및 항노화 효과를 갖는 화장료 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 캐럽콩을 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트 및 클로로포름으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 용매로 추출하는 캐럽콩추출물 제조단계; 상기 캐럽콩추출물을 용매에 용해시키고 당결합 분해효소를 첨가하는 효소첨가단계; 및 상기 효소가 첨가된 추출물을 교반하면서 효소반응을 실시하는 효소반응단계를 포함하는 효소처리 캐럽콩추출물의 제조방법이 제공된다.

상기 효소반응은 반응 pH 3.5 ~ 5.0, 반응온도 25 ~ 50℃ 및 반응시간 12 ~ 60시간의 조건 하에서 수행되는 것이 바람직하다. 상기 당결합 분해 효소로는 글루코시다제(glucosidase), 자일로시아다제(xylosidase), 자일라나제(xylanase), 셀룰라제(cellulose), 갈락토시다제(galactosidase), 펙티나제(pectinase), 나린지나아제(naringinase)로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 것이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 갈락토시다제(galactosidase), 더욱 바람직하게는 갈락토시다제 및 펙티나제를 0.5 ~ 2.0 :0.5 ~ 2.0의 비율로 혼합한 것이 사용될 수 있다.

상기 효소반응을 통해 캐럽콩추출물에 함유된 사이클리톨 유도체 (Cyclitol Derivatives)의 당결합이 선택적으로 제거됨으로써 피니톨 (pinitol)성분이 강화되며, 또한 키로-이노시톨(chiro-inositol), 미오-이노시톨 (myo-inositol) 등이 되어, 추출물에 포함된 각종 활성성분과의 상승작용에 의하여 항당화, 항산화, 콜라게나아제 발현 저해 및 항염 활성이 우수한 캐럽콩추출물이 제조된다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따르면 상기 효소반응에 의하여 제조된 캐럽콩추출물을 조성물 총중량에 대해서 0.005~50중량%, 바람직하게는 0.01~20중량% 함유하는 화장료조성물이 제공된다. 상기 화장료 조성물은 우수한 항당화, 항산화, 콜라게나아제 발현 저해 및 항염 효과를 나타내므로 항노화 화장료 조성물로 사용될 수 있다.

효소처리 캐럽콩추출물을 유효성분으로 함유하는 상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징 폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 및 아이섀도로 구성된 그룹에서 선택된 어느 하나의 제형으로 적용되어질 수 있다.

본 발명에 따른 제조방법에 의하여 제조되는 효소처리 캐럽콩추출물은 생물전환에 의하여 피니톨(pinitol)성분이 강화되며, 추출물 내의 각종 활성성분과의 상승작용에 의하여 우수한 항당화, 항산화, 콜라게나아제 발현 저해 및 항염 효과를 나타내므로 적은 사용량으로도 우수한 항노화활성을 확보할 수 있어 화장료 조성물로 유용하다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 캐럽콩 추출물에 특정효소 처리하여 다른 식물에 비하여 상대적으로 많이 함유되어 있는 피니톨을 강화하고, 추출물내의 다른 활성성분과의 상승작용을 통하여 항노화 활성이 우수한 화장료를 제조하는 기술에 관한 것이다.

하기의 화학식으로 표시되는 피니톨(pinitol)은 수용성 탄수화물류의 일종으로 콩류나 솔잎 등에 포함되어 있는 성분 중의 하나이다.

피니톨 (pinitol)은 1987년 이후 전 세계 각국에서 동물실험등에서 혈당조절 효과가 있는 것으로 밝혀졌다. 피니톨 (pinitol)은 섭취시 체내에서 카이로이노시톨 (chiro-inositol)로 전환된다. 카리로이노시톨 (Chiro-inositol)은 인슐린 신호전달체계에 관여하는 매개체 중 하나로 알려져 있고, 또한, 혈당조절 기능이 저하된 실험동물에 피니톨 (pinitol)을 섭취시키면 혈당조절 기능이 유의적으로 개선됨이 확인되었다. 피니톨 (pinitol)은 대두의 잎, 잎꼬지, 줄기, 뿌리, 뿌리혹, 씨앗 등에 분포하고 있으며, 함량은 건조된 콩 중 약 1% 정도 차지하여 귀한 원료이다.

본 발명에 따르면, 캐럽콩을 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트 및 클로로포름으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 용매로 추출하여 캐럽콩추출물을 제조하는 단계;

상기 캐럽콩추출물을 용매, 바람직하게는 물에 용해시키고 당결합 분해 효소를 첨가하는 효소첨가단계; 및

상기 효소가 첨가된 추출물을 교반하면서 효소반응을 실시하는 효소반응단계를 포함하는 효소처리 캐럽콩추출물의 제조방법이 제공된다.

상기 효소반응은 반응pH 3.5 ~ 5.0, 반응온도 25 ~ 50℃ 및 반응시간 12 ~ 60시간의 조건하에서 수행되는 것이 바람직하다.

그 방법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

효소반응에 제공되는 캐럽콩추출물은 분쇄된 캐럽콩을 물 또는 유기용매, 바람직하게는 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트 및 클로로포름을 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유기용매 또는 이들과 물의 혼합물, 더욱 바람직하게는 30% 에탄올을 사용하여 통상의 추출 방법으로 추출함으로써 제조될 수 있다.

상기 캐럽콩추출물은 당결합 분해작용을 하는 효소, 바람직하게는 글루코시다제(glucosidase), 자일로시아다제(xylosidase), 자일라나제(xylanase), 셀룰라제(cellulose), 갈락토시다제(galactosidase), 펙티나제(pectinase) 및 나린지나아제(naringinase)로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소에 의한 반응을 통해 생물전환된다. 이때, 바람직하게는 갈락토시다제(galactosidase)로 처리하여 효소반응을 진행하는 경우에 항당화 및 항노화활성 측면에서 우수한 효과를 나타낸다. 또한 더욱 바람직하게는 상기 갈락토시다제와 함께 펙티나제를 0.5 ~ 2.0 :0.5 ~ 2.0의 비율로 혼합하여 효소반응을 진행시키는 것이 항당화 및 항노화활성의 측면에서 가장 우수한 효과를 나타낸다.

상기 당결합 분해효소에 의하여 캐럽콩추출물에 함유된 사이클리톨 유도체(Cyclitol Derivatives)의 당결합이 선택적으로 제거됨으로써 추출물내의 피니톨(pinitol)성분의 함량이 증대되며, 추출물 내의 다른 활성성분들의 전환이 이루어진다. 상기 효소들은 아스퍼질러스(aspergillus)속, 바실러스(basillus)속, 페니실리움(penicillium)속, 리조푸스(rhizopus)속, 리조무코르(rhizomucor)속, 탈라로마이세스(talaromyces)속, 비피도박테리움(bifidobactertium)속, 모르티엘렐라(mortierella)속의 미생물로부터 얻을 수 있다.

상기 효소반응에 의하여 생물전환된 캐럽콩추출물은 단순 캐럽콩의 추출물과 비교하여 볼 때, 그 활성이 증대되어 적은 사용량으로도 더욱 우수한 항당화, 항산화, 콜라게나아제 발현 저해 및 항염 효과가 있는 것이 확인되었다.

이와 같이 본 발명에 따르면 상기 효소반응에 의하여 제조되어 우수한 항당화, 항산화, 콜라게나아제 발현 저해 및 항염 효과활성을 가지는 효소처리 캐럽콩추출물이 제공된다. 또한 본 발명에 따르면, 상기 효소처리 캐럽콩추출물을 조성물 총중량에 대해서 0.005~50중량%, 바람직하게는 0.01~20중량% 함유하는 항당화 및 항노화용 화장료조성물이 제공된다.

효소처리 캐럽콩추출물을 유효성분으로 함유하는 상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징 폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 및 아이섀도로 구성된 그룹에서 선택된 어느 하나의 제형으로 적용되어질 수 있다.

[실시예]

이하, 하기의 실시예와 시험예들을 통하여 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이 예들에 의하여 한정되는 것은 아니다.

비교예 1: 캐럽콩추출물의 제조

캐럽콩 100g을 30% 에탄올 600g에서 50℃로 3시간 추출하여 캐럽콩추출액을 얻은 후, 이를 감압 농축하고 동결 건조하여 캐럽콩추출물 5.4g을 제조하였다.

실시예 1~7: 효소처리 캐럽콩추출물의 제조

상기 비교예 1에서 제조된 캐럽콩추출물을 현탁한 농축액(100g당 고형분 함량 2g) 50g에 정제수 400ml와 하기 표 1의 효소액 50ml를 혼합하여 pH 4.5, 45℃조건에서 48시간 교반하면서 효소반응을 진행시킨 후, 감압 농축하여 효소반응에 의한 캐럽콩추출물을 제조하였다.

	효소(Enzyme)	출처(Origin)
실시예 1	아밀라아제	Aspergillus oryzae
실시예 2	베타-글루코시다제	Aspergillus niger
실시예 3	셀룰라아제	Aspergillus niger
실시예 4	베타-갈락토시다제	Aspergillus oryzae
실시예 5	베타-자일로시다제	Aspergillus niger
실시예 6	펙티나제	Rhizopus sp
실시예 7	나린지나아제	Penicillium decumbens

시험예 1: 피니톨 생성율 측정

분석기기는 HPLC를, 표준물질은 D-pinitol (sigma-aldrich사)를 이용하여 상기 실시예 1 ~ 7에서 제조된 효소처리 캐럽콩추출물의 피니톨 생성율을 측정하였다. 분석조건은 High performance carbohydrate column를 가지고 85% acetonitrile 이동상을 이동하여 분리후 시차굴절계로 검출하여 분석하였다.

피니톨의 생성율은 상기 비교예 1의 추출물을 대조군으로 하였을 때의 피니톨 함량의 증가율을 나타내며, 하기의 식과 같이 계산하였다.

생성율(%)= D-pinitol Standard 시료량(mg) × 실시예의 peak 면적값 ÷ D-pinitol Standard peak 면적값 ÷ 실시예의 시료량(mg)

그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

시험예 2: 총 폴리페놀 함량 측정

비교예 1과 실시예 1~7의 추출물 1ml에 각각 증류수 10ml를 첨가한 후, 2ml의 Folin-Ciocalteu phenol reagent를 첨가하여 혼합한 다음, 실온에서 5분간 반응하였다. 이 반응물에 20% 소듐 카보네이트를 2ml 첨가하여 혼합한 다음, 상온에서 1시간 반응시킨 후 725nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 지표물질은 탄닌산(tannic acid)을 사용하였다.

그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

시험예 3: 총 플라보노이드 함량 측정

비교예 1과 실시예 1~7의 추출물 0.5ml에 각각 10% aluminum nitrate 0.1ml, 1M potassium acetate 0.1ml, 에탄올 4.3ml씩 넣고 혼합한 다음, 상온에서 40분간 반응시킨 후 415nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 지표물질은 퀘르세틴(quercetin)을 사용하였다.

그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

	피니톨 생성율(%)	총 폴리페놀함량(㎍/㎖)	총 플라보노이드함량(㎍/㎖)
비교예 1	6.8	448	134
실시예 1	12	1084	20
실시예 2	25	727	228
실시예 3	29	978	164
실시예 4	34	1279	253
실시예 5	8	584	15
실시예 6	29	1207	226
실시예 7	12	985	30

상기 표 2에 나타낸 바와 같이 당결합 분해효소로서 베타-갈락토시다아제를 사용하는 경우에 피니톨 생성율, 총 폴리페놀 함량, 총 플라보노이드 함량이 가장 우수하게 생물전환되는 결과를 확인할 수 있었고, 그 외 베타-글루코시다아제, 셀룰라아제, 펙티나제를 촉매로 이용한 반응에서도 우수한 생물전환 결과 값을 나타내었다.

실시예 8~13: 효소처리 캐럽콩추출물의 제조

가장 적합한 효소처리 조건을 찾기 위하여 피니톨 생성율, 총 폴리페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량의 측면에서 우수한 상기 실시예 2, 3, 4, 6의 베타-글루코시다아제, 셀룰라아제, 베타-갈락토시다아제, 펙티나제를 이용하여 혼합 처리한 효소로 반응촉매를 달리하여 효소반응에 의한 캐럽콩추출물을 제조하였다. 상기 비교예 1에서 제조된 캐럽콩추출물의 현탁 농축액(100g당 고형분 함량 2g) 50g을 정제수 400ml와 베타-글루코시다아제(Multifect FE, Genencor사), 셀룰라아제(Cellulase KN, DSM사), 베타-갈락토시다아제(스미락트, 신일본화학사), 펙티나제(Pectinex 100L, Novozyme사)들의 혼합 효소액 50ml과 혼합하여 하기의 표 3과 같은 혼합 비율로 효소액을 제조하여 효소반응을 진행시킨 후, 감압 농축하여 효소처리 캐럽콩추출물을 제조하였다.

효소	실시예 8	실시예 9	실시예 10	실시예 11	실시예 12	실시예 13
베타-글루코시다제	50%	50%	50%
셀룰라제-A	50%			50%	50%
베타-갈락토시다제		50%		50%		50%
펙티나제			50%		50%	50%

시험예 4: 피니톨 생성율 측정

상기 실시예 8~13에서 제조된 효소반응에 의한 캐럽콩추출물의 피니톨 생성율을 측정하였으며 그 결과를 하기의 표 4에 나타내었다.

시험예 5: 총 폴리페놀 함량 측정

상기 실시예 8~13에서 제조된 효소반응에 의한 캐럽콩추출물의 총 폴리페놀 함량을 측정하였으며 그 결과를 하기의 표 4에 나타내었다.

시험예 6: 총 플라보노이드 함량 측정

상기 실시예 8~13에서 제조된 효소반응에 의한 캐럽콩추출물의 총 플라보노이드를 측정하였으며 그 결과를 하기의 표 4에 나타내었다.

	실시예 8	실시예 9	실시예 10	실시예 11	실시예 12	실시예 13
피니톨 생성율 (%)	27	30	27	32	29	35
총 폴리페놀함량 (㎍/㎖)	852	1103	967	1128	1092	1273
총플라보노이드함량 (㎍/㎖)	196	255	227	223	195	284

상기 표 4에 나타낸 바와 같이 당결합 분해효소로서 베타-갈락토시다아제와 함께 보조 효소로 베타-글루코시다아제, 셀룰라아제, 펙티나제를 상호 혼합하여 반응에 사용하였을 때 피니톨 생성율, 총 폴리페놀 함량, 총 플라보노이드 함량이 우수한 결과값을 가짐을 확인할 수 있었고, 그 중 베타-갈락토시다아제와 펙티나제를 혼합하여 효소반응에 이용하였을 때 생물전환에 의한 가장 우수한 결과 값을 나타내었다.

시험예 7. 항당화 효과 확인

당화 반응이 진행되면 산화, 축합 등의 일련의 복합적인 과정을 거쳐 여러 화합물이 혼재되어 있는 최종당화산물(AGEs)이 만들어진다. 최종당화산물 중 일부는 형광을 띄게 되어 당화 반응의 정도를 가늠할 수 있는 척도로 이용되고 있다. 그 중 excitation 370nm/emission 440nm에서 나타내는 형광도는 일반적으로 당화 반응의 정도를 나타내는 수치로 알려져 있다.

상기 원리를 이용하여 실험을 진행하였다. 반응물의 조제는 Mcpherson 등(Role of fructose in glycation and cross-linking of proteins. Biochemistry. 1998. 27. 1901~1907)의 방법을 일부 변형하여 진행하였다. 0.1M 포스페이트 버퍼(pH 7.0)에 소혈청알부민(BSA, 5㎎/㎖), 25mM 리보오스, 1mM 다이에틸렌 트라이아민 펜타아세트산(DTPA)과 0.02% 소듐 아자이드를 각각 최종 농도가 되도록 혼합한 후 96웰 플레이트(Nunc, Denmark)에 180㎕씩 분주한 다음 각각의 시료(10㎎/㎖)를 20㎕ 넣어 실험하였다. 이 때 리보오스를 혼합하지 않아 당화반응이 일어나지 않은 대조군(A), 제조물에서 당화반응이 일어난 당화대조군(B), 각각의 시료 처리군 (C)을 제조하였다. 각 시료에 의한 형광도의 간섭을 배제하기 위하여 리보오스를 처리 않은 시료 처리군 (D)도 함께 제조하였다. 반응 중 건조를 방지하기 위하여 완전히 밀봉한 다음 37℃ 항온항습배양기에서 7일간 반응을 진행하였다. 반응이 종료된 다음 분광형광계(VICTOR3, Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)를 이용하여 ex=370nm/em=440nm에서 형광도를 측정하였으며, 각 시료는 3회 반복 실험하였다. 최종당화산물 생성억제 활성은 당화반응이 일어나지 않은 대조군(A)을 100%로, 당화반응이 일어난 당화대조군(B)을 0%로 하여 각 시료의 최종당화산물 생성억제 활성을 나타내었으며, 시료의 경우 당화반응이 일어나지 않은 각 시료의 형광도를 배제한 값(C-D)을 사용하였다. 대조군으로는 aminoguanidine을 사용하였고, 시료는 비교예 1, 실시예13, 피니톨을 농도 별로 첨가하여 측정하였다. 최종당화산물 생성 억제율(%)은 하기 식에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 표 5에 나타내었다.

생성억제율(%)=100-[(C-D)/(A-B)×100]

시료명 (㎍/㎖)		생성 억제율(%)
Aminoguanidine	375	52
Pinitol	200	10
캐럽콩추출물	100	14
(비교예 1)	200	27
효소처리 캐럽콩추출물	100	25
(실시예 13)	200	54

상기 표 5에서 나타낸 바와 같이, 동일 농도 처리 시 캐럽콩추출물 (비교예 1)보다 효소처리 캐럽콩추출물(실시예13)이 더 우수한 최종당화산물 생성 억제 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

즉, 본 발명의 효소처리 캐럽콩추출물은 피니톨이나 일반 캐럽콩추출물보다 더 우수한 최종당화산물 생성 억제 효과를 가짐을 알 수 있다.

시험예 8 : Xanthine oxidase 저해 활성

Xanthine oxidase 저해 활성은 SOD 유사활성 측정/NBT(Nitroblue tetrazolium)법에 따라 측정하였다. 100, 200ppm 농도로 용해시킨 상기 비교예 1과 실시예 13의 캐럽콩추출물과 효소처리 캐럽콩추출물 시료를 각각 10㎕에 50mM sodium phosphate buffer(PH 7.5) 140㎕, xanthine(3mM)40㎕, 1.5mM NBT 10㎕를 넣어 혼합한 후, 여기에 xanthine oxidase(0.13 U/mL) 10㎕를 마지막으로 넣어 혼합한 후 25℃에서 40분 동안 반응시킨 후 560nm에서 흡광도를 측정하였다.

본 발명 추출물의 Xanthine oxidase 저해 활성은 하기의 식과 같이 시료의 첨가군과 무첨가군의 흡광도를 가지고 항산화 활성값을 %로 나타내었다. 대조군으로는 ascorbic acid을 사용하였고, 시료는 비교예 1, 실시예13, 피니톨를 농도 별로 첨가하여 측정하였다.

Xanthine oxidase 저해 활성(%)=(1-시료첨가구의 흡광도/시료 무첨가구의 흡광도)×100

그 결과를 하기의 표 6에 나타내었다.

시료명 (㎍/㎖)		Xanthine oxidase 저해 활성(%)
Ascorbic acid (대조군)	500	58
피니톨	200	13
캐럽콩추출물 (비교예 1)	100	48
	200	63
효소처리 캐럽콩추출물 (실시예 13)	100	65
	200	88

상기 표 6에서 확인되는 바와 같이 본 발명에 따른 효소처리 캐럽콩추출물은 기존의 항산화제인 아스코르빈산보다도 우수하고, 피니톨 및 일반 캐럽콩추출물에 비하여 우수한 항산화능을 나타내었다.

시험예 9 : 세포독성시험

섬유아세포를 10% FBS를 첨가한 IMDM 배지에 5×10⁵의 세포농도로 접종하여 37℃, 5% CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 비교예 1의 캐럽콩추출물과 실시예 13에서 제조한 효소처리 캐럽콩추출물을 최종 농도가 50, 100, 500, 1000㎍/㎖가 되도록 디메틸설폭시드에 희석하여 제조한 희석용액을 처리하여, 24시간 배양한 후에 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazolium boromide, Sigma, U.S.A.)용액을 각 well에 100㎕씩 첨가한 후(3㎎/㎖) 4시간 동안 더 배양하였다. 이후 상층액을 제거하고, 150㎕의 디메틸설폭시드를 첨가한 후, 30분간 shaking하여 생성된 formazan을 녹여 multimicroplate reader(Molecular device Spectra max190)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 아래의 식에 따라 계산하였으며 그 결과는 하기의 표 7에 나타내었다.

세포 생존율(%)=시료첨가군의 흡광도/대조군의 흡광도 × 100

시료 농도 (㎍/㎖)	세포 생존율(%)
	캐럽콩추출물(비교예 1)	효소처리 캐럽콩추출물(실시예 13)
0	100	100
50	100	100
100	100	100
500	100	100
1000	94.76	95.43

상기 표 7의 결과에서 보는 바와 같이, 캐럽콩추출물(비교예1), 효소처리 캐럽콩추출물(실시예13)의 시료 모두 500㎍/㎖ 농도에서 세포 독성이 없는 것으로 확인되었고, 사용 농도가 1000㎍/㎖에서는 세포 생존율이 감소하였으나 안전에는 문제가 없는 것을 확인하였다.

시험예 10: 콜라게나아제 ( MMP -1) 생성 억제 효과

인간 정상 피부세포인 섬유아세포(한국 세포주 은행, 대한민국)를 48-웰 마이크로 플레이트(Nunc. 덴마크)에 각 웰 당 1st 10⁶세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지(Sigma, 미합중국) 및 37℃의 조건에서 24시간 동안 배양한 후 상기 비교예 1과 실시예 13에서 제조한 캐럽콩추출물과 효소처리캐럽콩추출물, 피니톨을 각각 최종 농도가 50, 100, 500, 1000㎍/㎖가 되도록 디메틸설폭시드에 희석하여 제조한 희석용액을 첨가한 후 무혈청 DMEM 배지에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후, 각 웰의 상층액을 모아 콜라게나아제(MMP-1) 분석 킷트(Amersham, 미합중국)를 이용하여 새로 합성된 MMP-1의 양(㎍/㎖)을 측정하고, 하기 식에 따라 콜라게나아제 (MMP-1) 생성 억제율을 계산하였으며, 그 결과는 하기 표 8에 나타내었다. 이때, 콜라게나아제 (MMP-1) 생성 억제율의 양성 대조군으로 TGF-β(10㎎/㎖, Roche, 미합중국)을 사용하였다.

MMP-1 생성억제율(%)=(1-실험군의 MMP-1의 양/대조군의 MMP-1의 양)×100

시료 농도 (㎍/㎖)	콜라게나아제(MMP-1) 생성억제율(%)
	캐럽콩추출물 (비교예 1)	효소처리 캐럽콩추출물 (실시예 13)	피니톨	TGF-β
50	17.2	30.5	2.5	42.2
100	20.9	55.5	4.8	65.5
500	47.6	63.5	5.9	69.8
1000	57.1	76.5	6.2	88.8

상기 표 8의 결과에서 보는 바와 같이, 일반 캐럽콩추출물(비교예 1)보다 효소처리 캐럽콩추출물(실시예 13)을 적용한 시료가 콜라게나아제(MMP-1) 생성 억제율 효과가 더 높았으며, 효소처리 캐럽콩추출물이 보다 우수한 효과로 대조군 TGF-β와 유사한 경향의 효과를 보여주었다.

시험예 11 : 항염 효능 시험

상기 비교예 1과 실시예 13에서 제조한 캐럽콩추출물과 효소처리캐럽콩추출물와 피니톨의 항염 활성 효과를 확인해 보기 위해 초기 염증성 분자 중 하나인 종양괴사인자(TNF-α) 생성에 대한 효과를 알아보았다.

TNF-α와 같은 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)의 형성은 포스포리파제 A2(phospholipase A2)의 활성으로 인해 아라키돈산(arachidonic acid)이 프로스타글란딘 (prostaglandin)으로 바뀌는 과정 및 NO 형성 과정으로 이어지게 된다. 실험에 사용된 세포는 HaCaT(Human Skin Keratinocytes cell line)이며 37℃, 5%의 CO2, 10%의 Fetal bovine serum(FBS, Lonza), 50μg/mL의 streptomycin(Sigma)을 첨가한 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, Invitrogen)에서 배양하였다. 배양 후 1시간 동안 UV를 조사시켜 세포에 스트레스를 주었다. 대조구로는 시료를 처리하지 않고 UV를 조사한 세포를 사용하였다. 이때, 항염 효능의 양성 대조군으로 α-Bisabolol을 사용하였다.

RNA 분석을 위해 세포 내의 total RNA를 세포 배양으로부터 Trizol reagent(Invitrogen, USA)를 사용하여 추출하였다. RNA의 순도와 무결성은 A260nm/A280nm비율 측정을 통해 확인하였고, RNA 수율은 260nm에서 흡광도로 측정하였다. cDNA합성은 3㎍의 total RNA를 Oligo dT 15(500ng/㎕l) primer, dNTP (10mM), RTase inhibitor(40 U/㎕), Powerscript Ⅱ RTase(Clontech, USA)를 첨가하여 25℃에서 10분간 primer annealing, 42℃에서 60분간 cDNA를 합성하고 95℃에서 5분간 RTase denaturation 시켰다. PCR은 cDNA로부터 TNF-α, GAPDH를 증폭하기 위하여 cDNA 3㎕, 10X taq polymerase buffer 5㎕, 10mM dNTP 2㎕, 10pmol primer 각각 2㎕, taq polymerase 0.5㎕를 혼합하고 증류수를 더하여 50㎕로 조정한 후 증폭시켰다. 프라이머 서열은 표 9에 나타내었다. PCR에 의하여 생성된 산물은 1% 아가로우스 겔(agarose gel)에서 전기영동하여 image analyzer(UGEN, U:Genius)로 확인하였으며 각 밴드의 밀도는 밀도계측프로그램(Gene Tools from Syngene)을 이용하여 측정하였다.

Gene		Primer sequence
GAPDH	Forward	5' - AAC GAA TTT GGT CGA ACA GC - 3'
	Reverse	5' - TGA GGA GGG ATT CAG TG - 3'
TNF-α	Forward	5' - CAG AGG GAA GAG TTC CCC AG - 3'
	Reverse	5' - CCT TGG TCT GGT AGG AGA CG - 3'

그 결과를 하기의 표 10에 나타내었다.

TNF-α expression(%)	미조사	UV 조사
	0.00%	0.00%	0.01%	0.05%	0.10%	0.50%
Blank	6.18	100.00
캐럽콩추출물(비교예1)			82.99	65.50	44.06	36.76
효소처리 캐럽콩추출물 (실시예 13)			55.74	37.70	30.58	18.55
피니톨			56.88	43.66	37.55	26.65
α-Bisabolol						28.75

상기 표 10에서 확인되는 바와 같이, 본 발명에 의한 효소초리 캐럽콩추출물(실시예 13)은 UV에 의해 유발된 염증 반응 유발인자인 종양괴사인자(TNF-α)의 발현을 농도 의존적으로 감소시킴으로써 염증반응을 억제한 것을 알 수 있었다. 그러므로, 효소처리 캐럽콩추출물은 피부 염증 반응을 효과적으로 억제하며, 이로써 피부 트러블을 완화시키는 효능 또한 뛰어나다. 또한 본 발명의 효소처리 캐럽콩추출물(실시예 13)은 일반적인 캐럽콩추출물(비교예 1)에 비하여 그 효능이 매우 우수하였다.

본 발명의 효소처리 캐럽콩추출물를 함유하는 항당화 및 항노화용 화장료 조성물은 하기의 여러 제형으로 제조될 수 있다.

제조 실시예 1: 에멀젼 베이스 제조

본 발명의 효소처리 캐럽콩추출물을 함유하는 항당화 및 항노화용 화장료로서 하기 표 11의 조성에 따라 에멀젼 베이스를 제조하였다.

성분	함량(중량%)
글리세린	3.00
디소듐이디티에이	0.02
폴리글리세릴-3-메틸글루코스 디스테아레이트	1.50
세테아릴알코올	0.50
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	7.00
폴리아크릴아마이드 & C13-14이소파라핀 & 라우레스-7	0.60
효소처리 캐럽콩추출물(실시예 13)	0.2
향, 방부제	미량
정제수	잔량
계	100

제조 실시예 2: 유연 화장수

하기 표 12에 기재된 조성으로 본 발명에 따른 효소처리 캐럽콩추출물을 함유하는 유연 화장수를 통상의 방법으로 제조하였다.

성분	함량(중량%)
효소처리 캐럽콩추출물(실시예 13)	0.1
1,3-부틸렌 글리콜	5.2
올레일알코올	1.5
에탄올	3.2
폴리솔베이트 20	3.2
벤조페논-9	2.0
카르복실비닐폴리머	1.0
글리세린	3.5
향	미량
방부제	미량
정제수	잔량
계	100

제조 실시예 3: 영양 화장수

하기 표 13에 기재된 조성으로 본 발명에 따른 효소처리 캐럽콩추출물을 함유하는 영양 화장수를 통상의 방법으로 제조하였다.

성분	함량(중량%)
효소처리 캐럽콩추출물(실시예 13)	0.1
글리세릴스테아레이트SE	1.5
스테아릴알콜	1.5
라놀린	1.5
폴리솔베이트	1.3
소르비탄스테아레이트	0.5
경화식물유	1.0
광물유	5.0
스쿠알란	3.0
트리옥타노인	2.0
디메치콘	0.8
초산토코페롤	0.5
카르복시비닐폴리머	0.12
글리세린	5.0
1,3-부틸렌글리콜	3.0
소듐히아루로네이트	5.0
트리에탄올아민	0.12
방부제, 향, 색소	미량
증류수	잔량
합계	100

제조 실시예 4: 영양 크림

하기 표 14에 기재된 조성으로 본 발명에 따른 효소처리 캐럽콩추출물을 함유하는 영양 크림을 통상의 방법으로 제조하였다.

성분	함량(중량%)
효소처리 캐럽콩추출물(실시예 13)	0.2
친유형 모노스테아린산글리세린	2.0
스테아린산	1.6
밀납	1.0
폴리솔베이트	1.6
소르비탄 스테아레이트	0.6
경화식물유	1.0
스쿠알란	3.0
광물유	5.0
트리옥타노인	5.0
디메치콘	1.0
글리세린	5.0
트리에탄올아민	1.0
소듐히아루로네이트	4.0
방부제, 향, 색소	미량
증류수	잔량
합계	100

제조 실시예 5 : 맛사지 크림

하기 표 15에 기재된 조성으로 본 발명에 따른 효소처리 캐럽콩추출물을 함유하는 맛사지 크림을 통상의 방법으로 제조하였다.

성 분	함량(중량%)
효소처리 캐럽콩추출물(실시예 13)	0.2
글리세린	4.0
바셀린	3.5
트리에탄올아민	0.5
유동파라핀	24.0
스쿠알란	3.0
밀납	2.1
토코페릴아세테이트	0.1
폴리솔베이트 60	2.4
카르복실비닐폴리머	1.0
솔비탄세스퀴올레이트	2.3
향	미량
방부제	미량
정제수	잔량
계	100

실시예 6 :팩

하기 표 16에 기재된 조성으로 본 발명에 따른 효소처리 캐럽콩추출물을 함유하는 팩을 통상의 방법으로 제조하였다.

성 분	함량(중량%)
효소처리 캐럽콩추출물(실시예 13)	0.1
에틸알코올	3.0
EDTA-2Na	0.02
프로필렌 글리콜	5.1
글리세린	4.5
카보폴	1.0
폴리옥사이드	0.1
방부제	미량
향	미량
정제수	잔량
계	100

Claims (9)

1. 캐럽콩을 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트 및 클로로포름으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 용매로 추출하여 캐럽콩추출물을 제조하는 캐럽콩추출물 제조단계;
   상기 캐럽콩추출물을 용매에 용해시키고 갈락토시다제와 펙티나제를 1:1의 부피비율로 혼합한 당결합 분해 효소를 첨가하는 효소첨가단계; 및
   상기 효소가 첨가된 추출물을 교반하면서 반응 pH 3.5 ~ 5.0, 반응온도 25 ~ 50℃ 및 반응시간 12 ~ 60시간의 조건하에서 효소반응을 실시하는 효소반응단계를 포함하는 효소처리 캐럽콩추출물의 제조방법.
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