KR101774414B1 - 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포외다당체를 유효성분으로 함유하는 피부상태 개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세리포리아 락세라타(Ceriporia lacerata)에 의해 생산되는 세포외다당체, 상기 세포외다당체를 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양액, 또는 상기 균사체 배양액의 건조분말 또는 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부상태 개선용 조성물에 관한 것으로서, 상기 조성물은 피부 미백 효과, 주름 개선 효과, 피부 보습 효과 또는 피부 노화 방지 효과가 우수하여, 피부상태 개선용 화장품 및 식품의 소재로서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포외다당체를 유효성분으로 함유하는 피부상태 개선용 조성물{COMPOSITION FOR IMPROVING SKIN CONDITION COMPRISING EXOPOLYSACCHARIDE PRODUCED BY CERIPORIA LACERATA AS AN ACTIVE INGREDIENT}

본 발명은 세리포리아 락세라타(Ceriporia lacerata)에 의해 생산되는 세포외다당체, 상기 세포외다당체를 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양액, 상기 균사체 배양액의 건조분말, 또는 상기 균사체 배양액의 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부상태 개선용 조성물에 관한 것이다.

피부는 인체의 일차 방어막으로서 체내의 기관들을 외부환경의 자극으로부터 보호해 주며, 생체 항상성 유지에 중요한 역할을 한다. 하지만 피부는 나이가 들어감에 따라 점차 노화가 진행되게 되고, 그 결과로서 피부 탄력손실, 각질화, 주름 생성, 피부 위축 등의 현상이 나타난다.

이에, 피부상태를 개선하기 위한 물질로서 레티노익산(retinoic acid), 동물 태반 유래의 단백질 등을 이용하여 콜라겐 합성을 촉진하고자 하는 시도가 있었으나, 레티노익산은 불안정하여 제형화하기 어려울 뿐만 아니라 안정성의 측면에서 제한이 있고, 동물 태반 유래 단백질은 광우병에 걸린 소의 적출물을 사용할 수 있다는 치명적인 단점이 있다.

한편, 피부미용을 위한 미백 성분으로서, 코지산(kojic acid), 알부틴(arbutin) 등과 같은 티로시나제 효소활성을 억제하는 물질, 하이드로퀴논(hydroquinone), 비타민 C 및 이들의 유도체와 각종 식물 추출물이 사용되어 왔다. 그러나, 상기 물질들은 제제 중에서 안정성이 나빠 분해되어 착색되거나, 이취의 발생, 생체 레벨에서의 효과의 불분명 등으로 그 사용이 제한되고 있는 실정이다.

세리포리아 락세라타는 백색 부후균의 일종으로서, 생태계에서 셀룰로오스, 헤미 셀룰로오스, 기타 다당류 및 글리세롤 등의 탄소원을 이용하기 위하여 리그닌 분해라는 공동대사(co-metabolism)를 수행하는 것으로 알려져 있다.

세리포리아 락세라타를 이용한 의학적 치료 용도와 관련하여, 본 발명자들에 의하여 출원된 대한민국 특허 제1031605호에 세리포리아 락세라타 배양액 추출물의 당뇨 치료 용도만이 지금까지 알려져 있을 뿐, 세리포리아 락세라타를 이용한 피부상태 개선 효과는 아직까지 보고된 바 없다.

이에, 본 발명자들은 세리포리아 락세라타로부터 분리한 세포외다당체 또는 이를 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양액, 이의 건조분말 또는 추출물이 피부상태 개선 효과를 나타낸다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

대한민국 특허 제1031605호

본 발명의 목적은 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 활성 성분을 함유하는 피부상태 개선용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포외다당체, 상기 세포외다당체를 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양액, 또는 상기 균사체 배양액의 건조분말 또는 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부상태 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포외다당체 또는 이를 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양액, 이의 건조분말 또는 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 피부 미백 효과, 주름 개선 효과, 피부 보습 효과 또는 피부 노화 방지 효과가 우수하여, 피부상태 개선용 화장품 및 식품의 소재로서 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포외다당체를 다양한 농도로 B16 멜라노마 세포에 처리한 후의 세포생존율을 나타낸 그래프이다.
도 2는 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포외다당체를 다양한 농도로 B16 멜라노마 세포에 처리한 후의 멜라닌 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 3은 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포외다당체를 다양한 농도로 인간 피부 섬유아세포에 처리한 후의 Ι형 프로콜라겐(type-1 procollagen) 생합성량을 나타낸 그래프이다.
도 4는 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포외다당체를 다양한 농도로 인간 피부 섬유아세포에 처리한 후의 프로콜라게네이즈(Pro-MMP-1, pro matrix metal protease-1)의 양을 나타낸 그래프이다.
도 5는 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포외다당체를 다양한 농도로 각질형성세포에 처리한 후의 세포생존율을 나타낸 그래프이다.
도 6은 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포외다당체를 다양한 농도로 각질형성세포에 처리한 후의 필라그린(Filaggrin)의 발현을 나타낸 것으로, A 및 B는 각각 필라그린의 mRNA 및 단백질 발현을 나타낸 것이고, C는 필라그린의 단백질 발현을 수치화하여 나타낸 그래프이다.
도 7은 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포외다당체의 DPPH(1,1-diphenyl-2-pycrylhydrazyl) 소거 활성을 나타낸 그래프이다.
도 8은 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포외다당체의 ABTS(2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) 소거 활성을 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포외다당체, 상기 세포외다당체를 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양액, 또는 상기 균사체 배양액의 건조분말 또는 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부상태 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명의 피부상태 개선용 조성물은 화장품 또는 식품에 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 세포외다당체는 약 40~60 중량%의 당과 약 30~40 중량%의 단백질, 약 40~50 중량%의 당과 약 32~38 중량%의 단백질, 또는 약 43~47 중량%의 당과 약 33~36 중량%의 단백질을 포함할 수 있고, 바람직하게는 약 45 중량%의 당과 약 34 중량%의 단백질을 포함할 수 있다.

상기 당은 만노오스, 갈락토오스 및 글루코오스를 함유할 수 있다.

상기 세포외다당체는 약 100~150 kDa, 약 110~140 kDa 또는 약 115~125 kDa의 분자량을 가질 수 있고, 바람직하게는 약 120 kDa의 분자량을 가질 수 있다.

바람직한 하나의 구체예로서, 상기 세포외다당체는, (a) 세리포리아 락세라타 균사체를 액체 배양하여 세리포리아 락세라타 균사체 배양액을 제조하는 단계, (b) 세리포리아 락세라타 균사체 배양액을 건조시켜 분말화하는 단계, 및 (c) 세리포리아 락세라타 균사체 배양액 분말을 용매로 추출한 후 이를 여과하고 감압농축하는 단계를 포함하는 제조방법에 의하여 제조될 수 있다.

상기 (a) 단계에서의 세리포리아 락세라타 균사체의 액체 배양을 위한 배지는 설탕, 포도당, 전분, 수수분, 대맥분, 대두분, 황산마그네슘(MgSO₄), 1인산칼륨(KH₂PO₄), 2인산칼륨(K₂HPO₄) 및 물을 포함할 수 있고, 수소이온농도가 pH 4.5~6.0인 것일 수 있다.

바람직한 하나의 구체예로서, 상기 배지는, 설탕 0.2~3 중량%, 포도당 0.2~3 중량%, 전분 0.2~4 중량%, 수수분 0.1~0.5 중량%, 대맥분 0.1~0.5 중량%, 대두분 0.2~3 중량%, 황산마그네슘(MgSO₄) 0.05~0.1 중량%, 1인산칼륨(KH₂PO₄) 0.05~0.25 중량%, 2인산칼륨(K₂HPO₄) 0.05~0.25 중량% 및 잔량의 물을 포함할 수 있다.

상기 (a) 단계에서의 액체 배양은 청색 LED 광원 하에서 수행될 수 있고, 이산화탄소의 농도를 1,000~2,000 ppm으로 유지하여 수행될 수 있다.

이때, 액체 배양은 예를 들어, 20~25℃에서, 수소이온농도(pH) 4.5~6.0, 광원은 청색 LED, 조도는 0.5 LUX를 유지하며 공기는 0.5~1.5 kgf/cm²으로 주입하고 이산화탄소의 농도는 1,000~2,000 ppm으로 유지하면서 8~13일간 수행될 수 있고, 22℃, pH 5.0, 1.0 kgf/cm², 1,500 ppm 조건에서 10일간 수행되는 것이 세포외다당체의 함량이 높으므로 바람직하다.

상기 (a) 단계에서의 모균주로는 PDA(Potato dextrose agar) 배지 상태로 4℃에 보관중인 우량균주 1개를, 삼각플라스크에 PDB(Potato dextrose broth) 배지를 사용하여 진탕배양기에서 25℃의 항온을 유지하며 7~9일간 배양과정을 거친 것을 사용할 수 있다. 이때 접종원으로 투입될 균사체의 양은 배양할 용액의 양을 기준으로 0.5%(w/v) 정도인 것이 바람직하다. 균사체량(%/100 ㎖)이 많다고 세포외다당체의 함량도 같이 높아지는 것이 아니므로 배지 조성은 균사체의 성장에 가장 양호한 영양 비율 및 환경조건이 아닌, 세포외다당체의 함량을 가장 높게 형성시키는 선택적 배양조건을 적용하는 것이 바람직하다.

상기 배양액은 균사체와 수용액으로 분리 정제할 수 있다. 상기 분리 정제를 위해 원심분리기로 균사체를 제거한 용액을 다중필터프레스(Multi-Sheet Filter Press)와 진동원심막분리기(PALLSEP)로 반복하여 정제한 후 1분간 자외선(UV)을 조사할 수 있다. 또한, 용액은 산소를 제거한 후 밀봉 보관하는 것이 필요한데, 이는 용액속에 균사가 존재할 경우 균사의 성장으로 유효성분의 함량에 변화를 가져오기 때문이다.

상기 (b) 단계에서는 상기 (a) 단계에서 제조된 균사체 배양액을 진공건조 또는 동결건조시켜 분말화할 수 있다. 상기의 건조는 유효물질의 소멸을 방지하기 위해 40℃ 이하의 온도, 바람직하게는 30℃ 이하의 온도에서 48 내지 96시간 동안 수행되는 것이 바람직하다. 그리고 (b) 단계에서의 건조는 증발온도를 상대적으로 높게 설정하는 진공건조기보다 진공동결건조기를 사용하는 것이 유효물질 함량 변화가 최소화되므로 바람직하다.

상기 (c) 단계에서는 (b) 단계에서 얻은 균사체 배양액 건조분말을 용매로 추출한 후 본 발명에 따른 조성물의 유효성분인 세포외다당체를 분리, 제조한다. 구체적으로, 건조 분말 3 ~ 10g에 증류수 100 ㎖를 첨가하여 잘 현탁한 후, 5,000 ~ 10,000 rpm으로 10 ~ 30분 동안 원심분리하여 이의 상등액에 그 양의 2 ~ 3배에 해당하는 추출 용매를 첨가하고 1 ~ 5℃의 냉장고에 넣어 10 ~ 15시간 정치시킬 수 있다. 상기의 정치물에서 상등액만을 다시 5,000 ~ 10,000 rpm으로 10 ~ 30분 동안 원심분리한 후, 침전물을 회수하여 조(crude) 세포외다당체를 제조할 수 있다. 상기 조 세포외다당체를 30℃ 이하에서 진공동결건조하는 것이 바람직하다.

상기 추출 용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 아세톤, 에테르, 클로로포름 및 에틸아세테이트로 이루어진 군에서 선택되는 용매 또는 이들의 혼합용매일 수 있고, 바람직하게는, 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 아세톤 및 에틸아세테이트로 이루어진 군에서 선택되는 용매 또는 이들의 혼합용매일 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 물 또는 50 내지 80 %(w/w)의 에탄올 수용액일 수 있다.

본 발명의 피부상태 개선용 조성물은 피부 미백 효과를 나타낼 수 있다. 피부 미백 효과는 멜라닌의 생성이 저해됨에 따라 멜라닌의 증가에서 비롯되는 증상이 예방 또는 억제되는 작용을 의미한다. 일 실시예에 따르면, 본 발명의 조성물은 세포내 멜라닌의 생성이 억제됨으로서 피부 미백 효과를 나타내며, 안정성이 높고, 피부 자극 유발 등의 부작용이 거의 없다.

또한, 본 발명의 피부상태 개선용 조성물은 주름 개선 효과를 나타낼 수 있다. 주름 개선은 주름의 예방 및 주름의 제거 등을 포함한다. 일 실시예에 따르면, 본 발명의 조성물은 콜라게네이즈 활성 억제, 콜라겐 합성의 촉진 등의 분자적 기전을 통하여 우수한 주름 개선 효과를 발휘할 수 있다.

또한, 본 발명의 피부상태 개선용 조성물은 피부 보습 효과를 나타낼 수 있다. 구체적으로 본 발명의 조성물은 생물학적 제제를 사용함으로써 피부 자극이 적으며, 피부에 대한 침투력과 각질층에서의 수분 고정 기능이 우수하여 보습 효과의 지속력이 우수하다. 일 실시예에 따르면, 본 발명의 조성물은 필라그린(filaggrin)의 발현을 촉진하여 우수한 피부 보습 효과를 발휘할 수 있다.

또한, 본 발명의 피부상태 개선용 조성물은 피부 노화 방지 효과를 나타낼 수 있다. 일 실시예에 따르면, 본 발명의 조성물은 자유라디칼 제거를 통해 항산화 효과를 나타냄으로써, 피부 노화의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 전술한 효과뿐만 아니라 독성 및 부작용도 거의 없어 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 피부상태 개선용 조성물은 유효성분인 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포외다당체 또는 이를 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양액, 이의 건조분말 또는 추출물 이외에, 피부상태 개선 효과가 있다고 알려진 여타의 공지된 화합물이나 식물 추출물을 포함할 수 있다. 상기 피부상태 개선 효과가 있다고 이미 알려진 화합물이나 식물 추출물의 예로서는 멀캅토숙신산, 멀캅토덱스트란, 테프레논, 디하이드록시-이소퀴놀린, 인도메타신, 3-하이드록시마뉼, 비타민 K, 티아졸리돈, 키누레닌, 레몬 추출물, 오이 추출물, 오디 추출물, 감초 추출물, 로즈마리 추출물, 아세로라 체리 추출물, 은행 추출물, 카롭(carob) 추출물, 제라늄(geranium) 추출물 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포외다당체 또는 이를 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양액, 이의 건조분말 또는 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 화장품을 제공한다.

본 발명에 따른 화장품은 피부상태 개선 활성을 보이는 유효성분인 세포외다당체 또는 이를 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양액, 이의 건조분말 또는 추출물 이외에 화장품에 통상적으로 이용되는 성분들, 예컨대, 안정화제, 용해화제, 계면활성제, 비타민, 색소 및 항료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 포함할 수 있다.

상기 화장품은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포외다당체 또는 이를 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양액, 이의 건조분말 또는 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 식품을 제공한다.

본 발명에 따른 식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료의 형태일 수 있고, 캔디, 초콜릿, 음료, 껌, 차, 비타민복합체, 건강보조식품 등일 수 있다.

이때, 상기 식품 중에 포함되는 본 발명에 따른 세포외다당체 또는 이를 포함하는 균사체 배양액, 이의 건조분말 또는 추출물의 함량은, 일반적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 50 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 20 중량%로 포함될 수 있고, 건강 음료 조성물의 경우 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 포함될 수 있다.

본 발명의 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포외다당체 또는 이를 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양액, 이의 건조분말 또는 추출물은 피부상태 개선 효과를 나타내기 위한 목적으로 각종 화장품 및 식품 등에 첨가제로서 사용될 수 있으며, 이 때 사용량 및 사용 형태는 목적에 따라 적절히 조절할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

제조예 1. 세리포리아 락세라타 배양액, 이의 건조분말, 추출물 및 세포외다당체(exopolysaccharide; 이하, "EPS"라 함)의 제조

1.1 세리포리아 락세라타 배양액의 제조

경북 상주시에서 채취한 참나무 변제부 속에서 분리한 세리포리아 락세라타를 계대배양을 통해 육성한 모균을 -80℃에 냉동보관하였고, 보관중인 균주를 PDA(Potato dextrose agar) 배지(87플라스틱 배양구; Difco, Becton Dickinson and Company)에서 2~3회 계대 후 충분한 수량의 완전한 균주만을 4℃ 냉장고에 보관하여 사용하였다. 그리고 삼각플라스크에 PDB(Potato dextrose broth) 배지(Difco, Becton Dickinson and Company) 600 ㎖를 조성한 후, PDA 배양균주 1개를 넣고 8일간 진탕배양하였다. 그리고 설탕 1.5 중량%, 포도당 0.5 중량%, 감자전분 0.5 중량%, 수수분 0.25 중량%, 대맥분 0.25 중량%, 대두분 0.75 중량%, 황산마그네슘(MgSO₄) 0.05 중량%, 1인산칼륨(KH₂PO₄) 0.05 중량%, 2인산칼륨(K₂HPO₄) 0.05 중량% 및 잔량의 물을 포함하는 액체 배양 배지를 800 L 발효조에서 121℃, 1.5 kgf/cm²로 20분간 살균한 후, 23℃로 냉각한 상태에서 스타터로 사용할 PDB 배양균주 600 ㎖를 접종하고, 공기를 0.5~1.5 kgf/cm²로 통기시키면서, 광원은 청색 LED, 조도는 0.5 LUX를 유지하며, 이산화탄소의 농도는 2,000 ppm으로 세리포리아 락세라타 균사체를 23℃의 항온에서 10일간 액체 배양함으로써 세리포리아 락세라타 균사체 배양액을 제조하였다.

1.2 세리포리아 락세라타 배양액 건조분말의 제조

제조예 1.1에서 제조된 세리포리아 락세라타 균사체 배양액을 진공동결건조기를 이용하여 25℃의 저온에서 72시간 동안 동결건조시켜 분말화함으로써 세리포리아 락세라타 균사체 배양액의 건조분말을 제조하였다.

1.3 세리포리아 락세라타 배양액 추출물의 제조

제조예 1.2에서 제조된 건조 분말 5g에 증류수 100 ㎖를 첨가하여 잘 현탁한 후, 원심분리(8,000rpm, 20분)한 다음 이의 상등액에 그 양의 2~3배에 해당하는 에탄올을 첨가하고 냉장고(4℃)에 넣어 12시간 정치시켰다. 상기의 정치물에서 상등액을 취해 세리포리아 락세라타 균사체 배양액의 추출물을 제조하였다.

1.4 세리포리아 락세라타 배양액으로부터 EPS의 제조

제조예 1.3에서 제조된 추출물을 다시 원심분리(8,000rpm, 20분)한 후, 침전물을 회수하여 조(crude) EPS를 얻었다. 조 EPS를 동결건조기에서 72시간 건조시켜 완전한 EPS를 획득하였다.

실시예 1. EPS의 특성 평가

1.1 겔투과 크로마토그래피(Gel Permeation Chromatography, GPC)를 이용한 EPS의 분자량 측정

제조예 1에서 제조한 EPS를 0.1 M Na₂SO₄/0.05 M NaN₃(빙초산(glacial acetic acid)으로 pH를 4로 조정) 용액에 1%(w/v)가 되도록 녹인 다음, 4,000 rpm으로 0.5 시간 동안 원심분리 후 상층액만을 0.45 μm 시린지 필터(syringe filter)로 여과하여 GPC로 분석하였다.

구체적으로, 분석조건은 검출기로 굴절지수를 이용하였으며, GPC 칼럼은 OHpak SB 805 HQ(Shodex, Japan)를 이용하여 이동상을 0.1 M Na₂SO₄/0.05 M NaN₃(빙초산으로 pH를 4로 조정)로 유속은 1.0 ㎖/분의 속도로 흘려주었다. 표준곡선은 각기 다른 분자량(130, 400, 770, 1200 kDa)을 가진 덱스트란(American Polymer Corporation, USA)을 이용하여 작성하였으며, 굴절지수(refractive index, RI) 측정기 Knauer K-2310(Germany)를 이용하여 EPS의 분자량을 측정하였다. 측정 조건을 정리하면 아래 표 1과 같다.

그 결과, 본 발명의 EPS의 분자량은 약 120 kDa인 것으로 나타났다.

1.2 EPS의 당 및 단백질 함량 측정

EPS를 2차 정제하고 단백질 가수분해 효소를 처리하여 당 및 단백질 함량을 측정하였다.

구체적으로, 1차 정제된 EPS(제조예 1에서 제조한 EPS)를 다시 증류수에 녹이고 원심분리(8,000 rpm, 20분)하여 상등액을 분리한 후, 분리된 상등액에 그 양의 2~3배에 해당하는 에탄올을 첨가하고 냉장고(4℃)에 넣어 12시간 정치시켰다. 상기의 정치물에서 상등액만을 다시 원심분리(8,000 rpm, 20분)한 후, 침전물을 회수하여 2차 정제된 EPS를 획득하였다. 다음으로, 정제된 EPS를 증류수에 용해시킨 후 단백질 가수분해 효소인 알칼레이즈(alcalase)를 0.5%(w/v)의 농도로 50℃에서 30분간 처리하였다.

당 함량은 페놀-황산법(phenol-sulfuric acid method)에 의해 측정하였다. 농도별로 희석한 시료 1 ㎖에 80% 페놀을 25μL 첨가한 후 황산 2.5 ㎖를 첨가하여 실온에서 냉각하고 465 nm에서 흡광도를 측정하여 계산하였다. 단백질 함량은 BCA 방법(Smith PK et al., Analytical Biochemistry, 150(1):76-85, 1985)에 의해 측정되었고 표준품으로 소혈청 알부민을 사용하였다.

그 결과, 아래 표 2와 같이, 당 함량은 45~51 중량%이고 단백질 함량은 33~34 중량%인 것으로 나타났다.

또한, EPS의 당 구성 분석 결과, EPS는 주로 만노오스, 갈락토오스 및 글루코오스를 함유하고 있는 것으로 나타났다.

실시예 2. EPS의 피부 미백 효과 검증

2.1 B16 멜라노마 세포의 생존율 시험

세리포리아 락세라타 균사체 배양액으로부터 분리된 EPS의 세포 독성을 확인하였다.

구체적으로, 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 배지에서 배양한 B16 멜라노마 세포(입수처 : ATCC)를 96 웰 플레이트에 접종하고 16시간 후, 세포가 부착되면 제조예 1에서 제조한 EPS를 0.5 ㎍/㎖, 2.5 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 250 ㎍/㎖ 및 500 ㎍/㎖의 농도로 처리하고, 2시간 후 멜라닌 생성을 유도하는 물질로 알려진 α-MSH(alpha-melanocyte stimulating hormone) 50 nM을 처리한 후 37℃, 5% CO₂의 인큐베이터에서 배양하였다. 비교를 위해, 대조군의 경우 EPS를 처리하지 않았다. 72시간 후, 배지를 제거하고 MTT(3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 용액 100 ㎕을 첨가하여 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 용액을 제거하고 DMSO 100 ㎕를 첨가하여 염색된 세포를 녹인 후 ELISA 리더를 이용하여 570 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율(%)은 [실험군 흡광도/대조군 흡광도] X 100으로 계산하였다.

그 결과, 도 1에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 EPS는 50 ㎍/㎖의 농도까지 세포 독성을 나타내지 않았으나 250 ㎍/㎖ 이상의 농도부터는 강한 세포 독성을 나타내었다. 상기 결과를 바탕으로 50 ㎍/㎖ 이하의 농도의 EPS를 이용하여 차후 실험을 진행하였다.

2.2 멜라닌 합성 억제 시험

세리포리아 락세라타 균사체 배양액으로부터 분리된 EPS의 피부 미백 효과를 검증하기 위하여, 생성된 멜라닌 양의 변화를 측정하였다.

구체적으로, 배양한 B16 멜라노마 세포를 96 웰 플레이트에 접종하고 16시간 후, 세포가 부착되면 실험군으로서 제조예 1에서 제조한 EPS를 5 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖ 농도로 처리하고, 음성대조군의 경우, 아무것도 처리하지 않았으며, 양성대조군의 경우, 티로시나아제를 저해하여 멜라닌 색소 형성을 억제하는 것으로 알려진 알부틴을 50 ㎍/㎖ 농도로 처리하였다. 이후 바로 α-MSH 50 nM을 처리한 후 37℃, 5% CO₂의 인큐베이터에서 배양하였다. 72시간 배양한 다음, 트립신-EDTA를 이용하여 회수한 세포를 5000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 제거한 세포 펠렛을 얻었다. 회수한 세포 펠렛에 protein extraction buffer (Bio-Rad, 미국)를 첨가한 후 얼음에서 40분 동안 세포를 용해시키고 12000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상등액을 회수하고 희석하여 protein assay kit solution (Bio-Rad, 미국)을 넣고 상온에서 15분 동안 반응시켰다. 반응이 끝나고 ELISA 리더를 이용하여 595 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 단백질 량은 소혈청 알부민(bovine serum albumin)을 이용하여 그린 표준 곡선(standard curve)에 대입하여 구하였다. 단백질 정량이 끝난 세포를 60 ℃에서 1시간 반응시킨 후 ELISA 리더를 이용하여 595 nM 파장에서 흡광도를 측정하였다. 각 결과는 생성된 멜라닌 양/단백질 양(㎍ melanin/mg protein)으로 나타내었다.

그 결과, 도 2에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 EPS는 농도 의존적으로 멜라닌 생성을 억제하는 것으로 나타났으며, 특히 본 발명에 따른 EPS는 양성대조군인 알부틴보다도 멜라닌 생성 억제 효과가 우수하였다.

실시예 3. EPS의 주름 개선 효과 검증

3.1 콜라겐 생합성 촉진 효과 시험

세리포리아 락세라타 균사체 배양액으로부터 분리된 EPS의 피부 주름 개선 효과를 검증하기 위하여, EPS를 인간 피부 섬유아세포에 처리한 후, 콜라겐의 생합성 정도를 시험하였다.

구체적으로, 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 배지에서 배양한 인간 피부 섬유아세포를 12 웰 플레이트에 접종하고 3일간 배양한 후, 세포가 부착되면 제조예 1에서 제조한 EPS를 5 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖ 농도로 처리하고, 음성대조군의 경우, 아무것도 처리하지 않았으며, 양성대조군의 경우, TGF-β(10 ㎍/㎖)를 처리하였다. 72시간 배양 후 수집한 각각의 세포 배지 20 ㎕와 antibody-POD conjugate solution (Takara) 10 ㎕를 96 웰 플레이트에 넣고 37℃에서 3시간 배양하였다. 각 웰을 PBS 400 ㎕로 3회 세척한 후 기질용액(tetramethoxybenzil, TMBZ)을 100 ㎕를 각 웰에 첨가하여 상온에서 15분간 배양하고 1N 황산 100 ㎕을 각 웰에 첨가하여 잘 섞은 뒤, ELISA 리더를 이용하여 450 nM 파장에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 3에서 보는 바와 같이, EPS는 농도 의존적으로 콜라겐 합성을 증가시키는 것으로 나타났다. 특히 EPS는 25 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 양성대조군인 TGF-β보다 콜라겐의 생합성이 우수하였다.

3.2 콜라게네이즈 활성 억제 시험

세리포리아 락세라타 균사체 배양액으로부터 분리된 EPS의 피부 주름 개선 효과를 검증하기 위하여, 콜라겐을 분해하여 주름생성을 촉진시키는 콜라게네이즈의 활성억제 효과를 시험하였다. 콜라게네이즈(MMP-1, matrix metal protease-1) 활성 억제 정도를 측정하기 위해 콜라게네이즈를 활성화시키는 물질인 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)로 처리된 인간 피부 섬유아세포에 EPS를 처리한 후, 프로콜라게네이즈(Pro-MMP-1, pro matrix metal protease-1)의 양을 측정하였다. 실험군의 경우, EPS를 각각 5 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖의 농도로 처리하였고, 음성대조군의 경우, 아무것도 처리하지 않았으며, 양성대조군의 경우, PMA(50 ㎍/㎖)를 처리하였다. 22시간 배양 후 세포 배지를 수집하여 Human Pro-MMP1 Quantikine ELISA kit (R&D Systems)를 이용하여 프로콜라게네이즈의 양을 측정하였다.

그 결과, 도 4에서 보는 바와 같이, EPS의 농도가 증가함에 따라 콜라게네이즈 활성이 억제되는 것으로 나타났다. 상기 결과는 본 발명에 따른 EPS가 우수한 주름 개선 효과를 가짐을 보여준다.

실시예 4. EPS의 피부 보습 효과 검증

4.1 각질형성세포의 생존율 측정

세리포리아 락세라타 균사체 배양액으로부터 분리된 EPS의 피부 보습 효과를 검증하기 위하여, MTT 분석법으로 각질형성세포의 생존율을 측정하였다.

구체적으로, 각질형성세포주를 24-웰 플레이트에 1 X 10⁴개가 되도록 접종하여 하루 동안 배양하고, 여기에 실험군으로서 제조예 1에서 제조한 EPS를 1.5 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖ 및 15 ㎍/㎖로 처리하고, 음성대조군의 경우 아무것도 처리하지 않고 하루 동안 더 배양하였다. 세포의 생존율 평가를 위해 MTT 시약을 1 mg/㎖로 처리한 후 4시간 더 배양하고, 배양액을 제거한 후 DMSO를 처리하여 불용성 상태의 MTT를 용출시켰다. 이를 540 nm에서 흡광도를 측정하여 세포독성을 평가하였다.

그 결과, 도 5에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 EPS는 15 ㎍/㎖의 농도까지 세포 독성을 나타내지 않아, 상기 결과를 바탕으로 15 ㎍/㎖ 이하의 농도의 EPS를 이용하여 차후 실험을 진행하였다.

4.2 필라그린(filaggrin)의 발현 측정

세리포리아 락세라타 균사체 배양액으로부터 분리된 EPS의 피부 보습 효과를 검증하기 위하여, 피부 보습을 담당하는 천연보습 인자(Natural Moisturizing Factor, NMF)의 전구 단백질인 필라그린 유전자의 mRNA 및 단백질 발현을 측정하였다.

구체적으로, 각질형성세포를 24 웰 플레이트에 2×10⁵개로 분주하고 1일간 배양한 후, 실험군으로서 제조예 1에서 제조한 EPS를 1.5 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖ 및 15 ㎍/㎖로 처리하고, 음성대조군의 경우 아무것도 처리하지 않고 24시간 배양하였다.

상기의 방법으로 배양한 세포로부터 상층액을 제거하고 Eazy blue lysis reagent (iNtRON Biotechnology)를 이용하여 매뉴얼에　따라 RNA를 추출한 다음, RT PreMix(바이오니아사, 한국)에서 제공되는 방법에 준하여 RT-PCR(reverse transcriptional polymerase chain reaction) 분석을 시행하였다. 이때, 프라이머(primer)로는 필라그린에 대한 프라이머(마크로젠, 한국)를 사용하였으며, 내부 대조군(internal control)으로는 베타-액틴(β-actin)을 이용하여 발현량을 비교하였다. 또한, 필라그린 단백질 발현양을 알아보기 위하여 상기 방법으로 배양한 세포에 Protein Extraction Solution (iNtRON Biotechnology)을 처리하여 세포를 용해하고 원심분리하여 상층액의 단백질 농도를 측정하였다. 동일 양의 단백질로 희석하여 NuPAGE LDS sample buffer (Novex)를 혼합하여 100 ℃에서 5분간 끓인 후 Mini PROEAN^® Tetra cell (Bio-Rad, 미국)을 이용하여 SDS-PAGE 후 단백질을 Transfer membranes로 전이하였고, 웨스턴 블롯으로 밴드를 확인하였다.

그 결과, 도 6에서 보는 바와 같이, EPS의 농도가 증가함에 따라 필라그린의 mRNA 및 단백질의 발현을 촉진하는 것으로 나타났다. 상기 결과는 본 발명에 따른 EPS가 우수한 피부 보습 효과를 가짐을 보여준다.

실시예 5. EPS의 피부 노화 방지 효과 검증

5.1 DPPH 자유 라디칼 소거 활성 측정

세리포리아 락세라타 균사체 배양액으로부터 분리된 EPS의 피부 노화 방지 효과를 검증하기 위하여, DPPH(1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl)를 이용한 자유 라디칼 소거 활성을 측정하여 항산화 효과를 확인하였다(Thaipong Kriengsak., et al., Journal of Food Composition and Analysis, vol. 19, pp669~675, 2006).

구체적으로, DPPH 라디칼에 대한 소거 활성은 DPPH 자유 라디칼이 시료의 항산화 물질에 의해 제거되어 라디칼 특유의 색인 보라색이 탈색되는 것을 이용한 방법으로 측정하였다. EPS를 농도별(5 ppm, 10 ppm, 15 ppm, 20 ppm, 25 ppm 및 50 ppm)로 2 ㎖씩 96 웰 플레이트의 웰에 넣은 후, 100 mM의 DPP용액 198 ㎖를 가하여 잘 혼합한 후 상온에서 30분간 인큐베이션 하였다. 이어서, 남아있는 DPPH의 양을 파악하기 위해 540nm에서의 흡광도를 측정하여 농도에 따른 DPPH 라디칼 소거 활성을 확인하였다. 그 후, 본 실시예에 따른 시료의 흡광도를 DPPH를 넣지 않은 대조군의 흡광도와 비교한 라디칼 소거율(%)을 표 3 및 도 7에 나타내었다. 상기 라디칼 소거율(%)은 [1-(시료의 흡광도/대조군의 흡광도)] X 100으로 계산하였다.

상기 표 3에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 EPS의 농도가 5 ppm에서 50 ppm으로 증가함에 따라, DPPH 라디칼 소거 활성이 점점 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, EPS의 농도가 50 ppm일 때, 평균 52.64%의 DPPH 라디칼 소거율을 나타냈다. 따라서, 상기 결과는 본 발명에 따른 EPS가 강력한 항산화 활성을 나타냄으로써 피부 노화 방지에 우수한 효과가 있음을 보여준다.

5.2 ABTS 자유 라디칼 소거 활성 측정

세리포리아 락세라타 균사체 배양액으로부터 분리된 EPS의 피부 노화 방지 효과를 검증하기 위하여, ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonate)를 이용한 자유 라디칼 소거 활성을 측정하여 항산화 효과를 확인하였다(Thaipong Kriengsak., et al., Journal of Food Composition and Analysis, vol. 19, pp669~675, 2006).

구체적으로, ABTS 라디칼 소거 활성은 황산칼륨(Potassium persulfate)과의 반응에 의해 생성된 짙은 청록색의 ABTS 자유 라디칼이 시료의 항산화 물질에 의해 제거되어 라디칼 특유의 색인 청록색이 탈색되는 것을 이용한 방법으로 측정하였다. 7.4 mM ABTS 용액에 2.6 mM 황산칼륨을 혼합시킨 다음 암실에서 약 24시간 동안 반응시켰다. 이를 732nm에서 흡광도가 0.700±0.030이 되도록 인산완충식염수(phosphate buffered saline)로 희석한 후, 5 ppm, 10 ppm, 15 ppm, 20 ppm, 25 ppm 및 50 ppm 농도의 EPS와 혼합하여 암소에서 10분간 반응시켰다. 이어서, 남아있는 ABTS의 양을 파악하기 위해 732nm에서의 흡광도를 측정하였다. 그 후, 본 실시예에 따른 시료의 흡광도를 ABTS를 넣지 않은 대조군의 흡광도와 비교한 라디칼 소거율을 표 4 및 도 8에 나타내었다. 상기 라디칼 소거율(%)은 [1-(시료의 흡광도/대조군의 흡광도)] X 100으로 계산하였다.

상기 표 4에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 EPS의 농도가 5 ppm에서 50 ppm으로 증가함에 따라, 시료의 흡광도가 감소하면서 ABTS 라디칼 소거 활성이 점점 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, EPS의 농도가 50 ppm일 때, 평균 37.67%의 ABTS 라디칼 소거율을 나타냄으로서, 강력한 항산화 활성을 가지는 것으로 나타났다. 따라서, 상기 결과는 본 발명에 따른 EPS가 강력한 항산화 활성을 나타냄으로써 피부 노화 방지에 우수한 효과가 있음을 보여준다.

Claims (11)

1. 세리포리아 락세라타(Ceriporia lacerata) 균사체로부터 생산되는 세포외다당체, 상기 세포외다당체를 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양액, 상기 균사체 배양액의 건조분말 또는 상기 균사체 배양액의 추출물을 유효성분으로 함유하는, 주름 개선용 화장료 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 세포외다당체가 40~60 중량%의 당과 30~40 중량%의 단백질을 포함하고 100~150 kDa의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는, 주름 개선용 화장료 조성물.
   
3. 제 2 항에 있어서,
   상기 세포외다당체가 43~47 중량%의 당과 33~36 중량%의 단백질을 포함하고 115~125 kDa의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는,주름 개선용 화장료 조성물.
   
4. 제 2 항에 있어서,
   상기 당이 만노오스, 갈락토오스 및 글루코오스를 함유하는 것을 특징으로 하는, 주름 개선용 화장료 조성물.
   
5. 제 1 항에 있어서,
   상기 세포외다당체가 (a) 세리포리아 락세라타 균사체를 액체 배양하여 세리포리아 락세라타 균사체 배양액을 제조하는 단계, (b) 세리포리아 락세라타 균사체 배양액을 건조시켜 분말화하는 단계, 및 (c) 세리포리아 락세라타 균사체 배양액 분말을 용매로 추출한 후 이를 여과하고 감압농축하는 단계를 포함하는 제조 방법에 의하여 제조된 것을 특징으로 하는, 주름 개선용 화장료 조성물.
   
6. 제 5 항에 있어서,
   상기 액체 배양을 위한 배지가 설탕, 포도당, 전분, 수수분, 대맥분, 대두분, 황산마그네슘(MgSO₄), 1인산칼륨(KH₂PO₄), 2인산칼륨(K₂HPO₄) 및 물을 포함하고, 수소이온농도가 pH 4.5~6.0인 것을 특징으로 하는, 주름 개선용 화장료 조성물.
   
7. 제 5 항에 있어서,
   상기 액체 배양이 청색 LED 광원 하에서 수행되고, 이산화탄소의 농도를 1,000~2,000 ppm으로 유지하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 주름 개선용 화장료 조성물.
   
8. 삭제
9. 삭제
10. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 주름 개선용 화장품.
    
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