KR101323566B1 - 디(아릴아미노)아릴 화합물 - Google Patents
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Abstract
(과제) EML4-ALK 융합 단백질 및 변이 EGFR 단백질의 키나아제 활성의 저해제로서 유용한 화합물을 제공한다.
(해결수단) 본 발명자들은, EML4-ALK 융합 단백질 및 변이 EGFR 단백질의 키나아제 활성을 저해하는 작용을 갖는 화합물에 관해 예의 검토한 결과, 본 발명의 디(아릴아미노)아릴 화합물이, EML4-ALK 융합 단백질 및 변이 EGFR 단백질의 키나아제 활성의 저해 활성을 갖는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다. 본 발명 화합물은, 암, 폐암, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드 양성 및/또는 변이 EGFR 폴리뉴클레오티드 양성의 암, EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드 양성 및/또는 변이 EGFR 폴리뉴클레오티드 양성의 폐암 또는 EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드 양성 및/또는 변이 EGFR 폴리뉴클레오티드 양성의 비소세포 폐암 등의 예방 및/또는 치료용 의약 조성물로서 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 의약 조성물, 특히 암치료용 의약 조성물의 유효 성분으로서 유용한 디(아릴아미노)아릴 화합물에 관한 것이다.
폐암은, 기관, 기관지, 폐포의 세포가 정상 기능을 상실한 결과 무질서하게 증식하는 것에 의해 발생하는 것으로, 폐암에 의한 사망자수는 전체 암사망자의 17%를 차지하여 가장 많고, 전세계에서 연간 130만명 정도가 폐암으로 사망하고 있다.
폐암에 대한 치료는, 수술(외과 요법), 항암제(화학 요법), 방사선 조사(방사선 요법)로 크게 나누어지지만, 그 치료가 주효한지의 여부는 그 조직형에 따라 변동한다. 예를 들어, 폐암의 확정 진단은, 병리의의 손에 의한 현미경 표본의 세포 병리 조직 진단으로 행해지지만, 폐암의 20% 정도를 차지하는 소세포 폐암은 일반적으로 악성도가 높고, 급속하게 증대, 진전되어 다른 장기로의 전이가 많이 나타나기 때문에, 발견시에 이미 진행암인 경우가 많다. 이 때문에, 화학 요법이나 방사선 요법이 행해지는 경우가 많지만, 이들에 대하여 비교적 감수성은 있어도 대부분은 재발하기 때문에, 예후는 그다지 좋지 않다. 한편, 나머지 80% 정도를 차지하는 비소세포 폐암은, 어느 단계까지는 수술 요법이 검토되지만, 그 단계 이후에 서는 수술이 효과가 있는 경우는 그다지 없고, 화학 요법이나 방사선 요법이 치료의 주체가 된다.
따라서, 모든 폐암에서 화학 요법은 그 치료의 중요한 선택방법의 하나이다.
수용체형 티로신 키나아제인 EGFR은 리간드 결합에 따라 활성화하면, 수용체세포내 영역에 있는 티로신 잔기의 인산화에 이어서, 세포내의 단백질이 차례차례 활성화되고, 세포는 분화, 증식된다(Clinical Cancer Research, 12(18), 2006, p.5268-5272). EGFR은 각종 악성 종양에서 과잉 발현이 관찰되고(Journal of Cellular Physiology, 194(1), 2003, p.13-19), EGFR 과잉 발현이 암의 예후 불량 인자인 것이 나타나 있다(Annals of Oncology, 15(1), 2004, p.28-32, Journal of Clinical Oncology, 21(20), 2003, p.3798-3807). 최근, EGFR의 저해제에 관해, 비소세포 폐암의 한정된 집단에 대한 높은 임상 효과가 관찰되고, 이러한 환자 세그멘트에서 EGFR의 활성 변이가 보고되었다(N. Engl. J. Med. 350, 2004, p.2129-2139, Science 304, 2004, p.1497-1500, Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 2004, p.13306-13311). 이 변이 EGFR은, EGFR의 ATP 결합 부위가 구조 변화를 일으킨 결과, 리간드의 자극이 없어도 항상 활성화되어, 세포의 암화를 일으키고 있는 것으로 이해되고 있다. 이 변이 EGFR을 갖는 암세포에서는 EGFR 저해제로서 알려져 있는 게피티니브나 엘로티니브에 의해 아포토시스를 일으켜, 종양이 축소되는 것이 알려져 있다(Nat. Rev. Cancer 7, 2007, p.169-181).
ALK(Anaplastic Lymphoma Kinase)는, 수용체형 티로신 키나아제이며, 중앙부에 세포막 관통 영역을 가지며, 그 카르복실 말단측에 티로신 키나아제 영역, 아미 노 말단측에 세포외 영역을 갖는 단백질이다. 지금까지, 신경아세포종, 신경교아종, 유방암, 멜라노마 등, 몇개의 외배엽을 기원으로 하는 암세포에서 전장(全長) ALK가 발현하고 있는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 1). 또, 인간 악성 림프종의 일부의 증례에서, ALK 유전자가 염색체 전좌의 결과, 다른 유전자(예를 들어, NPM 유전자, CLTCL 유전자, TFG 유전자)와 융합하여, 암화능을 가진 융합형 티로신 키나아제를 만드는 것이 보고되어 있다(Science, vol.263, p.1281, 1994; Blood, vol.86, p.1954, 1995; Blood, vol.95, p.3204, 2000; Blood, vol.94, p.3265, 1999). 염증성 근선유아세포 종양(Inflammatory Myofibroblastic Tumor)에서도, 염색체 전좌의 결과, CARS 유전자나 SEC31L1 유전자 등의 다른 유전자와 ALK 유전자가 융합하여, 융합형 티로신 키나아제를 만드는 것이 알려져 있다(Laboratory Investigation, a journal of technical methods and pathology, vol.83, p.1255, 2003; International Journal of Cancer, vol.118, p.1181, 2006). EML4(echinoderm microtubule associated protein like-4)를 포함하며, ALK와 융합하는 파트너 분자의 대부분은 복합체 형성 도메인을 가지며, 융합체 자신도 복합체를 형성하고 있다고 생각되고 있고, 이 복합체 형성이 ALK의 티로신 키나아제 활성의 제어 불능을 야기하여, 세포내 시그널이 비정상적으로 활성화되는 결과, 암화를 야기하고 있다고 생각되고 있다(Cellular and Molecular Life Science, vol.61, p.2939, 2004; Nature Reviews Cancer, vol.8, p.11, 2008).
또, 최근의 보고에서는 식도암에서 TPM4-ALK 융합 단백이 존재하고 있는 것이 프로테오믹스 해석 방법에 의해 나타나 있다(World Journal of Gastroenterology, vol.12, p.7104, 2006; Journal Molecular Medicine, vol.85, p.863, 2007). 또한, 본원의 우선일 이후에는, 폐암 환자의 검체로부터 EML4와 ALK의 융합 유전자가 확인되고, 이 EML4-ALK 융합 유전자에 종양 형성능이 있어, 암의 원인 유전자인 것, 및 그 키나아제 활성의 저해제가 EML4-ALK 융합 단백질이 발현한 각종 세포의 증식을 억제하는 것이 보고되었다(특허문헌 1, 비특허문헌 2). 또한, 상기 문헌에는, EML4-ALK 융합 단백질의 저해제가, EML4-ALK 폴리뉴클레오티드 양성의 폐암 환자의 폐암에 대한 치료약으로서 유용하다는 것이 기재되어 있다.
상술한, EGFR 저해제이며, 유용한 비소세포 폐암 치료제로서 알려져 있는 게피티니브 및 엘로티니브는 이하의 화학 구조를 갖는다.
[화 1]
또, 본원의 우선일 이후에 공개된 특허문헌 1에는, EML4-ALK 융합 단백질의 저해 활성을 갖는 화합물로서, 이하의 화합물(화합물 모두 ALK 저해제로서 알려져 있는 화합물임)이 예시되고, 그 EML4-ALK 융합 단백질의 저해 활성치가 구체적으로 개시되어 있다(특허문헌 1). 하기 화합물 각각의 화합물 약칭은, 특허문헌 1에서 사용되고 있는 것이다.
[화 2]
각각의 화학명은, 화합물 A가 4-[(3'-브로모-4'-히드록시페닐)아미노]-6,7-디메톡시퀴나졸린(WHI-P154로도 불림)이고, 화합물 B가 N-[2-(3-클로로페닐)에틸]-2-[({[4-(트리플루오로메톡시)페녹시]아세틸}아미노)메틸]-1,3-티아졸-4-카르복사미드이고, 화합물 C가 5-클로로-N4-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-N2-{2-메톡시-4-[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]페닐}피리미딘-2,4-디아민이고, 화합물 D가 2-[(5-브로모-2-{[2-메톡시-4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐]아미노}피리미딘-4-일)아미노]-N-메틸벤젠술폰아미드이다.
또, ALK 융합체 발현 림프종 세포에서, ALK 저해 활성을 갖는 화합물인 WHI- P154이 세포 증식 억제, 아포토시스를 유도하는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 3). WHI-P154는 상술한 화합물 A와 동일한 화합물이다.
또, NPM 유전자와 ALK 유전자의 융합 유전자에 의한 융합 단백질의 저해제로서, 하기 식으로 표시되는 TAE684가 알려져 있다. 이 화합물은 상술한 화합물 C와 동일한 화합물이다.
[화 3]
TAE684는, 2개의 -NH기에 끼워진 중앙의 고리가 클로로 치환 피리미딘 고리인 점에서, 본 발명 화합물과 그 화학 구조가 상이하다.
또, TAE684가 NPM-ALK 융합 단백질의 저해 활성에 의해, 미분화 대세포성 림프종(ALCL)의 진전을 저해한 것이 보고되어 있다(비특허문헌 4). 한편, TAE684를 포함한 화합물에 접착반 키나아제(FAK)의 저해 활성이 있고, 그 저해 활성 때문에, 비소세포성 폐암, 소세포 폐암의 예방 및/또는 처치에 유용하다는 것이 기재되어 있기는 하지만, 구체적인 폐암의 치료 효과에 관해서는 전혀 기재되어 있지 않다(특허문헌 2).
본원의 우선일 이후에는, EML4-ALK가 비소세포성 폐암 세포(NCI-H2228)에서 발현하고 있는 것, TFG-ALK가 비소세포 폐암 환자에게서 발현하고 있는 것, TAE684가 비소세포성 폐암 세포(NCI-H2228)의 증식을 저해하는 것이 보고되어 있다(특허문헌 1, 비특허문헌 5, 6).
또, 비특허문헌 6의 서플리멘털 데이터에서는, 그 문헌의 조건에서, TAE684가 HCC-827 세포(변이 EGFR 단백질 발현 세포)에 대하여 거의 증식 억제 활성을 나타내지 않는(억제율 : 7.5%) 것이 기재되어 있다.
본원의 우선일 이후, 최근에 TAE684가 EGFR(L858R 변이)/BaF 세포에 대하여 증식 억제 활성을 나타내는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 7).
특허문헌 1 : 유럽 특허 출원 공개 EP 1914240호 공보
특허문헌 2 : 국제 공개 WO2004/080980호 팜플렛
비특허문헌 1 : International Journal of Cancer, 100권, 49페이지, 2002년
비특허문헌 2 : Nature, 448권, 2호, 561페이지, 2007년
비특허문헌 3 : Laboratory Investigation, 85권, 1544페이지, 2005년
비특허문헌 4 : Proceedings of the National Academy of Science, 104권, 1호, 270페이지, 2007년
비특허문헌 5 : Cell, 131권, 1190페이지, 2007년
비특허문헌 6 : Proceedings of the National Academy of Science, 104권, 50호, 19936페이지, 2007년
비특허문헌 7 : American Association for Cancer Research Annual Meeting 2008 Proceedings, vol.49, April 2008, p.560, #2373
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
의약 조성물, 특히 암치료용 의약 조성물의 유효 성분으로서 유용하고 의약 조성물의 유효 성분으로서 보다 안전하게 사용할 수 있는 화합물을 제공한다.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명자들은, 암치료용 의약 조성물의 유효 성분으로서 유용한 화합물에 관해 예의 검토한 결과, 본 발명의 디(아릴아미노)아릴 화합물이, 우수한 EML4-ALK 융합 단백질 및 변이 EGFR 단백질의 키나아제 활성의 저해 활성을 가지며, 암치료용 의약 조성물의 유효 성분으로서 유용하다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은, 식 (I)의 화합물 또는 그의 염, 그리고 식 (I)의 화합물 또는 그의 염, 및 부형제를 함유하는 의약 조성물에 관한 것이다.
[화 4]
(식 중의 기호는 이하의 의미를 나타낸다.
-X-는,
(1) 식 (II)의 기 또는
(2) 식 (III)의 기
이고,
[화 5]
-R5는,
(1) -H,
(2) -OH,
(3) 할로겐,
(4) 1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 저급 알킬,
(5) 1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 O-저급 알킬,
(6) -S-저급 알킬,
(7) 시아노,
(8) 1개 또는 2개의 저급 알킬로 치환되어 있어도 되는 아미노 또는
(9) 저급 알킬, 옥소, -OH, -O-저급 알킬, 및 1개 또는 2개의 저급 알킬로 치환되어 있어도 되는 아미노로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 기로 치환되어 있어도 되는 환상 아미노(단, -R5가 결합하는 트리아진 고리는 그 환상 아미노가 갖는 질소 원자와 결합한다)
이고,
-R6a, -R6b, -R6c 및 -R6d는,
각각 동일하거나 상이하고,
(1) -H,
(2) 할로겐,
(3) 1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 저급 알킬,
(4) 1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 O-저급 알킬,
(5) -S-저급 알킬 또는
(6) 시아노
이고,
-W는,
(1) -H,
(2) 할로겐,
(3) 1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 저급 알킬,
(4) 1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 O-저급 알킬,
(5) -S-저급 알킬,
(6) 시아노 또는
(7) -A-B로 표시되는 기
이고,
-A-는,
(1) -S(=O)2- 또는
(2) -C(=O)-
이고,
-B는,
(1) 저급 알킬,
(2) 1개 또는 2개의 RZA로 치환되어 있어도 되는 아미노,
(3) 환상 아미노(단, -A-는 그 환상 아미노가 갖는 질소 원자와 결합한다) 또는
(4) 시클로알킬
이고,
RZA는,
(1) 저급 알킬 또는
(2) 시클로알킬
이고,
-R1a, -R1b, -R1c 및 -R1d는,
각각 동일하거나 상이하고,
(1) -H,
(2) 할로겐,
(3) 1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 저급 알킬,
(4) 1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 O-저급 알킬,
(5) -S-저급 알킬 또는
(6) 시아노,
이거나, 또는,
-W가 -H인 경우에는, -R1a 또는 -R1b 중 어느 하나는 -A-B로 표시되는 기이고, -R1a 또는 -R1b 중 다른 하나, -R1c 및 -R1d는, 각각 동일하거나 상이하고, 상기 (1)∼(6) 중 어느 하나이고,
-R2는,
(1) -H,
(2) -OH,
(3) 할로겐,
(4) 1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 저급 알킬,
(5) 1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 O-저급 알킬,
(6) -S-저급 알킬 또는
(7) 시아노
이고,
-R3 및 -R4는,
(1) 하나가 -H, 다른 하나가 RZB, 옥소, -OH, -O-저급 알킬, 및 1개 또는 2개의 RZB로 치환되어 있어도 되는 아미노로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 기로 치환되어 있어도 되는 환상 아미노(단, -R3 또는 -R4가 결합하는 벤젠 고리는 그 환상 아미노가 갖는 질소 원자와 결합한다),
(2) 하나가 -H, 다른 하나가 식 (IV)로 표시되는 기(단, -L1 및 -L2는 결합하는 탄소 원자와 함께 일체가 되어, 비방향족 헤테로 고리를 나타내고, 그 비방향족 헤테로 고리가 질소 원자를 갖는 경우는, 그 질소 원자는 RZC로 치환되어 있어도 된다),
[화 6]
(3) 하나가 -H, 다른 하나가 -Y-Z로 표시되는 기 또는
(4) -R3 및 -R4가 결합하는 탄소 원자와 함께 일체가 되어, 비방향족 헤테로 고리(단, 그 비방향족 헤테로 고리가 질소 원자를 갖는 경우는, 그 질소 원자는 -CO2-(1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 저급 알킬)로 치환되어 있어도 된다)
이고,
RZB는,
(1) 옥소, -OH, -O-저급 알킬, -S-저급 알킬, 할로겐 및 1개 또는 2개의 저급 알킬로 치환되어 있어도 되는 아미노로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 기로 치환되어 있어도 되는 저급 알킬
이고,
RZC는,
(1) 저급 알킬 또는
(2) -CO2-(페닐로 치환되어 있어도 되는 저급 알킬)
이고,
-Y-는,
(1) 저급 알킬 및 옥소로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 기로 치환되어 있어도 되는 피페리딘-1,4-디일(단, -R3 또는 -R4가 결합하는 벤젠 고리는 그 피페리딘 1위의 질소 원자와 결합하고, -Z는 그 피페리딘 4위의 탄소 원자와 결합한다),
(2) 저급 알킬 및 옥소로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 기로 치환되어 있어도 되는 피페라진-1,4-디일,
(3) 저급 알킬 및 옥소로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 기로 치환되어 있어도 되는 피롤리딘-1,3-디일(단, -R3 또는 -R4가 결합하는 벤젠 고리는 그 피롤리딘 1위의 질소 원자와 결합하고, -Z는 그 피롤리딘 3위의 탄소 원자와 결합한다),
(4) 저급 알킬 및 옥소로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 기로 치환되어 있어도 되는 아제티딘-1,3-디일(단, -R3 또는 -R4가 결합하는 벤젠 고리는 그 아제티딘 1위의 질소 원자와 결합하고, -Z는 그 아제티딘 3위의 탄소 원자와 결합한다),
(5) -O- 또는
(6) -N(-RZD)-
이고,
-RZD는,
(1) -H 또는
(2) 저급 알킬
이고,
-Z는,
(1) -RZE, 옥소, -OH, -O-저급 알킬, 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 페닐, 피페리딘-1-일, 피리미딘-2-일, 및 1개 또는 2개의 저급 알킬로 치환되어 있어도 되는 아미노로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 기로 치환되어 있어도 되는 환상 아미노,
(2) 할로겐, 1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 저급 알킬, -O-저급 알킬 및 시아노로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 기로 치환되어 있어도 되는 아릴,
(3) 할로겐, 1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 저급 알킬, -O-저급 알킬, 시아노 및 옥소로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 기로 치환되어 있어도 되는 시클로알킬,
(4) 할로겐, 1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 저급 알킬, -OH, -O-저급 알킬 및 시아노로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 기로 치환되어 있어도 되는 방향족 헤테로 고리 또는
(5) 식 (V)의 기
[화 7]
이고,
-RZE는,
(1) 옥소, -OH, 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 페닐, 및 1개 또는 2개의 저급 알킬로 치환되어 있어도 되는 아미노로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 기로 치환되어 있어도 되는 저급 알킬
이다)
특별한 기재가 없는 한, 본 명세서 중의 어떤 화학식 중의 기호가 다른 화학식에서도 사용되는 경우, 동일한 기호는 동일한 의미를 나타낸다.
또, 본 발명은, 식 (I)의 화합물 또는 그의 염을 함유하는 변이 EGFR 단백질의 키나아제 활성의 저해제, 한 양태로는, EML4-ALK 융합 단백질 및 변이 EGFR 단백질의 키나아제 활성의 저해제에 관한 것이다.
또, 본 발명은, 식 (I)의 화합물 또는 그의 염을 함유하는 암치료 의약 조성물, 즉, 식 (I)의 화합물 또는 그의 염을 함유하는 암치료제에 관한 것이다.
또, 본 발명은, 암치료용 의약 조성물의 제조를 위한 식 (I)의 화합물 또는 그의 염의 사용, 암의 치료를 위한 식 (I)의 화합물 또는 그의 염의 사용, 그리고, 식 (I)의 화합물 또는 그의 염의 유효량을 환자에게 투여하는 것으로 이루어진 암치료 방법에 관한 것이다.
발명의 효과
식 (I)의 화합물 또는 그의 염은, EML4-ALK 융합 단백질 및 변이 EGFR 단백질의 키나아제 활성의 저해 활성, 그리고, 인간 비소세포 폐암 세포주 NCI-H2228 세포 및 HCC827 세포의 증식 억제 활성을 가지며, 암, 그 양태로는, 폐암, 다른 양태로는, 비소세포 폐암 또는 소세포 폐암, 또 다른 양태로는, EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드 양성 및/또는 변이 EGFR 폴리뉴클레오티드 양성의 암, 또 다른 양태로는, EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드 양성 및/또는 변이 EGFR 폴리뉴클레오티드 양성의 폐암, 또 다른 양태로는, EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드 양성 및/또는 변이 EGFR 폴리뉴클레오티드 양성의 비소세포 폐암 등의 예방 및/또는 치료용 의약 조성물의 유효 성분으로서 사용할 수 있다.
도 1은 폐암 환자 검체의 EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드의 스크리닝의 결과를 나타내는 도면이다. 레인 「46, XX」는 건강한 여성의 말초혈 단핵구, 「ID#2」∼「ID#42」는 폐암 환자 절제 표본으로부터 얻은 시료를 사용한 결과를 나타낸다. 또, 레인 「NTC」은 기질 cDNA를 첨가하지 않는 상태에서의 결과를 나타낸다. 레인 「Marker」는, 사이즈 마커 DNA를 영동한 레인을 나타낸다(상단). GAPDH cDNA를 증폭한 결과를 하단에 나타낸다. 각 증례의 성별(M : 남성, F : 여성), 병리형(S : squamous cellcarcinoma, A : adenocarcinoma, AS : adenosquamous carcinoma, B : bronchiolo-aleveolar carcinoma), EGFR 변이의 유무 및 흡연력의 유무에 관해 각각 도면 상부에 나타낸다.
도 2는 유전자의 종양 형성능을 나타내는 도면이다. 도면 상단(3T3)은, 공(空)벡터(Vector), 전장 ALK/pMXS(ALK), EML4-ALKv1/pMXS(EML4-ALK) 또는 EML4-ALK(K589M)/pMXS 발현 플러스미드를 도입한 경우의 3T3 섬유아세포를 나타내고 있다. 스케일바는 100 ㎛을 나타낸다. 도면 하단(누드 마우스)은, 각 3T3 섬유아세포주를 누드 마우스에 접종한 결과를 나타낸다.
발명을 실시하기
위한 최선의 형태
본 발명에 의해 이하가 제공된다.
[1] 식 (I)의 화합물 또는 그의 염.
[화 8]
(식 중의 기호는 이하의 의미를 나타낸다.
-X-는,
(1) 식 (II)의 기 또는
(2) 식 (III)의 기
이고,
[화 9]
-R5는,
(1) -H,
(2) -OH,
(3) 할로겐,
(4) 1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 저급 알킬,
(5) 1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 O-저급 알킬,
(6) -S-저급 알킬,
(7) 시아노,
(8) 1개 또는 2개의 저급 알킬로 치환되어 있어도 되는 아미노 또는
(9) 저급 알킬, 옥소, -OH, -O-저급 알킬, 및 1개 또는 2개의 저급 알킬로 치환되어 있어도 되는 아미노로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 기로 치환되어 있어도 되는 환상 아미노(단, -R5가 결합하는 트리아진 고리는 그 환상 아미노가 갖는 질소 원자와 결합한다)
이고,
-R6a, -R6b, -R6c 및 -R6d는,
각각 동일하거나 상이하고,
(1) -H,
(2) 할로겐,
(3) 1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 저급 알킬,
(4) 1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 O-저급 알킬,
(5) -S-저급 알킬 또는
(6) 시아노
이고,
-W는,
(1) -H,
(2) 할로겐,
(3) 1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 저급 알킬,
(4) 1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 O-저급 알킬,
(5) -S-저급 알킬,
(6) 시아노 또는
(7) -A-B로 표시되는 기
이고,
-A-는,
(1) -S(=O)2- 또는
(2) -C(=O)-
이고,
-B는,
(1) 저급 알킬,
(2) 1개 또는 2개의 RZA로 치환되어 있어도 되는 아미노,
(3) 환상 아미노(단, -A-는 그 환상 아미노가 갖는 질소 원자와 결합한다) 또는
(4) 시클로알킬
이고,
RZA는,
(1) 저급 알킬 또는
(2) 시클로알킬
이고,
-R1a, -R1b, -R1c 및 -R1d는,
각각 동일하거나 상이하고,
(1) -H,
(2) 할로겐,
(3) 1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 저급 알킬,
(4) 1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 O-저급 알킬,
(5) -S-저급 알킬 또는
(6) 시아노,
이거나, 또는,
-W가 -H인 경우에는, -R1a 또는 -R1b 중 어느 하나는 -A-B로 표시되는 기이고, -R1a 또는 -R1b 중 다른 하나, -R1c 및 -R1d는, 각각 동일하거나 상이하고, 상기 (1)∼(6) 중 어느 하나이고,
-R2는,
(1) -H,
(2) -OH,
(3) 할로겐,
(4) 1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 저급 알킬,
(5) 1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 O-저급 알킬,
(6) -S-저급 알킬 또는
(7) 시아노
이고,
-R3 및 -R4는,
(1) 하나가 -H, 다른 하나가 RZB, 옥소, -OH, -O-저급 알킬, 및 1개 또는 2개의 RZB로 치환되어 있어도 되는 아미노로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 기로 치환되어 있어도 되는 환상 아미노(단, -R3 또는 -R4가 결합하는 벤젠 고리는 그 환상 아미노가 갖는 질소 원자와 결합한다),
(2) 하나가 -H, 다른 하나가 식 (IV)로 표시되는 기(단, -L1 및 -L2는 결합하는 탄소 원자와 함께 일체가 되어, 비방향족 헤테로 고리를 나타내고, 그 비방향족 헤테로 고리가 질소 원자를 갖는 경우는, 그 질소 원자는 RZC로 치환되어 있어도 된다),
[화 10]
(3) 하나가 -H, 다른 하나가 -Y-Z로 표시되는 기 또는
(4) -R3 및 -R4가 결합하는 탄소 원자와 함께 일체가 되어, 비방향족 헤테로 고리(단, 그 비방향족 헤테로 고리가 질소 원자를 갖는 경우는, 그 질소 원자는 -CO2-(1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 저급 알킬)로 치환되어 있어도 된다)
이고,
RZB는,
(1) 옥소, -OH, -O-저급 알킬, -S-저급 알킬, 할로겐 및 1개 또는 2개의 저급 알킬로 치환되어 있어도 되는 아미노로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 기로 치환되어 있어도 되는 저급 알킬
이고,
RZC는,
(1) 저급 알킬 또는
(2) -CO2-(페닐로 치환되어 있어도 되는 저급 알킬)
이고,
-Y-는,
(1) 저급 알킬 및 옥소로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 기로 치환되어 있어도 되는 피페리딘-1,4-디일(단, -R3 또는 -R4가 결합하는 벤젠 고리는 그 피페리딘 1위의 질소 원자와 결합하고, -Z는 그 피페리딘 4위의 탄소 원자와 결합한다),
(2) 저급 알킬 및 옥소로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 기로 치환되어 있어도 되는 피페라진-1,4-디일,
(3) 저급 알킬 및 옥소로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 기로 치환되어 있어도 되는 피롤리딘-1,3-디일(단, -R3 또는 -R4가 결합하는 벤젠 고리는 그 피롤리딘 1위의 질소 원자와 결합하고, -Z는 그 피롤리딘 3위의 탄소 원자와 결합한다),
(4) 저급 알킬 및 옥소로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 기로 치환되어 있어도 되는 아제티딘-1,3-디일(단, -R3 또는 -R4가 결합하는 벤젠 고리는 그 아제티딘 1위의 질소 원자와 결합하고, -Z는 그 아제티딘 3위의 탄소 원자와 결합한다),
(5) -O- 또는
(6) -N(-RZD)-
이고,
-RZD는,
(1) -H 또는
(2) 저급 알킬
이고,
-Z는,
(1) -RZE, 옥소, -OH, -O-저급 알킬, 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 페닐, 피페리딘-1-일, 피리미딘-2-일, 및 1개 또는 2개의 저급 알킬로 치환되어 있어도 되는 아미노로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 기로 치환되어 있어도 되는 환상 아미노,
(2) 할로겐, 1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 저급 알킬, -O-저급 알킬 및 시아노로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 기로 치환되어 있어도 되는 아릴,
(3) 할로겐, 1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 저급 알킬, -O-저급 알킬, 시아노 및 옥소로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 기로 치환되어 있어도 되는 시클로알킬,
(4) 할로겐, 1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 저급 알킬, -OH, -O-저급 알킬 및 시아노로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 기로 치환되어 있 어도 되는 방향족 헤테로 고리 또는
(5) 식 (V)의 기
[화 11]
이고,
-RZE는,
(1) 옥소, -OH, 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 페닐, 및 1개 또는 2개의 저급 알킬로 치환되어 있어도 되는 아미노로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 기로 치환되어 있어도 되는 저급 알킬
이다.)
[2] -R5가,
(1) -H,
(2) -OH,
(3) 할로겐,
(4) 저급 알킬,
(5) 1개 또는 2개의 저급 알킬로 치환되어 있어도 되는 아미노 또는
(6) 환상 아미노(단, -R5가 결합하는 트리아진 고리는 그 환상 아미노가 갖 는 질소 원자와 결합한다)
이고,
-R6a, -R6b, -R6c 및 -R6d가,
각각 동일하거나 상이하고,
(1) -H 또는
(2) 할로겐
이고,
-W가,
(1) -H,
(2) 할로겐 또는
(3) -A-B로 표시되는 기
이고,
-R1a, -R1b, -R1c 및 -R1d가,
각각 동일하거나 상이하고,
(1) -H,
(2) 할로겐 또는
(3) -O-저급 알킬,
이거나, 또는,
-W가 -H인 경우에는, -R1a 또는 -R1b 중 어느 하나는 -A-B로 표시되는 기이 고, -R1a 또는 -R1b 중 다른 하나, -R1c 및 -R1d는, 각각 동일하거나 상이하고, 상기 (1)∼(3) 중 어느 하나이고,
-R2가,
(1) -H,
(2) -OH,
(3) 할로겐,
(4) 저급 알킬 또는
(5) -O-저급 알킬
이고,
-R3 및 -R4가,
(1) 하나가 -H, 다른 하나가 RZB, 옥소, -OH, 및 1개 또는 2개의 RZB로 치환되어 있어도 되는 아미노로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 기로 치환되어 있어도 되는 환상 아미노(단, -R3 또는 -R4가 결합하는 벤젠 고리는 그 환상 아미노가 갖는 질소 원자와 결합한다),
(2) 하나가 -H, 다른 하나가 식 (IV)로 표시되는 기(단, -L1 및 -L2는 결합하는 탄소 원자와 함께 일체가 되어, 비방향족 헤테로 고리를 나타내고, 그 비방향족 헤테로 고리가 질소 원자를 갖는 경우는, 그 질소 원자는 RZC로 치환되어 있어도 된다),
(3) 하나가 -H, 다른 하나가 -Y-Z로 표시되는 기 또는
(4) -R3 및 -R4가 결합하는 탄소 원자와 함께 일체가 되어, 비방향족 헤테로 고리(단, 그 비방향족 헤테로 고리가 질소 원자를 갖는 경우는, 그 질소 원자는 -CO2-(1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 저급 알킬)로 치환되어 있어도 된다)
이고,
-Y-가,
(1) 피페리딘-1,4-디일(단, -R3 또는 -R4가 결합하는 벤젠 고리는 그 피페리딘 1위의 질소 원자와 결합하고, -Z는 그 피페리딘 4위의 탄소 원자와 결합한다),
(2) 피페라진-1,4-디일,
(3) 피롤리딘-1,3-디일(단, -R3 또는 -R4가 결합하는 벤젠 고리는 그 피롤리딘 1위의 질소 원자와 결합하고, -Z는 그 피롤리딘 3위의 탄소 원자와 결합한다),
(4) 아제티딘-1,3-디일(단, -R3 또는 -R4가 결합하는 벤젠 고리는 그 아제티딘 1위의 질소 원자와 결합하고, -Z는 그 아제티딘 3위의 탄소 원자와 결합한다),
(5) -O- 또는
(6) -N(-RZD)-
이고,
-Z가,
(1) -RZE, 옥소, -OH, 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 페닐, 피페리딘-1-일, 피리미딘-2-일, 및 1개 또는 2개의 저급 알킬로 치환되어 있어도 되는 아미노로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 기로 치환되어 있어도 되는 환상 아미노,
(2) 아릴,
(3) 시클로알킬,
(4) 방향족 헤테로 고리 또는
(5) 식 (V)의 기
이고,
-RZE가,
(1) 옥소, -OH, 페닐, 및 1개 또는 2개의 저급 알킬로 치환되어 있어도 되는 아미노로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 기로 치환되어 있어도 되는 저급 알킬
인 [1]에 기재된 화합물 또는 그의 염.
[3] 식 (VI)의 화합물 또는 그의 염.
[화 12]
(식 중의 기호는 이하의 의미를 나타낸다.
-X1- : 식 (VII) 또는 식 (VIII)의 기.
[화 13]
-R15 : -H, 할로겐, 1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 저급 알킬, 1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 O-저급 알킬, -S-저급 알킬, 시아노, 1개 또는 2개의 저급 알킬로 치환되어 있어도 되는 아미노 또는 저급 알킬, 옥소, -OH, -O-저급 알킬, 및 1개 또는 2개의 저급 알킬로 치환되어 있어도 되는 아미노로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 기로 치환되어 있어도 되는 환상 아미노.
-R16a, -R16b, -R16c 및 -R16d : 각각 동일하거나 상이하고, -H, 할로겐, 1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 저급 알킬, 1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 O-저급 알킬, -S-저급 알킬 또는 시아노.
-W1 : 할로겐, 1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 저급 알킬, 1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 O-저급 알킬, -S-저급 알킬, 시아노 또는 -A1-B1로 표시되는 기.
-A1- : -S(=O)2- 또는 -C(=O)-.
-B1 : 저급 알킬 또는 1개 또는 2개의 저급 알킬로 치환되어 있어도 되는 아미노.
-R11a, -R11b, -R11c 및 -R11d : 각각 동일하거나 상이하고, -H, 할로겐, 1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 저급 알킬, 1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 O-저급 알킬, -S-저급 알킬 또는 시아노.
-R12 : 할로겐, 1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 저급 알킬, 1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 O-저급 알킬, -S-저급 알킬 또는 시아노.
-R13 및 -R14 : 하나가 -H를 나타내고, 다른 하나가 저급 알킬, 옥소, -OH, -O-저급 알킬, 및 1개 또는 2개의 저급 알킬로 치환되어 있어도 되는 아미노로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 기로 치환되어 있어도 되는 환상 아미노 또는 -Y1-Z1로 표시되는 기.
-Y1- : 저급 알킬 및 옥소로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 기로 각각 치환되어 있어도 되는 피페리딘-1,4-디일 또는 피페라진-1,4-디일 또는 -O- 또 는 -N(-RY)-. -R13 또는 -R14가 -Y1-Z1이고, -Y1-이 피페리딘-1,4-디일인 경우, -R13 또는 -R14가 결합하는 벤젠 고리는 그 피페리딘 1위의 질소 원자와 결합하고, -Z1은 그 피페리딘 4위의 탄소 원자와 결합한다. 또, -RY는, -H 또는 저급 알킬을 나타낸다.
-Z1 : 저급 알킬, 옥소, -OH, -O-저급 알킬, 및 1개 또는 2개의 저급 알킬로 치환되어 있어도 되는 아미노로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 기로 치환되어 있어도 되는 환상 아미노; 할로겐, 1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 저급 알킬, -O-저급 알킬 및 시아노로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 기로 치환되어 있어도 되는 아릴; 할로겐, 1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 저급 알킬, -O-저급 알킬, 시아노 및 옥소로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 기로 치환되어 있어도 되는 시클로알킬; 또는 할로겐, 1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 저급 알킬, -OH, -O-저급 알킬 및 시아노로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 기로 치환되어 있어도 되는 방향족 헤테로 고리.
[4] -R1a, -R1b, -R1c 및 -R1d가 -H이고, -R2가 -O-메틸이고, -R4가 -H인 [1]에 기재된 화합물 또는 그의 염.
[5] -R3이 4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일인 [4]에 기재된 화합물 또는 그의 염.
[6] -X-가 식 (II)로 표시되는 기이고, -R5가 -H인 [5]에 기재된 화합물 또는 그의 염.
[7] -W가 -A-B로 표시되는 기이고, -A-가 -S(=O)2-이고, -B가 이소프로필인 [6]에 기재된 화합물 또는 그의 염.
[8] -W가 -A-B로 표시되는 기이고, -A-가 -S(=O)2-이고, -B가 1개 또는 2개의 RZA로 치환되어 있어도 되는 아미노이고, RZA가 메틸, 에틸, 이소프로필 또는 시클로프로필인 [6]에 기재된 화합물 또는 그의 염.
[9] N-에틸-2-{[4-({2-메톡시-4-[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]페닐}아미노)-1,3,5-트리아진-2-일]아미노}벤젠술폰아미드,
2-{[4-({2-메톡시-4-[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]페닐}아미노)-1,3,5-트리아진-2-일]아미노}-N,N-디메틸벤젠술폰아미드,
N-이소프로필-2-{[4-({2-메톡시-4-[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]페닐}아미노)-1,3,5-트리아진-2-일]아미노}벤젠술폰아미드,
N-이소프로필-2-{[4-({2-메톡시-4-[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]페닐}아미노)-1,3,5-트리아진-2-일]아미노}-N-메틸벤젠술폰아미드,
2-{[4-({2-메톡시-4-[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]페닐}아미노)-1,3,5-트리아진-2-일]아미노}-N-메틸벤젠술폰아미드,
N-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-N'-{2-메톡시-4-[3-(4-메틸피페라진-1-일)아 제티딘-1-일]페닐}-1,3,5-트리아진-2,4-디아민,
N4-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-N2-{2-메톡시-4-[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]페닐}퀴나졸린-2,4-디아민,
N-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-N'-{2-메톡시-4-[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]페닐}-1,3,5-트리아진-2,4-디아민,
N-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-N'-(2-메톡시-4-피페라진-1-일페닐)-1,3,5-트리아진-2,4-디아민,
N-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-N'-[2-메톡시-4-(1-메틸-1,8-디아자스피로[4.5]데칸-8-일)페닐]-1,3,5-트리아진-2,4-디아민,
N-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-N'-[2-메톡시-4-(1-메틸-1,9-디아자스피로[5.5]운데칸-9-일)페닐]-1,3,5-트리아진-2,4-디아민,
N-시클로프로필-2-{[4-({2-메톡시-4-[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]페닐}아미노)-1,3,5-트리아진-2-일]아미노}벤젠술폰아미드,
N-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-N'-{2-메톡시-4-[메틸(1-메틸피페리딘-4-일)아미노]페닐}-1,3,5-트리아진-2,4-디아민,
N-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-N'-[2-메톡시-4-(4-피롤리딘-1-일피페리딘-1-일)페닐]-1,3,5-트리아진-2,4-디아민,
1-(1-{4-[(4-{[2-(이소프로필술포닐)페닐]아미노}-1,3,5-트리아진-2-일)아미노]-3-메톡시페닐}피페리딘-4-일)피롤리딘-3-올,
N-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-N'-[2-메톡시-4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐]-1,3,5-트리아진-2,4-디아민, 또는
N4-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-N2-{2-메톡시-4-[4-(1-메틸피페리딘-4-일)피페라진-1-일]페닐}퀴나졸린-2,4-디아민인 [1]에 기재된 화합물 또는 그의 염.
[10] N-에틸-2-{[4-({2-메톡시-4-[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]페닐}아미노)-1,3,5-트리아진-2-일]아미노}벤젠술폰아미드,
2-{[4-({2-메톡시-4-[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]페닐}아미노)-1,3,5-트리아진-2-일]아미노}-N,N-디메틸벤젠술폰아미드,
N-이소프로필-2-{[4-({2-메톡시-4-[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]페닐}아미노)-1,3,5-트리아진-2-일]아미노}벤젠술폰아미드,
N-이소프로필-2-{[4-({2-메톡시-4-[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]페닐}아미노)-1,3,5-트리아진-2-일]아미노}-N-메틸벤젠술폰아미드,
2-{[4-({2-메톡시-4-[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]페닐}아미노)-1,3,5-트리아진-2-일]아미노}-N-메틸벤젠술폰아미드,
N-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-N'-{2-메톡시-4-[3-(4-메틸피페라진-1-일)아제티딘-1-일]페닐}-1,3,5-트리아진-2,4-디아민,
N4-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-N2-{2-메톡시-4-[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]페닐}퀴나졸린-2,4-디아민, 또는
N-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-N'-{2-메톡시-4-[4-(4-메틸피페라진-1-일)피 페리딘-1-일]페닐}-1,3,5-트리아진-2,4-디아민인 [9]에 기재된 화합물 또는 그의 염.
[11] N-에틸-2-{[4-({2-메톡시-4-[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]페닐}아미노)-1,3,5-트리아진-2-일]아미노}벤젠술폰아미드,
2-{[4-({2-메톡시-4-[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]페닐}아미노)-1,3,5-트리아진-2-일]아미노}-N,N-디메틸벤젠술폰아미드, 또는
N-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-N'-{2-메톡시-4-[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]페닐}-1,3,5-트리아진-2,4-디아민인 [10]에 기재된 화합물 또는 그의 염.
[12] N-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-N'-{2-메톡시-4-[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]페닐}-1,3,5-트리아진-2,4-디아민인 [11]에 기재된 화합물 또는 그의 염.
[13] [1]에 기재된 화합물 또는 그의 염, 및 제약학적으로 허용되는 부형제를 함유하는 의약 조성물.
[14] [1]에 기재된 화합물 또는 그의 염을 함유하는, EML4-ALK 융합 단백질 및 변이 EGFR 단백질의 키나아제 활성의 저해제.
[15] [1]에 기재된 기재된 화합물 또는 그의 염을 함유하는 암, 폐암, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드 양성 및/또는 변이 EGFR 폴리뉴클레오티드 양성의 암, EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드 양성 및/또는 변이 EGFR 폴리뉴클레오티드 양성의 폐암, 또는 EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드 양성 및/또는 변이 EGFR 폴리뉴클레오티드 양성의 비소세포 폐암의 예방용 또는 치료용 의약 조성물.
[16] 암, 폐암, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드 양성 및/또는 변이 EGFR 폴리뉴클레오티드 양성의 암, EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드 양성 및/또는 변이 EGFR 폴리뉴클레오티드 양성의 폐암, 또는 EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드 양성 및/또는 변이 EGFR 폴리뉴클레오티드 양성의 비소세포 폐암의 예방용 또는 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 [1]에 기재된 화합물 또는 그의 염의 사용.
[17] 암, 폐암, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드 양성 및/또는 변이 EGFR 폴리뉴클레오티드 양성의 암, EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드 양성 및/또는 변이 EGFR 폴리뉴클레오티드 양성의 폐암, 또는 EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드 양성 및/또는 변이 EGFR 폴리뉴클레오티드 양성의 비소세포 폐암의 예방 또는 치료용 의약 조성물의 유효 성분으로서의 사용을 위한 [1]에 기재된 화합물 또는 그의 염.
[18] [1]에 기재된 화합물 또는 그의 염의 유효량을 환자에게 투여하는 것으로 이루어진 암, 폐암, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드 양성 및/또는 변이 EGFR 폴리뉴클레오티드 양성의 암, EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드 양성 및/또는 변이 EGFR 폴리뉴클레오티드 양성의 폐암, 또는 EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드 양성 및/또는 변이 EGFR 폴리뉴클레오티드 양성의 비소세포 폐암의 예방 또는 치료 방법.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 명세서 중 「할로겐」은 F, Cl, Br, I를 의미한다.
「저급 알킬」이란, 직쇄 또는 분지형의 탄소수 1 내지 6(이하, 「C1 -6」로 약칭)의 알킬이고, 예를 들어, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, n-헥실 등이고, 다른 양태로는 C1 -4 알킬이고, 또 다른 양태로는 메틸, 에틸, 이소프로필이다.
「환상 아미노」란, 적어도 하나의 질소 원자를 가지며, 질소, 산소 및 황으로 이루어진 군에서 선택되는 동일하거나 상이한 헤테로 원자를 1개 이상 더 갖고 있어도 되는 환원수(環員數) 3 내지 8의 단환식 비방향족 환상 아민의 1가기이고, 적어도 1개 갖는 질소 원자가 결합수를 갖는 기를 나타낸다. 구체적으로는 예를 들어, 아지리디닐, 아제티디닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 아제파닐, 아조카닐, 피페라지닐, 호모피페라지닐, 모르폴리닐, 옥사제파닐, 티오모르폴리닐, 티아제파닐 등이다. 또 다른 양태로는, 5 내지 6원환의 단환식 비방향족 환상 아민의 1가기이다. 이들의 고리는, 2,5-디아자비시클로[2.2.1]헵탄 등과 같이, 가교 환상 아미노이어도 되고, 또, 디히드로피롤릴, 테트라히드로피리딜, 테트라히드로피라질 등과 같이, 고리의 일부에 불포화 결합을 갖고 있어도 된다.
「비방향족 헤테로 고리」란, 질소, 산소 및 황으로 이루어진 군에서 선택되는 헤테로 원자를 1 내지 4개 갖는 환원수 5 내지 10의 단환식 비방향족 헤테로 고리이고, 예를 들어, 아지리딘, 아제티딘, 피롤리딘, 피페리딘, 아제판, 아조칸, 피 페라진, 호모피페라진, 모르폴린, 옥사제판, 티오모르폴린, 티아제판, 테트라히드로피란, 테트라히드로푸란, 디옥산, 디옥솔란 등이다. 다른 양태로는, 5 내지 6원환의 단환식 비방향족 환상 아민이고, 예를 들어, 피롤리딘, 피페리딘, 피페라진, 모르폴린, 티오모르폴린 등이다. 이들의 고리는, 디히드로피롤, 테트라히드로피리딘, 테트라히드로피라진 등과 같이, 고리의 일부에 불포화 결합을 갖고 있어도 된다.
「아릴」이란, C6 -14의 단환 내지 삼환식 방향족 탄화수소 고리기이고, 예를 들어 페닐, 나프틸 등이고, 다른 양태로는 페닐이다.
「시클로알킬」이란, 가교되어 있어도 되는 C3 -10의 포화 탄화수소 고리기이고, 예를 들어 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로옥틸, 아다만틸 등이다. 또, 부분적으로 불포화 결합을 가진, 시클로헥세닐, 시클로옥타디에닐 등도 포함한다. 또한, 그 고리 상의 1개 또는 2개의 메틸렌기가 -O-로 치환된, 예를 들어 테트라히드로피라닐, 테트라히드로푸라닐, 디옥사닐 등도 포함한다. 또, 이들의 고리가 벤젠 고리와 축합된, 인다닐, 테트라히드로나프틸, 인데닐, 디히드로나프틸, 디히드로크로메닐 등도 포함한다.
「방향족 헤테로 고리」란, 질소, 산소 및 황으로 이루어진 군에서 선택되는 헤테로 원자를 1 내지 4개 갖는 환원수 5 내지 10의 단환 내지 이환식 방향족 헤테로 고리의 1가기이고, 예를 들어 피리딜, 피롤릴, 피라지닐, 피리미디닐, 피리다지닐, 이미다졸릴, 티아졸릴, 옥사졸릴, 티에닐, 푸릴, 인돌릴, 벤조이미다졸릴, 퀴 놀릴, 이소퀴놀릴, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 프타라지닐, 벤조티아졸릴, 벤조옥사졸릴 등이고, 다른 양태로는, 피리딜, 피라지닐, 피리미디닐, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 프타라지닐이고, 또 다른 양태로는 피리딜이다.
「치환되어 있어도 된다」란, 「치환되어 있는」양태 및 「치환되어 있지 않은」양태를 포함한다. 복수의 기로 치환되어 있는 경우, 이들 기는 각각 동일해도 되고 상이해도 된다.
「1개 이상의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 저급 알킬」이란, 예를 들어 1 내지 7개의 동일하거나 상이한 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 저급 알킬이고, 다른 양태로는 1 내지 5개의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 저급 알킬이다. 또 다른 양태로는 1 내지 3개의 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 저급 알킬이다.
「1개 또는 2개의 RZA로 치환되어 있어도 되는 아미노」에서, 2개의 RZA로 치환되어 있는 경우는, 2개의 RZA는 각각 동일해도 되고 상이해도 된다.
본 발명의 한 양태를 이하에 나타낸다.
(1) 식 (I)에서, -R1a, -R1b, -R1c 및 -R1d가 -H인 화합물.
(2) 식 (I)에서, (2-1)-R2가 -O-저급 알킬인 화합물, 다른 양태로는 (2-2)-R2가 -O-메틸인 화합물.
(3) 식 (I)에서, (3-1)-R3이 저급 알킬로 치환되어 있어도 되는 환상 아미노인 화합물(단, -R3이 결합하는 벤젠 고리는 그 환상 아미노가 갖는 질소 원자와 결합한다), 다른 양태로는, (3-2)-R3이 저급 알킬로 치환되어 있어도 되는 피페라지닐인 화합물(단, -R3이 결합하는 벤젠 고리는 그 피페라진이 갖는 질소 원자와 결합한다), 또 다른 양태로는, (3-3)-R3이 메틸로 치환되어 있어도 되는 피페라지닐인 화합물(단, -R3이 결합하는 벤젠 고리는 그 피페라진이 갖는 질소 원자와 결합한다), (3-4)-R3이 4-메틸피페라진-1-일인 화합물, 또 다른 양태로는, (3-5)-R3이 식 (IV)로 표시되는 기이고, -L1 및 -L2가 일체가 되어, 저급 알킬로 치환되어 있어도 되는 환상 아미노를 나타내는 화합물, 또 다른 양태로는, (3-6)-R3이 식 (IV)로 표시되는 기이고, -L1 및 -L2가 일체가 되어, 저급 알킬로 치환되어 있어도 되는, 피롤리딘 또는 피페리딘을 나타내는 화합물, 또 다른 양태로는, (3-7)-R3이 식 (IV)로 표시되는 기이고, -L1 및 -L2가 일체가 되어, 메틸로 치환되어 있어도 되는, 피롤리딘 또는 피페리딘을 나타내는 화합물, 또 다른 양태로는, (3-8)-R3이 -Y-Z로 표시되는 기이고, -Y-가 피페리딘-1,4-디일, 피페라진-1,4-디일, 아제티딘-1,3-디일 또는 -N(-저급 알킬)-이고, -Z가 저급 알킬 및 -OH로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 기로 치환되어 있어도 되는 환상 아미노인 화합물, 또 다른 양태로는, (3-9)-R3이 -Y-Z로 표시되는 기이고, -Y-가 피페리딘-1,4-디일, 피페라진-1,4-디일, 아제티딘-1,3-디일 또는 -N(-메틸)-이고, -Z가 메틸 및 -OH로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 기로 치환되어 있어도 되는, 피페라지닐, 피페리디닐 또는 피롤리디닐인 화합물, 또 다른 양태로는, (3-10)-R3이 4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일인 화합물.
(4) 식 (I)에서, -R4가 -H인 화합물.
(5) 식 (I)에서, (5-1)-X-가 식 (II)로 표시되는 기이고, -R5가 -H인 화합물, 다른 양태로는, (5-2)-X-가 식 (III)으로 표시되는 기이고, -R6a, -R6b, -R6c 및 -R6d가 -H인 화합물.
(6) 식 (I)에서, (6-1)-W가 -A-B로 표시되는 기이고, -A-가 -S(=O)2-이고, -B가 저급 알킬인 화합물, 다른 양태로는, (6-2)-W가 -A-B로 표시되는 기이고, -A-가 -S(=O)2-이고, -B가 이소프로필인 화합물, 또 다른 양태로는 (6-3)-W가 -A-B로 표시되는 기이고, -A-가 -S(=O)2-이고, -B가 1개 또는 2개의 RZA로 치환되어 있어도 되는 아미노이고, RZA가 메틸, 에틸, 이소프로필 또는 시클로프로필인 화합물.
(7) 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 2 이상의 조합인 화합물.
(8) 식 (VI)에서, -R11a, -R11b, -R11c 및 -R11d가 -H인 화합물.
(9) 식 (VI)에서, (9-1)-R12가 -O-저급 알킬인 화합물, 다른 양태로는, (9-2)-R12가 -O-메틸인 화합물.
(10) 식 (VI)에서, (10-1)-R13이 저급 알킬로 치환되어 있어도 되는 환상 아미노인 화합물(단, -R13이 결합하는 벤젠 고리는 그 환상 아미노가 갖는 질소 원자와 결합한다), 다른 양태로는, (10-2)-R13이 저급 알킬로 치환되어 있어도 되는 피페라지닐인 화합물(단, -R13이 결합하는 벤젠 고리는 그 피페라진이 갖는 질소 원자와 결합한다), 또 다른 양태로는, (10-3)-R13이 메틸로 치환되어 있어도 되는 피페라지닐인 화합물(단, -R13이 결합하는 벤젠 고리는 그 피페라진이 갖는 질소 원자와 결합한다), (10-4)-R13이 4-메틸피페라진-1-일인 화합물, 또 다른 양태로는, (10-5)-R13이 -Y1-Z1로 표시되는 기이고, -Y1-이 피페리딘-1,4-디일, 피페라진-1,4-디일 또는 -N(-저급 알킬)-이고, -Z1이 저급 알킬 및 -OH로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 기로 치환되어 있어도 되는 환상 아미노인 화합물, 또 다른 양태로는, (10-6)-R13이 -Y1-Z1로 표시되는 기이고, -Y1-이 피페리딘-1,4-디일, 피페라진-1,4-디일 또는 -N(-메틸)-이고, -Z1이 메틸 및 -OH로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 기로 치환되어 있어도 되는, 피페라지닐, 피페리디닐 또는 피롤리디닐인 화합물, 또 다른 양태로는, (10-7)-R13이 4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일인 화합물.
(11) 식 (VI)에서, -R14가 -H인 화합물.
(12) 식 (VI)에서, (12-1)-X1-이 식 (VII)으로 표시되는 기이고, -R15가 -H인 화합물, 다른 양태로는, (12-2)-X1-이 식 (VIII)으로 표시되는 기이고, -R16a, -R16b, -R16c 및 -R16d가 -H인 화합물.
(13) 식 (VI)에서, (13-1)-W1이 -A1-B1로 표시되는 기이고, -A1-이 -S(=O)2-이고, -B1이 저급 알킬인 화합물, 다른 양태로는, (13-2)-W1이 -A1-B1로 표시되는 기이고, -A1-이 -S(=O)2-이고, -B1이 이소프로필인 화합물, 또 다른 양태로는 (13-3)-W1이 -A1-B1로 표시되는 기이고, -A1-이 -S(=O)2-이고, -B1이 1개 또는 2개의 저급 알킬로 치환되어 있어도 되는 아미노인 화합물.
(14) 상기 (8) 내지 (13) 중 어느 2 이상의 조합인 화합물.
본 발명에 포함되는 구체적 화합물의 예로서, 이하에 나타내는 화합물군 P, 화합물군 Q, 화합물군 R 및 화합물군 S에서 선택되는 화합물을 들 수 있다.
화합물군 P :
N-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-N'-{2-메톡시-4-[4-(4-메틸피페라진-1-일)피 페리딘-1-일]페닐}-1,3,5-트리아진-2,4-디아민 및 그의 염으로 이루어진 군.
화합물군 Q :
N-에틸-2-{[4-({2-메톡시-4-[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]페닐}아미노)-1,3,5-트리아진-2-일]아미노}벤젠술폰아미드, 및
2-{[4-({2-메톡시-4-[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]페닐}아미노)-1,3,5-트리아진-2-일]아미노}-N,N-디메틸벤젠술폰아미드, 그리고 이들의 염으로 이루어진 군.
화합물군 R :
N-이소프로필-2-{[4-({2-메톡시-4-[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]페닐}아미노)-1,3,5-트리아진-2-일]아미노}벤젠술폰아미드,
N-이소프로필-2-{[4-({2-메톡시-4-[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]페닐}아미노)-1,3,5-트리아진-2-일]아미노}-N-메틸벤젠술폰아미드,
2-{[4-({2-메톡시-4-[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]페닐}아미노)-1,3,5-트리아진-2-일]아미노}-N-메틸벤젠술폰아미드,
N-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-N'-{2-메톡시-4-[3-(4-메틸피페라진-1-일)아제티딘-1-일]페닐}-1,3,5-트리아진-2,4-디아민, 및
N4-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-N2-{2-메톡시-4-[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]페닐}퀴나졸린-2,4-디아민, 그리고 이들의 염으로 이루어진 군.
화합물군 S:
N-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-N'-(2-메톡시-4-피페라진-1-일페닐)-1,3,5-트리아진-2,4-디아민,
N-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-N'-[2-메톡시-4-(1-메틸-1,8-디아자스피로[4.5]데칸-8-일)페닐]-1,3,5-트리아진-2,4-디아민,
N-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-N'-[2-메톡시-4-(1-메틸-1,9-디아자스피로[5.5]운데칸-9-일)페닐]-1,3,5-트리아진-2,4-디아민,
N-시클로프로필-2-{[4-({2-메톡시-4-[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]페닐}아미노)-1,3,5-트리아진-2-일]아미노}벤젠술폰아미드,
N-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-N'-{2-메톡시-4-[메틸(1-메틸피페리딘-4-일)아미노]페닐}-1,3,5-트리아진-2,4-디아민,
N-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-N'-[2-메톡시-4-(4-피롤리딘-1-일피페리딘-1-일)페닐]-1,3,5-트리아진-2,4-디아민,
1-(1-{4-[(4-{[2-(이소프로필술포닐)페닐]아미노}-1,3,5-트리아진-2-일)아미노]-3-메톡시페닐}피페리딘-4-일)피롤리딘-3-올,
N-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-N'-[2-메톡시-4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐]-1,3,5-트리아진-2,4-디아민, 및
N4-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-N2-{2-메톡시-4-[4-(1-메틸피페리딘-4-일)피페라진-1-일]페닐}퀴나졸린-2,4-디아민, 그리고 이들의 염으로 이루어진 군.
식 (I)의 화합물에는, 치환기의 종류에 따라, 호변 이성체나 기하 이성체가 존재할 수 있다. 본 명세서 중, 식 (I)의 화합물이 이성체의 한 형태만으로 기재되는 경우가 있지만, 본 발명은, 그 외의 이성체도 포함하며, 이성체가 분리된 것 또는 이들의 혼합물도 포함한다.
또, 식 (I)의 화합물에는, 비대칭 탄소 원자나 축비대칭을 갖는 경우가 있고, 이것에 기초하는 광학 이성체가 존재할 수 있다. 본 발명은, 식 (I)의 화합물의 광학 이성체가 분리된 것 또는 이들의 혼합물도 포함한다.
또한, 본 발명은, 식 (I)로 표시되는 화합물의 제약학적으로 허용되는 프로드러그도 포함한다. 제약학적으로 허용되는 프로드러그란, 가용매 분해에 의해 또는 생리학적 조건하에서, 아미노기, 수산기, 카르복실기 등으로 변환될 수 있는 기를 갖는 화합물이다. 프로드러그를 형성하는 기로는, 예를 들어, Prog. Med., 5, 2157-2161(1985)이나, 「의약품의 개발」(히로카와서점, 1990년) 제7권 분자설계 163-198에 기재된 기를 들 수 있다.
또, 식 (I)의 화합물의 염이란, 식 (I)의 화합물의 제약학적으로 허용되는 염이며, 치환기의 종류에 따라, 산부가염 또는 염기와의 부가염을 형성하는 경우가 있다. 구체적으로는, 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 질산, 인산 등의 무기산이나, 포름산, 아세트산, 프로피온산, 옥살산, 말론산, 석신산, 푸마르산, 말레산, 젖산, 말산, 만델산, 타르타르산, 디벤조일타르타르산, 디톨루오일타르타르산, 시트르산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산, 아스파라긴산, 글루타민산 등의 유기산과의 산부가염, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘, 알루미늄 등의 무기 염기, 메틸아민, 에틸아민, 에탄올아민, 리신, 오르니틴 등의 유기 염기와의 염, 아세틸류신 등의 각종 아미노산 및 아미노산 유도체와의 염이나 암모늄염 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명은, 식 (I)의 화합물 및 그의 염의 각종 수화물이나 용매화물, 및 결정다형의 물질도 포함한다. 또, 본 발명은, 여러가지 방사성 또는 비방사성 동위체로 라벨된 화합물도 포함한다.
식 (I)의 화합물 및 그 제약학적으로 허용되는 염은, 그 기본 골격 또는 치환기의 종류에 기초하는 특징을 이용하여, 여러가지 공지의 합성법을 적용하여 제조할 수 있다. 그 때, 관능기의 종류에 따라서는, 그 관능기를 원료 내지 중간체의 단계에서 적당한 보호기(용이하게 그 관능기로 전화 가능한 기)로 치환해 두는 것이 제조 기술상 효과적인 경우가 있다. 이러한 보호기로는, 예를 들어, 그린(Greene) 및 우츠(Wuts) 저, 「Protective Groups in Organic Synthesis(제3판, 1999년)」에 기재된 보호기 등을 들 수 있고, 이들의 반응 조건에 따라 적절하게 선택하여 사용하면 된다. 이러한 방법에서는, 그 보호기를 도입하여 반응을 행한 후, 필요에 따라 보호기를 제거함으로써, 원하는 화합물을 얻을 수 있다.
또, 식 (I)의 화합물의 프로드러그는, 상기 보호기와 마찬가지로, 원료 내지 중간체의 단계에서 특정한 기를 도입, 또는 얻어진 식 (I)의 화합물을 사용하여 반응을 더 행함으로써 제조할 수 있다. 반응은 통상의 에스테르화, 아미드화, 탈수 등, 당업자에게 공지인 방법을 적용함으로써 행할 수 있다.
이하, 식 (I)의 화합물의 대표적인 제조법을 설명한다. 각 제법은, 그 설명에 붙인 참고 문헌을 참조하여 행할 수도 있다. 본 발명의 제조법은 이하에 나타낸 예에는 한정되지 않는다.
(제1 제법)
[화 14]
(식 중, -L은 이탈기를 나타낸다. 이하 동일.)
본 제법은, 이탈기를 갖는 화합물(1a)과 아닐린 유도체(1b)를 반응시켜, 본 발명 화합물(I)을 제조하는 방법이다. 여기서, 이탈기의 예에는, F, Cl 등의 할로겐, 메탄술포닐옥시, p-톨루엔술포닐옥시, 트리플루오로메탄술포닐옥시 등의 술포닐옥시기 또는 저급 알킬술파닐이나 저급 알칸술포닐이 포함된다.
이 반응에서는, 이탈기를 갖는 화합물(1a)과 아닐린 유도체(1b)를 등량 또는 한쪽을 과잉량 사용하고, 이들의 혼합물을, 반응에 불활성인 용매중 또는 무용매하, 냉각하로부터 가열 환류하, 바람직하게는 0℃∼80℃에서, 통상 0.1시간∼5일간 교반한다. 여기서 사용되는 용매의 예는 특별히 한정되지는 않지만, 벤젠, 톨루엔, 자일렌 등의 방향족 탄화수소류, 디에틸에테르, 테트라히드로푸란, 디옥산, 디메톡시에탄 등의 에테르류, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 클로로포름 등의 할로겐화탄화수소류, 메탄올, 에탄올, 2-프로판올 등의 알콜류, N,N-디메틸포름아미드, 디메틸술폭시드, 아세트산에틸, 아세토니트릴 및 이들의 혼합물을 들 수 있다. 트 리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민 또는 N-메틸모르폴린 등의 유기 염기, 또는 탄산칼륨, 탄산나트륨 또는 수산화칼륨 등의 무기 염기의 존재하에 반응을 행하는 것이, 반응을 원활하게 진행시키는 데 있어서 유리한 경우가 있다.
또, 상기와 같은 염기의 존재하에 반응을 행한 경우, 원료 화합물의 성질 등에 따라서는, 예를 들어, 원료 화합물이 분해되는 등, 원하는 반응이 진행되지 않거나 또는 진행되기 어려운 경우가 있다. 그 경우에는, 염산이나 브롬화수소산 등의 무기산, 아세트산이나 프로피온산 등의 유기산, 메탄술폰산이나 p-톨루엔술폰산 등의 술폰산류의 존재하에 반응을 행하는 것이, 반응을 원활하게 진행시키는 데 있어서 유리한 경우도 있다.
[문헌]
S. R. Sandler 및 W. Karo 저, 「Organic Functional Group Preparations」, 제2판, 제1권, Academic Press Inc., 1991년
일본화학회「실험화학강좌(제5판)」 14권 (2005년)(마루젠)
(제2 제법)
[화 15]
본 제법은, 이탈기를 갖는 화합물(2a)과 아닐린 유도체(2b)를 반응시켜, 본 발명 화합물(I)을 제조하는 방법이다.
이 반응에서는, 제1 제법의 방법을 준용할 수 있다.
(원료 합성)
[화 16]
(식 중, L1 및 L2는 각각 상술한 L에서 선택되는 이탈기를 나타낸다. 이하 동일.)
본 제법은, 이탈기를 갖는 화합물(3)과 아닐린 유도체(2b)를 반응시켜, 화합물(1a)을 제조하는 방법이다.
이 반응에서는, 제1 제법의 방법을 준용할 수 있다.
[화 17]
본 제법은, 이탈기를 갖는 화합물(3)과 아닐린 유도체(1b)를 반응시켜, 화합물(2a)을 제조하는 방법이다.
이 반응에서는, 제1 제법의 방법을 준용할 수 있다.
식 (I)의 화합물은, 유리 화합물, 그 제약학적으로 허용되는 염, 수화물, 용매화물 또는 결정다형의 물질로서 단리되어 정제된다. 식 (I)의 화합물의 제약학적으로 허용되는 염은, 통상의 방법의 제염 반응을 행하여 제조할 수도 있다.
단리, 정제는, 추출, 분별 결정화, 각종 분획 크로마토그래피 등 통상의 화학 조작을 적용하여 행해진다.
각종 이성체는, 적당한 원료 화합물을 선택함으로써 제조할 수 있거나, 또는 이성체간의 물리 화학적 성질의 차이를 이용하여 분리할 수 있다. 예를 들어, 광학 이성체는 일반적인 광학 분할법(예를 들어, 광학 활성인 염기 또는 산과의 다이아스테레오머염으로 유도하는 분별 결정화나, 키랄 컬럼 등을 사용한 크로마토그래피 등)에 의해, 광학적으로 순수한 이성체로 유도할 수 있다. 또, 적당한 광학 활성인 원료 화합물로 제조할 수도 있다.
식 (I)의 화합물의 약리 활성은, 이하의 시험에 의해 확인했다. 특별한 언급이 없는 경우, 이하에 나타내는 시험예는 공지의 방법에 따라 실시 가능하며, 시판하는 시약이나 키트 등을 사용하는 경우에는 시판품의 지시서에 따라서 실시 가능하다.
시험예 1 EML4-ALK 융합 단백질 v1의 키나아제 활성의 저해 활성 평가
EML4-ALK 융합 단백질 v1(EML4-ALK 융합 단백질 v1을 발현하는 BA/F3 세포로부터 정제)의 펩티드 기질에 대한 인산화 활성을 키나아제 활성 검출 키트(HTRF KinEASE-TK; Cisbio사)를 사용하여 검토했다. 피험 화합물을 최종 농도 1000 nM에 서 0.3 nM(TAE684는 100 nM에서 0.03 nM)의 8단계가 되도록 효소 단백을 포함하는 반응액 중에 첨가하고, 이어서 ATP를 첨가하여 1시간 반응시켰다. ATP 농도는 100 ㎛을 사용했다. 효소 단백을 포함하고, 피험 화합물을 첨가하지 않은 반응액(피험 화합물 대신 용매인 DMSO만 0.4% 첨가)을 제작하여, ATP를 첨가하거나 또는 첨가하지 않고 동일하게 반응시켰다. 피험 화합물 미첨가에서의, ATP 미첨가 및 첨가시의 인산화의 카운트를 각각 100% 저해, 0% 저해로 하여, 50% 저해할 때의 피험 화합물 농도(IC50)를 로지스틱 회귀법에 의해 산출했다.
그 결과, 본 발명 화합물 및 TAE684는, EML4-ALK 융합 단백질 v1의 키나아제 활성에 대하여 저해 활성을 나타냈다. 몇 개의 본 발명 화합물 및 TAE684에 관해, IC50값을 표 1에 나타낸다. Ex는 실시예 번호를 나타낸다.
[표 1]
시험예 2 변이 EGFR(L858R) 단백질의 키나아제 활성의 저해 활성 평가
변이 EGFR(L858R) 단백질(카르나바이오사이언스 주식회사)의 펩티드 기질에 대한 인산화 활성을 키나아제 활성 검출 키트(HTRF KinEASE-TK; Cisbio사)를 사용 하여 검토했다. 피험 화합물을 최종 농도 10000 nM에서 3 nM의 8단계가 되도록 효소 단백을 포함하는 반응액 중에 첨가하고, 이어서 ATP를 첨가하여 1시간 반응시켰다. ATP 농도는 5 ㎛을 사용했다. 효소 단백을 포함하고, 피험 화합물을 첨가하지 않은 반응액(피험 화합물 대신 용매인 DMSO만 0.4% 첨가)을 제작하여, ATP를 첨가하거나 또는 첨가하지 않고 동일하게 반응시켰다. 피험 화합물 미첨가에서의, ATP 미첨가 및 첨가시의 인산화의 카운트를 각각 100% 저해, 0% 저해로 하여, 50% 저해할 때의 피험 화합물 농도(IC50)를 로지스틱 회귀법에 의해 산출했다.
그 결과, 본 발명 화합물 및 TAE684는, 변이 EGFR(L858R) 단백질의 키나아제 활성에 대하여 저해 활성을 나타냈다. 몇 개의 본 발명 화합물 및 TAE684에 관해, IC50값을 표 2에 나타낸다. Ex는 실시예 번호를 나타낸다.
[표 2]
시험예 3 인간 비소세포 폐암 세포주 NCI-H2228 세포(EML4-ALK 융합 단백질 발현 세포)의 골격 비의존적 세포 증식 억제 작용 평가
골격(足場) 비의존적인 세포 증식의 측정(콜로니법 등)은, 피험 화합물의 항암 작용(약리 효과)을 검토하는 계로서 알려져 있다(임상종양학 2판, 암과 화학 요법사). 콜로니법 대신 세포 비접착성의 증식을 측정하는 방법으로서, 이하와 같은 스페로이드 플레이트를 이용하는 방법이 있다.
96웰 스페로이드 플레이트(스미론 셀타이트 스페로이드 96U; 스미토모베이크라이트)에, 인간 비소세포 폐암 세포주 NCI-H2228 세포를, 1 웰당 2000 세포가 되도록 10% 소태아 혈청을 포함하는 RPMI1640 배지(Invitrogen)에 파종했다. NCI-H2228 세포는, EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드 v1과는 EML4 cDNA 상의 융합점이 상이하지만 ALK 영역은 공통된 EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드에 의해, EML4-ALK 융합 단백질 v1과는 상이한 EML4-ALK 융합 단백질을 발현하고 있는 세포이다. 플레이트에 파종한 상술한 NCI-H2228 세포를, 5% CO2 존재하, 37℃에서 하룻밤 배양후, 피험 화합물(최종 농도 10 ㎛에서 1 nM) 및 음성 대조로서 피험 화합물의 용매인 DMSO를 화합물과 동일한 농도가 되도록 첨가했다. 그 후, 5% CO2 존재하, 37℃에서 5 일간 배양하고, 세포수 측정 시약(CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay; Promega사)을 첨가하여 20 분 교반한 후, 발광 측정 장치(ML3000 microtiter plate luminometer; Dynatech Laboratories사)를 사용하여 측정했다. 배지에서만의 측정치 및 음성 대조에서의 측정치를 각각 100% 억제, 0% 억제로 하여 피험 화합물의 억제율을 산출하고, 50% 억제 농도(IC50값)를 로지스틱 회귀법에 의해 구했다.
그 결과, 본 발명 화합물 및 TAE684는, 인간 비소세포 폐암 세포주 NCI-H2228 세포에 대하여 증식 억제 활성을 나타냈다. 몇 개의 본 발명 화합물 및 TAE684에 관해, IC50값을 표 3에 나타낸다. Ex는 실시예 번호를 나타낸다.
[표 3]
시험예 4 인간 비소세포 폐암 세포주 HCC827 세포(변이 EGFR(EGFR의 엑슨19의 부분 결실 변이) 단백질 발현 세포, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션)의 골격 비의존적 세포 증식 억제 작용 평가
시험예 3과 동일한 방법으로 평가했다.
그 결과, 본 발명 화합물 및 TAE684는, 인간 비소세포 폐암 세포주 HCC827 세포에 대하여 증식 억제 활성을 나타냈다. 몇 개의 본 발명 화합물 및 TAE684에 관해, IC50값을 표 4에 나타낸다. Ex는 실시예 번호를 나타낸다.
[표 4]
상기 시험예 1∼4의 결과에서, 본 발명 화합물 및 TAE684는, EML4-ALK 융합 단백질 v1의 키나아제 활성의 저해 활성 및 인간 비소세포 폐암 세포주 NCI-H2228 세포의 증식 억제 활성을 가지며, TAE684는, 본 발명 화합물에 비하여 보다 강한 활성을 갖고 있는 것이 확인되었다. 또, 본 발명 화합물 및 TAE684는, 변이 EGFR(L858R) 단백질의 키나아제 활성의 저해 활성 및 인간 비소세포 폐암 세포주 HCC827 세포의 증식 억제 활성을 가지며, 본 발명 화합물과 TAE684는, 거의 동등한 활성을 갖고 있는 것이 확인되었다.
시험예 5 래트 독성 시험
피험 화합물을 0.5% 메틸셀룰로오스 수용액에 현탁하여, 각 군의 암수 각각 2예 또는 4예의 SD 래트에 각 투여량으로 7일간 반복하여 경구 투여했다. TAE684는 3, 10, 30 및 100 mg/kg으로, 실시예 23의 화합물은 10, 30, 100 및 300 mg/kg으로 행했다.
결과를 표 5에 나타낸다.
[표 5]
본 시험의 투여량에서, TAE684는 이하에 나타낸 바와 같은 명확한 독성 증상을 발현하였다. 즉, 30 mg/kg 투여군의 암컷에서의 자발 운동 저하, 폐안(閉眼), 삭수(削瘦), 검렬(瞼裂)의 축소와 같은 일반 증상의 악화, 및 100 mg/kg 투여군의 암수에서의 상기 소견에 더한, 복와(腹臥), 호흡 완서, 유연(流涎), 또한 100 mg/kg 투여군의 암컷 2예(전례)에서의, 7 일째의 투여후의 상태의 현저한 악화이다(이 때문에, 이들 2예는 빈사 해부로 했다). 한편, 실시예 23의 화합물은, 300 mg/kg 투여군에서 수컷 4예 중 2예에서 분량(糞量)의 감소를 확인했지만, 어느 투여량군에서도 7 일간의 투여에서의 일반 상태의 악화는 1례도 관찰되지 않고, 빈사예도 전혀 보이지 않았다.
즉, 실시예 23의 화합물은, 변이 EGFR 단백질 발현 세포의 증식 억제에 관해 TAE684와 동등한 작용을 갖는 한편, TAE684에서 일반 증상의 악화나 빈사예가 관찰되는 30 mg/kg 내지 100 mg/kg라는 용량보다, 보다 많은 300 mg/kg라는 용량을 투여하더라도 일반 증상의 악화나 빈사예가 관찰되지 않아, TAE684에 비하여 보다 안정성이 높은 화합물이라 할 수 있다.
이상의 결과에서, EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드 양성암 환자의 암치료시에는, 실시예 23의 화합물에 비해 TAE684는 보다 낮은 용량에서 일반 증상의 악화 등의 안전성에 대한 우려가 발현되지만(시험예 5), 실시예 23의 화합물에 비하여 TAE684는 보다 낮은 용량에서 치료 효과를 발현하는 것으로 생각되기 때문에(시험예 1 및 시험예 3), 치료 효과와 안전성의 밸런스면에서는, 실시예 23의 화합물과 TAE684는 거의 동등할 것으로 예상된다. 한편, 변이 EGFR 폴리뉴클레오티드 양성암 환자의 암치료시에는, 실시예 23의 화합물과 TAE684에서는 거의 동등한 용량에서 치료 효과를 발현하는 것으로 생각되지만(시험예 2 및 시험예 4), 실시예 23의 화합물에 비하여 TAE684는 보다 낮은 용량에서 일반 증상의 악화 등의 안전성에 대한 우려가 발현되기 때문에(시험예 5), 치료 효과와 안전성의 밸런스면에서, 실시예 23의 화합물은 TAE684에 비하여 우수하다고 할 수 있다.
따라서, EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드 양성암 환자의 암치료시에는, 실시예 23의 화합물 및 TAE684의 두 화합물 모두, 어느 정도의 안전성을 가지고 암치료 효과를 발현할 수 있었다 하더라도, 변이 EGFR 폴리뉴클레오티드 양성암 환자의 암치료시에는, TAE684는 실시예 23의 화합물에 비하여 소위 안전 영역이 좁아, 안전성을 확보하기 위해 투여량을 감소해야 한다면 충분한 치료 효과를 얻을 수 없을 가능성이 있다. 한편, 실시예 23의 화합물은 TAE684에 비하여 보다 넓은 안전 영역을 갖고 있기 때문에, 충분한 치료 효과를 얻을 수 있는 투여량의 투여가 가능하다는 것을 예상할 수 있다. 즉, 실시예 23의 화합물은 TAE684에 비하여 보다 넓은 스펙트럼의 암환자에게 적용 가능한 암치료제인 것이 예상된다.
시험예 6 키나아제 저해 프로파일링
피험 화합물에 관해, 88종류의 키나아제(ABL, ACK, AXL, BMX, BTK, CSK, DDR2, EGFR, EphA2, EphB4, FES, FGFR1, FGFR3, FLT1, FLT4, FMS, INSR, JAK2, JAK3, KDR, MER, MUSK, PDGFRa, RET, TEC, TIE2, TYK2, TYRO3, ABL[T315I], EGFR[L858R], EGFR[T790M], AKT2, AurC, BMPR1A, BRAF, BRAF[V600E], CaMK2a, CaMK4, CDK3, CHK2, CK1a, CK1d, COT, CRIK, DAPK1, DLK, Erk5, GSK3a, GSK3b, IKKa, IKKb, IKKe, IRAK4, JNK1, JNK3, MAP2K2, MAP2k3, MAP2K4, MAP2K5, MAP2K7, MAP3K1, MAP3K2, MAP3K3, MAP3K4, MAP3K5, MAPKAPK2, MAPKAPK3, MAPKAPK5, MLK1, MLK2, MLK3, MNK1, MNK2, MSK1, NEK2, p38d, p38g, PAK6, PHKG1, PIM1, PKACa, PKCh, PKD2, ROCK1, RSK2, SRPK1, TAK1, TTK)에 대한 100 nM에서의 저해율을 산출했다. 활성 측정은 카르나바이오사이언스 주식회사에서 행해지고, 데이터의 해석 방법으로는 모든 반응 성분을 포함하는 컨트롤 웰의 평균 시그널을 0% 저해, 효소 비첨가의 평균 시그널을 100% 저해로 하여, 각 피험 물질 시험 2웰의 평균 시그널로부터 저해율을 계산했다.
그 결과, 100 nM의 농도에서는, TAE684가 29종의 키나아제에 대하여 50% 이상의 저해 활성을 나타낸 데 비해, 실시예 23의 화합물은 4종뿐이었다.
즉, TAE684가 폭넓은 키나아제에 대하여 강한 저해 활성을 갖는 데 비해, 동일한 농도의 실시예 23의 화합물은, TAE684와는 저해 프로파일이 상이하고, 특정 키나아제에 대한 선택성이 높은 것, 즉, 부작용의 원인이 될 수 있는 표적 이외의 키나아제 저해에 의한 안전성에 대한 우려가, TAE684에 비하여 매우 낮다고 생각된다.
또, 실제로 각종 키나아제 저해 프로파일에 관해 정밀하게 조사하면, 실시예 23의 화합물에 비하여, TAE684가 보다 높은 저해 활성을 갖는 키나아제로서 MUSK, MER, PHKG1을 들 수 있고, 이들은 TAE684가 100 nM의 농도에서 90% 이상의 저해 활성을 나타낸 데 비해, 실시예 23의 화합물은 동일한 농도에서 거의 저해 활성을 나타내지 않았다(20% 미만).
MUSK는, 신경근 접합부의 아세틸콜린 수용체 기능에 필수적인 키나아제이며, 이 키나아제에 변이가 있는 경우나 항MUSK 항체 양성인 경우에, 눈꺼풀이 쳐지고, 침을 흘리고, 호흡에 영향이 나타나는 등의 증상을 나타내는 근무력증을 발현하는 유전 질환이 알려져 있다(Hum Mol Genet. 2004 13, 3229-3240 및 Nat Med. 2001 7, 365-368). 시험예 5에 나타낸 TAE684에 보이는 일반 증상의 악화와, MUSK에 변이가 있는 경우의 표현형에는 공통되는 증상이 많아, TAE684의 30 mg/kg 이상의 투여에서 보이는 일반 증상의 악화는, MUSK의 저해와 관련이 있을 가능성이 생각된다.
MER은, 망막 세포의 생존 유지에 필요한 키나아제이며, 이 키나아제에 변이가 있는 경우에, 서서히 시야가 좁아져 실명하는 경우도 있는, 망막 색소 변성증을 발현하는 유전 질환이 알려져 있다(Nature Genet. 2000 26, 270-271). 따라서, TAE684의 MER 저해 활성에 의해, 망막 세포에 대한 이상을 일으킬 가능성을 부정할 수 없다. 한편, 실시예 23의 화합물의 MER 저해 활성은 TAE684의 저해 활성에 비하여 약하기 때문에, 망막 세포에 대한 이상을 일으킬 우려는 거의 없다고 생각된다.
PHKG1은 근육에서의 글루코겐 대사에 필수적인 효소이며, 당원병, 운동중의 근육통, 피로현상, 근강직, 간종대, 복부 팽만, 당원병(글리코겐 축적)에 의한 근조직 위축, 대사성 미오파치의 발현이 우려되는, 효소 복합체의 서브유닛의 변이에 의한 유전 질환이 알려져 있다(Am. J. Med. Genet. 2005 133 A, 82-84). 따라서, TAE684의 PHKG1 저해 활성에 의해, 근조직에 대한 이상을 일으킬 가능성을 부정할 수 없다. 한편, 실시예 23의 화합물의 PHKG1 저해 활성은 TAE684의 저해 활성에 비하여 약하기 때문에, 근조직에 대한 이상을 일으킬 우려는 거의 없다고 생각된다.
한편, TAE684보다 실시예 23의 화합물이 높은 저해 활성을 갖는 키나아제로서, MNK1 및 MNK2를 들 수 있다. 이들 키나아제에 대하여, TAE684가 100 nM에서 각각 4.8% 및 32%의 저해 활성을 나타낸 데 비해, 실시예 23의 화합물은 동일한 농도 에서 각각 60% 및 80%의 저해 활성을 나타냈지만, MNK1과 MNK2의 동시 유전자 파괴마우스는 정상적으로 육성되는 것이 보고되어 있다(Molecular and Celluar Biology 2004 24, 6539-6549). 따라서, 실시예 23의 화합물의 MNK1 및 MNK2 저해 활성이 심각한 질환을 야기한다고 생각하기는 어렵다.
시험예 7 MUSK 단백질의 키나아제 활성의 저해 활성 평가
MUSK 단백질(카르나바이오사이언스 주식회사)의 펩티드 기질에 대한 인산화 활성을 키나아제 활성 검출 키트(HTRF KinEASE-TK; Cisbio사)를 사용하여 검토했다. 피험 화합물을 최종 농도 10000 nM에서 3 nM의 8단계가 되도록 효소 단백을 포함하는 반응액 중에 첨가하고, 이어서 ATP를 첨가하여 1시간 반응시켰다. ATP 농도는 10 ㎛을 사용했다. 효소 단백을 포함하고, 피험 화합물을 첨가하지 않은 반응액(피험 화합물 대신 용매인 DMSO만 0.4% 첨가)을 제작하여, ATP를 첨가하거나 또는 첨가하지 않고 동일하게 반응시켰다. 피험 화합물 미첨가에서의, ATP 미첨가 및 첨가시의 인산화의 카운트를 각각 100% 저해, 0% 저해로 하여, 50% 저해할 때의 피험 화합물 농도(IC50)를 로지스틱 회귀법에 의해 산출했다.
그 결과, 본 발명 화합물 및 TAE684는, MUSK 단백질의 키나아제 활성에 대하여 저해 활성을 나타냈다. 몇 개의 본 발명 화합물 및 TAE684에 관해, IC50값을 표 6에 나타낸다. Ex는 실시예 번호를 나타낸다.
[표 6]
상기 시험예 7의 결과에서, MUSK 단백질의 키나아제 활성의 저해 활성에서는, TAE684는, 본 발명 화합물에 비하여 매우 강한 활성을 갖고 있는 것이 확인되었다. 시험예 5에 나타낸 TAE684에 보이는 일반 증상의 악화와, MUSK에 변이가 있는 경우의 표현형에는 공통되는 증상이 많아, TAE684의 30 mg/kg 이상의 투여에서 보이는 일반 증상의 악화는, MUSK의 저해와 관련이 있을 가능성이 생각된다.
시험예 8 NCI-H2228 세포에 대한 항종양 시험(in vivo)
PBS에 현탁한 NCI-H2228 세포 3×106개를 5 주령의 수컷 NOD/SCID 마우스(일본챨스리버사)의 등부위 피하에 주사하여 이식했다. 이식 3주후에 피험 화합물의 투여를 시작했다. 시험은 용매군 및 피험 화합물 투여군 각 6마리로 행하고, 10% 1-메틸-2-피롤리돈(SIGMA-ALDRICH사)/90% 폴리에틸렌글리콜300(Fluka사)의 조성의 용매에 피험 화합물을 용해하여, 3 mg/kg를 경구 투여했다. 투여는 14일간 1일 1회 행하고, 체중 및 종양 직경을 격일로 측정했다. 종양 체적의 산출에는 이하의 식을 이용했다.
[종양 체적(㎣)]=[종양의 장직경(mm)]×[종양의 단직경(mm)]2×0.5
피험 화합물 투여 개시일 및 투여 종료일의 용매군의 종양 체적을 각각 100% 억제, 0% 억제로 하여 피험 화합물의 억제율을 산출했다.
그 결과, 본 발명 화합물은, NCI-H2228 세포(종양)에 대하여 항종양 작용을 나타냈다. 그중에서도, 실시예 23 및 실시예 123의 화합물은, NCI-H2228 세포(종양)의 증식을, 각각 116% 및 108% 억제했다.
따라서, 본 발명 화합물의 경구 투여에 의해, H2228를 이식한 마우스에서의 종양 증대가 억제되어, 본 발명 화합물에 경구 활성이 있는 것이 확인되었다.
이상의 결과에서, 본 발명 화합물은, 시험예 1∼4에서, EML4-ALK 융합 단백질 v1 및 변이 EGFR(L858R) 단백질의 키나아제 활성의 저해 활성을 갖는 것, 인간 비소세포 폐암 세포주 NCI-H2228 세포 및 HCC827 세포의 증식 억제 활성을 갖는 것이 확인되었다. 또, 이들의 작용에 기초하여, 시험예 8에서, NCI-H2228 세포(종양)에 대하여 항종양 작용을 갖는 것이 확인되었다. 나아가, 시험예 5에서, TAE684에서 일반 증상의 악화가 관찰된 용량보다 고용량인 300 mg/kg을 투여한 경우에도 독성이 발현하지 않는, TAE684보다 안정성이 높은 화합물인 것이 확인되었다. 이것으로부터, 본 발명 화합물이, 암, 한 양태로는, 폐암, 다른 양태로는, 비소세포 폐암 또는 소세포 폐암, 또 다른 양태로는, EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드 양성 및/또는 변이 EGFR 폴리뉴클레오티드 양성의 암, 또 다른 양태로는, EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드 양성 및/또는 변이 EGFR 폴리뉴클레오티드 양성의 폐암, 또 다른 양태로는, EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드 양성 및/또는 변이 EGFR 폴리뉴클레오티드 양성의 비소세포 폐암 등의 예방 및/또는 치료용 의약 조성물의 유효 성분으로서 유용하다는 것은 분명하다.
또, 비특허문헌 7에서, EML4-ALK 융합 단백질 발현 폐암 세포주 중에는, EML4-ALK 융합 단백질과 함께 항상 활성화한 EGFR 단백질이 발현하고 있는 폐암 세포주가 존재하는 것이 확인되었다. 이들 폐암 세포주에 대한 증식 억제에 관해서는, 두 단백질의 저해가 필요하다고 되어 있지만(비특허문헌 7), 본 발명 화합물은, EML4-ALK 융합 단백질 v1 및 변이 EGFR(L858R) 단백질에 대하여 동등한 저해 활성을 갖고 있기 때문에, 이러한 폐암 세포주에 대해서도, 어떤 일정 용량에서 우수한 증식 억제 활성을 갖는다고 생각되고, EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드 양성 및 변이 EGFR 폴리뉴클레오티드 양성의 암의 예방 및/또는 치료용 의약 조성물의 유효 성분으로서 유용하다고 생각된다. 또한, 본 발명 화합물은, EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드 양성의 암에 대해서도, 변이 EGFR 폴리뉴클레오티드 양성의 암에 대해서도, 단일 용량으로 사용할 수 있다고 생각된다.
한편, TAE684는, 본 발명 화합물과 동등한 변이 EGFR(L858R) 단백질의 키나아제 활성의 저해 활성 및 HCC827 세포의 증식 억제 활성을 갖지만, 시험예 5에서, 실시예 23의 화합물에 비하여, 저용량에서 심각한 독성이 발현하고 있기 때문에, 변이 EGFR 폴리뉴클레오티드 양성의 암에 대해서는, 실시예 23의 화합물에 비하여, 충분한 증식 억제 효과를 얻기 위해 필요로 되는 약효 용량의 안전성에 대한 우려가 있다.
또, 식 (I)의 화합물의 약리 활성을, 이하의 일련의 시험에 의해서도 확인했다. 특별한 언급이 없는 경우, 이하에 나타내는 시험예는 공지의 방법에 따라 실시 가능하며, 시판하는 시약이나 키트 등을 사용하는 경우에는 시판품의 지시서에 따 라서 실시 가능하다.
전장 ALK cDNA는 St. Jude Children's Research Hospital의 Steve Morris 박사가 공여하였다. 또, 본 연구 프로젝트는 자치의과대학 유전자 해석 연구 윤리 심사위원회에 의해 인가되었다.
항인산화 ALK 항체는 Cell Signaling Technology사의 것을, 항ALK 항체는 NEOMARKERS사의 것을 사용했다.
시험예 9 EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드 v1의 단리
(1) cDNA 라이브러리의 구축
인폼드 콘센트를 얻은 62세 남성의 폐선암 절제 검체로부터, RNA 정제 키트(RNeasy Mini 컬럼; Qiagen사)에 의해 RNA를 추출하고, 역전사 효소(Power Script Reverse Transcriptase)와 프라이머(서열 번호 3의 올리고뉴클레오티드 및 CDS primer IIA)(모두 Clontech사)를 사용하여 cDNA를 합성했다. 또한 프라이머(5'-PCR primer IIA; Clontech사)와 폴리머라아제(PrimeSTAR HSDNA 폴리머라아제; 다카라바이오)를 사용한 폴리머라아제 연쇄 반응(polymerase chain reaction (PCR))(98℃에서 10초, 68℃에서 6분을 17사이클)에 의해 완전장 cDNA를 선택적으로 증폭시킨 후, cDNA의 양단에 BstXI 어댑터(인비트로젠사)를 결합시켰다. 얻어진 cDNA를 레트로 바이러스 플러스미드에 결합시키고, 대장균 DH10B(인비트로젠사)에 도입함으로써 레트로 바이러스 플러스미드 라이브러리를 구축했다. 그 결과, 총 150만 콜로니 형성 유닛을 초과한 클론수로 이루어진 플러스미드 라이브러리를 구축하는 것에 성공했다.
(2) 포커스 형성 분석
상술한 라이브러리의 플러스미드 2 ㎍를 패키징용 플러스미드 각 0.5 ㎍(pGP, pE-eco, 모두 다카라바이오)과 함께 트랜스펙션 시약을 사용하여 BOSC23 패키징 세포에 도입했다. 도입 2일후의 배양 상청을, 재조합 레트로 바이러스 라이브러리 용액으로서 회수하고, 폴리브렌(polybrene; Sigma사)을 4 ㎍/ml의 농도로 첨가한 후, 마우스 3T3 세포에 MOI(multiplicity of infection) 0.1의 농도로 첨가했다. 2일후에 3T3 세포의 배양 상청을 DMEM-F12 배지(인비트로젠사)에 5% 소혈청(인비트로젠사) 및 2 mM L-글루타민을 첨가한 것으로 교환하고, 2주간 더 계속 배양함으로써 10종류 이상의 형질 전환 포커스를 얻었다. 각각의 3T3 세포 클론을 단리한 후 별개로 계속 배양하고, 각 클론의 게놈 DNA를 추출했다. 그 게놈 DNA 10 ng를 주형으로 하여, 5'-PCR primer IIA 프라이머 및 DNA 폴리머라아제(PrimeStar HS DNA 폴리머라아제; 다카라바이오)를 사용하여 PCR(98℃에서 10초, 68℃에서 6분을 30사이클)을 행하고, 각 3T3 클론에 삽입된 바이러스의 cDNA를 증폭 회수하여, pT7Blue-2 벡터에 클로닝했다.
얻어진 cDNA의 하나는 3926 염기쌍의 길이를 가지며, 1059 잔기의 단백질(서열 번호 2)을 코드하는 단일한 긴 오픈 리딩 프레임(서열 번호 1의 제271-3447 염기)을 갖고 있다(서열 번호 1). 흥미롭게도 신규 전장 서열을 갖는 이 cDNA가 코드하는 단백질의 아미노 말단측의 절반 정도(서열 번호 2의 1-496 아미노산 잔기)는 에키노덤 마이크로튜블 어소시에이티드 프로틴라이크 4(echinoderm microtubule associated protein like-4; EML4, GenBank accession no. NM_019063)의 1-496 잔 기와 완전하게 일치하고 있고, 한편 카르복실 말단측의 절반 정도(서열 번호 2의 497-1059 잔기)는 아나플라스틱 림포머 키나아제(anaplastic lymphoma kinase; ALK, GenBank accession no. AB209477)의 아미노산 서열과 완전하게 일치했다. 이상에서, 이 cDNA는 EML4 cDNA와 ALK cDNA의 융합 cDNA라고 생각되었다. 취득한 cDNA(EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드 v1의 cDNA)에는, ALK의 티로신 키나아제 도메인이 포함되어 있다.
시험예 10 임상 검체에서의 EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드의 검출
33례의 임상 검체(비소세포 폐암 절제 표본) 및 건강한 자 1례의 말초혈 단핵구로부터 cDNA를 합성했다.
EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드 v1의 cDNA를 검출할 목적으로, 상기 임상 검체 및 건강한 자로부터 제작한 cDNA를 기질로 하여, 서열 번호 4 및 서열 번호 5로 나타내는 염기 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서, 정량적 PCR 키트(QuantiTect SYBR Green; Qiagen사)를 사용한 PCR(94℃에서 15초, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분을 50사이클)을 행했다. 동일한 검체를 사용하여, 컨트롤로서 글리세르알데히드-3-인산디히드로게나아제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; 이하 GAPDH) 유전자 cDNA의 PCR 증폭을 시도했다. GAPDH cDNA의 검출을 위해서는, 서열 번호 6 및 서열 번호 7로 나타내는 염기 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용했다. 사이즈 마커 DNA(Marker; 50bp ladder, 인비트로젠사)와 함께, 증폭시킨 각 샘플을 전기 영동했다. 그 결과, 도 1 상단에 나타낸 바와 같이, 3례의 증례에서 EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드 v1의 cDNA가 검출되었다. 해석한 전례에서 GAPDH cDNA의 증폭이 명료하게 확인되었다(도 1 하단). 또, 이들 3례의 PCR 산물의 염기 서열을 해석한 결과, 모두 동일한 서열(EML4 유전자와 ALK 유전자의 융합점을 포함하는 247bp. 서열 번호 8)인 것이 확인되었다. 즉, 비소세포 폐암 증례 33례의 해석 결과, 9.1%의 증례(3/33례)에서, EML4유전자와 ALK 유전자의 융합이 발생한 것이 확인되었다.
폐암의 원인의 하나로서, EGFR 유전자의 변이가 알려져 있다. 상기 해석한 33례의 검체에서, 공지의 방법에 따라 EGFR 유전자 염기 서열 이상의 유무를 해석한 결과, 6례에서 엑슨 19의 부분 결실이 확인되었다. EGFR 유전자 변이를 갖는 증례와 EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드 양성 증례는 상이한 서브 그룹이었다. 즉, EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드 양성의 폐암 환자에게는, EGFR 유전자 변이를 갖는 폐암 환자에게 치료 효과를 나타내는 기존의 치료제는, 유효하지 않다고 예상된다.
또, 전장 ALK 유전자가 존재하는지의 여부를 상기 해석한 33례의 검체에서 조사한 결과, 8례에서 존재하고 있는 것을 알 수 있었다. 이 8례 중 7례는 EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드가 존재하지 않는 검체였다. 즉, EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드가 양성이었던 3례 중 2예에서는, 전장 ALK 유전자는 존재하지 않았다.
시험예 11 EML4-ALK 융합 단백질 v1의 종양 형성능의 검토
EML4-ALKv1/pMXS(pT7Blue-2 벡터에 EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드 v1이 정방향으로 클로닝된 클론에 관해, 제한 효소 EcoRI 및 SalI로 소화함으로써 인서트를 꺼내어, pMXS(J. Biol. Chem., 275권, 24945-24952페이지, 2000년)의 EcoRI- SalI 사이트에 서브 클로닝한 것)를 기질로 하여 변이 도입 키트(QuickChange Site-Directed Mutagenesis 키트; Stratagene사)를 사용하여 EML4-ALK 융합 단백질 v1의 589번째 아미노산(ATP 결합 부위)인 리신 잔기를 메티오닌으로 치환한 EML4-ALK(K589M)/pMXS를 제작했다. 반응에는 서열 번호 9 및 서열 번호 10으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 사용했다. ALK cDNA(Morris, SW at al, Science. 1994 Mar 4; 263(5151): 1281-4)는 정법에 따라서 레트로 바이러스 벡터 pMXS에 클로닝했다(각각을 ALK/pMXS, ALK/pMX-iresCD8로 명명했다).
상기 EML4-ALKv1/pMXS, 전장 ALK/pMXS, EML4-ALK(K589M)/pMXS 발현 플러스미드 및 cDNA를 삽입하지 않은 공(空)벡터(pMXS)를 인산칼슘법으로 3T3 섬유아세포에 도입하여 21일간 배양한 결과, 도 2 상단에 나타낸 바와 같이 EML4-ALK 융합 단백질 v1 발현 바이러스를 도입한 경우에 한하여 다수의 형질 전환 포커스가 관찰되었다. 스케일바는 100 ㎛을 나타낸다. 또, 동일한 도입 3T3 세포를 누드 마우스의 피하에 5×105개씩 접종하여 20일 관찰한 결과, 역시 EML4-ALK 융합 단백질 v1 발현 세포에서만 종양이 형성되었다. 또, 종양 형성수(Tumor formation)(3T3 세포 접종 개소수와, 그 중 몇 곳에 종양이 형성되었는지)는 이하와 같다. 전장 ALK 발현 세포의 종양 형성수는 8개 중 0개이고, EML4-ALK 융합 단백질 v1 발현 세포는 8개 중 8개였다. 또, EML4-ALK(K589M) 발현 세포의 종양 형성수는 8개 중 0개였다. 이러한 결과로부터, 전장 ALK 단백질을 발현시켜도 종양 형성능은 없고, EML4-ALK 융합 단백질 v1이 종양 형성능이 있기 때문에 EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드 v1은 암의 원인 유전자인 것이 나타났다. 또, EML4-ALK의 종양 형성능은 EML4-ALK(K589M)에서는 관찰되지 않았기 때문에 종양 형성능은 키나아제 활성에 의존하고 있다고 생각되었다. 이하, EML4-ALK 융합 단백질 v1 발현 플러스미드를 도입하여, EML4-ALK 융합 단백질 v1을 발현시킨 3T3 세포를 v1 발현 3T3 세포라 칭한다.
시험예 12 EML4-ALK 융합 단백질의 키나아제 활성의 저해제의 스크리닝 방법
(1) EML4-ALK 융합 단백질 v1의 취득
N 말단에 FLAG 태그가 부가된 EML4-ALK 융합 단백질 v1을, 삽입 cDNA와 세포 표면 항원 CD8을 동시에 발현 가능한 벡터 pMX-iresCD8(J. Biol. Chem. 2001년, 276권, p.39012-39020)에 삽입하여, FLAG-EML4-ALKv1과 CD8을 모두 발현하는 벡터 FLAG-EML4-ALKv1/pMX-iresCD8을 제작했다. FLAG-EML4-ALKv1/pMX-iresCD8을 사용하여 상술한 바와 같은 방법으로 재조합 레트로 바이러스를 제작하고, 마우스 림프계 세포주 BA/F3 세포에 감염시켰다. 세포 분리용 자기 비드 시약 및 정제 컬럼(CD8에 대한 자기 비드 결합 모노클로날 항체와 MiniMACS 순화 컬럼; 모두 Miltenyi Biotec사)을 사용하여, 세포 표면 CD8 발현 세포를 간편하게 순화했다. 이 N 말단에 FLAG 태그가 부가된 EML4-ALK 융합 단백질 v1을 발현하는 BA/F3 세포를 10% 송아지 태아 혈청을 포함하는 RPMI1640 배지에 배양하여, 2.7×109개의 세포를 얻었다. PBS로 3회 세정후, 세포를 용해액(50 mM TrisキHCl(pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% Triton X100, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1 mM NaVO4, 1 mM DTT, 프로테아제 억제제 칵테일 complete)으로 용해했다. 원심후 얻어진 상청 중에 존재하는 EML4-ALK 융합 단백질 v1을, 항플래그 M2 항체 어피니티 겔(ANTI-FLAG M2 Affinity Gel; SIGMA-ALDRICH사)을 사용하여 제품 정보에 기재된 방법에 따라 정제했다.
(2) EML4-ALK 융합 단백질 v1의 in vitro 키나아제 활성의 검출
상기에서 정제한 EML4-ALK 융합 단백질 v1의 펩티드 기질에 대한 인산화 활성을 키나아제 활성 검출 키트(HTRF KinEASE-TK; Cisbio사)를 사용하여 검토했다. 키트 동봉의 TK Substrate 1을 기질에 사용하고, ATP 미첨가 및 ATP 100 ㎛ 첨가후 각각 실온에서 1시간 반응시켜, 키트 추천에 따라 HTRF의 카운트를 검출한 결과, ATP 미첨가에 대하여 ATP 첨가에서는 HTRF의 카운트(즉 펩티드 기질의 인산화)가 약 12배 증가하는 것이 명확해졌다. 이상과 같이, 항인산화 ALK 항체나 키나아제 활성 검출 키트를 사용함으로써, EML4-ALK 융합 단백질 v1의 in vitro 키나아제 활성을 검출하는 것이 가능했다.
(3) EML4-ALK 융합 단백질 v1 in vitro 키나아제 활성에 대한 화합물의 저해 작용
ALK 저해 작용을 갖는 화합물로서 알려져 있는 화합물 A, 화합물 B, 화합물 C 및 화합물 D에 관해, EML4-ALK 융합 단백질 v1의 in vitro 키나아제 활성에 대한 저해 작용을 상기 키나아제 활성 검출 키트를 사용하여 검토했다. 각 화합물을 최종 농도 10 ㎛ 또는 10 nM이 되도록 EML4-ALK 융합 단백질 v1을 포함하는 반응액 중에 첨가하고, 이어서, ATP를 첨가 또는 첨가하지 않고 반응시켰다. 그 밖에는, 상술한 (2)의 방법에 따라 행했다. 화합물 비존재하에서의 ATP 미첨가 및 첨가시의 인산화의 카운트를 각각 100% 저해, 0% 저해로 하여, 화합물에 의한 EML4-ALK 융합 단백질 v1의 키나아제 활성의 저해%를 이하의 식에서 산출했다.
[화합물에 의한 키나아제 활성 저해(%)]=(1-[화합물 첨가 ATP 첨가시의 인산화의 카운트-화합물 미첨가 ATP 미첨가시의 인산화의 카운트]/[화합물 미첨가 ATP 첨가시의 인산화의 카운트-화합물 미첨가 ATP 미첨가시의 인산화의 카운트])×100
그 결과를 표 7에 나타낸다.
이하의 화합물 A∼D는, 상술한 특허문헌 1에 기재된 화합물 A∼D이다.
[표 7]
모든 화합물이, 정제 EML4-ALK 융합 단백질 v1의 펩티드 기질에 대한 인산화 활성을 저해했다.
이상에서, EML4-ALK 융합 단백질을 취득하여 in vitro 키나아제 활성을 지표로 함으로써, 본 발명의 단백질의 활성을 저해하는 물질의 스크리닝이 가능하다는 것이 나타났다.
시험예 13 EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드 v1을 발현한 세포에 대한 EML4-ALK 융합 단백질의 키나아제 활성의 저해제의 세포 증식 저해 작용
PBS에 현탁한 v1 발현 3T3 세포 3×106개를, 5주령의 수컷 Balb/c 누드 마우스(일본챨스리버사)의 등부위 피하에 주사하여 이식하였다. 이식 7일후에 EML4-ALK 융합 단백질의 키나아제 활성의 저해제인 화합물 C의 투여를 시작했다. 시험은 용 매군 및 화합물 C군 각 4마리로 행하고, 10% 1-메틸-2-피롤리돈(1-methyl-2-pyrrolidinone)(SIGMA-ALDRICH사)/90% 폴리에틸렌글리콜 300(polyethylene glycol 300)(Fluka사)의 조성의 용매에 화합물 C를 용해하여, 10 mg/kg를 경구 투여했다. 투여는 14일간 1일 1회 행하고, 체중 및 종양 직경을 격일로 측정했다. 종양 체적의 산출에는 이하의 식을 이용했다.
[종양 체적(㎣)]=[종양의 장직경(mm)]×[종양의 단직경(mm)]2×0.5
화합물 투여 개시일 및 투여 종료일의 용매군의 종양 체적을 각각 100% 저해, 0% 저해로 하여 화합물 C의 저해율을 산출했다. 그 결과, 화합물 C는 v1 발현 3T3 세포(종양)의 증식을 103% 저해했다.
이식 6일후에 화합물의 투여를 시작하고, 투여는 10일간 하루 1회 행한 것 외에는 상기 방법과 동일하게 하여, 화합물 D의 항종양 작용을 검토했다. 그 결과, 화합물 D는 v1 발현 3T3 세포(종양)의 증식을 101% 저해했다.
시험예 14 EML4-ALK 융합 단백질 v1 in vitro 키나아제 활성에 대한 화합물의 저해 작용
시험예 12(3)과 동일한 방법으로, EML4-ALK 융합 단백질 v1 in vitro 키나아제 활성에 대한 화합물의 저해 작용을, 상술한 키나아제 활성 검출 키트를 사용하여 검토했다. 피험 화합물을 최종 농도 1000 nM에서 0.3 nM의 8단계가 되도록 EML4-ALK 융합 단백질 v1을 포함하는 반응액 중에 첨가하고, 이어서 ATP를 첨가했다. 또, EML4-ALK 융합 단백질 v1을 포함하고, 피험 화합물을 첨가하지 않은 반응 액(피험 화합물 대신 용매인 DMSO만 0.4% 첨가)을 제작하여, ATP를 첨가 또는 첨가하지 않고 반응시켰다. 그 밖에는 시험예 12(2)의 방법에 따라 행했다. 피험 화합물 미첨가에서의, ATP 미첨가 및 첨가시의 인산화의 카운트를 각각 100% 저해, 0% 저해로 하여, 50% 저해할 때의 피험 화합물 농도(IC50)를 로지스틱 회귀법에 의해 산출했다.
그 결과, 식 (I)의 화합물은, EML4-ALK 융합 단백질 v1의 키나아제 활성을 저해했다. 특히, 식 (I)의 화합물의 몇 개는, 상기 시험에서, 1000 nM 또는 100 nM 이하의 IC50값을 나타냈다. 그 중에서도, 실시예 1의 화합물은 42 nM의 IC50값을 나타냈다.
상기 각 시험의 결과, 식 (I)의 화합물은 EML4-ALK 융합 단백질 v1의 키나아제 활성 저해 작용을 갖는 것이 확인되었다. 이 때문에, EML4-ALK 융합 유전자양성의 암, 다른 양태로는 EML4-ALK 융합 유전자 양성의 폐암 등의 치료제로서 사용할 수 있다.
식 (I)의 화합물 또는 그 제약학적으로 허용되는 염의 1종 또는 2종 이상을 유효 성분으로서 함유하는 의약 조성물은, 당 분야에서 통상 사용되고 있는 약제용 부형제, 약제용 담체 등을 사용하여, 통상 사용되고 있는 방법으로 조제할 수 있다.
투여는 정제, 환제, 캡슐제, 과립제, 산제, 액제 등에 의한 경구 투여 또는 관절내, 정맥내, 근육내 등의 주사제, 좌제, 점안제, 안연고, 경피용 액제, 연고 제, 경피용 첩부제, 경점막 액제, 경점막 첩부제, 흡입제 등에 의한 비경구 투여 중 어떤 형태이어도 된다.
경구 투여를 위한 고체 조성물로는, 정제, 산제, 과립제 등이 사용된다. 이러한 고체 조성물에서는, 1종 또는 2종 이상의 유효 성분을, 적어도 1종의 불활성인 부형제, 예를 들어 젖당, 만니톨, 포도당, 히드록시프로필셀룰로오스, 미결정 셀룰로오스, 전분, 폴리비닐피롤리돈 및/또는 메타규산알루민산마그네슘 등과 혼합된다. 조성물은, 통상의 방법에 따라, 불활성인 첨가제, 예를 들어 스테아르산마그네슘과 같은 활택제나 카르복시메틸스타치나트륨 등과 같은 붕괴제, 안정화제, 용해 보조제를 함유하고 있어도 된다. 정제 또는 환제는 필요에 따라 당의 또는 위용성 또는 장용성 물질의 필름으로 피막해도 된다.
경구 투여를 위한 액체 조성물은, 약제적으로 허용되는 유탁제, 용액제, 현탁제, 시럽제 또는 에릭실제 등을 포함하며, 일반적으로 사용되는 불활성인 희석제, 예를 들어 정제수 또는 에탄올을 포함한다. 그 액체 조성물은 불활성인 희석제 이외에 가용화제, 습윤제, 현탁제와 같은 보조제, 감미제, 풍미제, 방향제, 방부제를 함유하고 있어도 된다.
비경구 투여를 위한 주사제는, 무균의 수성 또는 비수성의 용액제, 현탁제 또는 유탁제를 함유한다. 수성의 용제로는, 예를 들어 주사용 증류수 또는 생리식염액이 포함된다. 비수성의 용제로는, 예를 들어 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 또는 올리브유와 같은 식물유, 에탄올과 같은 알콜류 또는 폴리솔베이트 80(일본 약국방명) 등이 있다. 이러한 조성물은, 등장화제, 방부제, 습윤제, 유화제, 분 산제, 안정화제 또는 용해 보조제를 더 포함해도 된다. 이들은 예를 들어 박테리아 보류 필터를 통과시키는 여과, 살균제의 배합 또는 조사에 의해 무균화된다. 또, 이들은 무균의 고체 조성물을 제조하여, 사용전에 무균물 또는 무균의 주사용 용매에 용해 또는 현탁하여 사용할 수도 있다.
외용제로는, 연고제, 경고제, 크림제, 젤리제, 퍼프제, 분무제, 로션제, 점안제, 안연고 등을 포함한다. 일반적으로 사용되는 연고 기제, 로션 기제, 수성 또는 비수성의 액제, 현탁제, 유제 등을 함유한다. 예를 들어, 연고 또는 로션 기제로는, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 백색 바셀린, 표백 밀랍, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유, 모노스테아르산글리세린, 스테아릴알콜, 세틸알콜, 라우로마크로골, 세스키올레인산소르비탄 등을 들 수 있다.
흡입제나 경비제 등의 경점막제는 고체, 액체 또는 반고체형인 것이 사용되고, 종래 공지의 방법에 따라 제조할 수 있다. 예를 들어 공지의 부형제나, pH 조정제, 방부제, 계면활성제, 활택제, 안정제나 증점제 등이 적절하게 더 첨가되어 있어도 된다. 투여는, 적당한 흡입 또는 주입을 위한 디바이스를 사용할 수 있다. 예를 들어, 계량 투여 흡입 디바이스 등의 공지의 디바이스나 분무기를 사용하여, 화합물을 단독으로 또는 처방된 혼합물의 분말로서, 또는 의약적으로 허용할 수 있는 담체와 조합하여 용액 또는 현탁액으로서 투여할 수 있다. 건조 분말 흡입기 등은, 1회 또는 복수회의 투여용인 것이어도 되고, 건조 분말 또는 분말 함유 캡슐을 이용할 수 있다. 또는, 적당한 구출(驅出)제, 예를 들어, 클로로플루오로알칸, 히드로플루오로알칸 또는 이산화탄소 등의 적합한 기체를 사용한 가압 에어졸 스프레 이 등의 형태이어도 된다.
통상 경구 투여의 경우, 1일 투여량은, 체중당 약 0.001∼100 mg/kg, 바람직하게는 0.1∼30 mg/kg, 더욱 바람직하게는 0.1∼10 mg/kg이 적당하고, 이것을 1회로 또는 2 내지 4회로 나누어 투여한다. 정맥내 투여하는 경우는, 1일 투여량은, 체중당 약 0.0001∼10 mg/kg이 적당하고, 1일 1회 내지 복수회로 나누어 투여한다. 또, 경점막제로는, 체중당 약 0.001∼100 mg/kg을 1일 1회 내지 복수회로 나누어 투여한다. 투여량은 증상, 연령, 성별 등을 고려하여 각각의 경우에 따라 적절하게 결정된다.
식 (I)의 화합물은, 상술한 식 (I)의 화합물이 유효성을 나타낸다고 생각되는 질환의 여러가지 치료제 또는 예방제와 병용할 수 있다. 일반적으로, 종양, 특히 악성 종양의 화학 요법에서 항종양제를 단독으로 투여하는 경우, 부작용 등의 점에서 그 효과에는 한계가 있어, 충분한 항종양 효과를 얻을 수 없는 경우가 많다. 그 때문에, 임상의 장에서는, 작용 메커니즘이 상이한 2제 또는 3제 이상을 조합한 다제 병용 요법이 행해지고 있다. 이 병용 요법은, 작용 메커니즘이 상이한 항종양제를 조합함으로써, 1) 비감수성 세포 집단을 감소시킨다, 2) 약제 내성 출현을 예방 또는 지연시킨다, 3) 독성이 상이한 약제의 조합에 의해 독성을 분산시키는, 등의 부작용의 경감이나 항종양 작용의 증강을 목적으로 한다. 그 병용은, 동시 투여, 또는 별개로 연속적으로, 또는 원하는 시간 간격을 두고 투여해도 된다. 동시 투여 제제는, 배합제이어도 되고, 별개로 제제화되어 있어도 된다.
병용할 수 있는 약제로는, 알킬화제, 대사 결항제 등의 화학 요법제, 면역 요법제, 호르몬 요법제, 세포 증식 인자 저해제를 들 수 있고, 구체적으로는, 시스플라틴, 카르보플라틴, 파크리탁셀, 도세탁셀, 겜시타빈, 이리노테칸, 비노렐빈, 베바시즈마브 등의 약제를 들 수 있다.
실시예
이하, 실시예에 기초하여, 식 (I)의 화합물의 제조법을 더욱 상세히 설명한다. 본 발명은, 하기 실시예에 기재된 화합물에 한정되는 것이 아니다. 또, 원료 화합물의 제법을 제조예에 각각 나타낸다. 또, 식 (I)의 화합물의 제조법은, 이하에 표시되는 구체적 실시예의 제조법에만 한정되는 것이 아니라, 식 (I)의 화합물은 이들 제조법의 조합 또는 당업자에게 자명한 방법에 의해서도 제조될 수 있다.
또, 실시예, 제조예 및 후기 표 중에서, 이하의 약호를 사용하는 경우가 있다.
Rex : 제조예 번호, Ex : 실시예 번호, No : 화합물 번호, Structure : 화학 구조식, Data : 물리 화학적 데이터(FAB+ : FAB-MS[M+H]+, FAB- : FAB-MS[M-H]-, ESI+ : ESI-MS[M+H]+, CI+ : CI[M+H]+, EI : EI[M]+, NMR-DMSOd6 : 디메틸술폭시드-d6 중의 1H-NMR에서의 피크의 δ(ppm), NMR-CDCl3 : 중클로로포름 중의 1H-NMR에서의 피크의 δ(ppm), MP : 융점(℃), Amrph : 그 화합물이 비정질이었던 것을 나타낸다, Cryst : 그 화합물이 결정이었던 것을 나타낸다), Salt : 염(공란 : 그 화합물이 프리체인 것을 나타낸다), CL1 : 1염산염, CL2 : 2염산염, CL3 : 3염산염, FM : 2푸마르산염, Me : 메틸, Et : 에틸, iPr : 이소프로필, tBu : tert-부틸, nBu : n-부틸. Rsyn 및 Syn : 제조방법(숫자는, 그 화합물이 그 번호를 제조예 번호 또는 실시예 번호로서 갖는 화합물과 동일한 방법에 의해, 대응하는 원료를 사용하여 제조된 것을 나타낸다).
제조예 1
프로판-2-티올(1.5 mL), 탄산칼륨(3 g) 및 N,N-디메틸포름아미드(20 mL)의 혼합액에 4-클로로-2-플루오로니트로벤젠(2.5 g)을 첨가하여, 실온에서 5시간 교반했다. 반응액에 물을 첨가하여 아세트산에틸로 추출하고, 추출액을 물 및 포화 식염수로 세정했다. 무수 황산나트륨으로 건조후, 용매를 감압 증류 제거하여, 4-클로로-2-이소프로필술파닐-1-니트로벤젠(3.30 g)을 황색 유상물로서 얻었다.
제조예 2
이소프로필술핀산나트륨(3.3 g)과 N-메틸-2-피롤리디논(20 mL)의 혼합액에 2,3-디클로로니트로벤젠(4 g)을 첨가하여, 70℃에서 하룻밤 교반했다. 반응액에 물을 첨가하여 석출한 고체를 여과하고, 디에틸에테르로 세정하여, 3-클로로-2-이소프로필술포닐-1-니트로벤젠(3.0 g)을 백색 고체로서 얻었다.
제조예 3
m-클로로과벤조산(7.89 g)과 클로로포름(100 mL)의 혼합액에 제조예 1의 화합물(3.3 g)과 클로로포름(50 mL)의 혼합액을 첨가하여, 50℃에서 7시간 교반했다. 반응액을 방냉후, 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하여 클로로포름으로 추출했 다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조후, 용매를 감압 증류 제거하고, 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; n-헥산:아세트산에틸=3:1-2:1)로 정제하여, 4-클로로-2-이소프로필술포닐-1-니트로벤젠(3.33 g)을 황색 고체로서 얻었다.
제조예 4
2-니트로벤젠술포닐클로라이드(5.09 g), N-메틸에틸아민(1.35 g) 및 클로로포름(100 mL)의 혼합액에 빙냉하 트리에틸아민(4.11 mL)을 첨가하여, 실온에서 5시간 교반했다. 반응액에 물을 첨가하여 클로로포름으로 추출하고, 유기층을 1M염산, 포화 탄산수소나트륨 수용액 및 포화 식염수로 세정하여, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용매를 감압 증류 제거하여, N-에틸-N-메틸-2-니트로벤젠술폰아미드(6.48 g)를 갈색 유상물로서 얻었다.
제조예 5
N-시클로프로필-2-니트로벤젠술폰아미드(5.63 g), 탄산칼륨(4.82 g) 및 N,N-디메틸포름아미드(60 mL)의 혼합액에 요오드화메틸(2.17 mL)을 첨가하여, 실온에서 6시간 교반했다. 반응액을 감압 증류 제거하고, 잔사에 물을 첨가하여, 아세트산에틸로 추출했다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후, 용매를 감압 증류 제거했다. 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; n-헥산:디에틸에테르=1:0-1:1)로 정제하여, N-시클로프로필-N-메틸-2-니트로벤젠술폰아미드(5.35 g)를 차색 고체로서 얻었다.
제조예 6
제조예 3의 화합물(3.3 g)과 아세트산(30 mL)의 혼합액에 철분(2.23 g)을 첨 가하여 80℃에서 3시간 교반한 후, 반응액의 불용물을 제거하고 용매를 감압 증류 제거했다. 잔사에 아세트산에틸(100 mL)을 첨가하여 불용물을 제거한 후, 물 및 포화 식염수로 세정했다. 무수 황산나트륨으로 건조후, 용매를 감압 증류 제거했다. 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; n-헥산:아세트산에틸=3:1-2:1)로 정제하여, 4-클로로-2-이소프로필술포닐아닐린(2.79 g)을 엷은 주황색 고체로서 얻었다.
제조예 7
2,4-디클로로-6-메톡시-1,3,5-트리아진(370 mg)과 테트라히드로푸란(10 mL)의 혼합액에, 2-(이소프로필술포닐)아닐린(400 mg), N-에틸-N-이소프로필프로판-2-아민(0.72 mL) 및 테트라히드로푸란(5 mL)의 혼합액을 첨가하여 실온에서 하룻밤 교반하고, 70℃에서 7시간 더 교반했다. 반응액을 빙냉하여 물(60 mL)을 첨가하고, 석출한 고체를 여과하여, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 클로로포름)으로 정제후 헥산으로 세정하여, 4-클로로-N-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-6-메톡시-1,3,5-트리아진-2-아민(200 mg)을 백색 고체로서 얻었다.
제조예 8
2-(이소프로필술포닐)아닐린(450 mg)과 N,N-디메틸포름아미드(10 mL)의 혼합액에 빙냉하에 55% 유성 수소화나트륨(200 mg)을 첨가하여 30분간 교반한 후에, 2,4-디클로로퀴나졸린(500 mg)을 첨가하여 빙냉하에 30분간 교반하고, 실온에서 하룻밤 더 교반했다. 반응액을 빙냉하여 물을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하여, 유기층을 물 및 포화 식염수로 세정했다. 무수 황산나트륨으로 건조후, 용매를 감 압 증류 제거하고, 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; n-헥산:아세트산에틸=5:1-3:1)로 정제하여, 2-클로로-N-[2-(이소프로필술포닐)페닐]퀴나졸린-4-아민(0.67 g)을 담황색 고체로서 얻었다.
제조예 9
2-플루오로아닐린(232 mg), 2,4-디클로로퀴나졸린(400 mg) 및 N,N-디메틸포름아미드(4 mL)의 혼합액에 탄산칼륨(430 mg)을 첨가하여, 실온에서 8시간 교반했다. 반응액에 물(40 mL)을 첨가하여 석출한 고체를 여과하고, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; n-헥산:아세트산에틸=5:1-3:1)로 정제하여, 2-클로로-N-(2-플루오로페닐)퀴나졸린-4-아민(0.22 g)을 담황색 고체로서 얻었다.
제조예 10
제조예 24의 화합물(309 mg)과 아세토니트릴(5 mL)의 혼합액에, 아제티딘염산염(112 mg), N-에틸-N-이소프로필프로판-2-아민(0.42 mL)을 첨가하여, 실온에서 1시간 교반했다. 반응액에 물을 첨가하고, 석출한 고체를 여과한 후 건조시켜, 4-아제티딘-1-일-6-클로로-N-(2-플루오로페닐)-1,3,5-트리아진-2-아민(253 mg)을 백색 고체로서 얻었다.
제조예 11
tert-부틸 4-히드록시피페리딘-1-카르복실레이트(1.49 g)와 테트라히드로푸란(30 mL)의 혼합액에 빙냉하, 칼륨 tert-부톡시드(830 mg)를 첨가하여 30분 교반한 후, 4-플루오로-2-메톡시-1-니트로벤젠(1.00 g)과 테트라히드로푸란(20 mL)의 혼합액을 첨가하여, 실온에서 3시간 교반했다. 반응액에 물, 아세트산에틸을 첨가 하여 추출하고, 포화 식염수로 세정후 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용매를 감압 증류 제거하고, 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; n-헥산:디에틸에테르=4:1)로 정제하여, tert-부틸 4-(3-메톡시-4-니트로페녹시)피페리딘-1-카르복실레이트(898 mg)를 얻었다.
제조예 12
4-플루오로-2-메톡시-1-니트로벤젠(5 g), 탄산칼륨(10 g) 및 N,N-디메틸포름아미드(50 mL)의 혼합액에 1,4-디옥사-8-아자스피로[4.5]데칸(5 g)을 첨가하여 70℃에서 하룻밤 교반했다. 반응액에 물(150 mL)을 첨가하고, 석출한 고체를 여과하고, 디에틸에테르로 세정하여, 8-(3-메톡시-4-니트로페닐)-1,4-디옥사-8-아자스피로[4.5]데칸(7.86 g)을 담황색 고체로서 얻었다.
제조예 13
tert-부틸 3-(4-메틸피페라진-1-일)피롤리딘-1-카르복실레이트(3.04 g)와 클로로포름(30 mL)의 혼합액에 트리플루오로아세트산(10 mL)을 첨가하여, 실온에서 1시간 교반했다. 용매를 감압 증류 제거한 후, 4-플루오로-2-메톡시-1-니트로벤젠(1.93 g), 탄산칼륨(12.2 g) 및 N,N-디메틸포름아미드(60 mL)의 혼합액을 첨가하여, 80℃에서 밤새 교반했다. 용매를 감압 증류 제거한 후, 잔사에 물을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출했다. 유기층을 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용매를 감압 증류 제거하여, 1-[1-(3-메톡시-4-니트로페닐)피롤리딘-3-일]-4-메틸피페라진(2.16 g)을 얻었다.
제조예 14
제조예 57의 화합물(6.68 g), 1-메틸피페라진(4.17 mL) 및 디클로로메탄(100 mL)의 혼합액에 트리아세톡시수소화붕소나트륨(8.04 g)을 첨가하여, 실온에서 하룻밤 교반했다. 반응액에 물, 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 클로로포름으로 추출후 포화 식염수로 세정했다. 용매를 감압 증류 제거하고, 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 클로로포름:메탄올=1:0-20:1)로 정제하여, 1-[1-(3-에톡시-4-니트로페닐)피페리딘-4-일]-4-메틸피페라진(6.68 g)을 얻었다.
제조예 15
4-플루오로-2-메틸-1-니트로벤젠(3.08 g), 탄산칼륨(6.80 g) 및 N,N-디메틸포름아미드(30 mL)의 혼합액에 피페리딘-4,4-디올염산염(3.83 g)을 첨가하여, 70℃에서 2일간 교반했다. 반응액을 감압 증류 제거하고, 잔사에 물, 아세트산에틸을 첨가하여, 석출한 고체를 여과했다. 건조시킨 후, 디클로로메탄(56 mL), 1-메틸피페라진(3.00 mL) 및 트리아세톡시수소화붕소나트륨(5.75 g)을 첨가하여, 실온에서 하룻밤 교반했다. 반응액에 물, 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 클로로포름으로 추출후 포화 식염수로 세정했다. 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후, 용매를 감압 증류 제거하고, 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 클로로포름:메탄올=1:0-20:1)로 정제하여, 1-메틸-4-[1-(3-메틸-4-니트로페닐)피페리딘-4-일]피페라진(1.29 g)을 얻었다.
제조예 16
진한 황산(40 mL)과 아세트산(60 mL)의 혼합액에 N-[2-(4-클로로페닐)에틸]-2,2,2-트리플루오로아세트아미드(14.2 g)를 첨가한 후, 파라포름알데히드(2.79 g)를 첨가하여, 아르곤 분위기하 하룻밤 교반했다. 반응액을 빙수에 첨가하여, 아세트산에틸로 추출후, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 세정했다. 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후, 용매를 감압 증류 제거하여, 7-클로로-2-(트리플루오로아세틸)-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린(13.7 g)을 엷은 황색 고체로서 얻었다.
제조예 17
제조예 16의 화합물(13.7 g)을 진한 황산(60 mL)에 용해한 후, 0℃로 냉각시키고, 질산칼륨(3.3 g)과 진한 황산(60 mL)의 용액을 1시간동안 적하했다. 빙냉하 1시간 더 교반한 후, 반응액을 빙수에 첨가했다. 아세트산에틸로 추출후, 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용매를 감압 증류 제거하고, 잔사를 아세트산에틸-헥산으로 재결정하여, 7-클로로-6-니트로-2-(트리플루오로아세틸)-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린(4.46 g)을 무색 고체로서 얻었다.
제조예 18
tert-부틸 1-옥사-4,9-디아자스피로[5.5]운데칸-9-카르복실레이트(5.80 g)와 디옥산(100 mL)의 혼합액에 빙냉하, 1M 수산화나트륨 수용액(24.9 mL), 클로로포름산벤질(3.55 mL)을 순서대로 첨가하여, 실온에서 16시간 교반했다. 반응액을 감압 농축한 후, 아세트산에틸로 추출했다. 유기층을 감압 농축하고, 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; n-헥산:아세트산에틸=9:1-1:1)로 정제하여, 4-벤질 9-tert-부틸 1-옥사-4,9-디아자스피로[5.5]운데칸-4,9-디카르복실레이트(8.06 g)를 무색 시럽으로서 얻었다.
제조예 19
제조예 18의 화합물(8.06 g)과 에탄올 (200 mL)의 혼합액에 4M 염산디옥산 용액(30 mL)을 첨가하여, 실온에서 16시간 교반했다. 용매를 감압 증류 제거하고, 잔사를 디에틸에테르-에탄올로부터 재결정하여, 벤질 1-옥사-4,9-디아자스피로[5.5]운데칸-4-카르복실레이트 염산염(3.86 g)을 무색 고체로서 얻었다.
제조예 20
제조예 12(7.83 g)의 화합물과 에탄올(100 mL)의 혼합액에 10% 팔라듐 담지 탄소(수분 53%)(2.83 g)를 첨가하고, 상압 수소 분위기하, 실온에서 하룻밤 교반했다. 세라이트로 여과한 후, 여과액을 감압 증류 제거하여, 4-(1,4-디옥사-8-아자스피로[4.5]데카-8-일)-2-메톡시아닐린(6.83 g)을 엷은 보라색 고체로서 얻었다.
제조예 21
제조예 71의 화합물(1.32 g)과 아세트산(30 mL)의 혼합액에 철분(0.79 g)을 첨가하여 80℃에서 3시간 교반한 후, 반응액의 불용물을 제거하고 용매를 감압 증류 제거했다. 잔사에 아세트산에틸을 첨가하여 불용물을 제거한 후, 포화 식염수로 세정했다. 무수 황산나트륨으로 건조후, 용매를 감압 증류 제거하여, 2-클로로-4-[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]아닐린(290 mg)을 얻었다.
상기 제조예에서 제조한 화합물의 화학 구조를 표 8∼표 9에 나타낸다. 또, 상기 제조예의 방법과 동일하게 하여, 표 10∼표 16에 나타내는 제조예 화합물을, 각각 대응하는 원료를 사용하여 제조했다. 또, 이들 제조예 화합물의 기기 분석 데이터를 표 17∼표 19에 나타낸다.
실시예 1
2-메톡시-4-[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]아닐린(230 mg)과 에탄올(3 mL)의 혼합액에 메탄술폰산(0.11 mL)을 첨가하여 실온에서 15분간 교반한 후에, 제조예 8의 화합물(200 mg)을 첨가하여 100℃에서 3시간 교반했다. 반응액을 방냉후, 물(20 mL)을 첨가하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하여, pH 8로서 석출한 고체를 여과했다. 얻어진 고체를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 클로로포름:메탄올:포화 암모니아수=50:1:0.1-30:1:0.1)로 정제하여, N4-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-N2-{2-메톡시-4-[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]페닐}퀴나졸린-2,4-디아민(0.26 g)을 황색 비정질로서 얻었다.
실시예 2
2-메톡시-N4-메틸-N4-(1-메틸피페리딘-4-일)벤젠-1,4-디아민(150 mg)과 에탄올(3 mL)의 혼합액에 메탄술폰산(0.08 mL)을 첨가하여 실온에서 15분간 교반한 후에, 제조예 8의 화합물(240 mg)을 첨가하여, 100℃에서 3시간 교반했다. 반응액을 방냉후 물 및 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하여, pH 8로서 아세트산에틸로 추출하고, 추출액을 물 및 포화 식염수로 세정했다. 무수 황산나트륨으로 건조후, 용매를 감압 증류 제거하고, 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 클로로포름:메탄올:포화 암모니아수=100:1:0.1-50:1:0.1)로 정제하여 갈색 비정질을 얻었다. 얻어진 비정질을 에탄올(5 mL)과 아세트산에틸(5 mL)에 용해하고, 4M 염화수소의 아세트산에틸 용액(0.3 mL)을 첨가하여 10분간 교반했다. 아세트산에틸(20 mL) 을 첨가하여 석출한 고체를 여과하여, N4-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-N2-{2-메톡시-4-[메틸(1-메틸피페라진-4-일)아미노]페닐}퀴나졸린-2,4-디아민 3염산염(0.15 g)을 담황색 고체로서 얻었다.
실시예 3
제조예 27의 화합물(200 mg), 2-메톡시-4-(모르폴린-4-일)아닐린(158 mg) 및 아세토니트릴(10 mL)의 혼합액에, N-에틸-N-이소프로필프로판-2-아민(0.13 mL)을 첨가하여, 12시간 가열 환류했다. 반응액에 물을 첨가하고, 석출한 고체를 여과하여 건조시켰다. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 클로로포름:메탄올=20:1)로 정제하여, 2-({4-[(2-메톡시-4-모르폴린-4-일페닐)아미노]-1,3,5-트리아진-2-일}아미노)-N-메틸벤즈아미드(135 mg)를 백색 고체로서 얻었다.
실시예 4
제조예 22의 화합물(209 mg), 2-메톡시-4-(4-페닐피페라진-1-일)아닐린(189 mg), N-에틸-N-이소프로필프로판-2-아민(0.12 mL) 및 N-메틸-2-피롤리디논(3 mL)의 혼합물을 마이크로 웨이브 반응 장치를 사용하여 120℃에서 20분간 교반했다. 반응액에 물을 첨가하여 석출한 고체를 여과하고 건조시킨 후, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 클로로포름:메탄올=1:0-20:1)로 정제했다. 아세트산에틸에 용해하여, 4M 염화수소의 아세트산에틸 용액을 첨가한 후, 용매를 감압 증류 제거했다. 잔사를 에탄올로부터 결정화하여, N-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-N'-[2-메톡시-4-(4-페닐피페라진-1-일)페닐]-1,3,5-트리아진-2,4-디아민 3염산염(273 mg)을 얻었 다.
실시예 5
제조예 34의 화합물(850 mg)과 아세토니트릴(17 mL)의 혼합액에, 실온에서 제조예 37의 화합물(806 mg), N-에틸-N-이소프로필프로판-2-아민(0.44 mL)을 첨가하여 1시간 교반했다. 반응액에 물을 첨가하고, 클로로포름으로 추출한 후, 포화 식염수로 세정했다. 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후, 용매를 감압 증류 제거하고, 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; n-헥산:아세트산에틸=1:1)로 정제했다. 아세트산에틸에 용해하여, 4M 염화수소의 아세트산에틸 용액을 첨가한 후, 용매를 감압 증류 제거했다. 잔사를 에탄올과 아세트산에틸의 혼합 용매로부터 결정화하여, 6-클로로-N-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-N'-[2-메톡시-4-(피페리딘-4-일옥시)페닐]-1,3,5-트리아진-2,4-디아민 염산염(323 mg)을 얻었다.
실시예 6
제조예 78의 화합물(320 mg), 제조예 20의 화합물(260 mg), N-에틸-N-이소프로필프로판-2-아민(0.17 mL) 및 N-메틸-2-피롤리디논(1 mL)의 혼합액을 마이크로 웨이브 반응 장치를 사용하여 120℃에서 20분간 반응시켰다. 반응액을 방냉후, 물(20 mL)에 부어 석출한 고체를 여과한 후 건조시켜 엷은 보라색 고체를 얻었다. 얻어진 고체에 아세트산(2 mL) 및 물(1 mL)을 첨가하여 70℃에서 하룻밤 교반했다. 반응액을 감압 농축하고, 잔사에 아세트산에틸(50 mL) 및 포화 탄산수소나트륨 수용액(25 mL)을 첨가하고 분액하여, 유기층을 물 및 포화 식염수로 세정했다. 무수 황산나트륨으로 건조후, 용매를 감압 증류 제거하고, 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마 토그래피(용출액; n-헥산:아세트산에틸=1:1-1:3)로 정제하여, N-이소프로필-2-[(4-{[2-메톡시-4-(4-옥소피페리딘-1-일)페닐]아미노}-1,3,5-트리아진-2-일)아미노]벤젠술폰아미드(0.32 g)를 비정질로서 얻었다.
실시예 7
실시예 163의 화합물(174 mg), 아세트산(2 mL) 및 물(1 mL)의 혼합액을 70℃에서 하룻밤 교반했다. 반응액에 아세트산에틸과 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 유기층을 포화 식염수로 세정했다. 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후, 용매를 감압 증류 제거하여, 얻어진 잔사를 디클로로메탄(5 mL)에 용해하고, 1-메틸피페라진(0.063 mL) 및 트리아세톡시수소화붕소나트륨(122 mg)을 첨가하여, 실온에서 2일간 교반했다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하여, 클로로포름으로 추출후, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용매를 감압 증류 제거하고, 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 클로로포름:메탄올=1:0-20:1)로 정제하여, 2-{[4-({2-메톡시-4-[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]페닐}아미노)-1,3,5-트리아진-2-일]아미노}-N-메틸벤젠술폰아미드(42 mg)를 무색 고체로서 얻었다.
실시예 8
실시예 31의 화합물(76 mg)과 아세토니트릴(5 mL)의 혼합액에 피롤리딘(0.041 mL)을 첨가하여 1시간 가열 환류했다. 반응액에 물을 첨가하고, 석출한 고체를 여과했다. 건조시킨 후, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 클로로포름:메탄올=20:1)로 정제하여, 2-({4-[(2-메톡시-4-모르폴린-4-일페닐)아미노]-6-피 롤리딘-1-일-1,3,5-트리아진-2-일}아미노)-N-메틸벤즈아미드(46 mg)를 백색 분말로서 얻었다.
실시예 9
실시예 68의 화합물(3.15 g)과 아세트산에틸(30 mL)의 혼합액에 4M 염화수소의 아세트산에틸 용액(30 mL)을 첨가하여, 실온에서 1시간 교반했다. 용매를 감압 증류 제거하고, 잔사에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가한 후, 아세트산에틸로 추출했다. 유기층을 포화 식염수로 세정후, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용매를 감압 증류 제거하고, 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 클로로포름:메탄올:포화 암모니아수=100:10:1)로 정제하여, N-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-N'-[2-메톡시-4-(피페리딘-4-일옥시)페닐]-1,3,5-트리아진-2,4-디아민(2.1 g)을 무색 비정질로서 얻었다.
실시예 10
실시예 62의 화합물(140 mg), 모르폴린(0.08 mL) 및 1,2-디클로로에탄(2 mL)의 혼합액에 트리아세톡시수소화붕소나트륨(80 mg)을 첨가하여 실온에서 5시간 교반했다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하여 클로로포름으로 추출하고, 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압 증류 제거하고, 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 클로로포름:메탄올=100:0-100:1)로 정제후 디에틸에테르로 세정하여, N4-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-N2-[2-메톡시-4-(4-모르폴린-4-일피페리딘-1-일)페닐]퀴나졸린-2,4-디아민(0.1 g)을 황색 분말로서 얻었 다.
실시예 11
실시예 66의 화합물(150 mg), 트리에틸아민(0.05 mL) 및 테트라히드로푸란(2 mL)의 혼합액에 무수 아세트산(0.03 mL)을 첨가하여, 실온에서 6시간 교반했다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하여, 아세트산에틸로 추출하고, 유기층을 물 및 포화 식염수로 세정했다. 무수 황산나트륨으로 건조후, 용매를 감압 증류 제거하고, 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 클로로포름:메탄올=100:1-50:1)로 정제후 헥산으로 세정하여, N2-[4-(4-아세틸피페라진-1-일)-2-메톡시페닐]-N4-[2-(이소프로필술포닐)페닐]퀴나졸린-2,4-디아민(0.11 g)을 황색 분말로서 얻었다.
실시예 12
실시예 147의 화합물(240 mg), 포르말린(0.18 mL) 및 1,2-디클로로에탄(5 mL)의 혼합액에 트리아세톡시수소화붕소나트륨(280 mg)을 첨가하여 실온에서 3일간 교반했다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하여, 클로로포름으로 추출하고, 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압 증류 제거한 후, 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 클로로포름:메탄올:포화 암모니아수=50:1:0.1-30:10:1)로 정제후 디에틸에테르로 세정하여, N-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-N'-[2-메톡시-4-(1-메틸-디아자스피로[5.5]운데카-9-일)페닐]-1,3,5-트리아진-2,4-디아민(135 mg)을 담황색 분말로서 얻었다.
실시예 13
실시예 22의 화합물(169 mg)과 6M 염산(4 mL)의 혼합액을 50℃에서 2시간 교반했다. 반응액을 냉각후, 물 및 1M 수산화나트륨 수용액을 첨가하여 염기성으로 하고, 클로로포름으로 추출했다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용매를 감압 증류 제거하고, 에탄올-디에틸에테르로부터 재결정하여, 6-{[2-(이소프로필술포닐)페닐]아미노}-4-({2-메톡시-4-[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]페닐}아미노)-1,3,5-트리아진-2(1H)-온(27 mg)을 얻었다.
실시예 14
실시예 23의 화합물(250 mg)과 피리딘염산염(1 g)의 혼합물을 200℃에서 10분 교반했다. 실온에 방냉하고, 물을 첨가한 후, 클로로포름으로 세정했다. 수층을 감압 증류 제거하고, 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 클로로포름:메탄올=1:0-10:1)로 정제하여, 2-[(4-{[2-(이소프로필술포닐)페닐]아미노}-1,3,5-트리아진-2-일)아미노]-5-[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]페놀(45 mg)을 얻었다.
실시예 15
실시예 102의 화합물(630 mg), 에탄올(10 mL) 및 테트라히드로푸란(10 mL)의 혼합액에 10% 팔라듐 담지 탄소(수분 53%)(500 mg)를 첨가하여, 상압 수소 분위기하, 실온에서 2시간 교반했다. 세라이트로 여과한 후, 여과액을 감압 증류 제거하고, 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 클로로포름:메탄올=1:0-20:1)로 정제하여, N-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-N'-[2-메톡시-4-(1-옥사-4,9-디아자스피 로[5.5]운데카-9-일)페닐]-1,3,5-트리아진-2,4-디아민(102 mg)을 얻었다.
실시예 16
실시예 177의 화합물(1.09 g)과 아세트산에틸(10 mL)의 혼합액에 4M 염화수소의 아세트산에틸 용액(10 mL)을 첨가하여, 실온에서 30분간 교반했다. 반응액을 감압 증류 제거하여, 잔사를 아세트산에틸로 세정하고, 여과한 후 건조시켜, N-(7-플루오로-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-6-일)-N'-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-1,3,5-트리아진-2,4-디아민 2염산염(950 mg)을 무색 고체로서 얻었다.
실시예 17
실시예 178의 화합물(1.2 g)과 메탄올(15 mL)의 혼합액에, 2M 염산(15 mL)을 첨가하여 밤새 가열 환류를 행했다. 반응액을 감압 농축하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하여 클로로포름으로 추출후, 포화 식염수로 세정했다. 용매를 증류 제거하고, 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액; 클로로포름:메탄올=1:0-20:1)로 정제하여, N-(7-클로로-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-6-일)-N'-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-1,3,5-트리아진-2,4-디아민(260 mg)을 무색 비정질로서 얻었다.
실시예 18
실시예 62의 화합물(13.6 mg), 메틸아민염산염(2.0 mg), 트리에틸아민(3.0 mg), 1,2-디클로로에탄(0.5 mL)의 혼합액에 트리아세톡시수소화붕소나트륨(10.5 mg)을 첨가하여, 실온에서 하룻밤 교반했다. 반응액에 클로로포름, 물을 첨가하고, 분액 조작을 하여 유기층을 감압 증류 제거하고, 잔사를 HPLC(컬럼 : SunFire C18 5 ㎛ 19 mm×100 mm (waters사), 용매 : MeOH/0.1% HCOOH-H2O=10/90(0 min)-10/90(1 min)-95/5(9 min)-95/5(12 min), 유속 : 25 mL/min)로 분취 정제하여, N4-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-N2-{2-메톡시-4-[4-(메틸아미노)피페리딘-1-일]페닐}퀴나졸린-2,4-디아민(12.5 mg)을 얻었다.
실시예 76, 실시예 77, 실시예 78, 실시예 85, 실시예 110는, 동일하게 반응후 탈보호하여 분취 정제함으로써 얻었다.
실시예 19
실시예 72의 화합물(9.6 mg), 시클로헥사논(2.9 mg) 및 디클로로메탄(0.5 mL)의 혼합액에 트리아세톡시수소화붕소나트륨(10.5 mg)을 첨가하여 실온에서 하룻밤 교반했다. 반응액에 클로로포름, 물을 첨가하고, 분액 조작을 하여 유기층을 감압 증류 제거하고, 잔사를 HPLC(컬럼 : SunFire C18 5 ㎛ 19 mm×100 mm(waters 사), 용매 : MeOH/0.1% HCOOH-H2O=10/90(0 min)-10/90(1 min)-95/5(9 min)-95/5(12 min), 유속 : 25 mL/min)로 분취 정제하여, N-[4-(4-시클로헥실피페라진-1-일)-2-메톡시페닐]-N'-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-1,3,5-트리아진-2,4-디아민(5.1 mg)을 얻었다.
실시예 134, 실시예 141은, 동일하게 반응후 탈보호하여 분취 정제함으로써 얻었다.
실시예 20
실시예 72의 화합물(9.6 mg), 아세트산(1.8 mg), 1-히드록시벤조트리아졸(3.4 mg), N,N-디메틸포름아미드(0.5 mL)의 혼합액에 PS-카르보디이미드(PS-Carbodiimide)(아르고노트테크놀로지사) 100 mg를 첨가하여, 실온에서 하룻밤 교반했다. 반응액에 실온에서 MP-카보네이트(MP-Carbonate)(아르고노트테크놀로지사)(50 mg) 및 PS-이소시아네이트(PS-Isocyanate)(아르고노트테크놀로지사)(50 mg)를 첨가하여 2시간 교반하고, 불용물을 여과했다. 여과액을 감압하 농축하고, 잔사를 HPLC(컬럼 : SunFire C18 5 ㎛ 19 mm×100 mm(waters 사), 용매 : MeOH/0.1% HCOOH-H2O=10/90(0 min)-10/90(1 min)-95/5(9 min)-95/5(12 min), 유속 : 25 mL/min)로 분취 정제하여, N-[4-(4-아세틸피페라진-1-일)-2-메톡시페닐]-N'-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-1,3,5-트리아진-2,4-디아민(6.8 mg)을 얻었다.
실시예 160, 실시예 161, 실시예 162는, 동일하게 반응후 탈보호하여 분취 정제함으로써 얻었다.
상기 실시예에서 제조한 화합물의 화학 구조를 표 20∼표 22에 나타낸다. 또, 상기 실시예의 방법과 동일하게 하여, 표 23∼표 42에 나타내는 실시예 화합물을, 각각 대응하는 원료를 사용하여 제조했다. 또, 이들 실시예 화합물의 기기 분석 데이터를 표 43∼표 50에 나타낸다.
[표 8]
[표 9]
[표 10]
[표 11]
[표 12]
[표 13]
[표 14]
[표 15]
[표 16]
[표 17]
[표 18]
[표 19]
[표 20]
[표 21]
[표 22]
[표 23]
[표 24]
[표 25]
[표 26]
[표 27]
[표 28]
[표 29]
[표 30]
[표 31]
[표 32]
[표 33]
[표 34]
[표 35]
[표 36]
[표 37]
[표 38]
[표 39]
[표 40]
[표 41]
[표 42]
[표 43]
[표 44]
[표 45]
[표 46]
[표 47]
[표 48]
[표 49]
[표 50]
또, 본 발명의 다른 화합물의 구조를 표 51∼표 95에 나타낸다. 이들은, 상기 제조법이나 실시예에 기재된 방법, 및 당업자에게 자명한 방법, 또는 이들의 변법을 이용함으로써 합성되었거나, 합성할 수 있다.
표 중의 기호는 이하의 의미를 나타낸다.
-R1a', -R1b', -R1c', -R1d', -R2', -R3', -R4', -R5', -R6a', -R6b', -R6c', -R6d' 및 -RA : 일반식 중의 치환기.
[표 51]
[표 52]
[표 53]
[표 54]
[표 55]
[표 56]
[표 57]
[표 58]
[표 59]
[표 60]
[표 61]
[표 62]
[표 63]
[표 64]
[표 65]
[표 66]
[표 67]
[표 68]
[표 69]
[표 70]
[표 71]
[표 72]
[표 73]
[표 74]
[표 75]
[표 76]
[표 77]
[표 78]
[표 79]
[표 80]
[표 81]
[표 82]
[표 83]
[표 84]
[표 85]
[표 86]
[표 87]
[표 88]
[표 89]
[표 90]
[표 91]
[표 92]
[표 93]
[표 94]
[표 95]
식 (I)의 화합물 또는 그의 염은, EML4-ALK 융합 단백질 및 변이 EGFR 단백질의 키나아제 활성의 저해 활성, 그리고, 인간 비소세포 폐암 세포주 NCI-H2228 세포 및 HCC827 세포의 증식 억제 활성을 가지며, 암, 한 양태로는, 폐암, 다른 양태로는, 비소세포 폐암 또는 소세포 폐암, 또 다른 양태로는, EML4-ALK 융합 폴리 뉴클레오티드 양성 및/또는 변이 EGFR 폴리뉴클레오티드 양성의 암, 또 다른 양태로는, EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드 양성 및/또는 변이 EGFR 폴리뉴클레오티드 양성의 폐암, 또 다른 양태로는, EML4-ALK 융합 폴리뉴클레오티드 양성 및/또는 변이 EGFR 폴리뉴클레오티드 양성의 비소세포 폐암 등의 예방 및/또는 치료용 의약 조성물의 유효 성분으로서 사용할 수 있다.
서열표
프리
텍스트
이하의 서열표의 숫자 색인 <223>은, 「Artificial Sequence」의 설명을 기재한다. 구체적으로는, 서열표의 서열 번호 9 및 10의 서열로 나타내는 각 염기 서열은, 인공적으로 합성한 프라이머 서열이다.
SEQUENCE LISTING
<110> Astellas Pharma Inc.
<120> Di(arylamino)aryl compound
<130> A08013-WO
<160> 10
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 3900
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (271)..(3447)
<400> 1
ggcggcgcgg cgcggcgctc gcggctgctg cctgggaggg aggccgggca ggcggctgag 60
cggcgcggct ctcaacgtga cggggaagtg gttcgggcgg ccgcggctta ctaccccagg 120
gcgaacggac ggacgacgga ggcgggagcc ggtagccgag ccgggcgacc tagagaacga 180
gcgggtcagg ctcagcgtcg gccactctgt cggtccgctg aatgaagtgc ccgcccctct 240
gagcccggag cccggcgctt tccccgcaag atg gac ggt ttc gcc ggc agt ctc 294
Met Asp Gly Phe Ala Gly Ser Leu
1 5
gat gat agt att tct gct gca agt act tct gat gtt caa gat cgc ctg 342
Asp Asp Ser Ile Ser Ala Ala Ser Thr Ser Asp Val Gln Asp Arg Leu
10 15 20
tca gct ctt gag tca cga gtt cag caa caa gaa gat gaa atc act gtg 390
Ser Ala Leu Glu Ser Arg Val Gln Gln Gln Glu Asp Glu Ile Thr Val
25 30 35 40
cta aag gcg gct ttg gct gat gtt ttg agg cgt ctt gca atc tct gaa 438
Leu Lys Ala Ala Leu Ala Asp Val Leu Arg Arg Leu Ala Ile Ser Glu
45 50 55
gat cat gtg gcc tca gtg aaa aaa tca gtc tca agt aaa ggc caa cca 486
Asp His Val Ala Ser Val Lys Lys Ser Val Ser Ser Lys Gly Gln Pro
60 65 70
agc cct cga gca gtt att ccc atg tcc tgt ata acc aat gga agt ggt 534
Ser Pro Arg Ala Val Ile Pro Met Ser Cys Ile Thr Asn Gly Ser Gly
75 80 85
gca aac aga aaa cca agt cat acc agt gct gtc tca att gca gga aaa 582
Ala Asn Arg Lys Pro Ser His Thr Ser Ala Val Ser Ile Ala Gly Lys
90 95 100
gaa act ctt tca tct gct gct aaa agt ggt aca gaa aaa aag aaa gaa 630
Glu Thr Leu Ser Ser Ala Ala Lys Ser Gly Thr Glu Lys Lys Lys Glu
105 110 115 120
aaa cca caa gga cag aga gaa aaa aaa gag gaa tct cat tct aat gat 678
Lys Pro Gln Gly Gln Arg Glu Lys Lys Glu Glu Ser His Ser Asn Asp
125 130 135
caa agt cca caa att cga gca tca cct tct ccc cag ccc tct tca caa 726
Gln Ser Pro Gln Ile Arg Ala Ser Pro Ser Pro Gln Pro Ser Ser Gln
140 145 150
cct ctc caa ata cac aga caa act cca gaa agc aag aat gct act ccc 774
Pro Leu Gln Ile His Arg Gln Thr Pro Glu Ser Lys Asn Ala Thr Pro
155 160 165
acc aaa agc ata aaa cga cca tca cca gct gaa aag tca cat aat tct 822
Thr Lys Ser Ile Lys Arg Pro Ser Pro Ala Glu Lys Ser His Asn Ser
170 175 180
tgg gaa aat tca gat gat agc cgt aat aaa ttg tcg aaa ata cct tca 870
Trp Glu Asn Ser Asp Asp Ser Arg Asn Lys Leu Ser Lys Ile Pro Ser
185 190 195 200
aca ccc aaa tta ata cca aaa gtt acc aaa act gca gac aag cat aaa 918
Thr Pro Lys Leu Ile Pro Lys Val Thr Lys Thr Ala Asp Lys His Lys
205 210 215
gat gtc atc atc aac caa gaa gga gaa tat att aaa atg ttt atg cgc 966
Asp Val Ile Ile Asn Gln Glu Gly Glu Tyr Ile Lys Met Phe Met Arg
220 225 230
ggt cgg cca att acc atg ttc att cct tcc gat gtt gac aac tat gat 1014
Gly Arg Pro Ile Thr Met Phe Ile Pro Ser Asp Val Asp Asn Tyr Asp
235 240 245
gac atc aga acg gaa ctg cct cct gag aag ctc aaa ctg gag tgg gca 1062
Asp Ile Arg Thr Glu Leu Pro Pro Glu Lys Leu Lys Leu Glu Trp Ala
250 255 260
tat ggt tat cga gga aag gac tgt aga gct aat gtt tac ctt ctt ccg 1110
Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys Asp Cys Arg Ala Asn Val Tyr Leu Leu Pro
265 270 275 280
acc ggg gaa ata gtt tat ttc att gca tca gta gta gta cta ttt aat 1158
Thr Gly Glu Ile Val Tyr Phe Ile Ala Ser Val Val Val Leu Phe Asn
285 290 295
tat gag gag aga act cag cga cac tac ctg ggc cat aca gac tgt gtg 1206
Tyr Glu Glu Arg Thr Gln Arg His Tyr Leu Gly His Thr Asp Cys Val
300 305 310
aaa tgc ctt gct ata cat cct gac aaa att agg att gca act gga cag 1254
Lys Cys Leu Ala Ile His Pro Asp Lys Ile Arg Ile Ala Thr Gly Gln
315 320 325
ata gct ggc gtg gat aaa gat gga agg cct cta caa ccc cac gtc aga 1302
Ile Ala Gly Val Asp Lys Asp Gly Arg Pro Leu Gln Pro His Val Arg
330 335 340
gtg tgg gat tct gtt act cta tcc aca ctg cag att att gga ctt ggc 1350
Val Trp Asp Ser Val Thr Leu Ser Thr Leu Gln Ile Ile Gly Leu Gly
345 350 355 360
act ttt gag cgt gga gta gga tgc ctg gat ttt tca aaa gca gat tca 1398
Thr Phe Glu Arg Gly Val Gly Cys Leu Asp Phe Ser Lys Ala Asp Ser
365 370 375
ggt gtt cat tta tgt gtt att gat gac tcc aat gag cat atg ctt act 1446
Gly Val His Leu Cys Val Ile Asp Asp Ser Asn Glu His Met Leu Thr
380 385 390
gta tgg gac tgg cag aag aaa gca aaa gga gca gaa ata aag aca aca 1494
Val Trp Asp Trp Gln Lys Lys Ala Lys Gly Ala Glu Ile Lys Thr Thr
395 400 405
aat gaa gtt gtt ttg gct gtg gag ttt cac cca aca gat gca aat acc 1542
Asn Glu Val Val Leu Ala Val Glu Phe His Pro Thr Asp Ala Asn Thr
410 415 420
ata att aca tgc ggt aaa tct cat att ttc ttc tgg acc tgg agc ggc 1590
Ile Ile Thr Cys Gly Lys Ser His Ile Phe Phe Trp Thr Trp Ser Gly
425 430 435 440
aat tca cta aca aga aaa cag gga att ttt ggg aaa tat gaa aag cca 1638
Asn Ser Leu Thr Arg Lys Gln Gly Ile Phe Gly Lys Tyr Glu Lys Pro
445 450 455
aaa ttt gtg cag tgt tta gca ttc ttg ggg aat gga gat gtt ctt act 1686
Lys Phe Val Gln Cys Leu Ala Phe Leu Gly Asn Gly Asp Val Leu Thr
460 465 470
gga gac tca ggt gga gtc atg ctt ata tgg agc aaa act act gta gag 1734
Gly Asp Ser Gly Gly Val Met Leu Ile Trp Ser Lys Thr Thr Val Glu
475 480 485
ccc aca cct ggg aaa gga cct aaa gtg tac cgc cgg aag cac cag gag 1782
Pro Thr Pro Gly Lys Gly Pro Lys Val Tyr Arg Arg Lys His Gln Glu
490 495 500
ctg caa gcc atg cag atg gag ctg cag agc cct gag tac aag ctg agc 1830
Leu Gln Ala Met Gln Met Glu Leu Gln Ser Pro Glu Tyr Lys Leu Ser
505 510 515 520
aag ctc cgc acc tcg acc atc atg acc gac tac aac ccc aac tac tgc 1878
Lys Leu Arg Thr Ser Thr Ile Met Thr Asp Tyr Asn Pro Asn Tyr Cys
525 530 535
ttt gct ggc aag acc tcc tcc atc agt gac ctg aag gag gtg ccg cgg 1926
Phe Ala Gly Lys Thr Ser Ser Ile Ser Asp Leu Lys Glu Val Pro Arg
540 545 550
aaa aac atc acc ctc att cgg ggt ctg ggc cat gga gcc ttt ggg gag 1974
Lys Asn Ile Thr Leu Ile Arg Gly Leu Gly His Gly Ala Phe Gly Glu
555 560 565
gtg tat gaa ggc cag gtg tcc gga atg ccc aac gac cca agc ccc ctg 2022
Val Tyr Glu Gly Gln Val Ser Gly Met Pro Asn Asp Pro Ser Pro Leu
570 575 580
caa gtg gct gtg aag acg ctg cct gaa gtg tgc tct gaa cag gac gaa 2070
Gln Val Ala Val Lys Thr Leu Pro Glu Val Cys Ser Glu Gln Asp Glu
585 590 595 600
ctg gat ttc ctc atg gaa gcc ctg atc atc agc aaa ttc aac cac cag 2118
Leu Asp Phe Leu Met Glu Ala Leu Ile Ile Ser Lys Phe Asn His Gln
605 610 615
aac att gtt cgc tgc att ggg gtg agc ctg caa tcc ctg ccc cgg ttc 2166
Asn Ile Val Arg Cys Ile Gly Val Ser Leu Gln Ser Leu Pro Arg Phe
620 625 630
atc ctg ctg gag ctc atg gcg ggg gga gac ctc aag tcc ttc ctc cga 2214
Ile Leu Leu Glu Leu Met Ala Gly Gly Asp Leu Lys Ser Phe Leu Arg
635 640 645
gag acc cgc cct cgc ccg agc cag ccc tcc tcc ctg gcc atg ctg gac 2262
Glu Thr Arg Pro Arg Pro Ser Gln Pro Ser Ser Leu Ala Met Leu Asp
650 655 660
ctt ctg cac gtg gct cgg gac att gcc tgt ggc tgt cag tat ttg gag 2310
Leu Leu His Val Ala Arg Asp Ile Ala Cys Gly Cys Gln Tyr Leu Glu
665 670 675 680
gaa aac cac ttc atc cac cga gac att gct gcc aga aac tgc ctc ttg 2358
Glu Asn His Phe Ile His Arg Asp Ile Ala Ala Arg Asn Cys Leu Leu
685 690 695
acc tgt cca ggc cct gga aga gtg gcc aag att gga gac ttc ggg atg 2406
Thr Cys Pro Gly Pro Gly Arg Val Ala Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met
700 705 710
gcc cga gac atc tac agg gcg agc tac tat aga aag gga ggc tgt gcc 2454
Ala Arg Asp Ile Tyr Arg Ala Ser Tyr Tyr Arg Lys Gly Gly Cys Ala
715 720 725
atg ctg cca gtt aag tgg atg ccc cca gag gcc ttc atg gaa gga ata 2502
Met Leu Pro Val Lys Trp Met Pro Pro Glu Ala Phe Met Glu Gly Ile
730 735 740
ttc act tct aaa aca gac aca tgg tcc ttt gga gtg ctg cta tgg gaa 2550
Phe Thr Ser Lys Thr Asp Thr Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu
745 750 755 760
atc ttt tct ctt gga tat atg cca tac ccc agc aaa agc aac cag gaa 2598
Ile Phe Ser Leu Gly Tyr Met Pro Tyr Pro Ser Lys Ser Asn Gln Glu
765 770 775
gtt ctg gag ttt gtc acc agt gga ggc cgg atg gac cca ccc aag aac 2646
Val Leu Glu Phe Val Thr Ser Gly Gly Arg Met Asp Pro Pro Lys Asn
780 785 790
tgc cct ggg cct gta tac cgg ata atg act cag tgc tgg caa cat cag 2694
Cys Pro Gly Pro Val Tyr Arg Ile Met Thr Gln Cys Trp Gln His Gln
795 800 805
cct gaa gac agg ccc aac ttt gcc atc att ttg gag agg att gaa tac 2742
Pro Glu Asp Arg Pro Asn Phe Ala Ile Ile Leu Glu Arg Ile Glu Tyr
810 815 820
tgc acc cag gac ccg gat gta atc aac acc gct ttg ccg ata gaa tat 2790
Cys Thr Gln Asp Pro Asp Val Ile Asn Thr Ala Leu Pro Ile Glu Tyr
825 830 835 840
ggt cca ctt gtg gaa gag gaa gag aaa gtg cct gtg agg ccc aag gac 2838
Gly Pro Leu Val Glu Glu Glu Glu Lys Val Pro Val Arg Pro Lys Asp
845 850 855
cct gag ggg gtt cct cct ctc ctg gtc tct caa cag gca aaa cgg gag 2886
Pro Glu Gly Val Pro Pro Leu Leu Val Ser Gln Gln Ala Lys Arg Glu
860 865 870
gag gag cgc agc cca gct gcc cca cca cct ctg cct acc acc tcc tct 2934
Glu Glu Arg Ser Pro Ala Ala Pro Pro Pro Leu Pro Thr Thr Ser Ser
875 880 885
ggc aag gct gca aag aaa ccc aca gct gca gag gtc tct gtt cga gtc 2982
Gly Lys Ala Ala Lys Lys Pro Thr Ala Ala Glu Val Ser Val Arg Val
890 895 900
cct aga ggg ccg gcc gtg gaa ggg gga cac gtg aat atg gca ttc tct 3030
Pro Arg Gly Pro Ala Val Glu Gly Gly His Val Asn Met Ala Phe Ser
905 910 915 920
cag tcc aac cct cct tcg gag ttg cac agg gtc cac gga tcc aga aac 3078
Gln Ser Asn Pro Pro Ser Glu Leu His Arg Val His Gly Ser Arg Asn
925 930 935
aag ccc acc agc ttg tgg aac cca acg tac ggc tcc tgg ttt aca gag 3126
Lys Pro Thr Ser Leu Trp Asn Pro Thr Tyr Gly Ser Trp Phe Thr Glu
940 945 950
aaa ccc acc aaa aag aat aat cct ata gca aag aag gag cca cac gag 3174
Lys Pro Thr Lys Lys Asn Asn Pro Ile Ala Lys Lys Glu Pro His Glu
955 960 965
agg ggt aac ctg ggg ctg gag gga agc tgt act gtc cca cct aac gtt 3222
Arg Gly Asn Leu Gly Leu Glu Gly Ser Cys Thr Val Pro Pro Asn Val
970 975 980
gca act ggg aga ctt ccg ggg gcc tca ctg ctc cta gag ccc tct tcg 3270
Ala Thr Gly Arg Leu Pro Gly Ala Ser Leu Leu Leu Glu Pro Ser Ser
985 990 995 1000
ctg act gcc aat atg aag gag gta cct ctg ttc agg cta cgt cac 3315
Leu Thr Ala Asn Met Lys Glu Val Pro Leu Phe Arg Leu Arg His
1005 1010 1015
ttc cct tgt ggg aat gtc aat tac ggc tac cag caa cag ggc ttg 3360
Phe Pro Cys Gly Asn Val Asn Tyr Gly Tyr Gln Gln Gln Gly Leu
1020 1025 1030
ccc tta gaa gcc gct act gcc cct gga gct ggt cat tac gag gat 3405
Pro Leu Glu Ala Ala Thr Ala Pro Gly Ala Gly His Tyr Glu Asp
1035 1040 1045
acc att ctg aaa agc aag aat agc atg aac cag cct ggg ccc 3447
Thr Ile Leu Lys Ser Lys Asn Ser Met Asn Gln Pro Gly Pro
1050 1055
tgagctcggt cacacactca cttctcttcc ttgggatccc taagaccgtg gaggagagag 3507
aggcaatcaa tggctccttc acaaaccaga gaccaaatgt cacgttttgt tttgtgccaa 3567
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