KR101303299B1 - 항균 펩타이드의 피부 세포 재생 촉진제로서의 신규한 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 상처치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 피부 세포 재생 촉진을 수행하여 상처를 치료하는 항균 펩타이드의 신규한 용도, 상기 펩타이드를 포함하는 피부 세포 재생 촉진용 조성물 및 피부재생 화장품용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 항균 펩타이드는 항생제 내성 균주에도 효과가 있으며, 또한 본래의 항균력과 더불어 고염 조건에서도 구조적으로 안정한 특징을 갖는 물질로서, 피부 세포 이동 및 재생률을 증가시키며, 피 부상처 마우스 모델에서도 그 탁월한 효과를 보여주었으므로, 피부 세포 재생 촉진제로서 널리 이용될 수 있다. 이외에도 세포 재생 화장품 등의 다양한 산업적 응용 분야에도 널리 응용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 신규한 항균 펩타이드가 항생제 시장뿐 아니라, 외상치료제 시장 및 화장품 시장에 가져올 파급효과가 클 것으로 기대된다.

Description

항균 펩타이드의 피부 세포 재생 촉진제로서의 신규한 용도{Novel use of antimicrobial peptides for wound-healing}

본 발명은 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 상처치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 피부세포재생 촉진을 수행하여 상처를 치료하는 항균 펩타이드의 신규한 용도, 상기 펩타이드를 포함하는 피부세포 재생 촉진용 조성물 및 피부재생 화장품용 조성물에 관한 것이다.

상처 치료제는 상처 부위의 세균에 의한 2차 감염을 막는 항생제로 인류의 역사와 함께 발전하여 다양한 치료 제재가 개발되고 사용되어져 왔다. 20세기 플레밍에 의한 항생제의 발견과 더불어 비약적으로 발전한 상처 치료제는 초기에는 단순히 항생제만을 포함하고 있었으나, 최근에는 항생제와 함께 손상된 세포의 재생을 촉진시켜 주는 물질인 EGF (epidermal growth factor), 사이토카인 (cytokine), 인터루킨 (interlukin), TGF-β (transforming growth factor-beta) 등과 같은 단백질 등을 첨가하여 상처 치유력을 높이고 있다.

하지만 기존의 화학 항생제의 경우 내성 균주의 출현으로 새로운 항생제의 개발이 절실하게 요구되고 있다.

세균의 항생제에 대한 내성은 현재와 같이 세균의 감염을 막기 위해 항생 활성을 가지는 화학물질을 사용하는 한 인류가 영원히 함께해야 할 문제로 여겨지고 있다. 따라서 새로운 항생제의 개발에 있어서 세균이 항생제에 대한 내성을 갖지 못하도록 하는 것이 아니라 항생제 내성을 가지는 빈도를 줄이며 그러한 내성이 확산 되지 못하도록 하는 것이 더욱 중요하게 고려되고 있는 실정이다.

이렇게 항생제에 내성을 가지는 세균의 감염에 대한 효과적인 대응책을 찾지 못하고 있는 가운데, 많은 연구자들이 새로운 개념의 항생제 개발에 관심을 쏟고 있다. 또한 단백질 첨가제의 경우 값이 매우 비싸고 불안정하여 상처 치료제로 널리 사용되지 못하고 있으며, 대부분의 상처 치료제 내에 들어있는 스테로이드 성분은 스테로이드 피부염 같은 부작용을 유발하는 단점이 있다. 이에 대한 대안으로 피부부작용이 거의 없고 효과가 탁월한 상처 치료제로 항균 펩타이드가 주목받고 있다. 자연계에 존재하는 항균 펩타이드를 그대로 이용하거나 유사체들을 합성하여 이용하고자 하는 시도들이 있었으나, 항균활성과 동시에 세포독성의 적도인 적혈구 용혈활성도 동시에 증가하기에 실제적인 응용에 많은 제약을 받고 있다. 따라서 항균활성이 높으며 세포독성이 없는 항균 펩타이드의 개발을 위한 연구가 진행 중이다.

항균 펩타이드는 자연계에 널리 존재하며 길이가 아미노산 5-50개 정도로 짧고, 산알칼리 및 열처리 등에 거의 영향을 받지 않으며 항균 작용 후 쉽게 분해될 수 있다. 또한 이러한 항균 펩타이드들 중 카텔리시딘 (cathelicidin) LL-37과 마게이닌 (magainin) 유도체인 마게이닌2 (magainin2)와 같은 펩타이드는 항균력을 가짐과 동시에 세포재생을 촉진시키는 기능을 가지고 있다. 이들의 세포 재생 촉진 능력은 세포 재생에 관여하는 EGF (epidermal growth factor)가 작용하는 수용체 (epidermal growth factor receptor)에 상기의 펩타이드들이 결합하여 세포 재생을 유도하는 것으로부터 유래한다. 이는 LL-37과 비슷한 알파-나선 구조를 가지는 다른 항균 펩타이드들 역시 세포 재생 효과를 가질 수 있다는 사실을 의미한다 (TokuMaru S. et al., J Immunol. Japan, 175(7), p4662-4668, 2005).

현재 이러한 항균 펩타이드를 상처 치료제로 이용하기 위해서 다양한 연구가 수행 중이다. 그 중에서, 인간 카텔리시딘 (human cathelicidin) LL-37, 세라게닌 (ceragenin), 세크로핀 (cecropin), 박테리오신 (bacteriocin), 균성 디펜신 (fungal defensin) 그리고 플렉타신 (plectasin)이 상처치료제로 전 임상 단계에 있고, 개구리 마게이닌 (frog magainin)의 유도체인 펙시가난 (pexiganan;MSI-78)과 돼지 프로테그린 (pig protegrin) 유도체인 아이세그난 (iseganan;IB-367)등이 당뇨병성 족부 궤양 치료제, 구내 점막염 치료제로 임상 3단계에 있다.

그러나,생체 내에서 가지는 불안정성으로 인한 상처 치료 능력의 감소는 이들을 상처 치료제로서 사용하기 위해 반드시 극복해야할 문제점들이다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 생체내에서 안정성을 가지면서도 상처치료능력이 높은 항균 펩타이드를 찾기 위해 예의 노력한 결과, 본 발명자들이 기존에 개발한 생체내의 염 조건에서도 항균력을 유지하도록 제작된 항균 펩타이드 (국내 등록특허: 제10-0836596호) 중 일부 펩타이드가 시험관 내 피부세포 이동 재생증진 및 피부 상처 마우스 모델에서 상처치료의 시간을 감소시키는 효과가 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 하기 서열 일반식 (I)로 표시되는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 상처 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

[일반식 (I)]

[N-말단 - A P K A M X¹ L L X² L L X³ L Q K K G I - C-말단]

여기에서, X¹은 하나의 염기성 아미노산이고;

X²는 서로 같은 두 개의 염기성 아미노산이고;

X³은 하나의 염기성 아미노산이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 세포 재생 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 재생 화장품용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상처치료 및 피부 재생 치료방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서 본 발명은 하기 서열 일반식 (I)로 표시되는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 상처 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

[일반식 (I)]

[N-말단 - A P K A M X¹ L L X² L L X³ L Q K K G I - C-말단]

여기에서, X¹은 하나의 염기성 아미노산이고;

X²는 서로 같은 두 개의 염기성 아미노산이고;

X³은 하나의 염기성 아미노산이다.

본 발명에서 사용된 아미노산 서열은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 다음과 같이 약어로 기재하였다.

알라닌 A 아르기닌 R

아스파라긴 N 아스파르트산 D

시스테인 C 글루탐산 E

글루타민 Q 글라이신 G

히스티딘 H 이소루신 I

루신 L 리신 K

메티오닌 M 페닐알라닌 F

프롤린 P 세린 S

트레오닌 T 트립토판 W

티로신 Y 발린 V

본 발명에 의한 항균 펩타이드는 염기성 아미노산 (basic amino acid)과 소수성 아미노산 (hydrophobic amino acid)이 번갈아 위치하는 중심 단편과 상기 중심단편의 N-말단과 C-말단 쪽에 일정한 서열을 갖는 N-말단 단편과 C-말단 단편을 포함함으로써, 전체 펩타이드의 이차구조가 염 농도에 상관없이 안정화되어 항균작용을 나타낸다. 이때, 소수성 아미노산은 모든 소수성 아미노산이 가능하며, 이에 제한되는 것은 아니나, 알라닌, 발린, 또는 루신 등이 바람직하다. 또한, 염기성 아미노산은 모든 염기성 아미노산이 가능하며, 이에 제한되는 것은 아니나, 리신, 아르기닌 또는 히스티딘 등이 바람직하다.

본 발명에서의 용어, '염기성 아미노산'이란, 곁사슬이 염기성을 나타내는 아미노산으로,중성 pH영역에서 해리하여 곁사슬이 (+)전하를 갖는 아미노산이다. 히스티딘, 아르기닌 및 리신이 그 예이다.

바람직하게 상기 서열식에서 염기성 아미노산은 아르기닌 또는 리신일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 서열 일반식 (I)의 X¹ 내지 X³ 을 염기성 아미노산인 아르기닌 또는 리신으로 치환하여도 동일한 피부세포재생 효과를 확인하여 상기 서열에서 염기성 아미노산을 사용해도 동일한 효과가 있음을 확인하였다 (도 1 내지 2). 이와 같이, 상기 서열 일반식 (I)의 X¹ 내지 X³ 을 염기성 아미노산으로 치환하더라도, 상기 펩타이드들은 알파-나선 구조의 펩타이드 형태를 유지할 수 있으며, 이러한 알파-나선 구조의 펩타이드가 피부 세포 표면의 EGFR (epidermal growth factor receptor)을 활성화 시켜서 세포 재생 촉진 효과를 나타내는 것을 볼 때 (Tokuaru S. et al., J Immunol. Japan, 175(7), p4662-4668, 2005), 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 이외에 상기 서열 일반식 (I)의 알파-나선 구조를 가지는 다른 항균 펩타이드들 역시 EGFR를 활성화시켜 세포 재생을 촉진시키는 것이 가능하다는 것은 당연하다.

이와 같이 상기 항균 펩타이드가 상처치료에 효과가 있음을 본 발명자들에 의해 최초로 규명된 것으로 기존에는 단지 항균력만이 규명되었었다.

또한 본 발명은 상기 서열 일반식 (I)의 C-말단이 아미드화된 펩타이드 일 수 있으며, C-말단이 아미드화된 항균 펩타이드는 그람 양성균, 그람 음성균 및 곰팡이균에 대하여 보다 증진된 항균활성을 나타낸다.

바람직하게, 상기 조성물은 높은 염농도에서 항균활성을 추가적으로 가지며, 이로 인해 항균 펩타이드라고 명명할 수 있다. 이와 같이 본 발명의 펩타이드가 높은 염농도에서 항균활성을 가지는 것임은 국내등록특허 제 10-0836596호에서 입증하였다. 구체적으로, 염의 농도가 고농도인 100 또는 200mM 일 경우, 그람양성균, 그람음성균 및 곰팡이균에 대해 항균활성을 가지는 것을 확인하였으며, 이와 같은 높은 염농도에서 항균활성을 나타내는 본원 발명의 펩타이드는 생체내에서 안정성을 가져서 상처치료능력이 생체 내에서도 감소되지 않고, 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.

본 발명에서의 용어 '항균 펩타이드'란, 생체방어 메카니즘에 관련된 자연면역물질로서, 자연계에 널리 존재하며 길이가 아미노산 5-50개 정도로 짧고, 세균 (bacteria), 진균 (fungi), 바이러스 (viruses)와 같은 미생물의 생체막에 침투하여 이를 파괴하며 국소적인 감염방어까지 담당하는 저분자 물질을 말한다. 더욱 상세하게는 항균펩타이드는 양친매성 구조를 가지는 데, 항균펩타이드의 양이온 부위가 미생물 세포막이 가지고 있는 음이온성 인지질에 결합하는 원리에 의해 항균 활성을 나타낸다. 산,알칼리 및 열처리 등에 거의 영향을 받지 않으며 항균 작용 후 쉽게 분해될 수 있다.

바람직하게 상기 상처치료용 약학적 조성물은 피부 세포 재생촉진을 수행하여 상처를 치료할 수 있다.

본 발명에서의 용어, '상처치료'란, 물리적인 요인에 의해서 손상된 피부 세포를 회복시키기 위한 약물처치 및 손상된 피부 세포를 보호하는 것이다.

본 발명에서의 용어, '피부 세포 재생 촉진'이란, 일반적으로 질병 또는 외상 등에 의하여 피부조직의 일부가 탈락 또는 결손되면, 탈락조직 주위에 생존하고 있는 피부 세포가 분열증식하여 결손부에 이동하여 가는 현상을 피부 세포 재생이 빠르게 일어나도록 하는 것이다.

본 발명의 펩타이드를 이용할 경우 상처치료 시간이 감소되는 특징을 갖고 있다.

본 발명자들은 보이든 챔버 분석법으로 분석한 결과, 서열번호 1 또는 2의 항균 펩타이드가 1μM의 농도에서 가장 효과적인 피부 세포 이동율을 보이며, 대조군에 비해 최고 4.5배의 증진효과를 나타내는 것을 확인하였다 (도 1). 또한 긁힌 상처치료 분석을 통해, 1μM의 서열번호 1 또는 2의 항균 펩타이드가 피부 세포 재생을 2.5배 증가시키는 것을 확인하였다 (도 2). 또한 서열번호 1의 펩타이드가 피부상처치료 마우스모델에서 상처 크기를 7배 더 빨리 줄어들게 하는 것을 확인하였다 (도 3). 이로써, 본 발명의 펩타이드가 상처치료 효과와 세포재생 촉진 및 상처치료시간을 감소시킬 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적 제조에 통상적으로 사용되는 주사제, 환제, 정제 또는 캡슐제의 형태로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기 약학조성물의 투여 경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 구체적으로, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 주사제 형태로 투여될 수 있다. 또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

바람직하게 본 발명의 상기 약학조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, '약학적으로 허용가능한 담체'란, 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

바람직하게 상기 펩타이드의 농도는 0.5 내지 2μM 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1μM 일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 1μM의 농도에서 본 발명의 펩타이드가 가장 높은 상처치료 효과를 나타내는 것을 확인하였으며, 0.5 내지 2μM 일 경우에도 효과가 나타나는 것을 확인하였다 (도 1).

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 서열 일반식 (I)로 표시되는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 세포 재생 촉진용 조성물에 관한 것이다.

상기 펩타이드에 관한 설명은 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에서의 용어, '피부재생 촉진' 이란, 일반적으로 질병 또는 외상 등에 의하여 피부조직의 일부가 탈락 또는 결손되면, 탈락조직 주위에 생존하고 있는 피부세포가 분열증식하여 결손부에 이동하여 가는 현상을 피부 세포 재생이 빠르게 일어나도록 하는 것을 촉진시킬 수 있는 조성물을 의미한다. 본 발명의 펩타이드를 피부 세포 재생 촉진을 통해 상처치료시간을 감소시킬 수 있다. 상기 조성물에 관한 설명은 상기에서 설명한 바와 같다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 피부 세포 재생촉진용 조성물을 포함하는 피부 재생 화장품용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 피부 재생 화장품용 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로, 저자극성 화장료, 피부 보호제, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 크림, 에센스, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

또한, 각 제형의 피부 재생 화장품용 조성물에 있어서, 상기의 서열 일반식(I) 표시되는 펩타이드 외에 그의 변이체 또한 화장료의 제형 또는 사용목적 등에 따라 임의로 선정하여 배합할 수 있다. 예를 들어 점증제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체 등을 포함할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 서열 일반식 (I)로 표시되는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상처치료 및 피부 재생 치료방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 용어, '치료'란, 조성물의 투여로 상기 상처나 피부 재생이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하는 것이다.

본 발명의 항균 펩타이드를 이용한 치료 방법은 항균 펩타이드를 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 또한, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 조성물을 투여하는 개체는 인간을 포함한 포유동물을 제한 없이 포함하나, 그 예로 소, 돼지, 말, 토끼, 쥐, 인간 일 수 있다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약제학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명의 항균 펩타이드는 항생제 내성 균주에도 효과가 있으며, 또한 본래의 항균력과 더불어 고염 조건에서도 구조적으로 안정한 특징을 갖는 물질로서, 피부 세포 이동 및 재생률을 증가시키며, 피부 상처 마우스 모델에서도 그 탁월한 효과를 보여주었으므로, 피부 세포 재생 촉진제로서 널리 이용될 수 있다. 이외에도 세포 재생 화장품 등의 다양한 산업적 응용 분야에도 널리 응용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 신규한 항균 펩타이드가 항생제 시장뿐 아니라, 외상치료제 시장 및 화장품 시장에 가져올 파급효과가 클 것으로 기대된다.

도 1은 항균 펩타이드에 의한 피부 세포 이동률의 증가를 나타낸 그래프이다.
도 2는 항균 펩타이드의 피부 세포 재생 효과를 확인한 도이다.
도 3은 피부 상처 마우스 모델에서의 항균 펩타이드의 상처 치유 효과를 나타낸 도이다. 고농도의 염에서도 구조적으로 안정한 항균 펩타이드 17의 피부상처 마우스 모델에서의 상처 치유효과를 확인한 것으로, 하루 한 번 2일 동안 연속적으로 항균 펩타이드 17을 처리한 결과 마우스의 상처 크기가 그렇지 않은 경우 (증류수를 처리한 경우)에 비해 7배 더 빨리 줄어드는 것을 확인하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 항균 펩타이드의 합성

생체 내 고농도의 염 조건에서도 항균력을 유지하도록 제작된 항균 펩타이드들 (국내등록특허: 10-0836596) 중, 염기성 아미노산인 아르기닌 (Arginine :R)과 리신 (Lysine :K)을 각각 포함하며, C-말단이 아미드화 된 펩타이드 17 및 26번을 대표적으로 효과를 분석하였다(표 1).

항균 펩타이드 17 및 26번은 펩타이드 합성 기술인 프목-케이스트리 (Fmoc-chemistry)를 이용한 솔리드/솔루션 단계 (Solid/Solution Phase)를 통해 합성하였고, 고성능 액체 크로마토 그래피를 통해 정제하여 최종적으로 순도 97 %이상의 것을 사용하였다. 상기 항균펩타이드 17 및 26번을 각각 서열번호 1 및 2로 나타내었다.

실시예 2. 항균 펩타이드의 피부 세포 이동 증진 효과분석

항균 펩타이드 17 및 26번의 피부 세포 이동 증진 효과를 보이든 챔버 분석법 (boydem chamber assay)을 이용하여 시험관 내에서 평가하였다. 즉, 이들 항균 펩타이드들의 세포 재생 촉진제로서의 효과를 시험관 내 피부 세포 이동 재생 증진을 관찰함으로써 확인하였다.

HaCat 사람 피부 세포 5X10³ CFU/ml의 현탁액 중 50 ㎕의 현탁액을 챔버의 상층부에 놓고, 하층부에 피부 세포 배양 배지에 희석되어 0.25 내지 16 μM의 농도의 항균 펩타이드에 의해 챔버의 상층부와 하층부 사이의 막 (membrane)을 관통하여 이동하는 피부 세포의 수를 관찰하여 항균 펩타이드의 피부 세포 이동을 확인하였다.

그 결과, 1 μM의 농도에서 가장 효과적인 피부 세포 이동률을 보였으며, 펩타이드가 녹아 있지 않은 배양 배지 (대조군;0μM) 에 비해 최고 4.5 배의 증진 효과를 보여주었다. 이러한 실험 결과는 항균 펩타이드 17 및 26번이 피부 세포 이동률을 증진 시키는 효과를 가지고 있음을 보여주는 것이다 (도 1).

실시예 3. 항균 펩타이드의 피부 세포 재생 증진 효과분석

항균 펩타이드 17 및 26번의 피부 세포 재생 증진 효과는 긁힌 상처 치료 분석법 (Scratched wound-healing assay)을 통해 시험관 내에서 평가하였다.

12개의 구멍이 있는 평판 배양접시 (12-well plate)에 10⁵ CFU/ml의 피부 세포 현탁액 중 900 ㎕를 넣고, 3일 동안 키운 뒤, 평판 배양접시 중간에 옐로우 팁 (yellow tip)을 이용하여 클리어 영역 (clear zone)을 만들었다. 실시예 1의 실험 결과에서 가장 큰 피부 세포 이동률을 보여준 1 μM의 항균 펩타이드 농도에서 피부 세포 재생률을 확인하였다.

항균 펩타이드에 의한 피부 세포 재생 효과는 시험관 내 피부 상처인 클리어 영역 (clear zone)의 면적 크기의 감소로 확인하였으며, 면적의 크기는 포토샵을 이용하여 남아있는 클리어 존의 면적을 측정하고, 이를 기존의 클리어 존 면적에서 뺀 값으로 정량화하였다.

그 결과, 항균 펩타이드가 들어있지 않은 배양 배지 보다 항균 펩타이드 17 및 26을 각각 1μM 사용한 배지에서 2.5배 이상 피부 세포 재생이 증가하는 것을 확인하였다 (도 2).

실시예 4. 피부 상처 마우스 모델에서 항균 펩타이드의 상처 치료 시간 감소 효과 확인

피부 상처 마우스 모델에서의 항균 펩타이드의 상처 치료 시간 감소 효과는 전층 상처가 난 마우스의 등에 항균 펩타이드 17번(1 μM/day)을 2일간 지속적으로 처리한 뒤, 줄어드는 상처 크기로 평가하였다.

쥐의 등을 전기 면도기를 이용하여 제모하고, 지름 1.1 cm의 전층 상처를 수술용 가위로 만들었다. 실시예 2의 실험 결과에서 시험관 내에서 가장 큰 피부 세포 이동률을 보여준 1 μM의 농도의 항균 펩타이드 17번을 2일간 지속적으로 전층 상처에 50㎕ 씩 처리한 뒤, 줄어든 상처 크기를 확인하고, 항균 펩타이드 17번의 상처 치료 시간 감소 효과는 줄어드는 상처의 면적 크기로 계산하였다. 이때, 상처 면적의 크기는 포토샵을 이용하여 남아있는 클리어 존의 면적을 측정하고, 이를 기존의 클리어 존 면적에서 뺀 값으로 정량화하였다.

그 결과, 하루 한 번 2일 동안 연속적으로 항균 펩타이드 17번을 처리해 준 경우, 처리하지 않은 경우 (증류수를 처리한 경우)보다 상처 크기가 7배 더 빨리 줄어드는 것을 확인하였다 (도 3).

상기와 같은 결과들은 본 발명의 항균 펩타이드들이 높은 염농도의 생리적 환경에서 항균력을 유지하며, 피부 세포 이동촉진, 피부 세포 재생 촉진 및 상처치료 감소 효과가 있음을 확인한 것으로, 이는 항균 펩타이드가 가지는 항생제 내성균주에 대한 본래의 항균 효과와 더불어 세포 재생에도 효과가 있는 차세대 상처 치료제로 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.

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9. 하기 서열 일반식 (I)로 표시되는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 세포 재생 촉진용 약학적 조성물.
   [일반식 (I)]
   [N-말단 - A P K A M X¹ L L X² L L X³ L Q K K G I - C-말단]
   여기에서, X¹은 하나의 염기성 아미노산이고;
   X²는 서로 같은 두 개의 염기성 아미노산이고;
   X³은 하나의 염기성 아미노산이다.
   
10. 제9항에 있어서, 염기성 아미노산은 아르기닌 또는 리신인 것인 조성물.
    
11. 제9항에 있어서, 상기 서열 일반식 (I)의 C-말단이 아미드화된 것인 조성물.
    
12. 제9항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1 또는 2인 것인 조성물.
    
13. 제9항에 있어서, 상기 조성물은 100mM 또는 200mM의 염 농도에서 항균 활성을 추가적으로 가지는 것인 조성물.
    
14. 하기 서열 일반식 (I)로 표시되는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 재생 화장품용 조성물.
    [일반식 (I)]
    [N-말단 - A P K A M X¹ L L X² L L X³ L Q K K G I - C-말단]
    여기에서, X¹은 하나의 염기성 아미노산이고;
    X²는 서로 같은 두 개의 염기성 아미노산이고;
    X³은 하나의 염기성 아미노산이다.
    
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