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KR101274604B1 - Ｎ―아세틸뉴라민산을 포함하는 글리코마크로펩티드 뉴라미니다아제 분해물을 유효성분으로 하는 천연 항균제 조성물 - Google Patents

Ｎ―아세틸뉴라민산을 포함하는 글리코마크로펩티드 뉴라미니다아제 분해물을 유효성분으로 하는 천연 항균제 조성물 Download PDF

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KR101274604B1
KR101274604B1 KR1020110069459A KR20110069459A KR101274604B1 KR 101274604 B1 KR101274604 B1 KR 101274604B1 KR 1020110069459 A KR1020110069459 A KR 1020110069459A KR 20110069459 A KR20110069459 A KR 20110069459A KR 101274604 B1 KR101274604 B1 KR 101274604B1
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hydrolyzate
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Abstract

본 발명은 N-아세틸뉴라민산을 포함하는 글리코마크로펩티드 뉴라미니다아제 분해물을 유효성분으로 하는 천연 항균제 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 천연 항균제 조성물은 영유아식에 적용하기 안전할 뿐만 아니라, 영유아식에 혼입될 경우 영유아의 건강에 위해를 가할 수 있는 엔테로박터 사카자키나 바실러스 세레우스에 대하여 우유가 포함된 경우에도 그 항균활성이 저하되지 않음으로서, 영양이 강화되고 보다 안전한 우유함유 영유아식의 제조가 가능하다.

Description

Ｎ―아세틸뉴라민산을 포함하는 글리코마크로펩티드 뉴라미니다아제 분해물을 유효성분으로 하는 천연 항균제 조성물{A natural antibiotic compositon comprising glycomacropeptide hydorylsate of neuraminidase comprising N-acetylneuraminic acid as an effective component}
본 발명은 N-아세틸뉴라민산을 포함하는 글리코마크로펩티드 뉴라미니다아제 분해물을 유효성분으로 하는 천연 항균제 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 식품용 미생물에서 분리한 뉴라미니다아제를 이용하여 제조한 N-아세틸뉴라민산을 포함하는 글리코마크로펩티드 분해물과 중쇄지방산 또는 그 에스터 화합물을 유효성분으로 하는 천연 항균제 조성물로서 영유아식을 포함하는 식품에 첨가되어 식품의 유해미생물을 억제하는 천연 항균제로서 이용될 수 있다.
식품은 대사작용을 할 수 있는 효소와 여러 가지 영양성분을 함유하고 있어 생산 이후 소비될 때까지 이화학적이고 생리적인 변화가 계속 발생하며, 부패 미생물이나 병원성 미생물의 번식으로 인해 상품성, 영양성, 기호성 및 안전성이 저하된다. 이러한 식품을 안전하게 공급받고자 하는 인간의 욕구는 건강한 생활을 지속적으로 영위하고자 하는 것이며 따라서 위생적인 식품생산을 위한 다양한 노력들이 이루어지고 있다. 그러나 면역력이 약한 신생아 및 영유아가 섭취하는 조제분유나 이유식에서 엔테로박터 사카자키, 바실러스 세레우스 및 장내세균 등의 미생물에 의해 오염될 가능성이 제기되고 있다.
엔테로박터 사카자키는 대장균군에 속하는 그람 음성 간균으로 주요 매개체로서 건조 조제분유가 보고되며 장염을 일으키기도 하고 피로 들어가면 패혈증, 뇌로 침입하면 뇌수막염을 일으킬 수 있으며 이는 정상적인 면역력을 가진 사람에게는 크게 문제가 되지 않으나 신생아에게 치명적인 위험을 줄 수 있다. 또한 바실러스 세레우스는 구토와 설사를 일으키는 독소를 생산함으로써 식품매개질병을 유발할 수 있는 그람양성의 포자 생성균이다.
한편, 조제분유 등은 농축 및 건조 단계에서 HTLT, LTST, UHT 등의 가열살균이 이루어지고, 이러한 가열살균 조건은 위해 미생물의 사멸에 충분한 조건으로 수행된다. 그러나 살균 공정 후 분말화된 조제분유를 충전 및 포장하는 과정에서 미생물에 오염될 가능성이 제기되고 있다. 통상의 건조 식품 살균을 위해서는 항미생물제 또는 방사선 처리가 가능하지만, 안전성을 최우선으로 고려하는 조제분유에서는 이러한 선택에 제약이 따른다.
한편, N-아세틸뉴라민산(NANA 또는 시알산)은 각종 올리고당 및 당단백질과 연관된 것으로 나타나는, 인간 모유의 한 자연 발생적 성분이다. 인간 모유는 상당량의 N-아세틸뉴라민산을 함유하나, 대부분의 조제분유는 초유에서 발견되는 N-아세틸뉴라민산의 25% 미만을 함유한다. 또한, N-아세틸뉴라민산이 강글리오시드의 한 주요 성분으로서, 신생아 뇌의 발달 및 기능에 있어 중요하다고 보고되고 있으며, 다양한 병원성 미생물에 대하여 항균활성을 나타내는 것으로 알려져 있다.
N-아세틸뉴라민산은 시알릴락토스, 시알산-함유 강글리오시드, 글리코마크로펩티드(GMP), 및 카세이노글리코마크로펩티드(cGMP) 등에 일정 함량 이상이 포함되어 있어 N-아세틸뉴라민산의 공급원으로 조제분유에 사용하는 것도 가능하지만, 상기 공급원들로부터 말단 당쇄를 절단하여 N-아세틸뉴라민산을 생산하는 생체내 뉴라미니다아제의 활성이 성숙되지 않은 영유아, 특히 신생아에게 효율적으로 흡수되기 어렵고 또한 항균특성을 나타내기도 어렵다. 영유아에게 효율적으로 흡수되면서도 분말상태의 조제분유에 첨가되어 위해미생물의 억제 효과를 나타내기 위해서는 N-아세틸뉴라민산 자체를 조제분유에 공급하는 것이 효과적이나, 현재 상용화된 N-아세틸뉴라민산은 합성제제이거나 유전자 조작된 대장균에 의해 생산된 것으로 이를 조제분유에 사용하기 위해서는 더욱더 충분한 안전성의 검증이 필요하다.
따라서 식품, 그중에서도 영유아용 식품에 사용가능도록 천연의 유제품을 원료로 하여 식품용으로 사용가능한 효소 또는 미생물을 이용한 천연 N-아세틸뉴라민산을 생산하는 방법에 대한 시장의 욕구는 점점 더 증대되고 있다.
본 발명은 안정성이 검증된 식품용 효소 및 미생물 중에서 검색된 활성이 뛰어나고 N-아세틸뉴라민산의 대량생산이 적합한 뉴라미니다아제를 이용한 N-아세틸뉴라민산을 포함하는 글리코마크로펩티드 가수분해물을 유효성분으로 하는 천연 항균제 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 상기 천연 항균제 조성물을 포함하는 영유아용 식품을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
본 발명은 아스로박터 우레아파시엔스(Arthrobacter ureafaciens) KCTC 3387에서 분리한 뉴라미니다아제와 글리코마크로펩티드 또는 글리코마크로펩티드 함유 단백질을 반응시켜 제조한 글리코마크로펩티드 가수분해물; 및 탄소수 6 ~ 10의 중쇄지방산 또는 그 에스터 화합물;을 유효성분으로 하는 천연 항균제 조성물을 제공한다.
본 발명의 천연 항균제 조성물에서, 상기 글리코마크로펩티드 가수분해물은 N-아세틸뉴라민산을 4 ~ 99 중량% 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 천연 항균제 조성물에서, 상기 글리코마크로펩티드 가수분해물은 글리코마크로펩티드 3 ~ 8 중량% 함유하는 반응용액에 글리코마크로펩티드 단위 g 당 0.09 ~ 0.2 U의 뉴라미니다아제를 투입하여 pH 4 ~ 5에서 35 ~ 55 ℃에서 2 ~ 5 시간 반응시켜 제조하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 천연 항균제 조성물에서, 상기 탄소수 6 ~ 10의 중쇄지방산 또는 그 에스터 화합물은 카프로익산, 카프릴릭산, 카프릭산, 및 그 에스터 화합물 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 천연 항균제 조성물은, 상기 천연 항균제 조성물에서 상기 글리코마크로펩티드 가수분해물은 N-아세틸뉴라민산을 기준으로 0.01 ~ 10 중량% 및 상기 탄소수 6 ~ 10의 중쇄지방산 또는 그 에스터 화합물은 0.01 ~ 10 중량%를 함유하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 영유아에게 섭취될 수 있도록 희석 또는 조제된 형태 100 중량% 중, 상기 천연 항균제 조성물이 0.08 ~ 1 중량% 포함된 것을 특징으로 하는 유(乳)성분을 함유하는 영유아용 식품을 제공한다.
본 발명은 식품에 적용되는 미생물에서 분리되어 안전성이 강조되는 영유아식품에도 첨가될 수 있는 천연 N-아세틸뉴라민산을 포함하는 글리코마크로펩티드 분해물을 유효성분으로 하는 천연 항균제 조성물을 제공하며, 본 발명의 천연 항균제 조성물은 우유단백질에서 유래한 천연 항균활성 물질로서 영유아식에 적용하기 안전할 뿐만 아니라, 영유아식에 혼입될 경우 영유아의 건강에 위해를 가할 수 있는 엔테로박터 사카자키나 바실러스 세레우스에 대하여 우유가 포함된 경우에도 그 항균활성이 저하되지 않음으로서, 영양이 강화되고 보다 안전한 우유함유 영유아식의 제조가 가능하게 한다.
도 1은 실시예 1의 DEAE-셀룰로오스 음이온교환수지 크로마토그래피에서 단백질과 뉴라미니다아제의 용출 피크를 나타낸 그래프이다.
도 2는 실시예 1의 각 정제 단계별 단백질의 SDS-PAGE 전기영동 결과를 나타낸 사진이다.
도 3은 본 발명의 뉴라미니다아제의 최적 pH를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 뉴라미니다아제의 pH 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 뉴라미니다아제의 최적 온도를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 뉴라미니다아제의 열 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 7은 실시예 3에서 글리코마크로펩티드의 농도에 따른 N-아세틸뉴라민산의 생산량을 나타낸 그래프이다.
도 8은 실시예 3에서 글리코마크로펩티드의 농도에 따른 N-아세틸뉴라민산의 수율을 나타낸 그래프이다.
도 9는 실시예 3에서 뉴라미니다아제 활성에 따른 N-아세틸뉴라민산의 수율을 나타낸 그래프이다.
도 10은 실시예 4의 글리코마크로펩티드 가수분해물을 항생제 내성을 보유한 규에 10세대 반복 처리하여 항균효과의 지속여부를 확인한 것으로, A는 1세대의 항균활성 사진, B는 10세대의 항균활성 사진으로, A와 B에서 1은 대조군, 2는 10분 처리군, 3은 30분 처리군, 4는 1시간 처리군, 5는 3시간 처리군, 6은 6시간 처리군, 7은 18시간 처리군이다.
도 11은 그램음성균에서 실시예 4의 글리코마크로펩티드 가수분해물(NANA)과 카프릭산 에스터(Surfactant)의 농도에 따른 최소생육억제농도를 나타낸 평판 사진이다.
도 12는 그램양성균에서 실시예 4의 글리코마크로펩티드 가수분해물(NANA)과 카프릭산 에스터(Surfactant)의 농도에 따른 최소생육억제농도를 나타낸 평판 사진이다.
도 13은 O157 대장균을 실시예 4의 글리코마크로펩티드 가수분해물(NANA)과 카프릭산 에스터(Surfactant)로 각각 처리한 후 전자주사현미경으로 세포 표면 성상을 관찰한 SEM 사진으로 1은 아무것도 처리하지 않은 대조군, 2는 실시예 4의 글리코마크로펩티드 가수분해물(NANA) 처리군, 3은 카프릭산 에스터(Surfactant) 처리군을 나타낸다.
도 14는 효모를 실시예 4의 글리코마크로펩티드 가수분해물(NANA)과 카프릭산 에스터(Surfactant)로 각각 처리한 후 전자주사현미경으로 세포 표면 성상을 관찰한 SEM 사진으로 1은 아무것도 처리하지 않은 대조군, 2는 실시예 4의 글리코마크로펩티드 가수분해물(NANA) 처리군, 3은 카프릭산 에스터(Surfactant) 처리군을 나타낸다.
도 15는 O157 대장균(E. coli O157:H7)에 실시예 4의 글리코마크로펩티드 가수분해물(NANA)를 농도별로 처리하여 세포막에 주는 영향을 확인하기위해 형광 염색약(SYTOX green)을 처리하여 세포막의 파괴 여부를 확인한 그래프이다.
도 16은 O157 대장균(E. coli O157:H7)에 카프릭산 에스터(Surfactant)를 농도별로 처리하여 세포막에 주는 영향을 확인하기위해 형광 염색약(SYTOX green)을 처리하여 세포막의 파괴 여부를 확인한 그래프이다.
도 17은 O157 대장균에서 실시예 4의 글리코마크로펩티드 가수분해물(NANA)과 카프릭산 에스터(Surfactant)가 세포막 전위 변화를 통해 세포막을 직접 분해하는지를 확인한 그래프이다.
도 18은 스타필로코커스 아우레우스에서에서 실시예 4의 글리코마크로펩티드 가수분해물(NANA)과 카프릭산 에스터(Surfactant)가 세포막 전위 변화를 통해 세포막을 직접 분해하는지를 확인한 그래프이다.
도 19는 바실러스 세레우스에서 실시예 4의 글리코마크로펩티드 가수분해물(NANA)과 카프릭산 에스터(Surfactant)가 세포막 전위 변화를 통해 세포막을 직접 분해하는지를 확인한 그래프이다.
도 20은 실험예 6의 Cacein을 포함하는 인공세포막을 이용한 세포막 분해여부 확인실험의 개략도를 나타낸 것이다.
도 21은 실시예 4의 글리코마크로펩티드 가수분해물(NANA)과 카프릭산 에스터(Surfactant) 처리에 따른 인공세포막 내부에 포집된 형광염료의 유출 결과를 나타낸 그래프이다.
도 22는 락토페린, 박테리오신 및 이들의 혼합물을 조제유에 혼합했을 때의 엔테로박터 사카자키에 대한 항균활성을 나타낸 것으로 접종 후 18시간 경과 후 플레이트 사진이다.
도 23은 락토페린, 박테리오신 및 이들의 혼합물을 조제유에 혼합했을 때의 바실러스 세레우스에 대한 항균활성을 나타낸 것으로 접종 후 18시간 경과 후 플레이트 사진이다.
도 24는 N-아세틸뉴라민산을 조제유에 혼합했을 때의 엔테로박터 사카자키에 대한 항균활성을 나타낸 것으로 접종 시간별 플레이트 사진이다.
도 25는 N-아세틸뉴라민산을 조제유에 혼합했을 때의 바실러스 세레우스에 대한 항균활성을 나타낸 것으로 접종 시간별 플레이트 사진이다.
도 26은 생리식염수 또는 제제예 2의 과립을 함유한 생리식염수를 침과 혼합하여 플레이트에 도말한 후의 구강세균의 증식여부를 확인한 사진으로, 좌측은 침과 생리식염수를 혼합하여 도말한 대조군의 사진이고, 가운데는 침과 제제예 2의 과립을 5 중량% 용해시킨 용액을 3분간 혼합한 후 도말한 사진이며, 우측은 침과 제제예 2의 과립을 5 중량% 용해시킨 용액을 18시간 혼합한 후 도말한 사진이다.
본 발명에서는 영유아식품용으로 안전하게 사용할 수 있는 뉴라미니다아제를 기존 식품에 사용되거나 안전성이 검증된 식품용 효소제 또는 식품용 미생물제제에서 검색하여 효소역가와 효소생산의 용이성을 고려하여 Arthrobacter ureafaciens KCTC 3387를 뉴라미니다아제 생산균주로 선정하였다. 상기 Arthrobacter ureafaciens KCTC 3387에서 세포배양액을 원심분리하여 균체를 제거하고 배양상등액을 한외여과하여 농축한 후 음이온교환수지를 통해 분리정제한 뉴라미니다아제와 글리코마크로펩티드 또는 글리코마크로펩티드 함유 단백질을 반응시켜 글리코마크로펩티드 가수분해물을 제조한다.
본 발명에서 상기 글리코마크로펩티드 가수분해물은 글리코마크로펩티드 3 ~ 8 중량%, 바람직하게는 4 ~ 6 중량% 함유하는 반응용액에 글리코마크로펩티드 단위 g 당 0.09 ~ 0.2 U, 바람직하게는 0.1 ~ 0.15 U의 뉴라미니다아제를 투입하여 pH 4 ~ 6, 바람직하게는 pH 5 ~ 5.5에서 35 ~ 55 ℃, 바람직하게는 38 ~ 55 ℃ 에서 2 ~ 5 시간, 바람직하게는 2.5 ~ 4 시간 반응시켜 제조한다.
본 발명의 천연 항균제 조성물에서 글리코마크로펩티드 가수분해물은 N-아세틸뉴라민산을 4 ~ 99 중량%, 바람직하게는 6 ~ 90 중량%, 더욱 바람직하게는 8 ~ 80 중량% 포함한다. 상기 하한치 미만에서는 천연 항균제 조성물에서 글리코마크로펩티드 가수분해물의 첨가량에 제한을 받아 N-아세틸뉴라민산의 첨가량에 한계가 있어 항균성이 제한되고, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 정제비용이 높아지면서 그램양성균에 대한 항균활성이 저하된다.
상기 글리코마크로펩티드 가수분해물은 본 발명의 천연 항균제 조성물에서 N-아세틸뉴라민산을 기준으로 0.01 ~ 10 중량%, 바람직하게는 0.05 ~ 5 중량%, 더욱 바람직하게는 0.1 ~ 1 중량% 포함된다. 글리코마크로펩티드 가수분해물의 함량이 상기 하한치 미만에서는 그램음성균에 대한 항균활성이 충분치 못하고 중쇄지방산 또는 그 에스터 화합물과의 항균 상승효과가 충분히 발휘되지 못한다.
본 발명의 천연 항균제 조성물은 상기 글리코마크로펩티드 가수분해물과 탄소수 6 ~ 10의 중쇄지방산 또는 그 에스터 화합물을 유효성분으로 한다. 탄소수 6 ~ 10의 중쇄지방산 또는 그 에스터 화합물은 본 발명의 천연 항균제 조성물에서 0.01 ~ 10 중량%, 바람직하게는 0.05 ~ 5 중량%, 더욱 바람직하게는 0.1 ~ 1 중량% 포함된다. 탄소수 6 ~ 10의 중쇄지방산 또는 그 에스터 화합물이 상기 하한치 미만에서는 그램양성균에 대한 항균활성이 충분치 못하고 글리코마크로펩티드 가수분해물과의 항균 상승효과가 충분히 발휘되지 못할 수 있다.
본 발명의 탄소수 6 ~ 10의 중쇄지방산 또는 그 에스터 화합물은 카프로익산, 카프릴릭산, 카프릭산 및 그 에스터 화합물이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 카프릭산 또는 카프릭산의 에스터 화합물이고, 가장 바람직하게는 카프릭산의 에스터 화합물이다.
본 발명의 항균제 조성물은 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 분말, 과립, 정제, 캡슐 등의 형태의 건강기능식품으로 또는 항균성 강화를 위한 천연 식품첨가제로 사용할 수 있다.
본 발명의 항균제 조성물이 건강기능식품 또는 식품첨가제에 포함될 때 그 양은 건조물 또는 고형인 경우 전체 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 음료인 경우 100 ml를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 항균제 조성물이 음료 형태로 제조되는 경우 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 글리코마크로펩티드 가수분해물 및 탄소수 6 ~ 10의 중쇄지방산 또는 그 에스터 화합물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 음료 100 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.
상기 외에 본 발명의 항균제 조성물이 건강기능식품 또는 천연 식품첨가제로 사용되는 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 천연 항균제 조성물은 천연물로부터 유래한 것으로 독성 및 부작용이 거의 없이 예방 또는 치료 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.
특히 본 발명의 천연 항균제 조성물은 높은 안전성을 필요로하는 영유아 식품에 항균성 강화 및 N-아세틸뉴라민산 공급을 위하여 사용될 수 있고, 영유아에게 섭취될 수 있도록 희석 또는 조제된 형태 100 중량% 중, 천연 항균제 조성물이 0.08 ~ 1 중량% 포함하는 것이 바람직하다.
이하 실시예, 비교예 및 실험예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 예시적인 것일 뿐 이에 의해 본 발명의 기술적 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다.
실시예1 : 뉴라미니다아제 제조
뉴라미니다아제를 생산하기 위하여 Arthrobacter ureafaciens KCTC 3387를 30 ℃, 100 rpm, 0.2 bar, 0.3 ~ 0.66 vvm에서 15 시간 발효시켰다. 상기 배양액을 원심분리하여 균체를 제거한 상등액을 얻고, 상등액을 얻고, 그 상등액을 한외여과를 통해 분자량 10000 이하의 물질을 제거하여 10 배 농축한 후, pH 6의 10 mM 인산염 완충액에 염화나트륨으로 0.5 M까지 염농도를 증가시키면서 DEAE-셀룰로오스 음이온교환수지 크로마토그래피로 단백질을 용출시키고, 다시 한외여과를 통해 분자량 30000 이하의 물질을 제거하여 뉴라미니다아제를 분리하였다.
도 1에는 상기 DEAE-셀룰로오스 음이온교환수지 크로마토그래피에서 단백질과 뉴라미니다아제의 용출 피크를 나타내었고, 표 1에는 각 정제단계별 총 단백질량, 총 효소활성, 비활성, 정제배율, 수율을 나타내었으며, 도 2에는 각 정제 단계별 단백질의 SDS-PAGE 전기영동 결과를 나타내었다.
정제단계 총 단백질
(mg)		 총 효소활성
(U)		 비활성
(U/mg)		 정제배율
(배)		 수율
(%)
배양 상등액 112.0 537.6 4.8 1.0 100
한외여과(분자량 10k) 14.9 112.3 7.5 1.6 21
DEAE 셀룰로오스 0.64 8.8 13.8 2.9 1.6
한외여과(분자량 30k) 0.12 11.6 96.3 20.1 2.2
실시예2 : 뉴라미니다아제의 효소적 특성
실시예 1에서 분리한 뉴라미니다아제의 최적 pH, pH 안정성, 최적 온도, 열안정성을 측정하여 각각 도 3 내지 6에 나타내었다.
뉴라미니다아제의 최적 pH는 2 중량%의 글리코마크로펩티드를 함유한 완충액에서 37 ℃, 10분 배양하여 측정하였고, 최적 pH는 5를 나타내었다(도 3).
뉴라미니다아제의 pH 안정성을 pH 3 ~ 9 범위에서 확인하였다. 먼저 뉴라미니다아제를 각각의 pH에서 4 ℃, 1시간 배양한 후 잔존 효소활성을 측정하였고, 뉴라미니다아제는 pH 3 내지 9 범위에서 모두 60 % 이상의 잔존 활성을 나타내었다(도 4).
뉴라미니다아제의 최적 온도는 2 중량%의 글리코마크로펩티드를 함유한 소듐 아세테이트 완충액(pH 5)에서 10분 배양하여 측정하였고, 최적 온도는 55 ℃였고, 55 ℃를 초과하는 경우 효소 활성이 급격히 감소하였으므로, 적정 온도는 50 ~ 55 ℃인 것으로 판단되었다(도 5).
뉴라미니다아제의 열안정성은 4 ~ 70 ℃ 범위에서 확인하였다. 먼저 뉴라미니다아제를 각각의 온도에서 pH 5.5, 10 분간 배양한 후 잔존 효소활성을 측정하였고, 뉴라미니다아제는 4 ~ 55 ℃에서 활성이 유지되다가, 55 ℃를 초과하는 경우 효소 활성이 급격히 감소하였다(도 6).
실시예3 : 글리코마크로펩티드 가수분해물 생산조건 확인
실시예 1에서 분리한 뉴라미니다아제로 N-아세틸뉴라민산을 함유하는 글리코마크로펩티드 가수분해물을 제조함에 있어서, 글리코마크로펩티드의 농도에 따른 생산량 및 수율, 뉴라미니다아제 활성에 따른 수율을 도 7 내지 9에 나타내었다.
글리코마크로펩티드의 농도에 따른 생산량 및 수율은 10 mM 소듐 아세테이트 완충액(pH 5)에 뉴라미니다아제 0.23 U를 첨가하여 총 부피를 5 ml로 하여 37 ℃에서 반응시키면서 반응시간에 따른 N-아세틸뉴라민산의 생산량을 도 7에 나타내었고, 글리코마크로펩티드에 N-아세틸뉴라민산의 함량이 8.5 중량% 함유된 것으로 가정하여 이론적인 N-아세틸뉴라민산 함량에서 실제 생산된 N-아세틸뉴라민산의 생산수율을 계산하여 도 8에 나타내었다. 수율은 2 중량%의 글리코마크로펩티드를 사용한 경우가 5 중량% 사용한 경우보다 10 ~ 18 % 더 높게 나타났으나, 5 중량%의 글리코마크로펩티드를 사용한 경우에서 N-아세틸뉴라민산의 생산량이 더 많았다.
뉴라미니다아제 활성에 따른 N-아세틸뉴라민산의 수율은, 5 중량%의 글리코마크로펩티드를 함유한 100 mM 소듐 아세테이트 완충액(pH 5)에서 효소 활성을 달리하여 37 ℃에서 4시간 반응시켜 수율을 계산하여 도 9에 나타내었다. 효소활성이 0.09 U 이상에서는 수율이 모두 40 % 이상으로, 효소활성 증가에 따른 수율의 증가는 미미하였다.
실시예4 : N- 아세틸뉴라민산 함유 글리코마크로펩티드 가수분해물의 생산
치즈 유청에서 제조된 글리코마크로펩티드 2 kg가 용해된 반응용액 40L에 실시예 1에서 분리한 뉴라미니다아제 200 U를 첨가하고 37 ℃, pH 5에서 4시간 반응시키고, 필터프레스로 여과하여 미분해된 글리코마크로펩티드를 제거하고, 진공감압농축을 통해 8배 농축하여 부피가 5 L가 되도록 농축하였다. 상기 농축액에 주정 15 L를 첨가하고 4 ℃에서 12시간 방치하여 필터프레스로 여과하여 침전물을 제거하고, 2차 진공감압농축을 통해 최종 부피가 3.5 L가 되도록 하였다. 이 농축액을 동결건조하여 약 25 중량%의 N-아세틸뉴라민산을 함유한 글리코마크로펩티드 가수분해물 198 g을 제조하였다.
상기 생산공정 중에서 N-아세틸뉴라민산의 함량, 순도 및 수율을 표 2에 나타내었다.
구분 액량 건조무게(g) NANA함량(g) 순도(%) 수율(%)
효소반응 전
반응용액		 40 2000 0 0 0
효소반응 후
반응용액		 40 2000 79.0 3.95 100
효소반응 후
침전물		 - 610 6.3 1.03 7.98
(loss)
1차 진공감압
농축액		 5 1350 72.5 5.37 91.8
에탄올 침전
상등액		 20 - - - -
에탄올 침전물 - 1020 25.5 2.5 32.28
(loss)
2차 진공감압
농축액		 1.35 204 49.5 24.26 62.66
동결건조제품 - 198 49.8 25.15 63.04
실험예 1: 지속사용에 의한 내성 유발여부 확인
N-아세틸뉴라민산을 25 중량% 함유한 실시예 4의 글리코마크로펩티드 가수분해물을 항균 조성물로 지속 사용할 때 발생할 수 있는 내성 형성 여부를 항생제 내성을 보유한 균에 10세대 반복 처리하여 항균효과의 지속여부를 확인하였다.
먼저 모든 항생제에 감수성을 가진 대장균(E. coli NCTC 9001)과 Cf 및 Cm에만 감수성을 가진 O157 대장균(E. coli O157:K88ac)를 5 x 105 CFU/ml로 접종한 후, N-아세틸뉴라민산을 기준으로 0.25 중량%가 되도록 실시예 4의 글리코마크로펩티드 가수분해물을 희석한 희석액을 10분, 30분, 1시간, 3시간, 6시간 및 18 시간 처리하여 생존 콜로니 수를 비교하였다.
다음으로, 실시예 4의 글리코마크로펩티드 가수분해물를 처리한 후 3 시간 경과 후 생존 콜로니를 채취하고, 이를 배양한 후 다시 실시예 4의 글리코마크로펩티드 가수분해물을 희석한 희석액을으로 처리하는 것을 10 세대를 반복하여 항균활성을 1세대와 비교하였다.
1세대의 항균활성 사진은 도 10의 A에, 10세대의 항균활성 사진은 도 10의 B에 나타내었다. 도 10에서 1은 대조군, 2는 10분 처리군, 3은 30분 처리군, 4는 1시간 처리군, 5는 3시간 처리군, 6은 6시간 처리군, 7은 18시간 처리군이다.
본 발명의 실시예 4의 글리코마크로펩티드 가수분해물은 항균제로서 내성을 유발하지 않았고, 18시간 이내 사멸율이 99.9% 이상이 됨을 확인하였다.
실험예 2: 항균 스펙트럼
N-아세틸뉴라민산을 25 중량% 함유한 실시예 4의 글리코마크로펩티드 가수분해물의 항균 스펙트럼을 확인하기 위하여 영유아식에서 위해 미생물로 문제될 수 있는 그램양성균 대장균(E. coli), O157 대장균(E. coli O157) 및 엔테로박터 사카자키(E. sakazaki) 3종과 그램음성균으로 바실러스 서브틸리스(B. subtilis), 바실러스 세레우스(B. cereus), 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus) 및 스타필로코커스 티피무리움(S. typhimurium) 4종의 생육저해 효과를 확인하였다.
8 영역으로 분할한 평판에 상기 실시예 4의 글리코마크로펩티드 가수분해물(NANA)과 카프릭산 에스터(Surfactant)를 각각 0, 0.078, 0.15. 0.31. 0.62, 1.25, 2.5, 5 mg/ml 첨가한 배지에, 상기 미생물을 5 x 105 CFU/ml로 희석하여 각각의 영역의 평판에 도말하고 37 ℃에서 24시간 배양한 후 생육정도를 관찰하여 최소생육저해농도(MIC)를 결정하였다.
그램 음성균의 최소생육저해농도와 평판 사진을 표 3 및 도 11에, 그램 양성균의 최소생육저해농도와 평판 사진을 표 4 및 도 12에 나타내었다.
구분 NANA의 MIC(mg/ml) Surfactant의 MIC(mg/ml)
E. coli 5 2.5
E. coli O157 2.5 1.25
E. sakazaki 5 2.5
구분 NANA의 MIC(mg/ml) Surfactant의 MIC(mg/ml)
B. subtilis 5 1.25
B. cereus 2.5 0.31
S. aureus 2.5 1.25
S. typhimurium 5 1.25
실시예 4의 글리코마크로펩티드 가수분해물(NANA)은 카프릭산 에스터에 비해서는 항균활성이 약하였으나, 종래 합성 N-아세틸뉴라민산이 그램음성균에만 항균효과를 나타내고 그램양성균에는 항균활성이 없거나 거의 미미하다는 보고와 달리 본 발명의 천연 N-아세틸뉴라민산 함유 글리코마크로펩티드 가수분해물은 그램양성균에 대해서도 그램음성균과 동일한 수준의 항균활성을 나타내었다.
실험예 3: 세포막 표면 성상 변화 확인
실시예 4의 글리코마크로펩티드 가수분해물(NANA)과 카프릭산 에스터(Surfactant)의 O157 대장균(E. coli O157:H7) 및 효모(S. cerevisiae)에 최소생육저해농도로 처리했을 때의 세포 표면 성상의 변화를 전자주사현미경 사진으로 확인하였다.
5 x 105 CFU/ml의 O157 대장균(E. coli O157:H7)에 실시예 4의 글리코마크로펩티드 가수분해물(NANA)를 N-아세틸뉴라민산 함량을 기준으로 2.5 mg/ml, 카프릭산 에스터(Surfactant)를 1.25 mg/ml로 각각 처리한 후 37 ℃에서 20분 처리한 후 고정하여 전자주사현미경으로 세포 표면 성상을 관찰하여 도 13에 나타내었다. 도 13에서 1은 아무것도 처리하지 않은 대조군, 2는 실시예 4의 글리코마크로펩티드 가수분해물(NANA) 처리군, 3은 카프릭산 에스터(Surfactant) 처리군을 나타낸다. 대조군에 비해 2와 3의 처리군에서 O157 대장균의 표면이 파괴되어 응집되어 있는 것을 관찰할 수 있었다.
5 x 105 CFU/ml의 효모(S. cerevisiae)에 실시예 4의 글리코마크로펩티드 가수분해물(NANA)를 N-아세틸뉴라민산 함량을 기준으로 5 mg/ml, 카프릭산 에스터(Surfactant)를 2.5 mg/ml로 각각 처리한 후 28 ℃에서 30분 처리한 후 고정하여 전자주사현미경으로 세포 표면 성상을 관찰하여 도 14에 나타내었다. 도 14에서 1은 아무것도 처리하지 않은 대조군, 2는 실시예 4의 글리코마크로펩티드 가수분해물(NANA) 처리군, 3은 카프릭산 에스터(Surfactant) 처리군을 나타낸것으로, 대조구에 비해 처리군의 효모 표면에 크고 작은 구멍이 다수 생겼음을 확인할 수 있었다.
실험예 4: 세포막 관련성 확인
실시예 4의 글리코마크로펩티드 가수분해물(NANA)과 카프릭산 에스터(Surfactant)가 항균성을 나타내는 메카니즘에 있어서 세포막에 영향을 주는지 확인하기 위하여 O157 대장균(E. coli O157:H7)에 각각을 처리한 후 형광 염색약(SYTOX green)을 처리하여 세포막의 파괴 여부를 확인하였다(도 15 및 16). 형광 염색약(SYTOX green)은 스스로 세포안으로 침입하지 못하지만, 세포막이 파괴되면 세포 내에서 핵산과 결합하여 형광을 나타낸다.
실시예 4의 글리코마크로펩티드 가수분해물(NANA)[도 15]과 카프릭산 에스터(Surfactant)[도 16]은 모두 9분 이후 O157 대장균의 세포막에 손상을 가하며, 실시예 4의 글리코마크로펩티드 가수분해물(NANA)에 비하여 카프릭산 에스터(Surfactant)가 세포막을 더 크게 손상시키는 것을 확인하였다.
실험예 5: 세포막 분해여부 확인
실시예 4의 결과로부터 최소생육저해농도 이상에서의 항균성이 세포막과 관련이 있음을 확인하였으나, 직접 세포막의 분해(lysis) 또는 손상을 주는지는 확인할 수 없었다. 따라서 각각의 실시예 4의 글리코마크로펩티드 가수분해물(NANA)과 카프릭산 에스터(Surfactant)가 세포막 전위 변화를 통해 세포막을 직접 분해하는지를 확인하였다.
전위 지시약으로 DisC35를 사용하여 세포막 전위 편극법(Depolarization of membrane Potential)으로 O157 대장균에 대해 확인한 결과를 도 17에, 스타필로코커스 아우레우스에 대해 확인한 결과를 도 18에, 바실러스 세레우스에 대해 확인한 결과를 도 19에 나타내었다.
카프릭산 에스터(Surfactant)의 경우 3개의 공시균주 모두에서 높은 편극을 나타내었고, 실시예 4의 결과와 종합해서 살펴볼 때 직접적으로 세포막에 분해 또는 손상을 입히는 것으로 확인되었다.
카프릭산 에스터와 비교했을 때 실시예 4의 글리코마크로펩티드 가수분해물(NANA)은 최소생육억제농도 이하에서는 거의 변화를 보이지 않다가, 최소생육억제농도에서 20 ~ 30 %의 편극을 나타내는 것으로 보아 실시예 4의 글리코마크로펩티드 가수분해물(NANA)는 세포막에 직접 분해 또는 손상을 입히지는 않는 것으로 판단되었다.
실험예 6: 인공세포막 분해여부 확인
Cacein을 내부에 포함하는 PE와 PG가 7:3 중량비로 이루어진 인공세포막에 각각 실시예 4의 글리코마크로펩티드 가수분해물(NANA)과 카프릭산 에스터(Surfactant)를 농도별로 처리하여 형광염료(calcein)의 유출 여부를 확인하였다. 실험과정의 개략도는 도 20에 나타내었고, 실시예 4의 글리코마크로펩티드 가수분해물(NANA)과 카프릭산 에스터(Surfactant) 처리에 따른 인공세포막 내부에 포집된 형광염료의 유출 결과를 도 21에 나타내었다. 도 21에서 카프릭산 에스터(Surfactant)는 농도에 비례하여 현저한 형광염료의 유출을 보이지만, 글리코마크로펩티드 가수분해물(NANA)는 형광염료의 유출이 거의 없는 것으로 나타났다.
따라서 실시예 4의 글리코마크로펩티드 가수분해물은 최소생육억제농도 이상으로 처리하면 삽투압에 의해 세포막 내부로 유입이 극대화된 후 세포벽을 파괴하는 메카니즘에 따라 세포막 손상이 이루어지는 것으로 판단되었다.
실험예 7: 열처리에 따른 항균효과
N-아세틸뉴라민산을 함유한 글리코마크로펩티드 가수분해물(NANA)이 열처리 후에도 항균활성을 나타내는지를 함께 확인하였다. 실시예 4에서 제조한 N-아세틸뉴라민산을 각각 75 ℃, 30분 처리조건, 90℃, 30분 처리조건 및 121℃, 15분 처리조건으로 열처리를 실시한 후 각각의 항균 활성을 조사하였다.
열처리하지 않은 글리코마크로펩티드 가수분해물(NANA)과 열처리한 글리코마크로펩티드 가수분해물(NANA)의 엔테로박터 사카자키에 대한 항균활성 결과는 표 5에, O157 대장균에 대한 항균활성은 표 6에 각각 나타내었다. 표의 NT는 실험을 실시하지 않은 것을 나타낸다.
Figure 112011053814119-pat00001
Figure 112011053814119-pat00002
본 발명의 실시예 4의 N-아세틸뉴라민산을 함유한 글리코마크로펩티드 가수분해물은 엔테로박터 사카자키균, O157 대장균 모두에 대해서 0.01 중량%에서도 더 이상 균의 증식을 못하게 하는 정균 효과를 나타내었고, 엔터로박터 사카자키균에 대해서는 1 중량% 농도부터 균을 사멸시켰고, O157 대장균에 대해서는 2 중량% 농도부터 균을 사멸시킴을 확인할 수 있었다.
또한 본 발명의 실시예 4의 N-아세틸뉴라민산을 함유한 글리코마크로펩티드 가수분해물은 열처리를 통해 항균활성이 약화되지 않고, 오히려 열처리 조건을 강화시킬수록 항균활성이 증대되었다. 따라서, 본 발명의 글리코마크로펩티드 가수분해물은 열처리를 하지 않는 식품이나 열처리를 하는 식품이라도 열처리 후 공정에 첨가되는 경우, 글리코마크로펩티드 가수분해물을 미리 열처리한 후 첨가하는 것이 항균활성 면에서 바람직하며, 바람직한 열처리 조건은 90 ~ 130 ℃에서 5 ~ 60 분, 더욱 바람직하게는 110 ~ 130 ℃에서 5 ~ 30 분 처리하는 것으로 판단된다.
실험예 8: 유성분에 의한 항균효과의 간섭여부
종래 항균활성이 뛰어난 것으로 알려진 천연 항균제들은 유제품에 첨가되었을 때 그 항균활성이 급격히 감소한다는 보고가 있었다. 따라서 항균활성을 나타내는 것으로 알려진 우유에서 분리된 천연 항균제인 락토페린, 박테리오신과 실시예 4의 N-아세틸뉴라민산을 함유한 글리코마크로펩티드 가수분해물이 조제유에 첨가되었을 때 항균활성을 나타내는지를 비교하였다. 조제유는 매일유업에서 생산된 멸균조제유(고형분 13%)를 사용하였고, 락토페린은 일본 모리나가에서 제조한 동결건조한 락토페린을, 박테리오신은 LactoPEP을 이용하였으며, 멸균조제유에 접종할 위해미생물로는 엔테로박터 사카자키와 바실러스 세레우스를 이용하였다.
락토페린, 박테리오신 및 이들의 혼합물을 조제유에 혼합했을 때의 엔테로박터 사카자키에 대한 항균활성을 표 7 및 도 22에 나타내었고, 바실러스 세레우스에 대한 항균활성을 표 8 및 도 23에 나타내었다. 증류수에 각각의 균을 접종한 후 30분 경과 후의 균수를 100으로 하여 균수의 변화를 상대적으로 비교한 것으로, 도 22 및 도 23은 모두 각 균 접종 후 18시간 경과 후 플레이트 사진이다.
구분 사카자키균 접종 30분 3시간 18시간
1 증류수 100.0 100.0 882.8
2 50중량% 조제유 100.0 136.6 882.8
3 증류수, 1중량% 락토페린 47.7 0.0 0.0
4 증류수, 1중량% 박테리오신 47.8 3.2 0.0
5 50중량% 조제유, 1중량% 락토페린 100.0 100.0 882.8
6 50중량% 조제유, 1중량% 박테리오신 100.0 100.0 181.4
7 50중량% 조제유, 0.5 중량% 락토페린, 0.5중량% 박테리오신 100.0 100.0 882.8
엔테로박터 사카자키균에 대하여 락토페린과 박테리오신은 1중량%의 농도에서 증류수에서는 30분 배양시부터 뛰어나 항균활성을 나타내지만, 조제유에 첨가되었을 때는 박테리오신은 미약한 항균활성을 나타내고, 락토페린은 거의 항균활성을 나타내지 못하였다. 또한 락토페린과 박테리오신을 1/2씩 첨가한 경우에도 거의 황균활성을 나타내지 못하였다.
구분 세레우스균 접종 30분 3시간 18시간
1 증류수 100.0 149.6 233.6
2 50중량% 조제유 132.8 302.4 1,900.8
3 증류수, 1중량% 락토페린 28.8 80.2 121.9
4 증류수, 1중량% 박테리오신 28.8 0.5 0.0
5 50중량% 조제유, 1중량% 락토페린 125.6 316.8 1,932.8
6 50중량% 조제유, 1중량% 박테리오신 115.2 192.0 1,932.8
7 50중량% 조제유, 0.5 중량% 락토페린, 0.5중량% 박테리오신 131.2 262.4 1,932.8
바실러스 세레우스 균에 대하여 락토페린은 증류수에 1 중량% 첨가되었을 때 초기에 항균활성을 나타내다가 균의 증식을 억제하는 정균효과 정도만 나타내고, 박테리오신은 30분 배양시부터 뛰어나 항균활성을 나타내었다. 그러나, 조제유에 첨가되었을 때는 락토페린, 박테리오신 또는 이들의 혼합물은 거의 항균활성을 나타내지 못하였다.
본 발명의 실시예 4의 N-아세틸뉴라민산을 함유한 글리코마크로펩티드 가수분해물(NANA)을 조제유에 혼합했을 때의 엔테로박터 사카자키에 대한 항균활성을 표 9 및 도 24에 나타내었고, 바실러스 세레우스에 대한 항균활성을 표 10 및 도 25에 나타내었다. 증류수에 각각의 균을 접종한 후 30분 경과 후의 균수를 100으로 하여 균수의 변화를 상대적으로 비교한 것이다.
구분 사카자키균 접종 30분 3시간 18시간
1 증류수 (ES-con.) 100.0 145.0 4,771.0
2 50중량% 조제유 (ES-con(조제유)) 100.0 167.4 3,980.9
3 증류수, 1중량% NANA (ES-1%NANA) 14.3 0.4 0.0
4 50중량% 조제유, 1중량% NANA
(ES-1%NANA+조제유)		 101.3 23.2 0.0
엔테로박터 사카자키에 대하여 실시예 4의 글리코마크로펩티드 가수분해물(NANA)은 조제유에 첨가되었을 때 락토페린이나 박테리오신과 달리 조제유의 간섭효과에도 불구하고 3시간째부터 강력한 항균활성을 나타내었다.
구분 세레우스균 접종 30분 3시간 18시간
1 증류수 (BC-con.) 100.0 100.0 3,846.2
2 50중량% 조제유 (BC-con(조제유)) 0.0 118.6 3,571.4
3 증류수, 1중량% NANA (BC-1%NANA) 0.0 0.0 0.0
4 50중량% 조제유, 1중량% NANA
(BC-1%NANA+조제유)		 0.0 0.0 0.0
바실러스 세레우스에 대하여 실시예 4의 글리코마크로펩티드 가수분해물(NANA)은 조제유에 첨가되었을 때 증류수에 첨가되었을 때와 마찬가지로 30분부터 강력한 항균활성을 나타내었고, 이는 락토페린이나 박테리오신과 달리 조제유의 간섭효과를 전혀 받지 않았음을 의미한다.
실험예 9: 글리코마크로펩티드 가수분해물과 카프릭산 에스터의 항균 상승효과 확인
실시예 4의 글리코마크로펩티드 가수분해물(NANA)과 카프릭산 에스터(Surfactant)의 조합에 따른 항균활성의 상승효과를 확인하기 위해 체커보드 분석을 실시하고 FIC 지수가 0.5 이하인 경우 상승효과가 있는 것으로 판정하였다.
Figure 112011053814119-pat00003
공시균주 O157 대장균(E. coli O157:H7)에 대해 실시예 4의 글리코마크로펩티드 가수분해물(NANA)과 카프릭산 에스터(Surfactant)를 각각의 농도별로 조합하여 확인한 항균활성 결과를 표 11에 나타내었다.
Figure 112011053814119-pat00004
표 11에서 글리코마크로펩티드 가수분해물(NANA)과 카프릭산 에스터(Surfactant) 각각 단독의 MIC는 2.5mg/ml 이고, 혼합물에서의 NANA의 MIC는 0.3125 mg/ml, 그리고 혼합물에서의 Surfactant의 MIC도 0.3125 mg/ml로서 FIC지수는 0.25로서, 글리코마크로펩티드 가수분해물과 카프릭산 에스터의 항균 상승효과를 확인하였다.
실험예 10: 글리코마크로펩티드 가수분해물과 카프릭산 에스터에 의한 구강세균 사멸 효과
글리코마크로펩티드 가수분해물과 카프릭산 에스터에 의한 구강세균 사멸효과를 확인하기 위하여, 침 800 ㎕와 생리식염수에 아래 제제예 2의 과립을 5 중량% 용해시킨 용액 200 ㎕를 혼합한 후 TSA배지에 100㎕ 도말한 후 37 ℃에서 24시간 호기배양 하여 구강세균의 사멸을 확인하였다. 대조군으로 침 800 ㎕에 생리식염수 200 ㎕만 혼합한 것을 사용하였다.
도 26은 생리식염수 또는 제제예 2의 과립을 함유한 생리식염수를 침과 혼합하여 플레이트에 도말한 후의 구강세균의 증식여부를 확인한 사진으로, 좌측은 침과 생리식염수를 혼합하여 도말한 대조군의 사진이고, 가운데는 침과 제제예 2의 과립을 5 중량% 용해시킨 용액을 3분간 혼합한 후 도말한 사진이며, 우측은 침과 제제예 2의 과립을 5 중량% 용해시킨 용액을 18시간 혼합한 후 도말한 사진이다. 침과 제제예 2의 과립은 3분만 혼합되어도 99.9%의 구강세균이 사멸되었음을 확인할 수 있고, 18시간 혼합한 경우 100%의 구강세균이 사멸되었음을 확인할 수 있었다.
하기에 본 발명의 천연 항균제 조성물을 함유하는 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 500 mg 정제의 제조(단위: mg/정)
실시예 4의 글리코마크로펩티드 가수분해물 10,000
카프릭산 에스터 2,500
스테아린산 마그네슘 5,000
HPMC 10,000
이소말트 72,500
결정셀룰로오스 150,000
폴리덱스트로스 250,000
상기의 성분을 혼합한 후 통상의 정제 제조방법에 따라서 타정하여 1정 당 N-아세틸뉴라민산 2.5 mg을 포함하는 500mg 정제(직경 1 cm, 두께 0.5 cm)를 제조한다.
제제예 2. 과립의 제조(단위: 중량%)
실시예 4의 글리코마크로펩티드 가수분해물 20,000
카프릭산 에스터 5,000
스테아린산 마그네슘 10,000
HPMC 20,000
이소말트 145,000
결정셀룰로오스 300,000
폴리덱스트로스 500,000
상기의 성분을 혼합한 후 통상의 과립 제조방법에 따라 물을 분무하면서 1 g당 N-아세틸뉴라민산 5 mg을 포함하는 20 mesh 이하의 과립을 제조한다.

Claims (6)

  1. 아스로박터 우레아파시엔스(Arthrobacter ureafaciens) KCTC 3387에서 분리한 뉴라미니다아제와 글리코마크로펩티드 또는 글리코마크로펩티드 함유 단백질을 반응시켜 제조한 글리코마크로펩티드 가수분해물; 및
    탄소수 6 ~ 12의 중쇄지방산 또는 그 에스터 화합물;을 유효성분으로 하고,
    상기 글리코마크로펩티드 가수분해물은 글리코마크로펩티드 3 ~ 8 중량% 함유하는 반응용액에 글리코마크로펩티드 단위 g 당 0.09 ~ 0.2 U의 뉴라미니다아제를 투입하여 pH 4 ~ 5에서 35 ~ 55 ℃에서 2 ~ 5 시간 반응시켜 제조되는 것으로, N-아세틸뉴라민산을 4 ~ 99 중량% 포함하는 것을 특징으로 하는 천연 항균제 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 탄소수 6 ~ 10의 중쇄지방산 또는 그 에스터 화합물은 카프로익산, 카프릴릭산, 카프릭산, 및 그 에스터 화합물 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 천연 항균제 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 글리코마크로펩티드 가수분해물은 상기 전체 천연 항균제 조성물 중에서 N-아세틸뉴라민산을 기준으로 0.01 ~ 10 중량% 함유하고, 탄소수 6 ~ 10의 중쇄지방산 또는 그 에스터 화합물은 상기 전체 천연 항균제 조성물 중에서 0.01 ~ 10 중량%를 함유하는 것을 특징으로 하는 천연 항균제 조성물.
  6. 영유아에게 섭취될 수 있도록 희석 또는 조제된 형태 100 중량% 중, 청구항 제 1 항, 제 4 항 및 제 5 항 중에서 어느 하나의 천연 항균제 조성물 0.08 ~ 1 중량% 포함된 것을 특징으로 하는 유(乳)성분을 함유하는 영유아용 식품.
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