JP5502449B2 - 腸内フローラバランス改善剤及びその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、腸内フローラバランス改善剤及びその製造方法に係り、詳しくはローヤルゼリーを原料とし、乳酸菌を用いて発酵させることにより得られる腸内フローラバランス改善剤又はその製造方法に関する。

一般に、ローヤルゼリーは、羽化後３〜１５日の雌のミツバチが下咽頭腺及び大腮腺から分泌する分泌物を混合して作るゼリー状の物質で、特有のタンパク質、脂肪酸及びミネラル等が含有されていることが知られている。ローヤルゼリーは、血圧降下作用、抗腫瘍作用、創傷治癒促進、抗菌作用等の種々の生理作用を有していることが知られている。したがって、従来よりローヤルゼリーは、栄養価の高い健康食品のみならず、医薬品、化粧品等の用途にも用いられてきた。

従来より、ローヤルゼリーの機能をより優れたものとするために様々な処理が行われている。例えば、特許文献１，２に開示される方法が知られている。特許文献１は、生ローヤルゼリー又は乾燥ローヤルゼリーに例えば含水エタノールを添加して混合液を調製し、ローヤルゼリー中の可溶性成分を含水エタノール中に溶解させた後、これを濾過して得られるローヤルゼリーエキスの製造方法について開示する。ローヤルゼリーエキスはデセン酸をはじめとするローヤルゼリーに特有な脂肪酸、そのエステルからなる脂質、ローヤルゼリーにのみ含有される特殊な水溶性タンパク質、アミノ酸、糖質、ミネラル等を含有している。

特許文献２は、ローヤルゼリーを微生物で発酵させて得られる発酵物を含有する化粧料について開示する。かかる発酵物は線維芽細胞賦活作用及び細胞内チロシナーゼ活性抑制作用により美肌化効果を向上させる。

特開２０００−６０４５５号公報 特開２００６−２１９４３４号公報

ところで、人の腸内には、数百種の腸内細菌が約１００兆個以上バランスよく生息していることが知られている。腸内細菌としては、有用菌（いわゆる善玉菌）、例えば乳酸菌及びビフィズス菌、有害菌（いわゆる悪玉菌）、例えばクロストリジウム属（ウェルシュ菌）、及び有害物質を産生する大腸菌、並びに日和見菌が知られている。それらの腸内細菌は、腸内において互いにバランスを保ちながら、一種の生態系（腸内フローラ、腸内細菌叢）を形成している。

ところが、老化、疾病、ストレス、環境変化、食生活の変化により腸内フローラのバランスが崩れ、悪玉菌が増えると、腸内腐敗が促進されることがある。それにより、人に有害な物質が腸内で増加し、便秘・下痢症状の発症、免疫機能の低下が生ずる。また、有害物質が腸から吸収されると、心臓、肝臓及び腎臓に負担を与え、老化を促進したり、ガン等の生活習慣病の原因となることがある。

本発明は、ローヤルゼリーを乳酸発酵させたものを摂取することにより、腸内フローラバランスの改善効果が得られることを発見したことに基づくものである。
本発明の目的とするところは、飲食品・医薬品等の様々な用途に利用することができる腸内フローラバランス改善剤及びその製造方法を提供することにある。

上記目的を達成するために、請求項１に記載の発明の腸内フローラバランス改善剤は、ローヤルゼリーを乳酸菌で発酵させて得られる乳酸菌発酵ローヤルゼリーを含有する腸内フローラバランス改善剤であって、前記乳酸菌がストレプトコッカス・フェカリスを含んでなり、前記乳酸菌による発酵前又は発酵と同時にローヤルゼリーに対しバチルス・サブティリス属由来の中性プロテアーゼを用いた酵素処理が行われることを特徴とする。

請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の腸内フローラバランス改善剤において、前記ローヤルゼリーを乳酸菌で発酵処理した後、さらに滅菌処理されることを特徴とする。

請求項３に記載の腸内フローラバランス改善剤の製造方法は、乳酸菌発酵ローヤルゼリーを含有する腸内フローラバランス改善剤の製造方法において、ローヤルゼリーを乳酸菌で発酵させ、前記乳酸菌による発酵前又は発酵と同時にローヤルゼリーに対しバチルス・サブティリス属由来の中性プロテアーゼを用いた酵素処理が行われ、前記乳酸菌がストレプトコッカス・フェカリスを含んでなることを特徴とする。
請求項４に記載の発明は、請求項３に記載の腸内フローラバランス改善剤の製造方法において、前記ローヤルゼリーを乳酸菌で発酵処理した後、さらに滅菌処理されることを特徴とする。
請求項５に記載の医薬品としての腸内フローラバランス改善剤は、ローヤルゼリーを乳酸菌で発酵させて得られる乳酸菌発酵ローヤルゼリーを含有する腸内フローラバランス改善剤であって、前記乳酸菌がストレプトコッカス・フェカリスを含んでなり、前記乳酸菌による発酵前又は発酵と同時にローヤルゼリーに対しバチルス・サブティリス属由来の中性プロテアーゼを用いた酵素処理が行われることを特徴とする。

本発明によれば、飲食品・医薬品等の様々な用途に利用することができる腸内フローラバランス改善剤及びその製造方法を提供することができる。

以下、本発明の腸内フローラバランス改善剤を具体化した実施形態を説明する。
本実施形態の腸内フローラバランス改善剤は、原料としてローヤルゼリーを用い、該ローヤルゼリーを乳酸菌で発酵させて得られる乳酸菌発酵ローヤルゼリーを有効成分として含有する。

原料としてローヤルゼリーとしては、生ローヤルゼリー及び生ローヤルゼリーを凍結乾燥処理等により乾燥させて粉末化したローヤルゼリー粉末のいずれも使用することができる。本実施形態において使用される生ローヤルゼリー及び乾燥ローヤルゼリーの産地は、特に限定されないが、例えば中国、台湾、日本等のアジア諸国、ヨーロッパ諸国、北アメリカ諸国、南アメリカ諸国、及びオセアニア諸国のいずれでもよい。

また、生ローヤルゼリー及び乾燥ローヤルゼリーから選ばれる少なくとも一種より抽出溶媒として低級アルコールを用いて得られる不溶性の分画（不溶性残渣）を発酵処理するための原料として使用してもよい。低級アルコールに不溶性の残渣を発酵原料として使用することにより、投与後の腸内フローラバランス改善作用を高めることができる。この抽出溶媒に不溶性の画分には、主として水溶性タンパク質が高含有されている。抽出溶媒として用いられる低級アルコールとしては、例えばエタノール、メタノール、ブタノール及びプロパノールが挙げられる。これらの低級アルコールを単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。これらの中で、水溶性タンパク質分画の抽出効率、生体に対する適用性等の観点からエタノールが最も好ましい。含水低級アルコールとして例えば含水エタノールが使用される場合、抽出溶媒中におけるエタノールの濃度は、５０〜９９容量％が好ましく、８０〜９９容量％がより好ましく、９０〜９９容量％が最も好ましい。これらの抽出溶媒の添加量は、抽出効率の点から、生ローヤルゼリー及び乾燥ローヤルゼリーから選ばれる少なくとも一種を１重量部に対して１〜１０重量部が好ましく、２〜８重量部がより好ましく、３〜６重量部が最も好ましい。これらの抽出溶媒は、生ローヤルゼリー及び乾燥ローヤルゼリーから選ばれる少なくとも一種とともに混合及び撹拌される。

抽出の温度は、溶媒の揮発を防ぐ点から、１０〜４０℃が好ましく、２０〜３０℃がより好ましい。抽出の時間は、収率の点から、１〜２４時間が好ましく、１．５〜１２時間がより好ましく、２〜６時間がさらに好ましい。得られた抽出物は、溶媒に可溶性の画分と沈殿物からなる不溶性の画分から構成される。これらの可溶性画分と不可溶性画分は、公知の方法、例えば濾過処理、遠心分離、又は静置することにより、容易に分離することができる。

乳酸菌による発酵前又は発酵と同時に原料ローヤルゼリーに対しプロテアーゼを用いた酵素処理を行いローヤルゼリーペプチドを産生させてもよい。かかる酵素処理を行った方が、投与後における腸内の乳酸菌を活性化させ、腸内フローラバランス改善作用をより高めることができる。プロテアーゼを用いた酵素処理は、プロテアーゼを用いてローヤルゼリー中に含有されるタンパク質のペプチド結合を加水分解し、低分子化する処理である。したがって、プロテアーゼとしては、酸性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ及びアルカリ性プロテアーゼのいずれも使用することができる。これらの中で、乳酸菌を活性化させ、腸内フローラバランス改善作用をより高めることができる中性プロテアーゼが好ましい。

中性プロテアーゼとしては、至適ｐＨを中性付近（ｐＨ５．０〜８．５、好ましくはｐＨ６．５〜７．５）に有するプロテアーゼを挙げることができる。中性プロテアーゼには、ペプチドの末端から加水分解するエキソ型プロテアーゼとペプチドの途中から分解するエンド型プロテアーゼとが存在するが、いずれのプロテアーゼも使用することができる。中性プロテアーゼとして、例えば、酵素処理により腸内フローラバランス改善作用の高いバチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）由来の中性プロテアーゼを挙げることができる。

バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）由来の中性プロテアーゼとして、市販品としては、例えばプロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ（アマノエンザイム社製）を使用することができる。プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇは、至適ｐＨは約５．０〜７．０である。また、中性付近に至適ｐＨを有するとともに単独で又は組み合わせることによりプロテアーゼＮ「アマノ」Ｇと同様の部位を切断することができる他の中性プロテアーゼも使用することができる。プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇを用いたタンパク質分解酵素処理は、好ましくは１０〜８０℃、より好ましくは３５〜７５℃、さらに好ましくは４０〜６０℃の条件下で行われる。

中性プロテアーゼを用いたタンパク質分解酵素処理は、ローヤルゼリー、中性プロテアーゼ及び水（又は緩衝液）を含む反応液を、所定条件下でインキュベートすることにより実施される。タンパク質分解酵素処理の処理時間は、反応温度、酵素の力価等により適宜設定されるが、好ましくは０．１〜６時間、より好ましくは０．２〜５時間、さらに好ましくは２〜５時間である。なお、このタンパク質分解酵素処理は、前記インキュベート後の反応液を直ちに８０〜１００℃で３〜６０分間加熱して前記プロテアーゼを失活させることが望ましい。また、オートクレーブを用いて、殺菌処理と同時に酵素を失活させてもよい。

前記反応液には、ローヤルゼリーに起因する粘度上昇を抑えてタンパク質分解酵素処理を迅速に進行させるための溶媒として、水又は緩衝液が含有されている。反応液は、ローヤルゼリーの質量に対して２〜１５倍量、好ましくは２〜１４倍量、より好ましくは３〜１０倍量の水又は緩衝液が含有されていることが望ましい。ローヤルゼリーの質量に対して２倍量未満の溶媒が加えられる場合、ローヤルゼリーに起因する反応液の粘度上昇を十分に抑えることができないため、タンパク質分解酵素処理を迅速に進行させることが困難になる。逆に、ローヤルゼリーの質量に対して１５倍量を超える溶媒が加えられる場合、得られた酵素処理ローヤルゼリーを濃縮する際、多くの時間を要するおそれがある。

発酵に用いられる乳酸菌としては、特に限定されないが、例えば、ストレプトコッカス属、ラクトバチルス属、ビフィドバクテリウム属、ペディオコッカス属、及びリューコノストック属が挙げられる。これらの中で、腸内フローラバランス改善作用に優れる観点から、ストレプトコッカス属、ラクトバチルス属、及びビフィドバクテリウム属が好ましい。ストレプトコッカス属として、例えばストレプトコッカス・フェカリス（Streptococcus.faecalis）が挙げられる。ラクトバチルス属として、例えば、ラクトバチルス・アシッドフィルス（Lactobacillus.acidophilus）が挙げられる。ビフィドバクテリウム属として、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium.longum）が挙げられる。

ローヤルゼリーの発酵処理は、ローヤルゼリー原料を適当な溶媒、例えば水で所定倍率に希釈した溶液に乳酸菌を接種し、所定温度で培養することにより行うことができる。ローヤルゼリー原料の希釈倍率は特に限定されないが、培養液中に含まれるデセン酸の濃度が、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは５ｍＭ以下になるように希釈することが好ましい。デセン酸の濃度が１０ｍＭを超えるとデセン酸の抗菌作用により、乳酸菌の増殖が阻害されるおそれがある。

乳酸菌の培養条件は、乳酸菌の増殖が可能な温度であれば特に限定されないが、好ましくは２０〜４５℃、より好ましくは２５〜４０℃である。培養時間は、培養温度により適宜設定することができるが、好ましくは１〜５日、より好ましくは２〜４日程度が好ましい。培養期間が短いと乳酸菌が十分に増殖することができず、培養期間が長いと乳酸菌の増殖が衰退期に入り発酵処理速度は減少する。培養は、振とう培養でも静置培養でもいずれも用いることができる。

発酵処理後の乳酸菌発酵ローヤルゼリーは、発酵処理液をそのまま飲食品、医薬品等に適用してもよく、溶媒を蒸発させて濃縮処理して適用してもよく、乾燥及び粉末化して適用してもよい。また、発酵処理後の乳酸菌発酵ローヤルゼリーは、乳酸菌が生菌状態で飲食品、医薬品等に適用してもよく、殺菌処理、例えば加熱、煮沸した後に各種用途に適用してもよい。

上記のように得られた乳酸菌発酵ローヤルゼリーは、高い腸内フローラバランス改善作用を発揮する。したがって、それらの作用効果を得ることを目的とした腸内フローラバランス改善剤として適用することができる。具体的な配合形態としては、例えばそれらの作用効果を得ることを目的とした飲食品、医薬品等として適用することができる。

本実施形態の腸内フローラバランス改善剤を飲食品に適用する場合、種々の食品素材又は飲料品素材に添加することによって使用することができる。飲食品の形態としては、特に限定されず、液状、粉末状、ゲル状、固形状のいずれであってもよく、また剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、ドリンク剤のいずれであってもよい。その中でも、吸湿性が抑えられることから、カプセル剤であることが好ましい。前記飲食品としては、その他の成分としてゲル化剤含有食品、糖類、香料、甘味料、油脂、基材、賦形剤、食品添加剤、副素材、増量剤等を適宜配合してもよい。

本実施形態の腸内フローラバランス改善剤を医薬品として使用する場合は、服用（経口摂取）により投与する場合の他、経腸投与等の投与方法を採用することが可能である。本実施形態の腸内フローラバランス改善剤は経口摂取により投与されることが望ましい。剤形としては、特に限定されないが、例えば、散剤、粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、液剤等が挙げられる。また、添加剤として賦形剤、基剤、乳化剤、溶剤、安定剤等を配合してもよい。

本実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
（１）本実施形態において、ローヤルゼリーを乳酸菌で発酵させて得られる乳酸菌発酵ローヤルゼリーは、高い腸内フローラバランス改善作用を発揮する。より具体的には、腸内のいわゆる悪玉菌の数を減少させたり、いわゆる善玉菌の数を増加させることにより腸内環境を整えることができる。したがって、腸内フローラバランス改善作用の発揮を目的とした腸内フローラバランス改善剤として、飲食品及び医薬品等の分野に好ましく適用することができる。

（２）本実施形態の腸内フローラバランス改善剤は、優れた腸内フローラバランス改善作用を発揮する。したがって、腸内フローラバランスが崩れた場合に生ずる各種症状、例えば便秘・下痢症状の発症、免疫機能の低下を改善することができる。また、いわゆる悪玉菌由来の有害物質が腸から吸収された場合に生ずる心臓、肝臓及び腎臓への負担、老化促進、ガン等の生活習慣病の発症を予防することができる。それにより、本実施形態の腸内フローラバランス改善剤は、美容と健康に貢献することができる。

（３）本実施形態において、好ましくは、乳酸菌としてストレプトコッカス属、ラクトバチルス属、及びビフィドバクテリウム属から選ばれる少なくとも一種が用いられる。したがって、腸内フローラバランス改善作用をより向上させることができる。

（４）本実施形態において、好ましくは、乳酸菌としてストレプトコッカス・フェカリス、ラクトバチルス・アシッドフィルス、及びビフィドバクテリウム・ロンガムから選ばれる少なくとも一種が用いられる。したがって、腸内フローラバランス改善作用をさらに向上させることができる。

（５）本実施形態において、好ましくは、乳酸菌による発酵前又は発酵と同時にローヤルゼリーに対しプロテアーゼを用いた酵素処理が行われる。したがって、腸内フローラバランス改善作用をより向上させることができる。

（６）本実施形態において、好ましくは、乳酸菌による発酵前又は発酵と同時にローヤルゼリーに対しバチルス・サブチルス属由来の中性プロテアーゼを用いた酵素処理が行われる。したがって、腸内フローラバランス改善作用をさらに向上させることができる。

（７）本実施形態の腸内フローラバランス改善剤は、原料としてローヤルゼリーが用いられる。したがって、タンパク質、ビタミン、ミネラル、アミノ酸、脂肪酸等の成長に必要な栄養素の摂取も期待することができる。また、ローヤルゼリー由来の生理作用、例えば免疫機能の向上、滋養強壮の他、神経痛、肝炎、更年期障害、及び骨粗しょう症の改善作用の発揮も摂取により期待することができる。

なお、上記実施形態は以下のように変更してもよい。
・上記実施形態における酵素処理ローヤルゼリーは、ヒトが摂取する飲食品及び医薬品等に対して適用することができるのみならず、家畜の飼料にサプリメント、栄養補助食品、医薬品等として配合してもよい。

以下に実施例を挙げ、前記実施形態をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（ローヤルゼリーペプチドの調製）
まず中国産生ローヤルゼリー（固形分３０質量％）１０ｇに精製水９０ｇを加えて（１０倍希釈）スターラーで撹拌した。次に、この溶液を５０℃に加温した後、食品添加用の水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７．０に調整した後、プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ（アマノエンザイム社製）を３０ｍｇ（生ローヤルゼリー固形分に対し１質量％）加え、５０℃で４時間、酵素反応を行なった。反応後、オートクレイブ（１２１℃、２０分）にて酵素活性（プロテアーゼＮ）の失活及び滅菌を行ない、乳酸菌発酵に用いるローヤルゼリーペプチド溶液を得た。

（ローヤルゼリーペプチドの乳酸菌発酵試料の調製法）
（実施例１）
活性乳酸菌１００（アマノエンザイム社製）は、ストレプトコッカス・フェカリス（Streptococcus.faecalis）を純粋培養し、凍結乾燥し、粉末化したもので乳酸菌４３質量％、賦形剤として馬鈴薯澱粉５７質量％から成る乳酸菌製剤である。

上記ローヤルゼリーペプチドの乳酸菌発酵試料への馬鈴薯澱粉の混入を極力避けるために、まず活性乳酸菌１００を滅菌精製水で懸濁後、静置し、水に不溶な馬鈴薯澱粉の沈殿を除き、上清のストレプトコッカス・フェカリス（Streptococcus.faecalis）懸濁液を得た。この菌懸濁液と上記ローヤルゼリーペプチド溶液を混ぜ合わせて、最終濃度：固形分約８ｍｇ／ｍＬ（生ローヤルゼリー４０倍希釈）、デセン酸２．５ｍＭとした。そして、２７℃、３日間培養した。

培養液のｐＨ及び乾燥重量は、それぞれ培養前がｐＨ６．２と１．４ｇ、培養後がｐＨ４．２と１．７ｇであった。この培養液のｐＨ低下及び乾燥重量の増加から、ローヤルゼリーペプチドと微量の馬鈴薯澱粉を含む本培養条件において、ストレプトコッカス・フェカリス（Streptococcus.faecalis）の増殖（乳酸菌発酵）が行なわれていることを裏付けている。菌数においては培養前では７．１×１０^７個／ｍＬ、培養後では１．１×１０^７個／ｍＬと減少し、菌の増殖は衰退期に入っていることが予想される。培養前・後の試料は煮沸処理により殺菌後、凍結乾燥により粉末化した。粉末化した試料を滅菌水で２ｍｇ／ｍＬに調整したものと実施例１として使用した。

（参考例２）
アシドフィルス「アマノ」１００（アマノエンザイム社製）はラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus.acidophilus）を純粋培養し、凍結乾燥し、粉末化したもので乳酸菌１０質量％、賦形剤として馬鈴薯澱粉９０質量％から成る乳酸菌製剤である。

上記ローヤルゼリーペプチドの乳酸菌発酵試料への馬鈴薯澱粉の混入を極力避けるために、まずアシドフィルスを滅菌精製水で懸濁後、静置し、水に不溶な馬鈴薯澱粉の沈殿を除き、上清のラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus.acidophilus）懸濁液を得た。この菌懸濁液と上記ローヤルゼリーペプチド溶液を混ぜ合わせて、最終濃度：固形分約８ｍｇ／ｍＬ（生ローヤルゼリー４０倍希釈）、デセン酸２．５ｍＭとした。菌懸濁液と上記ローヤルゼリーペプチド溶液との混合液中の菌数は、１．４×１０^８個／ｍＬであった。そして、２７℃、３日間培養した。培養液のｐＨ及び乾燥重量は、それぞれ培養前がｐＨ６．１と１．７ｇ、培養後がｐＨ４．５と２．３ｇであった。この培養液のｐＨ低下及び乾燥重量の増加から、ローヤルゼリーペプチドと微量の馬鈴薯澱粉を含む本培養条件において、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus.acidophilus）の増殖
（乳酸菌発酵）が行なわれているものと推認される。菌数においては培養前では１．４×１０^８個／ｍＬ、培養後では３．５×１０^６個／ｍＬと減少し、菌の増殖は衰退期に入っていることが予想される。培養前・後の試料は、煮沸処理により殺菌、凍結乾燥により粉末化した。粉末化した試料を滅菌水で２ｍｇ／ｍＬに調整したものと参考例２として使用した。

（実施例３）
活性乳酸菌１００、アシドフィルス「アマノ」１００、及びビフィズス「アマノ」１００（ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium.longum）を純粋培養し、凍結乾燥し、粉末化したもので乳酸菌２０質量％、賦形剤として馬鈴薯澱粉８０質量％から成る乳酸菌製剤、アマノエンザイム社製）を１：１：１で混合した。次に、滅菌精製水で懸濁後、静置し、水に不溶な馬鈴薯澱粉の沈殿を除き、上清のストレプトコッカス・フェカリス（Streptococcus.faecalis）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus.acidophilus）、及びビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium.longum）の乳酸菌３種の懸濁液を得た。この菌懸濁液と上記ローヤルゼリーペプチド溶液を混ぜ合わせて、最終濃度：固形分約８ｍｇ／ｍＬ（生ローヤルゼリー４０倍希釈）、デセン酸２．５ｍＭとした。菌懸濁液と上記ローヤルゼリーペプチド溶液との混合液中の菌数は、１．４×１０^８個／ｍＬであった。そして、２７℃、３日間培養した。培養液のｐＨ及び乾燥重量は、それぞれ培養前がｐＨ５．６と２．６ｇ、培養後がｐＨ４．０と２．８ｇとなり、培養液のｐＨ低下及び乾燥重量の増加から、ローヤルゼリーペプチドと微量の馬鈴薯澱粉を含む本培養条件において，乳酸菌の増殖（乳酸菌発酵）が行なわれているものと推認される。菌数においては培養前では１．８×１０^８個／ｍＬ、培養後では９．３×１０^７個／ｍＬと減少し、菌の増殖は衰退期に入っていることが予想される。培養前・後の試料は、煮沸処理により殺菌後、凍結乾燥により粉末化した。粉末化した試料を滅菌水で２ｍｇ／ｍＬに調整したものと実施例３として使用した。

（比較例１）
中国産の生ローヤルゼリー（固形分３０質量％）を凍結乾燥により粉末化したものを滅菌水に溶解し、２ｍｇ／ｍＬに調整したものと比較例１として使用した。

（比較例２）
上記ローヤルゼリーペプチド溶液を滅菌水で２ｍｇ／ｍＬに調整したものと比較例２として使用した。

（比較例３）
実施例１の対照として、実施例１において使用したストレプトコッカス・フェカリス（Streptococcus.faecalis）懸濁液と上記ローヤルゼリーペプチドを混合後、すぐに煮沸処理し、凍結乾燥により粉末化した試料を滅菌水で２ｍｇ／ｍＬに調整したものと比較例３として使用した。

（比較例４）
参考例２の対照として、参考例２において使用したラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus.acidophilus）懸濁液と上記ローヤルゼリーペプチドを混合後、すぐに煮沸処理し、凍結乾燥により粉末化した試料を滅菌水で２ｍｇ／ｍＬに調整したものと比較例４として使用した。

（比較例５）
実施例３の対照として、実施例３において使用した乳酸菌３種の懸濁液と上記ローヤルゼリーペプチドを混合後、すぐに煮沸処理し、凍結乾燥により粉末化した試料を滅菌水で２ｍｇ／ｍＬに調整したものと比較例５として使用した。

＜腸内フローラバランスの改善効果の確認試験＞
（実験に使用した動物）
ＢＡＬＢ／ＣＮマウス（オス、５週齢）約２０ｇを使用した。

（試料投与法）
各例の試料溶液（２ｍｇ／ｍＬ）をピペットチップを用いて、それぞれマウスに１日１回、１０ｍｇ／ｋｇ量（４０μｇ／２０μＬ／２０ｇ−マウス）を５日間経口投与した。コントロールとして滅菌水（２０μＬ／２０ｇ−マウス）を投与した。

（糞便の採取）
５日目の投与から２４時間後にマウスをクリーンボックスに入れ、排泄した糞便をＣＯ_２充填チューブに約１００ｍｇ（糞便５〜６個）を無菌的に採取した。採集後、すぐに糞便の質量を測定した。嫌気性菌が大部分を占める腸内細菌にとって酸素は毒であり、腸内細菌を分離する実験においては、ＣＯ_２還流下における処理や酸素吸着剤等を用いて、嫌気的条件下で実験を行なった。

（糞便希釈系列の作成）
糞便に滅菌精製水１０ｍＬを加え、均一になるまで撹拌し、１０^−４〜１０^−６の糞便希釈液を調製した。操作はすべてＣＯ_２還流下、グローブボックス内で嫌気的に行なった。

（腸内細菌分離判定培地の調製）
腸内細菌の中で、乳酸菌、クロリストリジウム属、大腸菌等を判別する培地（調製培地）を用いた。各培地を精製水に溶解しオートクレーブ後、無菌的に内径１０ｃｍシャーレに２０ｍＬずつ分注し、平板培地を作成した。

乳酸菌の菌数測定用培地として、ＢＣＰ加プレートカウント寒天培地を使用した。組成は、０．２５質量％酵母エキス、０．５質量％ペプトン、０．１質量％ブドウ糖、０．０１質量％Ｌ−システイン、０．１質量％ツイーン８０、０．００４質量％ブロムクレゾールパープル（ＢＣＰ）、１．５質量％寒天（ｐＨ６．９）である。

クロストリジウム属判定用培地として、卵黄加ＣＷ寒天培地を使用した。組成は、０．５質量％酵母エキス、５質量％コウシ脳浸出液、６．５質量％ウシ心臓浸出液、１．５質量％ペプトン、１質量％乳糖、０．５質量％塩化ナトリウム、０．００５質量％フェノールレッド、１．５質量％寒天（ｐＨ７．６）、５％（ｖ／ｖ）卵黄乳液（ＣＷ寒天培地をオートクレーブ後、５０℃に保温し添加した）である。

大腸菌及びサルモネラ等選択鑑別用培地として、ＤＨＬ寒天培地を使用した。組成として、１質量％カゼインペプトン、１質量％肉ペプトン、０．３質量％肉エキス、１質量％ラクトース、１質量％スクロース、０．０２質量％Ｌ−システイン、０．１５質量％デソキシコレート、０．１質量％クエン酸ナトリウム、０．２質量％チオ硫酸ナトリウム、０．１質量％クエン酸鉄アンモニウム、０．００３質量％ニュートラルレッド、１．５質量％寒天（ｐＨ７．２）である。

（糞便希釈液の接種）
１０^−４〜１０^−６の糞便希釈液５０μＬを３種の平板培地に添加し、スプレッターで平板培地上に広げた後、酸素吸着剤を入れたボックス（嫌気培養システム：アネロパック・ケンキ、三菱化学社製）に平板培地を入れ、恒温槽内で３７℃、２日間培養した。

（菌の判定方法）
ＢＣＰ加プレートカウント寒天培地（乳酸菌の菌数測定用培地）は、生じたコロニー（菌の集落）の周りの色が黄変したコロニーを乳酸菌と判定し、コロニー数を計数した。希釈倍数を掛け、糞便１ｇ当たりの菌数を求めた。

卵黄加ＣＷ寒天培地（クロストリジウム属判定用培地）は、生じたコロニー（菌の集落）の周りが黄〜橙色に変化したコロニーをクロストリジウム属と判定し、コロニー数を計数した。希釈倍数を掛け、糞便１ｇ当たりの菌数を求めた。

ＤＨＬ寒天培地（大腸菌、サルモネラ等選択鑑別用培地）は、生じたコロニー（菌の集落）が赤色のものを大腸菌、黒色のものをサルモネラと判定し、コロニー数を計数した。希釈倍数を掛け、糞便１ｇ当たりの菌数を求めた。実験においてサルモネラの黒色コロニーは認められなかった。

各結果を表１，２に示す。表１は、糞便１ｇ中の細菌数、及び各菌においてコントロールの細菌数を１００とした場合の比率（％）を示す。表２は、表１に示される各試料を投与したマウスの糞便１ｇ中のクロストリジウム属、大腸菌及び乳酸菌の各菌数の合計を１００としたときの各細菌の割合を示す。腸内細菌叢の改善効果の目安として、いわゆる悪玉菌であるクロストリジウム属及び大腸菌の減少といわゆる善玉菌である乳酸菌の増加が挙げられる。

比較例１の生ローヤルゼリーを投与したマウスの糞便１ｇ中の細菌数（クロストリジウム属、乳酸菌）は、コントロール（水投与）マウスの約１／２となり、全般的な腸内細菌の減少を起こしていることが確認される。これは、生ローヤルゼリー中の抗菌物質であるデセン酸の影響によるものと思料される。この抗菌物質の作用は酵素処理ローヤルゼリー、乳酸菌との培養（発酵）前後においてもみられる。

比較例２の酵素処理ローヤルゼリー（ローヤルゼリーペプチド）投与により、乳酸菌の菌数が比較例１の生ローヤルゼリーに対し約１．５倍増加していることが確認される。酵素処理ローヤルゼリー（ローヤルゼリーペプチド）には乳酸菌の活性化作用があるものと思料される。

実施例１，参考例２に示されるように、それぞれ発酵処理前の比較例３，４と比べ、いわゆる悪玉菌であるクロストリジウム属細菌の減少がみられる。また、参考例２に示されるように、発酵処理前の比較例４と比べ、乳酸菌を約１．５倍に増加させた。また、実施例３の乳酸菌３種による発酵物について、クロストリジウム属細菌の顕著な抑制効果がみられ、発酵処理前の比較例５に比べて約１／５、コントロールに比べて約１／６に減少させた。また、大腸菌の減少効果もみられた。

実施例３の乳酸菌３種の乳酸発酵物は、マウス腸内細菌叢の内、いわゆる悪玉菌であるクロストリジウム属細菌及び大腸菌を大幅に減少させた。クロストリジウム属細菌や大腸菌は便秘や大腸での腫瘍発生率を高めるため、乳酸菌３種の乳酸発酵物の摂取により、便秘の改善や大腸がんの予防が期待できる。

表２に示すようにコントロール（水投与）においては、クロストリジウム属約４６％、乳酸菌約５４％、大腸菌がわずかにみられる。比較例１の生ローヤルゼリー投与の場合、クロストリジウム属と乳酸菌の割合は変化がなかった。比較例２の酵素処理ローヤルゼリー（ローヤルゼリーペプチド投与の場合、乳酸菌及び大腸菌の割合がコントロールと比べて増加し、クロストリジウム属の割合が減少している。各実施例の乳酸菌による培養（発酵）後及び対応する各比較例を比較すると、いずれも各実施例の場合、乳酸菌の割合が増加し、クロストリジウム属の割合が減少していることが確認される。特に乳酸菌３種による発酵物の腸内細菌叢の改善効果が顕著であった。以上により、ローヤルゼリーの乳酸菌発酵物が腸内細菌叢を改善することが確認された。

次に、上記実施形態及び別例から把握できる技術的思想について、以下に追記する。（ａ）前記乳酸菌による発酵に用いられるローヤルゼリーは、ローヤルゼリー原塊から低級アルコール又は含水低級アルコールで抽出した後の残渣であることを特徴とする前記腸内フローラバランス改善剤。

Claims (5)

1. ローヤルゼリーを乳酸菌で発酵させて得られる乳酸菌発酵ローヤルゼリーを含有する腸内フローラバランス改善剤であって、
   前記乳酸菌がストレプトコッカス・フェカリスを含んでなり、
   前記乳酸菌による発酵前又は発酵と同時にローヤルゼリーに対しバチルス・サブティリス属由来の中性プロテアーゼを用いた酵素処理が行われることを特徴とする腸内フローラバランス改善剤。
2. 前記ローヤルゼリーを乳酸菌で発酵処理した後、さらに滅菌処理されることを特徴とする請求項１に記載の腸内フローラバランス改善剤。
3. 乳酸菌発酵ローヤルゼリーを含有する腸内フローラバランス改善剤の製造方法において、ローヤルゼリーを乳酸菌で発酵させ、前記乳酸菌による発酵前又は発酵と同時にローヤルゼリーに対しバチルス・サブティリス属由来の中性プロテアーゼを用いた酵素処理が行われ、前記乳酸菌がストレプトコッカス・フェカリスを含んでなることを特徴とする腸内フローラバランス改善剤の製造方法。
4. 前記ローヤルゼリーを乳酸菌で発酵処理した後、さらに滅菌処理されることを特徴とする請求項３に記載の腸内フローラバランス改善剤の製造方法。
5. ローヤルゼリーを乳酸菌で発酵させて得られる乳酸菌発酵ローヤルゼリーを含有する腸内フローラバランス改善剤であって、
   前記乳酸菌がストレプトコッカス・フェカリスを含んでなり、
   前記乳酸菌による発酵前又は発酵と同時にローヤルゼリーに対しバチルス・サブティリス属由来の中性プロテアーゼを用いた酵素処理が行われることを特徴とする医薬品としての腸内フローラバランス改善剤。