KR101266652B1

KR101266652B1 - 하이드로젤을 이용한 세포 패터닝 및 전달 방법 및 이를 이용한 세포 기반 바이오센서

Info

Publication number: KR101266652B1
Application number: KR1020110106977A
Authority: KR
Inventors: 김태성; 최운선
Original assignee: 국립대학법인 울산과학기술대학교 산학협력단
Priority date: 2011-10-19
Filing date: 2011-10-19
Publication date: 2013-05-22
Also published as: US9869616B2; WO2013058572A2; WO2013058572A3; KR20130042857A; US20140242632A1

Abstract

본 발명은 하이드로젤을 이용한 세포 패터닝 및 전달 방법(HPT) 및 이를 이용한 세포 기반 바이오센서에 관한 것으로, 상기 HPT 방법에 따르면, 패터닝 되어진 세포의 분비 물질, 세포 내에서 발현된 단백질의 양을 정량 분석할 수 있으며, 적은 양의 세포 및 생체 분자들을 마이크로미터 크기의 개별적인 공간에 정확하게 고정(cell patterning)함으로써 실시간 세포 상태 모니터링과 고효율(high-throughput) 스크리닝이 가능하므로, 결과적으로 세포 기반 바이오센서가 분석, 진단 및 신약개발 시 소요되는 비용 및 노동력 절감과 대량 검색의 효율성에 크게 기여할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 바이오센서는 세포간 신호 평가 및 다분석물 바이오센서로서 활용 가능하다.

Description

하이드로젤을 이용한 세포 패터닝 및 전달 방법 및 이를 이용한 세포 기반 바이오센서{Hydrogelencapsulated cell pattering and transferring method and cell based biosensor using the same}

본 발명은 하이드로젤을 이용한 세포 패터닝 및 전달 방법 및 이를 이용한 세포 기반 바이오센서에 관한 것이다.

세포 패터닝은 마이크로미터 수준으로 여러 세포들을 특정한 위치에 고정시키는 작업으로서 세포-세포, 세포-표면, 세포-매트릭스 사이의 상호작용과 같은 기본적인 세포생물학을 연구하는데 필요한 모델 시스템을 제공해 줄 수 있을 뿐만 아니라, 세포 센서를 제조하는 데도 필요한 기술이다. 즉, 최근 들어 세포 센서가 분석, 진단 및 신약 개발 시 소요되는 비용의 절감과 고효율성을 위한 대량 검색(high throughput screening)의 필요성이 강조되면서 세포 패터닝을 이용하여 세포 센서를 어레이(array)화 및 소형화(miniaturization)하고자 하는 노력이 활발히 진행 중이다.

마이크로패터닝화 된 세포 어레이는 기존의 MEMS(micro electro mechanical system)란 반도체 공정기술을 바이오/의료분야의 요구에 맞게 적용하여 제조되는데 현재까지는 금속이나 플라스틱과 같은 2차원 표면을 포토리소그래피(photolithography)와 소프트 리소그래피(soft lithography)를 이용하여 마이크로패터닝한 후 패터닝된 표면 위에서 세포의 선택적 부착(adhesion) 및 성장(growth)을 제어하여 세포 어레이를 만드는 방법이 가장 널리 사용되고 있다.

한편, 세포 패터닝 기술과 함께 세포 패터닝된 기판을 다른 기판으로 이식하는 전달 기술은 펩타이드나 생체 고분자 또는 DNA 등을 재료로 대량의 샘플 배열(array)이 필요한 DNA 칩이나 단백질 칩 제작, 유전적 질환의 선별검사, 단백질 간의 상호 작용 연구와 신약 개발 등에 기여할 수 있으며, 이를 기반으로 하여 세포나 생체 분자를 표면에 패터닝하는 기술은 세포생물학, 항균제 스크리닝, 항균 모니터링, 조직 공학 등 다양한 분야에 적용될 수 있지만, 아직까지 패터닝된 세포의 다른 기판으로의 전달 기술에 대한 연구는 미흡한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 세포 패터닝 및 이를 다른 기판으로 전달하는 방법에 관하여 연구노력한 결과, 알지네이트 하이드로젤을 포함한 하이드로젤-캡슐화된 세포 패터닝을 갖는 기판을 아가로즈 하이드로젤 기판 상으로 세포 패터닝을 전달할 수 있다는 것을 밝혀냄으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 세포 패터닝과 함께 상기 세포 패터닝을 다른 기판으로 전달하는 방법을 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 방법을 이용하여 세포 기반 바이오센서를 개발하는데 필요한 플랫폼 기술을 제공하는 데에 있다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 제1세포와 알지네이트 하이드로젤을 포함한 하이드로젤-캡슐화된 세포 패터닝을 갖는 기판을 제작하는 단계; 제2세포 또는 생리활성물질 중 어느 하나와 아가로즈 하이드로젤을 포함한 아가로즈 하이드로젤 기판을 제작하는 단계; 및 상기 하이드로젤-캡슐화된 세포 패터닝을 갖는 기판을 상기 아가로즈 하이드로젤 기판 상에 배치시키고, 세포 패터닝을 전달하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 하이드로젤을 이용한 세포 패터닝 및 전달 방법(hydrogel-encapsulated cell patterning and transferring method; HPT)을 제공한다.

상기 하이드로젤-캡슐화된 세포 패터닝을 갖는 기판은, 소프트 식각(soft lithography) 기술을 이용하여 기판 상에 감광수지를 갖는 몰드를 제작하는 단계; 상기 몰드에 반대되는 상을 가지는 몰드를 제작한 후, 고분자를 부어 열처리하여 고분자 몰드를 제작하는 단계; 알지네이트 하이드로젤 용액과 혼합된 세포를 상기 고분자 몰드에 채우는 단계; 상기 고분자 몰드를 기울여 불필요한 용액을 제거하는 단계; 및 얻어진 알지네이트 하이드로젤 패턴을 칼슘 용액에 담구어 젤화시키는 단계를 포함하여 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 상기 고분자 몰드를 제작한 후, 산소 플라즈마를 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 상기 기판은 실리콘, 유리 및 메타크릴레이트수지(PMMA)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니며 일반적으로 널리 쓰이는 기판 소재군이 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 상기 감광수지는 일반적인 리소그래피공정에 사용되는 감광수지 중에서 어느 하나를 선택할 수 있으며, 예를들어 SU-8를 사용할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 상기 고분자는 폴리디메틸실록산(PDMS) 등일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니며 다른 고분자도 사용 가능하다.

상기 알지네이트 하이드로젤 용액과 혼합된 세포를 상기 고분자 몰드에 부어 100 ㎛ 내지 1000 ㎛ 범위의 길이를 갖도록 채울 수 있다.

본 발명에서 사용되는 상기 제1세포 및 제2세포는 상피 세포, 신경 세포, 표피세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌 세포, 연골세포, 림프구(B 및 T 림프구), 적혈구, 대식세포, 단핵구, 단핵 세포, 섬유모세포, 심근 세포 및 다른 근육 세포로 이루어진 군에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 상기 생리활성물질은 아세틸호모세린 락톤(AHL), 이소프로필-베타-D-치오갈락토피라노시드(IPTG), 테트라사이클린, 아라비노즈 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 제1세포와 알지네이트 하이드로젤을 포함한 하이드로젤-캡슐화된 세포 패터닝을 갖는 제1기판; 및 제2세포 또는 생리활성물질 중 어느 하나와 아가로즈 하이드로젤을 포함한 아가로즈 하이드로젤 제2기판을 포함하는 바이오센서를 제공한다.

이때, 제1기판의 세포 패터닝이 제2기판 상으로 전달되어 형성될 수 있다.

본 발명의 HPT 방법에 따르면, 패터닝 되어진 세포의 분비 물질, 세포 내에서 발현된 단백질의 양을 정량 분석할 수 있으며, 적은 양의 세포 및 생체 분자들을 마이크로미터 크기의 개별적인 공간에 정확하게 고정(cell patterning)함으로써실시간 세포 상태 모니터링과 고효율(high-throughput) 스크리닝이 가능하므로, 결과적으로 세포 기반 바이오센서가 분석, 진단 및 신약개발 시 소요되는 비용 및 노동력 절감과 대량 검색의 효율성에 크게 기여할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 바이오센서는 세포간 신호 평가 및 다분석물 바이오센서로서 활용 가능하다.

도 1은 본 발명에 따른 하이드로젤 패터닝 및 전달 방법(HPT)를 위한 미세제작 공정을 나타낸 것이고,
도 2의 a 내지 c는 각각 알지네이트 하이드로젤 캡슐화된 세포의 모니터링 결과이고,
도 3의 a 내지 d는 각각 알지네이트 하이드로젤 캡슐화된 세포의 패터닝 및 전달 특성을 나타낸 것이고,
도 4의 a 내지 d는 각각 본 발명에 따른 HPT를 이용한 세포외 유도를 통한 세포의 반응(유전자 발현 수준)의 정량 분석 결과이고,
도 5의 a 내지 c는 각각 본 발명에 따른 HPT를 이용한 2개의 유전자 회로를 가지는 세포를 이용한 다중 외부 물질 탐지 및 유전자 간의 상호간섭을 정량 분석한 결과이고, d는 본 발명에 따른 HPT에서 사용된 아가로즈 겔 입자층을 나타낸 것이고,
도 6의 a 내지 d는 각각 본 발명에 따른 HPT를 이용한 다양한 농도의 유도제 하에서 세포외 유전자 발현을 분석한 것이고,
도 7의 a 내지 c는 각각 본 발명에 따른 HPT를 이용한 세포 교신을 분석한 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 HPT 방법 및 상기 HPT 방법을 이용한 세포 기반 바이오센서 개발에 관한 것으로서, 탐지하고자 하는 타겟 물질(세포 포함)을 하이드로젤과 혼합하여 기판 형태로 제작하고, 이렇게 제작된 기판 위에 패턴닝된 세포를 부착하여 세포의 반응을 관찰함으로써, 기판에 섞여있는 타겟 물질(세포 포함)을 세포로 판별하는 세포 기반 바이오센서에 관한 것이다.

본 발명의 바이오센서는, 보다 상세하게는 하이드로젤을 이용한 센서의 기판(agarose hydrogel)과 하이드로젤 마이크로입자(alginate hydrogel microparticle)를 이용한 세포의 패터닝 및 전달 기술을 이용하여 마이크로미터 수준으로 세포 및 생리활성물질들을 특정한 위치에 고정시킬 수 있다.

상기 하이드로젤 기판은 여러 화학물질의 농도 구배를 형성할 수 있고, 세포가 반응하는 물질(inducer) 및 독성 물질 등과 같은 화학물질의 종류와 농도에 따른 세포의 반응 파악이 가능하다.

상기 하이드로젤 마이크로입자(microparticle)를 이용한 세포의 패터닝 및 전달 방법은 포토리소그래피가 특정 구조물을 반복적으로 똑같이 만들 수 있다는 장점에 생물 실험에 적합한 고분자를 결합하여 미세구조물을 제작하는 소프트 리소그래피(soft lithography)를 사용할 수 있다.

예를들어, 정밀레이저 프린터로 그림을 투명한 필름에 출력하여 마스크를 만들고, 상기 마스크에 UV를 조사하여 실리콘 표면에 미리 코팅한 감광수지 (photo-sensitive negative polymer)에 그림의 이미지가 전달되도록 하여 프린터의 그림과 반대되는 상을 가지는 몰드를 만들고, 이와 같이 제작되어진 틀에 PDMS (polydimethyl siloxane)을 부어서 65 ℃에서 열처리하면 PDMS 몰드가 만들어지고, 여기에 알지네이트 하이드로젤 마이크로입자(microparticle)를 만들어 다양한 패턴을 생성할 수 있다.

본 발명에 따른 세포 패터닝 방법은 3차원 구조의 하이드로젤 마이크로패턴 내부에 세포를 고정하는 즉, 세포 캡슐화(cell encapsulation) 기술과 미세가공기술을 결합하여 새로운 세포 패터닝 방법을 개발한 것이다.

한편, 본 발명에서 사용된 하이드로젤은 불수용성의 친수성 3차원 고분자 네트워크 구조를 가진 물질로, 수용액 상에서 다량의 물을 내부에 함유하여 팽윤할 수 있는 특징을 가지며, 다량의 물을 함유한 상태의 하이드로젤은 생체의 조직과 매우 유사한 성질을 보유하기 때문에 생체재료로 사용할 때 주변의 세포 또는 조직에 미치는 영향을 최소화 할 수 있다.

그리고, 하이드로젤의 투명한 특성은 다양한 광학적 분석 방법을 가능하게 하는데, 효소가 결합된 하이드로젤에 형광물질을 첨가할 경우 하이드로젤 내부에서 일어나는 생화학 반응들을 감지할 수 있다.

본 발명에서 제조된 하이드로젤의 물 함유량은 세포들이 존재하는 실제 신체조직과 비슷하게 70~80%로 조절될 수 있으며, 다양한 단백질 또는 생리활성물질들을 하이드로젤과 결합시켜 세포들이 자랄 수 있는 최적의 조건을 만들어 줄 수 있다.

도 4에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 HPT 방법은 다양한 균주 내 다양한 유전자 회로의 거동/발현 수준을 정확하게 분석하는 데에 매우 유용할 뿐 아니라, 약물, 독성, 항생제 등에 대한 세포의 세포외 반응에 대한 연구에도 유용하게 적용될 수 있다. 또한, 도 5에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 HPT 방법은 2개의 유전자 회로를 가지는 세포를 이용한 다중 외부 물질 탐지 및 유전자 간의 상호간섭을 정량적으로 분석할 수 있다. 또한, 도 6에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 HPT 방법은 유전자 회로의 유도제 농도 의존적 유전자 발현을 정량할 뿐 아니라, 다양한 농도의 유도제 하의 상호간섭을 분석할 수 있다. 그리고, 도 7에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 HPT 방법은 2개의 공생적으로 제조된 세포 간의 세포 대 세포 교신의 분석을 가능하게 한다.

이하, 하기 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하도록 한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 대장균 균주, 플라스미드 및 배양 조건

표 1과 같이 두가지 유형의 대장균 균주 MG1655 및 DH10B를 사용하여 이하의 실험을 수행하였다. MG1655 및 DH10B의 수용세포는 합성 공학적 유전자 회로로 형질전환 되었다. 몇몇 플라스미드는 표준 생물학 부품 등록부(Registry of Standard Biological Parts; )로부터 가져와 사용하였으며, 다른 플라스미드는 다른 항생제 저항성 마커 유전자와 함께 본 발명에서 설계하였다. 이러한 균주들의 성장을 위하여, 각 대장균 배양물을 적절한 항생제를 포함한 M9 아가 고체배지 플레이트 상 35℃에서 밤새도록 배양시켰다. 단일 콜로니를 이용하여 1% 글루코오스, 1% 트립톤 및 100 ㎍/mL 암피실린 또는 30 ㎍/mL 클로람페니콜 중 어느 하나를 포함한 5 mL M9 배지에 접종하였다. 그후, 이러한 배양물을 격렬하게 통기시키면서(로터리 교반기에서 200 rpm) 밤새도록(16 시간) 배양하고, OD₆₀₀ = 1.5-2인 세포 배양물(1-2 mL)을 5,000 rpm에서 5분 동안 초음파 처리하였다. 얻어진 펠렛을 신선한 M9 배지로 재현탁하여 원하는 세포 밀도를 갖는 박테리아 현탁액을 준비하였다.

균주/플라스미드		상세설명/유전자형	참조/기원
균주	E. coli MG1655	야생형	Anal Chem 2010; 82: 2900-6
	E. coli DH10B	F-mcrAΔ(mrr-hsdRMS mcrBC)	Life Technology
		Φ80dlacZΔM15ΔlacX74deoR
		recA1 araΔ139 Δ(ara leu)7697
		galU galK λ^-rpsL endA1 nupG Str^r
플라스미드	pTKU4-2	Cm^r; pBR322 리플리콘, P_LtetO-1-gfp
	pTKU4-65	Cm^r; pBR322 리플리콘, P_LtetO-1-rfp
	pTKU1-11S	Cm^r; pBR322 리플리콘, P_lac 프로모터
	pTKU1-12R	Cm^r; pBR322 리플리콘, P_Lux-gfp
	pZBRG	Cm^r; pZB::(P_BAD-rfp 및 P_tet-gfp)
	pZB	Cm^r; p15A 리플리콘, P_BAD 프로모터, P_tet 프로모터	J Bacteriol 2005; 187: 2793-800
	pTrc99A-gfp	Ap^r; pBR322 리플리콘, P_trc-gfp	Appl Environ Microbiol 2005; 71: 6856-62

< 실시예 2> 하이드로젤 -캡슐화된 세포 패턴 제작

도 1과 같이, 소프트 식각(soft lithography) 기술을 이용하여 다른 두께(25 ㎛, 50 ㎛, 80 ㎛ 및 140 ㎛)를 갖는 실리콘 웨이퍼 상에 SU-8(MicroChem Corp, 2150, 2050, and 2025, Newton, MA, USA) 몰드를 제작한 후, 문헌(Adv Mater 2007; 19: 1603-7)에 알려진 바와 같이 상기 몰드의 약 1 mm 두께의 PDMS 복제물을 제조하였다. 그리고, 상기 PDMS 표면을 70 W 및 50 sccm의 산소 하에서 50초 동안 산소 플라즈마(Cute-MP, FemtoScience, Korea)로 처리하여 소수성 표면을 친수성 표면으로 개질하여 하이드로젤 용액을 갖는 패턴된 마이크로웰을 보다 잘 채울 수 있도록 하였다.

하이드로젤 용액은 소듐 알지네이트(1% w/v, Sigma-Aldrich) 및 필수 영양분(1% 글루코오스 및 1% 트립톤, 또는 4% 글리세롤 및 1% 트립톤)을 M9 배지에서 혼합시켜 준비하였다. 알지네이트 하이드로젤 용액을 살아있는 박테리아 세포와 혼합하고, 상기 혼합물을 PDMS 복제물/주형 표면에 부어 100 ㎛ 내지 1000 ㎛ 범위의 길이를 갖는 패턴된 마이크로웰을 채웠다. 기판을 기울려 과량의 용액을 제거하고 블레이드를 이용해 쓸었다. 그후, 알지네이트 하이드로젤 패턴을 0.2M CaCl₂ 용액에 가볍게 담구어 젤화 시켰다.

<실시예 3> 하이드로젤-캡슐화된 세포 패턴의 다른 하이드로젤 기질 상으로의 전달(transferring)

도 1과 같이, 하이드로젤-캡슐화된 세포 패턴이 전이되는 하이드로젤 기판을 제작하기 위하여, PDMS 프레임을 글래스 슬라이드 상에 제조하였다. 1-mm 두께의 PDMS 스랩을 글래스 슬라이드 상에 놓고 상기 중앙부를 잘라 비워 2 cm X 2 cm PDMS 프레임을 제조하였다. 아가로즈(1% w/v), 글루코오스(1% w/v) 및 트립톤(1% w/v)을 M9 배지에 넣어 혼합한 후, 40℃에서 유도제(inducer) 또는 세포로 다시 혼합하였다. 그러나, 아라비노즈를 유도제로 사용할 경우에는 글루코오스 대신 글리세롤(4% w/v)을 사용하여 이화대사 억제를 피하였다. 그후, 상기 혼합물을 즉시 PDMS 프레임 내로 부어 젤화를 위해 실온(24℃)에 놓아두었다. 상기 프레임을 글래스 슬라이드로부터 제거한 후, 하이드로젤-캡슐화된 세포 패턴을 갖는 준비된 PDMS 주형을 아가로즈 하이드로젤 기판 상에 놓아두었다. 3-5분 내에 PDMS 주형을 벗겨내어 아가로스 기판 상에 세포 패턴을 형성시켰다.

이러한 공정은 알지네이트 하이드로젤과 아가로즈 하이드로젤 간의 접착력이 PDMS 주형의 알지네이트 하이드로젤 패턴/입자를 아가로즈 기판 상으로 옮길 수 있을 만큼 강하기 때문이며, 다른 하이드로젤을 사용한 경우에는 이러한 세포 패터닝의 전달이 일어나지 않는다.

<실시예 4> 현미경 관찰

세포 패턴의 이미지를 DP2-BSW 소프트웨어(Olympus, Japan)에 의해 작동하는 CCD 카메라(DP72, Olympus, Japan) 및 형광광원(Xcite-200, ExFo Photonics solutions Inc., Mississauga, Canada)이 구비된 입체 현미경(SZX16, Olympus, Japan)을 이용하여 관찰하였다. 세포 패턴을 UV에 노출하여 GFP의 경우 0.02-2초 동안, RFP의 경우 1-2초 동안 형광 이미지를 관찰하였다. 형광 강도의 모든 이미지 가공과 정량화는 Image J(NIH, USA)를 이용하여 수행하였으며, 그 결과는 Origin 7.1(OriginLab, Northampton, MA, USA)을 이용하여 프롯팅하였다.

<실시예 5> 하이드로젤 세포 패터닝 및 전달에 대한 분석 결과

1. 하이드로젤-캡슐화된 세포 패턴의 특성

500 ㎛ X 500 ㎛ 네모 패턴으로 각각 500 ㎛씩 떨어져 있는 미세제작된 PDMS 주형을 사용하여 HPT 방법을 시험하였다. 도 1과 같이 140-㎛ 깊이의 PDMS 주형을 세포와 혼합된 알지네이트 용액으로 채운 후, 글래스 슬라이드 상의 아가로즈 하이드로젤 기판 상으로 전이시키고, PDMS 주형을 벗겨낸 후, 세포를 모니터링 한 결과는 도 2a 내지 도 2c와 같다. 즉, 단지 영양분만을 포함한 아가로즈 기판 상의 알지네이트 패턴의 밝은 선 이미지는 분명하게 나타났으며(도 2a) 형광 이미지는 잘 정렬된 세포 패턴을 나타낸다(도 2b). 형광 신호는 구조적으로 GFP를 발현시키는 pTKU4-2 플라스미드를 갖는 세포에서 생성되었다. 마찬가지로, pZBRG 플라스미드를 갖는 세포는 유도제로서 400 μM 아라비노즈를 포함한 아가로즈 하이드로젤 기판 상으로 패턴화되고 전이되어 세포들이 활성화되어 8시간만에 붉은 형광 단백질(RFP)을 발현시켰다(도 2c).

이러한 패터닝 및 전달 공정은 패턴을 형성하는 하이드로젤 마이크로입자의 특정 크기를 특정할 수 있어 이에 대한 연구를 진행하였다. 즉, 다른 높이(H= 140 ㎛, 80 ㎛, 50 ㎛ 및 25 ㎛)를 갖는 SU-8 몰드를 제작하였으며, 몰드로부터 생산된 모든 PDMS 주형은 동일한 배열의 원형 패턴을 형성하며, 이때 직경(D)은 1000 ㎛, 500 ㎛, 400 ㎛, 300 ㎛, 200 ㎛ 및 100 ㎛이었다(도 3a 및 도 3b). 예를들어, 가장 깊은 PDMS 주형(H=140 ㎛)과 관련하여, 직경이 200 ㎛보다 큰 마이크로입자가 밝은 선 및 이와 관련된 형광 이미지에서 분명하게 나타난 반면, 100 ㎛ 직경의 마이크로입자는 성공적으로 패턴화되고 전이되지 않았다(도 3a 화살표). 한편, 가장 좁은 PDMS 주형(H=25 ㎛)에서는 모든 마이크로입자들이 잘 패턴화되고 전이된 것으로 나타났다.

이러한 결과로부터, 본 발명에 따른 공정은 마이크로입자의 종횡비(AR=D/H)에 의존함을 알 수 있었다. H=140 ㎛ 및 H=80 ㎛의 경우에는 단지 100 ㎛ 직경의 마이크로입자만이 패턴화와 전이에 실패하여 D=100 및 H=80 ㎛인 종횡비 1.25보다 큰 종횡비일 때 본 발명의 공정이 유효함을 알 수 있었다.

또한, 이러한 실험으로부터 패턴화 및 전이를 위한 세포 수가 적절함을 알 수 있었다. 즉, 알지네이트 용액에서의 세포 밀도는 패터닝 및 전이 공정 전 10⁹ 세포/mL이었다. 마이크로입자의 부피가 0.20 nL(D=100 ㎛ 및 H=25 ㎛)에서 0.11 μL(D=1000 ㎛ 및 H=140 ㎛)이므로, 세포 수는 대략 200 내지 1.1X10³이었다. 마이크로입자 중의 세포 수를 정량하기 위하여, 4개의 다른 높이 및 6개의 다른 직경에 대한 마이크로입자로부터 형광강도를 측정하여 높이와 비례함을 확인하였다. 이러한 결과로부터 단위 면적 당 세포 수는 PDMS 주형의 높이에 의해 거의 선형으로 조절됨을 알 수 있었다. 한편, 다른 패터닝 방법들은 세포 수 조절이 곤란한 것으로 알려져 있다. 도 3d는 도 3c에서의 형광 강도로부터 산출한 검량데이터로서 마이크로입자의 초기 세포 밀도를 조절하기 위한 가이드라인을 제공한다. 이러한 검량 결과로부터 패터닝 및 전이 공정을 위한 초기 세포 밀도는 10⁹ 세포/mL로 결정하였다. 이하 모든 실험에서 마이크로입자의 크기는 140 ㎛, 500 ㎛ X 500 ㎛ 네모 모양을 사용하였다.

2. 세포외 유도를 통한 세포의 반응(유전자 발현 수준)의 정량 분석

HPT 방법은 아세틸호모세린 락톤(AHL) 또는 이소프로필-베타-D-치오갈락토피라노시드(IPTG)와 같은 유도제를 포함한 아가로즈 기판 상에 하이드로젤-캡슐화된 세포를 패터닝 및 전달시켜 최초로 세포외 유도 실험에 적용하였다. 이 실험은 세포가 바이오센서로서 외부 자극에 반응하여 형광신호라는 정보를 생성한다는 기초적인 검증 실험이다. 이러한 실험을 위하여, GFP를 발현하도록 조작된 두가지 다른 플라스미드를 사용하였다. 제1 플라스미드 pTKU1-12R을 균주 MG1655에 전자천공법으로 도입시켜 세포가 활성화되어 GFP를 발현하도록 하였으며, "receiver cells"(RCs)로 명명하였다. 도 4a에 도시된 바와 같이, 10 nM AHL을 포함한 아가로즈 하이드로젤 기판 상의 하이드로젤-캡슐화된 RCs로부터 얻어진 시간경과 이미지 스퀀스는 RCs가 AHL에 반응하여 GFP를 발현시키기 시작한 반면, 대조군으로서 AHL이 존재하지 않을 경우 어떠한 형광 강도를 나타내지 않는다. 또한, 제2 플라스미드 pTrc99A-gfp를 다른 균주 DH10B로 전자천공법을 이용하여 도입시켰다. 동일하게, 시간경과 형광 이미지 스퀀스가 1 mM IPTG를 포함한 아가로즈 하이드로젤 기판 상의 하이드로젤-캡슐화된 세포로부터 얻어졌다. 도 4c는 무시할 만한 차이를 갖는 10개의 하이드로젤 마이크로입자의 평균 형광강도의 정량에 관한 것으로서, 이러한 방법은 신뢰할만하고 정확한 정량분석임을 가능하게 함을 의미한다. 두 개의 균주는 8시간 까지 계속적으로 GFP를 생산한 후, 발현을 멈추었다. 이러한 결과는 다른 균주와 유도제에 의해 야기되는 유전자 발현 수준의 정량적 비교에 사용될 수 있으며, 약 1.5배-차이를 초래한다(AHL 56 AU, IPTG 40 AU). 그리고, 유전자 카피 수를 정량하는 데에도 적용가능하다. 발현 수준이 균주의 성장률과 배양조건에 따라 변화하기 때문에 본 발명자는 GFP-발현 세포(pTKU4-2)를 아가로즈 시판 상에 다른 초기 수 밀도(10⁷, 10⁸ 및 10⁹ 세포/mL)로 패터닝하고 이들의 성장을 시간에 따라 모닝터링 한 대조군 실험을 수행하였다. 도 4d와 같이, 세포의 성장은 S 곡선을 따르며, 세포의 형광 강도는 초기 세포 밀도과 관계없이 결국 동일한 값에 접근한다. 각 마이크로입자의 최종 세포 수가 거의 동일하기 때문에 이러한 현상은 유전자 회로의 발현을 정량적으로 비교하고 분석하는 데에 유용하다. 또한, 성장 곡선으로부터 아가로즈 기판은 세포에 충분한 영양분을 제공하며 세포외 유도/발현 실험을 위해 적절한 배양 조건을 유지함을 알 수 있다. 초기 세포 밀도가 10⁸ 세포/mL 보다 높을 때 세포 성장은 8시간 만에 포화된 것으로 보이지만, 더 낮은 세포 밀도에서는 지연되는 것으로 보였다.

이러한 실험결과로부터 본 발명의 방법은 다양한 균주 내 다양한 유전자 회로의 거동/발현 수준을 정확하게 분석하는 데에 매우 유용할 뿐 아니라, 약물, 독성, 항생제 등에 대한 세포의 세포외 반응에 대한 연구, 즉 세포를 이용한 바이오 센서 개발에도 유용하게 적용될 수 있다는 것을 보여준다.

3. 2개의 유전자 회로를 가지는 세포를 이용한 다중 외부 물질 탐지 및 유전자간의 상호간섭(cross-talk)의 정량 분석

각각의 유도성 프로모터에 의한 여러 개의 유전자 회로의 발현을 이용하면, 동시에 여러 외부 자극/외부 물질에 대한 세포의 반응을 이용하여 바이오 센서로 개발이 가능하다. 또한, 생물학적으로는 다중의 유도성 물질이 인가될 경우, 프로모터 간의 오동작으로 인해 발현이 방해를 받게 되는데, HPT 방법은 2개의 합성 유전자 회로 간의 상호간섭을 조사할 수 있도록 한다. 보편적으로, 플라스미드 상의 2개의 유전자 회로는 화학적으로 유도될 때 쉽게 상호간섭된다. 그러나, 정량적인 분석은 마이크로플레이트 리더와 같은 보편적은 도구에 의존한다. 상호간섭 정량 분석에 대한 HPT 방법의 유용성을 검토하기 위하여, 테트라사이클린 존재 시 GFP를 발현시키고 아라비노즈에 의해 RFP를 발현시키는 유전자 회로(pZBRG)를 사용하였다. HPT 방법을 사용하여 세포를 유전자 회로로 패터닝한 후, 테트라사이클만, 아라비노즈만 또는 유도제 둘다를 포함한 아가로즈 하이드로젤 상에 전이시켰다. 먼저, 테트라사이클만(1 μM) 존재하는 경우 GFP 신호만이 검출된 반면, 아라비노즈만(400 μM) 존재하는 경우 RFP 신호만이 검출되었다. 한편, 테트라사이클린(1 μM)과 아라비노즈(400 μM) 둘다 존재 시에는 유전자 회로가 동시에 유도되어 어떠한 상호간섭도 관찰되지 않았다(도 5a, 도 5b). 도 5c는 각각의 실험에 대한 정량 분석 결과를 나타낸 것이다. 대조군 실험에서는 GFP 및 RFP의 형광 강도가 거의 0인 반면, 각각 및 동시 유도 시험에서는 의미있는 형광 강도가 나타났다. 그러나, 분리 유도 및 동시 유도는 RFP 및 GFP 강도에서 무시할만한 차이가 나타났다.

어떠한 상호간섭 현상이 관찰되지 않은 이유는 2개 유도제가 다른 분자구조 및 분자량을 가지기 때문인 것으로 판단된다. 그리고, 상기 프로모터는 다른 농도의 유도제에 의해 활성화된다. tet 프로모터(Ptet)는 1 nM 내지 1 μM의 테트라사이클린 농도에 의해 활성화되는 반면, araBAD 프로모터(PBAD)는 6 μM 내지 400 μM의 아라비노즈 농도에 의해 활성화 된다. 여기서 HPT 방법은 유전자 회로 간의 상호간섭을 정량적으로 분석할 수 있음을 알 수 있다.

4. 유도제 농도 구배를 이용한 세포의 반응(유전자 발현 수준)의 정량 분석

다양한 농도의 유도제 하에서 세포외 유전자 발현을 검토하는 것은 매우 유용할 수 있다. 알지네이트 하이드로젤 패턴에서 세포의 유도제 농도의존적 유전자 발현 수준을 조사하기 위하여 아가로즈 하이드로젤 기판에서 유도제의 농도 구배를 생성하였다. 이러한 실험을 위하여, RCs 및 pZBRG를 가진 세포를 를 재사용하였다. 도 6a에 도시된 바와 같이, RCs는 AHL의 유도제 농도 구배에 따라 GFP의 형광 강도 구배를 생성시킨다. 농도 구배를 생성시키는 방법은 세포를 전달한 면적의 좌우 혹은 상하에 높은 농도의 유도제를 포함한 아가로즈 젤과 유도제를 전혀 포함하지 않은 아가로즈젤을 적층하는 형태로 하여 유도제 source와 유도제 sink를 제작하였다. 젤의 두께가 1 mm 이하라 높이방향으로는 확산이 빨리 일어나게 되고 (20 분), 길이 방향으로는 상대적으로 긴 시간이 요구된다 (10 시간). 또한, 4시간을 전후로 하여, 적층한 아가로즈젤을 새로 제작한 젤로 교체하는 방식으로 오랫동안 (12시간) 유도제의 농도 구배를 선형으로 유지하였다. 젤을 적층하는 방법외에도,작은 세포를 전달한 면적의 좌우 혹은 상하에 well을 제작하여 용액을 채우는 방식도 가능하다.

또한, HPT 방법은 도 6b와 같이 2개의 유도제의 농도 구배를 야기할 수 있다. 왼쪽부터 오른쪽으로, 아라비노즈 농도 구배는 AHL과 동일하게 생성되었다. 오른쪽부터 왼쪽으로, 테트라사이클린의 농도구배가 생성되었다. GFP 및 RFP의 형광 강도는 각각 얻어진 후, 2개의 이미지를 겹쳐 GFP 및 RFP 강도를 동시에 나타내었다. 아라비노즈 농도가 가장 높기 때문에 가장 왼쪽 컬럼이 가장 강한 RFP 강도를 나타내었다. 한편, 테트라사이클린의 농도가 가장 높기 때문에 가장 오른쪽 컬럼이 가장 강한 GFP 강도를 나타내었다. 가운데 컬럼은 GFP 및 RFP 둘을 나타낸다. 도 6c 및 도 6d는 도 6a 및 도 6b 각각의 정량 결과를 나타낸다. AHL에서는 가장 높은 농도의 AHL에서 GFP 강도가 시간에 따라 점진저그로 증가하였고, 이들의 형광 강도도 4시간까지 잘 유지되었다. 그러나, 4시간 후 가장 낮은 AHL 농도에서 형광 강도가 증가하기 시작하였다. 이는 플라스미드를 개시하기 위한 AHL의 문턱값농도가 nM 이하로 낮기 때문에 가장 오른쪽 컬럼의 세포가 쉽게 AHL의 랜덤 확산에 의해 오염되기 때문인 것으로 판단된다.

한편, 아라비노즈 및 테트라사이클린의 문턱값 농도는 높아서 GFP 및 RFP의 형광 강도의 구배가 시간에 따라 가파르게 연속적으로 가파르게 변한 후, 약 10시간 내에 포화값에 도달한다. 따라서, HPT 방법은 유전자 회로의 유도제 농도 의존적 유전자 발현을 정량할 뿐 아니라, 다양한 농도의 유도제 하의 상호간섭을 분석할 수 있다.

5. 하이드로젤-캡슐화된 세포 패턴을 이용한 세포 교신(commuinication) 연구 및 타겟 세포 분석용 바이오 센서 응용

도 7과 같이, 아라비노즈 하이드로젤 기판은 플라스미드 pTKU1-11S가 전자천공으로 도입된 세포를 포함하며, 이러한 세포들을 "sender cells"(SCs)라고 명명한다. 한편, 알지네이트 마이크로입자 패턴은 앞서 살펴본 바와 같이 RCs를 포함한다. RCs의 반응에 대한 SC 농도의 효과를 살펴보기 위하여 아가로즈 하이드로젤 기판에서 SCs의 3개의 다른 초기 밀도를 사용하였다. 도 7과 같이, RCs 패턴 부존재 시(도 7a, 아가로즈 기판의 SCs의 10⁹ 세포/mL) 어떠한 형광 강도를 관찰할 수 없었다. 한편, SCs에 이웃한 RCs의 존재에 의해 강한 형광 강도가 관찰되었다. 흥미롭게, 가장 높은 SC 농도(10⁹ 세포/mL)는 가장 낮은 SC 농도(10⁷ 세포/mL)보다 더 약한 GFP 강도를 나타내었다. 도 7b는 모든 SC 밀도에 대한 RCs의 GFp 강도의 정량분석 결과이다. 가장 낮은 SC 밀도에서 RCs의 형광 강도는 RCs가 성장함에 따라 8시간 동안 점진적으로 증가하였다. 그러나, 8시간 후, RCs의 성장이 포화되고, SCs가 계속 성장하기 때문에 형광 강도는 감소하였다. 한편, 가장 높은 SC 밀도에서는 RCs가 약 3시간 동안 GFP를 발현시킨 후, 형광 강도가 계속적으로 감소하였다. 도 4d에서 정량한 바와 같이, 하이드로젤-캡슐화된 세포(10⁹ 세포/mL)는 세포가 아가로즈 기판 상에 패턴화되고 전이된 후 4시간 내지 6시간 사이에 대수적 성장기를 나타낸다. 따라서, 낮은 밀도(10⁷ 세포/mL)에서 SCs에 이웃하는 RCs는 높은 밀도(10⁹ 세포/mL)에서 SCs에 이웃하는 RCs보다 GFP를 늦게 생성하도록 유도됨을 알 수 있다.

또한, 세포내 교신에 대한 영양분의 효과를 검토하였다. 아가로즈 기판 상의 보다 많은 SCs는 보다 많으면서 보다 빨리 영양분을 소비하기 때문에 낮은 밀도에서 SC와 이웃하는 RCs는 높은 밀도에서 SCs의 그것보다 더 잘 성장할 수 있다. 이러한 가설을 규명하기 위하여, 고정된 밀도에서 알지네이트 마이크로입자에서 GFP-발현 세포와, 이전에 사용된 바와 같은 3개의 다른 밀도에서 아가로즈 기판에서 RFP-발현 세포로부터 얻은 형광 강도를 정량하였다. 가장 낮은 RFP-발현 세포 밀도에서, GFP-발현 세포는 잘 성장하고, 도 7b에 나타난 RCs와 유사한 성장곡선을 8시간까지 나타낸다. 한편, 가장 높은 RFP-발현 세포 밀도에서, GFP-발현 세포는 4시간 이내의 단지 초기 단계에서만 성장한 후, 더 이상 성장하지 않아 도 7b에서와 유사한 거동을 나타내었다. 흥미롭게도, RFP-발현 세포는 약 4시간만에 대수적인 성장을 나타내기 시작하였다. 따라서, 가장 높은 밀도에서의 SCs는 더많은 영양분을 섭취하며 RCs에 대한 대사적 부담을 더일찍 부여하므로, GFP를 적게 생산한다. 또한, AHL의 유도 농도는 매우 낮은 것으로 알려져 있고 AHL가 매우 저분자이므로, AHL는 SCs로부터 이웃하는 RCs로 신속하게 확산될 수 있다. 따라서, 가장 낮은 밀도에서의 SCs는 충분한 AHL을 생산하여 RCs를 유도하는 한편 영양분 섭취를 최소화한다.

이러한 결과는 종래 연구 결과들과 일치하며, 따라서, 본 발명에 따른 HPT 방법은 2개의 공생적으로 제조된 세포 간의 세포 대 세포 교신에 대한 분석을 촉진할 것이다. 또한, 세포간 교신을 이용하면, 패터닝된 세포를 이용하여 기판에 있는 타겟 세포의 생물학적인 성질을 탐지할 수 있는 세포기반의 센서로의 개발도 가능하다. 세포 기반 바이오센서의 경우도 앞서 기술한 세포간 교신을 연구하는 것과 동일한 방법으로 실험 및 적용이 가능하다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

제1세포와 알지네이트 하이드로젤을 포함한 하이드로젤-캡슐화된 세포 패터닝을 갖는 기판을 제작하는 단계;
제2세포 또는 생리활성물질 중 어느 하나와 아가로즈 하이드로젤을 포함한 아가로즈 하이드로젤 기판을 제작하는 단계; 및
상기 하이드로젤-캡슐화된 세포 패터닝을 갖는 기판을 상기 아가로즈 하이드로젤 기판 상에 배치시키고, 세포 패터닝을 전달하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 하이드로젤을 이용한 세포 패터닝 및 전달 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 하이드로젤-캡슐화된 세포 패터닝을 갖는 기판은,
기판 상에 감광수지를 갖는 몰드를 제작하는 단계;
상기 몰드에 반대되는 상을 가지는 몰드를 제작한 후, 고분자를 부어 열처리하여 고분자 몰드를 제작하는 단계;
알지네이트 하이드로젤 용액과 혼합된 세포를 상기 고분자 몰드에 채우는 단계;
상기 고분자 몰드를 기울여 불필요한 용액을 제거하는 단계; 및
얻어진 알지네이트 하이드로젤 패턴을 칼슘 용액에 담구어 젤화시키는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 하이드로젤을 이용한 세포 패터닝 및 전달 방법.
청구항 2에 있어서, 상기 고분자 몰드를 제작한 후, 산소 플라즈마를 처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 하이드로젤을 이용한 세포 패터닝 및 전달 방법.
청구항 2에 있어서, 상기 기판은 실리콘, 유리 및 메타크릴레이트수지로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 하이드로젤을 이용한 세포 패터닝 및 전달 방법.
청구항 2에 있어서, 상기 감광수지는 SU-8인 것을 특징으로 하는, 하이드로젤을 이용한 세포 패터닝 및 전달 방법.
청구항 2에 있어서, 상기 고분자는 폴리디메틸실록산인 것을 특징으로 하는, 하이드로젤을 이용한 세포 패터닝 및 전달 방법.
청구항 2에 있어서, 상기 알지네이트 하이드로젤 용액과 혼합된 세포를 상기 고분자 몰드에 부어 100 ㎛ 내지 1000 ㎛ 범위의 길이를 갖도록 채우는 것을 특징으로 하는, 하이드로젤을 이용한 세포 패터닝 및 전달 방법.
제1세포와 알지네이트 하이드로젤을 포함한 하이드로젤-캡슐화된 세포 패터닝을 갖는 제1기판; 및 제2세포 또는 생리활성물질 중 어느 하나와 아가로즈 하이드로젤을 포함한 아가로즈 하이드로젤 제2기판을 포함하는 바이오센서.
청구항 8에 있어서, 제1기판의 세포 패터닝이 제2기판 상으로 전달되어 형성되는 것을 특징으로 하는 바이오센서.