KR101260935B1

KR101260935B1 - 환경 스트레스 내성 유도 고추 유전자 ＣａＢＩ－１

Info

Publication number: KR101260935B1
Application number: KR1020090121806A
Authority: KR
Inventors: 홍주봉; 지바 나히드; 이스밧 모하모드
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2009-12-09
Filing date: 2009-12-09
Publication date: 2013-05-06
Anticipated expiration: 2029-12-09
Also published as: KR20110064993A

Abstract

본 발명은 환경 스트레스 내성 유도 고추 유전자 CaBI -1(Capsicum annuum Bax Inhibitor-1)에 대한 것으로, 구체적으로 고온 스트레스, 건조 스트레스 또는 고염 스트레스에 내성을 유도하는 신규한 고추 유전자 CaBI -1에 관한 것이다. CaBI - 1는 고추 식물체에 고온, 저온, 고염도, 건조, 침수 또는 중금속 스트레스를 가했을 때 과발현되며, CaBI - 1를 도입한 형질전환 식물체는 내고온성, 내건성 및 내염성을 획득하였으므로, 환경 스트레스에 대한 내성을 획득한 식물체의 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

CaBI-1(Capsicum annuum Bax Inhibitor-1), 식물체 내고온성, 식물체 내건성, 식물체 내염성, 고추, 담배, 환경 스트레스

Description

환경 스트레스 내성 유도 고추 유전자 ＣａＢＩ－１{A red pepper gene CaBI-1 confers stress-tolerance to plants}

본 발명은 환경 스트레스에 대한 내성을 부여하는 신규 유전자에 관한 것이다.

식물은 건조, 고염도, 저온 등의 다양한 환경 스트레스에 항시 노출되어 있다. 따라서 식물체의 일생은 환경 스트레스에 대한 반응 및 적응 과정의 연속이라 해도 과언은 아니다(Boyer, 1982, Science 218: 443-448).

환경 스트레스 하의 식물은 다양한 생화학적 및 생리학적 반응 및 적응 과정을 나타낸다. 식물체가 환경 스트레스에 얼마나 효율적으로 반응하고 적응할 수 있느냐는 식물체가 환경 스트레스를 얼마나 잘 이겨낼 수 있는가를 결정하는 요소이다. 환경 스트레스에 대한 생물체의 반응 중, 세포사멸조절(Programmed Cell Death, PCD)은 중요한 환경 스트레스 적응 메커니즘으로 판단되고 있다(Huckelhoven, 2004, Apoptosis 9: 299-307). PCD는 모든 진핵세포생물체에서 확인되고 있으며, 현재까지는 후생동물(metozoan)에서 주로 연구되어왔고 동물의 발달과정과 환경 스트레스에 대한 반응 및 적응과정에서 그 기능이 확인되고 있다(Huckelhoven, 2004). 식물체에서도 PCD는 널리 작용할 것으로 판단되나, 현재까지의 연구는 제한적이어 관상요소(tracheary element)의 발달, 화분의 발달 등의 일부의 발달과정과 병원성 미생물에 의해 감염되었을 시 식물체의 감염체에 대한 내성 기능인 과민(hypersensitive)반응의 기본 메커니즘으로 연구가 주로 진행되어 왔다. 식물체에서 확인된 PCD는 동물체에 비해 현재까지는 많이 제한적이나 분자세포 수준에서의 변화는 많은 공통점을 나타내고 있어, 동물체와 식물체에서의 PCD가 진화과정을 통해 잘 보존되었을 가능성이 제시되고 있다(Lam et al., 2001, Nature 411: 848-853; Bolduc et al., 2003, Planta 216: 377-386; Huckelhoven, 2004).

PCD의 주요 조절자로서 PCD를 유발하는 기능을 보이는 BCL2 연관 x 단백질(BCL2 associated x protein; BAX)이 많은 연구의 대상이 되어왔으며(Kroemer, 1997, Nat Med 3: 614-620), 반면 BAX의 기능을 억제함으로써 PCD의 발달을 저해하는 인자로 BAX 억제자-1(BAX inhibitor-1; BI-1)도 최근에 들어 많은 연구의 대상이 되고 있다(Scorrano et al., 2003, Biochem Biophys Res Commun 304: 437-444).

식물체로부터는 BAX가 발견되지 않았으나, BI-1은 동물체와 식물체에 공히 존재함이 확인되었다. 그리고 식물체의 BI-1의 유전자를 외부로부터 도입하여 동물세포나 효모에 과발현시키면 이들 세포에서 BAX에 의한 세포사멸 과정의 억제가 확인되었으며 동물체의 BAX 유전자를 식물세포에 도입하여 과발현시키면 식물세포의 BAX 유도성 세포사멸 현상이 발생하였다(Sanchez et al., 2000, Plant J 21: 393-399; Kawai-Yamada et al., 2004, Plant Cell 16: 21-32; Lacomme and Cruz, 1999, Proc Natl Acad Sci USA 96: 7956-7961; Huckelhoven et al., 2003, Proc Natl Acad Sci USA 100: 5550-5560; Eichman et al., 2004, Mol Plant Microbe Int 17: 484-490; Matsumura et al., 2003, Plant J 33: 425-434). 따라서 식물체에서 BAX가 발견되지는 않았으나, 식물체에도 BAX와 연계된 PCD 과정이 존재할 가능성이 있다 하겠다.

BI-1의 발현이 유도되는 조건은 전술한 바와 같이 세포사멸이 관여하는 특정 발달과정과 생물적 또는 비생물적 환경스트레스임이 확인되고 있다. 예로, 애기장대로부터 병원성 미생물의 침입에 따른 BI-1 유전자의 발현 유도(Sanchez et al., 2000; Matsumura et al., 2003; Eichmann et al., 2004)가 보고되었고, 고온 스트레스와 활성산소 스트레스 하의 애기장대에서 BI-1의 발현이 유도됨이 보고되었다(Watanabe and Lam, 2006, Plant J 45: 884-894).

비생물적 환경 스트레스에 의한 작물의 생산량 손실은 지대하여 가능한 생산량의 반 이상이 비생물적 환경 스트레스에 의해 손실됨이 확인되고 있으며(Bray et al., 2000, In Biochemistry & Molecular Biology of Plants, BB Buchanan, W Gruissem, and RL Jones ed, American Society of Plant Biologists, Rockville; Wang et al., 2007, Planta 218: 1-14), 최근에는 국지적이나마 급격한 환경 변화가 기록되고 있고 이에 따른 작물의 피해 정도가 더욱 우려되고 있다(Lane and Jarvis, 2007, EJournal 4: 1-12). 전술한 바와 같이 비생물적 환경 스트레스에 대한 식물체의 적응 메커니즘과 연계하여 PCD와 BI-1의 역할이 제시되었고, 이와 같은 가능성은 담배 잎절편에 BI-1의 유전자를 일시발현(transient expression)시키고 그 결과로 짧은 시간 동안의 효과이기는 하나 고온과 저온과 활성산소에 대한 담배세포의 내성 증가가 보고됨으로써 일부 확인되고 있다(Chae et al., 2003, Gene 323: 101-113; Watanabe and Lam, 2006). 그러나 BI -1 유전자를 사용하여 형질전환 식물체를 제조하고, 제조된 형질전환 식물체를 이용하여 BI -1 유전자가 환경스트레스에 대한 내성의 증진을 식물체에 부여할 수 있음을 보여 준 보고는 없다.

이에, 본 발명자들은 고추 식물체에 고온 스트레스를 가하고 이에 따라 발현이 증가하는 신규 BI -1 유전자를 선별하였고, 상기 신규 유전자를 도입하여 형질전환된 담배 식물체가 고온내성, 내건성 및 내염성을 획득함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 고추에서 유래한 신규 환경 스트레스 내성 유전자 및 상기 유전자가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 환경 스트레스 내성 단백질인 CaBI-1(Capsicum annuum Bax Inhibitor-1)을 구성하는 폴리펩티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 코딩하는, 하기 (a) 또는 (b)의 폴리뉴클레오티드를 제공한다:

(a) 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및

(b) 서열번호 2로 기재된 폴리뉴클레오티드.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 숙주에 도입하여 제조한 형질전환체, 상기 형질전환체의 자손 또는 클론인 식물체 및, 상기 형질전환체의 종자, 열매, 이삭, 괴경, 괴근, 주, 캘러스 또는 원형질체를 제공한다.

아울러, 본 발명은

1) 상기 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 발현벡터를 제조하는 단계;

2) 단계 1)의 발현벡터를 숙주 식물세포에 도입하는 단계; 및

3) 단계 2)의 형질전환된 식물 세포를 조직 배양하여 재분화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 환경 스트레스 내성 유도 유전자 형질전환체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 신규한 고추 유전자 CaBI -1(Capsicum annuum Bax Inhibitor-1)은 식물체가 고온 스트레스 하에서 과발현되며, CaBI -1가 형질도입된 형질전환체는 내온성, 내건성 및 내염성을 획득하므로 환경 스트레스에 내성을 가지는 형질전환 식물체의 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 환경 스트레스 내성 단백질인 CaBI-1(Capsicum annuum Bax inhibitor-1)을 구성하는 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 1로 기재되는 폴리펩티드와 70% 이상의 상동성을 가지는 폴리펩티드인 것이 바람직하며, 80% 이상의 상동성을 가지는 폴리펩티드인 것이 더욱 바람직하며, 90% 이상의 상동성을 가지는 폴리펩티드인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 70% 이하의 상동성을 가지나 서열번호 1로 기재되는 폴리펩티드와 15개 아미노산 이하의 펩티드 조각에서 90% 이상의 상동성을 보이거나 생물학적으로 동등한 기능을 가지는 폴리펩티드라면 본 발명의 폴리펩티드에 포함될 수 있다.

(a) 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및,

(b) 서열번호 2로 기재된 폴리뉴클레오티드.

상기 환경 스트레스는 고온, 건조, 저온, 고염, 중금속 및 침수로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나; 고온, 건조 및 고염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 더욱 바람직하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 고추 식물체로부터 유래되는 것이 바람직하다.

본 발명의 발현벡터에 포함되는 유전자는 서열번호 1로 기재되는 CaBI-1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 바람직하게는 서열번호 2로 기재되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것이다. 상기 유전자를 삽입하기 위하여 사용되는 벡터로는 pKBS1-1 벡터, pBI102 벡터 및 pCAMBIA 벡터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나를 이용하는 것이 바람직하며, 당업계에서 식물 형질전환용 발현벡터라면 어느 것을 이용하여도 무방하다.

상기 숙주는 미생물, 동물세포, 식물세포, 동물 또는 식물체 및 이들로부터 유래된 배양세포 등을 포함한다.

바람직하게는, 상기 식물세포 또는 식물체는 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 실시예에서 본 발명자들은 식물체에 환경 스트레스 내성을 증진시킬 수 있는 유전자를 얻기 위하여, 먼저 고추에 고온 스트레스를 가한 후, cDNA 라이브러리를 제작하여 고온 스트레스에서 발현양이 대폭 증가하는 cDNA 클론들을 차별화 스크리닝(differential screening) 기법을 활용하여 선별하고, 선별된 cDNA 클론들로부터 플라스미드 DNA를 수거하여 염기서열을 부분적으로 결정한 다음, 기존에 보고된 BI-1(BAX inhibitor-1)과 높은 상동성을 보이는 cDNA 클론을 분리하여CaBI-1(GenBank 접근 번호: ACS 36610)이라 명명하였다(도 1 및 도 2 참조). 또한, 본 발명자들은 고추 식물체에 고온, 건조, 저온, 고염도, 중금속 및 침수 스트레스를 가했을 경우에도 CaBI -1 발현이 증가함을 확인하였다(도 3 참조). pBluescript 벡터에 CaBI -1 유전자가 삽입되어 있는 클론이 도입된 대장균(Escherichia coli strain DH5α)을 2009년 12월 03일자로 대한민국 경기도 수원시 권선구 서둔동 88-20 소재 농업유전자원센터에 기탁하였다(수탁번호: KACC95101P; 기탁일: 2009년 12월 03일).

또한, 본 발명자들은 상기 CaBI -1 유전자를 아그로박테리움에 형절전환 시킨 뒤, 이를 담배 식물체에 감염시켜 CaBI -1 형질전환 담배 식물체를 제조하였다(도 4 참조). 상기 CaBI -1 형질전환 담배에서 CaBI-1이 정상적으로 발현되는 것을 확인한 다음, 환경 스트레스에 대한 내성을 분석한 결과, CaBI -1 형질전환 식물체에서 고온(도 5 참조), 건조(도 6 참조) 및 고염(도7 참조)에 대한 내성이 생긴 것을 확인하였다.

아울러, 본 발명은

2) 단계 1)의 발현벡터를 숙주 식물세포에 도입하는 단계; 및

상기 단계 2)의 식물세포는 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물로부터 유래한 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 단자엽 식물은 택사과(Alismataceae), 자라풀과(Hydrocharitaceae), 지채과(Juncaginaceae), 장지채과(Scheuchzeriaceae), 가래과(Potamogetonaceae), 나자스말과(Najadaceae), 거머리말과(Zosteraceae), 백합과(Liliaceae), 지모과(Haemodoraceae), 용설란과(Agavaceae), 수선화과(Amaryllidaceae), 마 과(Dioscoreaceae), 물옥잠과 (Pontederiaceae), 붓꽃과(Iridaceae), 버먼초과(Burmanniaceae), 골풀과 (Juncaceae), 닭의장풀과(Commelinaceae), 곡정초과(Eriocaulaceae), 화본과(벼과, Gramineae, Poaceae), 천남성과(Araceae), 개구리밥과(Lemnaceae), 흑삼릉과 (Sparganiaceae), 부들과(Typhaceae), 사초과(방동사니과, Cyperaceae), 파초과 (Musaceae), 생강과(Zingiberaceae), 홍초과(Cannaceae), 난초과(Orchidaceae)인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 쌍자엽 식물은 암매과(돌매화나무과, Diapensiaceae), 매화오리나무과(Clethraceae), 노루발과(Pyrolaceae), 진달래과(Ericaceae), 자금우과(Myrsinaceae), 앵초과(Primulaceae), 갯질경이과 (Plumbaginaceae), 감나무과(Ebenaceae), 때죽나무과(Styracaceae), 노린재나무과, 회목과(Symplocaceae), 물푸레나무과(목서과, Oleaceae), 마전과(Loganiaceae), 용담과(Gentianaceae), 조름나물과(Menyanthaceae), 협죽도 과(마삭나무과, Apocynaceae), 박주가리과(Asclepiadaceae), 꼭두서니과(Rubiaceae), 꽃고비과 (Polemoniaceae), 메꽃과(Convolvulaceae), 지치과(Boraginaceae), 마편초과 (Verbenaceae), 꿀풀과(Labiatae), 가지과(Solanaceae), 현삼과(Scrophulariaceae), 능소화과(Bignoniaceae), 쥐꼬리망초과(Acanthaceae), 참깨과(Pedaliaceae), 열당과 (Orobanchaceae). 제스네리아과(Gesneriaceae), 통발과(Lentibulariaceae), 파리풀과(Phrymaceae), 질경이과(Plantaginaceae), 인동과(Caprifoliaceae), (연복초과 Adoxaceae), 마타리과(Valerianaceae), 산토끼꽃과(Dipsacaceae), 초롱꽃과 (Campanulaceae), 국화과(Compositae), 소귀나무과 Myricaceae, 가래나무과 (Juglandaceae), 버드나무과(Salicaceae), 자작나무과(Betulaceae), 너도 밤나무과(참나무과, Fagaceae), 느릅나무과(Ulmaceae), 뽕나무과(Moraceae), 쐐기풀과 (Urticaceae), 단향과(Santalaceae), 겨우살이과(Loranthaceae), 마디풀과(여뀌과, Polygonaceae), 자리공과(상륙과, Phytolaccaceae), 분꽃과(Nyctaginaceae), 석류풀과(Aizoaceae), 쇠비름과(Portulacaceae), 석죽과(Caryophyllaceae), 명아주과 (Chenopodiaceae), 비름과(Amaranthaceae), 선인장과(Cactaceae), 목련과 (Magnoliaceae), 붓순나무과(Illiciaceae), 녹나무과(Lauraceae), 계수나무과 (Cercidiphyllaceae), 미나리아재비과(Ranunculaceae), 매자나무과(Berberidaceae), 으름덩굴과(Lardizabalaceae), 새모래덩굴과(방기과, Menispermaceae), 수련과 (Nymphaeaceae), 붕어마름과(Ceratophyllaceae), 어항마름과(Cabombaceae), 삼백초과(Saururaceae), 후추과(Piperaceae), 홀아비꽃대과(Chloranthaceae), 쥐방울덩굴과(Aristolochiaceae), 다래나무과(Actinidiaceae), 차나무과(동백나무과, Theaceae), 물레나물과(Guttiferae), 끈끈이주걱과(Droseraceae), 양귀비과 (Papaveraceae), 풍접초과(Capparidaceae), 십자화과(겨자과, Cruciferae), 플라타너스과(버즘나무과, Platanaceae), 조록나무과(금루매과, Hamamelidaceae), 꿩의비름과(돌나물과, Crassulaceae), 범의귀과(Saxifragaceae), 두충과(Eucommiaceae), 돈나무과(Pittosporaceae), 장미과(Rosaceae), 콩과(Leguminosae), 괭이밥과 (Oxalidaceae), 쥐손이풀과(Geraniaceae), 한련과(Tropaeolaceae), 남가새과 (Zygophyllaceae), 아마 과(Linaceae), 대극과(Euphorbiaceae), 별이끼과 (Callitrichaceae), 운향과(Rutaceae), 소태나무과(Simaroubaceae), 멀구슬나무과 (Meliaceae), 원지과(Polygalaceae), 옻나무과(Anacardiaceae), 단풍나무과(단풍과, Aceraceae), 무환자나무과(Sapindaceae), 칠엽수과(Hippocastanaceae), 나도 밤나무과(Sabiaceae), 봉선화과(물봉선과, Balsaminaceae), 감탕나무과(Aquifoliaceae), 노박덩굴과(화살나무과, Celastraceae), 고추나무과(Staphyleaceae), 회양목과 (Buxaceae), 시로미과(Empetraceae), 갈매나무과(Rhamnaceae), 포도 과(Vitaceae), 담팔수과(Elaeocarpaceae), 피나무과(Tiliaceae), 아욱과(Malvaceae), 벽오동과 (Sterculiaceae), 팥꽃나무과(서향나무과, Thymelaeaceae), 보리수나무과 (Elaeagnaceae), 이나무과(Flacourtiaceae), 제비꽃과(Violaceae), 시계꽃과 (Passifloraceae), 위성류과(Tamaricaceae), 물별과(Elatinaceae), 베고니아과 (Begoniaceae), 박과(Cucurbitaceae), 부처꽃과(배롱나무과, Lythraceae), 석류나무과(Punicaceae), 바늘꽃과(Onagraceae), 개미탑과(Haloragaceae), 박쥐나무과 (Alangiaceae), 층층나무과(산수유나무과, Cornaceae), 두릅나무과(오갈피나무과, Araliaceae), 산형과(미나리과)(Umbelliferae(Apiaceae))인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 범위에는 상기 스트레스 내성을 갖는 형질전환 식물체의 자손 또는 클론인 식물체 및 상기 식물체의 종자, 열매, 이삭, 괴경, 괴근, 주, 캘러스 또는 원형질체도 포함된다.

상기 단계 2)의 발현벡터를 숙주 식물세포에 도입하는 단계는 공지된 식물 형질전환 방법에 의하여 식물체내로 도입될 수 있다. 즉, 아그로박테리움 매개방법, 유전자 총(gene gun), PEG를 이용한 방법 및 전기천공법(electroporation)등 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려진 주지의 방법을 이용할 수 있다. 바람직하게는 상기 쌍자엽식물은 아그로박테리움 매개방법(R.B. Horsch, et al., A simple and general method for transferring genes into plants, Science 227(1985), pp. 1229-1231)을 이용하고, 단자엽식물은 유전자 총을 이용한 방법(P. Christou, Particle bombardment, Methods Cell Biol 50(1995), pp. 375-382) 또는 아그로박테리움 매개에 의한 DREB 형질전환 식물체 제작(Oh et al . Plant Physiol 138: 341-351, 2005; Ito et al. Plant Cell Physiol 47: 141-153, 2006)을 이용하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

형질전환 후, 식물세포는 전식물로 재생되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재생을 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해 잘 알려져 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.). 따라서 일단 형질전환이 실현되면, 형질전환된 식물세포로부터 성숙한 식물을 재생시키는 것은 당분야의 지식 범위 내에 있다.

상기 단계 3)의 환경 스트레스는 고온, 건조, 저온, 고염, 중금속 및 침수로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나, 고온, 건조 및 고염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 더욱 바람직하나 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 고추로부터 환경 스트레스 내성 관련 Bax inhibitor -1 유전자( CaBI -1 )의 클로닝

<1-1> 고온 스트레스 특이적 고추 cDNA 라이브러리( library ) 제조와 환경 스트레스 내성 관련 CaBI -1 의 클로닝

어린 발달 단계(잎 6-7장)의 고추(Capsicum annuum cv. Bu Gang)에 42℃ 30분의 열충격을 주어 고온 스트레스를 가하고, 이로부터 mRNA를 추출(Cho and Hong, J. Plant Biol . 47:149-159, 2004; Sambrook, J. et al ., Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Ed., 1989)하여 cDNA를 합성하고(Sambrook, J. et al ., Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Ed., 1989), UNI-XR 벡터(Stratagene, 미국)에 삽입하여 고온스트레스 특이적 cDNA 라이브러리(library)를 제조하였다. 상기 제조된 cDNA 라이브러리를 대상으로 차별화 스크리닝(differential screening)을 하기의 방법과 같이 수행하였다. 고온스트레스 조건에서 추출한 mRNA를 주형으로 하여 제조된 ³²P로 표지된 cDNA(실험군 cDNA)와 스트레스가 가해지지 않은 정상적인 조건에서 생육하고 있는 고추에서 추출한 mRNA를 주형으로 하여 제조된 ³²P로 표지된 cDNA(대조군 cDNA)를 탐침으로 하여 수행하였다. UniZAP-XR 벡터에 삽입된 고추 cDNA 라이브러리를 23 cm × 23 cm LB 바텀 아가 플레이트(bottom agar plate)에 배양한 대장균(Escherichia coli) KW251 위에 도말하였다. 플레이트 위에 약 1×10⁵ 개의 플라크(plaque)가 형성된 후, 1차 스크리닝을 위해 플레이트를 하이본드-N 나일론(Hybond-N nylon) 막에 블롯팅(blotting)하였다. 이후 실험군 cDNA를 탐침으로 하여 전형적인 DNA-DNA 혼성화 반응을 수행하였다. 또한 동일한 플레이트로부터 블롯팅된 하이본드-N 나일론막을 대조군 cDNA를 탐침으로 하여 DNA-DNA 혼성화반응을 수행하였다(Sambrook, J. et al ., Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Ed., 1989).

그 결과 실험군 cDNA 프루브에서는 양성반응을 보이는 반면 대조군 cDNA 프루브에서는 음성반응을 보이는 플라크로부터 Exassist helper phage(M13)를 이용한 절제(excision) 과정을 통해 pBluescript II SK(-) plasmid 벡터에 들어있는 유전자 클론들을 분리하였고(Stratagene사의 매뉴얼 참조), 이들에 대해 자동DNA염기서열분석기(ABI 3730; Applied Bio-systems, 미국)를 사용하여 염기서열을 결정하였다. 상기에서 결정된 염기서열을 미국 NCBI에서 운영하는 공용 데이터베이스(//www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 상동성 유무를 검색하여 기존에 보고된 BAX 억제자(BAX inhibitor) 유전자와 비교한 결과, 리코페르시콘 에스쿨렌툼 벡스 억제자(Lycopersicon esculentum Bax inhibitor; AY380778.1) mRNA와 91%, 니코티아나 타바쿰 백스 억제자 1(Nicotiana tabacum Bax inhibitor 1; GenAF390556.1) mRNA와 85%의 높은 상동성을 보이는 것으로 확인되었으며 이를 “고추 백스 억제자 1(Capsicum annuum Bax Inhibitor-1)"(CaBI -1; 도 1, GenBank 접근 번호: ACS36610.1)이라 명명하였다. pBluescript 벡터에 CaBI -1 유전자가 삽입되어 있는 클론이 도입된 대장균(Escherichia coli strain DH5α)을 2009년 12월 03일자로 대한민국 경기도 수원시 권선구 서둔동 88-20 소재 농업유전자원센터에 기탁하였다(수탁번호: KACC95101P; 기탁일: 2009년 12월 03일)

<1-2> CaBI -1 의 염기서열 결정

엑소뉴클리아제 Ⅲ(exonuclease Ⅲ)를 사용하는 시퀀싱 키트(deletion kit for kilo-sequencing, Takara, 일본)를 이용하여 한쪽 방향 삭제 시리즈(deletion series)를 제작하였으며, 이들 deletion series에 대한 염기서열을 샹거(Sanger)의 다이디옥시 사슬 종결법(dideoxy chain termination, Sambrook J., Fritsch E.F., and Maniatis T., Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Ed., 1989)을 사용한 자동 DNA 염기서열분석기(ABI 3730; Applied Bio-systems, 미국)를 사용하여 CaBI -1의 전체 염기서열을 결정하였다. 그리고 일반적인 유전자 코돈을 따라 결정된 염기서열을 아미노산 서열로 번역하였다(도 2). CaBI -1은 서열번호 2로 기재되는 744개의 염기로 이루어진 ORF(open reading frame)를 가지고 있었으며, 서열번호 1로 기재되는 248개의 아미노산 서열로 번역되었다.

<1-3> CaBI -1 유전자 클론에 대한 RNA 블롯 분석

식물체에서 분리된 환경 스트레스에 의해 발현이 유도되는 유전자들은 다양한 환경 스트레스에 의해 공통적으로 발현이 유도됨이 알려진 바, 상기 실시예 <1-1>에서 분리된 고추의 BAX 억제자 cDNA 클론 CaBI-1에 대해 고온, 건조, 저온, 고염도, 중금속 및 침수 각각의 스트레스 하의 고추에서의 발현 양상을 RNA 블롯 분석법으로 검증하였다.

잎이 6-8장 난 파종 후 5주가 경과한 어린 고추 식물체에 고온, 건조, 저온, 고염, 중금속 및 침수 스트레스를 각각 하기와 같은 조건으로 처리하였다. 먼저, 고온 스트레스 처리는 90% 이상의 상대습도가 유지되는 배양기에서 42℃로 1시간, 2시간, 3시간, 4시간 처리하였다. 건조 스트레스 처리는 고추 식물체를 뿌리가 손상되지 않게 조심히 뽑아 물로 세척한 후 마른 여과지가 깔려 있는 페트리 디쉬 상으로 옮겨 12시간까지 25℃, 16시간 광주기가 유지되는 식물배양실에 위치하였다. 저온 스트레스 처리는 16시간의 광주기가 유지된 4℃ 저온실에서 고추 유식물을 24시간까지 위치하였다. 고염도 스트레스 처리는 고추 식물체를 뿌리가 손상되지 않게 조심히 뽑아 물로 세척한 후 250mM NaCl 용액에 뿌리를 4시간까지 침수시켰다. 중금속 스트레스 처리는 고추 식물체를 뿌리가 손상되지 않게 조심히 뽑아 물로 세척한 후 뿌리를 100mM의 CaCl₂, MgCl₂, MnCl₂, CoCl₂ 또는 LiCl 용액에 25℃, 16시간 광주기가 유지되는 식물배양실에서 24시간까지 침수하였다. 침수스트레스 처리는 16시간의 광주기가 유지되는 식물배양실에서 고추 유식물 전체가 물에 잠기도록 하여 72시간 동안 두었다.

고추 식물체로부터의 RNA 추출은 Cho 및 Hong(Cho and Hong, J. Plant Biol . 47:149-159, 2004)의 방법을 참조하였으며 방법은 하기와 같다. 고추 식물체를 액체 질소로 냉동한 후, 막자사발로 갈아 분말로 제조하였다. 분말에 세포용해 완충액(lysis buffer: 25 mM Tris-Cl pH 8.0, 50 mM LiCl, 35 mM EDTA, 35 mM EGTA, 0.5% SDS)을 첨가하고 강하게 교반하여 혼합하였다. 이후 동량의 페놀(phenol)을 첨가한 후 강하게 교반하였다. 이후 1/4 부피의 클로로포름(chloroform)을 추가적으로 첨가하고 강하게 교반하여 골고루 혼합시키고 20℃에서 6,000 g로 15분간 원심분리를 수행하였다. 원심분리 후 상등액을 취하고 동량의 4 M LiCl 용액을 첨가하고 원심분리기(microcentrifuge)로 4℃에서 15,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 RNA를 침전물로 수득하였다.

상기에서 수득한 RNA를 포름알데히드-아가로스 젤(formaldehyde-agarose gel) 전기영동으로 크기에 따라 분리하고 하이본드-N 막으로 블롯팅하였다(Sambrook, J. et al ., Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Ed., 1989). RNA 블롯 막은 α-³²P-dCTP로 표지된 CaBI - 1으로 혼성화(hybridization) 되었다. 혼성화 방법은 Sambrook의 방법(Sambrook, J. et al ., Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Ed., 1989)을 참조하였으며, 방법은 하기와 같다. 막은 용액[0.5 M sodium phosphate, pH 7.2, 7%(w/v) SDS 및 1 mM EDTA(pH 7.0)]에서 전-혼성화(prehybridization)되었고, 여기에 ³²P-dCTP로 표지된 CaBI - 1를 첨가하고 65℃에서 16-22 시간 동안 혼성화하였다. 혼성화된 막은 1X SSPE, 0.1% SDS 용액으로 65℃에서 세척하고 X-ray 필름에 감광시켰다(Sambrook J., Fritsch E.F., and Maniatis T., Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Ed., 1989).

그 결과, 분석된 다양한 환경 스트레스 하에서 정도의 차이를 보이기는 하나 공히 발현이 증가함을 확인하였다(도 3).

< 실시예 2> CaBI -1 유전자로 형질전환된 형질전환 식물체에서의 환경 스트레스 내성 실험

본 발명의 CaBI -1 유전자가 형질전환된 형질전환 식물체를 제조하기 위하여, 본 발명자들은 고추와 같은 가지과 식물인 담배를 숙주 식물체로 사용하였다. 담배의 형질전환을 위하여 니코티아나 타바쿰 위스콘신 38(Nicotiana tabacum cv. Wisconsin 38)의 어린 단계의 잎 절편을 사용하였다.

<2-1> CaBI -1 유전자를 포함하는 식물체 형질전환용 발현 벡터의 제조

CaBI -1 유전자의 단백질 기록 부위를 식물체의 염색체 내로 삽입하여 발현시 키기 위하여, pBluescript II SK(-)/CaBI -1 벡터에서 CaBI -1의 ORF의 양쪽 바깥 부위의 염기서열을 따라 설계된 프라이머 쌍(센스 프라이머(서열번호 3): 5'-ATATGGATCCATGGAGGGTTTCACGGTCGT-3' 및 안티센스 프라이머(서열번호 4) 5'-ATATGGATCCCTAGTTTCTCCTCTTCTTCTTC-3'; 밑줄 친 부분은 식물체 형질전환벡터에 ORF를 도입하기 위하여 ORF 바깥 쪽으로 BamHI 제한효소를 만들기 위하여 추가된 부분을 나타냄)을 이용하여 PCR을 수행함으로써 CaBI - 1으로부터 ORF만을 분리했고, 이를 식물체 형질전환벡터인 pBKS1-1(Suh et al ., Mol . Cells 4: 211-129, 1994)의 CaMV35S 프로모터(promoter) 다음의 BamHI 제한효소 위치에 삽입하였다. 즉, PCR 증폭된 DNA는 BamHI 처리하고 아가로즈 겔에 전기영동 하였고 단백질 기록 부위에 해당되는 위치의 DNA 절편을 GeneClean Ⅱ 키트(Bio 101, 미국)를 사용하여 아가로즈 겔로부터 순수 분리한 후, 상기 분리한 DNA 절편을 식물체 형질전환용 벡터인 pBKS1-1(Suh M.C. et al., Molecules and Cells , 4, 211-219, 1994)의 BamHI 위치에 T4 DNA 접합효소를 이용하여 19℃에서 8시간 동안 반응시켜 부착시킴으로써 CaBI -1 유전자의 식물체 형질전환용 발현벡터 pBKS1-1/CaBI - 1를 제조하였다(도 4A)(Sambrook, J. Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Ed., 1989).

상기 발현벡터 내에 CaBI -1 유전자의 단백질 기록부위가 pBKS1-1이 가지고 있는 CaMV35S 프로모터와 노팔린 합성효소(nopaline synthase)의 종결부위 사이에 올바르게 삽입된 것을, pBKS1-1/CaBI - 1를 DNA 시료로 준비하고 CaMV35S 프로모터의 3' 말단 부위를 프라이머를 이용하여 샹거(Sanger) 등의 다이디옥시 사슬 종결법을 이용하는 DNA 서열 키트(Sequenase version 2.0 DNA sequencing kit)를 사용하여 확인하였다. 정제한 DNA에 2 ㎕의 시쿼나제(sequenase) 완충액(200 mM TrisHCl, pH 7.5, 100 mM MgCl₂, 250 mM NaCl)과 0.5 pmol 프라이머를 참가하여 65℃에서 2분간 반응한 뒤 상온에 30분간 방치하였다. 여기에 1 ㎕의 0.1 M DTT, 2 ㎕의 1/5로 희석한 표지 혼합액(labeling mix), 0.5 ㎕의 [α-³⁵S]dATP, 2 ㎕의 1/8로 희석한 시쿼나제를 순서대로 첨가하여 혼합한 뒤 상온에서 2 내지 3분간 반응시켰다. 4 개의 튜브에 ddGTP, ddATP, ddTTP 및 ddCTP를 각각 2.5 ㎕씩 분주하여 37℃에 두고 여기에 3.5 ㎕의 표지 혼합액을 넣고 원심분리하여 반응액을 혼합한 뒤 다시 37℃에서 3 내지 5분간 반응시켰다. 4 ㎕의 반응 종료액을 각 튜브에 넣어 반응을 종료시킨 후 75 내지 80℃에서 2분 동안 가열한 다음 전기영동 겔에 2 내지 3 ㎕씩 로딩(loading)하여 전기영동 후 X-레이 필름에 감광시켜 염기서열을 분석하였다.

그 결과, 목표한 ORF는 발현벡터에 포함된 CaMV35S 프로모터(promoter)와 노팔린 합성효소(nopaline synthase)의 종결부위(terminator) 사이에 센스(sense) 또는 앤티센스(antisense) 방향으로 삽입되어 있음을 확인하였다(도 4A).

<2-2> pBKS1 -1/ CaBI -1 발현벡터의 식물체로의 형질전환

상기 실시예 <2-1>에서 수득한 pBKS1-1/CaBI -1 발현벡터를 아그로박테리움투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404에 도입하였다. 20 mM CaCl₂를 처리하여 제조한 형질전환 수용 세포(transformation competent cell)에 DNA를 첨가 하여 얼음에서 30분간 반응시킨 후 액체 질소에 1분간 방치하였다. 이것을 37℃ 수조에서 5분간 처리하여 녹인 후 1 ㎖ YEP 배지를 첨가하여 28℃에서 200 rpm으로 5시간 배양한 후 12,000 rpm으로 원심분리하여 아그로박테리움을 침전시켰다. 침전된 아그로박테리움을 0.1 ㎖ YEP 배지에 재현탁하여 카나마이신(kanamycin)이 함유된 LB 고체 배지에 도말하여 28℃에서 배양하였다(An G., Methods in Enzymology , 153, 292-305, 1987). 카나마이신 배지에서 콜로니를 형성한 균주를 CaBI -1 형질전환 균주로서 선별하였다.

상기에서 수득한 CaBI -1 형질전환 균주를 하기와 같은 방법으로 담배 생물체에 감염시켜 CaBI -1 형질전환 담배를 제조하였다. 즉, pBKS1-1/CaBI -1 발현벡터가 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 현탁액에 담배의 잎 절편을 암 상태에서 48시간 혼합시켜 배양한 후(Suh M.C., Hong C.B., et al ., Molecules and Cells, 4, 211-219. 1994), BAP 2.0 ㎎/ℓ, NAA 0.1 ㎎/ℓ, 카나마이신(kanamycin) 100 ㎎/ℓ 및 세포탁심(cefotaxim) 100 ㎎/ℓ가 함유된 MS 줄기 유도배지(Murashige T. and Skoog F., Physiol . Plant ., 15, 473-497, 1962)에서 4 내지 6주 동안 기내 배양하였다. 상기 기내배양에 의해 줄기가 유도되면 이를 다시 카나마이신이 200 ㎎/ℓ 함유된 MS 뿌리 유도배지(Murashige T. and Skoog F., Physiolia Plantarum ., 15, 473-497, 1962)로 옮겨 기내 배양하였다. 뿌리가 유도된 식물체를 토양으로 옮겨 심었으며, 자연광 하에서 온도가 25 ± 2℃로 유지되고 외부와 이중창에 의해서 차단된 온실에서 재배하여 성장과 개화 및 종자의 발달 과정을 분석하였다. 종자가 성숙되면 이를 수확하여 실온에서 2주일간 건조시킨 후 4℃에 보관하였다.

<2-3> pBKS1 -1/ CaBI -1 발현 형질전환 식물체의 환경 스트레스 내성 분석

상기 실시예 <2-2>에서 수득한 CaBI -1 형질전환 담배는 RNA 블롯 분석을 수행하여 도입한 CaBI -1가 제대로 발현되는지 확인하였다. RNA 블롯 분석에 사용된 방법은 상기 실시예 <1-2>에 기술된 방법과 동일하게 이루어졌다.

그 결과 생성된 식물체 대부분이 CaBI -1의 발현이 이루어진 형질전환 식물체임을 확인할 수 있었다. 즉, 센스 방향으로 도입된 형질전환 식물체의 경우에는 분석된 12 라인의 식물체 중 11 라인에서 강력한 RNA blot 결과가 확인되었고 엔티센스의 경우에는 분석된 9 라인 중 8 라인에서 강력한 RNA blot 결과가 확인되었다. 반면 야생형과 vector만이 도입된 식물체로부터는 센스와 앤티센스에서 공히 RNA 블롯 결과가 음성으로 나타났다(도 4B 및 도 4C).

상기 CaBI -1 형질전환 담배를 온실에서 재배하며 자가수분을 유도하여 종자를 수확하였다. 상기 수확된 종자를 파종하여 식물체를 얻고 이를 대상으로 환경 스트레스 내성의 증가 여부를 확인하는 생체 분석 실험을 수행하였다.

환경 스트레스에 대한 내성의 증가를 확인하기 위한 생체 분석은 하기와 같이 수행되었다. 고온내성 분석과 건조내성 분석은 공통적으로 수확한 종자를 카나마이신이 200 mg/ml 함유된 MS-아가 배지에서 발아시켜 키워 초록색으로 변하는 유식물만을 골라 배양토가 담겨있는 화분에 이식하고 배양실에서 배양하여 사용하였다.

1) 고온내성분석: 잎이 8-10개 난 CaBI -1 형질전환 담배를 습도가 90% 이상 유지되는 배양기에서 48℃로 2시간 고온 처리를 하고 25℃의 배양실로 옮겨 1주일간 배양하였다. 그리고 잎을 채취하여 액체질소에 얼리고 -70℃ 초저온냉동고에 보관하였다. 이로부터 단백질과 엽록소를 추출하여 정량을 함으로써 식물체의 고온내성 정도를 검증하였다.

상기 식물체로부터 단백질의 추출은 미국 미주리주의 Columbia Proteomic Center에서 개발한 방법에 따랐다. 요약하면 다음과 같다. 액체질소에 얼리고 초저온냉동고에 보관된 잎을 액체질소 속에서 막자사발로 갈아 분말화하였다. 분말 0.3 g을 1.5 ㎖ 마이크로 튜브에 넣고 4× 단백질 추출완충액(0.175 M Tris-Cl pH 8.8, 5% SDS, 15% 글리세롤과 0.3M dithiothreitol)을 0.5 ㎖을 첨가하였다. 볼텍스(vortex)를 하여 잘 섞은 후 얼음 위에 15분간 방치하였다. 그리고는 마이크로 원심분리기로 15000 rpm으로 4℃에서 15분간 원심분리하고, 상등액을 새 1.5 ㎖ 마이크로 튜브에 넣고 다시 15000 rpm으로 4℃에서 15분간 원심분리하였다. 상등액을 취하여 브래드포드 방법에 근거한 Bio-Rad(미국) 단백질분석시스템을 사용하여 정량하였다.

식물체로부터의 엽록소 추출은 다음과 같이 수행하였다. 분말 0.2g을 코니컬 튜브에 넣고 80% 아세톤을 첨가하고 볼텍스한 후, 실온에서 48시간 암소에서 방치한 다음 상등액 만을 취하였다. 분광 광도계를 이용하여 상등액에 대한 흡광도를 645 nm와 663 nm에서 측정하였다. 측정된 흡광치를 하기 수학식 1에 대입함으로써 엽록소를 정량하였다.

엽록소a + 엽록소b = 0.0202 A₆₄₅ + 0.00802 A₆₆₃(Mochizuki et al., 2001, Proc Natl Acad Sci USA 98: 2053-2058).

2) 내건성 분석: 잎이 4-5개 난 CaBI -1 형질전환 담배를 배양실에서 35일간 물주기를 멈추어 건조스트레스를 가하였다. 여기에 물을 준 후, 2일 후에 생체량과 상대수분량을 측정함으로써 내건성을 측정하였다. 생체량은 지상부위를 잘라 무게를 측정한 수치로 하였다. 상대수분량은 지상부위만을 절단하여 두 시간 동안 물에 침수시키고 측정한 무게와 절단된 지상부위를 54℃에서 48시간 건조시킨 후 측정한 무게를 하기 수학식 2에 대입하여 결정하였다.

상대수분량 =(생체량 - 건조량)/(침수 후 무게 - 건조량) x 100(Bray 등, 2000).

3) 고염도 내성 분석: 카나마이신이 함유된 MS-아가배지에서 발아되고 15일간 배양된 CaBI -1 형질전환 담배를 NaCl이 각 0, 50, 100 및 200 mM이 함유된 MS-아가배지로 옮겼다. 그리고 전체를 수직으로 세우고 배양실에서 10일간 배양 후, 뿌리의 길이를 측정하여 고염도 내성을 정량하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 고온 스트레스가 대조구(wild type과 vector만이 도입된 형질전환체)의 경우 심각한 피해를 입혀 잎은 황화되었고 성장 은 멈추었으나, CaBI -1이 도입된 형질전환체는 잎의 황화와 성장의 감소 정도가 외관상으로도 적게 나타났다.

이의 정량화를 위해 고온 처리 후 7일간 배양실에서 식물체를 배양하고 엽록소의 양과 단백질의 양을 측정하여 대조구와 CaBI -1이 도입된 형질전환체의 고온스트레스에 의한 피해 정도를 비교하였다.

그 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이 대조구의 경우는 엽록소의 함량이 생체량 g당 1.46-1.64 mg인 반면, CaBI -1이 도입된 형질전환체의 경우는 엽록소의 함량이 생체량 g당 2.09-2.36 mg이었다. 단백질의 함량도 비슷한 경향을 보여, 대조구의 경우는 생체량 g당 단백질 함량이 3.28-3.68 mg인 반면, CaBI-1이 도입된 형질전환체의 경우는 단백질 함량이 생체량 g당 4.11-5.79 mg이었다(도 5).

또한, 도 6에서 나타난 바와 같이 35일간 물주기를 멈추어 준 건조 스트레스에 대해서도 CaBI -1이 도입된 형질전환체가 대조구에 비해 보다 우수한 내성을 나타내었다. 물주기를 재개하여 2일이 지난 후 측정한 생체량의 비교치는 CaBI -1이 도입된 형질전환체가 대조구에 비해 1.7배에서 2.4배 만큼 생체량이 큰 것을 보여주었다. 아울러, 상대수분량에 있어서도 CaBI -1이 도입된 형질전환체가 대조구에 비해 4.58-17.91% 만큼 높은 수치를 나타내었다(도 6).

아울러, 도 7에서 나타난 바와 같이 고염도에 대한 내성 분석의 결과도 CaBI -1이 도입된 형질전환체가 대조구에 비해 우수한 내성을 보였다. 50 mM NaCl이 함유된 배지에서 대조구는 평균 17%의 뿌리 길이의 감소가 관찰된 반면, CaBI -1이 도입된 형질전환체는 평균 9%의 뿌리 생장이 관찰되었다. NaCl 100 mM이 함유 된 배지에서는 대조구의 경우 뿌리 생장의 감소가 심화되었으나 CaBI -1이 도입된 형질전환체의 경우, 뿌리 생장의 감소가 관찰되지 않았다. NaCl 200 mM이 함유된 배지에서는 S-2 라인을 제외하고는 대조구나 CaBI -1이 도입된 형질전환체 모두에서 심각한 피해가 관찰되었다. 또한, 고염도 스트레스 조건에서 생체량의 경우, CaBI -1이 도입된 형질전환체 라인 중에서 S-2와 S-7 라인을 제외하고는 대조구와 생체량의 감소가 유사함이 관찰되었다. CaBI -1이 도입된 형질전환체 및 대조구 모두에서 NaCl 50 mM이 배지에 함유된 경우에는 평균 25%의 생체량 감소, 100 mM이 함유되었을 경우에는 평균 45%의 생체량 감소가 관찰되었고, S-2 라인을 제외한 모든 식물체에서 NaCl 200 mM이 함유되었을 경우 사멸하는 것을 관찰하였다(도 7).

도 1은 CaBI -1을 포함하는 플라스미드 벡터 pBluescript Ⅱ SK(-)/CaBI -1 벡터의 유전자 지도이다.

도 2는 본 발명의 환경 스트레스 내성 유도 유전자의 염기 서열 및 아미노산 서열이다.

도 3은 고추 식물체에 고온, 건조, 저온, 고염도, 중금속, 침수 스트레스를 가한 후, CaBI -1 유전자 발현 양상을 RNA 블롯을 통해 확인한 결과이다.

도 4A는 CaBI -1 유전자를 식물체에서 발현시키기 위해 사용된 식물 발현 벡터 pBKS1-1/CaBI -1의 유전자 지도이다.

도 4B와 C는 본 발명의 식물 발현 벡터 pBKS1-1/CaBI -1가 도입되어 형질전환된 담배 식물체에서 CaBI-1이 sense 또는 antisense 방향으로 발현됨을 확인하는 RNA 블롯 분석 결과이다.

도 5는 본 발명의 pBKS1-1/CaBI -1 벡터가 도입되어 형질전환된 담배 식물체와 상기 벡터가 도입되지 않은 담배 식물체에 고온 스트레스를 가한 후 비교한 생체 실험 결과이다.

도 6은 본 발명의 pBKS1-1/CaBI -1 벡터가 도입되어 형질전환된 담배 식물체와 상기 벡터가 도입되지 않은 담배 식물체에 건조 스트레스를 가한 후 비교한 생체 실험 결과이다.

도 7은 본 발명의 pBKS1-1/CaBI -1 벡터가 도입되어 형질전환된 담배 식물체와 상기 벡터가 도입되지 않은 담배 식물체에 고염 스트레스를 가한 후 비교한 생 체 실험 결과이다.

<110> SNU R&D Foundation <120> A red pepper gene CaBI-1 confers stress-tolerance to plants <130> 9p-11-68 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 248 <212> PRT <213> Capsicum annuum <400> 1 Met Glu Gly Phe Thr Ser Phe Phe Glu Ser Gln Ser Ala Ser Arg Ser 1 5 10 15 Arg Trp Asn Tyr Asp Ala Leu Lys Asn Phe His Gln Ile Ser Pro Arg 20 25 30 Val Gln Thr His Leu Lys Gln Val Tyr Leu Thr Leu Cys Cys Ala Leu 35 40 45 Val Ala Ser Ala Ala Gly Ala Tyr Leu His Ile Leu Trp Asn Ile Gly 50 55 60 Gly Phe Leu Thr Thr Leu Ala Cys Ile Gly Ser Met Val Trp Leu Leu 65 70 75 80 Ala Thr Pro Pro Tyr Gln Glu Gln Lys Arg Val Ala Leu Leu Met Ala 85 90 95 Ala Ala Leu Phe Glu Gly Ala Ser Ile Gly Pro Leu Ile Glu Leu Gly 100 105 110 Ile Asn Phe Asp Pro Ser Ile Val Leu Gly Ala Phe Val Gly Cys Gly 115 120 125 Val Val Phe Gly Cys Phe Ser Ala Ala Ala Met Leu Ala Arg Arg Arg 130 135 140 Glu Tyr Leu Tyr Leu Gly Gly Leu Leu Ser Ser Gly Val Ser Leu Leu 145 150 155 160 Met Trp Leu His Phe Ala Ser Ser Ile Phe Gly Gly Ala Met Ala Leu 165 170 175 Phe Lys Phe Glu Val Tyr Phe Gly Phe Leu Val Phe Val Gly Tyr Ile 180 185 190 Val Phe Asp Thr Gln Glu Ile Ile Glu Lys Ala His Leu Gly Asp Met 195 200 205 Asp Tyr Val Lys His Ala Leu Thr Leu Phe Thr Asp Phe Val Ala Val 210 215 220 Phe Val Arg Ile Leu Ile Ile Met Leu Lys Asn Ala Phe Glu Lys Glu 225 230 235 240 Glu Lys Lys Lys Lys Arg Arg Asn 245 <210> 2 <211> 747 <212> RNA <213> Capsicum annuum <400> 2 auggaggguu ucacgucguu cuucgaaucg caaucggcuu cucgcagucg cuggaauuau 60 gaugcucuca aaaacuucca ucagaucucu ccucguguuc aaacucaucu caaacagguc 120 uaccucacac uaugcugugc uuuagucgca ucagcugcug gggcuuaccu ucacauucuu 180 uggaacaucg guggcuuccu cacaacacug gcuugcauug gaagcauggu guggcuucug 240 gcaacuccuc cuuaucaaga gcaaaaaagg guggcacuuc ugauggcagc ugcacucuuu 300 gaaggcgcuu caauuggucc ucugauugaa cugggcauca acuucgaccc aagcauugug 360 cuuggugcuu uuguagguug uggugugguu uuugguugcu ucucagcugc ugccauguug 420 gcaaggcgca gggaguacuu guaccuugga ggccuucuuu caucuggugu cucccuccuc 480 augugguugc acuuugcauc cuccauuuuu gguggugcca uggcccuuuu caaguuugag 540 guguauuuug guuucuuggu guuugugggc uacauaguuu uugacaccca agaaaucauu 600 gagaaggcuc acuuggguga uauggauuac gucaagcaug cacucacccu cuucacagau 660 uuuguugcag ucuuugugcg gauuuugauc aucauguuga agaaugcauu ugagaaggaa 720 gagaagaaga agaagaggag aaacuag 747 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaBI-1 sense primer <400> 3 atatggatcc atggagggtt tcacggtcgt 30 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaBI-1 antisense primer <400> 4 atatggatcc ctagtttctc ctcttcttct tc 32

Claims

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서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드를 숙주에 형질도입하여 제조한 고온, 건조 및 고염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 환경 스트레스 내성을 보이는 형질전환체.
제 5항의 형질전환체의 자손 또는 클론인 식물체.
제 5항의 형질전환체의 종자, 열매, 이삭, 괴경, 괴근, 주, 캘러스 또는 원형질체.
제 5항에 있어서, 상기 숙주는 미생물, 동물세포, 식물세포, 동물 또는 식물체 및 이들로부터 유래된 배양세포인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
제 6항에 있어서, 상기 식물체는 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물인 것을 특징으로 하는 식물체.
1) 제 5항의 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 발현벡터를 제조하는 단계;

2) 단계 1)의 발현벡터를 숙주 식물세포에 도입하는 단계; 및

3) 단계 2)의 형질전환된 식물 세포를 조직 배양하여 재분화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 고온, 건조 및 고염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 환경 스트레스 내성 유도 유전자 형질전환체의 제조 방법.
제 10항에 있어서, 상기 단계 2)의 발현벡터를 숙주 식물세포에 도입하는 단계는 아그로박테리움 매개방법, 유전자 총(gene gun), PEG를 이용한 방법 및 전기천공법(electroporation)으로 수행되는 것을 특징으로 하는 환경 스트레스 내성 유도 유전자 형질전환체의 제조 방법.
제 10항에 있어서, 상기 단계 2)의 식물 세포는 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물인 것을 특징으로 하는 환경 스트레스 내성 유도 유전자 형질전환체의 제조 방법.
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