KR101169850B1 - 트로락스를 포함하는 골 대사성 질환 또는 골 전이성 암 질환 예방 및 치료용 약제학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 트로락스(Trolox)를 포함하는 골 대사성 질환 또는 골 전이성 암 질환 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물에 포함되는 트로락스(Trolox)는 수용성 비타민 E 유사체로서 NF-κB의 수용체 활성 인자 리간드(Receptor Activation for Nuclear Factor κB Ligand, RANKL)의 발현 및 c-Fos 단백질의 발현을 저해하고, 파골 세포의 형성을 억제한다. 본 발명의 조성물에 포함되는 트로락스는 파골 세포의 전구체에서 c-Fos 단백질 발현을 직접 억제할 뿐만 아니라 조골세포에서 RANKL의 발현을 간접적으로 억제함으로써 파골 세포 형성을 저해하며, 인터루킨-1(IL-1) 에 의한 파골 세포 형성으로 인한 골 손실을 막으므로, 치료학상 과도한 골 파괴로 인한 여러 골 대사성 질환 및 골 전이성 암 질환을 억제하고 치료하는데 유용하다.

골 대사성 질환, 트로락스(Trolox), NF-κB의 수용체 활성 인자 리간드(RANKL), c-Fos, IL-1

Description

트로락스를 포함하는 골 대사성 질환 또는 골 전이성 암 질환 예방 및 치료용 약제학적 조성물{A pharmaceutical composition for preventing and treating bone metabolic disease or metastatic cancer by bone metastasis comprising Trolox}

본 발명은 조골세포에서의 NF-κB의 수용체 활성 인자 리간드(RANKL)의 유도를 억제하고 파골 세포 전구체에서의 c-Fos 단백질의 감소로 인하여 파골 세포의 형성 및 골 손실 감소에 우수한 효과를 나타내는, 트로락스(Trolox)를 포함하는 골 대사성 질환 또는 골 전이성 암 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

골 조직은 연골과 골격계를 구성하며 기계적 기능으로 지지와 근 부착의 역할을 하고, 생체기관 및 골수를 보호하는 기능을 하며, 칼슘과 인 이온의 항상성 유지를 위해 이들을 보존하는 기능을 담당한다. 골 조직은 교원질, 당단백질과 같은 세포 기질과 조골세포, 파골 세포 및 골세포 등 여러 종류의 세포들로 이루어진다. 골수 내 간질세포(bone marrow stromal cell)로부터 유래한 조골세포는 골 형성에 주된 역할을 담당하며. 조혈모세포로부터 유래 되는 파골 세포는 파괴된 노화 된 골의 흡수를 담당하여, 조골세포와 파골 세포의 균형 있는 작용을 하여 골의 재형성(remodeling)을 유지하게 된다.

골 대사성 질환은 생체 내에서 파골 세포와 조골세포와의 평형이 깨짐으로써 발생한다. 골 대사성 질환의 예로써 골다공증을 들 수 있는데 골다공증은 조골세포에 비하여 파골 세포의 활성이 증가함으로써 총 골량(total bone mass)이 감소하면서 경미한 충격에도 뼈가 쉽게 부서지게 되는 질환을 말한다. 이 외에도 종양이 전이된 전이성 암, 류마티스성 관절염, 퇴행성 관절염 및 세균의 감염에 의해 치조골의 파괴를 유발하는 치주 질환 등이 있다. 골 대사 질환 등은 파골 세포가 과도하게 활성화되어 뼈를 쉽게 파괴하는 결과를 초래하게 된다.

파골 세포 전구체(osteoclast progenitor)는 골수에서 기원하는 단핵 세포/대식 세포(monocyte/macrophage) 계통의 조혈 세포(hematopoietic cell)이다. 파골 세포 전구체는 골수에서 생성되는 성장인자와 사이토카인에 의해 파골 세포로 분화된다(Roodman G. D., Endocr. Rev., 17, 308-332 (1996)). 파골 세포는 뼈를 파괴 또는 흡수하는 역할을 한다.

파골 세포로 분화하는데 필요한 파골 세포 분화 인자(Osteoclast Differentiation Factor, ODF)가 최근에 클로닝 되는데, 파골 세포 분화 인자는 세포막에 결합 된 종양괴사인자(Tumor Necrosis Factor, TNF) 리간드족의 일원이다. 유전공학적으로 만들어진 ODF는 대식세포 콜로니 자극 인자(Macrophage Colony Stimulating Factor, M-CSF)의 존재 하에 조골세포나 기저세포(stromal cells) 없이도 파골 세포를 형성할 수 있음이 밝혀졌다. ODF는 다른 이름으로 오스테오프로테그린(osteoprotegerin ligand, OPGL) 또는 NF-κB의 수용체 활성 인자 리간드(RANKL))이라고도 한다. OPG은 TNF수용체의 일종으로 파골 세포의 전구체 및 성숙한 파골 세포에 존재하는 NF-κB의 수용체 활성 인자(RANK)에 결합하여 작용한다. 생쥐에서는 ODF의 발현이 뼈, 비장 흉선 및 폐에 한정되어 있다. 배양된 조골세포에 있어서는 뼈의 재흡수 자극과 함께 ODF의 발현이 증가한다고 보고되었다 (Suda T. et. al., Endocr. Rev., 20,345-357 (1999); Yasuda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(7), 3597-3604 (1998)). 파골 세포 생성 억제인자(osteoclastogenesis-inhibitory factor)는 오스테오프로토게린(osteoprotogerin, OPG)이라고도 하며 파골세포의 생성 및 성숙한 파골세포의 활성을 억제하는 단백질이다. OPG는 TNF 수용체의 분비 단백질로서 세포에 결합한 ODF와 높은 친화도로 결합한다.

뼈와 조직에 염증이 생기면 혈류 내 사이토카인의 수치가 증가하게 되고, 이 사이토카인 중 하나인 인터루킨-1(IL-1)과 TNF등이 모세혈관에 신호를 보내게 되고 세포 표면에 RANKL이라는 분자를 표시하게 된다. RANKL은 인체가 파골 세포(osteoclast)를 만드는 과정 및 파골 세포의 활성화하는 과정에 중요한 신호이며 M-CSF의 존재 하에 파골 세포 전구체가 성숙한 파골 세포로의 분화에 중요한 역할을 담당하는 요소이다.

M-CSF 및 RANKL은 파골 세포의 형성과 분화에 중요한 요소이다. RANKL은 시험관 내에서 M-CSF 존재 하에 파골 세포의 전구체에서 파골 세포의 형성을 촉진하는데, RANKL이 RANK 수용체에 결합됨으로써 삼중화합물을 생성하고, 몇 가지 신호전달계(signal cascade)의 활성화가 이루어진다. 활성화된 신호전달경로는 TNF 수용체 연관 인자 6(receptor-associated factor 6)로써 NF-κB, c-Jun N-말단 단백질 키나아제(c-Jun N-terminal protein kinase, JNK), p38 MAP 키나아제(p38 mitogen-activated protein kinase), 세포외 신호 조절 키나아제(extracellar signal-regulated kinase, ERK), P13K/AKT등을 포함하는 멀티플 다운스트림(multiple downstream) 신호 체계를 의미한다.

또한, PU.1, 소안구증 연관성 전사 인자(microphthalmia-associated transcription factor, MITF), NF-κB및 c-Fos, NFAT2등의 몇몇 전사 인자들은 파골 세포의 발달에 있어 역할을 하는 것으로 보인다. PU.1, MITF는 파골 세포화 경로에서 초기 비특이적인 분화에서 역할을 담당한다(Teitelbaum SL,Ross FP 2003 Genetic regulation of osteoclast development and function. Nat Rev Genet 4:638-849).

반면에 NF-κB, c-Fos와 NFAT2는 파골 세포 형성에서 RANKL의 신호 체계에 있어 하위에서 기능을 발휘한다. RANKL은 NF-κB 경로를 활성화하고, NF-κB의 하위 단위인 p50과 p52가 결손 된 마우스는 파골 세포의 생장이 둔화 되면서 골 석화증이 심화 된다(Iotsova V, Caamano J, Loy J, Yang Y, Lewin A, Bravo R 1997 Osteopetrosis in mice NF-kappaB1 and NF-kappaB2. Nat Med3:1285-1289). 다시 말 해, RANKL이 파골 세포의 전구체에 작용하면서, AP-1 전사 인자 중 하나인 c-Fos를 현저하게 조절하게 되며, c-Fos가 결손 된 마우스는 파골 세포의 분화가 일어나지 않으면서 골 석화증이 심화 된다.

RANKL에 의해 유도된 파골 세포 분화 중 c-Fos 상위 신호로서 NF-κB의 역할의 규명과 같은, 골다공증을 비롯한 골 대사성 질환의 예방 및 치료를 위한 연구가 활발하게 이루어지면서 부갑상선 호르몬, 골 형성 단백질, TGF-β와 같은 골 형성 촉진 인자와 에스트로겐, 비타민 D와 그의 유사체 등과 같은 파골 억제 인자가 개발되었다.

트로락스(Trolox)는 6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2 카르복실산(6-hydroxy-2,5,7,8,-tetramethylchroman-2-carboxylic acid)으로서 피틸 쇄(phytyl chain)를 대신하여 카르복실 그룹을(carboxyl group)갖는 α-토코페롤에서 유래한 수용성 비타민 E 유사체이다. 트로락스는 산성에 의한 인간 림프구에서 DNA 손상을 방지하고 신장의 인접한 세뇨관 상피 세포(proximal tubular epithelial cell)에서 시스플라틴(Cisplatin)에 의한 세포 사멸을 억제한다. 또한 트로락스는 몇몇 암 세포에만 특이적으로 작용하여 세포 사멸을 유도한다. 아울러, 운트 신호 전달 경로(Wnt signaling pathway)를 변형시키는 메커니즘을 통해 아밀로이드 베타 펩타이드와 하이드로젠 퍼옥사이드를 매개로 한 신경 독성에 대한 보호 역할을 수행한다. 동물 모델에 있어, 트로락스는 국소 빈혈에 의한 간의 약물 대사 기능 장애(hepatic drug-metabolizing dysfunction)를 증가시키고, 3 산화 비소(arsenic trioxide)의 영향인 항 임파종을 향상시키는 것으로 알려져 있다.

기존 몇몇 연구 결과에 따르면 활성 산소 원들(reactive oxygen species)이 골 손실 및 파골 세포의 분화에 연관되어 있다고 한다. 티올(Thiol) 항산화 물질 (antioxident)들은 에스트로겐 결핍시 일어나는 골 손실에 있어 중추적인 역할을 담당한다. N-아세틸 시스테인(N-acetyl cystein)이나 아스코르브산염(ascorbate)등 항산화 물질은 난소 절제(ovariectomy)후 일어나는 골 손실을 저해한다(Wang ZQ, Ovitt C, Grigoriadis AE, Mohle-Steinlein U, Ruther U, Wagner EF 1992 Bone and haematopoietic defects in mice lacking c-Fos. Nature360:741-745). 최근에는 세포간 활성 산소 원들이 분열제활성 단백질 키나아제(Mitogen-Activated Protein Kinases, MAPKs)와 RANKL에 의해 신호 전달 경로뿐 아니라 파골 세포의 분화와 성장 과정도 매개한다고 알려져 있다(Lee NK, Choi YG, Baik JY, Han SY, Jeong DW, Bae YS, Kim N, Lee SY 2005 A crucial role for reactive oxygen species in RANKL-induced osteoclast differentiation. Blood 106:852-859). 이러한 기존의 연구들은 세포 간 활성 산소원들의 농도를 저하시키면 RANKL에 의한 신호 전달 경로를 억제할 수 있다는 사실을 알려 준다.

현재까지 트로락스는 RANKL에 의한 인접한 신호 전달 경로의 관계에는 영향을 주지 않는다고 알려져 있다.

이렇듯 상기와 같은 트로락스의 다양한 이점이 있음에도 불구하고, 특히 파골 세포의 골 손실에 있어 트로락스의 효과에 대한 연구가 거의 미비함에 따라, 본 발명자는 부작용이 적고, 파골 세포의 형성 및 분화를 억제하는 기전에 선택적으로 작용하는 효과가 우수한 트로락스를 포함하는 약제학적 조성물에 대한 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 트로락스(Trolox)를 포함하는 골 대사성 질환 또는 골 전이성 암 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 트로락스를 포함하는 골 대사성 질환 또는 골 전이성 암 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 용어 "트로락스(Trolox)"는 6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2카르복실산(6-hydroxy-2,5,7,8,-tetramethylchroman-2-carboxylic acid)으로서 피틸 쇄(phytyl chain)를 대신하여 카르복실 그룹을(carboxyl group)갖는 α-토코페롤에서 유래한 비타민 E 의 친수성 유도체이며, 하기 화학식 1로 표현된다.

상기 트로락스는 산성에 의한 인간 림프구에서 DNA 손상을 방지하고 신장의 인접한 세뇨관 상피 세포(proximal tubular epithelial cell)에서 시스플라틴(Cisplatin)에 의한 세포 사멸을 억제한다. 뿐만 아니라, 트로락스는 몇몇 암 세포에만 특이적으로 작용하여 세포 사멸을 유도한다. 또한, Wnt 신호 전달 경로(Wnt signaling pathway)를 변형시키는 메커니즘을 통해 아밀로이드 베타 펩타이드와 하이드로젠 퍼옥사이드를 매개로 한 신경 독성에 대하여 보호하는 역할을 한다. 동물 모델에 있어, 트로락스는 국소 빈혈에 의한 간의 약물 대사 기능 장애(hepatic drug-metabolizing dysfunction)를 증가시키고, 3 산화 비소(arsenic trioxide)의 영향인 항 임파종을 향상시킨다.

본 발명에 사용되는 트로락스는 공지의 제조방법에 의해 당업자가 용이하게 제조하여 사용할 수 있으며, 혹은 상업적으로 이용 가능한 기 제조된 트로락스를 사용할 수도 있다. 구체적인 일 실시예로서, 본 발명자는 Sigma 사에서 제조하여 상업적으로 판매하고 있는 트로락스를 구입하여 본 발명의 약제학적 조성물을 제조하였다. 본 발명의 트로락스의 함량은 바람직하게 1 내지 1000μM, 보다 바람직하게는 100 내지 1000μM, 더욱 바람직하게는 200 내지 800μM, 보다더욱 바람직하게는 400 내지 600μM일 수 있으며, 가장 바람직하게는 500μM이다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 파골세포 형성의 완벽한 억제효가 있는 트로락스(Trolox)의 적절한 함량이 500μM인 결과를 얻을 수 있었다(실시예 1).

본 발명의 골 대사성 질환에는 에스트로겐의 부족으로 인한 인터루킨-1(IL-1)에 의한 골 파괴와 염증성 질환 등이 포함될 수 있고, 과도한 파골 세포의 골 흡 수에 의한 골다공증(osteoprosis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 치주질환(periodontal disease), 파제트병(Paget disease) 및 전이성 암 (metastatic cancers)등과 같은 병리학적 골 질환으로 골 파괴를 촉진하는 질환이 포함되나, 상기 예에 의해 본 발명의 골 대사성 질환이 제한 되는 것은 아니다.

바람직한 다른 일 양태로서, 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 골 대사성 질환 뿐만 아니라 암의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "암 (cancer)"이란 세포의 사멸 조절과 관련된 질병으로서, 정상적인 아팝토시스 균형이 깨지는 경우 세포가 과다 증식하게 됨으로써 생기는 질병으로서, 본 발명에서의 용어 암이란 골 전이에 의한 모든 암을 의미하며, 본 발명은 바람직하게 골 전이에 의해 유발되는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 바람직하게 본 발명은 또한 암세포의 골전이에 의한 전이성 암질환을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 트로락스의 용도를 제공한다.

본 발명의 전이성 암질환의 종류로는 전이에 의한 골암 자체 뿐만 아니라 뇌척수종양, 두경부암, 폐암, 유방암, 흉선종, 식도암, 취암, 대장암, 간암, 췌장암, 담도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 림프종, 급성 백혈병, 만성 백혈병, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종 및 피부암등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명의 골전이에 의함 암질환의 종류가 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 목적상 트로락스를 포함하는 조성물은 골전이에 의해 유발되는 암 질환을 억제 또는 경감 시키며, 바람직하게는 흑색종에 의한 골전이 및 상기 골전이에 의한 전이성 암 질환을 억제할 수 있다.

골은 폐 및 간 다음으로 세번째로 전이가 가장 흔하게 발생하는 부위로서, 특히 유방암, 전립선암 및 폐암은 전이성 질환의 일차적인 부위이다. 이러한 골 전이는 골 손상(bone lesion)을 유발하며, 일반적으로 심한 골 통증을 동반한다. 또한 골전이에 따라 척추에 전이되는 경우, 신경의 압박 및 마비가 유발될 수 있으며, 암세포에 의한 뼈 조직의 파괴로 척추 및 다리 뼈를 비롯한 골절이 유발될 수 있다. 경우에 따라 구토 및 두통등의 다양한 증상이 수반되는 고 칼슘혈증이 발생하기도 한다. 따라서 종양에 의한 골 통증 뿐만 아니라 골전이에 따른 추가적인 질환을 경감 및 억제하기 위하여 효과적인 치료제가 요구되는데, 본 발명의 트로락스를 포함하는 약제학적 조성물은 일반적인 골 대사성 질환 뿐만 아니라 상기 암의 골 전이에 의한 질환에도 효과적임을 확인하였다.

바람직한 하나의 양태로서 본 발명의 약제학적 조성물은 파골 세포의 형성을 억제하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서의 용어 "파골 세포"는 대식 세포 전구체(macrophage precursor)로부터 파생되는 세포로 파골 세포 전구 세포들은 대식 세포 콜로니 자극 인자(macrophage colony stimulating factor, M-CSF), NF-κB의 수용체 활성 인자 리간드(RANKL) 등에 의해 파골 세포로 분화되며 융합을 통해 다핵 파골세포(multinucleated osteoclast)를 형성한다. 파골 세포는 αvβ3 인테그린(integrin) 등을 통해 골에 결합하며 산성 환경을 조성하는 한편 각종 콜라게네이즈(collagenase) 및 프로테아제(protease)를 분비하여 골 흡수(bone resorption)를 일으킨다. 파골 세포는 완전히 분화된 세포로 증식하지 않으며 약 2주간의 수명이 다하면 세포 사멸(apotosis)를 일으킨다.

하나의 구체적인 일 양태로서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 유효성분인 트로락스는 분화 초기 단계를 타겟으로 하며 파골세포의 형성을 억제하며, 바람직하게 본 발명인 트로락스(Trolox)를 포함하는 약제학적 조성물은 RANKL에 의해 유도된 c-Fos 단백질 농도를 억제함으로써 골의 손실을 감소시킨다.

본 발명에서의 "c-Fos/c-Jun/NFAT2" 경로(pathway)는 파골 세포 형성에 중추적이고 근본적인 역할을 수행한다. 또한 이들 중 어떤 것이라도 부족하게 되면 파골 세포 형성을 저해하게 된다(Teitelbaum SL 2004 RANK c-Jun in osteoclast development. J Clin Invest 114:463-465). 상기 c-Fos와 c-Jun는 AP-1 전사 인자의 구성원이며 NFAT2 프로모터에 부착됨으로써 NFAT2의 발현을 조절한다 (Matsuo K, GAlson DL, Zhao C, Peng L, Laplace C, Wang KZ, Bachler MA, Amano H, Aburatani H, Ishikawa H, Wagner EF 2004 Nuclear factor of activated T-cells(NFAT) rescues osteoclastogenesis in precursors lacking c-Fos. J Biol Chem 279:26475-26480).

기존에 보고된 바에 따르면, RANKL이 축적되면 골수 대식세포에서 c-Fos와 NFAT2 단백질의 발현을 증가시키게 되는데, 트로락스는 RANKL에 의해 유도된 c-Fos와 NFAT2의 발현을 억제하나, c-Fos mRNA의 발현에는 영향을 미치지 않으며(도 5a 및 5b), c-Fos 단백질의 발현의 감소는 투여량 의존적인 경향을 보였다(도 5c 및 5d). 본 발명인 트로락스를 포함하는 약제학적 조성물은 골수 대식세포에서 c-Fos 단백질의 번역(translation)을 억제하며, 본 발명의 바람직한 실시예에 의한 순간 표지 추적 실험(pulse-chase experiment)으로부터 c-Fos 단백질 합성을 측정한 결과, c-Fos의 단백질 합성이 RANKL의 축적에 따라 증가하며, 트로락스에 의해 감소 된다는 결과를 얻을 수 있었다.

바람직하게, 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 트로락스는 생체 내(in vivo)에서 IL-1에 의해 유도된 파골 세포 형성을 억제하는 것을 특징으로 한다.

구체적인 일 실시예에서, 본 발명자는 트로락스가 시험관 내(in vitro)에서 RANKL의 발현 뿐 아니라 RANKL에 의한 파골 세포 형성을 저해할 수 있다. 이를 증명하기 위하여 본 발명자들은 생체 내(in vivo)에서 두개골(calvarial bone)의 파괴에 대한 마우스 모델을 사용하여 파골 세포의 골 손실에 대해 트로락스가 얼마나 효과를 나타내는지 실험하였고, 트로락스는 생체 내(in vivo)에서의 IL-1에 의한 두개관 골 손실(calvarial bone loss)뿐만 아니라 파골 세포 형성을 현저하게 저해함을 확인하였다(실시예 1).

바람직한 다른 또 하나의 양태로서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 본 발명에서 투여는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 상기 결합체의 투여 경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 조성물은 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 주사제 형태로 투여될 수 있다. 또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 결합체를 포함한 약제학적 조성물은 약제적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.

한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고 무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 있어 트로락스(Trolox)를 포함하는 약제학적 조성물물의 실제 투여량은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.

본 발명에 따른 트로락스를 포함하는 약제학적 조성물은 파골 세포의 전구체에서 c-Fos 발현을 억제할 뿐만 아니라, 조골세포에서의 RANKL의 발현을 간접적으로 억제함으로써 파골 세포의 형성을 억제하는 효과가 우수하고, IL-1에 의한 파골 세포화로 인한 골 손실을 막는데 매우 유효하여, 본 발명의 약제학적 조성물은 시험관 내(in vitro) 뿐만 아니라, 생체 내(in vivo)에서도 과도한 뼈 파괴로 인한 골 질환 및 골 전이에 의한 암 질환을 억제하고 치료하는데 치료학적 가치가 높다.

이하 본 발명을 하기 실시예를 참조하여 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되지는 않는다.

실시예1. 시험관 내 파골 세포 형성 분석 (in vitro osteoclast formation assay)

골수 세포로부터 (bone marrow cells) 뮤린 파골 세포(murine osteoclast)가 분화된다. 5주령 되는 ICR-마우스의 대퇴부 및 경골에서 얻은 마우스 골수 세포(mouse bone marrow cell)를 준비하고, 10% FBS(fetal bovine serum)과 (Invitrogen Life Technologies) 100U/㎖ 페니실린(penicillin)(Invitrogen Life Technologies), 100㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin)(Invitrogen Life Technologies)이 포함되어 있는 α-MEM(Invitrogen Life Technologies) 배지로 M-CSF(10ng/㎖)(PeproTech)가 처리되 있는 10cm 배양 접시에서 하루 밤 동안(overnight) 배양했다. 비 부착 세포(Nonadherent cell)들은 10-cm 박테리아 배양 접시(bacterial culture dish)로 옮겨서 3일 동안 M-CSF(30ng/㎖)(PeproTech)을 첨가한 상태에서 배양하였다.

비 부착 세포(Nonadherent cell)들을 제거한 후에 부착(Adherent) 세포들을 파골 세포의 전구체로서 골수에서 유래한 대식세포로 사용하였다. 파골 세포의 배양을 위해 M-CSF (30ng/㎖)와 RANKL(100ng/㎖)(PeproTech)이 첨가된 48-웰(well)(1㎖/well) 조직 배양 플레이트에서 골수-유래 대식 세포(Bone Marrow-Drived Macrophages,BMMs)(4×10⁴cell/㎖)를 배양하였다. 일차(primary) 조골세포(osteoblast)와 골수세포를 공동 배양한 파골 세포의 증식을 위해 처음에는 사전에 설명한 바와 같이 새로이 생성된 ICR 마우스 두개(calvariae)로부터 일차 조골 세포에서 준비하였다.

골수 세포 (3×10⁵cells/well)와 일차 조골세포를 48-웰(well)(1㎖/well) 플레이트에서 6일간 α-MEM배지에 배양하였다. 배지를 매 3일째에 교환해주었다. 배양기간 마지막 기간에는 10%의 포르말린에 10분 간 고정하고, 0.1% 트리톤 X-100(Triton X-100)으로 투과시킨 후, 백혈구 산 포스파타아제 키트(Leukocyte Acid Phosphate Assay Kit(Sigma))를 사용하여 TRACP 염색을 수행하였다.

상기 배양 시스템에서 마우스의 골수 세포와 일차 조골 세포를 IL-1(10ng/㎖)을 처리한 상태에서 RANKL(100ng/㎖)를 처리하였고, 트로락스(500㎛)의 투여 여부에 따라 6일간 배양한 후에, TRACP 염색을 하였다. TRACP 염색을 실시한 후 다핵의 파골세포 수를 측정하였다. 본 발명의 트로락스를 포함하는 골 대사성 질환 또는 골 전이성 암 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물은 조골 세포와 골수 세포의 공동배양에서 IL-1에 의해 생성된 파골세포의 형성을 강하게 억제하는 결과를 얻을 수 있었다(도 1a).

상기 배양 시스템에서 본 발명자는 OPG(Osteoclastogenesis-inhibitory factor, osteoprotegerin)와 RANKL의 발현을 RT-PCR 및 효소면역분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)에 의해 측정한 결과 IL-1에 의해 조골세포에서의 RANKL의 발현은 증가 되고, OPG의 발현은 감소되었다. 한편, 트로락스의 처리 결과 IL-1에 의한 RANKL의 발현은 억제되고, OPG의 발현에 있어서는 변화가 없다는 결과가 도출되었다(도 1b 및 1c).

본 발명은 파골 세포의 전구체에서 파골 세포의 형성을 직접적으로 억제하는 효과를 얻을 수 있다. 본 발명자들은 골수 대식세포에 M-CSF(30ng/㎖) 및 RANKL(100ng/㎖)를 처리한 상태에서 4일간 배양 후, 상당수의 TRACP-양성반응을 보이는 다핵 파골 세포들이 생성됨을 확인하였다. 한편, 상기와 동일한 배양 조건에서 트로락스를 투여한 후에 TRACP 염색을 실시하여 생성된 다핵 파골 세포의 수를 측정한 결과, 트로락스의 투여량 의존적으로 파골 세포 형성이 억제됨을 확인하였다. 즉, 트로락스의 투여량이 증가함에 따라 파골 세포 형성이 감소하는 결과를 보였다(도 2a).

본 발명자는 트로락스를 포함하는 약제학적 조성물이 파골 세포의 형성에 있어 어느 단계까지 영향이 미칠지 여부를 실험하였다. 트로락스의 파골 세포의 형성의 완벽한 억제 효과는 트로락스 500μM이라는 사실을 실험을 통해 얻을 수 있었다. 또한 0 내지 3일까지 파골 세포의 배양에 있어 트로락스의 양을 추가하였으며, 4일째 되는 날에는 TRACP 염색을 실시하였다. 실험 결과 트로락스는 효과적으로 처음 이틀째까지만 억제하였으며, 이러한 실험 결과로 미루어 볼 때, 트로락스는 초기 파골 세포 형성에만 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다(도 2c). 또한, 이틀째 트로락스의 투여를 중지하자 파골 세포가 형성되는 결과를 얻을 수 있었다(도 2d).

실시예2. 세포 활성 실험 (cell viability assay)

제조사의 사용지침서에 따라 세포 증식 키트(Cell Proliferation Kit(Roche))를 사용함으로써 골수 대식세포(BMMs)의 세포 활성(cell viability)에서의 트로락스의 효과 시험을 위해 XTT 시험(assay)을 시행하였다.

골수 대식세포 (1×10⁴cells/well)는 M-CSF(30ng/㎖)와 RANKL(100ng/㎖)을 첨가한 상태에서 48시간 동안 트로락스 처리한 96-웰(200㎕/well) 플레이트에서 배양하였다. 그 다음 배지를 제거하고, 50㎕ XTT 용액(XTT 라벨이 붙은 시약(reagent) + 일랙트론-커플링시약(Elecron-coupling reagent))이 첨가된 새 배지를 넣어주었다. 6시간 배양 후, 96-웰 플레이트 리더(plate recorder)를 사용하여 플레이트를 450nm(650nm 참조(reference))에서 읽었다.

상기 실험 결과 트로락스의 항-파골 세포형성 기능은 세포 독성이나 세포 증식에는 영향이 없는 것으로 나타났다(도 2b).

실시예3. 생존성 및 골 흡수 실험(Survival and bone resorption assay)

성숙한 파골 세포를 상기 서술한 바와 같이 골수 세포와 일차 조골세포(primary osteoblast)를 공동 배양하여 준비하였다. 골수 세포(1×10⁷cells) 및 일차 조골세포(primary osteoblasts,1×10⁶cells)를 콜라겐이 코팅된 배양 접시에 접종하고, 10^-8 M 1α, 25-디하이드록시비타민 D₃(25-dihydroxyvitamin D ₃(Sigma)),10^-6M 프로스타갈란딘 E₂(10^-6M prostaglandin E₂(Sigma))가 첨가된 상태에서 6-7일간 배양하였다. 세포들을 0.2% 콜라게네이즈(collagenase)(Invitrogen) 37℃에서 10분간 처리 후 분리시키고 후에 실험을 위해 배양 접시에 다시 접종하였다. 조골세포를 30분간 37℃에서 0.1% 콜라게네이즈를 처리하여 제거하였다. 남아있는 세포들은 충분히 성숙한 파골 세포라고 생각되었다.

생존성 시험(survival assay)은 다음과 같이 시행되었다. 성숙한 파골 세포들은 1시간 동안 다양한 농도의 트로락스와 RANKL(100ng/ml)이 존재하는 상태에서 배양하였다. 24시간 후에 TRACP 염색을 살아남은 파골 세포를 찾아내기 위해 수행하였다.

골 흡수 시험을 위해 파골 세포와 함께 탄산화된 인산칼슘(carbonated calcium phosphate)이 코팅된 OAAS 플레이트(Osteogenic Core Technologies Inc., Korea)에 재접종하고, 12시간 동안 방치하였다. OAAS 플레이트에 1시간 동안 실험했던 대로 트로락스(Sigma)처리에 따라 배양하였다. 그 후 RANKL(100ng/㎖)이 존재하는 상태에서 배양하였고, 24시간 후 세포들을 제거한 후, 전체 흡수 피트(pit) 사진을 찍고 프로-플러스 프로그램(Pro-Plus program)을(version 4.0) 사용하여 분석하였다(Media Cybernetics).

상기와 같은 배양 시스템에서 실험 한 결과, 본 발명인 트로락스를 포함하는 약제학적 조성물은 성숙한 파골 세포에는 영향을 미치지 않음을 확인하였다(도 3a,3b). 성숙한 파골 세포에서 트로락스의 활성을 측정하기 위해 성숙한 파골 세포를 OAAS 플레이트에 접종하고 24시간 동안 RANKL이 존재하는 상태에서 트로락스와 투입 여부에 따라 배양한 결과, 트로락스는 RANKL로 인한 골 흡수를 회복시키지 못하였다(도 3a). 또한 RANKL에 의한 성숙한 파골 세포의 생존에도 아무런 영향을 미치지 못하였다(도 3b).

실시예4. 레트로바이러스 유전자 도입(Retroviral gene tranduction)

레트로바이러스 벡터(pMX-IRES-EGFP, pMX-c-Fos-IRES-EGFP, pMX-constitutivly active(CA)-NFAT2-IRES-EGFP)는 Dr. Nacksung Kim(University of Chonnam, Gwangju, Korea)으로부터 제공받았다.

레트로바이러스 패키징(Retrovirus packaging)은 플랫-E 레트로바이러스 패키징 세포(Plat-E retroviral packaging cells)에 이 pMX 벡터들을 일시적으로 주입하여 수행하였다. 새 배지에서 이틀 동안 배양한 후에 레트로바이러스-생산 세포(retrovirus-producing cells)의 상층액을 수득하였다. 레트로바이러스 감염에 의해 부착되지 않은 골수 세포들을 M-CSF(30ng/㎖)가 포함되어 있는 배지에서 48시간 동안 배양하였다. 배지를 제거하고 폴리브렌(polybrene)(6㎍/㎖) 및 M-CSF(30ng/㎖)를 8시간 동안 처리하고, pMX-IRES-EGFP, pMX-c-Fos-IRES-EGFP, pMX-CA-NFAT2-IRES-EGFP 바이러스-생산 플랫-E 세포(virus-producing Plat-E cell)의 배양된 상층액을 대체하였다. 감염된 세포들을 M-CSF 존재 하에 하루 동안 배양하 였고, 퓨로마이신(puromycin)(2㎍/㎖) 및 M-CSF와 함께 이틀간 배양하였다. 그 후 감염되지 않은 세포들은 제거하였다. 안정적으로 감염된 세포들은 M-CSF(30ng/㎖)와 RANKL(100ng/㎖)의 존재 하에 4일간 트로락스(Trolox)(500㎛)의 처리 한 것과 그렇지 않은 것을 나누어 배양하였다. 각각의 성분 및 파골 세포의 발현을 각각 TRACP 염색 및 형광현미경을 통해 측정하였다.

실험 결과 트로락스에 의한 c-Fos 단백질 매개 항-파골 세포형성 효과가 감소하는지 여부의 규명을 위해 상기와 같은 시스템에서 레트로바이러스 시스템을 이용해 골수 대식세포에서 c-Fos 유전자를 상당량 발현시켰다. 파골 세포화의 트로락스 억제 기능은 c-Fos 뿐만 아니라 CA-NFAT2를 발현을 억제시키는 결과를 얻을 수 있었다(도 6c).

실시예5. 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)

세포들을 차가운 PBS(Phosphate Buffered Saline)로 두 번 세척하고, 용해 버퍼(lysis buffer, 20mM Tris-Hcl, 150mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.2% 디옥시콜레이트(deoxycholate), 프로테아제(protease) 와 포스페이트 억제제(phosphate inhibitor))로 용해 시킨 후, 30분간 차갑게 유지시켰다.

세포의 용해물(lysates)에서 단백질 성분들을 DC 단백질 시험 키트(DC Protein Assay Kit(Bio Red))에서 정량하였다. 단백질(30㎍/lane)의 동등한 양을 SDS-PAGE로 변성 분리시키고, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막(polyvinylidene diflouride membrane(Amersham Biosciences))으로 옮겼다.

블롯은 홀스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)가 부착된 2차 항체를 부착시키고, 현상하여 화학적 형광테크닉으로(Amersham Pharmacia Biotech)로 감광하였다.

phospho-ERK1/2, ERK, phospho-JNK1/2, JNK, phospho-p38, p38, phospho-AKT, AKT, phospho-IκBα와 IκBα를 위한 특이 항체는 Cell Signaling Technology에서 구입하였다. c-Fos, NFAT2 와 β-actin에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology에서 구입하였다.

트로락스를 골수 대식 세포에 사전 처리한 후, M-CSF(30ng/㎖)를 투여하고, 시간별로 RANKL(100ng/㎖)을 투여량을 점차 증가시켜, 항체를 이용하여 전체 세포 용해물을 웨스톤 블롯으로 검출하였다. 그 결과 본 발명인 트로락스를 포함하는 약제학적 조성물의 처리에 따른 RANKL에 의한 ERK, JNK, p38, AKT의 활성은 RANKL 처리 5분 후 관찰할 수 있었는데, 이는 트로락스의 사전처리와는 무관한 것이었다(도 4a). 또한, NF-κB의 신호체계에 있어 상기 트로락스를 포함하는 약제학적 조성물이 갖는 효과를 규명하기 위하여 웨스턴 블롯을 실시한 결과 트로락스는 이 과정에서 처리하지 않았으며(도 4b), RANKL의 축적은 5분 내 IκB의 인산화(phosphorylation) 및 분해(degradation)를 유도하였다.

실시예6. 핵 분획(Nuclear fraction) 및 EMSA 분석(electrophoretic mobility-shift assay)

세포들은 냉각된 PBS로 두 차례 세척하고 15분간 차갑게 유지시킨 0.6% NP-40이 포함된 저장성의 용해 버퍼(lysis buffer, 10mM HEPES[pH 7.9], 1.5 mM MgCl₂, 10mM KCl, 0.5mM DTT, 0.5mM PMSF)로 용해시키고, 4000 rpm에서 15분간 원심 분리하였다.

펠렛(Pellet)을 고염의 용해 버퍼(20mM HEPES[pH 7.9], 420mM NaCl, 25% glycerol, 1.5 mM MgCl₂, 0.2mM EDTA, 0.5mM PMSF, 0.5mM DTT) 15㎕에서 20분간 차가운 상태에서 용해시켰다. 저장 버퍼(20mM HEPES[pH 7.9], 100mM NaCl, 20% glycerol, 0.2mM EDTA, 0.5mM PMSF, 0.5mM DTT) 75㎕를 첨가하고, 샘플을 10초간 섞어주고 14000 rpm에서 20분간 원심 분리하였고, 상층액은 핵 추출물(nuclear extracts)로 사용하였다.

EMSA(electrophoretic mobility-shift assay)는 사전에 기술한 바와 같이 시행하였다. 핵 추출물(nuclear extracts(10㎍))은 반응 버퍼(10mM Tris-HCL, 50mM KCI, 1mM EDTA, 5% glycerol, 2mM DTT 와 1㎍의 poly[dI-dC])에서 즉, 20,000cpm ³²P-labeled NF-κB 가 붙어있는 올리고머(oligomer(5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3', Santa Cruz Biotechnology))를 가지고 있는 반응 버퍼에서 30분간 20℃에서 배양하였다. DNA-바운드(bound) NF-κB 촬영을 하였다.

골수 대식 세포에서 RANKL에 의한 신호 체계에서 트로락스의 효과를 증명하 기 위한 실험의 일환으로 M-CSF(30ng/㎖)가 존재 하에 트로락스를 사전 처리한 것과 비히클(vehicle(DMSO(dimthylsulfoxide)))에 RANKL(100ng/㎖)을 15분간 자극 시킨 후, 배양된 세포들에서 핵 추출물(nuclear extracts)을 준비하였다. NF-κB에 대한 DNA 부착 활성은 EMSA(electrophoretic mobility-shift assay)를 이용하여 측정하였다. 그 결과 트로락스는 RANKL의 축적에 의하여 NF-κB의 부착 활성을 약화시키지 않는다는 사실을 알 수 있었다(도 4c).

실시예7. RT-PCR 분석(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction).

전체 RNA는 제조사의 사용지침서에 따라 Trizol 시약(reagent)(Invitrogen)을 사용해서 준비하였고, cDNA는 역전사효소(Superscrip Ⅱ Preamplifiction System ; Invitrogen)에 의해 전체 RNA중 2㎍으로부터 합성하였다. cDNA(1㎕)는 PCR에 의해 각각 프라이머 셋트를 이용하여 증폭하였다.

94℃에서 30초간 변성, 58℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 1분간 신장하는 사이클로 19-25회 PCR 반응을 수행하였다. 증폭된 cDNA 절편들은 1% 아가로스 겔에 러닝하여 분리하고, EtBr(ethidium bromide)로 염색하였다.

골수 대식 세포에서 c-Fos 와 MFAT2의 RANKL에 의한 발현에 있어 트로락스의 효과를 알아 보기 위하여, 트로락스를 사전 처리한 골수 대식 세포와 비히클(DMSO)은 M-CSF가 투여된 상태에서 RANKL(100ng/㎖)로 시간에 따라 RT-PCR과 웨스톤 블롯(Western blot)을 실시한 결과, c-Fos mRNA의 발현에는 영향을 미치지 않는다는 사실(도 5a 및 도b) 및 c-Fos 단백질의 발현에 있어 특정 감소는 투여량 의존적인 경향을 보인다는 사실을 알 수 있었다(도 5c,5d).

실시예8. 조골세포에서 RANKL과 OPG 단백질 발현

일차 조골세포들은 6-웰(well)(4×10⁵cells/well)에 접종하였고, 트로락스(500μm)(Sigma)유무와 인터루킨-1(IL-1(10ng/㎖)(PeproTech))을 처리한 상태에서 24시간 동안 배양하였다. 세포 용해물(cell lysates)에 있는 RANKL 단백질 양과 세포 내에 있는 OPG 분비량을 RANKL과 OPG 효소 면역 분석법(ELISA(R&D system))을 사용하여 측정하였다.

상기 실시예1에서 제시하였던 배양 시스템에서 OPG와 RANKL의 발현을 RT-PCR 및 효소면역분석법(ELISA)에 의해 측정한 결과 IL-1에 의해 조골세포에서의 RANKL의 발현은 증가 되고, OPG의 발현은 감소 되며 트로락스의 처리 결과 IL-1에 의한 RANKL의 발현은 억제되고, OPG의 발현에 있어서는 변화가 없다는 결과를 얻었다(도 1b 및 1c)

실시예9. 순간 표지 추적 실험(Pulse-chase experiment)

골수 대식세포(BMMs)는 M-CSF 및 RANKL에 의해 24시간 동안 트로락스(Trolox) 처리 여부 하에 자극받게 되며, L-[³⁵S]메티오닌/시스테인(L-[³⁵S]methionine/cysteine)으로 세포 표지가 되어 있는 혼합물(Amersham Bioscience) 중 200 μCi/㎖에서 1시간 동안 방사성 동위원소를 사용하여 식별하였다. 배양 후에 세포들은 완전배지(complete media)로 세 번 세척하고 40분간 라벨 되지 않은 메티오닌(100㎍/㎖)과 시스테인(500㎍/㎖)으로 추적을 위해 배양하였다. 세포 용해물은 항(anti)-c-Fos 항체(antibody)를 가지고 면역 침강이 되고, 면역 침강 된 것들은 SDS-PAGE로 시행하였으며, 겔을 건조시켜서 방사능 사진을 촬영 하였다.

상기와 같은 순간 표지 추적 실험(pulse-chase experiment)을 수행하여 c-Fos 단백질 합성을 확인하였다. 도 6b는 c-Fos 단백질의 생합성은 RANKL 축적에 따라 선별적으로 증가하는 것을 보여주며, 이는 트로락스에 의해 감소 된다는 결과를 보여주었다. 새로운 단백질의 합성 저해제인 시클로핵사마이드(cycloheximide)(Calbiochem)를 4시간 동안 처리한 결과, RANKL에 의한 c-Fos 단백질 농도의 증가를 둔화시켰다(도 6a, lane 2 및 lane 4). 또한, 26s 거대 단백질 분해 효소(proteasome)의 선택적 억제제로서 MG132(Calbiochem)를 함께 처리하자 상기와 동일한 결과를 보였다(도 6a, lane4 및 lane 6). 상기 결과와 달리 트로락스에 의한 c-Fos 단백질의 감소는 MG-132에 의한 영향을 받지 않았다 (도 6a, lane 5 및 lane7). 이는 단백질 분해 담당효소를 매개로 하는 퇴화는 트로락스에 의한 c-Fos 단백질의 감소와 연관이 없다는 것을 알려준다. 파골 세포화의 트로락스 억제 기능은 효과적으로 c-Fos 뿐만 아니라 CA-NFAT2를 발현시킴으로써 극복되었다(도 6c).

실시예10. IL-1로 유도된 마우스 두개골 손실

IL-1에 의해 뼈 손실을 나타내는 마우스를 상기 기술된 바와 같이 사용하였다. 비히클(vehicle(PBS))이나 IL-1(1.5μg)이 처리된 콜라겐 스폰지를 5 마리의 마우스(5주령 male ICR mice) 그룹 두개골에 주입하였다. 마우스는 내부적으로 비히클(vehicle(DMSO))이나 트로락스(60mg/kg of body weight)에서 첫째 날 시작 시 준비해둔다. 그 마우스는 주입 후 7일에 희생시켰으며, 전체 두개(calvaria)는 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정하고 TRACP로 염색하였다.

두개골(calvarial bone)의 3차원 이미지는 μCT 스캐닝(scanning)으로 얻을 수 있다(SMX-90CT, Shimadzu, Japan). 조직학적 분석을 위해, 두개 조직은 4% 파라포름알데히드, 석회화 되있는 12% EDTA에서 파라핀에 포매하였다. 그 후, 조직 절편(5㎛)을 준비하고, TRACP로 염색하며, 헤마토자일린(hematoxylin)으로 대비 염색시켰다.

트로락스는 시험관 내(in vitro)에서 RANKL의 발현 뿐 아니라 RANKL에 의한 파골 세포 형성을 저해하므로, 생체 내(in vivo)에서 두개골(calvarial bone)의 파괴에 대한 마우스 모델을 사용하여 파골 세포의 골 손실에 대해 트로락스 효과의 정도를 실험하였다(Ha H, Lee JH, Kim HM, Kwak HB, Lee S, Kim HH, LeeZH 2006 alpha-Lipoic acid inhibits inflammatory bone resorption by suppressing prostaglandin E2 synthesis. J Immunol 176:111-117). IL-1을 흡수한 콜라겐 스폰지를 마우스 두개골에 접종한 결과 파골 세포를 형성한 반면, 트로락스를 투여하자 IL-1에 의한 파골 세포 형성을 억제하였다(도 7a 및 7c). 마이크로시티단층촬영 분석법(μCT analysis)과 조직학적 절편에 의한 TRACP-염색 결과 역시, IL-1에 의한 파골 세포의 형성 및 골 손실이 트로락스의 처리에 의해 억제될 수 있다는 결과를 보여주었다(도 7b 및 7c).

실시예11. 통계학적 분석 (Statistisal analysis)

상기의 모든 정량 데이터는 ± SD 로 나타내었다. 각각의 실험은 3~4차례 수행되었으며, 하나의 대표 실험으로부터 얻은 결과를 나타내었다. 통계적 분석은 ANOVA의 한 가지 방법으로 수행되었다(SPSS statistical package, version 12, SPSS Inc). p＜0.05.

실시예 12. 흑색종 세포주를 이용한 마우스 골전이암 모델에서 트로락스의 골전이 억제능 확인

암세포를 이용한 마우스 골 전이 모델을 확립하기 위하여 흑색종 세포주는 B16F10을 사용하였다. 이들은 C57BL/6 마우스 종에서 유래된 것으로 모두 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 암세포주의 배양에 사용한 배지는 10% 우태아혈청(fetal calf serum)과 페니실린(100 U/ml), 스트렙토마이신(100 ug/ml)이 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, WelGENE, Korea)을 사용하였다. 배지는 최소 3일에 한번 갈아주었으며, 최소 1 : 4 이상의 비율로 암세포주를 분리하였고, 세포배양접시에 70% 이하를 차지할 때까지 배양하여 사용하였다. 트립신-EDTA(Invitrogen)를 이용하여 암세포주를 배양접시에서 분리한 후에 인산완충용액(Phosphate buffered saline containing sodium chloride, sodium phosphate, and potassium chloride and potassium phosphate, pH 7.2~7.4) 0.1 ml 당 1 x 10⁵ 세포를 균일하게 부유시켜 마우스에 주입할 수 있도록 준비하였다.

흑색종 세포주인 B16F10은 C57BL/6 마우스 종에서 유래된 것이므로, 동물모델 역시 C57BL/6 마우스종(NIH/ Charles River, Bethesda, MD)을 사용하였다. 마우스를 1.2% Avertin(2,2,2-Tribromoethanol, 2-methyl-2-butanol, Sigma-Aldrich사, St. Louis, MO)을 이용하여 마취 시킨 후, 상기에서 기술한 준비된 암 세포주를 30 게이지 주사바늘을 이용하여 마우스의 좌심실에 주입하였다.

암세포주마다 뼈로 전이되는 시기는 각각 다른데, 흑색종세포주인 B16F10의 경우, 암 세포주를 주입한 후 10일 부터 확인 되므로, 보통의 방법과 같이 12~14일째 희생시켜 확인하였다.

뼈로 전이된 암세포에 의한 골 파괴 정도의 분석을 위하여 적출된 경골을 인산완충용액으로 3-4회 수세한 다음, 4% 파라포름알데하이드 용액에 24시간 고정하였다. 조직학적 분석을 위하여, 고정이 끝난 마우스 경골을 12% EDTA 용액(pH7.2 - 7.4)에서 14일 동안 탈회(2-3일에 한 번씩 용액을 교환해줌) 시킨 후에 파라핀에 포매하였다. 포매된 절편에 헤마톡실린-에오신 염색(Sigma-Aldrich사, St. Louis, MO)을 시행하여 전체적인 조직학적 사진을 관찰하였다.

마우스흑색종세포주의 골 전이에 있어서 트로락스의 기능을 파악하기 위하여앞에서 설명한 골 전이 실험을 토대로 암세포주 주입 삼일 전(-3일)부터 30 ㎕의 DMSO에 녹인 트로락스를 마우스당 0.5 mg을 복강을 통해 2일 간격으로 투여하였다. 암세포주 주입 13일 후에 마우스를 희생시켜 화합물을 투여한 마우스와 DMSO를 비히클로 투여한 마우스의 골 전이 정도를 비교 분석하였다.

뼈로 전이된 흑색종 세포에 의한 골 전이 정도를 확인하기 위하여 포매된 장골 절편을 헤마톡실린-에오신 염색을 실시한 결과(도 8a 참조), 비히클을 처리한 마우스의 장골에서는 암세포의 골 전이에 의해 골 흡수가 현저히 일어나 골소주(trabeculae)를 관찰할 수 없고, 골수강(bone marrow) 부위(M으로 표시)에 종양조직으로 (T로 표시)으로 채워져 있는 반면, 트로락스를 처리한 마우스에서의 장골에서는 암세포에 의한 골 전이가 현저히 억제되어, 골소주를 관찰할 수 있으며, 골수강(M)에 종양조직(T)도 현저히 적게 관찰되었다. 헤마톡실린-에오신 염색 결과를 토대로 장골로 전이된 암세포 면적을 측정하여 통계 처리한 결과, 도 8b에 나타난 바와 같이, 트로락스를 처리한 마우스가 비히클을 처리한 마우스에 비하여 전이된 종양의 면적이 현저히 감소하였음을 확인할 수 있었다(p<0.01).

본 발명은 트로락스를 포함하는 골 대사성 질환 또는 골 전이성 암 질환 예방 및 치료용 약제학적 조성물로서, IL-1에 의한 파골 세포 형성과 파골 세포 전구체에서의 c-Fos의 발현 및 조골세포에서의 RANKL의 발현을 억제함으로써 파골 세포의 형성을 저해할 수 있다. 상기 효과로 인하여 트로락스를 포함하는 약제학적 조 성물이 과도한 골 파괴에 의한 골 질환을 억제하고 치료적 효과가 우수하므로 차후에 골다공증을 비롯한 골 대사성 질환 또는 골 전이성 암 질환의 예방 및 치료에 상업적으로 이용가능하다.

도 1a는 공동배양(coculture)에서 인터루킨-1(IL-1)에 의한 파골 세포의 형성에서 트로락스(Trolox)의 효과를 나타내는 사진이다.

도 1b는 공동배양에서 IL-1에 의한 RANKL 및 OPG의 발현 결과를 나타내는 RT-PCR 실험결과를 나타내는 사진이다.

도 1c는 조골세포에서 IL-1에 의한 RANKL 및 OPG의 양을 ELISA 키트으로 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 2a는 골수 대식세포에서 RANKL에 의한 파골 세포 형성에서 트로락스의 효과의 측정을 위해 M-CSF와 RANKL이 포함되어 있는 골수 대식세포에서 트로락스에 처리에 따른 TRACP-다중 핵산 양성 반응을 보이는 세포 수를 나타내는 그래프이다.

도 2b는 골수 대식세포에서 RANKL에 의한 파골 세포 형성에서 트로락스의 효과의 측정을 위해 M-CSF 와 RANKL이 포함되어 있는 골수 대식세포에서 트로락스(Trolox) 처리 후 XTT 시험(assay)으로 세포 활성(cell viability)을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 2c는 골수 대식세포에서 RANKL에 의한 파골 세포 형성에서 트로락 스(Trolox)의 효과의 측정을 위해 M-CSF 와 RANKL이 포함되어 있는 골수 대식세포에서 트로락스 500㎛첨가하여 처리한 일자별로 결과를 나타내는 그래프이다.

도 2d는 골수 대식세포에서 트로락스를 배양시 처리한 결과(ⅱ 와 ⅲ)와 배양 초기에 처리하지 않은 결과(ⅰ)를 나타내는 사진이다.

도 3a는 골 흡수 활성과 파골 세포의 생존에 있어 트로락스의 효과를 알아보기 위해 OAAS 플레이트에 공동배양한 파골 세포에 RANKL의 존재하에 트로락스의 처리에 따른 결과를 나타내는 사진과 그래프이다.

도 3b는 골 흡수 활성과 파골 세포의 생존에 있어 트로락스의 효과를 알아보기 위해 정제된 성숙한 파골 세포에서 RANKL의 존재하에 트로락스의 처리에 따른 TRACP 염색을 실시 한 파골 세포의 수를 나타내는 사진 및 그래프이다.

도 4a는 골수 대식세포에서 RANKL에 의한 초기 신호체계에 있어 트로락스의 효과를 측정하기 위해 M-CSF와 RANKL의 존재하에 골수 대식세포에서 각 시간별로 실시한 웨스톤 블롯(Western Blot)의 실시 결과를 나타내는 사진이다. (ERK, JNK, p38 및 AKT에 대한 항체 사용)

도 4b는 골수 대식세포에서 RANKL에 의한 초기 신호체계에 있어 트로락스의 효과를 측정하기 위해 M-CSF와 RANKL의 존재하에 골수 대식세포에서 각 시간별로 실시한 웨스톤 블롯(Western Blot) 실시 결과를 나타내는 사진이다. (IKBα에 대한 항체 사용)

도 4c는 트로락스를 처리한 골수 대식세포에서 NF-κB의 DNA 결합 활성을 EMSA(electrophoretic mobility-shift assay)의 결과를 나타내는 사진이다.

도 5a 및 5c는 골수 대식세포에서 RANKL에 의한 c-Fos와 NFAT2의 발현에 있어서 트로락스의 효과를 측정하기 위해 골수 대식세포에서 RANKL에 의한 c-Fos와 NFAT2의 발현에 있어서 트로락스(Trolox)의 효과를 RT-PCR에 의해 측정한 결과를 나타내는 사진이다.

도 5b 및 5d는 골수 대식세포에서 RANKL에 의한 c-Fos와 NFAT2의 발현에 있어서 트로락스의 효과를 웨스턴 블롯(Western-Blot) 결과를 나타내는 사진이다.

도 6a는 단백질 합성 저해제로 CHX와 MG132를 처리한 골수 대식세포에서 웨스턴 블롯 결과를 나타내는 사진이다.

도 6b는 골수 대식세포에서 c-Fos 단백질의 전사 여부에 대한 면역학적 실험 결과를 나타내는 사진이다.

도 6c는 레트로바이러스 벡터로 감염된 골수 대식세포에서의 형광현미경 사진 및 TRACP 염색 결과를 나타내는 그래프이다.

도 7a는 생체 내 IL-1에 의한 골 파괴에 있어 트로락스의 효과를 알아보기 위하여 전체 두개(calvaria)에 대해 TRACP 염색을 실시한 사진이다.

도 7b는 생체 내 IL-1에 의한 골 파괴에 있어 트로락스의 효과를 알아보기 위한 μCT 분석(analysis)을 실시한 삼차원 이미지 사진이다.

도 7c는 생체 내 IL-1에 의한 골 파괴에 있어 트로락스의 효과를 알아보기 위한 골 두개(calvaria)의 조직학적 절편을 TRACP 염색을 실시하여 헤마토자일린을 대비염색한 결과이다.

도8a는 골 전이를 유발시킨 C57BL/6 마우스 심장에 트로락스를 처리한 후에 적출된 장골에서의 뼈로 전이된 흑색종 세포에 의한 골 전이 정도를 확인하기 위하여 포매된 장골 절편을 헤마톡실린-에오신 염색을 실시한 결과를 나타낸 도이다 (M: 골수강(bone marrow) 부위, T: 종양조직).

도8b는 도8a의 헤마톡실린-에오신 염색 결과를 토대로 장골로 전이된 암세포 면적을 측정하여 통계 처리한 결과를 나타낸 도이다(p<0.01).

<110> Seoul National University RandDB Foundation <120> A PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING AND TREATING BONE METABOLIC DISEASE OR METASTATIC CANCER BY BONE METASTASIS COMPRISING TROLOX <130> PA090553/KR <150> KR10-2008-0137466 <151> 2008-12-30 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for mouse RANKL <400> 1 caggtttgca ggactcgac 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for mouse RANKL <400> 2 agcagggaag ggttggaca 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for mouse OPG <400> 3 ccactcttat acggacagct 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for mouse OPG <400> 4 tctcggcatt cactttggtc 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for mouse c-Fos <400> 5 ctggtgcagc ccactctggt c 21 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for mouse c-Fos <400> 6 ctttcagcag attggcaatc tc 22 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for mouse NFAT2 <400> 7 caacgccctg accaccgata g 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for mouse NFAT2 <400> 8 ggctgccttc cgtctcatag t 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for mouse beta-actin <400> 9 aaccctaagg ccaaccgtga 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for mouse beta-actin <400> 10 atggatgcca caggattcca 20

Claims (7)

1. 트로락스를 포함하는 암세포의 골 전이 억제용 약제학적 조성물.
2. 삭제
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5. 삭제
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7. 제1항에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함하는 조성물.

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