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KR101135220B1 - 항-마이오스타틴 항체 - Google Patents

항-마이오스타틴 항체 Download PDF

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KR101135220B1
KR101135220B1 KR1020087008254A KR20087008254A KR101135220B1 KR 101135220 B1 KR101135220 B1 KR 101135220B1 KR 1020087008254 A KR1020087008254 A KR 1020087008254A KR 20087008254 A KR20087008254 A KR 20087008254A KR 101135220 B1 KR101135220 B1 KR 101135220B1
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파멜라 진 미첼
로사먼드 캐롤 스미스
오'브라이언 (니 토비아스), 린다
롱 왕
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일라이 릴리 앤드 캄파니
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Abstract

성숙 형태의 인간 마이오스타틴의 아미노산 40-64에서 중화 에피토프가 확인된다. 높은 친화력으로 이러한 에피토프에 결합하는 항체는 GDF-11에 비해 GDF-8에 우선적으로 결합하고, 키메라, 인간화 또는 완전 인간 항체, 항체의 면역접합체 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있다. 본 발명의 항체는 근육 질량의 증가, 골 밀도의 증가, 또는 포유류 및 조류 종에서의 다양한 장애의 치료에 유용하다.
마이오스타틴, 항-마이오스타틴 항체, 중화 에피토프, 중화 항체

Description

항-마이오스타틴 항체{ANTI-MYOSTATIN ANTIBODIES}
본 발명은 의약 분야, 특히 마이오스타틴에 대한 모노클로날 항체 분야에 속한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 GDF-11에 비해 마이오스타틴에 우선적으로 결합하는 고친화력 키메라, 인간화 또는 인간 항-마이오스타틴 항체, 및 포유류 및 조류 종에서의 다양한 장애 또는 용태의 치료, 예방 또는 진단을 위한 항체의 용도에 관한 것이다.
전환 성장 인자 베타 (TGF-β) 상과 단백질의 구성원들은 배발생 및 성체 조직 항상성에 수반된다. TGF-β 상과 구성원들은 단백질의 분비에 필요한 펩티드 신호 서열, 및 성숙 단백질이 생산되도록 대형 전구체 단백질의 카르복시-말단으로부터 약 105-140 개의 아미노산에서 단백질분해에 의해 절단되는 아미노-말단 단편을 포함하는 공통적인 구조를 공유한다. 성숙 단백질은 고도로 보존된 시스테인 잔기를 특징으로 하고, 성숙 단백질의 활성 형태는 단백질분해에 의해 절단된 전단백질(proprotein)의 디술피드-연결된 동종이량체이다 ([Gray, A., and Maston, A., Science, 247:1328, 1990]).
성장 분화 인자-8 (GDF-8)로 또한 지칭되는 마이오스타틴은 TGF-β 상과 단백질의 구성원이다. 마이오스타틴은 다른 TGF-β 과 구성원과 구조적 유사성을 공 유한다. 이는 분비 신호로 작용하는 소수성 아미노-말단, 및 단백질분해성 프로세싱에 중요한 보존된 RSRR 도메인을 함유한다. 단백질의 절단으로 아미노-말단 잠복성 회합 펩티드, 및 생물학적으로 활성인 동종이량체를 형성하는 카르복시-말단 성숙 신호전달 펩티드가 생성된다. 마이오스타틴은 발육되고 있는 또는 성체 골격근에서 대량으로 발현되고, 골격근의 음성 조절인자로 기능한다. 성체 마우스에서의 마이오스타틴의 전신 과발현은 근육 소모에 이르는 한편 ([Zimmers, et al., Science, 296:1486-1488, 2002]), 반대로, 마이오스타틴 녹아웃(knock-out) 마우스는 이의 야생형 한배새끼에 비해 2배 내지 3배 더 많은 근육 질량이 초래되는 골격근의 비대 및 과다형성, 및 지방 축적에서의 감소를 특징으로 한다 ([McPherron, et al. Nature, 387:83-90, 1997]). 마이오스타틴 녹아웃 돌연변이가 있는 인간은 전체 근육 비대와 관련되는 것으로 보고되었다 (Scheulke, et al., New Eng. J. Med. 350:2682, 2004).
근육 소모에 대해, 또는 근육 퇴행위축, 무름, 무용성 위축 및 악액질이 예를 들어 포함되는, 근육 질량 및/또는 근육 강도에서의 증가가 이로울 장애 또는 용태, 뿐만 아니라 근육 소모와 관련된 장애, 예를 들어, 신장 질환, 심장 부전 또는 질환 및 간 질환에 대해 이용가능한 치료가 현재 제한되어 있다. 골격근 성장의 음성 조절인자로서의 역할로 인해, 마이오스타틴은 이같은 장애 또는 용태의 치료적 또는 예방적 시술 또는 이같은 장애 또는 용태의 진행의 모니터링에 바람직한 표적이다. 골격근 조절에서의 직접적인 역할과는 별개로, 마이오스타틴은 지방세포로의 지방전구세포 분화 ([Kim et al. BBRC, 281:902-906, 2001])가 포함되는 기 타 생리학적 프로세스에, 그리고 간접적으로 글루코스 항상성 ([McPherron, A and Lee S-J. JCI 109:595, 2002]) 및 골형성 억제 ([Hamrick, M. Mol. Cell Evol. Biol. 272 388-91, 2003]; [Hamrick et al. Calcif Tissue Int. 71:63, 2002])에 또한 수반된다. 따라서, 마이오스타틴-특이적 길항제, 예를 들어, 마이오스타틴-특이적 항체는 골 밀도의 증가가 이로운 장애 또는 용태 (예를 들어, 골다공증), 제II형 당뇨병, 대사 증후군, 비만 및 골관절염과 같은 장애 또는 용태의 치료, 예방 또는 모니터링에 유용한 것으로 또한 증명될 수 있다.
마이오스타틴은 종(種)에 걸쳐 고도로 보존된다; 인간, 마우스, 래트, 닭, 칠면조 및 소에서의 성숙 형태의 마이오스타틴의 아미노산 서열은 100 ％ 동일하다 (도 2 및 3 참조). 소에서 천연 발생 마이오스타틴 돌연변이가 있고, 이는 이중 근육 표현형과 연관되었다 ([McPherron, et al. PNAS, 94:12457-61, 1997]). 마이오스타틴은 종에 걸쳐 서열 및 기능이 고도로 보존되기 때문에, 항-마이오스타틴 항체는 인간에서뿐만 아니라, 또한 가축 동물 (예를 들어, 개 및 고양이), 운동 동물 (예를 들어, 말) 및 식품-공급원 동물 (예를 들어, 소, 돼지 및 양)이 예를 들어 포함되는 다른 포유동물, 및 조류 종 (예를 들어, 닭, 칠면조, 오리 및 기타 사냥새 및 가금류)에서, 근육 질량을 증가시키는 전도유망한 수단, 또는 상기 열거된 장애 또는 용태의 치료 또는 예방을 제공한다.
GDF-11 또는 BMP-11로 또한 지칭되는 성장 분화 인자-11은 마이오스타틴과 가장 상동성인 TGF-β 상과 단백질의 구성원이다. 성숙 형태의 인간 마이오스타틴과 GDF-11은 아미노산 서열이 약 90 ％ 동일하다; 그러나, GDF-11은 치수, 뇌, 심 장, 신장 및 폐, 뿐만 아니라 근육 및 지방 조직을 포함하여 GDF-8보다 광범위한 조직에서 발현된다 ([Nakashima, et al. Mech. of Development 80:185, 1999]). GDF-11 녹아웃 마우스는 다중 이상으로 출생 24시간 이내에 사망한다. 특히, 마우스는 여분의 갈비뼈 쌍을 나타내고, 신장이 없으며, 위, 지라 및 이자에서의 결함을 나타낸다 ([McPherron et al., Nature Genetics 22:260, 1999]; [Esquela and Lee, Dev. Biol. 257:356, 2003]; [Harmon et al., Devpt. 131:6163, 2004]). 인간 GDF-11은 다능성 선조가 별개의 신경 자손을 생산하는 능력을 유지하는 일시적인 창을 통치하는 것으로 최근 확인되었다 ([Kim, J. et al. Science 308:1927-1930, 2005]).
마이오스타틴 길항제가 또다른 TGF-β 상과 단백질에 결합하는 것으로부터 초래되는 바람직하지 않은 부작용의 가능성을 최소화시키기 위해, 다른 TGF-β 상과 단백질, 특히 GDF-11의 활성을 억제하지 않거나 또는 최소한도로 억제하면서 마이오스타틴 활성을 특이적으로 억제하는 것이 치료용으로 요구된다. 또한, 샘플 내의 마이오스타틴 수준을 더욱 정확하게 모니터링 또는 결정하기 위해, 또다른 TGF-β 상과 단백질, 특히 GDF-11과 교차반응하지 않거나 최소한도로 교차반응하는 항-마이오스타틴 항체가 진단용으로 요구된다. 또한, 특이적 및 우선적으로 고친화력으로 마이오스타틴에 결합함으로써 환자가 받는 투여량 수준이 최소화되도록 하는 마이오스타틴-특이적 항체가 요구되고, 이에 의해 더 낮은 친화력 (즉, 더 높은 KD)으로 마이오스타틴에 결합하는 항체보다 이같은 항체가 덜 빈번하게 투여될 수 있다. 예를 들어 약물이 피하 투여되는 것보다 정맥내 투여되는 것이 덜 바람직하기 때문에, 고친화력 항체는 환자에게의 항체 투여 경로에서 더욱 융통성을 허용할 수 있다는 점에서 또한 바람직하다. 최소한도의 효과적인 치료 용량을 갖는 치료용 항-마이오스타틴 항체를 생성시키기 위해, 마이오스타틴 생체활성 분석법에서 낮거나 다른 방식으로 유리한 IC50 값을 갖는 마이오스타틴-특이적 항체가 또한 요구된다. 항체가 제공된 환자에 의해 유발되는 항체에 대한 임의의 면역 응답이 최소한도로 감소된, 마이오스타틴에 특이적인 항체를 제공하는 것이 또한 바람직하다. 본 발명은 이러한 요구를 충족시키고, 관련된 장점을 제공한다.
발명의 개요
본 발명의 항체는 마이오스타틴 또는 이의 일부분과 관련된 1가지 이상의 시험관내 또는 생체내 생물학적 활성 또는 성질을 길항하거나 중화시키는, 키메라, 인간화 또는 완전 인간 항-마이오스타틴 모노클로날 항체, 및 이의 항원-결합 부분이다.
한 실시양태에서, 마이오스타틴에 특이적으로 및/또는 우선적으로 결합하는 본 발명의 항체는 마이오스타틴보다 GDF-11과 현저하게 덜 반응성이고, 즉 본 발명의 모노클로날 항체는 당업계의 기술에 의해, 예를 들어, 경쟁 ELISA, 또는 BIACORE 또는 KINEXA 분석법에 의해 측정했을 때 GDF-11에 결합하는 것보다 적어도 약 2, 3, 5, 10, 20, 22, 24, 또는 25배 더 많이 마이오스타틴에 결합하여, GDF-11보다 GDF-8에 대한 항체의 더 높은 친화력 (즉, 더 낮은 KD)을 나타낸다. 가장 바 람직하게는, 본 발명의 항체는, Fab로 발현되었을 때, 당업계에서 이용가능한 어떠한 결합 분석법에서도 배경 수준을 초과하여 GDF-11에 결합하지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 성숙 마이오스타틴의 아미노산 40-64 [인간의 경우 ANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQA], 43-57 [인간의 경우 CSGECEFVFLQKYPH 또는 CSGESEFVFLQKYPH] 및/또는 45-59 [인간의 경우 GECEFVFLQKYPHTH]에 스패닝(spanning)된 도메인 내에서 마이오스타틴에 특이적으로 결합하거나, 또는 성숙 마이오스타틴의 아미노산 40-64, 43-57 및/또는 아미노산 45-59으로 구성된 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체의 IC50은 시험관내 마이오스타틴/SBE 리포터 분석법에서 약 25 nM, 20 nM, 16 nM, 14 nM, 10 nM, 9 nM, 6 nM 또는 5.2 nM 이하이다 (실시예 6 참조). 바람직하게는, 이같은 본 발명의 항체는 GDF-8보다 GDF-11과 현저하게 덜 반응성이라는 것, 즉 당업계의 기술에 의해, 예를 들어, 경쟁 ELISA, 또는 BIACORE 또는 KINEXA 분석법에 의해 측정했을 때 GDF-11에 결합하는 것보다 적어도 약 2, 3, 5, 10, 20, 22, 24, 또는 25배 더 많이 마이오스타틴에 결합하여, GDF-11보다 GDF-8에 대한 항체의 더 높은 친화력 (즉, 더 높은 KD)을 나타낸다는 것을 추가로 특징으로 한다. 더욱 더 바람직하게는, 본 발명의 항체는 성숙 마이오스타틴의 아미노산 40-64, 43-57 및/또는 45-59에 스패닝된 도메인 내에서 마이오스타틴에 결합하거나, 또는 성숙 마이오스타틴의 아미노산 40-64, 43-57 및/또는 45-59로 구성된 폴리펩티드에 결합한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 마이오스타틴에 대한 강한 결합 친화력 (KD), 즉, 약 3 × 10-8 M, 1 × 10-8 M 또는 1 × 10-9 M 미만, 바람직하게는 약 9 × 10-10 M, 8.7 × 10-10 M 미만, 가장 바람직하게는 약 8 × 10-11 M 미만을 특징으로 한다. 별법적으로, 본 발명의 항체는 약 3 × 10-8 M, 1 × 10-8 M, 1 × 10-9 M 또는 9 × 10-10 M 이하, 더욱 바람직하게는 약 8.7 × 10-10 M 이하, 가장 바람직하게는 약 8 × 10-11 M 이하의 마이오스타틴에 대한 KD를 특징으로 한다. 바람직하게는, 상기 기술된 바와 같은 강한 결합 친화력을 특징으로 하는 본 발명의 항체는 시험관내 마이오스타틴/SBE 리포터 분석법에서 25 nM, 20 nM, 16 nM, 14 nM, 10 nM, 9 nM, 6 nM, 또는 5.2 nM 미만의 IC50을 또한 갖고/갖거나, GDF-8보다 GDF-11과 현저하게 덜 반응성이다. 더욱 더 바람직하게는, 본 발명의 항체는 성숙 마이오스타틴의 아미노산 40-64, 43-57 및/또는 45-59에 스패닝된 도메인 내에서 마이오스타틴에 결합하고/하거나 성숙 마이오스타틴의 아미노산 40-64, 43-57 및/또는 45-59로 구성된 폴리펩티드에 결합한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체는 서열 5-12로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 ("LCVR(light chain variable region)") 폴리펩티드를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체는 서열 13-26, 55 및 56으로 구 성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 ("HCVR(heavy chain variable region)") 폴리펩티드를 포함한다. 각각의 서열 번호와 관련된 서열은 본원의 도 5-9에 제시된다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 모노클로날 항체는 당업계의 이용가능한 분석법 (예를 들어, 경쟁 ELISA)에 의해 증명되는 바와 같이 인간 마이오스타틴에의 결합에 대해 경쟁 항체와 경쟁할 수 있는 것이고, 이때 경쟁 항체는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 갖는 2개의 폴리펩티드를 포함한다: (i) 서열 5 및 15, (ii) 서열 5 및 16, 및 (iii) 서열 10 및 26. 바람직하게는, 상기 정의된 경쟁 항체와 경쟁하는 본 발명의 항체는 GDF-11에 비해 GDF-8에 우선적으로 결합하는 것을 추가로 특징으로 한다; 더욱 더 바람직하게는, 이는 성숙 마이오스타틴의 아미노산 40-64, 43-57 및/또는 45-59에 스패닝된 도메인 내에서 마이오스타틴에 결합하고/하거나 성숙 마이오스타틴의 아미노산 40-64, 43-57 및/또는 45-59로 구성된 폴리펩티드에 결합한다. 바람직하게는, 상기 정의된 경쟁 항체와 경쟁하는 본 발명의 항체는 마이오스타틴에 대한 KD가 약 3 × 10-8 M, 1 × 10-8 M, 1 × 10-9 M 또는 9 × 10-10 M, 8.7 × 10-10 M 또는 8 × 10-11 M 이하인 것을 추가로 특징으로 한다. 바람직하게는, 상기 정의된 경쟁 항체와 경쟁하는 본 발명의 항체는 시험관내 마이오스타틴/SBE 리포터 분석법에서 IC50이 25 nM, 20 nM, 16 nM, 14 nM, 10 nM, 9 nM, 6 nM, 또는 5.2 nM 미만인 것을 추가로 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-마이오스타틴 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 갖고, 이때 중쇄 가변 영역은 CDRH1 (서열 59), CDRH2 (서열 60) 및 CDRH3 (서열 61)의 아미노산 서열을 갖는 CDR 영역을 포함하고/하거나 경쇄 가변 영역은 CDRL1 (서열 57), CDRL2 (서열 30) 및 CDRL3 (서열 58)의 아미노산 서열을 갖는 CDR 영역을 포함한다.
본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체는 인간 (또는 실질적으로 인간에서 유래된) IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 및 IgD, 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체는 인간 카파 또는 람다 경쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 항체가 인간에서 치료제로서 사용되는 경우, 바람직하게는 불변 영역은 실질적으로 인간에서 유래된다. 항체가 비-인간 동물, 또는 비-인간 동물의 알에서 치료제로서 사용되는 경우, 바람직하게는 불변 영역은 항체가 치료제로서 사용될 동물로부터 실질적으로 유래된다. (예를 들어, [Clarkson, C. et al., Mol. Imm. 30:1195-1204, 1993]; 미국 출원 번호 2002/01651350; 및 Genbank 접속 번호 X69797, U03778, X16701, X07174, AB016711 참조).
다양한 형태의 항체가 본원에서 구현된다. 예를 들어, 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체는 무손상 항체 (즉, 무손상 Fc 영역을 갖는 전장(全長)), 실질적인 무손상 항체, 이의 항원-결합 부분 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2) 또는 단일쇄 Fv 단편을 포함하거나 이것으로 구성될 수 있다. 이같은 형태의 항체 모두 가 본원에서 전반적으로 용어 "항체" 내에 포함되는 것으로 이해된다. 또한, 본 발명의 항체는 검출가능한 표지로 표지되고/되거나, 고체상 상에 고정되고/되거나, 이종 화합물, 예를 들어, 효소 또는 폴리에틸렌 글리콜 분자와 접합될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는, 비록 글리코실화 패턴이 상이할 수 있지만, "모노클로날"인 것으로 구현된다.
본 발명의 모노클로날 항체에 대한 진단, 치료 및 예방 용도가 본원에서 구현된다. 한 진단 용도에서, 본 발명은 마이오스타틴 단백질을 함유하는 것으로 예측되는 테스트 샘플을 본 발명의 항-마이오스타틴 항체에 노출시키는 단계 및 샘플에 대한 항체의 특이적 결합을 결정하는 단계를 포함하는, 마이오스타틴 단백질의 존재 및/또는 양을 결정하는 방법을 제공한다. 본 발명의 항-마이오스타틴 항체는 당업계에서 이용가능한 임의의 방법, 예를 들어, ELISA 분석법을 사용하여 상기 항체를 기지량의 마이오스타틴이 있는 샘플과 결합시킴으로써 생성된 표준 곡선과 테스트 샘플 값을 비교함으로써 테스트 샘플 내의 마이오스타틴의 수준을 결정하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 본 발명의 항체 및, 바람직하게는, 예를 들어 테스트 샘플 내의 마이오스타틴 단백질을 검출하는데 항체를 사용하기 위한 설명서를 포함하는 키트를 추가로 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 본 발명의 제약 조성물은 제약상 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제약 조성물에서, 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체는 활성 성분이다. 바람직하게는, 제약 조성물은 본 발명 의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체의 균질한 또는 실질적으로 균질한 집단을 포함한다. 치료적 용도를 위한 조성물은 무균성이고, 동결건조될 수 있고, 바람직하게는 적절한 희석제와 함께 공급된다.
본 발명은 치료적 유효량 또는 예방적 유효량, 또는 마이오스타틴-중화 또는 마이오스타틴-억제량의 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체를 포유류 또는 조류 종에게 투여하는 것을 포함하는, 마이오스타틴의 1가지 이상의 생물학적 활성을 억제하는 것을 필요로 하는 동물, 바람직하게는 포유류 또는 조류 종, 바람직하게는 인간에서 마이오스타틴의 1가지 이상의 생물학적 활성을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명은 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자 (예를 들어, 인간)에게 치료적 또는 예방적 유효량의 본 발명의 모노클로날 항체를 투여하는 것을 포함하는, 근육 질량을 증강시키거나, 또는 마이오스타틴 생체활성을 중화시키거나 길항함으로써 개선되는 질환 또는 장애 또는 용태를 치료 또는 예방하는 방법을 또한 제공한다.
본 발명은 예를 들어, 무름, 악액질, 연령-관련 근육감소증, 근육 소모 또는 쇠약, 근육병증, 근육 퇴행위축, 골다공증, 비만, COPD, 신장 부전 또는 질환, 간 부전 또는 질환, 심장 부전 또는 질환, 대사 증후군 및 제II형 당뇨병의 치료를 필요로 하는 포유동물, 바람직하게는 인간에서 치료적 유효량 또는 예방적 유효량의 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체를 상기 포유동물에게 투여하는 것에 의한 이의 치료를 위해 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여하기 위한 약제의 제조에서 사용하기 위한 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체를 구현한다.
본 발명은 포장재 및 상기 포장재 내에 함유된 본 발명의 항체를 포함하고, 항체가 특이적으로 마이오스타틴 활성을 중화시키거나 길항하거나 또는 마이오스타틴의 수준을 감소시킨다는 것을 바람직하게는 나타내는 포장 삽입물을 포장재가 포함하는 제조품을 구현한다. 임의로, 포장 삽입물은 GDF-11에 결합하는 것에 비해 마이오스타틴에 우선적으로 결합함으로써 항체가 GDF-11 활성에 비해 마이오스타틴 활성을 우선적으로 중화시키거나 길항하거나 또는 GDF-11의 수준을 감소시키는 것에 비해 우선적으로 마이오스타틴의 수준을 감소시킨다는 것을 또한 나타낸다.
본 발명은 본 발명의 항체를 코딩하는 단리된 핵산; 벡터로 형질전환된 숙주 세포가 인식하는 제어 서열에 임의로 작동가능하게 연결된, 상기 핵산을 포함하는 벡터 (또는 벡터들); 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포; 핵산이 발현되도록 상기 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 임의로 숙주 세포 배지로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하는 본 발명의 항체의 생산 방법을 추가로 제공한다.
도 1은 인간 프로마이오스타틴의 아미노산 서열을 나타내고, 신호 서열에는 밑줄이 쳐지고, 성숙 형태의 마이오스타틴의 단량체를 구성하는 카르복시-말단에서의 단백질의 부분은 진한 글자로 표시된다.
도 2는 단량체성 인간 성숙 마이오스타틴의 아미노산 서열을 나타낸다. 활성 인간 마이오스타틴은 디술피드 결합에 의해 회합된 이러한 폴리펩티드의 동종이량체이다. 본 발명의 항원성 에피토프에 밑줄이 쳐진다. 이러한 서열은 마우스, 래트, 닭, 칠면조, 개, 말 및 돼지에서의 성숙 마이오스타틴의 것과 동일하다.
도 3은 다양한 포유류 및 조류 종의 성숙 마이오스타틴의 아미노산 서열의 정렬을 나타낸다.
도 4는 성숙 형태의 인간 마이오스타틴 및 인간 GDF-11의 아미노산 서열의 정렬을 나타내고, 본 발명의 항원성 에피토프에는 밑줄이 쳐지고, 마이오스타틴과 GDF-11 사이에서 상이한 항원성 에피토프 내의 잔기는 진하게 인쇄된다.
도 5는 VH2-70 프레임워크(framework)를 갖는 HCVR의 아미노산 서열의 정렬을 나타낸다. CDR 도메인은 진하게 인쇄된다.
도 6은 VH4-39 프레임워크를 갖는 HCVR의 아미노산 서열의 정렬을 나타낸다. CDR 도메인은 진하게 인쇄된다.
도 7 및 8은 O2 프레임워크를 갖는 LCVR의 아미노산 서열의 정렬을 나타낸다. CDR 도메인은 진하게 인쇄된다.
도 9는 본 발명의 다양한 항체의 LCVR 및 HCVR의 CDR의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 10은 다양한 뮤린(murine) 항-마이오스타틴 항체의 LCVR의 아미노산 서열을 나타내고, 이들 중 임의의 것이 본 발명의 항체에 대한 대표적인 어버이 분자일 수 있다. 본원에 포함된 미국 특허 출원 60/559,621 및 60/555,456 참조.
도 11은 다양한 뮤린 항-마이오스타틴 항체의 HCVR의 아미노산 서열을 나타내고, 이들 중 임의의 것이 본 발명의 항체에 대한 대표적인 어버이 분자일 수 있다. 미국 특허 출원 60/559,621 및 60/555,456 참조.
본 발명은 포유류 또는 조류 마이오스타틴 (전(前)단백질 또는 성숙 단백질 또는 이의 일부분; 단량체성 또는 동종이량체성)에 특이적으로 결합할 수 있는 항-마이오스타틴 모노클로날 항체를 제공하고, 이때 상기 항체는 시험관내에서 및/또는 생체내에서 1가지 이상의 마이오스타틴 활성을 중화시키거나 길항할 수 있는 키메라, 인간화 또는 완전 인간 항체 또는 이의 항원-결합 부분인 것을 추가로 특징으로 하고; 바람직하게는 마이오스타틴/SBE 리포터 분석법에서 약 25 nM, 20 nM, 16 nM, 14 nM, 10 nM, 9 nM, 6 nM, 또는 5.2 nM 미만의 IC50을 나타내고/내거나 바람직하게는 마이오스타틴과의 높은 결합 친화력을 나타낸다. 본 발명의 항체는 성숙 형태의 마이오스타틴의 잔기 40-64 (예를 들어, 서열 53)에 스패닝된 도메인 내에서 마이오스타틴에 결합하고 마이오스타틴의 가장 가까운 상동체인 GDF-11과 현저하게 덜 반응성이라는 것을 추가로 특징으로 한다.
정의
본원에서 사용된 용어 "성숙 마이오스타틴" (인간, 뮤린, 래트, 닭, 칠면조, 개, 말 및 돼지 종에 대해 서열 2 참조)은 아미노산 375개의 전단백질 형태의 마이오스타틴의 Arg 266에서의 단백질분해성 절단 후에 생성된 단량체성 또는 동종이량체성 형태의 단백질을 지칭한다. 본원에서 사용된 용어 "마이오스타틴"은 성숙 마이오스타틴을 지칭한다. 인간 단백질과 관련하여 사용된, 본원에서 사용된 용어 "프로마이오스타틴" 또는 "전단백질 형태의 마이오스타틴"은 단량체 또는 동종이량체로서의 서열 1에 제시된 서열을 포함하는 단백질을 지칭한다.
천연적으로 존재하는 전장 항체는 디술피드 결합에 의해 상호연결된 2개의 중쇄 (H) (전장인 경우 약 50-70 kDa) 및 2개의 경쇄 (L) (전장인 경우 약 25 kDa)의 4개의 펩티드 사슬로 구성된 면역글로불린 분자이다. 각 사슬의 아미노 말단 부분은 항원 인식을 주로 담당하는 아미노산 약 100-110 개 이상의 가변 영역을 포함한다. 각 사슬의 카르복시-말단 부분은 이펙터(effector) 기능을 주로 담당하는 불변 영역을 한정짓는다.
경쇄는 카파 또는 람다로 분류되고, 당업계에 공지된 바와 같은 특정 불변 영역을 특징으로 한다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론으로 분류되고, 항체의 이소타입을 각각 IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE로 한정지으며, 이들 중 몇몇은 서브클래스 (이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 각각의 중쇄 유형은 당업계에 공지된 바와 같은 특정 불변 영역을 특징으로 한다. 상이한 클래스의 항체들의 서브유닛 구조 및 3차원 형상은 당업계에 주지되어 있다. 각각의 중쇄는 N-말단 중쇄 가변 영역 (본원에서 "HCVR") 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 IgG, IgD, 및 IgA에 대해서는 3개의 도메인 (CH1, CH2, 및 CH3)으로; IgM 및 IgE에 대해서는 4개의 도메인 (CH1, CH2, CH3, 및 CH4)으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 "LCVR") 및 경쇄 불변 영역 CL로 구성된다. HCVR 및 LCVR 영역은 프레임워크 영역 (FR: framework region)으로 칭해지는 좀더 보존된 영역이 산재된, 상보성 결정 영역 (CDR: complementarity determining region)으로 칭해지는 과가변성의 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 HCVR 및 LCVR은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 정렬된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 이때, 중쇄의 3개의 CDR은 "CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3"으로 지칭되고, 경쇄의 3개의 CDR은 "CDRL1, CDRL2 및 CDRL3"으로 지칭된다. CDR은 항원과의 특이적 상호작용을 형성하는 잔기의 대부분을 함유한다. 각각의 도메인에 대한 아미노산 할당은 주지된 약조에 따른다 [예를 들어, [Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)], 또는 [Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948, 1997]에 기술된 Chothia 넘버링(numbering) 도식, 또한 인터넷 사이트 http:www.rubic.rdg.ac.uk/～andrew/bioinf.org/abs 참조]. 특정 항원에 결합하는 항체의 기능적 능력은 6개의 CDR에 의해 크게 영향을 받는다.
본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체 (또는 간단히 "본 발명의 모노클로날 항체")와 관련하여 본원에서 사용된 용어 "항체"는 모노클로날 항체를 지칭한다. 본원에서 사용된 "모노클로날 항체"는, 달리 지시되지 않는 한, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간 항체를 지칭한다. 바람직하게는, 본 발명의 모노클로날 항체는 균질한 또는 실질적으로 균질한 집단으로 존재한다. 본 발명의 모노클로날 항체는, 예를 들어, 당업계에 주지된 하이브리도마(hybridoma) 기술, 뿐만 아니라 재조합 기술, 파지 디스플레이 기술, 합성 기술 또는 이같은 기술들의 조합 또는 당업계에 공지된 기타 기술을 사용하여 제조할 수 있다. "모노클로날 항체"는 예를 들어, 임의의 진핵생물, 원핵생물 또는 파지 클론이 포함되는 단일 카피 또는 클론으로부터 유래된 항체를 지칭하고, 항체가 제조된 방법을 지칭하지 않는다. "모노클로날 항체"는 키메라, 인간화 또는 인간 항체의 무손상 항체 (완전 또는 전장 Fc 영역 포함), 실질적인 무손상 항체, 또는 항원-결합 부분을 포함하는 항체의 일부 또는 단편, 예를 들어, Fab 단편, Fab' 단편 또는 F(ab')2 단편일 수 있다.
각각의 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 항체의 항원-결합 부위를 형성한다. 따라서, 무손상 IgG 항체는 2개의 결합 부위를 갖는다. 2관능성 또는 이중특이성 항체를 제외하고는, 2개의 결합 부위는 동일하다. 본원에서 사용된 "항원-결합 부분" 또는 "항원-결합 영역" 또는 "항원-결합 단편"은 항원과 상호작용하고 항원에 대한 특이성 및 친화력을 항체에 부여하는 아미노산 잔기를 함유하는, 가변 영역 내의 항체 분자의 부분을 본원에서 상호교환적으로 지칭한다. 항체의 항원-결합 부분은 항원-결합 잔기의 적절한 입체구조를 유지하기 위해 필요한 프레임워크 아미노산 잔기를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체의 항원-결합 영역의 CDR 또는 전체 항원-결합 영역은 뮤린에서 유래된 것이거나, 또는 특정 활성이 개선되도록 특정 아미노산 잔기들이 변형되면서 실질적으로 뮤린에서 유래된 것일 것이다 (도 9 참조). 바람직하게는, 본 발명의 항체의 프레임워크 영역은 인간에서 유래되거나, 또는 실질적으로 인간에서 유래될 것이다 (적어도 85％, 90％, 95％, 97％ 또는 99％ 인간 유래). 또다른 실시양태에서, 항원-결합 영역, 또는 항원-결합 영역의 CDR은 토끼, 래트 또는 햄스터가 포함되지만 이에 한정되지 않는 다른 비-인간 종으로부터 유래될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 항원-결합 영역은 전체적으로 인간에서 유래되거나, 또는 특정 활성, 예를 들어, 친화력 또는 특이성이 개선되도록 특정 아미노산 잔기들이 변형되면서 실질적으로 인간에서 유래될 수 있다 (예를 들어, 진하게 인쇄되고 밑줄이 쳐진 도 9의 아미노산 위치 참조).
또한, 본원에서 사용된 "모노클로날 항체"는 LCVR 및 HCVR을 코딩하는 DNA를 링커 서열로 연결시킴으로써 생산될 수 있는 단일쇄 Fv 단편일 수 있다 ([Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp 269-315, 1994] 참조). 단편 또는 부분이 특정되는지 여부와 상관없이 본원에서 사용된 용어 "항체"에는 이같은 단편 또는 부분, 뿐만 아니라 단일쇄 형태도 포함되는 것으로 이해된다. 단백질이 이의 의도된 표적 (즉, 에피토프 또는 항원)에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 능력을 유지하는 한, 이는 용어 "항체"에 포함된다.
"모노클로날 항체의 집단"은 균질한 또는 실질적으로 균질한 항체 집단 (즉, 집단 내의 항체의 적어도 약 85％, 87％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 더욱 바람직하게는 적어도 약 97％ 또는 98％, 가장 바람직하게는 적어도 99％가 ELISA 분석법에서 동일한 항원 또는 에피토프에 대해 경쟁할 것이다). 항체는 글리코실화되거나 글리코실화되지 않을 수 있고, 여전히 본 발명의 범위 내에 속한다. 모노클로날 항체는, 번역후 변형, 예를 들어, 글리코실화 패턴이 상이할 수 있지만, 동일한 아미노산 서열을 갖는다면 균질할 수 있다.
"변이체" 항-마이오스타틴 항체는 어버이 항체 서열에서의 1개 이상의 아미노산 잔기(들)의 부가, 결실 및/또는 치환에 의해 "어버이" 항-마이오스타틴 항체 아미노산 서열과 아미노산 서열이 상이한 분자를 지칭한다. 바람직한 실시양태에서, 변이체는 어버이 항체의 1개 이상의 CDR 영역(들) 내에 1개 이상의 아미노산 치환(들)을 포함한다. 예를 들어, 변이체는 어버이 항체의 1개 이상의 CDR 영역 내에 1개 이상 (예를 들어, 약 1개 내지 약 10개, 바람직하게는 약 2개 내지 약 5개)의 치환을 포함할 수 있다. 변이체 서열에 관한 동일성 또는 상동성은 서열들을 정렬하고 필요하다면 갭(gap)을 도입하여 최대 백분율 서열 동일성을 달성한 후 어버이 항체 잔기와 동일한 변이체 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로 본원에서 정의된다. 항체 서열 내의 N-말단, C-말단, 또는 내부 연장, 결실 또는 삽입은 서열 동일성 또는 상동성에 영향을 미치는 것으로 해석되지 않는다. 변이체는 마이오스타틴에 결합하는 성질을 유지하고, 바람직하게는 어버이 항체보다 우수한 성질을 갖는다. 예를 들어, 변이체는 더욱 강한 결합 친화력, SBE/리포터 분석법에서의 더 낮은 IC50, 또는 마이오스타틴 생체활성을 억제하는 증강된 능력을 가질 수 있다. 본원에서 특히 흥미로운 변이체 항체는 어버이 항체와 비교하여 생물학적 활성에서 적어도 약 2배, 5배, 바람직하게는 적어도 약 10배, 더욱 바람직하게는 적어도 약 20배, 30배, 또는 50배 증강을 나타내는 것이다.
본원에서의 "어버이" 항체는 변이체의 제조에 사용된 아미노산 서열에 의해 코딩되는 것이다. 어버이 항체는 뮤린 프레임워크를 가질 수 있지만, 바람직하게는 인간 프레임워크 영역을 갖는다. 어버이 항체는 뮤린 (예를 들어, 본원의 도 10 및 11 참조), 키메라, 인간화 또는 인간 항체일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "특이적으로 결합한다"는 당업계의 기술에 의해, 예를 들어, 경쟁 ELISA에 의해 또는 BIACORE 또는 KINEXA 분석법으로의 KD의 측정에 의해 측정했을 때 특이적 결합 쌍의 한 구성원이 이의 특이적 결합 파트너(들) 이외의 분자에는 현저하게 결합하지 않는 상황 (즉, 약 35％, 33％, 30％, 20％, 또는 10％ 미만의 교차-반응성)을 지칭한다. 이 용어는 예를 들어, 본 발명의 항체의 항원-결합 도메인이 다수의 항원이 운반하는 특정 에피토프에 특이적인 경우에도 또한 적용가능하고, 이러한 경우 항원-결합 도메인을 운반하는 특이적 항체는 이 에피토프를 운반하는 다양한 항원에 결합할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명의 모노클로날 항체는 성숙 형태의 마이오스타틴의 아미노산 40-64, 43-57 및/또는 45-59 내에 국소화된 에피토프에 특이적으로 결합한다.
본원에서 사용된 용어 "우선적으로 결합한다"는 당업계의 기술에 의해, 예를 들어, 경쟁 ELISA에 의해 또는 BIACORE 또는 KINEXA 분석법으로의 KD의 측정에 의해 측정했을 때 항체가 다른 항원에 결합하는 것에 비해 적어도 약 2, 3, 5, 10, 20, 22, 24, 또는 25배 더 많이 특정 항원에 결합하는 상황을 지칭한다. 따라서, 본 발명의 모노클로날 항체는 GDF-11에 비해 GDF-8에 우선적으로 결합한다. 유사하게, 항체는 항원 내의 한 에피토프에 동일한 항원 내의 다른 에피토프보다 우선적으로 결합할 수 있다.
용어 "에피토프"는 항체의 항원-결합 영역 중 1곳 이상에서 항체에 의해 인식되어 결합될 수 있는 분자의 부분을 지칭한다. 에피토프는 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 군체(grouping)로 종종 구성되고, 특이적인 3차원성 구조 특징, 뿐만 아니라 특이적인 전하 특징을 갖는다. "억제 에피토프" 및/또는 "중화 에피토프"는 무손상 분자 (이러한 경우, 마이오스타틴)의 문맥에서, 그리고 에피토프에 특이적인 항체에 결합되었을 때, 생체내 또는 시험관내에서 분자 또는 분자를 함유하는 생물의 생물학적 활성이 결과적으로 손실 또는 감소되는 에피토프를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "에피토프"는 동물, 바람직하게는 포유동물, 예를 들어, 마우스 또는 인간에서 항원성 및/또는 면역원성 활성을 갖는 폴리펩티드의 부분을 또한 지칭한다. 본원에서 사용된 용어 "항원성 에피토프"는 당업계에 주지된 임의의 방법, 예를 들어, 통상적인 면역분석법에 의해 결정될 때 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩티드의 부분으로 정의된다. 항원성 에피토프는 반드시 면역원성일 필요는 없지만, 면역원성일 수 있다. 본원에서 사용된 "면역원성 에피토프"는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 때 동물에서 항체 응답을 도출해 내는 폴리펩티드의 부분으로 정의된다 (예를 들어, [Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002 (1983)] 참조).
본 발명의 항체와 관련된 어구 "생물학적 성질" 또는 "생체활성", "활성" 또는 "생물학적 활성"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 에피토프/항원 친화력 및 특이성, 생체내 또는 시험관내에서 마이오스타틴의 활성을 중화시키거나 길항하는 능력, 마이오스타틴/SBE 리포터 분석법 또는 기타 시험관내 활성 분석법에서의 IC50, 항체의 생체내 안정성, 및 항체의 면역원성 성질을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 항체의 또다른 확인가능한 생물학적 성질에는, 예를 들어, 교차-반응성 (즉, 일반적으로, 표적 펩티드의 비-인간 상동체와의 교차 반응성, 또는 다른 단백질 또는 조직과의 교차 반응성), 및 포유류 세포에서 단백질의 높은 발현 수준을 보존하는 능력이 포함된다. 상기 언급된 성질 또는 특징은 필요에 따라 ELISA, 경쟁적 ELISA, 표면 플라즈마 공명 분석법, 비제한적인 시험관내 및 생체내 중화 분석법, 수용체 결합, 사이토카인 또는 성장 인자 생산 및/또는 분비, 제노푸스(Xenopus) 동물 캡 발생, 신호 전달, 및 인간, 영장류 또는 기타 공급원이 포함되는 여러 공급원으로부터의 조직 절편으로의 면역조직화학이 포함되지만 이에 한정되지 않는 당업계에 인정된 기술을 사용하여 관찰 또는 측정 또는 평가할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "마이오스타틴 활성"은 활성 마이오스타틴 단백질과 관련된 1가지 이상의 생리학적 성장-조절 또는 형태형성 활성을 지칭한다. 예를 들어, 활성 마이오스타틴은 골격근 질량의 음성 조절인자이다. 또한 활성 마이오스타틴은 근육-특이적 효소 (예를 들어, 크레아틴 키나제)의 생산을 조절할 수 있고, 근육모세포 증식을 자극할 수 있으며, 지방세포로의 지방전구세포 분화를 조정할 수 있다.
본 발명의 항체의 활성과 관련하여 본원에서 사용된 용어 "억제" 또는 "중화"는, 예를 들어, 생물학적 활성 또는 성질, 질환 또는 용태가 포함되지만 이에 한정되지 않는 억제될 것의 진행 또는 중증도를 실질적으로 길항하거나, 방해하거나, 방지하거나, 제지하거나, 느리게 하거나, 파괴하거나, 제거하거나, 정지시키거나, 감소시키거나 또는 역행하는 능력을 의미한다. 억제 또는 중화는 바람직하게는 적어도 약 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％ 이상이다.
핵산 또는 단백질 (예를 들어, 항체)와 관련되어 사용된 용어 "단리된"은 천연 공급원 내에서 통상적으로 회합된 1개 이상의의 오염물로부터 확인 및 분리된 핵산 서열 또는 단백질을 지칭한다. 바람직하게는, "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체이다 (예를 들어, 본 발명의 제약 조성물은 마이오스타틴에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 포함하고, 마이오스타틴 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다).
용어 "카밧(Kabat) 넘버링" 및 "카밧 라벨링"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 당업계에서 인정되는 이러한 용어는 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 내의 다른 아미노산 잔기보다 더욱 가변성인 (즉, 과가변성인) 아미노산 잔기의 넘버링 시스템을 지칭한다 ([Kabat, et al., Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93 (1971)]; [Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)]).
폴리뉴클레오티드는 또다른 폴리뉴클레오티드와 기능적인 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서는 코딩 서열의 전사에 영향을 미치면 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 이들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결되었을 때, 바람직하게 이들이 동일한 오픈 리딩 프레임 내에 있을 때, 펩티드는 또다른 펩티드에 "작동가능하게 연결"된다.
본원에서 상호교환적으로 사용된 용어 "개체", "대상" 및 "환자"는 뮤린, 원숭이, 인간, 포유류 농장 동물 (예를 들어, 소, 돼지, 양), 포유류 운동 동물 (예를 들어, 말), 및 포유류 애완동물 (예를 들어, 개 및 고양이)이 포함되지만 이에 한정되지 않는, 동물, 바람직하게는 포유류 (비-영장류 및 영장류 포함) 또는 조류 종을 지칭한다; 바람직하게는, 이 용어는 인간을 지칭한다. 이 용어는 닭 및 칠면조가 포함되지만 이에 한정되지 않는 조류 종을 또한 지칭한다. 특정 실시양태에서, 대상, 바람직하게는 포유동물, 바람직하게는 인간은 마이오스타틴의 수준 감소 또는 생체 활성 감소가 이로울 질환 또는 장애 또는 용태를 추가로 특징으로 한다. 또다른 실시양태에서, 대상, 바람직하게는 포유동물, 바람직하게는 인간은 마이오스타틴의 수준 감소 또는 마이오스타틴의 생체 활성 감소가 이로울 장애, 질환 또는 용태가 발달될 위험이 있는 것을 추가로 특징으로 한다.
용어 "벡터"에는 플라스미드 또는 바이러스 벡터가 포함되지만 이에 한정되지 않는, 자신이 연결된 또다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자가 포함된다. 특정 벡터는 자신이 도입된 숙주 세포 내에서 자가 복제할 수 있고, 또다른 벡터들은 숙주 세포 내로의 도입 시 숙주 세포의 게놈 내로 통합되어 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 또한, 특정 벡터는 자신이 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이같은 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 간단히 "발현 벡터")로 지칭되고, 예시적인 벡터는 당업계에 주지되어 있다.
본원에서 사용된 표현 "세포", "숙주 세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되고, 임의의 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드, 또는 본 발명의 HCVR, LCVR 또는 모노클로날 항체를 코딩하는 서열을 포함하는 임의의 재조합 벡터(들)의 수용체인 개별적인 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포에는 단일 숙주 세포의 후손이 포함되고, 후손은 자연적인, 우연한 또는 계획적인 돌연변이 및/또는 변화로 인해 원래의 어버이 세포와 반드시 완전하게 동일하지 않을 수 있다 (형태학 또는 전체 DNA 상보체의 관점에서). 숙주 세포에는 본 발명의 모노클로날 항체 또는 이의 경쇄 또는 중쇄를 발현하는 1개 이상의 재조합 벡터 또는 폴리뉴클레오티드로 생체내에서 또는 시험관내에서 형질전환, 형질도입 또는 감염된 세포가 포함된다. 본 발명의 재조합 벡터 (숙주 염색체 내로 안정적으로 혼입되었거나 혼입되지 않음)를 포함하는 숙주 세포를 "재조합 숙주 세포"로 또한 지칭할 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 바람직한 숙주 세포는 CHO 세포 (예를 들어, ATCC CRL-9096), NS0 세포, SP2/0 세포 및 COS 세포 (예를 들어, ATCC CRL-1650, CRL-1651), HeLa (ATCC CCL-2)이다. 본 발명에서 사용하기 위한 추가적인 숙주 세포로는 식물 세포, 효모 세포, 기타 포유류 세포 및 원핵생물 세포가 포함된다.
항체 특징화
본 발명은 높은 친화력으로 마이오스타틴에 특이적으로 결합하는, 단리된 모노클로날 항체에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 바람직하게는 키메라, 인간화 또는 인간 항체 또는 이의 항원-결합 부분이고, 바람직하게는 아미노산 40-64에 스패닝된 성숙 형태의 마이오스타틴의 영역 내에서, 더욱 바람직하게는 아미노산 43-57 및/또는 45-59에 스패닝된 성숙 형태의 마이오스타틴의 영역 내에서 마이오스타틴에 결합한다. 또한, 본 발명의 항체는 생체내에서 또는 시험관내에서 마이오스타틴의 생물학적 활성을 중화시킨다. 마이오스타틴에 대한 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체의 특이적 결합은 본 발명의 항체가 마이오스타틴-관련 용태, 질환 또는 장애, 즉 마이오스타틴 수준을 저하시키는 것 또는 마이오스타틴의 생물학적 활성을 억제하는 것이 이로운 용태, 질환 또는 장애에 대한 치료제 또는 예방제로서 사용되도록 한다. 또한, 본 발명의 항체는 마이오스타틴의 수준 또는 생체활성 변화가 이로운 용태, 질환 또는 장애를 진단 또는 모니터링하는데, 또는 샘플 내의 마이오스타틴의 수준을 결정하는데 사용될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 약 3 × 10-8 M, 1 × 10-8 M 또는 1 × 10-9 M 이하, 바람직하게는 약 9 × 10-10 M 또는 8.7 × 10-10 M 또는 8 × 10-11 M 미만의 마이오스타틴에 대한 결합 친화력 (KD)으로 마이오스타틴 또는 이의 일부에 결합하는 항-마이오스타틴 모노클로날 항체를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 약 3 × 10-8 M, 1 × 10-8 M, 1 × 10-9 M 또는 9 × 10-10 M 이하의 마이오스타틴에 대한 KD, 가장 바람직하게는 약 8.7 × 10-10 M 또는 8 × 10-11 M 이하의 마이오스타틴에 대한 KD를 특징으로 한다. 항체 친화력은 하기의 실시예에서 기술된 바와 같이 또는 당업계에서 이용가능한 임의의 적절한 방법에 의해 결정될 수 있다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 하기의 실시예에 기술된 바와 같은 시험관내 마이오스타틴/SBE 리포터 분석법에서 IC50이 약 25 nM, 20 nM, 16 nM, 14 nM, 10 nM, 9 nM, 6 nM, 5.2 nM 이하인 항-마이오스타틴 모노클로날 항체를 제공한다. 이같은 항체는 약 3 × 10-8 M, 1 × 10-8 M, 1 × 10-9 M 또는 9 × 10-10 M 이하의 마이오스타틴에 대한 KD, 가장 바람직하게는 약 8.7 × 10-10 M 또는 8 × 10-11 M 이하의 마이오스타틴에 대한 KD를 추가로 특징으로 할 수 있다. 이같은 항체는 임의의 당업계에 이용가능한 방법, 예를 들어, ELISA 분석법 또는 경쟁적 ELISA 분석법, 또는 예를 들어 BIACORE 또는 KINEXA 분석법으로 측정된 KD 값을 사용하여 GDF-11에 결합하는 능력과 비교했을 때 마이오스타틴에 우선적으로 결합하는 것을 추가로 특징으로 할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 모노클로날 항체는 당업계의 표준 기술 예컨대 ELISA 분석법, 경쟁적 ELISA 분석법, 또는 예를 들어 BIACORE 또는 KINEXA 분석법으로 측정된 KD 값에 의해 측정했을 때 비-마이오스타틴 단백질 (예를 들어, GDF-11) 또는 적어도 15, 14, 13, 12, 11, 10 또는 9개의 인접한 아미노산으로 구성된 비-마이오스타틴 펩티드와의 교차 반응성이 약 35, 33, 30, 28, 25, 23, 또는 20％ 미만이다 (더욱 바람직하게는 약 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 또는 6％ 미만, 더욱 더 바람직하게는 약 5 또는 4 ％ 미만의 교차반응성). 바람직하게는, 본 발명의 항체는, 예를 들어, 경쟁 ELISA 또는 BIACORE 또는 KINEXA 분석법에 의해 결정했을 때, GDF-11에 결합하는 것보다 마이오스타틴에 적어도 2, 3, 5, 10, 20, 22, 24 또는 25배 더 많이 결합한다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 항체는 당업계에서 이용가능한 또는 통상적인 임의의 결합 분석법을 사용했을 때 배경 수준을 초과하여 GDF-11에 결합하지 않는다. 본 발명의 모노클로날 항체는 단량체성 또는 이량체성 형태의 마이오스타틴 또는 성숙 마이오스타틴의 잔기 40-64, 43-57 및/또는 45-59에 스패닝된 아미노산을 포함하는 이의 일부분에 결합한다.
바람직하게는, 본 발명의 항체의 우선적인 결합에 대해 테스트된 마이오스타틴 및 GDF-11 폴리펩티드는 양쪽 모두 동종이량체성 형태의 성숙 단백질, 바람직하게는 포유류 또는 조류에서 유래된 것, 더욱 더 바람직하게는 인간에서 유래된 것이다. 그러나, 본 발명의 항체의 우선적인 결합에 대해 테스트된 마이오스타틴 및 GDF-11 폴리펩티드는 단량체성 형태의 성숙 단백질 또는 전단백질 형태, 또는 성숙 형태의 단백질의 아미노산 40-64, 43-57 및/또는 45-59에 스패닝된 성숙 단백질의 일부분을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다.
본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체는 성숙 마이오스타틴의 아미노산 40-64 (인간에 대해 서열 53), 바람직하게는 성숙 마이오스타틴의 아미노산 43-57 및/또는 45-59에 국소화된 것으로 발견된 항원성 에피토프에 결합한다. 또한, 본 발명의 마이오스타틴 면역원성 에피토프는 임의의 포유류 또는 조류 종의 성숙 마이오스타틴의 아미노산 40-64 (인간에 대해 서열 53), 바람직하게는 성숙 마이오스타틴의 아미노산 43-57 및/또는 45-59에 국소화된다. 본 발명의 면역원성 에피토프는 또한 항원성 에피토프인 것으로 구현된다. 항원성 에피토프는 성숙 마이오스타틴의 아미노산 40-64 이외의 추가적인 마이오스타틴 잔기를 가질 수 있지만, 본 발명의 모노클로날 항체는 마이오스타틴에 특이적으로 결합하기 위해 이러한 추가적인 잔기를 필요로 하지는 않는다. 추가적으로, 아미노산 40-64 이외의 마이오스타틴의 잔기는 항원성 도메인의 입체형태적 구조에 영향을 미쳐, 본 발명의 항체가 항원성 에피토프에 결합하는 것을 변경시킬 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 모노클로날 항체는 GDF-8에 결합하는 수준과 비교하여 GDF-11과 현저하게 반응하지 않는다 (즉, 결합하지 않는다). 더욱 바람직하게는, 본 발명의 모노클로날 항체는, 예를 들어 ELISA 분석법, 경쟁 ELISA 분석법 또는 BIACORE 또는 KINEXA 분석법에서의 KD 값에 의해 결정될 때, GDF-11에 결합하는 것에 비해 적어도 2, 3, 5, 10, 20, 22, 24 또는 25배 더 많이 마이오스타틴에 결합한다 (예를 들어, 더 큰 친화력 또는 더 큰 특이성).
성숙 마이오스타틴의 아미노산 40-64 (경계 포함), 43-57 또는 45-59로 구성된 펩티드 또는 본원에 기술된 바와 같은 면역원성 에피토프로 구성된 임의의 펩티드를, 바람직하게는 캐리어 단백질, 예를 들어, KLH에 접합시켜, 당업자에게 이용가능한 방법을 사용하여 본 발명의 모노클로날 항체를 생성시키도록 면역원성 펩티드로 사용할 수 있다. 이러한 펩티드 내의 시스테인 잔기가 세린 잔기로 변화될 수 있고, 여전히 면역원성 에피토프로 기능한는 것으로 구현된다. 면역원성 펩티드를 비-인간 동물, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 마우스를 면역화시키는데 사용할 수 있다. 완전 인간 항체를 위해서, 면역원성 펩티드를 마우스 항체 유전자 발현이 억제되고 인간 항체 유전자 발현으로 효과적으로 대체된 트랜스제닉 계통의 마우스를 면역화시키는데 사용할 수 있다. 이어서, 면역화된 동물로부터 항-마이오스타틴 항체를 단리하고, 당업계에 주지된 방법에 의해 스크리닝하여, 바람직하게는 약 3 × 10-8 M, 1 × 10-8 M 또는 1 × 10-9 M 미만, 바람직하게는 약 9 × 10-10 M, 8.7 × 10-10 M 또는 8 × 10-11 M 미만의 결합 친화력에 대해 스크리닝되고/되거나 시험관내 마이오스타틴/SBE 분석법 (본원의 실시예 6에 기술된 분석법 참조)에서 약 25 nM, 20 nM, 16 nM, 14 nM, 10 nM, 9 nM, 6 nM, 5.2 nM 이하의 IC50에 대해 스크리닝된, 성숙 마이오스타틴의 아미노산 40-64에 스패닝된 도메인, 바람직하게는 아미노산 43-57 및/또는 45-59에 스패닝된 도메인에 특이적으로 결합하는 이러한 항체를 단리한다.
모노클로날 항체는 당업계에 주지된 하이브리도마 방법 (예를 들어, [Kohler et al., Nature, 256:495, 1975] 참조)를 사용하여 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 4,816,567의 방법) 또는 당업계에서 이용가능한 기타 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 적절한 불멸 세포주 (예를 들어, 골수종 세포주 예컨대 SP2/0)를 면역화된 동물의 항체 생산 세포와 융합시킴으로써 하이브리도마를 생산할 수 있다. 항체 생산 세포, 바람직하게는 지라 또는 림프절의 항체 생산 세포를 당해 항원으로 면역화된 동물로부터 수득한다. 융합된 세포 (하이브리도마)를 선별 배양 조건을 사용하여 단리하고, 제한 희석에 의해 클로닝할 수 있다. 하이브리도마 세포가 성장하고 있는 배양 배지를 항원에 대해 지시된 모노클로날 항체의 생산에 대해 분석한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성이 면역침전에 의해 또는 시험관내 결합 분석법, 예컨대 방사선면역측정법 (RIA) 또는 ELISA에 의해 결정된다. 원하는 결합 성질을 갖는 항체를 생산하는 세포를 적절한 스크리닝 분석법에 의해 선별할 수 있다. 이같은 단리 및 스크리닝 방법은 당업계에 주지되어 있다.
재조합 항체 (예를 들어, 단일쇄 Fv 또는 Fab)를 라이브러리로부터 선별하는 방법, 또는 인간 항체의 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)의 면역화에 의존하는 방법이 예를 들어 포함되는, 인간 또는 인공 항체를 포함하여 성숙 마이오스타틴의 아미노산 40-64, 43-57 및/또는 45-59에 스패닝된 도메인 내에서 결합하는 항체를 생산 또는 단리하는 또다른 적절한 방법을 사용할 수 있다 (예를 들어, [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-2555, 1993]; [Jakobovits et al., Nature, 362:255-258, 1993]; 미국 특허 5,545,806 (Lonberg et al.); 미국 특허 5,545,807 (Surani et al.) 참조).
상이한 종으로부터 유래된 부분을 포함하는, 단일쇄 항체, 및 키메라, 인간화 또는 영장류화 (CDR-그래프트(grafted)) 항체, 뿐만 아니라 키메라 또는 CDR-그래프트 단일쇄 항체 등이 또한 본 발명 및 용어 "항체"에 포함된다. 이러한 항체의 다양한 부분을 통상적인 기술에 의해 화학적으로, 합성적으로 함께 연결시킬 수 있거나, 유전자 조작 기술을 사용하여 인접 단백질로서 제조할 수 있다. 예를 들어, 키메라 또는 인간화 사슬을 코딩하는 핵산을 발현시켜 인접 단백질을 생산할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 4,816,567; 유럽 특허 0,125,023 B1; 미국 특허 4,816,397; 유럽 특허 0,120,694 B1; WO 86/01533; 유럽 특허 0,194,276 B1; 미국 특허 5,225,539; 유럽 특허 0,239,400 B1 및 미국 특허 5,585,089 및 5,698,762 참조. 또한, 영장류화 항체에 관해서 [Newman, R. et al., BioTechnology, 10:1455-1460, 1993], 및 단일쇄 항체에 관해서 미국 특허 4,946,778 (Ladner et al.) 및 [Bird, R. E. et al., Science, 242:423-426, 1988] 참조.
또한, 키메라, 인간화, 인간 또는 단일쇄 항체의 항원-결합 부분을 포함하는 항체의 기능성 부분이 또한 생산될 수 있다. 상기 항체들의 기능성 부분들은 이들이 유래된 전장 항체의 1가지 이상의 항원-결합 기능 및/또는 생물학적 기능을 유지한다. 바람직한 기능성 부분은 상응하는 전장 항체의 항원-결합 기능 (예를 들어, 성숙 형태의 포유류 마이오스타틴에 결합하는 능력)을 유지한다. 특히 바람직한 기능성 부분 또는 단편은 포유류 성숙 마이오스타틴의 1가지 이상의 기능 또는 생체활성 특징, 예컨대 결합 활성, 신호전달 활성 및/또는 세포 응답의 자극을 억제하는 능력을 유지한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 기능성 부분 또는 단편은 성숙 마이오스타틴과 1가지 이상의 이의 리간드와의 상호작용을 억제할 수 있고/있거나 1가지 이상의 수용체-매개 기능을 억제할 수 있다.
성숙 마이오스타틴 또는 이의 일부에 결합 (바람직하게는 성숙 마이오스타틴의 아미노산 40-64, 43-57 및/또는 45-59 내에서)할 수 있는 항체 부분 또는 단편에는 Fv, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편이 포함되지만 이에 한정되지 않고, 이들은 본 발명에 포함된다. 이같은 단편은 효소 절단에 의해 또는 재조합 기술에 의해 생산할 수 있다. 예를 들어, 파파인 또는 펩신 절단으로 각각 Fab 또는 F(ab')2 단편이 생성될 수 있다. 최소 항원-결합 단편은 HCVR 및 LCVR 도메인으로 구성된 Fv이다. Fab 단편은 불변 영역 간의 디술피드 결합으로 연결된 HCVR-CH1 및 LCVR-CL 도메인으로 구성된다. Fv 내의 비-공유결합으로 연결된 HCVR 및 LCVR 도메인의 숙주 세포 내에서 공동-발현되었을 때 해리되는 경향을 극복하기 위해, 가요성이고 적절하게 긴 폴리펩티드가 HCVR의 C-말단을 LCVR의 N-말단에 또는 LCVR의 C-말단을 HCVR의 N-말단에 연결하는 소위 단일쇄 (sc) Fv 단편 (scFv)이 구축될 수 있다. 가장 통상적으로 사용되는 링커는 잔기 15개의 (Gly4Ser)3 펩티드이지만, 또다른 링커가 또한 당업계에 공지되어 있다. 또한 1개 이상의 정지 코돈이 천연 정지 부위의 상류에 도입된 항체 유전자를 사용하여 다양한 말단절단된(truncated) 형태로 항체를 생산할 수 있다. 예를 들어, 중쇄의 힌지(hinge) 영역 및 CH1 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 포함하도록 F(ab')2 중쇄 부분을 코딩하는 키메라 유전자를 디자인할 수 있다.
파지 디스플레이 ([Matthews DJ and Wells JA. Science. 260:1113-7, 1993]), 리보솜 디스플레이 ([Hanes, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:14130-5, 1998]), 박테리아 디스플레이 ([Samuelson P., et al., Journal of Biotechnology. 96:129-54, 2002]) 또는 효모 디스플레이 ([Kieke MC, et al., Protein Engineering, 10:1303-10, 1997])와 같은 강화 기술을 사용하여 라이브러리로부터 항체 단편을 선별하는 것이 고전적인 하이브리도마 기술에 대한 성공적인 대안인 것으로 입증되었다 (최근의 리뷰: [Little M. et al., Immunology Today, 21:364-70, 2000).
변이체 항체
본 발명의 면역원성 에피토프 (성숙 마이오스타틴의 아미노산 40-64, 43-57 또는 45-59) 또는 본 발명의 면역원성 에피토프를 포함하는 단백질에 대해 생성된 뮤린 모노클로날 항체 또는 인간 항체 (예를 들어, 트랜스제닉 마우스에서 생산됨)는 어버이 항체이다. 당업계에 주지된 방법을 사용하여 키메라 또는 인간화 형태의 항체가 생성되도록 뮤린 어버이 항체가 추가로 변형될 수 있다. 이같은 키메라 또는 인간화 항체는 추가적인 변형 또는 돌연변이유발을 위한 어버이 항체로 작용할 수 있다. 본 발명의 어버이 항체는 당해 성질, 예를 들어, 결합 친화력, IC50, 특이성 등이 최적화된 변이체 항체가 생성되도록, 예를 들어, CDR 도메인(들) 내에서 추가로 돌연변이될 수 있다 (예를 들어, 도 9 참조). 아미노산 치환 변이체 항체가 바람직하고, 이는 어버이 항체 분자의 1개 이상의 아미노산 잔기가 제거되어 상이한 잔기가 대신 삽입된다. 치환 돌연변이유발에 가장 흥미로운 부위는 CDR 영역을 포함하지만, FR 변형 또한 구현된다. 보존적 아미노산 치환이 바람직하다. 이같은 치환으로 항체의 생물학적 활성이 변하게 되면, 더욱 실질적인 변화, 즉 비-보존적 아미노산 변화가 도입될 수 있고, 생성물을 스크리닝하게 된다.
치환 변이체를 생성시키는 간편한 방법은 파지 디스플레이를 이용한 친화성 성숙이다. 간략하게, 몇몇 CDR 영역 부위를 돌연변이시켜 각각의 부위에서 모든 가능한 아미노산 치환을 생성시킨다. 이렇게 생성된 항체 변이체가 각각 입자 내에 패키징된 M13의 유전자 III 생성물에 대한 융합체로서 섬유상 파지 입자로부터 1가 방식으로 디스플레이된다. 이어서, 파지-디스플레이된 변이체를 본원에 개시된 바와 같이 이의 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화력, 특이성, IC50)에 대해 스크리닝한다. 변형에 대한 후보 CDR 영역 부위를 확인하기 위해, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 사용하여 항원 결합에 현저하게 기여하는 CDR 영역 잔기를 확인할 수 있다. 별법적으로 또는 추가적으로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하여 항체와 마이오스타틴 사이의 접촉 위치를 확인하는 것이 유리할 수 있다. 이같은 접촉 잔기와 이웃 잔기는 본원에서 상술된 또는 당업계에 공지된 기술에 따른 치환에 대한 후보물이다. 별법적으로 또는 추가적으로, 무작위 돌연변이유발을 1개 이상의 CDR 서열 상에서 1개 이상의 잔기 위치에서 수행할 수 있고, 이때 CDR은 가변 영역에 작동가능하게 연결되어 있거나, 또는 CDR은 다른 가변 영역 서열과 독립적이고, 그후 변형된 CDR이 재조합 DNA 기술을 사용하여 가변 영역으로 되돌려진다. 일단 이같은 변이체 항체가 생성 및 발현되면, 변이체 패널을 본원에 기술된 바와 같이 스크리닝하고, 1가지 이상의 관련 분석법에서 탁월한 성질을 갖는 항체를 추가적인 개발용으로 선별할 수 있다.
본 발명의 항-마이오스타틴 항체의 적당한 입체형태를 유지하는데 수반되지 않은 임의의 시스테인 잔기가, 일반적으로 세린으로, 또한 치환되어 분자의 산화적 안정성이 개선되고 비정상적인 가교결합이 방지될 수 있다. 역으로, 시스테인 결합(들)이 항체에 부가되어 이의 안정성이 개선될 수 있다 (특히, 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우).
항체의 아미노산 변이체의 또다른 유형은 항체의 원래의 글리코실화 패턴을 변경시킨다. 변경은 항체에서 발견되는 1개 이상의 탄수화물 모이어티(moiety)를 결실시키는 것 및/또는 어버이 항체에 존재하지 않는 1개 이상의 글리코실화 부위를 부가하는 것을 의미한다.
항체의 글리코실화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결된다. N-연결은 탄수화물 모이어티가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 지칭한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (식중 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)은 탄수화물 모이어티를 아스파라긴 측쇄에 효소적으로 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이러한 트리펩티드 서열 중의 하나가 폴리펩티드에 존재함으로써 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. O-연결 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스 중의 하나가 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착되는 것을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시라이신 또한 사용될 수 있다.
항체에 글리코실화 부위를 부가하는 것은 항체가 상기 기술된 트리펩티드 서열 중 1개 이상을 함유하도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 달성된다 (N-연결 글리코실화 부위의 경우). 또한 변경은 원래 항체의 서열에 1개 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 부가하거나 치환시킴으로써 이루어질 수 있다 (O-연결 글리코실화 부위의 경우).
서열
바람직한 본 발명의 모노클로날 항체는 서열 5-12로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 LCVR 및/또는 서열 13-26, 55 및 56으로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 HCVR를 갖는다 (본원의 도 5-9 참조). 또한, 본 발명의 모노클로날 항체는 (i) 서열 5 및 15; (ii) 서열 5 및 16; 및 (iii) 서열 10 및 26으로 구성된 군에 제시된 서열을 갖는 2개의 폴리펩티드를 포함하는 모노클로날 항체에 의해 성숙 인간 마이오스타틴 (또는 이의 일부)에 결합하는 것이 경쟁적으로 억제되는 것이다. 항체들 간의 이같은 경쟁적 억제는 당업자에게 주지된 분석법, 예를 들어, 경쟁 ELISA 분석법에 의해 측정될 수 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체는 (i) 서열 5-12로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 LCVR 폴리펩티드 및 (ii) 서열 13-26, 55 및 56으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는HCVR 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게는, 서열 5의 아미노산 서열을 갖는 LCVR 폴리펩티드를 포함하는 항체가 서열 13-20으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 HCVR 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 서열 6의 아미노산 서열을 갖는 LCVR 폴리펩티드를 포함하는 항체가 서열 14의 아미노산 서열을 갖는 HCVR 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 서열 7의 아미노산 서열을 갖는 LCVR 폴리펩티드를 포함하는 항체가 서열 21-25 및 56으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 HCVR 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 서열 10의 아미노산 서열을 갖는 LCVR 폴리펩티드를 포함하는 항체가 서열 26 또는 55의 아미노산 서열을 갖는 HCVR 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 서열 55의 아미노산 서열을 갖는 HCVR 폴리펩티드를 포함하는 항체가 서열 8-12로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 LCVR 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
당업자는 본 발명의 항체가 본원의 도 5-9에 언급된 바와 같은 HCVR 및 LCVR의 특정 서열에 제한되지 않고, 항원 결합 능력이 유지된 이러한 서열들의 변이체를 또한 포함한다는 이해할 것이다. 이같은 변이체는 제공된 서열로부터 상기 기술된 바와 같이 당업계에 공지된 기술을 사용하여 유래될 수 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 항-마이오스타틴 항체는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 이때 중쇄 가변 영역은 CDRH1 (서열 59), CDRH2 (서열 60) 및 CDRH3 (서열 61)의 아미노산 서열을 갖는 CDR 영역을 포함하고/하거나 경쇄 가변 영역은 CDRL1 (서열 57), CDRL2 (서열 30 또는 52) 및 CDRL3 (서열 58)의 아미노산 서열을 갖는 CDR 영역을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체의 중쇄 CDR은 도 5, 6 또는 9에 제시된 바와 같고, 본 발명의 항체의 경쇄 CDR은 도 7, 8 또는 9에 제시된 바와 같으며, CDR은 도면에 정의된 CDR 위치에서 항체에 존재한다. 예를 들어, 본 발명의 한 항체는 서열 27의 CDRL1, 서열 30의 CDRL2, 서열 31의 CDRL3, 서열 36의 CDRH1, 서열 43의 CDRH2 및 서열 47의 CDRH3을 갖는다 (예컨대 도 9의 항체 IC7.1).
본 발명의 항-마이오스타틴 항체가 서열 36-42에 제시된 바와 같은 것들로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 갖는 CDRH1 영역 및/또는 서열 43-46에 제시된 바와 같은 것들로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 갖는 CDRH2 영역 및/또는 서열 47-51에 제시된 바와 같은 것들로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 갖는 CDRH3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것이 또한 구현된다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 항-마이오스타틴 항체는 서열 27-29에 제시된 바와 같은 것들로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 갖는 CDRL1 영역 및/또는 서열 30 또는 52에 제시된 바와 같은 것들로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 갖는 CDRL2 영역 및/또는 서열 31-35에 제시된 바와 같은 것들로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 갖는 CDRL3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항-마이오스타틴 항체는 서열 36-42에 제시된 바와 같은 것들로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 갖는 CDRH1 영역 및/또는 서열 43-46에 제시된 바와 같은 것들로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 갖는 CDRH2 영역 및/또는 서열 47-51에 제시된 바와 같은 것들로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 갖는 CDRH3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열 27-29에 제시된 바와 같은 것들로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 갖는 CDRL1 영역 및/또는 서열 30 또는 52에 제시된 바와 같은 것들로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 갖는 CDRL2 영역 및/또는 서열 31-35에 제시된 바와 같은 것들로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 갖는 CDRL3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 또한 포함한다.
본 발명의 CDR을 운반하는 구조물은 일반적으로 항체 중쇄 또는 경쇄 서열 또는 이의 실질적인 부분이고, 이때 CDR은 천연 발생 HCVR 및 LCVR의 CDR에 상응하는 위치에 위치한다 ([Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept of HHS, 1991]). 바람직하게는, 각각의 경쇄 및 중쇄에 대해 3개의 초가변 영역 (CDR)이, 예를 들어, 식 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4로 표시되는 인접 서열로서, 인간 프레임워크 영역 내에 제공된다. 언급된 순서로 CDR과의 인접 서열로서 배열되는 경우 완전한 프레임워크를 형성하도록 중쇄 또는 경쇄 FR1, FR2, FR3 및 FR4가 조합된다.
CDR 서열에 더하여, LCVR 및 HCVR은 프레임워크 서열을 추가로 포함한다. 인간에서의 치료적 사용을 위한 인간화 항체에서, 바람직하게는 프레임워크 서열은 전체적으로 또는 실질적으로 인간에서 유래된다 (즉, 적어도 85％, 87％, 90％, 92％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％가 인간에서 유래됨). 바람직하게는, 본 발명의 인간화, 인간 또는 키메라 항체의 경쇄 프레임워크 영역은 서열 65의 FR1, 서열 66의 FR2, 서열 67의 FR3 및 서열 68의 FR4로 구성된, 도 7에 제시된 바와 같은 O2이다. 바람직하게는 본 발명의 인간화, 인간 또는 키메라 항체의 중쇄 프레임워크 영역은 각각 도 5 및 6에 제시된 바와 같은 VH2-70 또는 VH4-39이다. VH2-70 프레임워크는 서열 69의 FR1, 서열 70의 FR2, 서열 71의 FR3, 및 서열 72의 FR4로 구성된다. VH4-39는 서열 73의 FR1, 서열 74의 FR2, 서열 75의 FR3 및 서열 76의 FR4로 구성된다. 비-인간 동물에서 사용하기 위한 항체에서, 프레임워크 영역은 인간 게놈으로부터 (바람직하게는 태아 또는 신생아일 때 비-인간 동물에서 사용됨), 또는 항체가 치료적으로 사용될 동물의 게놈으로부터 실질적으로 유래될 수 있다.
한 실시양태에서, 가변 영역 전체 또는 일부가 본원의 서열 번호에서 제시된 바와 같은 특정 서열에 한정되는 본 발명의 항-마이오스타틴 항체는 생체내 또는 시험관내에서 1가지 이상의 마이오스타틴 활성을 길항하거나 중화시키는 키메라, 인간화 또는 완전 인간 항체 또는 이의 항원-결합 부분인 것을 추가로 특징으로 한다. 바람직하게는, 가변 영역 전체 또는 일부가 본원의 서열 번호에서 제시된 바와 같은 특정 서열에 한정되는 본 발명의 항-마이오스타틴 항체는 GDF-11에 비해 GDF-8에 우선적으로 결합하는 것을 추가로 특징으로 한다. 더욱 바람직하게는, 이같은 항체는 GDF-11에 결합하는 것보다 마이오스타틴에 적어도 약 2, 3, 5, 10, 20, 22, 24, 또는 25배 더 많이 결합한다. 가장 바람직하게는, 이같은 항체는, Fab로 발현될 때, 배경 수준을 초과하여 GDF-11에 결합하지 않는다.
바람직하게는, 가변 영역 전체 또는 일부가 본원의 서열 번호에서 제시된 바와 같은 특정 서열에 한정되는 본 발명의 항-마이오스타틴 항체는 (i) 서열 53에 제시된 바와 같은 아미노산 서열로 구성된 펩티드, 바람직하게는 서열 62에 제시된 바와 같은 아미노산 서열로 구성된 펩티드에 결합하고/하거나; (ii) 시험관내 마이오스타틴/SBE 리포터 분석법에서 IC50이 약 25 nM, 20 nM, 16 nM, 10 nM, 9 nM, 6 nM, 5.7 nM 이하이고/이거나; (iii) 마이오스타틴에 대한 결합 친화력 (KD)이 약 3 × 10-8 M, 1 × 10-8 M 또는 1 × 10-9 M 미만, 바람직하게는 약 9 × 10-10 M 또는 8.7 × 10-10 M 또는 8 × 10-11 M 미만인 것을 특징으로 하거나; 별법적으로 약 3 × 10-8 M, 1 × 10-8 M, 1 × 10-9 M 또는 9 × 10-10 M 이하의 마이오스타틴에 대한 KD; 더욱 바람직하게는 약 8.7 × 10-10 M 이하의 KD; 가장 바람직하게는 약 8 × 10-11 M 이하의 KD를 특징으로 한다.
항체 발현
또한 본 발명은 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체 또는 이의 일부를 발현하는 세포주에 관한 것이다. 본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 세포주의 생성 및 단리는 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 달성할 수 있다. 바람직한 세포주로는 COS, CHO, SP2/0, NS0 및 효모가 포함된다 (ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA)와 같은 공공 기탁기관으로부터 입수가능함).
원핵생물 (박테리아) 및 진핵생물 발현 시스템 (예컨대, 효모, 배큘로바이러스, 식물, 포유류 및 기타 동물 세포, 트랜스제닉 동물, 및 하이브리도마 세포), 뿐만 아니라 파지 디스플레이 발현 시스템이 포함되는 광범위한 숙주 발현 시스템을 사용하여 본 발명의 항체를 발현시킬 수 있다. 적절한 박테리아 발현 벡터의 예는 pUC119이고, 적절한 진핵생물 발현 벡터는 약화된 DHFR 선별 시스템과 함께 사용되는 변형된 pcDNA3.1 벡터이다. 기타 항체 발현 시스템이 당업계에 또한 공지되어 있고, 본원에서 구현된다.
본 발명의 항체는 숙주 세포에서의 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 유전자의 재조합 발현에 의해 제조할 수 있다. 재조합에 의해 항체를 발현시키기 위해, 경쇄 및/또는 중쇄가 숙주 세포 내에서 발현되도록 항체의 면역글로불린 경쇄 및/또는 중쇄를 코딩하는 DNA 단편을 운반하는 1개 이상의 재조합 발현 벡터로의 형질전환, 형질도입, 감염 등이 숙주 세포에 이루어진다. 중쇄 및 경쇄는 하나의 벡터 내의 이들이 작동가능하게 연결된 상이한 프로모터들로부터 독립적으로 발현될 수 있거나, 별법적으로 중쇄 및 경쇄는 하나는 중쇄를 발현하고 또다른 하나는 경쇄를 발현하는 두 개의 벡터 내의 이들이 작동가능하게 연결된 상이한 프로모터들로부터 독립적으로 발현될 수 있다. 임의로, 중쇄 및 경쇄가 상이한 숙주 세포 내에서 발현될 수 있다. 바람직하게는, 재조합 항체는 숙주 세포가 배양된 배지 내로 분비되고, 배지로부터 항체를 회수 또는 정제할 수 있다. 표준 재조합 DNA 방법론을 사용하여, 항체 중쇄 및 경쇄 유전자를 수득하고, 이러한 유전자를 재조합 발현 벡터 내로 혼입시키고, 벡터를 숙주 세포 내로 도입한다. 이같은 표준 재조합 DNA 기술은, 예를 들어, [Sambrook, Fritsch, and Maniatis (Eds.), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989]; [Ausubel, et al (Eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1989]에 기술되어 있다.
HCVR 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 HCVR-코딩 DNA를 중쇄 불변 영역 (CH1, CH2, 및 CH3)을 코딩하는 또다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결시킴으로써 전장 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, [Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)] 참조. 이러한 영역들을 포함하는 DNA 단편을, 예를 들어, 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. [Kabat, 상기 문헌]에 기술된 바와 같이 중쇄 불변 영역은 임의의 유형 (예를 들어, IgG, IgA, IgE, IgM 또는 IgD), 클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4) 또는 서브클래스 불변 영역 및 이의 임의의 동종이형 변이체일 수 있다. 별법적으로, 항원 결합 부분은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fd, 또는 단일쇄 Fv 단편 (scFv)일 수 있다. Fab 단편 중쇄 유전자에 대해, HCVR-코딩 DNA는 오직 중쇄 CH1 불변 영역만을 코딩하는 또다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다.
LCVR 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 LCVR-코딩 DNA를 경쇄 불변 영역, CL을 코딩하는 또다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결시킴으로써 전장 경쇄 유전자 (뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)로 전환될 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, [Kabat, 상기 문헌] 참조. 이러한 영역들을 포함하는 DNA 단편을 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다.
scFv 유전자를 생성시키기 위해, LCVR 및 HCVR 영역이 가요성 링커에 의해 연결된 인접 단일쇄 단백질로서 HCVR 및 LCVR 서열이 발현될 수 있도록, HCVR- 및 LCVR-코딩 DNA 단편이 가요성 링커를 코딩하는, 예를 들어 아미노산 서열 (Gly4-Ser)3을 코딩하는 또다른 단편에 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, [Bird, et al., Science 242:423-6, 1988]; [Huston, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83, 1988]; [McCafferty, et al., Nature 348:552-4, 1990] 참조.
본 발명의 항체를 발현시키기 위해, 상기 기술된 바와 같이 수득된, 부분적 또는 전장 경쇄 및/또는 중쇄를 코딩하는 DNA를 유전자가 전사 및 번역 제어 서열에 작동가능하게 연결되도록 발현 벡터 내로 삽입한다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 혼화성이도록 선택된다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자를 별도의 벡터 내로 삽입할 수 있거나, 또는 더욱 전형적으로는 양 유전자를 동일한 발현 벡터 내로 삽입한다. 항체 유전자는 표준 방법에 의해 발현 벡터 내로 삽입된다. 추가적으로, 재조합 발현 벡터는 항-마이오스타틴 모노클로날 항체 경쇄 및/또는 중쇄가 숙주 세포로부터 분비되는 것을 용이하게 하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 항-마이오스타틴 모노클로날 항체 경쇄 및/또는 중쇄 유전자는 신호 펩티드가 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 인-프레임(in-frame)으로 작동가능하게 연결되도록 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드일 수 있다.
항체 중쇄 및/또는 경쇄 유전자(들)에 더하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서의 항체 사슬 유전자(들)의 발현을 제어하는 조절 서열을 운반한다. 용어 "조절 서열"은, 필요에 따라, 항체 사슬 유전자(들)의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 제어 요소 (예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하도록 의도된다. 조절 서열의 선택을 포함하는 발현 벡터의 디자인은 형질전환될 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준과 같은 요소에 의존할 수 있다. 포유류 숙주 세포 발현에 대한 바람직한 조절 서열에는 포유류 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소, 예컨대 사이토메갈로바이러스 (CMV), 시미안(Simian) 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)) 및 폴리오마(polyoma) 바이러스로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서가 포함된다.
항체 중쇄 및/또는 경쇄 유전자 및 조절 서열에 더하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 추가적인 서열, 예컨대 숙주 세포에서의 벡터의 복제를 조절하는 서열 (예를 들어, 복제 기원) 및 1가지 이상의 선별성 마커 유전자를 운반할 수 있다. 선별성 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선별을 용이하게 한다. 예를 들어, 전형적으로 선별성 마커 유전자는 약물, 예컨대 G418, 하이그로마이신, 또는 메토트렉세이트에 대한 저항성을 벡터가 도입된 숙주 세포에 부여한다. 바람직한 선별성 마커 유전자에는 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선별/증폭과 함께 DHFR-마이너스 숙주 세포에서 사용하기 위해), neo 유전자 (G418 선별을 위해), 및 선별/증폭을 위한 GS-음성 세포주 (예컨대 NSO)에서의 글루타민 합성 효소 (GS)가 포함된다.
경쇄 및/또는 중쇄의 발현을 위해, 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 발현 벡터(들)을 표준 기술, 예를 들어, 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염, 형질도입, 감염 등에 의해 숙주 세포 내로 도입한다. 본 발명의 항체를 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서 발현시키는 것이 이론적으로 가능하지만, 진핵생물 세포가 바람직하고, 포유동물 숙주 세포가 가장 바람직한데, 이같은 세포가 적절하게 폴딩(folding)되고 면역학적으로 활성인 항체를 조립 및 분비하는데 더 적절하기 때문이다. 본 발명의 재조합 항체의 발현에 바람직한 포유류 숙주 세포로는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO 세포) (예를 들어, [Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol. 159:601-21, 1982]에 기술된 바와 같이 DHFR 선별성 마커와 함께 사용되는 [Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20, 1980]에 기술된 DHFR-CHO 세포 포함), NS0 골수종 세포, COS 세포, 및 SP2/0 세포가 포함된다. 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유류 숙주 세포 내로 도입되면, 항체가 숙주 세포 내에서 발현되도록, 또는 더욱 바람직하게는 숙주 세포가 성장된 배양 배지 내로 항체가 분비되도록 하기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 항체가 생산된다. 항체를 숙주 세포 및/또는 배양 배지로부터 표준 정제 방법을 사용하여 회수할 수 있다.
통상적인 기술에 의해 무손상 항체의 일부 또는 단편, 예를 들어, Fab 단편 또는 scFv 분자를 생산하는데 숙주 세포를 또한 사용할 수 있다. 상기 절차의 변형이 본 발명의 범주 내에 속한다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 예를 들어, 숙주 세포를 본 발명의 항체의 경쇄 또는 중쇄 중 하나를 코딩하는 DNA로 형질전환시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한 재조합 DNA 기술을 사용하여 마이오스타틴에 결합하는 것에 필요하지 않은 경쇄 및 중쇄 중 하나 또는 모두를 코딩하는 DNA의 일부 또는 전부를 제거할 수 있다. 이같은 말단절단 DNA 분자로부터 발현된 분자 또한 본 발명의 항체에 포함된다.
본 발명의 항체의 재조합 발현을 위한 바람직한 시스템에서, 항체 중쇄 및 항체 경쇄 모두를 코딩하는 재조합 발현 벡터를 DHFR-CHO 세포 내로 예를 들어 인산칼슘-매개 형질감염에 의해 도입한다. 재조합 발현 벡터 내에서, 항체 중쇄 및 경쇄 유전자는 인핸서/프로모터 조절 요소 (예를 들어, SV40, CMV, 아데노바이러스 등으로부터 유래된 것들, 예컨대 CMV 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 요소 또는 SV40 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 요소)에 각각 작동가능하게 연결되어 유전자의 고수준의 전사가 구동된다. 재조합 발현 벡터는 메토트렉세이트 선별/증폭을 사용하여 벡터로 형질감염된 CHO 세포가 선별되도록 하는 DHFR 유전자를 또한 운반한다. 선별된 형질전환체 숙주 세포를 배양하여 항체 중쇄 및 경쇄가 발현되도록 하고, 무손상 항체를 배양 배지로부터 회수한다. 표준 분자 생물학 기술을 사용하여, 재조합 벡터를 제조하고, 숙주 세포를 형질감염시키고, 형질전환체를 선택하고, 숙주 세포를 배양하고, 항체를 배양 배지로부터 회수한다. 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은 인간 면역글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉인 동물 (예를 들어, 마우스)에서 발현될 수 있다 (예를 들어, [Taylor, et al., Nucleic Acids Res. 20:6287-95, 1992] 참조).
일단 발현되면, 무손상 항체, 이의 이량체, 개별적인 경쇄 및 중쇄, 또는 본 발명의 기타 면역글로불린 형태물을 황산암모늄 침전, 이온 교환, 친화성, 역상, 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피, 젤 전기영동 등이 포함되는 당업계의 표준 절차에 따라 정제할 수 있다. 제약 용도를 위해, 적어도 약 90 ％, 92 ％, 94 ％ 또는 96 ％ 균질성의 실질적으로 순수한 면역글로불린이 바람직하고, 98 내지 99 ％ 이상의 균질성이 가장 바람직하다. 부분적으로 또는 원하는 균질성으로 일단 정제한 후, 펩티드를 본원에 지시된 바와 같이 치료적 또는 예방적으로 사용할 수 있다.
키메라 항체
본원에서 사용된 용어 "키메라 항체"에는 1가, 2가 또는 다가 면역글로불린이 포함된다. 1가 키메라 항체는 디술피드 다리를 통해 키메라 경쇄에 회합된 키메라 중쇄에 의해 형성된 이량체이다. 2가 키메라 항체는 1개 이상의 디술피드 다리를 통해 회합된 2개의 중쇄-경쇄 이량체에 의해 형성된 사량체이다.
항체의 키메라 중쇄는 인간 또는 실질적인 인간 (또는 항원-결합 영역이 유래된 것과 상이한 종) 중쇄 불변 영역의 적어도 일부에 작동가능하게 연결된, 마이오스타틴에 특이적인 비-인간 항체의 중쇄로부터 유래된 항원-결합 영역을 포함한다. 항체의 키메라 경쇄는 인간 또는 실질적인 인간 (또는 항원-결합 영역이 유래된 것과 상이한 종) 경쇄 불변 영역 (CL)의 적어도 일부에 작동가능하게 연결된 비-인간 항체의 경쇄로부터 전체적으로 또는 실질적으로 유래된 항원 결합 영역을 포함한다. 동일한 또는 상이한 가변 영역 결합 특이성의 키메라 중쇄 및 경쇄를 갖는 항체, 단편 또는 유도체를, 공지된 방법 단계에 따라, 개별적인 폴리펩티드 사슬의 적절한 회합에 의해 또한 제조할 수 있다.
이러한 접근법으로, 키메라 중쇄를 발현하는 숙주를 키메라 경쇄를 발현하는 숙주와 별도로 배양하고, 면역글로불린 사슬들을 별도로 회수한 후, 회합시킨다. 별법적으로, 숙주를 공동-배양하고, 배양 배지 내에서 사슬들이 자발적으로 회합하도록 한 후, 조립된 면역글로불린 또는 단편을 회수할 수 있다. 키메라 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 6,284,471; 5,807,715; 4,816,567; 및 4,816,397 참조).
인간화 항체
바람직하게는, 치료적 목적을 위해 사용될 본 발명의 항체는 치료적 항체에 대한 면역 응답을 포유동물이 이끌어낼 가능성이 감소되도록 항체가 치료제로서 사용될 포유동물로부터 유래된 프레임워크 및 불변 영역의 서열 (항체 내에 존재하는 정도로)을 가질 것이다. 인간화 항체는 치료적 용도에 유용할 것으로 간주되고 설치류 항체에서 종종 관찰되는 인간 항-마우스 항체 응답이 방지되기 때문에 특히 흥미롭다. 추가적으로, 인간화 항체에서는, 이펙터 부분이 인간의 것이어서 인간 면역계의 다른 부분과 더 양호하게 상호작용할 수 있다 (예를 들어, 보체-의존적 세포독성 또는 항체-의존적 세포형 세포독성에 의해 더욱 효율적으로 표적 세포를 파괴한다). 또한, 주사된 인간화 항체는 예를 들어 뮤린 항체보다 천연 발생 인간 항체와 더욱 유사한 반감기를 가질 수 있어, 더 작고 덜 빈번한 용량이 제공되도록 한다. 본원에서 사용된 용어 "인간화 항체"는 적어도 한 부분이 인간 기원인, 상이한 기원의 항체들의 부분을 포함하는 항체를 지칭한다. 예를 들어, 인간화 항체는 통상적인 기술 (예를 들어, 합성)에 의해 화학적으로 연결된 또는 유전자 조작 기술을 사용하여 인접 폴리펩티드로서 제조된, 필수적인 특이성을 갖는 비인간 기원, 예컨대 마우스의 항체로부터 유래된 부분 및 및 인간 기원의 항체로부터 유래된 부분을 포함할 수 있다.
바람직하게는, "인간화 항체"는 비-인간 항체 (바람직하게는 마우스 모노클로날 항체)로부터 유래된 CDR을 갖고, 프레임워크 및 불변 영역 (또는 이의 상당한 또는 실질적인 부분, 즉 적어도 약 85％, 87％, 90％, 92％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％)은, 항체 내에 존재하는 정도로, 상기 항체가 인간 세포에서 생산되었는지 여부와 상관없이, 인간 생식계열 면역글로불린 영역 (예를 들어, International ImMunoGeneTics Database 참조) 또는 이의 재조합 또는 돌연변이 형태물에서 발생하는 핵산 서열 정보에 의해 코딩된다. 인간화 항체의 CDR은 원하는 성질, 예를 들어, 특이성, 친화력 및 능력이 생성되도록 이들이 유래된 비-인간 어버이 항체의 CDR로부터 최적화될 수 있다. 최적화된 CDR에는 어버이 CDR과 비교했을 때 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실이 있을 수 있다. 예를 들어, 도 9의 밑줄이 쳐지고 진하게 인쇄된 서열 57, 30, 58, 59, 60, 및 61의 아미노산 위치는 도 10 및 11에 제시된 바와 같은 어버이 CDR로부터 최적화된 위치이다. 그러나, (i) 서열 53 또는 62에 제시된 서열로 구성된 펩티드에 대해 생성된 또는 (ii) 서열 53 또는 62에 제시된 서열을 포함하는 펩티드에 대해 생성되고 서열 53 또는 62에 제시된 서열로 구성된 펩티드에 대해 반응성인 임의의 비-인간 항-마이오스타틴 항체가 당업계에서 이용가능한 표준 방법을 사용하여 인간화 또는 키메라 항체로 전환될 수 있는 어버이 항체로 작용할 수 있는 것으로 구현된다.
인간화 형태의 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체는 무손상 항체, 실질적인 무손상 항체, 항원-결합 부위를 포함하는 항체의 일부분, 또는 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2, 또는 단일쇄 Fv 단편을 포함하는 항체의 일부분을 포함한다. 바람직하게는 인간화 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유한다. 인간화 항체는 수용체 항체에서 또는 수입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 또한 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하고, 이때 CDR 영역 내의 모든 또는 실질적으로 모든 아미노산은 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고 FR 영역 내의 모든 또는 실질적으로 모든 아미노산은 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 것이다. 최적으로는 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것을 또한 포함할 것이다. [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)].
인간화 항체를 당업계에서 일상적으로 사용되는 방법을 사용하여 시험관내 돌연변이유발 (또는 인간 Ig 서열에 대해 트랜스제닉인 동물을 사용할 때는, 생체내 체세포 돌연변이유발)시킬 수 있고, 따라서, 인간화 재조합 항체의 HCVR 및 LCVR 영역의 프레임워크 영역 아미노산 서열은, 인간 생식계열 HCVR 및 LCVR 서열에 관련된 것들로부터 유래되면서, 생체내에서 인간 항체 생식계열 레파토리 내에 천연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다. 인간화 재조합 항체의 HCVR 및 LCVR 프레임워크 영역의 이같은 아미노산 서열은 인간 생식계열 서열과 적어도 85％, 87％, 90％, 92％, 94％, 95％, 96％, 98％, 가장 바람직하게는 적어도 99 ％ 동일한 것으로 생각된다. 바람직하게는, 조합-부위 구조를 유지시키거나 이에 영향을 미치는 어버이 항체 (예를 들어, 뮤린 항체 또는 일반적으로는 인간화 항체가 유래되는 항체)의 프레임워크 잔기는 유지될 것이다. 이러한 잔기는 어버이 항체 또는 Fab 단편의 X-선 결정학에 의해 항원-결합 부위의 3차원 구조를 확인함으로써 확인될 수 있다.
본 발명의 인간화 항체는 인간 생식계열 경쇄 프레임워크를 포함하거나 이로부터 유래될 수 있다. 특정 실시양태에서, 경쇄 생식계열 서열은 A1, A10, A11, A14, A17, A18, A19, A2, A20, A23, A26, A27, A3, A30, A5, A7, B2, B3, L1, L10, L11, L12, L14, L15, L16, L18, L19, L2, L20, L22, L23, L24, L25, L4/18a, L5, L6, L8, L9, O1, O11, O12, O14, O18, O2, O4, 및 O8을 포함하지만 이에 한정되지 않는 인간 VK 서열로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 이러한 경쇄 인간 생식계열 프레임워크는 V1-11, V1-13, V1-16, V1-17, V1-18, V1-19, V1-2, V1-20, V1-22, V1-3, V1-4, V1-5, V1-7, V1-9, V2-1, V2-11, V2-13, V2-14, V2-15, V2-17, V2-19, V2-6, V2-7, V2-8, V3-2, V3-3, V3-4, V4-1, V4-2, V4-3, V4-4, V4-6, V5-1, V5-2, V5-4, 및 V5-6으로부터 선택된다. 여러 생식계열 서열의 설명에 대해서 PCT WO 2005/005604 참조.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 인간화 항체는 인간 생식계열 중쇄 프레임워크를 포함하거나 이로부터 유래될 수 있다. 특정 실시양태에서, 이러한 중쇄 인간 생식계열 프레임워크는 VH1-18, VH1-2, VH1-24, VH1-3, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH1-8, VH2-26, VH2-5, VH2-70, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-7, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH3-9, VH4-28, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-4, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1, 및 VH7-81로부터 선택된다. 여러 생식계열 서열의 설명에 대해서 PCT WO 2005/005604 참조.
특정 실시양태에서, 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역은 프레임워크 영역 또는 프레임워크 영역의 적어도 일부분을 포함한다 (예를 들어, 2 또는 3개의 하위영역, 예컨대 FR2 및 FR3 함유). 특정 실시양태에서, 적어도 FRL1, FRL2, FRL3, 또는 FRL4는 완전히 인간의 것이다. 또다른 실시양태에서, 적어도 FRH1, FRH2, FRH3, 또는 FRH4는 완전히 인간의 것이다. 일부 실시양태에서, 적어도 FRL1, FRL2, FRL3, 또는 FRL4는 특정 프레임워크에 대해 인간 컨센서스 서열을 포함하거나 생식계열 서열 (예를 들어, 인간 생식계열)이다. 또다른 실시양태에서, 적어도 FRH1, FRH2, FRH3, 또는 FRH4는 특정 프레임워크에 대해 인간 컨센서스 서열을 포함하거나 생식계열 서열 (예를 들어, 인간 생식계열)이다. 바람직한 실시양태에서, 프레임워크 영역은 인간 프레임워크 영역이다.
일반적으로, 인간화 항체는 본 발명의 마이오스타틴 에피토프에 결합하는 항체, 예를 들어, 뮤린 항체 또는 하이브리도마에 의해 제조된 항체의 HCVR 및 LCVR을 코딩하는 핵산 서열을 수득하고, 상기 HCVR 및 LCVR (비인간) 내의 CDR을 확인하고, 이같은 CDR-코딩 핵산 서열을 선택된 인간-프레임워크 코딩 핵산 서열 상에 그래프트시킴으로써 생산된다. 임의로, CDR 영역을 프레임워크 영역 내로 그래프트시키기 전에 CDR 내의 1개 이상의 아미노산을 치환시키거나, 결실시키거나 부가하기 위해 특정 위치에서 또는 무작위로 돌연변이시킴으로써 CDR 영역이 최적화될 수 있다. 별법적으로, 당업자가 이용가능한 방법을 사용하여 인간 프레임워크 영역 내로의 삽입에 이어서 CDR 영역이 최적화될 수 있다. 바람직하게는, 인간 프레임워크 아미노산 서열은 생성된 항체가 인간에서의 생체내 투여에 적절할 수 있도록 선택된다. 이는, 예를 들어, 이같은 인간 프레임워크 서열을 함유하는 항체의 이전의 사용을 기초로 결정할 수 있다. 바람직하게는, 인간 프레임워크 서열은 그 자체는 유의하게 면역원성이지 않을 것이다.
별법적으로, 인간화될 항체에 대한 프레임워크의 아미노산 서열을 공지된 인간 프레임워크 서열과 비교하고, CDR-그래프트화에 사용될 인간 프레임워크 서열을 마이오스타틴에 결합하는 어버이 항체, 예를 들어, 뮤린 항체의 것과 고도로 유사한 서열을 포함하는 것을 기초로 선택할 수 있다. 수많은 인간 프레임워크 서열이 단리되었고, 이들의 서열이 당업계에 보고되었다. 이는 선택된 인간 프레임워크 (및 가능하게는 또한 인간 불변 영역) 상에 그래프트된 어버이 (예를 들어, 뮤린) 항체의 CDR 또는 어버이 항체의 최적화된 CDR을 함유하는 생성된 CDR-그래프트 인간화 항체가 항원 결합 구조를 실질적으로 유지하고 따라서 어버이 항체의 결합 친화력을 유지하는 가능성을 증강시킨다. 현저한 정도의 항원 결합 친화력을 유지하기 위해, 바람직하게는 선택된 인간 프레임워크 영역은 생체내 투여에 적절할 것으로 예상되는, 즉 면역원성이 아닌 것들인 것이다.
양쪽의 방법에서, 바람직하게는 뮤린 항-마이오스타틴 항체의 HCVR 및 LCVR 영역을 코딩하는 DNA 서열이 수득된다. 면역글로불린을 코딩하는 핵산 서열의 클로닝 방법은 당업계에 주지되어 있다. 이같은 방법은, 예를 들어, 적절한 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 면역글로불린-코딩 서열을 증폭시키는 것을 수반할 수 있다. 면역글로불린 핵산 서열, 특히 뮤린 HCVR 및 LCVR 서열의 증폭에 적절한 프라이머는 문헌에 보고되어 있다. 이같은 면역글로불린-코딩 서열을 클로닝한 후, 당업계에 주지된 방법에 의해 이를 서열분석할 수 있다.
CDR-코딩 서열을 선택된 인간 프레임워크 코딩 서열 상에 그래프트시킨 후, "인간화" 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열을 코딩하는 생성된 DNA 서열을 발현시켜 마이오스타틴에 결합하는 인간화 Fv 또는 인간화 항체를 생산한다. 인간화 HCVR 및 LCVR은 전체 항-마이오스타틴 항체 분자의 일부로서, 즉 코딩하는 DNA 서열이 시판되는 라이브러리로부터 수득된, 또는 예를 들어 상기 기술된 DNA 서열 수득 방법 중 하나를 사용하여 수득되거나 당업계에 존재하는 인간 불변 도메인 서열과의 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 그러나, 인간화 항-마이오스타틴 Fv가 생산되도록 불변 영역의 부재 하에 HCVR 및 LCVR 서열이 또한 발현될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 생성된 인간화 항-마이오스타틴 항체가 인간 이펙터 기능을 가질 수 있기 때문에, 가변 영역 상으로의 인간 불변 서열의 융합이 잠재적으로 바람직하다.
공지된 서열의 단백질을 코딩하는 DNA의 합성 방법은 당업계에 주지되어 있다. 이같은 방법을 사용하여, 대상으로 하는 인간화 HCVR 및 LCVR 서열을 코딩하는 DNA 서열을 합성한 후 (불변 영역과 함께 또는 불변 영역 없이), 이를 재조합 항체의 발현에 적절한 벡터 시스템 내에서 발현시킨다. 이는 대상으로 하는 인간화 HCVR 및 LCVR 서열이 인간 불변 도메인 서열과의 융합 단백질로서 발현되고 회합하여 기능성 (항원 결합) 항체 또는 항체 단편이 생산되는 임의의 벡터 시스템에서 실행될 수 있다.
인간 불변 도메인 서열은 당업계에 주지되어 있고, 문헌에 보고되어 있다. 바람직한 인간 불변 경쇄 서열에는 카파 및 람다 불변 경쇄 서열이 포함된다. 바람직한 인간 불변 중쇄 서열에는 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3, 인간 IgG4, 및 변형된 이펙터 기능, 예를 들어, 증강된 생체내 반감기, 저하된 Fc 수용체 결합 또는 변형된 탈아미드화 프로필을 제공하는 이의 돌연변이된 버젼이 포함된다.
존재한다면, 인간 프레임워크 영역은 항원 결합 영역 도너(donor) (즉, 어버이 항체)의 유사 또는 등가 영역과 서열 유사성을 갖는 인간 항체 가변 영역으로부터 바람직하게 유래된다. 인간화 항체의 인간 기원 부분에 대한 프레임워크 영역의 기타 공급원으로는 인간 가변 컨센서스 서열이 포함된다 (예를 들어, [Kettleborough, C. A. et al. Protein Engineering 4:773-783 (1991)]; WO94/04679 (Carter et al.) 참조). 예를 들어, 비인간 부분을 수득하기 위해 사용된 항체 또는 가변 영역의 서열을 [Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH, U. S. Government Printing Office (1991)]에 기술된 인간 서열과 비교할 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 인간화 항체 사슬의 프레임워크 영역은 비인간 도너의 가변 영역과 적어도 약 60％ 전체 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 약 70％ 전체 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 85％ 전체 서열 동일성을 갖는 인간 가변 영역으로부터 유래된다. 또한 인간 부분은 비인간 도너의 등가 부분 (예를 들어, FR)과 비교했을 때, 사용될 특정 부분 (예를 들어, FR) 내에 적어도 약 65％ 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 약 70％ 서열 동일성을 갖는 인간 항체로부터 유래될 수 있다.
사용될 수 있는 마우스 항체의 인간화에 수반되는 방법을 추가로 기술하는 참고문헌은, 예를 들어, [Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869, 1991]; 미국 특허 5,693,761; 미국 특허 4,816,397; 미국 특허 5,225,539; [Levitt, M., J. Mol. Biol. 168:595-620, 1983]에 기술된 컴퓨터 프로그램 ABMOD 및 ENCAD이다; 인간화는 Winter 및 공동작업자들의 방법을 따라 본질적으로 수행할 수 있다 ([Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)]; [Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)]).
인간 항체
인간화에 대한 별법으로서, 인간 항체가 생성될 수 있다. 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리가 포함되는 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산할 수 있다 ([Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]). Cole 등 및 Boerner 등의 기술이 인간 모노클로날 항체의 제조에 또한 이용가능하다 ([Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)] 및 [Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]). 유사하게, 인간 면역글로불린 유전자좌를 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 트랜스제닉 동물, 예를 들어, 마우스 내로 도입함으로써 인간 항체를 제조할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 면역원성 에피토프를 포함하는 항원으로의 면역화 시, 인간 항체 생산의 전체 레퍼토리가 수득되고, 이는 유전자 재배열, 조립 및 항체 레퍼토리를 포함하여 모든 점에서 인간에서 나타나는 것과 밀접하게 유사하다. 이러한 접근법은, 예를 들어, 미국 특허 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,589,369; 5,591,669; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, 및 하기의 과학 간행물에 기술되어 있다: [Marks et al., BioTechnology 10:779-783, 1992]; [Lonberg et al., Nature 368: 856-859, 1994]; [Morrison, Nature 368: 812-13, 1994]; [Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51, 1996]; [Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996)]; [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)] 및 [Jobkobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551, 1993].
인간 면역글로불린 유전자가 마우스 내로 도입되어 인간 서열을 갖는 항체로 항원에 응답할 수 있는 트랜스제닉 마우스가 생성되는 것이 [Bruggemann et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 86:6709-6713 (1989)]에 또한 기술되어 있다. 인간 항체를 생산하는 포유동물의 생성을 위해 여러 전략이 존재한다. 특히, Ig 유전자좌로부터의 조각 (개별적인 유전자)의 포함 (예를 들어, 미국 특허 5,545,807, 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, 및 5,814,318, 5,612,205, 5,721,367, 5,789,215 참조), Ig 유전자좌의 실질적으로 생식계열인 대형 단편의 YAC 도입 ([Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997)], [Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998)] 참조), 및 미세세포 융합을 통한 전체적인 또는 실질적으로 전체적인 유전자좌의 도입 (유럽 특허 출원 EP 0 843 961 A1 참조)을 통해 외인성 Ig 유전자좌가 모방되는 "미니유전자좌(minilocus)" 접근법이 있다.
인간 서열을 갖는 항체로 면역화에 응답할 수 있는 임의의 트랜스제닉 마우스를, 당업자에게 이용가능한 방법을 사용하여, 예를 들어, 이같은 마우스를 본 발명의 면역원성 에피토프를 포함하는 폴리펩티드로 면역화시켜, 본 발명의 항-마이오스타틴 항체를 생산하는데 사용할 수 있다.
용도
본 발명의 항체는 본원에 기술된 바와 같은 치료, 예방, 진단 및 연구 용도에 유용하다. 본 발명의 항체는 인간 마이오스타틴의 발현과 관련된 장애 또는 질환의 진단에 사용될 수 있다. 유사한 방식으로, 본 발명의 항체는 마이오스타틴-관련 용태에 대해 치료될 대상에서 마이오스타틴 수준을 모니터링하는 분석법에서 사용될 수 있다. 진단 분석법에는 샘플, 예를 들어, 인간 체액 또는 세포 또는 조직 추출물 내의 마이오스타틴을 검출하기 위해 표지 및 본 발명의 항체를 사용하는 방법이 포함된다. 본 발명의 항체는 변형되어 또는 변형되지 않고 사용될 수 있고, 검출가능한 모이어티의 공유 또는 비-공유 부착에 의해 표지화될 수 있다. 검출가능한 모이어티는 검출가능한 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 생산할 수 있는 임의의 것일 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 모이어티는 3H, 14C, 32P, 35S, 또는 125I와 같은 방사성동위원소, 형광 또는 화학발광 화합물, 예컨대 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민 또는 루시페린; 또는 효소, 예컨대 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 또는 양고추냉이 과산화효소일 수 있다. [Hunter, et al., Nature 144:945, 1962]; [David, et al., Biochemistry 13:1014, 1974]; [Pain, et al., J. Immunol. Meth. 40:219, 1981]; 및 [Nygren, J. Histochem. And Cytochem. 30:407, 1982]에 기술된 방법들을 포함하여, 항체를 검출가능한 모이어티에 별도로 접합시키기 위한 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다.
예를 들어, ELISA, RIA, 및 FACS를 포함하여, 마이오스타틴을 측정하기 위한 다양한 통상적인 프로토콜이 당업계에 공지되어 있고, 변경된 또는 비정상적인 마이오스타틴 발현 수준을 진단하기 위한 기초를 제공한다. 임의의 당업계에 공지된 기술을 사용하여, 예를 들어, 마이오스타틴 폴리펩티드를 포함하는 샘플을, 예를 들어, 항원:항체 복합체를 형성하기에 적절한 조건 하에 항체와 조합함으로써 정상 또는 표준 발현 값을 정한다. 항체를 검출가능한 물질로 직접적으로 또는 간접적으로 표지시켜 결합된 또는 결합되지 않은 항체의 검출을 용이하게 한다. 적절한 검출가능한 물질에는 다양한 효소, 인공 기, 형광 재료, 발광 재료 및 방사능 재료가 포함된다. 적절한 효소의 예로는 양고추냉이 과산화효소, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린스테라제가 포함되고; 적절한 인공 기 복합체의 예로는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴이 포함되고; 적절한 형광 재료의 예로는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 파이코에리트린이 포함되고; 발광 재료의 예로는 루미놀이 포함되며; 방사능 재료의 예로는 125I, 131I, 35S, 또는 3H가 포함된다. (예를 들어, [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987)] 참조).
형성된 표준 복합체의 양을 예를 들어 광도측정 수단과 같은 다양한 방법에 의해 정량한다. 그 후 대상, 대조군 및 샘플 (예를 들어, 생검 조직으로부터의 샘플)에서 발현된 마이오스타틴 폴리펩티드의 양을 표준 값과 비교한다. 표준 값과 대상 값 간의 편차로 특정 장애, 상태, 용태, 증후군 또는 질환을 마이오스타틴 폴리펩티드에 대한 특정 수준의 발현 (또는 발현 결여)과 상관시키는 파라메터를 정한다.
일단 장애, 상태, 용태, 증후군 또는 질환의 존재가 정해지고 치료 프로토콜이 개시되면, 분석법을 규칙적으로 반복하여 마이오스타틴 발현 수준을 모니터링한다. 연속적인 분석법으로부터 수득된 결과를 사용하여, 수일 내지 수개월 범위의 기간에 걸친 치료의 효능을 나타낸다. 특정 장애 (예를 들어, 무름 또는 악액질)와 관련하여, 대상으로부터의 생검 조직 또는 체액 (예를 들어, 혈청 또는 소변) 내의 마이오스타틴의 양 변화가 존재하는 것은 장애, 상태, 용태, 증후군 또는 질환의 발달에 대한 소인을 가리킬 수 있거나, 또는 실제 임상 증상이 나타나기 전에 이같은 장애, 상태, 용태, 증후군 또는 질환의 검출 수단을 제공할 수 있거나, 또는 본 발명의 항체에 대해 더욱 치료적으로 응답할 것 같은 집단을 한정지을 수 있다. 더욱 명확한 초기 검출은 더 빨리 치료되도록 할 수 있어, 마이오스타틴 발현과 관련된 질환 또는 장애, 예를 들어, 근육 또는 골 악화의 추가적인 진행을 방지하고/하거나 개선시킬 수 있다.
간편함을 위해, 본 발명의 항체는 진단 분석법을 수행하기 위한 설명서와 함께 미리 정해진 양의 시약들이 조합되어 포장된 키트 내에 제공될 수 있다. 항체가 효소로 표지된 경우, 키트는 효소에 필요한 기질 및 보조인자 (예를 들어, 검출가능한 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체)를 포함할 것이다. 또한, 안정화제, 완충제 (예를 들어, 차단 완충제 또는 용해 완충제) 등과 같은 기타 첨가물이 포함될 수 있다. 다양한 시약의 상대적인 양은 분석법의 감도를 실질적으로 최적화시키는 시약들의 용액 내 농도를 제공하도록 광범위하게 변할 수 있다. 특히, 시약은 부형제를 포함하는 건조 분말 (일반적으로 동결건조됨)로서 제공될 수 있고, 이는 용해 시 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공할 것이다.
항체에 대한 치료적 용도
마이오스타틴은 근육 발달, 및 다수의 관련 장애 또는 질환에서 기능을 나타낸다. 성체에서, 마이오스타틴 mRNA는 골격근에서 주로 검출되지만, 더 낮은 농도로 지방 조직 및 심장 조직에서 또한 발견된다 ([Sharma, M., et al., J. Cell Physiol. 180:1, 1999]). 마이오스타틴 녹아웃 마우스는 야생형 한배새끼에 비해 2배 내지 3배 더 큰 근육 질량을 갖는다. 증가된 근육 질량은 섬유 비대증 및 증식증의 결과이다 ([McPherron, A., et al. Nature 387:83-90, 1997] 및 [Zhu, X. et al., FEBS Letters 474:71]). 또한, 마이오스타틴 녹아웃 마우스는 야생형 한배새끼보다 지방을 덜 축적하지만, 다른 점에서는 정상이고 건강하게 나타난다. 또한 마이오스타틴은 지방생성의 중요한 조절인자인 것으로 최근 나타났다 ([Rebbapragada, A., et al., Mol. and Cell. Bio. 23:7230-7242, 2003]). 추가적으로, 마이오스타틴 결핍 마우스에서 골 구조 및 함량이 최근 연구되었다 ([Hamrick M. W., et al., J. Orthopaedic Research 21:1025, 2003]; [Hamrick, M. W., et al., Calcif Tissue Int 71:63, 2002]).
따라서, 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체를 포함하는 제약 조성물은 포유동물, 바람직하게는 인간에서 근육 질량 증가, 골 밀도 증가, 근육 소모 감소에 사용될 수 있거나, 또는 근육 소모, 근육 손상, 수술, 손상된 근육의 복원, 무름, 연령-관련 근육감소증, 무용성 위축, 골다공증, 골관절염, 인대 성장 및 복원, 비만, 체지방 축적의 억제, 비만, 임의 유형의 근육 퇴행위축, 중환자 근육병증, 알콜성 근육병증, 악액질 (예를 들어, 암에 관련되거나 HIV에 의해 유도되거나, 또는 COPD, 만성 폐 질환, 패혈증으로부터의 회복, 신장 부전, 간 부전, 심장 부전 또는 질환으로부터 초래됨), 대사 증후군, 화상후 근육 소모, 및 제II형 당뇨병이 포함되지만 이에 한정되지 않는, 마이오스타틴의 존재가 바람직하지 않은 병리학적 효과를 야기하거나 이에 기여하거나 또는 마이오스타틴 수준의 감소가 치료적 이점을 갖는 용태의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다. 무용성 위축은 실질 기관 이식, 관절 교체, 뇌졸중, 척수 손상, 중증 화상으로부터의 회복, 좌식 만성 혈액투석, 패혈증후 회복 및 극미중력에의 노출이 포함되지만 이에 한정되지 않는, 장기간의 부동 또는 불용 또는 침상 안정에 이르는 임의의 장애 또는 질환 또는 상태를 포함하는 수많은 원인 또는 사건으로부터 초래될 수 있다. 마이오스타틴은 종에 걸쳐 서열 및 기능이 고도로 보존되기 때문에, 본 발명의 항체는 비-인간 포유동물 또는 조류 종 [예를 들어, 가축 동물 (예를 들어, 개 및 고양이), 운동 동물 (예를 들어, 말), 식품-공급원 동물 (예를 들어, 소, 돼지 및 양), 조류 종 (예를 들어, 닭, 칠면조, 기타 사냥새 또는 가금류)]에서 근육 질량을 증가시키거나, 골 밀도를 증가시키거나, 마이오스타틴의 존재가 바람직하지 않은 병리학적 효과를 야기하거나 이에 기여하거나 또는 마이오스타틴 수준의 감소가 치료적 이점을 갖는 용태를 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다.
마이오스타틴 활성이 해롭거나 생체활성 마이오스타틴의 감소된 수준이 이로운 상기 언급된 장애들 중 1가지 이상의 치료 또는 예방을 위한 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체의 용도가 본원에서 구현된다. 추가적으로, 상기 언급된 장애들 중 1가지 이상의 치료를 위한 약제의 제조에서 사용하기 위한 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체의 용도가 구현된다.
본원에서 사용된 용어 "치료"는 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 수득하는 것을 지칭한다. 효과는 질환 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 방지하는 관점에서 예방적일 수 있고/있거나 질환 및/또는 질환에 기인하는 역효과에 대한 부분적인 또는 완전한 치료의 관점에서 치료적일 수 있다. 본원에서 사용된 "치료"는 포유동물, 특히 인간에서 질환 또는 용태의 치료를 위해 본 발명의 화합물을 투여하는 것을 포함하고, (a) 질환에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직은 질환에 걸린 것으로 진단되지 않은 대상에서 질환이 발생하는 것을 방지하는 것; (b) 질환을 억제하는 것, 즉 이의 발달을 정지시키는 것; 및 (c) 질환을 경감시키는 것, 즉 질환 또는 장애의 퇴행을 야기하거나 이의 증상 또는 합병증을 완화시키는 것을 포함한다. 투여량 계획은 최적의 원하는 응답 (예를 들어, 치료적 또는 예방적 응답)을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 여러 분할된 용량이 경시적으로 투여될 수 있거나, 또는 치료적 상황의 요건에 의해 지시되는 대로 용량이 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다.
제약 조성물
본 발명의 항체는 대상에게의 투여에 적절한 제약 조성물 내로 혼입될 수 있다. 본 발명의 화합물은 단독으로 또는 제약상 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제와 조합되어, 단일 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다. 투여용 제약 조성물은 선택된 투여 방식에 적절하도록 디자인되고, 제약상 허용가능한 희석제, 담체 및/또는 부형제 예컨대 분산제, 완충제, 계면활성제, 방부제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등이 적절하게 사용된다. 상기 조성물은, 예를 들어, 진료의에게 일반적으로 공지된 제형 기술의 개요를 제공하는 [Remington, The Science and Practiceof Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995]에서와 같은 통상적인 기술에 따라 고안된다.
본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체를 포함하는 제약 조성물을 경구, 정맥내, 복강내, 피하, 폐, 경피, 근육내, 비강내, 구강, 설하, 또는 좌약 투여가 포함되는 표준 투여 기술을 사용하여 본원에 기술된 바와 같은 병리학의 위험이 있거나 이러한 병리학을 나타내는 대상에게 투여할 수 있다.
바람직하게는 본 발명의 제약 조성물은 "치료적 유효량" 또는 "예방적 유효량"의 본 발명의 항체이다. "치료적 유효량"은 필요한 투여량에서 및 기간 동안 원하는 치료적 결과를 달성하기에 효과적인 양을 지칭한다. 항체의 치료적 유효량은 질환 상태, 개체의 연령, 성별 및 체중, 및 개체에게서 원하는 응답을 이끌어내는 항체 또는 항체 일부분의 능력과 같은 인자에 따라 다를 수 있다. 또한 치료적 유효량은 또한 치료적으로 이로운 효과가 항체의 임의의 독성 또는 불리한 효과를 능가하는 것이다. "예방적 유효량"은 필요한 투여량에서 및 시간 동안 원하는 예방적 결과를 달성하기에 효과적인 양을 지칭한다. 전형적으로, 예방적 용량은 질환 전에 또는 질환의 초기 단계에 대상에서 사용되기 때문에, 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 적을 것이다.
치료적 유효량 또는 예방적 유효량은 대상에게 치료적 이점을 부여하기 위해 필요한 활성 작용제의 적어도 최소의 용량이지만 독성 용량보다 적다. 다시 말하면, 본 발명의 항체의 치료적 유효량은 포유동물, 바람직하게는 인간에서 근육 질량을 증가시키거나, 골 밀도를 증가시키거나, 또는 근육 소모, 근육 손상, 수술, 무름, 연령-관련 근육감소증, 무용성 위축, 골다공증, 골관절염, 인대 성장 및 복원, 비만, 체지방 축적의 억제, 임의 유형의 근육 퇴행위축, 중환자 근육병증, 악액질 (예를 들어, 암에 관련되거나 HIV에 의해 유도되거나, 또는 COPD, 신장 부전, 간 부전, 심장 부전 또는 질환으로부터 초래됨), 대사 증후군 및 제II형 당뇨병이 포함되지만 이에 한정되지 않는, 마이오스타틴의 존재가 바람직하지 않은 병리학적 효과를 야기하거나 이에 기여하거나 또는 마이오스타틴 수준의 감소가 포유동물, 바람직하게는 인간에서 이로운 치료적 효과를 초래하는 용태를 치료하는 양이다. 무용성 위축은 실질 기관 이식, 관절 교체, 뇌졸중, 척수 손상, 중증 화상으로부터의 회복, 좌식 만성 혈액투석, 패혈증후 회복 및 극미중력에의 노출이 포함되지만 이에 한정되지 않는, 장기간의 부동 또는 불용 또는 침상 안정에 이르는 임의의 장애 또는 질환 또는 상태를 포함하는 수많은 원인 또는 사건으로부터 초래될 수 있다.
본 발명의 항체의 투여 경로는 경구 투여, 비경구 투여, 흡입, 또는 국소 투여일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 비경구 투여에 적절한 제약 조성물 내로 혼입될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 비경구에는 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질, 또는 복강내 투여가 포함된다. 정맥내 또는 복강내 또는 피하 주사에 의한 말초 전신 전달이 바람직하다. 이같은 주사를 위한 적절한 비히클은 당업계에서 간단하다.
전형적으로 제약 조성물은 제작 및 보관 조건 하에 예를 들어 밀봉 바이알 또는 주사기가 포함되는 제공된 용기 내에서 무균성 및 안정적이어야 한다. 따라서, 제약 조성물은 제형의 제조 후에 무균 여과될 수 있거나, 또는 다르게는 미생물학적으로 허용가능하게 제조될 수 있다. 전형적인 정맥내 주입용 조성물은 무균 링거액, 생리식염수, 덱스트로스 용액 및 행크 용액(Hank's solution)과 같은 유체 250-1000 ㎖의 부피 및 치료적 유효 용량 (예를 들어, 1 내지 100 ㎎/㎖ 이상)의 항체 농도를 가질 수 있다. 용량은 질환의 유형 및 중증도에 따라 다를 수 있다. 의학 업계에 주지된 바와 같이, 임의의 한 대상에 대한 투여량은 환자의 사이즈, 신체 표면적, 연령, 투여될 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반적인 건강, 및 함께 투여되는 기타 약물이 포함되는 많은 인자에 따라 좌우된다. 전형적인 용량은, 예를 들어, 0.001 내지 1000 ㎍ 범위일 수 있다; 그러나, 특히 상기 언급된 인자들을 고려하여, 이러한 예시적인 범위보다 낮은 또는 높은 용량이 구현된다. 일일 비경구 투여량 계획은 전체 체중 1 ㎏ 당 약 0.1 ㎍ 내지 약 100 mg, 바람직하게는 약 0.3 ㎍/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏, 더욱 바람직하게는 약 1 ㎍/㎏ 내지 1 ㎎/㎏, 더욱 더 바람직하게는 약 0.5 내지 10 ㎎/㎏/일일 수 있다. 주기적인 평가에 의해 진행을 모니터링할 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여를 위해, 용태에 따라, 질환 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 치료를 반복할 수 있다. 그러나, 또다른 투여량 계획이 유용할 수 있고, 본 발명에서 배제되지 않는다. 원하는 투여량은 진료의가 달성하기 바라는 약동학적 붕괴 패턴에 따라 단일 볼루스(bolus) 투여, 다중 볼루스 투여, 또는 항체의 연속 주입 투여에 의해 전달될 수 있다.
항체의 이러한 제안된 양은 많은 치료적 판단에 영향을 받기 쉽다. 적절한 용량 및 스케쥴의 선택에서의 주요 인자는 수득된 결과이다. 이러한 상황에서 고려할 요소에는 치료될 특정 장애, 치료될 특정 포유동물, 개별적인 환자의 임상 용태, 장애의 원인, 항체의 전달 부위, 항체의 특정 유형, 투여 방법, 투여 스케쥴, 및 진료의에게 공지된 기타 요소가 포함된다.
본 발명의 치료제는 보관을 위해 동결 또는 동결건조되어, 사용 전에 적절한 무균 담체 내에서 재구축될 수 있다. 동결건조 및 재구축으로 항체 활성이 여러 정도로 손실될 수 있다. 보상되도록 투여량이 조절되어야 할 수 있다. 일반적으로, 6 내지 8 사이의 pH가 바람직하다.
제조품
본 발명의 또다른 실시양태에서, 상기 기술된 장애 또는 용태의 치료 또는 예방에 유용한 물질들을 함유하는 제조품이 제공된다. 제조품은 컨테이너 및 표지를 포함한다. 적절한 컨테이너에는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, 및 시험관이 포함된다. 컨테이너는 다양한 재료 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 컨테이너는 장애 또는 용태를 예방 또는 치료하는데 효과적인 본 발명의 조성물을 보유하고, 멸균 접근 포트(port)를 가질 수 있다 (예를 들어, 컨테이너는 피하주사 바늘이 관통가능한 마개가 있는 바이알 또는 정맥내 용액 백일 수 있다). 조성물 내의 활성 작용제는 본 발명의 항-마이오스타틴 항체이다. 컨테이너 상의 또는 컨테이너와 결합된 표지는 조성물이 선택된 용태의 치료에 사용된다는 것을 가리킨다. 제조품은 제약상 허용가능한 완충제, 예컨대 포스페이트-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 컨테이너를 추가로 포함할 수 있다. 기타 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 사용 설명서가 있는 포장 삽입물을 포함하여, 상업용 및 사용자의 관점에서 바람직한 기타 물질을 추가로 포함할 수 있다.
하기의 예들은 예시적 목적을 위해서만 제공되고, 본 발명의 범주를 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1: ELISA 분석법
A. 항- 마이오스타틴 Fab 가 GDF -11에 비해 마이오스타틴에 우선적으로 결합한다.
본 발명의 항-마이오스타틴 Fab (또는 전장 mAb)를 Fab가 96웰 플레이트 상에서 다양한 농도로 코팅된 성숙 마이오스타틴 (이량체 형태)에 결합하는 것을 측정하는 ELISA 분석법에서 테스트하였다. Fab가 GDF-11에 결합하는 것을 또한 테스트하였다.
2개의 96웰 플레이트의 각 웰을 200 ng/웰의 재조합 마우스 마이오스타틴 (R&D systems, 카탈로그# 788-G8/CF, 캐리어 없음, 카르보네이트 완충제 (pH 9.6) 내) 또는 200 ng/웰의 재조합 인간 GDF-11 (Peprotech, Inc., 카탈로그# 120-11, 캐리어 없음, 카르보네이트 완충제 (pH 9.6) 내)로 코팅하였다. 플레이트를 4 ℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 웰을 흡인하고, 세정 완충제 (20 mM 트리스 (히드록시메틸) 아미노메탄 (pH 7.4), 0.15 M NaCl, 0.1 ％ Tween-20)으로 2회 세정하였다. 플레이트를 웰 당 200 ㎕의 차단 완충제 (상기 세정 완충제 내의 5 ％ 카네이션 인스턴트 밀크(Carnation Instant milk))로 5 시간 동안 차단시켰다.
테스트할 Fab 또는 mab를 차단 완충제 내로 다양한 농도로, 예를 들어, 10 ㎍/㎖, 2 ㎍/㎖, 0.4 ㎍/㎖, 0.08 ㎍/㎖, 및 0.016 ㎍/㎖로 희석하였다. 50 ㎕의 각각의 Fab 용액을 GDF-8 및 GDF-11로 코팅된 웰에 이중으로 첨가하였다. 플레이트를 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이어서 웰을 세정 완충제로 3회 세정하였다. AP-접합 2차 항체 (50 ㎕ 염소 항-마우스 카파 AP (Southern Biotech), 차단 완충제에서 1:1000으로 희석됨)를 각 웰에 첨가하고, 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이어서 웰을 세정 완충제로 3회 세정하였다. 50 ㎕의 발색성 기질 (즉, AP 기질)을 각 웰에 첨가하고, 실온에서 발색시켰다. 웰의 흡광도를 560 nm의 OD에서 판독하였다. 이중 웰로부터의 평균 흡광도를 결정하였다.
모든 본 발명의 항체는 플레이트에 결합된 인간 성숙 마이오스타틴에 결합하고, GDF-11 결합에 비교했을 때 마이오스타틴에 우선적으로 결합하는 것으로 구현되었다. GDF-8 다운 ELISA에서, Fab C12의 IC50은 0.25 ㎍/㎖이고, Fab 510C2의 IC50은 0.27 ㎍/㎖였다.
B. 인간화-최적화 항- 마이오스타틴 항체가 마이오스타틴 펩티드에 결합한다
ELISA 분석법에서, 본 발명의 항체가 아미노부티르산이 시스테인 잔기 대신 위치 47에 있는 것을 제외하고는 성숙 인간 마이오스타틴의 아미노산 40-64 (서열 53)에 스패닝된 서열을 갖는, 정제되고 비오틴화된 펩티드에 결합하였다. 본 발명의 항체는 서열 62에 제시된 서열을 갖는 펩티드 (성숙 마이오스타틴의 위치 47에 시스테인 또는 세린), 뿐만 아니라 단량체 및 이량체 형태의 성숙 형태의 마이오스타틴에 또한 결합하였다.
대표적인 ELISA 분석법에서, 50 mM 중탄산나트륨 완충제 (pH 8.0) 내의 염소 항-인간 카파 항체 (UNLB, Southern Biotech 2060-01)의 1 ㎍/㎖ 용액 50 ㎕를 사용하여 고도-결합 미량역가 플레이트 (Greiner EK 20061)의 각 웰을 코팅하였다. 웰을 흡인하고, PBST (PBS, 0.1％ Tween)로 세정한 후, 1시간 동안 PBST-BSA (PBS, 1％ BSA, 0.1％ Tween)으로 차단하였다. 그후, 웰을 다시 PBST로 세정하였다. 분 석법의 모든 단계를 실온에서 수행하였다. 50 ng/웰에서 시작하여 PBST-BSA에 희석된 인간화-최적화 항-마이오스타틴 항체 (293 세포에서 일시적으로 발현된, IgG4 Fc 영역을 포함하는 전장 항체)의 적정물을 웰에 첨가하고, 플레이트를 1시간 동안 추가로 인큐베이션하고, 상기와 같이 세정하고, 50 nM 농도 (PBST-BSA에 희석됨)의 상기 기술된 비오틴화 펩티드 50 ㎕로 프로빙(probing)하였다. 그후, 50 ㎕의 2 ㎍/㎖ NeutrAvidin-AP (PBST- BSA 내의 1:1000, Pierce 31002)를 첨가하고, 제조업자의 설명서 (Pierce 31002)에 따라 AP 기질을 첨가함으로써 검출을 달성하였다. 단독 완충제를 대조군으로 사용하였다. 흡광도를 560 nm에서 판독하였다. 510C2 및 C12 Fab가 각각 6.73 및 5.42 ng/웰의 IC50 값으로 펩티드에 결합하였다.
본 발명의 항체는 성숙 마이오스타틴의 아미노산 40-64 (서열 53)로 구성된 펩티드 및/또는 성숙 마이오스타틴의 아미노산 43-57 (서열 62) (위치 47에 시스테인 또는 세린 아미노산)로 구성된 펩티드에 결합할 수 있었다. 그러나, 본 발명의 항체는 성숙 마이오스타틴의 아미노산 60-73, 74-86, 87-97, 96-108, 16-29, 1-15 또는 30-42로 구성된 펩티드에 결합할 수 없었다 (배경보다 유의하게 더 큰 수준으로). 뮤린 IgG1 Fc 영역에 작동가능하게 부착된 뮤린 가변 영역 (도 10 및 11 참조)을 포함하는, Mab-3로 명명된 뮤린 항체 (본원에 포함된 미국 특허 출원 60/559,621 및 60/555,456 참조)는 성숙 마이오스타틴의 아미노산 60-73, 74-86, 87-97, 96-108, 16-29, 1-15 또는 30-42로 구성된 펩티드에 결합하지 않았고, 본 발명의 항체에 대한 어버이 항체였다.
인간화 항체 510C2 및 C12는 성숙 마이오스타틴의 아미노산 43-57 및 45-59 (하기 표 1에 제시된 바와 같음)로 구성된 펩티드에 유사한 정도로 결합하였다. 이는 본 발명의 에피토프가 성숙 마이오스타틴의 아미노산 45-57에 스패닝된 펩티드 내에 더욱 명확하게 국소화되었음을 나타낸다. 성숙 마이오스타틴의 아미노산 47-61로 구성된 펩티드에 결합하는 것에 대해 항체를 테스트했을 때 결합이 약간 감소하였고, 이는 결합에 대한 또는 결합을 허용하는 펩티드의 입체형태를 보존하는 것에 대한 성숙 마이오스타틴의 아미노산 45-46의 중요성을 나타낸다. 성숙 마이오스타틴의 아미노산 49-63으로 구성된 펩티드에 결합하는 것에 대해 항체를 테스트했을 때 결합이 추가로 감소하였고, 이는 결합에 대한 또는 결합을 허용하는 펩티드의 입체형태를 보존하는 것에 대한 성숙 마이오스타틴의 아미노산 47-48의 중요성을 나타낸다. 성숙 마이오스타틴의 아미노산 39-53으로 구성된 펩티드에 결합하는 것에 대해 항체를 테스트했을 때 결합이 배경 수준으로 감소하였고, 이는 잔기 54-57로부터의 영역의 중요성을 시사한다.
Figure 112008024679549-pct00001
C. 마이오스타틴 인간화-최적화 Mab ELISA 분석법
인간화 항-인간 마이오스타틴 전장 모노클로날 항체 510C2 및 C12를 플레이트 상에 코팅된 GDF-8 항원에 대한 항체의 결합이 측정되는 ELISA 분석법에서 테스트하였다. GDF-11에 대한 Mab의 교차반응성을 또한 테스트하였다. Mab가 없는 조건, 이소타입 대조군 항체, 및 관련이 없는 단백질 (HGF)을 음성 대조군으로 사용하였다.
96웰 플레이트의 각 웰을 70 ㎕의 인간 GDF-8 (캐리어 없음, 카르보네이트 완충제 (pH 9.6) 내 1 ㎍/㎖), 재조합 인간 GDF-11 (Peprotech, Inc., 카탈로그# 120-11, 캐리어 없음, 카르보네이트 완충제 (pH 9.6) 내 1 ㎍/㎖), 또는 재조합 인간 HGF (R&D Systems, 카탈로그# 294-HG/CF, 캐리어 없음, 카르보네이트 완충제 (pH 9.6) 내 1 ㎍/㎖)로 코팅하였다. 플레이트를 4 ℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 웰을 흡인하고, 세정 완충제 (20 mM 트리스 (히드록시메틸) 아미노메탄 (pH 7.4), 0.15 M NaCl, 0.1 ％ Tween-20)으로 2회 세정하였다. 플레이트를 웰 당 200 ㎕의 차단 완충제 (상기 세정 완충제 내의 5 ％ 카네이션 인스턴트 밀크(Carnation Instant milk))로 4 시간 동안 차단시켰다. 플레이트를 세정 완충제로 2회 세정하였다.
Mab를 차단 완충제 내로 1 ㎍/㎖, 0.2 ㎍/㎖, 0.04 ug/㎖, 0.008 ug/㎖, 0.0016 ㎍/㎖, 및 0.00032 ㎍/㎖로 희석하였다. 차단 완충제 단독으로 구성된, Mab가 없는 대조군을 사용하였다. 또한 이소타입 대조군 항체를 1 ㎍/㎖로 음성 대조군으로 사용하였다. 그후, 50 ㎕의 각각의 Mab 용액을 GDF-8 및 GDF-11로 코팅된 웰에 이중으로 첨가하였다. 플레이트를 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이어서 웰을 세정 완충제로 3회 세정하였다.
그후, 차단 완충액에서 1:2000 희석된, 과산화효소가 접합된 2차 항체 (염소 항-인간 IgG HRP, Fc 감마 단편 특이적, Jackson ImmunoResearch, 카탈로그# 109-035-008) 50 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이어서 웰을 세정 완충액으로 3회 세정하였다. 50 ㎕의 발색성 기질 (즉, OPD 기질)을 각 웰에 첨가하고, 실온에서 2.5분 동안 발색시켰다. 100 ㎕ 1N HCl을 각 웰에 첨가하여 반응을 정지시켰다. 웰의 흡광도를 490 nm에서 판독하였다. 이중 웰로부터의 평균 흡광도를 결정하였고, 이러한 값들이 하기 표 2에 열거된다.
이러한 데이타는 Mab 510C2 및 C12가 플레이트에 결합된 마이오스타틴에 결합하였음을 나타낸다. 특이성과 관련하여, 이러한 Mab들은 GDF-11에 비해 GDF-8에 우선적으로 결합하였다. Mab 510C2는 GDF-11에 비해 마이오스타틴 (GDF-8)에 대해 약 25배 더 많은 결합을 나타냈다. Mab C12는 GDF-11에 비해 마이오스타틴 대해 약 5배 더 많은 결합을 나타냈다.
Figure 112008024679549-pct00002
또한, 전장 mab C12는 ELISA 분석법에서 기타 TGF-β 상과 단백질 구성원인 BMP-2, BMP-3, BMP-3b/GDF-10, BMP-4, BMP-7, BMP-8B, 액티빈 A, 액티빈 B, TGF-α, TGF-β1, TGF-β2 및 GDF-3에 결합하지 않는 것으로 나타났다; BMP-5에 대해서는 최소한의 결합을 나타냈다. 또다른 본 발명의 항-마이오스타틴 항체가 유사하게 이러한 기타 TGF-β 상과 구성원에 결합하지 않거나 최소한으로 결합하는 것으로 구현된다.
실시예 3 마이오스타틴 중화 분석법
외배엽 외식편을 표준 절차에 의해 단계 8-9 포배 제노푸스 배아로부터 제거하고, 0.5× MBS (1× MBS: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0.7 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 5 mM HEPES, 2.5 mM NaHCO3, 1:1000 v/v 젠타마이신, 0.1 ％ 소 혈청 알부민)에서 성장 인자 (GDF8 또는 GDF11) 플러스 또는 지정물을 첨가하여 18 시간 동안 18 ℃에서 배양하였고, 이 시간 동안 대조군 배아는 초기 신경배 단계 (단계 15-16)에 도달한다. 외식편을 사진찍고, 각 외식편의 길이를 동물 캡(cap) 정량을 위해 고안된 영상 분석 알고리즘을 사용하여 측정하였다. 성장 인자 또는 Fab으로 처리되지 않은 외식편 (대조군)은 표피 구로 성장하였다. 마이오스타틴 및 GDF-11은 이러한 외배엽 외식편에서 중배엽을 유도하였고, 이는 외식편이 신장하여 아령형 구조를 형성하도록 하였다. 중화 활성에 대해 테스트할 때, 항체 또는 Fab를 전체 배양 기간 동안 마이오스타틴을 함유하는 배양 배지에 첨가하였고, 성장 인자에 의해 유도된 신장 운동을 억제하는 능력을 평가하였다. 마이오스타틴을 외식편에 25 ng/㎖로 첨가하였다. 테스트될 항체 또는 Fab를 20 ㎍/㎖로 첨가하였다. 관련이 없는 항원에 대해 생성된 Fab를 대조군으로 사용하였다. 시판되는 모노클로날 항-마우스 GDF8 항체를 대조군으로 테스트할 수 있고, 이러한 항체는 정제된 마우스 GDF8로 면역화된 염소에서 생산되었고, 약 10-20 ㎍/㎖로 존재할 때 25 ng/㎖의 뮤린 GDF8에 의해 도출된 제노푸스 동물 캡의 신장을 중화시키는 것으로 제조업자에 의해 증명되었다 (R&D Systems 카탈로그# MAB788).
ImagePro (v4.5.1.22, Media Cybernetics)를 영상 프로세싱에 사용하였다. 마크로를 기록하여 영상 프로세싱을 자동화하였다. 마크로는 영상을 프로세싱하여 길이를 비트의 단위로 기록하였다. 별법적인 측정 방법을 당업계에 공지된 바와 같이 사용할 수 있었다. 본 발명의 항체는 동물 캡 분석법에서 GDF8 활성을 중화시키는 것으로 구현되었고, GDF-11 중화 활성은 없었다.
실시예 4: Fab 의 친화력 측정
본 발명의 항-마이오스타틴 Fab의 친화력 (KD) 및 kon 및 koff 속도를 CM4 센서 칩을 함유하는 BIAcore？ 2000 기구를 사용하여 측정하였다. BIAcore？는 표면 플라즈몬 공명의 광학 성질을 이용하여 덱스트란 바이오센서 매트릭스 내의 상호작용 분자들의 단백질 농도에서의 변화를 검출한다. 달리 언급되지 않는 한, 모든 시약 및 재료는 BIAcore？ AB (Upsala, Sweden)에서 구입하였다. 모든 측정은 25 ℃에서 수행하였다. Fab를 함유하는 샘플을 HBS-EP 완충제 (150 mM 염화나트륨, 3 mM EDTA, 0.05 ％ (w/v) 계면활성제 P-20, 및 10 mM HEPES, pH 7.4)에 용해시켰다. 마이오스타틴 또는 GDF-11 (R&D Systems)를 아민-커플링 화학을 사용하여 CM4 칩의 유동 세포 상에 고정시켰다. 유동 세포 (1-4)를 0.1 M N-히드록시숙신이미드와 0.1 M 3-(N,N-디메틸아미노)프로필-N-에틸카르보디이미드의 1:1 혼합물로 20 ㎕/분의 유속에서 활성화시켰다. 마이오스타틴 또는 GDF-11 (10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.5) 내의 2.5 ㎍/㎖)를 10 ㎕/분의 유속으로 개별적인 유동 세포에 수동으로 주사하였다. 각각의 유동 세포가 ~150 응답 단위 (RU)의 표면 밀도에 도달할 때까지 표면 밀도를 모니터링하였다. 1 M 에탄올아민-HCl (pH 8.5)의 50 ㎕ 주사 (10 ㎕/분)로 표면을 차단시켰다. 모든 비공유 결합된 마이오스타틴 또는 GDF-11의 완전한 제거를 확실히 하기 위해. 15 ㎕의 10 mM 글리신 (pH 1.5)를 2회 주사하였다. 동력학 실험에 사용된 러닝(running) 완충제는 10 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.005 ％ P20을 함유하였다.
동력학 결합 데이타의 수집은 최대 유속 (100 ㎕/분)에서 수행하였다. 각각의 분석 사이클은 하기로 구성되었다: (i) 유동 세포 1을 기준 유동 세포로 하여 모든 4종의 유동 세포에 대해 Fab (2배 희석 증가분의 50 nM 내지 0.4 nM의 농도 범위)를 250 ㎕ 주사함, (ii) 20 분 동안 해리시킴 (완충제 유동), (iii) 10 mM 글리신 (pH 1.5)를 2회 15 ㎕ 주사하여 GDF-8 또는 GDF-11 표면을 재생시킴, (iv) 러닝 완충제를 15 ㎕ 블랭크(blank) 주사함, 및 (v) 다음 사이클을 시작하기 전에 2 분 동안 안정화시킴. 유동 세포 2 빼기 유동 세포 1, 유동 세포 3 빼기 유동 세포 1 및 유동 세포 4 빼기 유동 세포 1로 신호를 모니터닝하였다. 샘플 및 완충제 블랭크를 무작위 순서로 이중으로 주사하였다. 데이타를 SCRUBBER (Center for Biomolecular Interaction Analysis, Univ. of Utah) 소프트웨어를 사용하여 프로세싱하였다. ClampXP (Center for Biomolecular Interaction Analysis, Univ. of Utah)를 사용하여 단순 회합 모델에 바이오센서 데이타를 핏팅시킴으로써 각각의 사이클에 대한 회합 및 해리 속도를 결정하여, kon 및 koff 속도 상수를 구하였다; 평형 결합 상수 Kd를 관계식 Kd = koff/kon을 사용하여 계산하였다. 510C2 Fab에 대한 마이오스타틴 결합에 대해 측정된 친화력 데이타는 하기와 같았다: 5.4 × 105 M-1s-1의 kon, 4.67 × 10-4 sec-1의 koff, 및 0.87 nM의 Kd (계산치). 510C2 Fab에 의한 GDF-11에 대한 결합은 관찰되지 않았다.
실시예 5: Mab 의 친화력 측정
본 발명의 전장 모노클로날 항체에 대한 결합 친화력 측정을 Sapidyne KINEXA 분석법을 사용하여 결정하였다. NHS-활성화 고속 유동 세파로스 비드 (GE Healthcare)를 본 발명의 항체 (비드 1 ㎖ 당 50 ㎍의 항-마이오스타틴 항체)로 예비-코팅하고, 1 M 트리스-HCl (pH 8.0) 내의 10 ㎎/㎖ BSA로 차단하였다. 그후, 20 pM 및 50 pM의 본 발명의 항체를 러닝 완충제 (PBS, 0.005％ (v/v) Tween-20, 1 mg/㎖ 오브알부민) 내의 다양한 농도 (예를 들어, 2.4 pM 내지 20 nM, 계단 희석)의 마이오스타틴과 함께 10시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 평형상태로 존재하는 유리 항체를 결정하기 위해, 각각의 샘플을 마이오스타틴이 코팅된 비드에 통과시켰다. 그후, 러닝 완충제에서 1:4000으로 희석된 형광 (Cy5) 표지된 염소 항-인간 Fc 항체 (Jackson Jmmuno Research)의 용액을 비드에 통과시킴으로써 비드에 결합된 항체의 양을 정량하였다. 측정된 형광 신호는 평형상태의 유리 항체의 농도에 비례하였다. 각각의 마이오스타틴 농도를 이중으로 측정하였다. 다중-곡선, 단일-부위 균질성 결합 모델 (KINEXA 소프트웨어)을 사용하여 경쟁 곡선의 비-선형 회귀로부터 평형 해리 상수 (KD)를 수득하였고, 데이타는 95％ 신뢰 간격 (CI)으로 제시되었다.
Sapidyne KINEXA 분석법을 사용하여 GDF-8 결합에 대한 회합 속도 상수 (kon)를 또한 결정하였다. 상기 기술된 동일한 조건을 사용하여 20 pM 항체를 1 nM GDF-8과 혼합하였다. 다양한 시점에, 평형 결합에 대해 상기 기술된 조건을 사용하여 샘플을 유리 항체에 대해 프로빙한 후, 생성된 시간 의존성을 KINEXA 소프트웨어를 사용하여 핏팅하여, 회합 속도 (kon)를 결정하였다. 해리 속도 상수 (koff)는 식 koff = KD × kon을 사용하여 계산하였다. 기술된 분석법을 사용하여 전장 510C2 및 C12 (IgG4 Fc 영역에 작동가능하게 연결됨)를 측정하였을 때, 결과는 하기 표 3에 언급된 바와 같았다.
Figure 112008024679549-pct00003
실시예 6 마이오스타틴 / SBE 리포터 분석법
이러한 리포터 분석법에서, SMAD 결합 요소 ("SBE"), 더욱 특히 (CAGA)12 하류의 리포터 유전자, 즉, 루시퍼라제 유전자를 코딩하는 플라스미드는 마이오스타틴, GDF-11, 또는 기타 TGF-β 상과 구성원과 같은 분자가 이들 자신의 수용체에 결합함으로써 SMAD 신호전달을 촉발하여, SBE에 결합할 수 있는 인산화된 SMAD 복합체가 초래될 때, 루시퍼라제 단백질을 발현한다. CAGA 서열은 TGF-β 유도 유전자 PAI-1의 프로모터 내의 TGF-β 응답성 서열인 것으로 기존에 보고되었다 ([Denner et al., EMBO J., 17:3091-3100, 1998]). 세포에 노출된 활성 마이오스타틴의 양은 생산된 루시퍼라제 효소의 양에 직접적으로 비례하고, 이는 생산되어 측정가능한 빛의 양에 직접적으로 비례한다. 억제제 (예를 들어, 마이오스타틴에 결합하는 항체)의 존재는 SBE를 활성화시킬 수 있는 마이오스타틴의 양을 감소시키고, 궁극적으로 빛 생산의 감소가 초래된다. 이러한 분석법은 본원에 포함된 국제 공개 공보 WO 2004/037861에 또한 기술되어 있다.
마이오스타틴/SBE 리포터 분석법이 본원에 기술된 정확한 조건에 한정되지 않고, 다른 유형의 세포, 예를 들어, 293HEK (ATCC) 또는 A204 횡문근육종 세포 (예를 들어, [Whittemore, et al. BBRC, 200:965-71, 2003] 참조)가 사용될 수 있고, 다른 유형의 리포터, 예를 들어, CAT, β-gal, GFP가 사용될 수 있으며, 세포에 대한 다른 성장 조건 및 분석 조건 (반응에서 마이오스타틴의 양을 변화시키는 것을 포함)이 사용될 수 있는 것으로 구현된다. 당업자는 분석법이 마이오스타틴/SBE 리포터 분석법의 범주 내에 속하는지를 쉽게 분별할 수 있을 것인데, 이는 분석법이 숙주 세포 내로 도입된 리포터 유전자의 상류에 SBE 요소를 포함하는 벡터를 가질 것이기 때문이고, 이때 사용된 SBE 요소는 마이오스타틴 수용체에 결합하는 마이오스타틴에 응답하여 생산된 SMAD에 응답성이다. [R.S. Thies, et al., Growth Factors, 18:251-259, 2001]에 유사한 분석법이 기술되어 있고, [Wittemore, L. et al., BBRC, 300:965-971, 2003]에는 수용체에 결합하는 마이오스타틴에 응답하여 생산된 SMAD에 대한 SBE 요소 응답이 기술되어 있다.
이러한 분석법에서, DMEM/F12 배지 (3:1) (Gibco 93-0152DK), 10％ FBS, 20mM Hepes, 4 mM L-글루타민 내의 293E 세포 (Edge Biosystems)를 96웰 플레이트 (BD Biocoat 35-4461)의 폴리-라이신이 코팅된 내부 웰에 약 25000 개의 세포/웰로 파종하고, 하룻밤 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 다음날, 세포를 PBS에서 세정하고, 웰 당 50 ㎕의 OptiMEM I (Gibco 31985-070)를 첨가하였다. 세포를 50 ㎕의 하기 SBE-루시퍼라제 DNA 혼합물로 형질감염시켰다: (i) 80 ㎕ Lipofectamine (Gibco 11668-019)을 1.5 ㎖ OptiMEM과 합치고 5분 동안 방치한 후, (ii) 20 ㎍ SBE 루시퍼라제 DNA를 1.5 ㎖ OptiMEM 및 200 ㎕ Plus 시약과 합쳐서 혼합하고, 5분 동안 방치시킨 튜브에 첨가하였다. 두 혼합물을 함께 첨가한 후, 용액을 격렬하게 혼합하고, 30분 동안 방치한 후, 50 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 그후, 세포를 하룻밤 동안 37℃에서 5％ CO2에서 인큐베이션하였다. 세포의 각각의 플레이트에 대해, 5 ㎖의 마이오스타틴 (R&D Systems 788-G8)을 완전 배지에서 20 ng/㎖로 희석하였다. 테스트할 각각의 본 발명의 항체를 완전 배지에서, 예를 들어, 약 40 ㎍/㎖ 내지 약 50 ng/㎖로 적정하였다. 형질감염 배지를 웰로부터 제거하고, 웰 당 50 ㎕의 항체 희석물을 첨가하고, 웰 당 50 ㎕의 GDF-8 (마이오스타틴) 또는 GDF-11 (R&D Systems)을 첨가하였다. 그후, 세포의 플레이트를 하룻밤 동안 37℃에서 5％ CO2에서 인큐베이션하였다. 다음날, 배지를 흡인하고, 세포를 PBS에서 세정하고, 75 ㎕ 용해 완충제 (Promega E266A)를 첨가하였다. 세포 용해물 내의 루시퍼라제 활성을 루시퍼라제 시약을 사용하여 제조업자의 설명서에 따라 측정하였다 (Promega E2620). 발광을 Log10 Mab 농도 (㎍/㎖)에 대해 플롯팅하고, 마이오스타틴 및 GDF-11에 대한 각각의 Mab의 IC50을 계산하였다.
GDF-8로 이러한 조건에서 테스트하였을 때 모노클로날 항체 510C2, C12로는 각각 5.15 nM (5.74 및 4.57 nM) 및 16.07 nM (23.04 및 9.12 nM)의 IC50 값 (2회 테스트의 평균)이 산출되었다. 510C2 또는 C12는 GDF-8 대신 GDF-11로 테스트되었을 때 이러한 분석법에서 중화 활성을 나타내지 않았다.
실시예 7 약동학
단일 정맥내 (IV) 또는 복강내 (IP) 투여 후 1 ㎎/㎏ 용량에서 C57B6/SCID 마우스에서 본 발명의 항체의 약동학 (PK)을 평가할 수 있다. 상기 기술된 용량의 표지되지 않은 항체 및 125I-표지 항체의 혼합물을 동물에게 제공하고, 혈청 내의 125I 방사능 및 주사된 용량의 비활성(比活性)을 기초로 혈청 농도를 결정하였다. IV 또는 IP 투여된 항체의 혈청 농도 대 시간을 플롯팅하였다.
실시예 8 근육 질량 및 강도에 대한 생체내 효과
본 발명의 항체가 마이오스타틴 활성을 생체내에서 억제하는지 여부를 결정하기 위해, 본 발명의 항체를 성체 SCDD 마우스에서 테스트할 수 있다. SCLD 마우스는 중증 복합성 면역 결핍증을 앓고 있고, 따라서 본 발명의 항체의 주사 후에 면역학적 반응을 생성할 수 없다. 근육 질량을 본 발명의 항체로 처치된 마우스에서의 마이오스타틴 활성에 대한 지표로 사용하였다..
8주령의 수컷 C57B6 SCID 마우스를 칭량하고, 8마리의 군으로 체중과 관련하여 균일하게 분포시켰다. PBS 완충제 내의 본 발명의 항체를 다양한 용량 (예를 들어, 60, 10, 5 및 1 ㎎/㎏)으로 매주 마우스에게 IP 주사하였다. PBS-처치 마우스 또는 미처치 마우스를 대조군으로 사용하였다. 4-12주 동안 처치를 계속하였다. 처치 후 장딴지근 및 사두근을 절개하여 칭량함으로써 근육 질량을 분석하였다.
근육 강도를 결정하기 위해, 앞다리의 강도를 악력 강도 테스트 계랑기 (예를 들어, 모델 1027 csx, Columbus Instruments)로 측정하였다.
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Leu Thr 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 35 Gln Gln Trp Tyr Phe Asn Pro Leu Thr 1 5 <210> 36 <211> 12 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 36 Gly Phe Ser Leu Arg Lys Val Gly Ser Ser Val Ser 1 5 10 <210> 37 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 37 Gly Phe Ser Leu Arg Lys Val Gly Arg Ser Val Ser 1 5 10 <210> 38 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 38 Gly Phe Ser Trp Arg Lys Val Gly Ser Ser Val Ser 1 5 10 <210> 39 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 39 Gly Phe Ser Met Arg Lys Val Gly Ser Ser Val Ser 1 5 10 <210> 40 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 40 Gly Phe Ser Leu Arg Lys Val Gly Ser Ser Ile Ser 1 5 10 <210> 41 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 41 Gly Phe Ser Leu Arg Arg Val Gly Ser Ser Val Ser 1 5 10 <210> 42 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 42 Gly Phe Ser Leu Arg Met Val Gly Ser Ser Val Ser 1 5 10 <210> 43 <211> 16 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 43 His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Asn 1 5 10 15 <210> 44 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 44 His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Leu Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Asn 1 5 10 15 <210> 45 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 45 His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Leu Asn Pro Ser Leu Arg Asn 1 5 10 15 <210> 46 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 46 His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Leu Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Asn 1 5 10 15 <210> 47 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 47 Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 48 <211> 14 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 48 Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 49 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 49 Arg Lys Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 50 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 50 Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Phe Asp Met 1 5 10 <210> 51 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 51 Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 52 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Val 1 5 <210> 53 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr 1 5 10 15 Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala 20 25 <210> 54 <211> 124 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 54 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Ser Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Val Leu Gly Gly Gly Thr Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 55 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 55 Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Arg Lys Val 20 25 30 Gly Ser Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Arg Asn Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 56 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 56 Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Arg Lys Val 20 25 30 Gly Ser Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Leu Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Arg Asn Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 57 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> X <222> (9)..(9) <223> X is S or A <400> 57 Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Xaa His 1 5 10 <210> 58 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> X is S, R, L, E, or F <400> 58 Gln Gln Trp Tyr Xaa Asn Pro Leu Thr 1 5 <210> 59 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> X is L, W, or M <220> <221> X <222> (6)..(6) <223> X is K, R, or M <220> <221> X <222> (9)..(9) <223> X is S or R <400> 59 Gly Phe Ser Xaa Arg Xaa Val Gly Xaa Ser Val Ser 1 5 10 <210> 60 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> X <222> (8)..(8) <223> X is K or L <220> <221> X <222> (10)..(10) <223> X is Y or L <400> 60 His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Xaa Arg Xaa Asn Pro Ser Leu Arg Asn 1 5 10 15 <210> 61 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> X <222> (2)..(2) <223> X is A or K <220> <221> X <222> (12)..(12) <223> X is M or F <220> <221> X <222> (14)..(14) <223> X is M or L <400> 61 Arg Xaa Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Xaa Asp Xaa 1 5 10 <210> 62 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His 1 5 10 15 <210> 63 <211> 124 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 63 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Leu Ser Gly Phe Ser Leu Arg Thr Ser 20 25 30 Gly Met Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Ser Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Glu Arg Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Arg Asn Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Leu Arg Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Gly Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 64 <211> 124 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 64 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Met Leu Gln Ser Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Leu Ser Gly Phe Ser Leu Arg Thr Ser 20 25 30 Gly Met Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Ser Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Arg Asn Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Leu Arg Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Gly Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 65 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 66 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 67 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 68 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 69 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Thr Gln Thr 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser 20 <210> 70 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 71 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr 1 5 10 15 Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 72 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 73 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser 20 25 <210> 74 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 1 5 10 <210> 75 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 76 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 77 <211> 109 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 77 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Tyr Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp 100 105 <210> 78 <211> 109 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 78 Gln Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val His Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp 100 105 <210> 79 <211> 109 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 79 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp 100 105 <210> 80 <211> 109 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 80 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp 100 105 <210> 81 <211> 109 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 81 Gln Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Tyr Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp 100 105 <210> 82 <211> 109 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 82 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp 100 105 <210> 83 <211> 109 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 83 Gln Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Tyr Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Arg Ser Gly Ala Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Tyr Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp 100 105 <210> 84 <211> 109 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 84 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Tyr Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp 100 105 <210> 85 <211> 109 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 85 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Glu Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Asn Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp 100 105 <210> 86 <211> 124 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 86 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Ser Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Leu Ser Gly Phe Ser Leu Arg Thr Ser 20 25 30 Gly Met Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Ser Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Arg Asn Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Leu Arg Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Gly Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 87 <211> 123 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 87 Gln Val Thr Leu Lys Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Ser Ser Gln Thr 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Ser Leu Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Ser Gly 20 25 30 Met Ile Val Ser Trp Ile Arg Gln Ser Ser Gly Arg Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Arg Asn Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Leu Arg Asn Gln Val Phe 65 70 75 80 Leu Trp Ile Ser Ser Val Gly Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Met Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120

Claims (21)

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  8. a) 서열 37의 서열을 갖는 CDRH1의 펩티드,
    b) 서열 43의 서열을 갖는 CDRH2의 펩티드, 및
    c) 서열 48의 서열을 갖는 CDRH3의 펩티드
    를 포함하는 HCVR, 및
    a) 서열 27의 서열을 갖는 CDRL1의 펩티드,
    b) 서열 30의 서열을 갖는 CDRL2의 펩티드, 및
    c) 서열 31의 서열을 갖는 CDRL3의 펩티드
    를 포함하는 LCVR을 포함하는, 인간화 또는 완전 인간 모노클로날 항체.
  9. a) 서열 36의 서열을 갖는 CDRH1의 펩티드,
    b) 서열 45의 서열을 갖는 CDRH2의 펩티드, 및
    c) 서열 51의 서열을 갖는 CDRH3의 펩티드
    를 포함하는 HCVR, 및
    a) 서열 27의 서열을 갖는 CDRL1의 펩티드,
    b) 서열 30의 서열을 갖는 CDRL2의 펩티드, 및
    c) 서열 33의 서열을 갖는 CDRL3의 펩티드
    를 포함하는 LCVR을 포함하는, 인간화 또는 완전 인간 모노클로날 항체.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 인간 GDF-11에 결합하는 것보다 적어도 5배 더 많이 인간 마이오스타틴에 우선적으로 결합하고, 인간 마이오스타틴에 1 × 10-9 M 미만의 친화력으로 결합하며, GECEFVFLQKYPHTH의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드에 결합하는 항체.
  11. 제8항 또는 제9항에 있어서, 인간 프레임워크(framework) 영역을 추가로 포함하는 모노클로날 항체.
  12. 제10항에 있어서, 인간 프레임워크 영역을 추가로 포함하는 모노클로날 항체.
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  15. 제8항 또는 제9항의 모노클로날 항체를 포함하는, 무름(frailty), 악액질(cachexia), 근육 소모(muscle wasting), 근육 쇠약(muscle weakness), 근육병증(myopathy), 근육 퇴행위축(muscular dystrophy), 골다공증, COPD(만성 폐쇄성 폐질환), 신장 부전 또는 질환, 간 부전 또는 질환, 심장 부전, 제II형 당뇨병 및 대사 증후군으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용태의 치료 또는 예방용 제약 조성물.
  16. 제10항의 모노클로날 항체를 포함하는, 무름, 악액질, 근육 소모, 근육 쇠약, 근육병증, 근육 퇴행위축, 골다공증, COPD, 신장 부전 또는 질환, 간 부전 또는 질환, 심장 부전, 제II형 당뇨병 및 대사 증후군으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용태의 치료 또는 예방용 제약 조성물.
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