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KR101121987B1 - 파골세포 골흡수 억제 ｓｉＲＮＡ 발현 벡터 및 이를 이용한 유전자 치료제 - Google Patents

파골세포 골흡수 억제 ｓｉＲＮＡ 발현 벡터 및 이를 이용한 유전자 치료제 Download PDF

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KR101121987B1
KR101121987B1 KR1020080092697A KR20080092697A KR101121987B1 KR 101121987 B1 KR101121987 B1 KR 101121987B1 KR 1020080092697 A KR1020080092697 A KR 1020080092697A KR 20080092697 A KR20080092697 A KR 20080092697A KR 101121987 B1 KR101121987 B1 KR 101121987B1
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재단법인서울대학교산학협력재단
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Abstract

본 발명은 RNA 발현 벡터에 CK-B 유전자의 발현을 억제하는 siRNA를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 삽입하여, 여기서 전사된 siRNA에 의해 CK-B의 발현을 억제함으로써 파골세포의 골흡수를 억제하는 벡터와 이의 응용방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 CK-B 억제 siRNA 발현 벡터, CK-B 억제 siRNA 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것으로, 액틴 링 구조 형성, RhoA의 단백질의 형성, vATPase의 활성도 및 파골세포의 골흡수를 억제하여 골대사성 질환을 예방 및 치료하는데 사용될 수 있다.
파골세포, shRNA(short hairpin RNA), siRNA(short interfering RNA), CK-B(brain-type creatine kinase)

Description

파골세포 골흡수 억제 ｓｉＲＮＡ 발현 벡터 및 이를 이용한 유전자 치료제{Anti-osteoclast mediated bone resorption siRNA vector for gene therapy}
본 발명은 RNA 발현 벡터에 CK-B 유전자의 발현을 억제하는 siRNA를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 삽입하여, 여기서 전사된 siRNA에 의해 CK-B의 발현을 억제함으로써 파골세포의 골흡수를 억제하는 벡터와 이의 응용방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 CK-B 억제 siRNA 발현 벡터, CK-B 억제 siRNA 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다.
뼈(bone)는 인체의 연조직과 체중을 지탱해주고 내부기관을 둘러싸서 내부 장기를 외부의 충격으로부터 보호한다. 또한, 근육이나 장기를 구조적으로 지탱할 뿐만 아니라 체내의 칼슘이나 다른 필수 무기질, 즉 인이나 마그네슘과 같은 물질을 저장하는 인체의 중요한 부분 중 하나이다. 따라서 성장이 끝난 성인의 뼈는 멈추지 않고 죽는 날 까지 오래된 뼈는 제거되고 새로운 뼈로 대체하는 생성과 흡수 과정을 매우 역동적, 지속적으로 반복 재생 하면서 균형을 유지하게 된다. 이를 골 재형성(bone remodeling) 이라고 한다(Yamaguchi A. et al., Tanpakushitsu Kakusan Koso., 50(6Suppl):664-669(2005). 뼈는 재형성과정을 거쳐 항상성을 유지해 나간다. 이러한 뼈의 재형성 과정에는 골 형성과 골 흡수의 두 가지 상호적인 과정이 있다. 오래된 뼈는 제거되고 새로운 뼈로 대체하는 뼈의 순환(turnover)은 성장과 스트레스에 의해서 일어나는 뼈의 미세한 손상을 회복시키고 적절히 뼈의 기능을 유지하는데 필수적이다(Cohen-Solal M. et al., Therapie., 58(5):391-393(2003)). 이 과정은 파골세포, 조골세포의 적절한 활성에 의해서 진행된다.
골재형성에는 크게 두 종류의 세포가 관여하는 것으로 알려져 있다. 두 세포 중 하나는 뼈를 생성하는 조골세포(osteoblast)이고, 다른 하나는 뼈를 파괴하는 파골세포(osteoclast)이다. 조골세포는 RANKL(receptor activator of nuclear factor-κB ligand)와 이것의 유도 수용체(decoy receptor)인 OPG(osteoprotegerin)을 생성한다. RANKL이 파골 전구세포(osteoclast progenitor cells) 표면에 있는 수용체인 RANK(receptor activator of nuclear factor-κB)에 결합하면 파골 전구 세포가 파골세포로 성숙화(maturation)되어 골 흡수(resorption)가 일어난다. 그러나 OPG가 RANKL과 결합하면 RANKL과 RANK간 결합이 차단되어 파골세포의 형성이 억제되고 필요 이상의 골 흡수가 일어나지 않게 된다(Theill LE. et al., Annu Rev Immunol., 20:795-823(2002); Wagner EF. et al., Curr Opin Genet Dev., 11:527-532(2001)). 오래된 뼈의 흡수 또는 파괴는 혈액세포(조혈모세포)에서 생기는 파골세포에 의해 이루어지며 이는 뼈에 구멍을 내어 적 은 양의 칼슘이 혈류로 방출되어 신체기능을 유지하는데 사용된다(William J. et al., Nature., 423:337-342(2003)).
골 재형성 과정 중 골 형성과 골 흡수의 불균형이 이루어지면 대사성 골 질환이 유발될 수 있다. 대표적인 골대사성 질환으로는 골다공증(osteoporo sis)이 있는데, 골다공증은 파골세포의 활성이 조골세포에 비해 증가함으로써 총골량(total bone mass)이 감소하는 증상을 말한다. 골다공증이 발생하면 피질뼈(cortical bone)의 폭이 감소되고 골수의 공동(cavity)이 확대되며 망상조직 골주가 낮아져서 뼈가 계속해서 다공질로 된다. 골다공증이 진전됨에 따라 뼈의 물리적 강도가 저하되어 요통과 관절통이 유발되고, 약간의 충격에도 뼈가 쉽게 부서진다. 골의 대사성 질환으로는 이외에도 유방암, 전립선암 등의 종양이 뼈로 전이된 뼈전이암 병소, 원발성(Primary)으로 다발성골수종(multiple myeloma)과 같이 뼈에 생성된 종양, 류마티스성 또는 퇴행성관절염, 치주질환을 야기하는 세균에 의해 발생하여 치조골의 파괴가 일어난 치주질환, 치과용 임프란트를 식립한 후에 야기된 염증성 치조골 흡수 질환, 정형외과 영역에서 뼈를 고정하기 위하여 식립된 임프란트에 의해 야기된 염증성 뼈 흡수 질환 및 각종 유전적인 소인에 의해 발생하는 파제트 병(Paget's disease) 등이 있다.
최근 뼈의 흡수분해기작을 직접적으로 담당하여 골대사성 질환의 직접적인 원인이 되는 파골세포의 분화(differentiation) 및 골 재흡수(bone resorption) 기 작이 세포 및 분자적 수준에서 규명되고 있다. 파골세포의 기능규명을 통한 골다공증 치료제의 개발이 기대를 모으고 있다. 파골세포의 기능억제에 의한 골다공증 치료제 개발은 크게 두 가지 방향에서 진행되고 있다.
첫 번째는 파골세포의 분화 기작 규명을 통한 골다공증 저해제 개발에 대한 연구이다. 파골세포는 면역세포의 분화과정과 동일하게 골수(bone marrow)에 존재하는 조혈모세(hematopoietic stem cell)로부터 분화된다. 특히, 초기의 파골세포분화과정은 면역체계에 존재하는 식세포(macrophage)의 분화인자인 M-CSF (macrophage - colony stimulating factor)와 rankl라는 사이토카인(cytokine)에 의해서 단핵세포(monocyte)로 분화된 후, rankl에 의해서 파골세포로 최종적으로 성숙된다(도 2) (8,9,10). 따라서 파골세포의 분화과정 중 신호전달기작을 억제할 수 있는 물질을 탐색함으로서 골다공증 치료제를 개발할 수 있다.
두 번째는 파골세포의 뼈 재흡수기작 저해제 개발에 대한 연구이다. 파골세포의 재흡수는 분화된 파골세포가 세포내 액틴 고리(actin ring) 형성과 같은 특수한 구조를 만든 뒤, 뼈의 흡수 부위에 과량의 산과 단백질 분해 효소를 분비하여 이루어진다. 따라서 분화된 파골세포의 재흡수기작을 억제하는 물질은 골다공증의 치료제로서 직접적으로 사용될 수 있다.
파골세포의 뼈 재흡수기작 저해 인자로는 에스트로겐, 칼시토닌, 비타민 D 및 그의 유사체(Vitamin analogues), 비스포스포네이트(bisphosphonate) 등이 알려져 있다(Jardine et al., Annual Reports in Medicinal Chemistry, 31, p211, 1996).
그외에도 지금까지 여러 물질이 골대사성 질환 치료제로 개발되고 있으며, 그 중 골다공증 치료제로 가장 많이 사용되는 에스트로겐은 그 실제적인 효능이 아직 검증되지 않은 상태이며 생애 동안 계속 복용해야하는 단점이 있고, 또한 장기간 투여하는 경우 유방암이나 자궁암이 증가하는 부작용이 있다. 알렌드로네이트(alrendronate)도 그 효능이 명확하지 않고 소화관에서의 흡수가 더디며 위장과 식도점막에 염증을 유발하는 문제가 있다. 칼슘제제는 부작용이 적으면서도 효과가 우수한 것으로 알려져 있지만 치료제라기보다는 예방제에 해당하는 한계가 있다. 그 외에 칼시토닌과 같은 비타민 D 제제가 알려져 있으나 아직 효능 및 부작용에 대한 연구가 충분히 되어있지 않은 상태이다.
2002년 과학잡지 "Science"는 small RNA를 'molecule of the year'에 선정하였으며, 2003년 12월에는 과학 전 분야를 대상으로 10대 중요 과학적 성과를 발표하였는데 그 중에 RNAi (RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 siRNA(small interfering RNA) 기술이 선정되었다. 이러한 사실은 현재 small RNA 연구분야 및 이를 이용한 RNAi 기술의 중요성과 연구자들 사이의 관심을 단적으로 보여 주고 있다. 이 기술은 아직은 초기단계에 불과하지만 세포 유전학 연구에 혁명적인 변화를 가져올 것으로 생각되며 일부 과학자들은 이 기술이 polymerase chain reaction (PCR)에 버금가는 기술이 될 수도 있을 것으로 평가하고 있다. 지금까지는 한 유전 자의 형질발현을 중단시킨 세포를 만들기 위해서는 6개월에서 1년에 걸친 실험이 필요하지만 siRNA를 이용한 RNAi 기술로는 일주일에 수 십 개의 유전자를 제어할 수도 있다. 지난 10 여년 간 많은 연구자와 제약회사 연구진은 anti-sense oligonucleotide 또는 antisense RNA 발현에 의해 유전자의 기능 규명 및 새로운 drug의 개발을 위해 각고의 노력으로 경주해 왔으나 이러한 anti-sense technique의 사용은 많은 경우 대조군으로 sense strand를 사용한 실험에서도 target gene의 발현 억제 현상이 관찰되어 그 원인 규명을 위한 관심이 지속되고 있었고 이러한 노력의 일환으로 Dr. Fire 그룹은 안티센스 RNA와 센스 RNA를 각각 RNA polymerase를 이용해 시험관 속에서 합성한 후, 아주 소량이긴 하지만 비특이적으로 반대 방향의 RNA가 합성되어 dsRNA가 생성된다는 사실을 관찰했을 뿐 아니라, 전기영동으로 정제한 안티센스 RNA 및 센스 RNA는 유전자 발현을 효율적으로 억제하지 못하는 반면, 흥미롭게도 분리하지 않은 시험재료에서 생성된 dsRNA가 매우 효율적으로 유전자 발현을 억제한다는 사실을 밝혀내었다(Fire et al., 1998). 이 보고에서 Dr. Fire 그룹은 특정 유전자의 염기 서열에 해당하는 double strand RNA(dsRNA)를 선충 Caenorhabditis elegans의 체내에 넣으면, 그에 대응하는 mRNA가 특이적으로 분해되어 유전자의 기능을 상실하며 또한 투여하는 dsRNA는 분해될 mRNA에 비하여 극히 소량이어도 가능하다라는 실험 결과 (RNA interference, RNAi)를 관찰하였으며, 이러한 RNAi 현상의 염기서열 특이성과 기존의 gene knock-out 방법보다 간단하고 신속한 유전자 발현 억제 유도 기능으로 인하여 급속하게 전파되어 선충을 이용한 reverse genetics 연구에 활발히 사용되게 되었으며 RNAi는 선충에만 적용되는 것 이 아니고, 전 생물계에 응용될 수 있다는 사실이 보고되었다. 즉, RNAi는 21-25 nt의 small-size RNA에 의해 상보적인 염기서열을 갖는 mRNA가 선택적으로 분해되거나 번역(translation)이 억제되는 현상으로 siRNA에 의한 mRNA분해와 miRNA에 의한 번역 억제는 사실상 동일한 조절 경로에 속한다고 볼 수 있다.
따라서 이러한 RNAi 기술을 이용하여 CK-B를 억제함으로써 파골세포의 골흡수를 억제하여 골대사성 질환을 예방 및 치료할 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명의 목적은 siRNA 발현 벡터에 CK-B 유전자의 발현을 억제하는 siRNA를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 삽입하여, 여기서 전사된 siRNA에 의해 CK-B의 발현을 억제함으로써 파골세포의 골흡수를 억제하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 CK-B 억제 siRNA 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 CK-B 억제 siRNA 및 서열번호 2의 염기서열과 이와 루프(loop) 영역으로 연결된 서열번호 2에 역상보적인 RNA 염기서열을 포함하는 헤어핀 구조의 CK-B 억제 siRNA을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 CK-B(brain-type creatine kinase)유전자의 발현 또는 그 발현 단백질의 작용 억제제를 유효성분으 로 포함하는 파골세포의 골흡수 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 (1) CK-B 단백질을 발현하는 동물세포에 임의의 약제를 처리하는 단계; (2) 상기 동물세포에서 약제를 처리하지 않은 대조군과 비교하여 CK-B 단백질의 발현 또는 활성이 감소되는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 파골세포의 골흡수 억제제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 siRNA 발현 벡터에 CK-B 유전자의 발현을 억제하는 siRNA를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 삽입하여, 여기서 전사된 siRNA에 의해 CK-B 유전자의 발현을 억제함으로써 파골세포의 골흡수를 억제하는 벡터를 제공한다.
본 발명자들은 파골세포 분화 중에 CK-B가 특이적으로 증가 발현하여 골 흡수 기작에 관여한다는 것과, CK-B가 파골세포의 골흡수 조절의 타겟이 될 수 있음을 발견했다. 이에, 외래 서열을 벡터에 삽입시키는 전략으로 벡터의 파골세포의 골흡수를 억제하기 위해 연구 노력한 결과, CK-B의 mRNA를 타겟팅하는 siRNA를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 벡터에 삽입시켜 발현시키면 파골세포에 의한 골흡수가 억제된다는 것을 밝혀냈다.
본 발명에서 사용한 용어, "파골세포"는 다핵성세포로 조혈모세포로부터 유 래되며, 오래된 뼈의 흡수 또는 파괴는 혈액세포(조혈모세포)에서 생기는 파골세포에 의해 이루어지며 이는 뼈에 구멍을 내어 적은 양의 칼슘이 혈류로 방출되어 신체기능을 유지하는데 사용된다(William J. et al., Nature., 423:337-342(2003)). 골 흡수는 파골세포의 흡수 부분으로 이동, 파골세포의 뼈와의 부착, 새로운 막 도메인(membrane domains)의 극성화(polarization)와 생성, 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite)의 분해, 유기 조직의 분해, 흡수, 공백으로부터 분해 산물의 이동, 마지막으로 파골세포의 세포사멸 과정으로 진행된다.
Creatine kinase(CK)은 크레아틴 인산으로부터 고에너지 인산기를 ADP로 전이하는 반응을 촉매하는 효소로 CK의 isoenzyme은 CK-BB(EP상에서 albumin위치로 이동하고 주로 뇌에 존재), CK-MM(EP상에서 globulin 영역으로 이동하며 주로 골격근에 존재), CK-MB(양자의 hybrid형으로 EP에서 2-globulin 위치로 이동하며 주로 심근에 존재)가 있다. 본 발명에서의 용어 "CK-B"는 CK-BB를 의미한다. 이하 도 1a에서 보는 바와 같이 파골세포의 분화 및 활성화 과정에서 발현양이 증가한다. 또한, CK-B는 RhoA 및 V-ATPase 활성 및 세포 내 골격을 이루는 actin ring 조절에 관여한다.
본 발명은 siRNA(short interfering RNA)의 발현을 개시할 수 있는 프로모터 및 서열번호 1의 CK-B(brain-type creatine kinase) mRNA의 일부에 상보적이며 CK-B 유전자의 발현을 억제하는 siRNA를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 전사방향으 로 연결하여 포함하는 CK-B 억제 siRNA 발현 벡터를 제공한다.
본 발명에서 사용한 용어 "siRNA"는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있어 타겟이 되는 유전자의 발현을 특이적으로 억제할 수 있는 핵산 분자를 의미한다 (참조: WO00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99/07409 및 WO 00/44914).
본 발명에서 사용되는 용어 "특이적"은 세포 내에서 다른 유전자에 영향을 미치지 않고 목적 유전자만 억제하는 능력을 의미하고, 본 발명에서는 CK-B 유전자에 특이적이다.
본 발명에서 이용되는 siRNA는 CK-B mRNA에 상보적인 서열을 포함하는데, 용어 “상보적”은 100% 상보적인 경우뿐만 아니라, iRNA(interference RNA)기전을 통해 CK-B 유전자의 발현을 억제할 수 있을 정도의 대응하는 일부 염기 결손 및 불완전한 상보성도 포괄하는 의미이며, 바람직하게는 90%의 상보성, 보다 바람직하게는 98%의 상보성, 가장 바람직하게는 100%의 상보성을 의미한다. 본 명세서에서 100% 상보성을 표현하는 경우에는 “완전 상보적 (completely complementary)"으로 특별하게 기재된다.
본 발명자들은 최적의 siRNA 목적 부위를 찾기 위해 www.invivogen.com, www.oligoengine.com, www.genescript.com, www.wistar.com, www.ambion.com 등 인 터넷상의 siRNA 합성 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 선택 기준은 Tuschl 등이 제시한 기준, 즉, 낮은 GCcontents를 갖을 것, 제어 단백질의 결합부위를 피하기 위해 적어도 첫 codon으로부터 50~100 nt 아래 부위일 것, 최소 2차 구조를 갖을 것, 적어도 3 염기의 반복이 없을 것, 엑손-인트론 경계부위가 아닐 것, 다른 부위와 유사성을 갖지 않을 것 등이다 (Elbashir et al., 2002). 이들 기준에 의하면 CK-B mRNA의 512~532 nt가 siRNA에 가장 적당한 부위로 선정되었다.
이에, 본 발명의 바람직한 CK-B(brain-type creatine kinase) mRNA의 일부는 서열번호 1의 CK-B mRNA 서열 중 512~532 nt인 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 siRNA를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1의 CK-B mRNA 서열 중 512~532 nt에 해당하는(corresponding) 서열번호 2의 서열을 포함하는 서열을 가지는 것을 특징으로 한다. siRNA를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 서열을 최소 서열로 필요로 한다.
상기 siRNA를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 CK-B 유전자 사일런싱을 매개하는 데에 유효한 최소 길이 19 뉴클레오타이드(nt), 보다 바람직하게는 최소 20 nt 이다.
본 발명의 siRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 상기의 최소 서열 을 포함하며, 가장 바람직하게는 19-25 nt이다.
본 발명의 siRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은, 캐리어가 ds DNA 지놈을 갖는 벡터이기 때문에, DNA 분자인 것이 바람직하다.
안티센스 RNA와 센스 RNA는 동일한 벡터에서 발현될 수도 있고, 다른 벡터에서 각각 발현되는 형태일 수도 있다.
프로모터에서 센스 RNA가 발현되는 발현 카세트와 프로모터에서 안티센스 RNA가 발현되는 별개의 발현 카세트를 각 구축하고 이들 카세트를 같은 방향 혹은 역방향으로 벡터에 삽입할 수 있다.
본 발명의 siRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은, siRNA를 코딩하는 일반적인 서열과 같이, 센스 가닥 (CK-B mRNA 서열에 상응하는 (corresponding) 서열)과 안티센스 가닥 (CK-B mRNA 서열에 상보적인(complementary) 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있다.
또한, 다른 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 siRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은, 센스 가닥 및 자기-상보성 (self-complementary) 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다.
본 발명에서의 용어 "자기 상보성 (self-complementary) 안티센스 가닥" 이라함은 센스 가닥에 역상보적인(reverse complementary) 서열의 안티센스 가닥을 말한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 siRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1의 CK-B mRNA 서열의 512~532 nt에 해당하는(corresponding) 서열번호 2의 서열과 서열번호 2에 역상보적 (reverse complementary) 서열이 동일한 가닥(strand)에 모두 존재하는 것을 특징으로 한다.
또한, 스템-앤드-루프 구조 siRNA를 발현할 수 있는 시스템으로 안티센스 RNA와 센스 RNA를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 동일 DNA 가닥상에 역방향으로 배치하고, 이들 DNA 사이에 루프를 삽입하여 연결시킨 단위를 하나의 프로모터의 하위(downstream)에 위치하도록 할 수 있다. 이 때, 발현되는 순서는 제한되지않는다. 즉, 안티센스 RNA를 코딩하는 DNA-루프-센스 RNA를 코딩하는 DNA 형태와 센스 RNA를 코딩하는 DNA-루프-안티센스 RNA를 코딩하는 DNA 형태일 수 있다. 그 결과, 생성되는 siRNA는 루프 양쪽의 센스 RNA와 안티센스 RNA가 짝을 이루게 되는 스템 루프형 구조를 가진다.
본 발명의 siRNA를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은, 센스 가닥 및 자기-상보성 (self complementary) 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오타이드 서열 (예컨 대, 약 5-15 nt)이 삽입된 형태를 가지며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자 내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 siRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1의 CK-B mRNA 서열의 512~532 nt에 해당하는(corresponding) 서열번호 2의 서열 및 서열번호 2에 역상보적 (reverse complementary) 서열을 가지며, 상기 서열번호 2의 서열과 서열번호 2에 역상보적인 서열 사이에 헤어핀 구조를 형성하게 하는 서열(5-15 nt, 바람직하게는 8-12 nt)이 삽입되어 있는 것을 특징으로 한다.
센스 및 자기-상보성 (selfcomplementary) 안티센스 가닥 사이에 삽입된 짧은 뉴클레오타이드 서열은 루프 (헤어핀) 구조를 형성시킬 수 있는 어떠한 염기도 가능하며, 이러한 루프 영역은 서열에 특별한 의미가 없다. 단지 센스서열과 안티센스서열을 적당한 간격으로 연결하기 위하여 5-15 nt 정도의 염기를 가지고 있으면 족하다. 종래에 siRNA의 루프 영역으로 많이 사용되어온 예들은 다음과 같다: AUG (Sui et al., (2002) A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. US A 99(8): 5515-5520), CCC (Paul et al., (2002) Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nature Biotechnology 20 : 505-508), UUCG (Lee et al., (2002) Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells. Nature Biotechnology 20 : 500-505), CCACC (Paul et al., (2002) Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nature Biotechnology 20 : 505-508), CTCGAG, AAGCUU (Editors of Nature Cell Biology (2003) Whither RNAi, Nat Cell Biol. 5:489-490), CCACACC (Paul et al., (2002) Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nature Biotechnology 20 : 505-508), UUCAAGAGA (Yu et al., (2002) RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(9) :6047-6052), 및 TTGATATCCG(www.genscript.com의 default spacer). 본 발명의 구체적인 예에 따르면 TTGATATCCG를 루프 영역으로 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 siRNA를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 3의 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명 CK-B 억제 발현 벡터에는 CK-B mRNA에 상보적인 서열을 갖는 RNA만을 발현시키는 벡터도 포함된다.
본 발명의 발현 벡터에 있어서, 벡터는 목적 유전자를 코딩하는 핵산 서열을 숙주세포로 도입하기 위한 수단으로, 본 발명의 표적 서열을 siRNA로 발현할 수 있는 종래 알려진 어떤 siRNA 발현 벡터도 사용할 수 있다. 예컨대, Promega 제품으로 GeneClip™ U1 Hairpin Cloning System(Cat.#'s C8750, C8760, C8770, C8780, C8790), siLentGene™ U6 Cassette RNA Interference System (Cat.# C7800), T7 RiboMAX™Express RNAi System (Cat.# P1700), siSTRIKE™ U6 Hairpin Cloning Systems (Cat.#'s C7890, C7900, C7910, C7920) 및 siLentGene™ -2 U6 Hairpin Cloning Systems (Cat.#'s C7860, C8060, C8070, C8080) 등을 사용할 수 있으며, Genscript 제품으로 pRNA-U6.1 (Cat.#'s SD1201, SD1202, SD1207), pRNATin-H1.2 (Cat.#'s SD1223, 1224) 및 pRNA-H1.1/Adeno (Cat.# SD1209) 등을 사용할 수 있고, Oligoengine 제품으로 pSUPER-retro-GFP/Neo (Cat.#'s VEC-IND-0013/0014)등을 사용할 수 있으며, Clontech 제품으로 pAdeno-X expression system (Cat.#'s PT3414-1) 등을 사용할 수 있다.
CK-B mRNA를 타겟팅하는 siRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 벡터 지놈에 탑재된다. siRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 적합한 발현 컨스트럭트 (expression construct) 내에 존재하는 것이 바람직하다. 상기 발현 컨스트럭트에서, siRNA-코딩 뉴클레오타이드 서열은 프로머터에 작동적으로 연결되는(operatively linked) 것이 바람직하다. 본 명세서에서, 용어 “작동적으로 결합된”은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
본 발명에 있어서, siRNA를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 결합된 프로모터는 siRNA의 발현을 개시할 수 있는 어떤 프로모터도 가능하나, 바람직하게는 동물세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포에서 작동하여 siRNA-코딩 뉴클레오타이드 서열의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, transcript를 전사하는 RNA polymerase III (pol III) promoter중에서 선택하는 것이 좋으며, 대부분의 siRNA의 센스 사슬(sense strand)의 5' 말단은 G 또는 C로 끝나므로 G 또는 C의 전사를 효율적으로 개시할 수 있는 프로모터를 선택하는 것이 좋다. 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, U6 프로모터, T7 프로모터, H1 프로모터, CMV (cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터, 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, 유도성 (inducible) 프로모터, 암세포 특이적 프로모터 (예컨대, TERT 프로모터, PSA 프로모터, PSMA 프로모터, CEA 프로모터, E2F 프로모터 및 AFP 프로모터) 및 조직 특이적 프로모터 (예컨대, 알부민 프로모터)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 CK-B 유전자 억제 재조합 벡터를 제조하기 위하여 벡터에 CK-B mRNA를 타겟팅하는 siRNA를 코딩하는 DNA를 포함하는 발현 카세트를 삽입함으로써 CK-B mRNA를 타겟팅하는 siRNA를 생산할 수 있는 발현 벡터를 제조한다.
이를 위한 벡터의 디자인을 위해 CK-B 유전자 억제를 위해 타겟팅할 CK-B mRNA 서열을 확보한다. 짧은 RNA transcript를 전사하는 RNA polymerase III (pol III) promoter중 적절한 프로모터를 선택한다. 프로모터로부터 siRNA를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 루프 영역을 사이에 두고 위치하며 발현되어 헤어핀 구조의 (shRNA)가 합성되게 된다. 이렇게 합성된 shRNA는 세포 내에 존재하는 siRNA processing enzyme (Dicer or Rnase III)에 의해 정확한 구조를 갖는 siRNA로 전환되어 target gene의 silencing을 유도하게 된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 상기 서열번호 1의 CK-B mRNA를 타겟팅하는 siRNA를 코딩하는 서열번호 3의 염기 서열을 갖는 뉴클레오타이드가 U6 프로모터 다음에 전사 방향으로 삽입되어 제조되는 것을 특징으로 하는 도17a 의 개열지도를 갖는 CK-B 억제 재조합 벡터 pRNA-U6.1/Neo를 제공한다.
보다 구체적으로 본 발명은 U6 프로모터, 서열번호 3의 염기 서열을 갖는 뉴클레오타이드로 구성되는 발현 카세트를 포함하는 siRNA 발현 벡터이다. CK-B 유전자 발현을 억제하기 위한 RNA 간섭 (interference)을 유도할 수 있는 서열을 siRNA target으로 선택하고, BamHI 및 HindIII 제한효소 절단부위를 갖는 염기 서열을 제작하여 2중 나선 DNA절편으로 만든 후 pRNA-U6.1/Neo 벡터에 클로닝하여 CK-B 억제 재조합 벡터를 만든다.
또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 상기 서열번호 1의 CK-B mRNA를 타겟팅하는 siRNA를 코딩하는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 뉴클레오타이드가 T7 프로모터 다음에 전사 방향으로 삽입되어 제조되는 것을 특징으로 하는 도17b의 개열지도를 갖는 pSUPER-retro-GFP/Neo를 제공한다.
보다 구체적으로 레트로바이러스 발현용 pSUPER-retro-GFP/Neo vector (Oligoengine 제품)에 CK-B mRNA를 타겟팅하는 siRNA를 코딩하는 뉴클레오타이드를 클로닝하여 shRNA plasmid를 제작한다. 레트로바이러스를 복제할 수 있는 Plat-E 세포주에 유전자 이입한 후 세포외 부유액을 모아 iRNA로 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 상기 서열번호 1의 CK-B mRNA를 타겟팅하는 siRNA 분자를 코딩하는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 뉴클레오타이드가 U6 프로모터 다음에 전사 방향으로 삽입되어 제조되는 RNAi-Ready-pSIREN-shuttle vector에서 제한효소로 절단하여 수득한 유전자 단편을 삽입하여 제조되는 것을 특징으로 하는 도17c의 개열지도를 갖는 pAdeno-CK-B-sh DNA를 제공한다. 상기 제한효소는 바람직하게는 I-CeuI 및 PI-SceI이다.
보다 구체적으로 CK-B shRNA를 발현하는 아데노바이러스는 RNA 발현용 U6 promoter를 가진 RNAi-Ready-pSIREN-shuttle vector (Clontec 제품)에 CK-B shRNA를 클로닝한 후 I-CeuI/PI-SceI 제한효소로 절단하여 pAdeno-X vector (Clontech 제품)로 다시 클로닝함으로써 제작하였다. 완성된 아데노바이러스 발현용 pAdeno-CK-B-sh DNA는 Fugene 6 (Roche 제품)를 이용하여 HEK 293 세포주에 유전자 이입 후 세포를 용해하여 CsCl 밀도구배 원심분리법에 의해 아데노바이러스를 얻어 정량 후 사용한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 CK-B 억제 siRNA 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 본 발명의 숙주세포는 예컨대 CaCl2 나 electroporation 법과 같은 종래 알려진 형질전환방법에 의해 본 발명의 CK-B 억제 siRNA 발현 벡터가 주입되어 발현될 수 있는 어떤 숙주세포도 가능하나, 바람직하게는 본 발명의 siRNA 발현 벡터로 형질전환된 대장균 균주를 특징으로 한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 CK-B 억제 siRNA를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 서열번호 2의 염기서열과 이와 루프(loop) 영역으로 연결된 서열번호 2에 역상보적인 RNA 염기서열을 포함하는 헤어핀 구조의 CK-B 억제 shRNA를 제공한다.
CK-B mRNA를 타겟팅하는 본 발명의 siRNA-코딩 뉴클레오타이드 서열은 위에 기재된 내용을 인용하여 보다 상세하게 설명된다.
siRNA 말단 구조는 표적유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt)말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3 말단 돌출한 구조와 5 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하다. 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 예를 들어, 염기 개수로는 1 내지 8 염기 , 바람직하게는 2 내지 6 염기로 할 수 있다. 또한, siRNA는 표적유전자의 발현억제효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한 쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA,rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA분자 또는 인공의 RNA분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 루프 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1로 전사(transcription)되는 CK-B(brain-type creatine kinase)유전자의 발현 또는 그 발현 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 파골세포의 골흡수 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 CK-B 유전자의 발현 또는 CK-B 단백질의 활성을 억제하는 데는 CK-B 유전자의 전사 또는 번역을 하향조절하거나 CK-B 단백질의 활성을 억제하는 것을 포함한다.
보다 구체적으로, 상기 CK-B(brain-type creatine kinase)유전자의 발현 억제제에는 본 발명의 CK-B 억제 siRNA 발현 벡터 또는 본 발명의 CK-B 억제 siRNA 또는 본 발명의 CK-B 억제 shRNA를 포함한다.
보다 구체적으로, 상기 CK-B(brain-type creatine kinase)단백질의 활성 억제제에는 Ccr(cyclocreatine)를 포함한다.
본 발명의 조성물에는 파골세포의 골흡수를 억제하는 억제하는 추가의 물질을 포함할 수 있으며, 또한 shRNA, siRNA 및 벡터의 세포내 유입을 촉진시키는 제제를 포함할 수 있다. siRNA의 세포내 유입을 촉진시키는 제제에는, 리포좀 (미국특허 제4,897,355호, 제4,394,448호, 제4,235,871호, 제4,231,877호, 제4,224,179호, 제4,753,788호, 제4,673,567호, 제4,247,411호, 제4,814,270)을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수도 있다. 또한 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 스퍼민(spermine), 폴리실아잔(polysilazane), 폴리에틸레민(PEI:polyethylenimine), 폴리디하이드로이미다졸레늄(polydihydroimidazolenium),폴리알리라민(polyallylamine), 키토산(chitosan) 등의 양이온성 고분자(cationic polymer)를 이용할 수도 있고, 숙실화된 PLL(succinylated PLL), 숙실화된PEI(succinylated PEI), 폴리글루타믹산(polyglutamic acid), 폴리아스파틱산(polyaspartic acid), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리메타아크릴산(polymethacylic acid), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 헤파린(heparin), 히아루릭산(hyaluronic acid) 등의 음이온성 고분자(anionic polymer)를 이용할 수도 있다. siRNA를 복합체 형태로 체내 투여할 경우 유전자의 체내 체류시간 및 발현 지속시간이 네이키드 핵산에 비하여 현 저히 증가하는 것으로 밝혀졌다.
본 발명 파골세포의 골흡수 억제용 조성물은 골대사성 질환의 예방 및 치료용으로 사용될 수 있다. 대표적인 골대사성 질환으로는 골다공증(osteoporo sis)이 있는데, 골다공증은 파골세포의 활성이 조골세포에 비해 증가함으로써 총골량(total bone mass)이 감소하는 증상을 말한다. 골다공증이 발생하면 피질뼈(cortical bone)의 폭이 감소되고 골수의 공동(cavity)이 확대되며 망상조직 골주가 낮아져서 뼈가 계속해서 다공질로 된다. 골다공증이 진전됨에 따라 뼈의 물리적 강도가 저하되어 요통과 관절통이 유발되고, 약간의 충격에도 뼈가 쉽게 부서진다. 골의 대사성 질환으로는 이외에도 유방암, 전립선암 등의 종양이 뼈로 전이된 뼈전이암 병소, 원발성(Primary)으로 다발성골수종(multiple myeloma)과 같이 뼈에 생성된 종양, 류마티스성 또는 퇴행성관절염, 치주질환을 야기하는 세균에 의해 발생하여 치조골의 파괴가 일어난 치주질환, 치과용 임프란트를 식립한 후에 야기된 염증성 치조골 흡수 질환, 정형외과 영역에서 뼈를 고정하기 위하여 식립된 임프란트에 의해 야기된 염증성 뼈 흡수 질환 및 각종 유전적인 소인에 의해 발생하는 파제트 병(Paget's disease) 등이 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있으며, 경구 투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릴시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다.
본 발명의 조성물은 상기에서 언급한 질환들을 가지는 환자에게 투여함으로써, 파골세포의 골흡수를 억제할 수 있고 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "예방"이란 본 발명의 조성물 투여에 의해 파골 세포에서 골흡수 유발이 억제되거나 지연되는 모든 행위을 의미하고 "치료"란 본 발명의 조성물 투여에 의해 신경 세포사멸 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 조성물은 치료학적 또는 예방학적 유효양으로 목적 조직에 도달할 수 있는 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 치료학적 또는 예방학적 유효양으로 투여될 수 있다. 투 여량은 환자의 질환 종류 및 중증도, 연령, 성별, 체중, 약물에 대한 민감도, 현재 치료법의 종류, 투여방법, 표적 세포 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 바람직하게는 siRNA의 경우 2~5 mg/kg 를 투여하는 것이 바람직하고, cK-B 활성 억제제의 경우 0.1~1 g/kg 를 투여하는 것이 바람직하다. 본 발명의 조성물은 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한 단일 또는 다중 투여일 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명에서 사용한 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 siRNA를 포함하는 세포 사멸 억제용 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (1) CK-B 단백질을 발현하는 동물세포에 임의의 약제를 처리하는 단계; (2) 상기 동물세포를 약제를 처리하지 않은 대조군과 비교하여 CK-B 단백질의 발현 또는 활성이 감소되는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 파골세포의 골흡수 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용한 용어 "동물 세포"는 CK-B 단백질을 발현하는 인간 또는 소, 염소, 돼지. 마우스, 래빗, 래트 등의 동물 기원의 모든 세포를 포함한다,
본 발명에서 사용한 용어 "임의의 약제"는 파골세포의 골흡수 억제를 유도할 것으로 추정되는 물질을 말한다. 이러한 임의의 약제에는 유기 또는 무기 화함물과 같은 단일 화합물, 단백질, 탄수화물, 핵산분자 및 지질과 같은 고분자 화합물 및 복수의 화합물의 복합체 등이 포함될 수 있다. 본 발명에 따른 파골세포의 골흡수 억제용 조성물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 보다 구체적으로 본 발명의 CK-B 억제 siRNA 발현 벡터 또는 본 발명의 CK-B 억제 siRNA일 수 있다.
본 발명에서 사용한 용어 "처리"한 임의의 약제가 파골세포에 영향을 미치도록 하는 것을 의미하고, 세포 내로 직접 흡수되는 것에 한정되지 않는다. 또한 임의의 약제가 파골세포의 골흡수를 억제하는 기작은 특별히 한정되지 않는다.
CK-B 단백질의 발현 또는 활성도는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 측정될 수 있다. 바람직하게는 CK-B 유전자의 mRNA 또는 단백질의 양에 의해 측정될 수 있다. 또한, 파골세포의 분화 중 발현양이 증가하는 CK-B는 RhoA 및 V-ATPase 활성 및 세포 내 골격을 이루는 actin 조절에 관여하는바, 임의의 약제를 투여한 결과는 RhoA 단백질의 발현양, V-ATPase 활성도, actin ring 구조 형성여부를 측정하여 알 수도 있다.
본 발명에서 사용한 용어, "actin ring"은 파골세포가 활성화되어 골흡수를 하는 과정에서 형성하는 구조이다. 활성화된 파골세포 아래 기질 표면에서는 sealing off가 진행된다. 이는 podosom의 축적, f-actin이 풍부한 sealing zone이 형성되는 과정을 말한다. 상기 sealing zone은 뼈 기질과 파골세포의 플라즈마 막을 단단하게 부착시키는 역할을 하는 것으로 보고되어 있다.
본 발명에서 사용한 용어, "RhoA"는 Ras family의 하나로 파골세포의 분화와 이동, 재흡수 과정에 중요한 역할을 하는 단백질을 의미한다. 본 발명자들은 이것이 sealing zone 형성에 관여하는바, V-ATPase 활성이 RhoA에 의해 간접적으로 조절될 가능성이 있음을 밝혀냈다.
본 발명에서 사용한 용어, "V-ATPase"는 파골세포의 분화 중에 발현하는 유전자로서, 파골세포의 골 흡수 과정 중 뼈를 분해하기 위해 강한 산 및 뼈 기질 분해 효소를 분비하는데 있어서 H+의 이동에 관여하여 파골세포가 최상의 활성을 가질 수 있도록 pH를 낮춰 주는 역할을 한다. V-ATPase가 활성화되어 뼈흡수가 일어나고 있는 lacuna 구조 내에 산성화를 촉진하며, V-ATPase 활성은 RhoA 및 actin에 의해 간접적으로 조절될 가능성이 있음이 본 발명자들에 의해 밝혀졌다.
mRNA 양을 측정하기 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
단백질 양은 CK-B 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있고, 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
V-ATPase의 활성도 확인을 위한 분석 방법으로는 Fernandez, R. ＆ Malnic, G. H+ ATPase and Cl- interaction in regulation of MDCK cell pH. J. Membr. Biol. 163, 137-145 (1998) 등에 기재된 방법이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
상기 방법으로 획득한 물질을 이용하여, 파골세포에서의 골흡수를 억제할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
RNA 발현 벡터에 CK-B 유전자의 발현을 억제하는 siRNA를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 삽입하여, 여기서 전사된 siRNA에 의해 CK-B의 발현을 억제함으로써 파골세포의 골흡수를 억제하는 벡터와 이의 응용방법에 관한 본 발명은 액틴 링 구조 형성, RhoA의 단백질의 형성, vATPase의 활성도 및 파골세포의 골흡수를 억제하여 골대사성 질환을 예방 및 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 siRNA 발현 벡터는 기존의 안티센스 올리고머나 바이러스 벡터에 비해 독성이나 부작용이 적은 반면 기존의 안티센스 올리고머보다 월등하게 우수한 효과를 내는 것으로 생각되어 항암 유전자 요법이나 줄기세포 분화 조절에 사용하는 경우 매우 우수한 안전성 및 효과가 있다.
실시예 1. 파골세포 형성을 위한 배양조건 및 분화 확인
마우스 골수세포를 ICR 마우스의 경골에서 분리하여 30 ng/ml의 농도로 M-CSF를 3일간 처리하였다. 이로써 형성된 골수 유래 대식세포를 30 ng/ml의 M-CSF와 100 ng/ml의 RANKL을 포함하는 a-MEM 배양액 (이하, 파골세포 분화 배양액)에서 3일간 처리하여 파골전구세포를 얻었고, 그 후 2일간 추가 배양함으로써 성숙한 파골세포를 얻었다. 파골세포의 분화 여부는 Acid-Phosphatase Kit (Sigma제품)를 이용하여 tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) 활성을 측정함으로써 확인하였다. 상아질을 이용한 성숙한 파골세포 뼈흡수 활성 측정은 골수 유래 대식세포를 상아질 절편 위에 깔아준 후 동일한 방법으로 파골세포의 분화를 유도한 후 1일간 추가 배양한 후 관찰하였다.
또한, 레트로바이러스를 이용한 세포 내 CK-B 단백질의 발현은 동일한 배양조건에서 파골전구세포에 레트로바이러스를 도입시켜 유도하였다.
실시예 2. 2차원 전기영동 (2D PAGE)을 통한 CK-B 단백질의 발굴 및 확인
파골세포 분화 전 세포 및 성숙한 파골세포를 각각 용해시켜 얻은 세포 내 단백질을 포함한 용해액을 Immobiline DryStrips (pH 3-10 linear, Amersharm Pharmacia) 에 흡착시킨 후 Multiphor II electrophoresis unit (Amersham Pharmacia)에서 72,000 Vh, 최대 전압 4000V에서 20시간 동안 1차원 등전점 전기영동을 실시하였고, 2차원 전기영동을 통해 분리하여 silver 염색 후 단백질 분획들 을 확인하였다. 분화 후 파골세포에서 증가된 발현 차이를 보이는 SDS-PAGE 젤 상의 분리된 단백질 분획을 잘라 트립신을 이용하여 용해시킨 후 Nano-LC electrospray ionization (ESI) quadrupole time-of-flight (Q/TOF) mass spectrometer (Micromass QTOF II, Micromass)을 이용하여 분석하였고, MASCOT program (Matrix Science)을 이용한 펩타이드 서열 확인 후 NCBI에서 제공하는 rodent database를 이용하여 CK-B 단백질임을 검증하였다.
실시예 3. 웨스턴 블로팅 (Western Blotting)을 이용한 CK-B 단백질 발현 확인
골수유래 대식세포 및 RAW264.7 대식세포주를 이용하여 파골세포 분화시기별 세포들을 용해한 후 세포 내 단백질을 얻었다. 용해액을 SDS-PAGE 젤을 이용하여 전기영동 후 1차 항체로 항 CK-B 항체 (Fitzgeral제품), 항 V-ATPase E subunit 항체 (Santa Cruz Biotechnology), 항 RhoA 단클론 항체 (Upstate, Temecula, CA) 및 항 actin 단클론 항체 (Sigma 제품)를 이용하여 웨스턴 블로팅을 실시하였다.
실시예 4. 역전사 중합효소연쇄반응 (RT-PCR analysis)에 의한 DNA 증폭 반응을 이용한 유전자 발현 확인
Trizol (Invitrogen 제품)을 이용하여 전체 세포 내 RNA를 추출한 후 cDNA를 합성하였고, thermal cycler (Perkin Elmer)에서 다음과 같은 조건으로 중합효소연쇄반응을 진행하여 CK-B 유전자의 발현 정도를 관찰하였다. 94℃에서 30초간 변성 단계 (denaturation), 58℃에서 1분간 상보결합단계 (annealing) 및 72℃에서 1분간 신장단계 (extention) 반응을 30-35회 반복하였고, 사용된 CK-B 프라이머의 염기서열은 5'-ATGCCCTTCTCCAACAGCCA-3'(forward) 및 5'-CGTGCCGCTCCTCAATAATG-3'(reverse)이었다.
실시예 5-1. CK-B 억제 염기 서열 확보
미국 GenScript사의 target finder 프로그램을 이용하여 accession number BC_015271 (Mus musculus creatine kinase, brain, mRNA (cDNA clone MGC:18576 IMAGE:4225384), complete cds)의 염기 서열 중 GC% 70%이하인 target 염기 서열을 확보하였다. Loop 염기서열로는 TTGATATCCG를 사용하여, 제한효소 절단부위 뒤에 sense 염기서열을 넣고 loop 염기서열, anti-sense 염기서열 및 terminal은 TTTTTTCCAA을 포함하도록 고안하였다.
실시예 5-2. shRNA 용 염기서열 및 발현 벡터 제작
CK-B 발현을 억제하기 위한 RNA 간섭 (interference)을 유도할 수 있도록 DNA target 부분과 small hairpin (sh) loop RNA 부분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 탑재되도록 벡터를 제작하였다. 즉, GC% 57.14%의 염기 서열인 5`- CCATCGAGAAGCTGGCAGTAG -3`(서열번호 2)을 sense siRNA 서열로 선택하고, 루프 서열은 5`- TTGATATCCG -3`로 하여 shRNA 서열을 5`- CCATCGAGAAGCTGGCAGTAGTTGATATCCGCTACTGCCAGCTTCTCGATGG -3`(서열번호 3)로 제작하 였다.
보다 구체적으로 진핵세포 발현용 및 레트로바이러스용으로는 BamHI 및 HindIII 제한효소 절단부위를 갖도록 제작하였고, 진핵세포용으로 제작한 염기서열을 2중 나선 DNA절편으로 만든 후 pRNA-U6.1/Neo (미국 GenScipt사) 벡터에 클로닝하여 재조합 벡터를 얻었다.
즉, 진핵세포 제작용 및 레트로바이러스 제작용으로는 5`-GGATCCCGCCATCGAGAAGCTGGCAGTAGTTGATATCCGCTACTGCCAGCTTCTCGATGGTTTTTTCCAAAAGCTT-3`(Forward; 서열번호 4) 및
3'-CCTAGGGCGGTAGCTCTTCGACCGTCATCAACTATAGGCGATGACGGTCGAAGAGCTACCAAAAAAGGTTTTCGAA-5' (Reverse; 서열번호 5) 를 사용하였다.
상기 염기서열을 레트로바이러스 발현용 pSUPER-retro-GFP/Neo vector (Oligoengine 제품)에 클로닝하여 shRNA plasmid를 제작하였다. 레트로바이러스를 복제할 수 있는 Plat-E 세포주에 유전자 이입한 후 세포외 부유액을 모아 사용하였다.
CK-B shRNA를 발현하는 아데노바이러스는 RNA 발현용 U6 promoter를 가진 RNAi-Ready-pSIREN-shuttle vector (Clontec 제품)에
5'-CGCCATCGAGAAGCTGGCAGTAGTTGATATCCGCTACTGCCAGCTTCTCGATGGTTTTTTCCAA-3`(Forward; 서열번호 6) 및
3`-GCGGTAGCTCTTCGACCGTCATCAACTATAGGCGATGACGGTCGAAGAGCTACCAAAAAAGGTT-5' (Reverse; 서열번호 7)을 클로닝한 후 I-CeuI/PI-SceI 제한효소로 절단하여 pAdeno-X vector (Clontech 제품)로 다시 클로닝함으로써 제작하였다. 완성된 아데노바이러스 발현용 pAdeno-CK-B-sh DNA 및 대조군 shRNA는 Fugene 6 (Roche 제품)를 이용하여 HEK 293 세포주에 유전자 이입 후 세포를 용해하여 CsCl 밀도구배 원심분리법에 의해 아데노바이러스를 얻어 정량 후 사용하였다.
실시예 6. 파골세포의 in vitro 골흡수 활성 분석
파골세포의 골흡수활성 정도를 분석하기 위하여 하기 과정을 거쳤다.
골수 유래 대식세포를 상아질절편 상에서 파골세포 분화 배양액으로 5일간 처리하여 생성된 파골전세포에 CK-B shRNA 레트로바이러스 및 대조군 Luc shRNA 레트로바이러스를 처리하였다. 24시간 후 다시 파골세포 분화 배양액을 처리하여 24시간 배양한 후 상아질 절편의 골흡수정도를 관찰하였다. 양성 대조군으로 Creatine Kinase (CK) 억제제인 cyclocreatine (Ccr, Sigma 제품)을 이용하였다. 상아질 절편에서 5일간 분화시킨 파골세포에 cyclocreatine을 0.5-1.5 mM 농도로 24시간 처리하여 관찰하였다. 또한, 다른 양성 대조군으로 CK-B 결손 마우스의 골수유래 세포를 이용하였는바, CK-B 결손 마우스의 골수유래 세포를 6일간 분화시켜 관찰하였다. 골흡수정도는 상아질 절편 표면의 세포들을 초음파분해 처리하여 없앤 후 1% toluidine blue 용액으로 염색하여 광학현미경 하에서 관찰하였으며, image analysis system (Image Pro-Plus, Media Cybernetics 제품)을 이용하여 정량화하였다.
실시예 7. 공초점 현미경 (Confocal microscopy)을 이용한 파골세포의 actin ring 구조 관찰
골수 유래 대식세포를 3일간 파골세포 분화 배양액에서 파골전세포로 분화시킨 후 CK-B shRNA 레트로바이러스를 처리하고 다시 파골세포 분화 배양액에서 40시간 배양하였다. 그 후 3.7% formaldehyde/PBS 용액으로 세포를 5분간 고정시킨 후 0.5% saponin 용액으로 20분간 처리하여 항체의 침입을 용이하게 하였다. 비특이적인 항체 결합반응을 방지하기 위해 2% BSA/PBS 용액을 처리한 후 actin에 결합하는 FITC-labeled phalloidin (Sigma 제품)을 처리하였다. 형광 이미지는 공초점 현미경 (LSM 5 PASCAL, Carl Zeiss 제품) 하에서 관찰하였으며, 전체 다핵성 세포의 수와 actin ring구조를 갖고 있는 다핵성 세포의 수를 측정한 후 actin ring 양성 세포의 비율을 측정하였다.
실시예 8. Rho 단백질 활성 분석
Rho 단백질 활성은 Pierce 사 (Rockford, IL)의 제품 및 방법을 사용하였다. 세포를 용해액 (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1% NP-40, 1 mM DTT, 5% glycerol, 1 g/ml leupeptin, 1 g/ml aprotinin, and 1 mM PMSF)으로 용해한 후 세포 부유액에 활성화된 RhoA 단백질과 결합하는 GST-rhotekin-RBD를 Immobilized Glutathione Disc 와 함께 4℃에서 2시간 동안 처리한 후 bead만을 모아 세정하고 5분간 가열하여 단백질 변성을 유도하였다. 추출된 단백질은 SDS-PAGE 젤 하에서 전기영동 한 후 nitrocellulose 막으로 이동시켜 항 Rho (Upstate 제품) 항체를 이용하여 웨스턴 블라팅을 실시하였다.
실시예 9. V-ATPase 활성 분석
파골세포의 V-ATPase 활성은 Na+/H+-exchanger 억제제인 EIPA [5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride를 처리한 상태에서 pH-sensitive probe인 BCECF (2',7'-bis(carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein)를 세포에 처리하여 세포내 pH (pHi) 변화를 측정함으로써 관찰하였다. 골수 유래 대식세포를 30-mm cover glass위에 올린 후 5일간 파골세포 분화 배양액 하에서 배양하여 성숙한 파골세포를 얻었고, CK-B 활성 억제에 따른 V-ATPase 활성 분석을 위해 사용하였다. 성숙한 파골세포에 1 mM 농도의 Ccr을 30분간 전처리 후 1 M 농도의 BCECF acetoxymethyl ester (BCECF-AM)를 37℃에서 30분간 처리하여 세포 내로 유입시키고, 다시 acid loading buffer (145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM NaH2PO4, 1 mM Na2SO4, 1.8 mM CaCl2, 30 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 10 mM glucose, 40 mM NH4Cl, pH 7.4) 용액에서 15분간 처리하였다. 다시 용액을 non-acid buffer (acid loading buffer missing NH4Cl)으로 대체한 후 5 M의 EIPA 유무에 따른 pHi변화를 Intracellular Ion Image System (Olympus 제품, IX71)을 이용하여 측정하였다. 495 nm 및 440 nm에서 0.5초 간격으로 측정된 형광도는 Metafluor Universal Imaging software를 이용하여 분석하였다. RhoA의 발현 억제에 따른 V-ATPase 활성 측정을 위해, 골수유래 대식세포를 다핵성 파골세포로 분화시킨 후 Lipofectamine 2000 (Invitrogen 제품)을 이용하여 RhoA siRNA oligonucleotide duplex (5'-CAUGUAGAGUUGGCUUUAUGGGACA-3') 혹은 negative control duplex (Invitrogen 제품)를 유전자이입시켰고, 파골세포 분화 배양액에서 1일간 배양한 후 V-ATPase 활성을 측정하였다.
실시예 10. 세포 내 ATP 농도 측정
세포 내 전체 ATP농도는 ENLITEN？ATP Assay System Bioluminescence Detection Kit (Promega 제품)을 이용하여 측정하였다. CK-B 결손 마우스 세포의 ATP농도를 측정하기 위해, 골수유래 대식세포를 분리하여 파골세포 분화 배양액에서 48시간 배양한 후 Glo-lysis buffer (Promega 제품)을 이용하여 세포를 융해하였다. 동량의 luciferinluciferase reaction buffer를 첨가하여 20℃에서 10분간 처리하였다가 LB 9501 Lumat luminometer (Berthold GmbH 제품)에서 luminescence를 측정하였다.
실시예 11. CK-B 결손 마우스 (knockout mice)
모든 동물 실험은 서울대학교 및 네델란드 Radboud University (Nijmegen) 동물실험윤리위원회의 승인 하에 국제적인 지침을 따라 수행하였다. 실험에 사용된 정상 및CK-B 결손 마우스는 25% 129/Ola 및 75% C57Bl/6 background간 교배로 얻은 F2 CK-B+/- 이형접합체 (heterozygotes) 를10-12 세대 교배를 통해 얻었다.
실시예 12. 마우스 및 랫 난소절제 (ovariectomy) 모델 동물을 이용한 in vivo 골흡수현상 분석
8주령 정상 및 CK-B 결손 마우스 (실험군 당 n=9) 혹은 12주령 Sprague-Dawley 랫 (실험군 당 n=5) 에서 난소절제 수술을 시행하였고, 난소절제를 하지 않고 수술처치만 시행한 동물의 경우 (sham operated), 대조군으로 사용하였다. 수술 4주 후 안락사시켜 대퇴골 및 경골을 적출한 다음 μ-CT 및 morphometric analysis로 골흡수정도를 관찰하였다. 랫의 경우 CK-B 억제에 따른 골흡수효과를 관찰하기 위해, 수술 후 3주째부터 Ccr (0.5 g/kg) 혹은 vehicle (0.005 N HCl) 용액을 gastric Zonde needle (Natsume 제품)을 이용하여 1주일에 2번씩 4주간 투여하였다. 생화학적 골흡수지표 측정을 위해, 소변의 DPD 농도를 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) kit (Pyrilinks, Metra Biosystems, Inc. 제품) 방법으로 측정하였고, QuantiChromTMCreatinine Assay Kit (BioAssay System 제품)을 이용하여 creatinine농도를 측정하여 정량적으로 나타내었다.
실시예 13. LPS 투여에 의한 골흡수모델 동물 분석
4주령 정상 및 CK-B 결손 마우스 (실험군 당 n=8)에 PBS 혹은 LPS (5 mg/kg) 를 4일 간격으로 2번 복강주사 하였고, 7일째 안락사시킨 후 대퇴골 및 경골을 추출하여 μ-CT 분석하고 bone mineral density (BMD)를 측정함으로써 골흡수정도를 관찰하였다.
실시예 14. PTH(부갑상선 호르몬) 투여에 의한 골흡수모델 동물 분석
지속적인 PTH 노출에 의한 골흡수유도를 위해 Alzet osmotic minipumps를 이용한 PTH 주입술을 시행하였다. 8주령 정상 ICR마우스 (n=5)에 인간 PTH (아미노산 1-84로 이루어진 펩타이드) 혹은 vehicle (PBS)를 시간당 0.5 μl로 방출되는 Alzet osmotic minipumps를 견갑골 사이 피하에 심어 5일간 4.3 pmol/h 속도로 PTH가 방출되게 유도하였다. CK 억제제의 효과를 관찰하기 위해 Ccr (0.5 g/kg) 혹은vehicle (0.005N HCl)를 gastric Zonde needle (Natsume 제품)을 이용하여 수술 1일째 및 3일째에 투여하였고, 5일째 안락사시킨 후 대퇴골 및 경골을 적출하여 μ-CT 및 조직학적 분석 방법을 이용하여 골흡수 정도를 관찰하였다.
실시예 15. 두개골 골흡수 모델 동물
두개골 in vivo 골흡수모델에서 CK-B shRNA 혹은 control shRNA 아데노바이러스 (1 ×1010 MOI/마우스)를 두개골 위에 피하 주사하여 전처리한 후 골흡수억제효과를 관찰하고자 하였다. 2일 후 PBS, IL-1α (2.5 μg) 단독 혹은 IL-1 (2.5 μg) 및 30 μl의 shRNA 아데노바이러스를 함께 처리한 collagen sheet (넓이, 100 mm2) 를 피하 두개골 중앙에 심었고 (n=5), 4일 후 두개골을 적출하여 μ-CT 분석을 통해 두개골의 골흡수정도를 관찰하였다.
실시예 16. Micro-CT를 이용한 방사선학적 분석, BMD(골밀도) 측정 및 조직 학적 분석
In vivo 골흡수정도를 관찰하기 위하여 대퇴골 및 경골을 포함하는 다리뼈, 발, 혹은 두개골을 적출하여 1072 Microtomograph (SkyScan 제품) system을 이용하여 전체 320~350 tomographic slices를 얻은 후 V-Works program (Cybermed 제품)을 이용하여 3차원적인 이미지로 재구성하였다. 다리뼈의 BMD는 dual-energy x-ray absorptiometry (DEXA) densitometry 인 Lunar PIXImus Densitometer (GE Medical Systems 제품)을 이용하여 측정하였다. 조직학적 분석을 위해 뼈를 4% formaldehyde/PBS 용액에서 고정하고, 탈회 및 탈수과정을 거쳐 파라핀에 포매 하였다. 4 mm 두께 절편을 얻어 파라핀 제거 및 탈수과정을 거친 후 hematoxylin 및eosin (H&E 염색) 용액으로 염색하고 파골세포 관찰을 위해 TRAP 염색을 시행하였다. 모든 결과는 Bioquant Bone Morphometry System (R&M Biometrics Corp. 제품, Nashville, TN)을 이용하여 다양한 지표 측정을 통해 골흡수정도를 분석하였다.
실시예 17. 통계처리 및 유의성 검증
모든 정량적 실험들은 최소 3회 이상 반복하여 결과를 얻은 후 평균값 표준오차로 나타내었으며, 결과의 통계적인 유의성 검증은 two-tailed Student t-test 방법에 의해 분석하였다.
RNA 발현 벡터에 CK-B 유전자의 발현을 억제하는 siRNA를 코딩하는 뉴클레오 타이드 서열을 삽입하여, 여기서 전사된 siRNA에 의해 CK-B의 발현을 억제함으로써 파골세포의 골흡수를 억제하는 벡터와 이의 응용방법에 관한 본 발명은 액틴 링 구조 형성, RhoA의 단백질의 형성, vATPase의 활성도 및 파골세포의 골흡수를 억제하여 골대사성 질환을 예방 및 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 siRNA 발현 벡터는 기존의 안티센스 올리고머나 바이러스 벡터에 비해 독성이나 부작용이 적은 반면 기존의 안티센스 올리고머보다 월등하게 우수한 효과를 내는 것으로 생각되어 항암 유전자 요법이나 줄기세포 분화 조절에 사용하는 경우 매우 우수한 안전성 및 효과가 있다.
도1은 RANKL에 의한 파골세포 분화 중의 CK-B 발현되는 정도를 나타낸 것이다.
(a) 분화 전후 (화살표) 세포 내 단백질들에 대한silver 염색된 2D gel 상의 CK-B 단백질 이미지 및 CK-B 단백질의 DLFDPIIEER peptide 서열을 포함하는 MS/MS profile 결과.
(b,c) 골수유래 대식세포 혹은 RAW264.7 세포에서 유래한 파골세포 분화 중 CK-B 단백질 발현 양상을 관찰한 웨스턴 블라팅 결과.
(d) 골수유래 대식세포에 M-CSF 및 RANKL을 처리하여 1~4일간 발현되는 CK-M mRNA 발현 양상. 근육 세포에서 추출한 RNA를 이용한 결과를 양성 대조군으로 사용하여 비교.
(e) 골수유래 대식세포를 이용한 파골세포 분화 중의 UbCKmit mRNA 발현 양상. 분화 4일째의 CK-B 발현 정도와 비교.
도2는 CK-B shRNA을 이용한 CK-B발현 억제 및 약리학적 활성 억제에 따른 파골세포 활성 억제 효과를 나타낸 것이다.
(a) 골수대식세포를 파골전세포로 분화시킨 후 shRNA 레트로바이러스를 24시간 처리에 의한CK-B 발현의 억제 확인. 대조군으로 luciferase shRNA (Luc-sh) 아데노바이러스 사용.
(b,c) 상아질 절편에서의 CK-B shRNA 레트로바이러스에 의한 파골세포 활성 억제 확인. 대조군으로 luc shRNA 레트로바이러 사용. *** P < 0.001 Luc-sh 대조군에 대한 CK-B-sh 처리군 억제효과 유의성.
(d) 세포 독성이 없는 농도의 CK 억제제인 cyclocreatine (Ccr)에 의한 골흡수활성 감소 효과.
(e) CK-B shRNA 레트로바이러스 처리에 의한 파골세포의 actin ring 형성에 미치는 영향을 FITC-phalloidin 염색 후 공초점 현미경하에서 관찰. 전체 다핵성 세포의 수에 대한 actin ring을 갖고 있는 다핵성 세포의 비율로 표시. ** P < 0.01 Luc-sh 처리군과 비교한 CK-B-sh 처리군의 유의성.
(f) 파골세포의 RhoA 활성에 대한 Ccr 억제 효과. 골수유래 대식세포를30 ng/ml의 M-CSF 및 100 ng/ml의 RANKL가 들어있는 파골세포 분화 배양액으로 분화시킨 파골세포에 1시간 동안 Ccr 처리 후 Rho 활성 분석 (왼쪽 그림). 또는 파골세포를 혈청이 없는 상태에서 3시간 처리하는 동안 마지막 45분간 Ccr을 처리하고, 100 ng/ml의 M-CSF 및 500 ng/ml의 RANKL로 15분간 처리한 후 Rho 활성 분석 (오른쪽 그림)을 위해 GTP 결합된 활성화 형태의 RhoA 관찰.
(g) Ccr에 의한 파골세포의 V-ATPase 활성 억제. 골수유래 대식세포로부터 분화된 파골세포에 30분간 Ccr을 처리한 후 EIPA (Na+/H+ exchanger 억제제) 처리한 조건 하에서 pHi 조절 반응을 관찰함으로써 V-ATPase 활성 측정. Non-acid buffer 용액으로 교환하는 시점을 화살표로 표시.
(h,i) siRNA에 의한 RhoA 발현 억제에 따른 파골세포의 V-ATPase 활성 억제.
도3은 CK-B 결손에 의한 in vitro 및 in vivo 골흡수활성 차이를 분석한 것이다.
(a) 정상 및 CK-B 결손 마우스의 파골세포에서의 CK-B 발현 정도를 관찰한 웨스턴 블라팅 결과.
(b,c) 정상 및 CK-B 결손 마우스의 골수유래 대식세포로부터 분화된 파골세포의 in vitro 골흡수활성을 상아질 절편에서 관찰. 상아질 절편을 toluidine blue 용액으로 염색한 후 흡수된 면적을 측정. *** P < 0.001 정상 파골세포 대비 CK-B결손 파골세포의 활성에 대한 유의성.
(d) 정상 및 CK-B 결손 마우스를 이용하여 분화시킨 파골세포에서 RhoA 단백질 활성 측정. 감소된 RhoA 활성을 보이는 CK-B 결손 파골세포.
(e) 정상 파골세포에 비해 V-ATPase 활성이 감소되어 있는 CK-B 결손 파골세포. (f) 동일한 V-ATPase 단백질 발현을 나타내는 정상 및 CK-B 결손 파골세포.
(g) 정상 및 CK-B 결손 마우스의 골수유래 대식세포를 30 ng/ml의 M-CSF 단독 혹은 30 ng/ml의 M-CSF와 100 ng/ml의 RANKL을 동시에 처리하여 세포 내 ATP 농도 측정 결과.
(h-q) 난소절제모델 동물의 골다공증에 미치는 CK-B의 영향. 정상 및 CK-B 결손 마우스를 난소절제 시술하여 4주 후 난소절제 시술 없이 수술 처리만 한 마우스와 비교 관찰. 대퇴골을 이용한 m-CT 분석결과 (h-l) 및 골흡수정도를 나타내는 지표 분석 결과 (m-p). 경골에서의 H-E (m, 위 그림) 및 TRAP (m, 아래 그림) 염색 을 통한 조직학적 분석 결과. 소변 내 DPD 측정 결과, 난소절제 정상 마우스에 비해 감소된 골흡수활성을 나타내는 난소절제 CK-B 결손 마우스 (q). BV/TV, 조직 부피 당 뼈의 부피; Tb.Th, 해면골 두께; Tb.Sp, 해면골간 거리; Th.N, 해면골 수; Oc.N/B.Pm, 뼈둘레 당 파골세포 수; ES/BS, 뼈 표면 당 흡수된 표면. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 표시된 실험군간 유의성. NS, 유의성 없음.
(r-t) LPS에 의한 뼈흡수에 미치는 CK-B의 역할. 정상 및 CK-B 결손 마우스에 PBS 혹은 LPS (5 mg/kg)를 2회 주사. CK-B 결손 마우스에서 감소된 뼈손실을 보이는 대퇴골의 m-CT 분석 결과의 횡단면 (r, 위 그림) 및 3차원 이미지 (r, 아래 그림). LPS에 의해 유의한 뼈손실 유도를 보이는 정상 마우스에 비해 감소되어 있는 CK-B 결손 마우스의 BV/TV (s) 및 BMD (t). * P < 0.05, ** P < 0.01 표시된 실험군간 유의성. NS, 유의성 없음.
도4는 CK 억제제에 의한 랫 및 마우스의 뼈파괴 억제 효과를 나타낸 것이다.
(a-e) 랫의 난소절제에 따른 뼈손실에 미치는 CK 억제제 Ccr의 영향. 수술처치만 한 랫과 난소절제를 시행한 랫에 vehicle 혹은 Ccr (0.5 g/kg)을 4주간 투여. 감소된 뼈손실을 보이는 Ccr 투여 난소절제 랫 대퇴골의 m-CT 분석 결과 (a). Ccr 투여에 의해 감소된 경골 뼈 파괴 정도를 보이는 골흡수지표 분석 결과 (b-d). Ccr 투여에 의한 소변 내 DPD의 감소 (e). * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 표시된 실험군간 유의성.
(f-i) PTH 투여에 의한 뼈손실 마우스에서의 Ccr투여에 따른 in vivo 효과. ICR 마우스에 지속적으로 PTH (1-84)를 5일간 투여하는 동안 Ccr 및 vehicle을 각각 0일째 및 3일째 2회 투여. Ccr에 의해 감소된 뼈손실을 보이는 경골의 조직학 표본에 대한 골흡수지표 분석. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 표시된 실험군간 유의성.
(j and k) in vivo 뼈흡수에 미치는 CK-B shRNA의 영향. CK-B shRNA 혹은 대조군 shRNA를 PSB 혹은 IL-1과 조합하여 collagen sheets에 적신 후 마우스 두개골에 처리. 5일 후 μ-CT 분석에 따른 두개골의 3차원 이미지 (j) 및 BV/TV (k). * P < 0.05, ** P < 0.01 표시된 실험군간 유의성.
(l) 파골세포의 골흡수활성에 관여하는 CK-B 단백질에 의한 ATP 공급의 중요성을 나타내는 모식도. RANKL에 의한 파골세포 분화시 증가되는 CK-B는 RhoA 및 V-ATPase 활성 및 세포 내 골격을 이루는 actin 조절에 관여한다. 따라서, 파골세포에서 RhoA 활성 및 actin 구조는 sealing zone 형성에 중요하고, V-ATPase 활성은 뼈흡수가 일어나고 있는 lacuna 구조 내에 산성화를 촉진함으로써 뼈기질의 분해에 중요한 역학을 담당한다. 결과적으로, V-ATPase 활성이 RhoA 및 actin에 의해 간접적으로 조절될 가능성이 있으며, 이러한 과정은 CK-B에 의해 조절되고 있음을 제시한다.
도5는 CK-B 단백질의 분석된 펩타이드 서열. 10개의 펩타이드 서열 (붉은 색으로 표시)을 tandem mass spectrometry를 이용하여 확인함으로써 CK-B 단백질임을 확인한 것이다.
도6은 Ccr이 파골세포의 생존에 영향을 주지 않는다는 것을 나타낸 것이다.
골수유래 대식세포를 상아질 절편 상에서 30 ng/ml의 M-CSF 및 100 ng/ml의 RANKL을 5일간 처리하여 파골세포로 분화 유도하고 이 시기의 파골전세포 혹은 작은 다핵성 파골세포에 Ccr을 표기된 농도로 24시간 처리하였다. 세포의 생존 측정은 MTT 분석을 변형한 방법인 Cell Counting Kit (Dojindo 제품, Japan)을 이용하여 실시하였다. 측정된 Y 축의 OD값은 살아있는 세포의 수를 표기.
도7은 Actin 구조에 미치는 Ccr의 영향을 나타낸 것이다.
골수유래 대식세포를 30 ng/ml의 M-CSF 및 100 ng/ml의 RANKL을3일간 처리하여 융합 직전의 파골전세포로 분화 유도.
(a,b) 파골전세포에 Lipofectamine 2000 (Invitrogen 제품)을 이용하여 CK-B anti-sense (5'-AGUCAGCCUAGUCCGAUAGCGCUAU-3' 혹은 scrambled (5'-GUGUCUGCAACAGCUUAGCCAUCAG-3' oligonucleotide를 30 ng/ml의 M-CSF가 있는 상태에서 16시간 유전자 이입. 24시간 후 30 ng/ml의 M-CSF 및 100 ng/ml의 RANKL으로 24시간 추가 배양 후 FITC-conjugated phalloidin으로actin 염색. 전체 파골세포 중actin ring 구조를 갖는 다핵성 파골세포의 수 측정. ** P < 0.01 대조군인 scramble 처리군과 비교한 anti-sense oligonucleotide 처리군의 유의성. 바 크기, 200 mm.
(c) 파골전세포에 30 ng/ml의 M-CSF 및 100 ng/ml의 RANKL 처리한 상태에서 24시간 동안 0.1-1.5 mM 농도의 Ccr 처리 후 FITC-phalloidin 으로 actin 염색. ** P < 0.01, *** P < 0.001 대조군과 비교한 Ccr 처리군의 유의성.
(d) 골수유래 대식세포를 30 ng/ml의 M-CSF 및 100 ng/ml의 RANKL을 5일간 처리하여 분화시킨 파골세포에 1 mM 농도의 Ccr을 3시간 동안 처리 후 FITC-phalloidin으로 actin 염색. 바 크기, 200 mm.
도8은 파골세포에서의 V-ATPase 특이적인 활성 확인한 것이다.
(a) Na+/H+-exchanger 억제제인 5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA) 처리 유무 (왼쪽 및 오른쪽 그림)에 따른 조골세포에서의 세포 내 pH (pHi) 조절 활성. (b) 분화 전 전구세포인 골수유래 대식세포에서의 세포 내 pH (pHi) 조절 활성. (c) pHi recovery activity was assessed in differentiated OCs in the presence of EIPA 및 V-ATPase 특이억제제인 bafilomycin A 혼합 처리 유무에 따른 파골세포에서의 세포 내 pH (pHi) 조절 활성. 100 nm 농도의 bafilomycin A 처리시 세포 내 pH (pHi) 조절 활성 억제. Non-acid buffer 용액으로 교환하는 시점을 화살표로 표시.
도9는 CK-B 결손에 따른 파골세포의 흡수 면적 감소함을 나타낸 것이다.
정상 및 CK-B 결손 마우스의 골수유래 대식세포에 30 ng/ml의 M-CSF 및 100 ng/ml의 RANKL을 6 일간 처리하여 분화시킨 후 TRAP 염색하여 다핵성 파골세포의 수를 측정하였다. 흡수 정도는 toluidine blue 염색 후 흡수된 면적을 측정하여 파골세포당 흡수 면적으로 표시하였다. ** P < 0.01 정상 파골세포에 비교한 CK-B 결손 파골세포의 유의성.
도10은 정상 및 CK-B 결손 파골세포에서의 actin ring 형성 비교를 나타낸 것이다.
정상 및 CK-B 결손 마우스의 골수유래 대식세포에 30 ng/ml의 M-CSF 및 100 ng/ml의 RANKL을 6 일간 처리하여 분화시킨 후 FITC-phalloidin 염색하여 공초점 현미경하에서 actin ring 구조 관찰하였다. * P < 0.05 정상 파골세포에 비교한 CK-B 결손 파골세포의 유의성.
도11은 PTH에 의한 뼈손실에서의 CK-B 역할을 나타낸 것이다. 8주령 정상 및 CK-B 결손 마우스 (n=5)에 Alzet osmotic minipump를 이용하여 5 일간 지속적으로 PTH 노출 유도하였다.
(a) 대퇴골의 μ-CT 분석 및 (b-g)경골 조직표본에서의 골흡수지표 분석을 통해 감소된 뼈손실을 보이는 CK-B 결손 마우스. BV/TV, 조직 부피 당 뼈의 부피; Th.N, 해면골 수; Tb.Th, 해면골 두께; Tb.Sp, 해면골간 거리; ES/BS, 뼈 표면 당 흡수된 표면; Oc.N/B.Pm, 뼈둘레 당 파골세포 수. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 표시된 실험군간 유의성. NS, 유의성 없음.
도12는 난소절제에 의한 뼈파괴에 대한 Ccr의 억제효과를 나타낸 것이다.
수술처치만 시행한 실험군 및 난소절제된 랫에 vehicle 혹은 Ccr (0.5 g/kg)을 4주간 구강투여하고 경골 조직표본에서의 골흡수지표 분석하였다. Tb.Th, 해면골 두께; Tb.Sp, 해면골간 거리; Th.N, 해면골 수. *** P < 0.001 표시된 실험군간 유의성.
도13은 PTH에 의한 뼈손실에 대한 Ccr의 억제효과를 나타낸 것이다.
(a) 8주령 ICR 마우스 (n=5)에 Alzet osmotic minipump를 이용하여 5 일간 지속적으로 PTH 노출 유도하면서 vehicle 혹은 Ccr (0.5 g/kg)을 0일째 및 3일째 구강투여.
(b,c) 대퇴골의 μ-CT 분석 및 경골 조직표본에서의 골흡수지표 분석을 통해 감소된 뼈손실을 보이는 Ccr 투여 마우스. Tb.Th, 해면골 두께; Tb.Sp, 해면골간 거리. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 표시된 실험군간 유의성. NS, 유의성 없음.
도14는 LPS 및 CIA 유도 뼈파괴에 대한 Ccr의 억제효과를 나타낸 것이다.
(a,b) 마우스에 PBS 혹은 LPS (5 mg/kg)를 0일째 및 4일째에 복강투여 하였고, vehicle 혹은 Ccr (0.5 g/kg)은 0일째, 2일째 및 5일째에 함께 복강투여 한 후 7일째 대퇴골을 적출하여 μ-CT 분석. LPS 투여에 의한 뼈파괴에 대해 억제효과를 나타내는Ccr 투여군의 대퇴골 횡단면 (왼쪽 그림) 및 종단면 (오른쪽 그림) 이미지 및 BV/TV 결과. * P < 0.05, ** P < 0.01 표시된 실험군간 유의성.
(c-e) 보조결과 방법에 따라 CIA 조건을 유도한 후 vehicle 혹은 Ccr 투여군의 관절부위를 포함한 발에 대한 μ-CT 분석 결과 (c). 대퇴골의 H-E 염색 결과 (d) 및 BV/TV 결과 (e). ** P < 0.01 표시된 실험군간 유의성.
도15는 CK-B shRNA 아데노바이러스에 의한 CK-B 발현 억제 결과를 나타낸 것이다.
골수유래 대식세포에서 파골전세포로 분화 유도 후 CK-B shRNA 아데노바이러스를 이용하여 유전자이입하고 24시간 후 30 ng/ml의 M-CSF 및 100 ng/ml의 RANKL을 처리하여 파골세포로 분화 유도하였다. 분화된 파골세포를 융해하여 항 CK-B 항체를 이용하여 웨스턴 블라팅 수행한 결과를 나타낸 것이다. 대조군으로 GFP shRNA를 사용하였다.
도16은 IL-1α에 의한 in vivo 두개골 뼈흡수에 미치는 CK-B의 효과를 나타낸 것이다. 4주령 정상 및 CK-B 결손 마우스의 두개골 (n=5) 에 PBS 혹은 IL-1α을 처리한 collagen sheets를 넣어 골흡수를 유도하였다.
(a) 5일 후 μ-CT 분석한 3차원 이미지 및 (b) BV/TV . *** P < 0.001 표시된 실험군간 유의성.
도17은 shRNA를 발현하는 벡터를 나타낸 것이다. 초록색으로 밑줄 그은 부분 은 제한효소 절단부위이며 초록색 화살표는 shRNA를 코딩할 뉴클레오타이드가 삽입되는 영역을 표시한 것이다.
(a)는 진핵세포 발현용 벡터, (b) 레트로바이러스 발현용 벡터, (c) 아데노바이러스 발현용 벡터를 나타낸 것이다.
<110> Seoul national university indusrtry foundation <120> Anti-osteoclast mediated bone resorption siRNA vector for gene therapy <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1498 <212> RNA <213> Mus musculus creatine kinase, brain, mRNA <400> 1 gcacaggcau ccaucgcccc ugcuucgucc ggcaucccgc ccgcugccgc cgccaugccc 60 uucuccaaca gccauaauac gcagaagcug cgcuucccgg ccgaggauga guucccugau 120 cugagcagcc acaacaacca uauggccaag gugcugaccc cggagcugua cgccgagcuc 180 cgugccaagu gcacgccgag cggcuuuacu uuggacgacg ccauucagac uggcguagac 240 aauccgggcc acccguacau caugacugug ggugcagugg cgggcgacga ggagaguuac 300 gacguauuca aggaccucuu cgaccccauu auugaggagc ggcacggcgg cuaccagccc 360 agugaugagc acaagaccga ccucaaccca gacaaccugc aggguggcga ugaccuggac 420 cccaacuacg ugcugagcuc gcgagugcgc acaggccgca gcauccgcgg cuucugucuc 480 cccccgcacu gcagccgcgg ggagcgccgc gccaucgaga agcuggcagu agaagcucug 540 uccagccuag auggcgaccu gucuggcagg uacuacgcgc ucaagagcau gacugaggcg 600 gagcagcagc agcucauuga cgaccacuuc cucuucgaua agccuguguc gccucugcug 660 cuggccuccg gcauggcccg cgacuggccg gaugcucgug gcauauggca caaugacaau 720 aagacuuucc ugguguggau uaacgaggag gaccaccugc gagucaucuc caugcagaag 780 gggggcaaca ugaaggaagu guucacccga uucugcaccg gccucacuca gaucgaaacu 840 cucuucaagu ccaagaacua ugaguucaug uggaauccuc accugggcua cauccucaca 900 ugcccaucca accugggcac cggacugcgg gcaggugugc acaucaagcu gccccaccug 960 gggaagcacg agaaguucuc ggaggugcuc aagcggcugc ggcuucagaa gcgaggcaca 1020 gguggcgugg acaccgcugc ugucgguggg guguuugaug ucuccaacgc ugaccgccug 1080 ggcuucucgg agguggaacu ggugcagaug gugguggacg gagugaaacu acucauugag 1140 auggagcaac ggcucgagca gggucaggca aucgaugacc ucaugccggc ccagaaguga 1200 agccuggccc ucgccaccau caggcugccg cuuccuaacu uauuacccgg gcagugcccg 1260 ccaugcaucc uugauguuug ccgccuggcg gcugagcccu uagccucgcu guagagacuu 1320 cugucgcccu ggguagaguu uauuuuuuug auggcuaagc uguugcugac acugaaaaua 1380 aacuaggguu uggccugccc uaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1440 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1498 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> sense siRNA sequence interfering CK-B gene <400> 2 ccatcgagaa gctggcagta g 21 <210> 3 <211> 52 <212> DNA <213> shRNA sequence interfering CK-B gene <400> 3 ccatcgagaa gctggcagta gttgatatcc gctactgcca gcttctcgat gg 52 <210> 4 <211> 76 <212> DNA <213> forward shRNA(or shRNA retrovirus) sequence for CK-B gene <400> 4 ggatcccgcc atcgagaagc tggcagtagt tgatatccgc tactgccagc ttctcgatgg 60 ttttttccaa aagctt 76 <210> 5 <211> 76 <212> DNA <213> reverse shRNA(or shRNA retrovirus) sequence for CK-B gene <400> 5 cctagggcgg tagctcttcg accgtcatca actataggcg atgacggtcg aagagctacc 60 aaaaaaggtt ttcgaa 76 <210> 6 <211> 64 <212> DNA <213> forward shRNA adenovirus sequence for CK-B gene <400> 6 cgccatcgag aagctggcag tagttgatat ccgctactgc cagcttctcg atggtttttt 60 ccaa 64 <210> 7 <211> 64 <212> DNA <213> reverse shRNA adenovirus sequence for CK-B gene <400> 7 gcggtagctc ttcgaccgtc atcaactata ggcgatgacg gtcgaagagc taccaaaaaa 60 ggtt 64 <210> 8 <211> 527 <212> DNA <213> U6 promoter <400> 8 ccccagtgga aagacgcgca ggcaaaacgc accacgtgac ggagcgtgac cgcgcgccga 60 gcccaaggtc gggcaggaag agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg 120 atacaaggct gttagagaga taattagaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt 180 acaaaatacg tgacgtagaa agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg 240 ttttaaaatg gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt 300 atatatcttg tggaaaggac gaaacaccgt gctcgcttcg gcagcacata tactaaaatt 360 ggaacgatac agagaagatt agcatggccc ctgcgcaagg atgacacgca aattcgtgaa 420 gcgttccata tttttacatc aggttgtttt tctgttttta catcaggttg tttttctgtt 480 tggttttttt tttacaccac gtttatacgc cggtgcacgg tttacca 527 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> T7 promoter <400> 9 taatacgact cactataggg 20

Claims (15)

  1. 서열번호 8 또는 서열번호 9의 siRNA(short interfering RNA)의 발현을 개시할 수 있는 프로모터 및 서열번호 1의 CK-B(brain-type creatine kinase) mRNA의 일부에 상보적인 서열을 포함하며 CK-B 유전자의 발현을 억제하는 siRNA를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 전사 방향으로 연결하여 포함하는 CK-B 유전자 억제 siRNA 발현 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 CK-B(brain-type creatine kinase) mRNA의 일부는 서열번호 1의 CK-B mRNA 서열 중 512~532 nt에 해당하는 뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 CK-B 유전자 억제 siRNA 발현 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 상기 siRNA를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1의 CK-B mRNA 서열 중 512~532 nt에 해당하는(corresponding) 서열번호 2의 서열과 서열번호 2에 역상보적 (reverse complementary) 서열이 동일한 가닥(strand)에 모두 존재하는 것을 특징으로 하는 CK-B 유전자 억제 siRNA 발현 벡터.
  4. 제3항에 있어서, 상기 siRNA를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1의 CK-B mRNA 서열 중 512~532 nt에 해당하는(corresponding) 서열번호 2의 서열 및 서열번호 2에 역상보적 (reverse complementary) 서열 사이에 헤어핀(hairpin) 구조를 형성하게 하는 루프(loop) 서열이 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 CK-B 유전자 억제 siRNA 발현 벡터.
  5. 제4항에 있어서, 상기 siRNA를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 CK-B 유전자 억제 siRNA 발현 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 상기 CK-B 유전자 억제 siRNA 발현 벡터는 서열번호 3의 염기 서열을 갖는 뉴클레오타이드가 서열번호 8의 염기서열을 갖는 U6 프로모터 다음에 전사 방향으로 삽입되어 제조되는 것을 특징으로 하는 도17a의 개열지도를 갖는 pRNA-U6.1/Neo.
  7. 제5항에 있어서, 상기 CK-B 유전자 억제 siRNA 발현 벡터는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 뉴클레오타이드가 서열번호 9의 염기서열을 갖는 T7 프로모터 다음에 전사 방향으로 삽입되어 제조되는 것을 특징으로 하는 도17b의 개열지도를 갖는 pSUPER-retro-GFP/Neo.
  8. 제5항에 있어서, 상기 CK-B 유전자 억제 siRNA 발현 벡터는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 뉴클레오타이드를 서열번호 8의 염기서열을 갖는 U6 프로모터 다음에 전사 방향으로 삽입되어 제조된 RNAi-Ready-pSIREN-shuttle vector로부터 제한효소로 절단하여 수득한 유전자 단편을 삽입하여 제조되는 것을 특징으로 하는 도17c의 개열지도를 갖는 pAdeno-CK-B-sh DNA.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 CK-B 억제 siRNA 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  10. 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 CK-B 유전자 억제 siRNA.
  11. 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열과 이와 루프 영역으로 연결된 서열번호 2에 역상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 헤어핀 구조의 CK-B 유전자 억제 shRNA.
  12. 서열번호 1로 전사(transcription)되는 CK-B(brain-type creatine kinase) 유전자의 발현 또는 그 발현 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 파골세포의 골흡수 억제용 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 CK-B 유전자의 발현 억제제는 제1항 내지 제8항 중에서 선택된 어느 한 항의 CK-B 유전자 억제 siRNA 발현 벡터 또는 제10항의 CK-B 유전자 억제 siRNA 또는 제11항의 CK-B 유전자 억제 shRNA인 것을 특징으로 하는 파골세포의 골흡수 억제용 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 상기 CK-B 단백질의 활성 억제제는 싸이클로크리에틴(Ccr;cyclocreatine)인 것을 특징으로 하는 파골세포의 골흡수 억제용 조성물.
  15. 다음 단계를 포함하는 파골세포의 골흡수 억제제 스크리닝 방법:
    (1) CK-B 단백질을 발현하는 동물세포에 임의의 약제를 처리하는 단계;
    (2) 상기 동물세포를 약제를 처리하지 않은 대조군과 비교하여 CK-B 단백질의 발현 또는 활성이 감소되는지 여부를 결정하는 단계.
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