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KR101118481B1 - 항-ｔｎｆ 처리와 병용된 체외 광분리반출법 - Google Patents

항-ｔｎｆ 처리와 병용된 체외 광분리반출법 Download PDF

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KR101118481B1
KR101118481B1 KR1020040110878A KR20040110878A KR101118481B1 KR 101118481 B1 KR101118481 B1 KR 101118481B1 KR 1020040110878 A KR1020040110878 A KR 1020040110878A KR 20040110878 A KR20040110878 A KR 20040110878A KR 101118481 B1 KR101118481 B1 KR 101118481B1
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gvhd
ecp
tnfα
cell
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그레고리데이빗
캠벨킴
길스-코마질
해리먼그레고리
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테라코스, 인크.
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Abstract

자가면역 질환, 아토피 질환, 이식 거부반응 또는 GVHD를 치료하거나 이의 하나 이상의 증상을 개선시키는 방법은 병용 치료요법의 사용을 포함한다. 상기 치료요법은 환자에게 체외 광분리반출법을 실시하고 TNFα 길항제를 투여함을 포함한다.
체외 광분리반출법, TNFα 길항제, 병용 치료요법, 자가면역 질환, 아토피 질환, 이식 거부반응, 이식편 대 숙주 질환

Description

항-ＴＮＦ 처리와 병용된 체외 광분리반출법{Extracorporeal photopheresis in combination with anti-TNF treatment}
본 발명은 면역 관련 질환의 치료에 관한 것이다.
자가면역 질환은 자가 조직에 대해 반응성인 면역세포의 부적절한 활성화를 포함한다. 이러한 활성화된 면역세포는 상기 질환의 병리상태에 관여하는 사이토킨과 자가항체의 생산을 촉진한다. T-세포가 관여하는 기타 질환에는 이식과 관련하여 발생하는 이식편 대 숙주 질환(GVHD)이 포함된다. GVHD에서, 공여자 T-세포는 수용자의 신체에 대한 공격을 개시함으로써 수용자의 조직과 기관을 거부한다. 다수의 질환은 숙주 면역계의 조절이상과 연루되어 있다. 일부는 약제로, 일부는 생물제제로, 다른 그룹은 체외 광분리반출법(extracorporeal photopheresis)으로 가장 잘 치료되지만, 여전히 또 다른 그룹의 치료 선택권은 매우 제한된다.
체외 광분리반출법(ECP)은 특정 T-세포 매개성 질환에서 효과적인 치료요법인 것으로 나타났다. GVHD의 경우, 광분리반출법은 국소 트리암시놀론 연고, 항진균제, 항바이러스, 항생제, 면역글로불린 및 메토트렉세이트와 함께 치료법으로서 사용되어 왔다. ECP는 또한 cGVHD 및 불응기 cGVHD의 경우에 미코페놀레이트 모페틸, 타크롤리무스, 프레드니손, 사이클로스포린, 하이드록시클로로퀸, 스테로이드, FK-506 및 탈리도미드와 같은 면역억제제와 함께 사용되어 왔다. 실질 기관 이식의 경우, ECP는 신장 동종이식편 및 심장 이식체와 관련된 다수의 급성 동종이식편 거부 에피소드를 감소시키기 위해 면역억제제와 병용되어 왔다. 예를 들어, ECP는 급성 신장 이종이식편 거부반응을 역전시키기 위해 OKT3 및/또는 면역억제제 프레드니손, 아자티오프린 및 사이클로스포린과 함께 사용되어 왔다. ECP는 또한 급성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 비호지킨 림프종 또는 중증 무형성 빈혈에 대한 동종 골수 이식의 경우 사이클로포스파미드, 전신 방사선 분할조사 및 에토포시드와 함께 사용되어 왔다.
통상적인 ECP와 다른 치료제의 병용에도 불구하고, 기존의 치료제가 심각한 부작용을 가질 수 있거나 치료제가 자체적으로 전달되는 수준에서는 투여되기가 어렵기 때문에 더이상 효과적이지 않은 경우, 면역 매개성 질환, 아토피 과민성 또는 GVHD를 앓는 환자를 치료하기 위해 ECP와 동시 제제의 병용이 여전히 요구된다.
단핵구 및 대식세포는 내독소 또는 기타 자극에 반응하여 사이토킨으로서 종양 괴사 인자(TNF-α)를 분비한다. TNF-α는 17kD 단백질 서브유닛의 가용성 동종삼량체이다. 단핵구 또는 대식세포 이외의 세포도 TNF-α를 생산한다. 예를 들어, 사람 비-단핵구 종양 세포주가 TNF를 생산한다. TNF-α는 염증 질환, 자가면역 질환, 바이러스, 세균 및 기생충 감염, 악성종양 및/또는 신경퇴행성 질환에 연루되어 왔으며, 류마티스 관절염 및 크론(Crohn)병과 같은 질환에서 특수한 생물학적 치료요법에 유용한 표적이다. 치료제로서 항체의 투여에는 문제가 없지 않았다. 예를 들어, TNF-α-길항제의 사용은 일부 경우에 중증 감염의 발생에 기여하였다. 이러한 물질의 용량을 감소시키면 치료의 합병증이 감소될 것이다.
관절염 치료를 위해 메토트렉세이트(MTX)와 배합된 인플릭시마브 및 에타네르셉트와 같은 TNF 길항제의 성공적 사용이 보고된 바 있으며, 이들 제제 중 몇가지는 현재 이의 사용이 규제기관에 의해 승인되어 있다. 이들 제제는 관절염 치료에 대한 약진적 진보이지만, 다양한 이유로 이들 제제에 반응하지 않거나 미약하게 반응하는 사실상 소수의 환자가 있다. 류마티스 관절염 환자의 경우에 곤란한 치료 문제는 여전히 남아있다. 많은 현행 치료법은 부작용 발생율이 높거나 질환 진행을 완전히 예방하지 못한다. 메토트렉세이트, 스테로이드 및 기타 화학치료제와 같은 제제가 류마티스 관절염을 포함한 각종 면역학적 질환의 치료에서 오래 동안 사용된 역사를 갖고있다 해도, 이들 화합물을 사용한 환자들은 간, 폐, 신장 및 골수 비정상과 같은 주요 독성 효과를 가질 수 있다. 이들 화합물을 사용한 환자들은 또한 구내염, 권태감, 오심, 설사, 두통 및 경미한 탈모증과 같은 사소한 부작용을 가질 수도 있으나, 이들 환자를 엽산염 보충으로 치료할 수 있다. 따라서, 현재 승인된 제품 이외에 TNF 길항제를 이용한 보다 안전한 관절염용 치료법이 요구된다.
발명의 요약
제1 양태에서, 본 발명은 유효량의 세포사멸성(apoptotic) 세포와 TNFα 길항제를 병용하여 자가면역 질환 또는 반응, 아토피 질환, GVHD 또는 이식 거부반응을 앓는 피험자를 치료하기 위한 방법이다.
다른 양태에서, 본 발명은 이식체 공여자 및/또는 이식체 수용자 또는 임플란트(implant) 수용자를 이식 전에 체외 광분리반출법과 TNFα 길항제를 병용하여 처리하는 방법이다.
또 다른 양태에서, 이식체 공여자는 이식체를 수거하기 전에 체외 광분리반출법과 TNFα 길항제를 병용하여 처리된다. 또 다른 양태에서, 이식체 수용자는 이식체를 수용한 후에 추가로 처리된다.
또 다른 양태에서, 임플란트 수용자는 임플란트를 수용하기 전에 체외 광분리반출법과 TNFα 길항제를 병용하여 처리된다. 임플란트 수용자는 임플란트를 수용한 후에 추가로 처리될 수 있다.
또 다른 양태에서, ECP에서 사용되는 광활성화가능한 화합물은 프소랄렌 또는 프소랄렌 유도체이다.
본 발명의 방법은 TNFα억제제의 용량을 저하시키고(이로써 독성을 완화시키고), 주입 사이의 시간을 연장시키고, 세포 처리(예: ECP) 및 TNFα억제제 둘다의 효능을 증가시킴으로써 GVHD 및 기타 면역 관련 질환용 치료를 개선시킨다.
발명의 상세한 설명
본 설명에서 인용된 모든 참조문헌은 이의 전문이 본원에서 참조로 인용된 다. "피험자" 또는 "환자"란 용어는 상호교환적으로 사용되며 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 사람을 의미한다.
"세포 집단"은 일반적으로 혈중에서 발견되는 세포 유형을 포함한다. 상기 용어는 혈액 세포, 구체적으로는 적혈구, 혈소판 및 백혈구 중 하나 이상의 유형을 포함한다. 세포 집단은 백혈구, 예를 들어, T-세포, 수지상세포, B-세포 등의 아형을 포함할 수 있다. 하나의 양태에서, 세포 집단은 세포 유형의 혼합물 또는 혼주물(pool)을 포함할 수 있다. 대안으로, 세포 집단은 세포, 예를 들어, T-세포 또는 수지상 세포의 실질적으로 정제된 유형을 포함할 수 있다.
"ECP 과정" 또는 "ECP"는 체외 광요법으로서도 공지된 체외 광분리반출법을 의미한다. 이는 UVA 광 및 광활성화가능한 화합물에 도입된 세포 집단의 처리법이다. 바람직하게는, 세포 집단은 기관 또는 조직으로부터 유래되며, 보다 바람직하게는 세포 집단은 혈액의 일부분이며, 가장 바람직하게는 세포 집단은 백혈구연층이다. ECP는 때때로 세포 집단을 프소랄렌(바람직하게는 8-MOP)와 같은 DNA 가교결합제의 존재하에 UVA 광을 이용한 세포사멸-유도 과정에 도입시킨 과정을 지칭하기 위해 사용된다.
본 명세서에서 지칭되는 부작용은 동시 치료제의 원치않으며 유해한 효과이다. 유해 효과는 항상 원치않는 것이지만, 원치않는 효과는 항상 유해한 것은 아니다. 치료제로 인한 유해 효과는 해로울 수 있거나 불쾌할 수 있거나 위험할 수 있다. 항-TNF-α 치료제의 투여로 인한 부작용에는 감염 및 과민성 반응의 위험이 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 다른 부작용에는 발열 또는 오한, 소양증 또는 두드러기와 같은 비특이적 증상 및 흉통, 저혈압, 고혈압 또는 호흡곤란과 같은 심폐 반응 내지 근육통 및/또는 관절통, 발진, 안면, 손 및 입술 부종, 연하곤란증, 인후염 및 두통과 같은 부작용이 포함된다. 또 다른 부작용에는 복부 탈장, 비장 경색, 비장비대, 현기증, 상위운동신경원 병변, 전신홍반성낭창 증후군, 류마티스 결절, 이구분해, 복통, 설사, 위궤양, 장폐색, 장천공, 장폐쇄증, 오심, 췌장염, 구토, 요통, 골 골절, 건 장애 또는 손상, 심부전증, 심근 허혈, 림프종, 혈소판감소증, 연조직염, 불안증, 착란, 섬망, 우울증, 기면, 자살시도, 빈혈, 농양, 세균 감염 및 패혈증이 포함될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
"장애" 및 "질환"이란 용어는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. "아토피 질환"이란 용어는 만성 염증과 같은 염증을 특징으로 하는 피험자의 상태를 의미하기 위해 "염증 질환"이란 용어와 상호교환적으로 사용된다. 자가면역 질환은 염증을 동반할 수 있거나 동반하지 않을 수 있다. 또한, 염증은 자가면역 질환에 의해 유발될 수 있거나 유발되지 않을 수 있다. 따라서, 특정 질환은 자가면역 질환과 염증 질환 둘다로서 특성화될 수 있다. 본 발명의 동시 제제는 TNF-α와 관련되는 면역조절제를 포함한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 병용 치료요법에서 사용되는 면역조절제는 TNF-α 길항제이다. 이러한 TNF-α 길항제는 바람직하게는 레미케이드(REMICADE？), 후미라(HUMIRA？) 또는 엔브렐(ENBREL？) 치료제이다. TNF-α 억제 효과를 갖는 p38 억제제와 같은 소분자를 이용한 치료요법을 사용할 수도 있다.
본 발명의 종양 괴사 인자 항체 또는 이의 단편 등은 시험관내, 동일계내(in situ) 및/또는 바람직하게는 생체내에서 TNF-α 활성을 감소, 차단, 억제, 방해 또는 간섭한다. 예를 들어, 본 발명의 적합한 사람 항체는 TNFα에 결합할 수 있으며 항-TNF 항체, 이의 항원-결합 단편 및 특수화된 돌연변이체 또는 TNFα에 특이적으로 결합하는 이의 도메인을 포함한다. 적합한 항-TNF-α 항체 또는 단편은 또한 TNF RNA, DNA 또는 단백질 합성, TNFα 방출, TNFα수용체 신호전달, 막 TNF-α분해, TNF-α 활성, TNF-α 생산 및/또는 합성을 감소, 차단, 방해, 간섭, 방지 및/또는 억제할 수 있다.
키메라 항체 cA2는 A2로서 명명된 고친화성 중화 마우스 항-사람 TNFαIgG1 항체의 항원 결합 가변 영역과 사람 IgG1 카파 면역글로불린의 불변 영역으로 이루어진다. 사람 IgG1 Fc 영역은 동종 항체 이펙터 기능을 개선시키고, 순환성 혈청 반감기를 증가시키고, 항체의 면역원성을 감소시킨다. 키메라 항체 cA2의 결합능 및 에피토프 특이성은 쥐 항체 A2의 가변 영역으로부터 유래된다. 특정 양태에서, 쥐 항체 A2의 가변 영역을 암호화하는 핵산의 바람직한 공급원은 A2 하이브리도마 세포주이다.
키메라 A2(cA2)는 천연 및 재조합 사람 TNFα 둘다의 세포독성 효과를 용량 의존적 방식으로 중화시키는 것을 돕는다. 키메라 항체 cA2 및 재조합 사람 TNFα의 결합 검정으로부터, 키메라 항체 cA2의 친화 상수는 1.04×1010M-1로 계산되었다.
특정 양태에서, 쥐 모노클로날 항체 A2는 c134A로 명명된 세포주에 의해 생 산된다. 키메라 항체 cA2는 c168A로 명명된 세포주에 의해 생산된다. 본 발명에서 사용할 수 있는 모노클로날 항-TNFα항체의 추가의 예는 당해 분야[참조: 미국 특허 제5,231,024호; Moller, A. et al., Cytokine 2(3):162-169 (1990); 미국 출원 제07/943,852호(1992년 9월 11일자로 출원); Rathjen et al., 국제 공개공보 제WO 91/02078호(1991년 2월 21일자로 공개됨); Rubin et al., EPO 특허 공개공보 제0 218 868호(1987년 4월 22일자로 공개됨); Yone et al., EPO 특허 공개공보 제0 288 088호(1988년 10월 26일); Liang, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 137:847-854 (1986); Meager, et al., Hybridonma 6:305-311 (1987); Fendly et al., Hybridoma 6:359-369 (1987); Bringman, et al., Hybridoma 6:489-507 (1987); and Hirai, et al., J. Immunol. Meth. 96:57-62 (1987)]에 기재되어 있다.
본 발명에서 유용한 바람직한 TNF 수용체 분자는 TNFα에 고친화성으로 결합하고 임의로 낮은 면역원성을 지니는 분자이다. 특히, 55kDa(p55 TNFα-R) 및 75kDa(p75 TNF-R) TNFα 세포 표면 수용체가 본 발명에서 유용하다. 이들 수용체의 세포외 도메인(ECD) 또는 이의 기능성 부분을 포함하는, 이들 수용체의 절두된(truncated) 형태도 또한 본 발명에서 유용하다. ECD를 포함하는 TNF 수용체의 절두된 형태는 뇨 및 혈청 중에서 30kDa 및 40kDa TNF-α 억제성 결합 단백질로서 검출된 바 있다.
본 발명에서 유용한 TNFα 수용체 다량체 분자는 하나 이상의 폴리펩타이드 링커 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)와 같은 기타 비펩타이드 링커를 통해 연결된 2 개 이상의 TNFα 수용체의 모든 ECD 또는 이의 기능성 부분을 포함한다. 다량체 분자는 이러한 다량체 분자의 발현을 지시하는 분비된 단백질의 시그날 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 이들 다량체 분자 및 이의 제조 방법은 미국 특허원 제08/437,533(1995년 5월 9일자로 출원됨)에 기재되어 있다.
TNF 수용체 분자의 기능성 등가물, 유도체, 단편 또는 영역은 본 발명에서 사용될 수 있는 TNFα 수용체 분자와 기능적으로 유사하기에 충분한 크기와 서열을 갖는(예를 들어, TNFα에 고친화성으로 결합하며 낮은 면역원성을 지니는) TNF 수용체 분자의 일부분 또는 TNFα 수용체 분자를 암호화하는 TNF 수용체 분자 서열의 일부분을 의미한다. TNFα수용체 분자의 기능성 등가물은 또한 본 발명에서 사용될 수 있는 TNFα 수용체 분자와 기능적으로 유사한(예를 들어, TNFα에 고친화성으로 결합하며 낮은 면역원성을 지니는) 변형된 TNFα 수용체 분자를 포함한다. 예를 들어, TNFα 수용체 분자의 기능성 등가물은 "사일런트(silent)" 코돈 또는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 첨가(예: 하나의 산성 아미노산의 다른 산성 아미노산으로의 치환; 또는 동일하거나 상이한 소수성 아미노산을 암호화하는 하나의 코돈의 소수성 아미노산을 암호화하는 다른 코돈으로의 치환)을 함유할 수 있다.
바람직한 사람 치료제는 이러한 고친화성 항체, 및 TNF-유도된 IL-6 분비를 차단하는 생체내 TNFα-억제 능력 및/또는 중화 활성의 잠재성을 갖는 이의 단편, 영역 및 유도체이다. 생체내 및 시험관내에서 ELAM-I 및 ICAM-I과 같은 세포 부착 분자의 TNF-유도된 발현을 차단하고 TNF 분열촉진 활성을 차단함을 포함하여, TNF-유도된 응혈촉진 활성을 차단하는, 고친화성 TNF-α 항체 및 이의 단편, 영역 및 유도체가 사람 치료학적 용도로 또한 바람직하다.
본 발명의 TNFα 길항제는 바람직하게는 비경구, 피하, 근육내, 정맥내 또는 관절내 수단에 의해 투여한다. 기관지내, 복부내, 관절낭내, 연골내, 강내, 복강내, 소뇌내, 뇌실내, 대장내, 자궁경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심장주위내, 복막내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 활액내, 흉곽내, 자궁내, 방광내, 일시주사, 질, 직장, 구강, 설하, 비내 또는 경피 수단을 포함하는 기타 수단도 가능하다.
피험자에서의 자가면역 질환 또는 아토피 질환과 관련된 하나 이상의 증상의 예방, 치료 또는 개선을 위한 병용 치료요법을 제공하는 본 발명의 양태에서, 당해 치료요법은 세포사멸 유도 처리, 예를 들어, 체외 광분리반출법(ECP)으로 처리된 세포 집단 및 하나 이상의 TNFα 길항제를 피험자에게 투여함을 포함한다.
ECP와 동시 제제(즉, TNFα 길항제)의 병용은 피험자에서 단독의 처리보다 우수한 치료 효과를 산출한다. 특정 양태에서, ECP와 동시 제제의 병용은 자가면역 질환, 아토피 질환, GVHD 또는 이식 거부반응을 앓는 피험자에서 단독의 치료보다 2배 이상(바람직게는 10배 내지 20배)의 우수한 치료 효과를 달성한다. 다른 양태에서, ECP와 하나 이상의 TNF 길항제의 병용은 자가면역 질환, 아토피 질환, GVHD 및 임플란트 또는 이식체 거부반응을 앓는 피험자에서 보다 많은 부가적 효과를 갖는다. 본 발명의 병용 치료요법은 자가면역 또는 아토피 질환을 앓는 피험자에게 ECP를 덜 빈번하게 실시하여 치료 효과를 달성할 수 있게 하며; 자가면역 질환, 아토피 질환 또는 GVHD의 예방 또는 치료를 위해 ECP와 함께 사용되는 TNFα 길항제의 용량을 저하시키고/시키거나 자가면역 질환, 아토피 질환 또는 GVHD를 앓는 피험자에게 이러한 TNFα 길항제를 덜 빈번하게 투여하여 치료 효과를 달성할 수 있게 한다. 당해 치료요법은 자가면역, 아토피 질환 또는 GVHD용의 통상적인 단일 제제 치료요법 및/또는 기존의 병용 치료요법과 관련된 원치않거나 유해한 부작용을 감소시켜, 치료 프로토콜에 대한 환자의 순응도를 개선시킨다.
자가면역 질환 또는 아토피 질환을 앓는 피험자에 대한 ECP 또는 동시 제제 투여의 횟수 및/또는 용량의 저하는 이러한 치료요법을 받고 있는 환자의 삶의 질을 개선시킨다. 자가면역 질환 또는 염증 질환을 앓는 피험자에 대한 ECP 또는 동시 제제 투여의 횟수 및/또는 용량은 저하되어도 여전히 환자의 특정 기관, 조직 또는 관절의 염증을 20% 이상(바람직하게는 90 내지 98% 이상) 감소시킬 수 있다.
하나의 양태에서, ECP는 모노클로날 항-TNFα 항체와 병용하여 사용된다. 가장 바람직한 모노클로날 항-TNF 항체는 인플릭시마브(레미케이드), 에타네르셉트(엔브렐), (후미라)이다. 특정 양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용되는 TNFα 길항제는 인플릭시마브(레미케이드; Centocor), 또는 이의 유도체, 유사체 또는 항원 결합 단편이다. 인플릭시마브(레미케이드)는 종양 괴사 인자 알파(TNFα)에 결합하는 키메라 모노클로날 항체이다. 인플릭시마브는 통상적으로 매 4주 내지 8주마다 약 1 내지 20mg/체중 kg의 용량으로 투여된다. 환자에 따라서 약 3 내지 10mg/체중 kg의 용량이 매 4주 내지 8주마다 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 양태에서, 레미케이드(인플릭시마브)는 멸균 주사 용수 10ml로 재구성되는 정맥내 주입용의 멸균 및 동결건조 분말로서 공급된다. 레미케이드(인플릭시마브)의 각 1회용 바이알은 100mg 인플릭시마브, 500mg 슈크로스, 0.5mg 폴리소르베이트 80, 2.2mg 일염기성 인산나트륨 및 6.1mg 이염기성 인산나트륨을 함유한다. 의사의 처방 지침서(Physician's Desk Reference; 55ed., 2001)에 따라서, 재구성된 생성물의 총 용량은 0.9% 염화나트륨 주사액(USP)을 사용하여 주입 농도가 0.4mg/ml 내지 4mg/ml의 범위가 되도록 250ml로 추가로 희석시켜야 한다. 본 발명의 양태에서, 레미케이드의 권장 용량은 0.1 내지 10mg/kg, 보다 바람직하게는 1 내지 7mg/kg, 보다 더욱 바람직하게는 2 내지 6mg/kg, 가장 바람직하게는 3 내지 5mg/kg이다. 가장 바람직한 양태에서, 용량은 3mg/kg를 초과하지 않는다. 특정한 바람직한 양태에서, 레미케이드(인플릭시마브)는 정맥내 주입으로 투여하고, 이어서 제1 주입 후 2주 및 6주째에 추가의 용량을 투여한 다음, 이후 매 8주마다 투여한다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 레미케이드(인플릭시마브)는 ECP와 병용하여 약 0.01mg/kg 내지 약 50mg/kg의 용량, 보다 바람직하게는 약 1mg/kg 내지 40mg/kg의 용량, 가장 바람직하게는 약 2.5mg/kg 내지 약 20mg/kg의 용량을 투여한다. 바람직한 양태에서, 레미케이드의 양은 상승효과가 강력하고 질환(예: GVHD)이 분명한 경우에 독성을 저하시키기 위해 현저하게 저하된다. 이러한 양태에서, ECP 및 항-TNFα 처리의 횟수는 20%, 보다 바람직하게는 40%, 가장 바람직하게는 50% 이상까지 감소된다. 따라서, 바람직한 양태에서, 600mg 이하의 레미케이드(인플릭시마브)를 정맥내 주입으로 투여하고, 이어서 제1 주입 후 2주 및 6주째에 추가의 용량을 투여한 다음, 이후 매 8주마다 투여한다. 다른 양태에서, 추가의 용량은 1주 내지 12주째, 바람직하게는 4주 내지 12주째, 보다 바람직하게는 6주 내지 12주째, 보다 더욱 바람직하게는 8주 내지 12주째에 투여하고, ECP 처리는 격주로 1일 동안 또는 보다 바람직하게는 총 20회 이하의 처리 동안 월 1회 실시한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용되는 TNFα 길항제는 에타네르셉트(엔브렐) 또는 아달리물라브(후미라), 또는 이의 단편 또는 유사체이다. 에타네르셉트(예: 엔브렐)는 종양 괴사 인자(TNF)에 결합하여 TNF 수용체와 이의 상호작용을 차단하는 이량체 융합 단백질이다. 통상적으로 투여되는 에타네르셉트의 용량은 성인의 경우 1주마다 약 10 내지 100mg이며, 바람직하게는 1주마다 약 50mg의 용량이다. 소아 피험자에 대한 용량은 1주마다 약 0.1 내지 50mg/체중 kg의 범위로, 1주마다 최대 약 50mg이다. 본 발명의 다른 바람직한 양태에서, 엔브렐은 공급된 멸균 정균성 주사용수(USP, 0.9% 벤질알콜을 함유함) 1ml으로 재구성한 후에 비경구 투여하기 위한 방부제 비함유 멸균 동결건조 분말로서 공급된다. 의사의 처방 지침서(Physician's Desk Reference; 55ed., 2001)에 따라서, 엔브렐의 각 1회용 바이알은 에타네르셉트 25mg, 만니톨 40mg, 슈크로스 10mg 및 트로메타민 1.2mg을 함유한다.
ECP는 본 발명의 TNFα 길항제(들)와 순서대로 순차적으로 실시한다. 이는 또한 주기적으로 수행할 수도 있다. 주기적 치료요법은 일정 기간 동안 동시 제제를 투여한 다음, 일정 기간 동안 세포사멸성 세포를 포함하는 세포 집단을 투여하고 이러한 순차적 투여를 반복함을 포함한다. 바람직하게는, 세포사멸성 세포(예: ECP 동안 수득된 세포)를 포함하는 세포 집단은 동시 제제를 투여하기 전 또는 투여한 후에 적어도 약 15분 내지 60분째에 투여한다. 그러나, 세포사멸성 세포를 포함하는 세포 집단은 TNFα 길항제를 투여하기 전 또는 투여한 후에 보다 큰 간격으로 투여할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에 세포사멸성 세포를 포함하는 세포 집단은 동시 제제를 투여하기 전 또는 투여한 후에 1일 내지 30일 이상 경과하여 투여하여 병용 치료요법의 유익한 효과를 수득할 수 있다.
본 발명의 방법의 치료요법에서 유용한 세포 집단은 하나 이상의 세포사멸-특징적 특성을 나타내거나 나타낼 수 있는 세포와 세포체, 즉 세포사멸성 세포체를 포함하는 "세포사멸성 세포"를 포함한다. 세포사멸성 세포는 유도기, 작용기 또는 분해기에 있는 어떠한 세포라도 포함할 수 있다. 본 발명의 치료요법의 세포 집단은 또한 세포사멸-유도제로 처리되었으며 여전히 생존성인 세포를 포함할 수 있다. 이러한 세포는 일부 시점에서, 예를 들어, 피험자에게 투여한 후에 세포사멸-특징적 특성을 나타낼 수 있다.
ECP는 현저한 수준의 세포사멸을 직접 유도한다. 이는 예를 들어, CTCL, GVHD 및 경화부종 환자에서 관찰되었다. 세포사멸성 세포는 관찰된 임상 효과에 기여한다.
세포사멸-특징적 특성에는 아넥신 V 염색법과 같은 채택된 표준 검출 방법으로 검출되는 바와 같은 포스파티딜세린의 표면 노출; 채택된 표준 방법[참조: Salvioli et al., 411 FEBS LETTERS 77-82 (1997)]으로 측정된 미토콘드리아 막 투과성의 변경; 세포로부터 DNA 추출[참조: Teiger et al., 97 J. CLIN. INVEST. 2891-97 (1996)] 후 또는 동일계내 표지화[참조: GavTieli et al., 1992, 상기 참조]에 의한 아가로스 겔 전기영동상의 DNA 래더링(laddering)의 외관과 같은 DNA 단편화의 증거가 포함될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용하기 위한 세포 집단은 생체외, 즉 체외에서 세포사멸성이 되고 피험자, 공여자 또는 수용자에 적합하도록 유도할 수 있다. 세포 집단은 배양된 세포주를 포함하는 실질적으로 모든 유형의 포유동물 세포로부터 제조할 수 있다. 예를 들어, 세포 집단은 포유동물 피험자 자신의 신체 또는 확립된 세포주로부터 유래된 세포 유형으로부터 제조할 수 있다. 구체적으로는, 세포 집단은 포유동물 피험자의 혈액 세포와 혈액 적합성인 백혈구, 피험자 자신의 백혈구 및 보다 구체적으로는 피험자 자체의 T-세포로부터 제조할 수 있다.
세포 집단은 또한 확립된 세포주로부터 제조할 수 있다. 본 발명의 방법에서 유용할 수 있는 세포주에는 예를 들어, 저켓(Jurkat) 세포(ATCC 제TIB-152호)가 포함된다. 본 발명의 방법에 따라서 사용하기에 적절한 기타 세포주는 당해 분야의 숙련가가 동정하고/하거나 결정할 수 있다. 세포 집단은 피험자, 공여자 또는 수용자에게 투여하기 전에 체외에서 제조할 수 있다. 따라서, 하나의 양태에서, 피험자의 혈액, 수용자의 혈액 또는 공여자의 혈액의 분취액을 예를 들어, 정맥천자로 수거하고, 이의 백혈구의 적어도 일부분을 세포사멸-유도성 조건에 체외에서 도입할 수 있다.
하나의 양태에서, 세포 집단은 수지상 세포, CD25+ CD4 T-조절 세포 및 CD4+ T-세포를 포함하나 이에 제한되지 않는 세포의 특정 서브세트를 포함할 수 있다. 혈액 성분의 분리 및 정제는 당해 분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있다. 게다가, 혈액 성분 치료요법의 도래는 특정 혈액 성분의 수집용으로 디자인된 수많은 시스템을 초래하였다. 이러한 수집 시스템의 몇가지는 예를 들어, 이뮤니콘 코포레이션(Immunicon Corp., 펜실베니아주 헌팅던 밸리 소재), 박스터 인터내셔날(Baxter International, 일리노이주 디어필드 소재) 및 다이날 바이오테크(Dynal Biotech, 노르웨이 오슬로 소재)로부터 시판되고 있다.
이뮤니콘의 분리 시스템은 혈액 샘플 중의 표적 샘플에 접합되는, 즉 복합체를 형성하는 항체로 피복된 자기성 나노입자(자성유체(ferrofluid))를 이용하여 혈액 성분을 분리한다. 이어서, 혈액 샘플은 강한 자기장하에 항온처리되고, 표적 복합체는 샘플의 나머지로부터 떨어진 곳으로 이동된 다음, 그 곳에서 수집될 수 있다[참조: 미국 특허 제6,365,362호; 제6,361,749호; 제6,228,624호; 제6,136,182호; 제6,120,856호; 제6,013,532호; 제6,013,188호; 제5,993,665호; 제5,985,153호; 제5,876,593호; 제5,795,470호; 제5,741,714호; 제5,698,271호; 제5,660,990호; 제5,646,001호; 제5,622,831호; 제5,597,531호; 제5,541,072호; 제5,512,332호; 제5,466,574호; 제5,200,084호; 제5,186,827호; 제5,108,933호; 및 제4,795,698호].
다이날의 다이나비드(Dynabeads？) 생체자기 분리 시스템은 혈액 샘플 중의 표적 성분에 접합하는 항체로 피복된 자기 비드를 이용하여 다이나비드-표적 복합 체를 형성시켜 혈액 성분을 분리한다. 이어서, 상기 복합체를 자기 입자 농축기(Dynal MPC？)를 이용하여 샘플로부터 제거한다. 예를 들어, 단핵구 유래의 수지상 세포(단핵구 음성 분리 키트, 제품 번호 113.09), CD34+ 세포 유래의 수지상 세포(Dynal？CD34 전구 세포 선별 시스템, 제품 번호 113.01) 및 사람 단핵구(다이나비드 CD14; 분자 분석용 단핵구 양성 분리, 제품 번호 111.11 또는 111.12)를 포함하는 몇가지 상이한 세포 유형을 상기 분리 시스템을 이용하여 수집할 수 있다. 또한, T 세포 및 T 세포 서브세트는, CELLectionTM CD2 키트(제품 번호 116.03), 다이나비드 M-450 CD2(제품 번호 111.01/02), 다이나비드 CD3(제품 번호 111.13/14), 다이나비드 플러스 DETACHaBEAD(제품 번호 113.03), 다이나비드 M-450 CD4(제품 번호 111.05/06), CD4 음성 분리 키트(T 보조/유도 세포)(제품 번호 113.17), CD8 양성 분리 키트(제품 번호 113.05), 다이나비드 CD8(제품 번호 111.07/08), CD8 음성 분리 키트(제품 번호 113.19), T 세포 음성 분리 키트(제품 번호 113.11), 다이나비드 CD25(제품 번호 111.33/34) 및 다이나비드 CD3/CD28 T Cell 확장기(제품 번호 111.31)를 사용하여 전혈, 백혈구연층, 구배 단핵 세포 또는 조직 분해산물로부터 양성적으로 또는 음성적으로 분리 또는 방혈시킬 수 있다. 박스터 인터내셔날은 CS-3000 혈액 세포 분리기, 아미쿠스(Amicus) 분리기 및 자동분리반출법-C 시스템을 포함하는, 원심분리의 특성에 기초한 몇가지 분리반출법 시스템을 개발하였다. CS-3000 플러스 혈액 세포 분리기는 세포성 분리반출 생성물 및 혈장 둘다를 수집한다. 이는 분리반출 생성물을 수집하는 이중 챔버 원심분리 시스템이 장착된 연속류 분리기를 포함한다. 아미쿠스는 연속류 또는 간헐류 포맷으로 작동하여 단일 공여자 혈소판과 혈장을 수집한다. 자동분리반출법-C 시스템은 공여자로부터의 혈장 수집용으로 디자인된 것으로서 혈장 250mL 이상을 수집할 수 있다[참조: 미국 특허 제6,451,203호; 제6,442,397호; 제6,315,707호; 제6,284,142호; 제6,251,284호; 제6,033,561호; 제6,027,441호; 및 제5,494,578호].
본 발명의 가장 바람직한 양태에서, ECP는 세포사멸을 유도하기 위해 사용된다. 이는 생체외에서 세포 집단에 첨가된 광활성화가능한 화합물을 포함한다. 상기 광감성 화합물은 경우에 따라서 피험자, 수용자 또는 공여자로부터의 혈액 세포를 포함하는 세포 집단을 수거한 후, 및 자외선 광에 노출시키기 전 또는 자외선 광에 대한 노출과 동시에 혈액 세포를 포함하는 세포 집단에 투여할 수 있다. 광감성 화합물은, 표적 혈액 세포 또는 혈액 성분이 이러한 광감성 화합물을 수용하는 한 전혈 또는 이의 분획을 포함하는 세포 집단에 투여될 수 있다. 다른 양태에서, 피험자의 혈액, 수용자의 혈액 또는 공여자의 혈액의 일부분을 공지된 방법으로 먼저 처리하여 적혈구를 실질적으로 제거한 다음, 광활성 화합물을 농축된 백혈구 분획을 포함하는 수득된 세포 집단에 투여할 수 있다.
대안적 양태에서, 광활성화가능한 화합물은 생체내로 투여할 수 있다. 광감성 화합물을 경우에 따라 생체내에서 피험자의 혈액, 수용자의 혈액 또는 공여자의 혈액을 포함하는 세포 집단에 투여하는 경우, 경구 투여할 수 있을 뿐만 아니라 정맥내 및/또는 기타 통상의 투여 경로로 투여할 수 있다. 광감성 화합물의 경구 투여량은 약 0.3 내지 약 0.7mg/kg, 보다 특히 약 0.6mg/kg의 범위일 수 있다. 경구 투여하는 경우 광감성 화합물은 광분리반출법 처리 적어도 약 1시간 이상 전 및 광분리반출법 처리하기 약 3시간 이하 전에 투여할 수 있다.
본 발명에 따라서 사용하기 위한 광활성화가능한 화합물에는 프소랄렌(또는 푸로쿠마린) 및 예를 들어, 미국 특허 제4,321,919호 및 미국 특허 제5,399,719호에 기재된 바와 같은 프소랄렌 유도체가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 바람직한 화합물에는 8-메톡시프소랄렌; 4,5'8-트리메틸프소랄렌; 5-메톡시프소랄렌; 4-메틸프소랄렌; 4,4-디메틸프소랄렌; 4-5'-디메틸프소랄렌; 4'-아미노메틸-4,5',8-트리메틸프소랄렌; 4'-하이드록시메틸-4,5',8-트리메틸프소랄렌; 4',8-메톡시프소랄렌; 및 4'-(4-아미노-2-옥사)부틸-4,5',8-트리메틸프소랄렌을 포함하나 이에 제한되지 않는 4'-(오메가-아미노-2-옥사)알킬-4,5',8-트리메틸프소랄렌이 포함된다. 하나의 양태에서, 사용될 수 있는 광감성 화합물은 프소랄렌 유도체, 아모토살렌(S-59)(제조원: Cerus, Corp. Concord, CA)를 포함한다. 다른 양태에서, 광감성 화합물은 8-메톡시프소랄렌(8-MOP)을 포함한다.
광감성 화합물이 첨가된 세포 집단은 이 광감성 화합물을 활성화시키는 파장의 광으로 처리된다. 광감성 화합물을 활성화시키는 처리 단계는 바람직하게는 예를 들어, 320 내지 400nm의 범위내의 파장에서 장파장 자외선 광(UVA)을 사용하여 수행한다. 광분리반출법 처리 동안 자외선 광에의 노출은 바람직하게는 약 1 내지 2J/cm2를 세포 집단에 전달하기에 충분한 길이의 시간 동안 실시한다.
본 발명에 따른 방법에서 유용한 체외 광분리반출법 장치에는 상표명 UVAR？하에 테라코스, 인크(Therakos, Inc., 펜실베니아주 엑스톤 소재)에 의해 제조된 장치가 포함된다. 이러한 장치의 설명은 미국 특허 제4,683,889호에서 찾아볼 수 있다. UVAR？ 시스템은 처리 시스템을 사용하며, (1) 백혈구연층 분획(백혈구가 풍부함)의 수집기, (2) 수집된 백혈구연층 분획의 방사선 조사기 및 (3) 처리된 백혈구의 재주입기를 포함하는 세 시기로 이루어진다. 수집기는 혈액 수거, 원심분리 및 재주입 단계의 6회의 사이클을 갖는다. 각 사이클 동안, 전혈을 수집하고 분리반출법 용기에서 분리시킨다. 이러한 분리로부터, 혈장(각 사이클에서의 용적은 UVAR？. Instrument operator로 측정한다)과 백혈구연층 40ml을 각 수집 사이클마다 모은다. 적혈구 및 모든 추가의 혈장을 다음 수집 사이클을 시작하기 전에 환자에게 재주입한다. 마지막으로, 백혈구연층 총 240ml 및 혈장 300ml을 분리시키고 UVA 방사선 조사를 위해 모아둔다.
방사선 회로 내의 백혈구가 풍부한 혈액의 방사선 조사는 제1 수집 사이클의 백혈구연층 수집 동안 시작한다. 수집된 혈장 및 백혈구연층을 헤파린첨가된 표준 염수 200ml 및 UVADEX？(수용성 8-메톡시프소랄린) 200mg과 혼합한다. 상기 혼합물은 PHOTOCEPTOR？ 광활성화 챔버를 통해 1.4 ㎜ 두께의 층으로 유동되는데, 이러한 광활성화 챔버는 PHOTOSETTE？의 UVA 램프의 두 뱅크 사이에 삽입되어 있다. PHOTOSETTE？ UVA 램프로 상기 UVA-투과 PHOTOCEPTOR？ 챔버의 양 측면을 조사하여, 자외선 A 광선에 180분 노출시킴으로써, 림프구당 1 내지 2 J/㎠의 평균 노출을 산출한다. 최종 백혈구연층 제제는 전체 말초혈 단핵구 성분의 대략 20% 내지 25%를 함유하며, 적혈구 용적은 2.5% 내지 7%이다. 광활성화 단계 후에, 상기 용적을 30 내지 45분에 걸쳐 상기 환자에게 재주입한다. 미국 특허원 제09/480,893호(본원에서 참조로 인용됨)에는 ECP 시행에서 사용하기 위한 또 다른 시스템이 기재되어 있다. 미국 특허 제5,951,509호; 제5,985,914호; 제5,984,887호; 제4,464,166호; 제4,428,744호; 제4,398,906호; 제4,321,919호; PCT 공개공보 제WO 97/36634호; 및 제WO 97/36581호에도 이와 관련하여 유용한 장치의 설명 및 방법이 기재되어 있다.
본 발명의 방법에 유용할 수 있는 또 다른 시스템은 미국 특허원 제09/556,832호(이의 전문은 본원에 참조로 인용된다)에 기재되어 있다. 상기 시스템은 피험자로부터 수집되었거나 제거된 체액 순용적을 ECP 동안 감소시킬 수 있는 장치를 포함한다. 세포 집단에게 전달되는 유효량의 광 에너지는 미국 특허원 제6,219,584호에 기재된 방법과 시스템을 사용하여 측정할 수 있다.
세포 집단에서 세포사멸을 유도하기 위한 다양한 기타 방법은 익히 공지되어 있으며 본 발명에서 사용하기 위해 채택할 수 있다. 이러한 한가지 처리법은 자외선 광, 가열, 냉각, 혈청 고갈(depletion), 성장 인자 고갈, 산성화, 희석, 알칼리화, 이온 강도 변화, 혈청 고갈, 방사선 조사 또는 이들의 병용을 포함하여, 세포 집단을 이온화 방사선(감마-선, x-선 등) 및/또는 비이온화 전자기 방사선에 도입시킴을 포함한다.
세포사멸을 유도하는 또 다른 방법은 산화적 스트레스를 세포 집단에 체외 적용시킴을 포함한다. 이는 현탁액 중의 세포 집단을 과산화수소, 기타 과산화물 및 과산화수소물, 오존, 과망간산염, 과요오드산염 등과 같은 화학적 산화제로 처리함으로써 달성할 수 있다. 생물학적으로 허용되는 산화제를 사용하여, 이렇게 형성된 세포사멸-유도된 세포 집단의 잔사 및 오염과 관련된 잠재적 문제를 감소시킬 수 있다.
세포사멸-유도된 세포 집단의 제조시, 과도한 수준의 산화적 스트레스, 방사선, 약물 처리 등이 적용되지 않도록 주의해야 하는데, 이는 그렇지 않다면 처리중인 세포의 적어도 일부가 괴사될 수 있는 심각한 위험이 있기 때문이다. 괴사는 생물학적으로 유해한 결과, 특히 염증 사건을 초래하는 세포 막 파열과 세포 내용물의 방출을 유발하기 때문에, 세포사멸성 세포를 포함하는 세포 집단과 함께 괴사성 세포 및 이의 성분의 존재를 피하는 것이 최상이다. 세포사멸을 유도하기에 적절한 세포 집단의 처리 수준 및 세포사멸을 유도하기 위해 선택된 처리 유형은 당해 분야의 숙련가에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 한가지 과정은 피험자 또는 적합한 포유동물 세포주로부터의 세포를 배양함을 포함한다. 이어서, 상기 배양된 세포를 체외에서 처리하여 세포사멸을 유도하고, 그 안에 세포 집단을 생성시킬 수 있다. 체외 처리는 항체, 화학치료제, 방사선, 체외 광분리반출법, 초음파, 단백질 및 산화제로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다. 이어서, 피험자의 혈장 또는 적합한 또 다른 현탁액 매질, 예를 들어, 식염수 또는 균형화된 포유동물 세포 배양 배지 속에 현탁된 세포를 다음에 지시된 바와 같이 투여할 수 있다.
세포사멸의 검출 및 정량화 방법은 본 발명에서 피험자에게 투여된 제제 중의 세포사멸의 존재 및 수준을 측정하는데 유용하다. 피험자에서 요구된 임상적 잇점을 획득하기 위해 요구되는 세포 집단 중의 세포사멸성 세포의 수는 세포 공급원, 피험자의 상태, 피험자의 연령과 체중 및 익히 공지된 방법으로 용이하게 결정가능한 기타 관련 요인에 따라 다를 수 있다. 바람직하게는, 환자에게 투여되는 세포사멸성 세포의 수는 1억개 내지 500억개, 보다 바람직하게는 10억개 내지 100억개, 가장 바람직하게는 25억개 내지 75억개이다.
하나의 양태에서, 세포사멸 과정 중인 세포는 DNA가 일련의 단편으로 분해됨으로써 초래되는 아가로스 겔 전기영동 상에서 보여지는 DNA의 특징적 래더링에 의해 확인할 수 있다. 다른 양태에서, 세포상의 포스파티딜세린의 표면 발현을 사용하여 세포사멸-유도된 세포 집단을 확인하고/하거나 정량화할 수 있다. 미토콘드리아막 투과성의 변화를 반영하는 미토콘드리아막 전위의 변화를 측정하는 것은 세포 집단을 확인하는 또 다른 인정된 방법이다. 세포 집단의 특이적 마커에 대한 모노클로날 항체를 사용하여 세포사멸 과정 중인 세포 및 세포 집단을 확인하는 수많은 기타 방법이 또한 과학 문헌에 기재되어 있다.
본 발명의 세포사멸성 세포 및 TNF-α 길항제의 투여는 관절염 및 기타 자가면역 질환에서 유용하다. 이는 또한 급성 및 만성 면역 및 자가면역 병리상태, 예를 들어, 전신홍반루프스, 갑상선염, 이식편 대 숙주 질환, 피부경화증, 진성 당뇨병, 그레이브스병 등; 아토피 질환, 예를 들어, 만성 염증성 장 질환, 궤양성 대장염 및 크론병을 포함하는 만성 염증 병리 및 혈관 염증 병리 및 범발성 혈관내응고증, 죽상동맥경화증 및 가와사키병을 포함하는 이에 제한되지 않는 혈관 염증 병리를 포함하나 이에 제한되지 않는, 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서의 하나 이상의 자가면역 관련 질환의 치료 또는 예방에서 유용하다.
예를 들어, 실질 기관 이식은 TNF-α 길항제만을 투여하는 것보다 유리하게 본 발명의 방법으로 치료된다. 면역억제제의 성공으로 인해, 급성 실질 기관 이식 거부반응은 폐 이식 후에 30% 내지 60%의 환자에서 발생하며, 간, 신장, 심장 등의 경우에 보다 낮은 정도로 발생한다. 이식 항원에 대한 림프구 (세포) 매개성 면역반응은 급성 거부반응의 주요 기작이다. 지연된 또는 만성 거부반응은 이식 후 수개월 내지 수년내에 이식편 파괴를 유발하며 이식된 조직의 괴사를 유도하는 혈관 파괴를 특징으로 한다. 이러한 거부반응은 통상적으로 표준 요법에 의해서는 상당한 정도로 억제되지 않으므로, 보다 지속적인 면역 내성의 요구는 충족되지 않은 중요한 요구이다.
때로는 후기 이식편 변질이 일어나는데, 이러한 유형의 만성 거부반응은 면역억제 요법을 증가시켜도 흔히 잠행적으로 진행된다. 병리 소견은 급성 거부반응의 소견과는 다르다. 관절염 내피가 주로 관여하는데, 과도한 증식으로 혈관 루멘을 점차적으로 폐색시켜 이식편의 허혈과 섬유화가 초래된다.
면역억제제는 거부반응을 조절하기 위해 통상적으로 널리 사용되고 있으며 이식 성공의 주된 원인이 된다. 그러나, 이러한 약물은 모든 면역학적 반응을 억제하여, 이식 수용자의 중요한 사망 원인인 과도한 감염을 초래한다.
기존의 면역억제제 치료는 상이한 유형의 이식체의 경우마다 다를 수 있다. 간 동종이식체는 다른 기관 동종이식체에 비해서 덜 공격적으로 거부된다. 예를 들어, 간 이식체의 초급성 거부반응은 HLA 항원에 제시되었거나 ABO 부적합성이 있는 환자들에게서 항상 일어나는 것은 아니다. 성인에서의 전형적 면역억제 치료요법은 일반적으로 이식시에 4 내지 6mg/kg/일로 정맥내 투여하기 시작하여 이어서 공급에 내성이 생긴 경우에 8 내지 14mg/kg/일로 투여하는 사이클로스포린의 사용을 포함한다. 용량은 신부전이 발생한 경우에 하향 조절하며, 혈액 수준은 적정 용량의 대략적 척도로서 사용한다.
심장 이식에서, 면역억제 요법은 신장 또는 간 이식의 요법과 유사하다. 그러나, 폐 및 심장-이식 이식체에서 급성 거부반응이 80%를 초과하는 환자에서 발생하나 성공적으로 관리될 수 있다. 환자는 고용량으로 정맥내로 신속히 투여되는 코르티코스테로이드, ATG 또는 OKT3으로 처리한다. 흔히, 예방적 ALG 또는 OKT3는 이식후 처음 두 주 동안 또한 투여한다. 췌장 이식은 혈관이 많이 형성되어 있는 기관 이식체 중에서 독특한 것이다. 생명을 보존하기 위해 사용되기 보다는, I형 당뇨병의 엄청난 표적 기관 합병증을 안정화시키거나 예방하기 위한 시도로 사용된다. 수용자가 인슐린 주사의 위험을 면역억제의 위험으로 교환하기 때문에, 췌장 이식은 일반적으로, 이미 면역억제성 약물을 투여받을 필요가 있는 환자(즉, 신장 이식체를 수용한 신부전을 앓는 당뇨병 환자)로 주로 제한되었다.
급성 골수성 백혈병 또는 림프모구성 백혈병 환자는 골수 이식(BMT)으로 이득을 얻을 수 있다. 유전적 질환(예: 지중해빈혈증, 겸상 적혈구 빈혈증, 면역결핍증, 선천적 대사 이상)을 앓는 아동을 치유할 수 있다는 잠재성으로 인해 소아의 BMT는 발전되어 왔다. BMT에 대한 다른 선택사항은 자가 이식(완전한 관해가 유도되었을 때 환자 자신의 골수를 제거한 다음, 모든 나머지 종양이 파괴되고 환자 자신의 골수로 구제할 수 있다는 희망이 있는 환자의 파괴성 치료)이다. 자가이식편을 이용한 이래로, 종양 퇴치 및 골수 제거용으로 사용되는 단기간의 고용량의 화학요법제 이외에는 면역억제제를 사용할 필요가 없고, GVHD와 연관된 이식 후 문제도 적다.
HLA-동일 공여자로부터 이식받은 백혈병 환자의 이식체 거부율은 5% 미만이다. 여러 차례 수혈을 받은 재생불량성 빈혈 환자에서도 거부율은 상당히 감소되었는데, 이는 이식체 유도 동안의 증가된 면역억제 때문이다. 그럼에도 불구하고, 골수 이식편의 숙주에 의한 거부반응, 급성 GVHD 및 감염을 포함한 합병증이 발생할 수 있다. 후기 합병증에는 만성 GVHD, 연장된 면역결핍증 및 질환 재발이 포함된다.
이식편 대 숙주 질환(GVHD)는 단독의 TNF-α 길항제를 투여하거나 단독의 ECP를 실시하는 것보다 유리하게 본 발명의 방법으로 처리된다. 만성 이식편 대 숙주 질환(cGVHD)은 동종 골수 이식(BMT) 후에 환자의 30 내지 60%에서 발생한다. ECP 및 항-TNFα 치료요법은 둘다 상기 질환에서 긍정적 효과를 나타냈지만 완전하지 못하며, 항-TNFα는 중증 부작용을 동반하였다.
수많은 기타 이식은 본 발명의 병용 치료법으로 보다 효과적이 될 수 있다. 예에는 각막 이식, 피부 동종이식편, 연골 동종이식편, 골 이식편 및 소장 이식체가 포함된다.
다수의 기타 장애가 본 발명의 방법을 사용하여 보다 효과적으로 치료될 수 있다. 예를 들어, 피부 T-세포 림프종은 T-림프구가 악성이 되어 피부에 해를 끼치는 질환이다. 통상적으로 다음의 3가지 종류의 치료법이 사용된다: 방사선; 화학요법; 및 광분리반출법. 피부 T-세포 림프종의 치료는 질환의 병기 및 환자의 연령과 전반적 건강에 따라 좌우된다. 표준 치료법이 고려될 수 있는데, 이는 과거 연구에서 환자에 대한 이의 효능 또는 임상 시험 참여가 고려될 수 있기 때문이다. 피부 T-세포 림프종을 앓는 대부분의 환자는 표준 치료요법으로는 치유되지 않으며 일부 표준 치료법은 목적하는 것 보다 더 많은 부작용을 나타낼 수 있다. 본 발명의 방법을 사용한 치료법은 상기 질환의 치료시에도 사용할 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 임플란트 수술, 예를 들어, 미용 또는 미용이 아닌 성형 수술에서 통상적으로 수행된 임플란트 수술과 관련해서 사용될 수 있다. 이러한 임플란트에는 치아, 예를 들면, 볼, 입술 및 엉덩이에 대한 지방 이식; 코, 볼, 이마, 볼 및 두개골에 대한 임플란트를 포함한 안면 임플란트; 엉덩이 임플란트, 유방 임플란트 등이 포함된다. 기타 임플란트에는 각막 고리, 피질, 안와, 와우관, 근육(흉부, 둔부, 복부, 비복근, 발바닥, 이두근, 삼두근을 포함한 모든 근육), 동종성형 관절 및 골 대체물, 골 회복용 임플란트(스크류, 막대, 빔, 바, 스프링), 금속 판, 척추, 추골, 모발, 보톡스/콜라겐/레스틸란/퍼란 주사제, 음경 임플란트, 전립선 시드 임플란트, 유방 임플란트(미용 및 복원용), 자궁내 장치, 호르몬 임플란트, 태아 또는 줄기 세포 매식, 심박 조율기, 심세동제거기, 인공 동맥/정맥/관, 및 인공 장기가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
자가면역 질환도 또한 본 발명의 방법을 사용하여 보다 효율적으로 치료될 수 있다. 이는 면역계가 내인성 항원에 대한 자가항체를 생산하여 결국에는 조직 손상을 초래하는 질환이다. 개체는 HLA 연관 형별검사, 혈액 또는 혈청 기반 검정 또는 유전적 변이체, 예를 들어, 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)의 동정을 포함하지만 이에 제한되지 않는 몇가지 방법으로 질환을 갖는지를 동정할 수 있다. 예를 들어, 일단 개체가 HLA DR4 연관성을 갖고 있는 것으로 결정되고 류마티스 관절염을 갖고 있는 것으로 진단되었다면, ECP와 TNFα 길항제 병용 치료가 처방될 수 있다. 가장 바람직하게는, TNF-α 길항제는 레미케이드, 후미라 또는 엔브렐 TNF-α 길항제이다. 자가면역 질환과 관련된 MHC 대립 유전자로서도 공지된 다른 HLA 대립 유전자에는 B27(강직성 척추염); DQA1*0501 및 DQB1*0201(복강 질환); DRB1*03, DRB1*04, DQB1*0201, DQB1*0302, 및 DMA*0101(I형 당뇨병); 및 Cw6(건선)이 포함된다. 이들 대립 유전자는 개체가 자가면역 질환을 경험중인지를 결정하고, 이에 따라 ECP 및 TNF-α 길항제로 병용 치료될 수 있는지를 결정하는데 사용할 수도 있다.
혈액 또는 혈청 기반 검정은 질환의 소인을 평가하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 혈청 중에 루프스의 발병을 유도할 수 있는 자가핵 항체가 존재하는지를 검출하는 검정이 있다. 자가면역 심근염을 예측하기 위한 혈청 기반 검정도 존재한다. 또한, 혈청 기반 검정을 사용하여 인슐린 수준(당뇨병) 또는 기타 질환에 대한 간 또는 심장 효소를 결정할 수 있다. T-3 수준은 하시모토 갑상선염의 예측인자일 수 있다. 혈액 또는 혈청 기반 검정을 사용하여 개체가 질환을 갖는지를 결정한 후, 본 발명의 방법을 사용하여 이들 질환의 발병을 지연시키거나 이들 질환의 효과를 감소시킬 수 있다. 개체에서, SNP를 포함하나 이에 제한되지 않는 유전적 변이의 동정을 통해 질환에 대한 소인이 있는지를 동정할 수 있다. 따라서, 본 발명의 추가의 양상에서, 환자가 자가면역 질환을 갖는지 또는 한 질병에 대한 소인이 있는지를 먼저 결정한 다음, 환자가 ECP(또는 기타 세포사멸성 세포의 투여)와 TNF-α 길항제의 병용이 처방될 수 있는지를 결정한다.
본 발명의 방법은 개체가 외인성 알레르겐에 매우 민감한 알레르기 질환인 아토피 질환에도 적용할 수 있다. 아토피 질환에는 아토피 피부염, 외인성 기관지 천식, 두드러기, 알레르기 비염, 알레르기 위장염 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
표준 진단 시험을 사용하여 환자가 상기한 유형의 질환을 갖는지를 결정할 수 있다.
실시예
다음의 비제한적 실시예로 본 발명을 추가로 설명한다.
실시예 1 내지 5에서, 단핵구 유래의 수지상 세포는 다음과 같이 수득되었다: PBMC를 Ficoll-Hypaque 구배 원심분리 상의 분획화에 의해 건강한 공여자의 말초혈로부터 분리시켰다. 단핵구를 MACS CD14 분리 키트 및 Automacs 시스템(제조원: Miltenyi Biotec, Germany)를 사용하여 양성적으로 선별하였다. CD14+ 단핵구를 40ng/ml의 IL-4 및 GM-CSF가 보충된 완전 RPMI(제조원: R&D System)에서 5일 동안 배양하였다. 수지상 세포를 리포폴리사카라이드("LPS", 제조원: Sigma)로 자극하여 사이토킨 분비를 유도하였다. 표준 ELISA 과정을 사용하여 배양 보충물 중의 TNFα 및 IL-12(제조원: R&D System) 수준을 측정하였다.
실시예 1(TNFα 생산의 억제에 관한 시험관내 연구)
갓 분리된 CD14+ 세포 및 단핵구 유래의 수지상 세포(5×105개 세포/웰)를 ECP-처리된 CD15+ 세포(2.5×105개 세포/웰)와 함께 24웰 조직 배양 플레이트에서 공동 배양하였다. 2시간 후, 0.5mg/ml의 LPS를 상기 배양물에 첨가하였다. 자극한지 24시간 후, 상청액을 사이토킨 측정을 위해 상기 배양물로부터 수집하였다. ECP-처리된 세포는 LPS-활성화된 항원-제시 세포로부터의 TNFα 생산을 억제하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 2(TNFα 생산의 억제에 관한 시험관내 연구)
단핵구 유래의 수지상 세포(1×105개 세포/웰)를 증가되는 양의 단독의 LPS의 존재하에 또는 ECP-처리된 CD15+ 세포(5×105개 세포/웰)와 함께, 단독의 200ng/ml 레미케이드 mAb와 함께 또는 mAb와 ECP-처리된 CD15+ 세포의 배합물과 함께 배양하였다. 배양 상청액을 TNFα 생산의 측정을 위해 48시간째에 이들 배양물로부터 수거하였다. 레미케이드 mAb만으로 처리된 세포는 약 100 pg/ml의 TNFα를 갖는 것으로 밝혀졌다. ECP만으로 처리된 세포는 약 1000pg/ml의 TNFα를 갖는 것으로 밝혀졌다. 이러한 처리가 각각 1000pg/ml 이상의 기선값으로부터의 감소를 나타내는 반면, 본 발명의 방법을 사용한 경우 수준은 50pg/ml 미만의 평균값으로 저하되었다.
실시예 3(TNFα 생산의 억제에 관한 시험관내 연구)
단핵구 유래의 수지상 세포(1×105개 세포/웰)를 증가되는 단독의 0.1mg/ml LPS의 존재하에 또는 ECP-처리된 신선한 CD15+ 세포(5×105개 세포/웰)와 함께, 단독의 200ng/ml 레미케이드 mAb와 함께 또는 mAb와 ECP-처리된 CD15+ 세포의 배합물과 함께 배양하였다. 배양 상청액을 TNFα 생산의 정량화를 위해 48시간째에 이들 배양물로부터 수거하였다. 레미케이드 mAb만으로 처리된 세포는 약 500pg/ml의 TNFα를 갖는 것으로 밝혀졌다. ECP만으로 처리된 세포는 약 1700pg/ml의 TNFα를 갖는 것으로 밝혀졌다. 이러한 처리가 각각 2300pg/ml 이상의 기선값으로부터의 감소를 나타내는 반면, 본 발명의 방법을 사용한 경우 수준은 약 100pg/ml으로 저하되었다.
실시예 4(TNFα 생산의 억제에 관한 시험관내 연구)
단핵구 유래의 수지상 세포(1×105개 세포/웰)를 증가되는 양의 단독의 LPS의 존재하에 또는 ECP-처리된 CD15+ 세포(5×105개 세포/웰)와 함께, 단독의 200ng/ml 레미케이드 mAb와 함께, 또는 레미케이드 mAb와 ECP-처리된 CD15+ 세포의 배합물과 함께 배양하였다. 배양 상청액을 TNFα 생산의 측정을 위해 48시간째에 이들 배양물로부터 수거하였다. 수지상 세포의 다른 그룹을 유사하게 처리하고, 배양 상청액을 TNFα 생산의 정량화를 위해 48시간째에 이들 배양물로부터 수거하였다. 약 2ng/ml의 레미케이드 mAb 만으로 처리된 세포는 약 1000pg/ml TNFα를 갖는 것으로 밝혀졌다. 이러한 동일한 용량의 레미케이드 mAb를 투여하고 ECP를 실시한 경우, 수준은 약 1500pg/ml으로 저하되었다. 8ng/ml의 레미케이드 mAb만을 투여한 경우, 수준은 1300pg/ml을 초과하였으며, ECP 처리의 추가는 이 수준을 약 100pg/ml로 저하시켰다. ECP와 병용되거나 병용되지 않은 40ng/ml 이상의 레미케이드 mAb의 용량은 수준을 100pg/ml 미만으로 감소시켰다. 병용 치료요법의 효과는 낮은 수준의 레미케이드 mAb 투여(예: 2ng/ml)에서 가장 잘 나타났다. 상기 용량은 통상적으로 치료적 용량으로 고려되지 않으며, 일반적으로 유해 효과가 예상되지 않을 수 있는 수준에서 효능을 나타낸다.
실시예 5(기타 염증촉진 사이토킨의 억제에 관한 시험관내 연구)
단핵구 유래의 수지상 세포(1×105개 세포/웰)를 증가되는 양의 단독의 레미케이드 mAb의 존재하에 또는 ECP-처리된 신선한 CD15+ 세포(5×105개 세포/웰)와 함께 배양하였다. 이어서, 세포를 0.8ng/ml LPS로 자극하였다. 배양 상청액을 IL-12 생산의 측정을 위해 48시간째에 이들 배양물로부터 수거하였다. IL-12 수준은 ECP의 사용에 의해 약 150pg/ml의 기선값에서 약 125pg/ml로 감소되었다. ECP와 2ng/ml 레미케이드 mAb의 병용은 IL-12 수준을 약 10pg/ml로 감소시켰다. 200ng/ml의 레미케이드 mAb를 ECP와 함께 사용한 경우, IL-12 수준은 거의 검출할 수 없었다. 따라서, ECP-처리된 세포와 레미케이드 mAb의 병용은 수지상 세포에 의한 IL-12 생산을 현저하게 감소시켰다.
실시예 6(마우스 모델 생체내 적용)(예후적)
마우스
수컷 C3H/HeJ(C3H; H2k), (B6xC3H)F1(H2bxk), (B6xDBA/2)F1(H2bxd), C57BL/6 (B6; H2b) 및 CBA/JCr(CBA; H2k) 마우스는 국립암연구소 조사개발센터(National Cancer Institute Research and Development Center, Frederick, MD)로부터 구입할 수 있다. B1O.BR(H2k) 마우스는 잭슨 래보러터리스(Jackson Laboratories, Bar Harbour, ME)로부터 구입할 수 있다. 실험용으로 사용되는 마우스는 6주령 내지 10주령이며 오토클레이브된 음식과 물을 자유롭게 수용할 수 있도록 하면서 특수 병균부재 시설내에서 멸균 미세분리기 케이지에서 사육한다.
배지
0.1% 소 혈청 알부민(BSA; 제조원: Sigma Chemical Co., St Louis, MO)이 보충된 포스페이트 완충 염수(PBS)를 공여자 골수 및 림프구의 모든 시험관내 조작을 위해 사용한다. 주사 직전에 세포를 세척하고 단독의 PBS 속에 재현탁시킨다. 세포주를 유지시키고 시험관내 검정을 위해, 10% 송아지 혈청(FBS; GIBCO, Grand Island, NY), 2mmol/L L-글루타민, 50 IU/mL 페니실린 및 50 ㎍/mL 스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640 배지(제조원: Mediatech, Herndon, VA)를 사용한다.
항체
쥐 TNFα에 대해 특이적인 랫트 (Fab)2 단위를 갖는 랫트/마우스 Fc 키메라 IgG2a 작제물인 cVlq(aka. CNTO 2213) mAb 및 이의 이소형 대조군 M-T412 사람 항-CD4 mAb는 센토코어(Centocor, Malvern, PA)에 의해 공급될 수 있다. mAb를 함유하는 복수액은 Thy-1.2(Jlj; ATTC IIB-184), CD4(RL 172) 또는 CD8(3.168) 단백질에 대해 특이적인 하이브리도마 세포주로부터 제조하고, 세포 이식편의 제조용으로 사용한다. 친화성-정제된 염소 항-마우스 IgG(제조원: Cappel, Cosa Mesa, CA)는 B 세포 고갈용으로 사용한다. 기니아 피그 보체는 록랜드 이뮤노케미칼스(Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA)로부터 구입한다. 모두 피코에리트린(PE)에 커플링된 항-CD3, 항-CD4, 항-CD8, 항-B220 및 이소형 대조군 mAb는 모두 BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences, Palo Alto, CA)로부터 구입할 수 있다.
실험적 광분리반출법
비장세포를 동계 동복자(同腹子)인 건강한 마우스로부터 수거하고 PBS 중에 서 주사기의 후부를 이용하여 분쇄하여 단일 세포 현탁액으로 만든다. 상기 세포들을 재현탁시키고 세포를 12.5 x 106 세포/PBS mL로 재현탁시키기 전에 PBS로 2회 세척한다. 세포를 세척한 후, 이를 빙냉 배지에 재현탁시키고 T75 플라스크에 약 106개 세포/ml로 접종시킨다. 프소랄렌(UVADEX 용액)을 최종 농도가 200ng/ml가 되도록 첨가하면, 이는 테라코스에 의해 공급된 모액으로부터의 100배 희석액이 된다. 플라스크를 UVA 방사선 조사 챔버에 눕혀지게 놓고, 트레이가 광원으로부터 6cm 떨어져 있는 경우의 1.5분간의 최저 광에 상응하는 약 1.5 J/cm2의 광을 조사한다. 부착을 피하기 위해 세포를 플라스크로부터 신속하게 제거하여 주사에 적절한 농도로 만든다. 부착이 일어난 경우, 플라스크를 서서히 스크랩하거나 가볍게 두드려서 대부분의 세포를 제거한다.
골수 이식
골수는 0.01% BSA(PBS/BSA)를 함유하는 PBS로 플러싱하여 공여자 마우스의 경골 및 대퇴골로부터 수거한다. 골수 세포를 37℃에서 45분 동안 항-Thy 1.2 mAb(Jlj; American Type Culture Collection, Rockville, MD)를 1:100 희석율로 사용하고 기니아 피그 보체(Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA)를 1:6의 희석율로 사용하여 T-세포를 고갈시킨다. 림프구를 공여자 마우스의 비장 및 림프절로부터 분리한다. 비장세포를 0.7% 염화암모늄(NH4Cl)를 함유하는 게이스 발란스 염 용해 용액(Gey's balanced salt lysing solution)으로 처리하여 적혈구(RBC)를 제거한다. RPC가 고갈된 후, 비장 및 림프절 세포를 모으고 염소 항-마우스 IgG의 5mg/ml 희석액으로 예비피복된 플라스틱 페트리 접시상에서 4℃에서 1시간 동안 패닝(panning)하여 B 세포를 고갈시킨다. 이러한 처리는 유세포측정법으로 정량화한 바에 의하면 약 90 내지 95%가 CD3+ 세포로 이루어진 공여자 집단을 초래하는 것으로 예상된다. 이어서, T 세포 서브세트를 항-CD8(3.168) 또는 항-CD4 mAb(RL172) 및 보체를 사용하여 음성 선별을 통해 분리한다. 이러한 처리는 유세포측정 분석법으로 측정한 바에 의하면 표적화된 T 세포 서브서트 집단을 배경값 수준으로 감소시키는 것으로 예상된다. 수용자 마우스는 1.43 Gy/분에서 137CS 선원으로부터의 13 Gy 전신 방사선에 노출시키는데, 방사선은 3시간 간격으로 나누어서 6.5Gy의 분리 선량으로 전달되게 한다. 이어서 상기 마우스에 2×106개 항-Thy 1.2 처리된 골수 세포(ATBM; T 세포가 고갈됨)와 함께 명시된 수의 적절한 T 세포(공여자 CD4 또는 CD8가 풍부한 T 세포)를 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 이식한다. 마우스는 이식 1일 전에 cVlq 항-TNF-α 또는 이소형 대조군 M-T412 mAb(1mg; 복강내)로 처리하고 0일째, 4일째, 8일째 및 12일째(모두 0.5mg; 복강내)에 다시 처리한다. GVL 실험을 위해, B6 수용자 마우스를 공여자 ATBM 및 T 세포를 이식하기 1일 전에 항-TNFα mAb 처리와 유사한 스케쥴을 사용하여 MMB3.19 세포(0.5mL PBS 중의 1×105; 복강내)를 주사하여 접종한다. GVHD 및 GVL 실험 둘다에서, 마우스를 완료시까지 질병율 및 사망율에 대해 매일 검사한다. 데이타를 2회 내지 3회의 개별적 실험으로부터 모으고, 중간 생존 시간(MST)를 0을 포함하는 모든 사망일 데이타 포인트 전반에 걸쳐 선형 회귀선의 50% 생존 포인트를 삽입하여 측정한다. 실험 그룹 간의 생존에 대한 통계학적 비교를 비파라메터 윌콕슨 부호순위검정(Wilcoxon signed rank test)으로 수행한다. 중량 비교의 유의성을 각각의 시점에서 T-검정으로 측정한다.
유세포분석법
25㎕ 용적 중의 적절한 mAb를 96웰 U-기저 미세플레이트의 웰에서 2 내지 5×105개 세포와 함께 4℃에서 30분 동안 항온처리하고, 3분 동안 1500rpm으로 원심분리하고, 0.1% BSA와 0.01% 아지드화나트륨을 함유하는 PBS(세척 완충액)로 세척한다. 양성 세포의 백분율 및 산술 평균 형광 강도를 각 샘플에 대해 계산한다.
병리학적 분석
전체층 귀 생검(3×2mm)을 다양한 처리군의 각 마우스로부터 표본 추출하고 즉시 4% 글루타르알데히드 속에 밤새 고정시킨 다음, 0.1M 나트륨 카코딜레이트 완충액(pH 7.4)으로 세정한다. 조직을 2% 사산화오스뮴으로 고정시키고, 단계적 에탄올 속에서 탈수시키고 Epon 812에 매립한다. 1마이크론 두께의 절편을 Porter-Blum MT2B 초미세절단기로 절단하고 톨루이딘 블루로 염색하고 마지막으로 광현미경 분석을 위해 95% 에탄올 속에 침지시킨다. 미리 측정한 각화이상 상피 세포의 수/선상 mm를 광학현미경의 100배율 대물렌즈 및 10배율 접안렌즈하에 계수한다. 10 선상 mm 이상의 표피를 각 동물에서 각 시점마다 평가한다. 처리군에 대한 맹검 조건하에 분석을 수행한다.
CD8 T 세포 매개성 GVHD에 미치는 항-TNFα mAb의 효과
항-TNFα mAb 처리가 CD8+ T 세포 매개성 GVHD에 영향을 줄 수 있는지를 결정하기 위해, MHC-매치된 miHA-이종 B10.BRaCBA GVHD 모델을 사용하는데, 이는 이 모델이 익히 확립된 병인론을 갖기 때문이다. CBA 마우스에게 치사량의 방사선(13 Gy, 분리 선량)을 조사하고 B10.BR ATBM 세포(2x106)만을 이식하거나, CD8+ T 세포(3x106)가 매우 풍부한 집단(95%)와 함께 이식한다. 마우스를 처리하지 않은 상태로 방치하거나, -1일째(1mg, 복강내) 및 이식 0일째, 4일째, 8일째 및 12일째(0.5mg; 복강내)에 이소형-매치된 대조군 MT412 mAb 또는 항-TNFα mAb(cVlq) mAb로 처리한다. ATBM 세포만을 수용한 모든 수용자는 70일 이상 동안 생존하는 반면에, 공여자 T 세포가 이식된 마우스 및 처리되지 않은 마우스 또는 대조군 MT412 mAb로 처리된 마우스는 GVHD로 인해 사망하며 MST 값은 유사하게 약 20일이다. 대조적으로, 공여자 T 세포를 수용하였으나 cVlq mAb가 투여된 CBA 수용자는 약 40% 생존율을 나타내며, MST는 MT412 대조군과 유의적으로 상이한 약 50일이다. 또한, 생존한 항-TNFα mAb 처리된 마우스는 명백한 GVHD 증상(예: 주름진 모피, 피부 병변, 구부정한 자세 또는 설사)를 나타내지 않으며 이의 체중은 ATBM 이식된 대조군의 수준보다 5 내지 12% 낮은 범위의 비교적 일정한 수준이다. cV1q의 존재하에 치명적 GVHD가 발병한 마우스도 이와 마찬가지이며 미처리되거나 MT412-처리된 그룹보다 느린 반응속도론을 나타낸다. cV1q가 0.1mg에서 복강내로 투여된 경우, GVHD 발병이 유의적으로 감소되지 않는다. 실험적 ECP는 BMT와 동일한 날 및 3일 이후에 동복자 대조군 마우스로부터의 107 동계 비장세포를 주사하여 실시한다. 공여자 T 세포를 수용하였지만 ECP-처리된 세포가 투여된 CBA 수용자는 약 20%의 생존율을 나타내며 MST는 대조군과 유의적으로 상이한 30일이다. 또한, 생존성 ECP-처리된 마우스는 감소된 GVHD 증상(예: 주름진 모피, 피부 병변, 구부정한 자세 또는 설사)의 증거를 나타내며 이의 체중은 ATBM 이식된 대조군의 수준보다 5 내지 20% 낮은 범위의 비교적 일정한 수준일 수 있다. ECP-처리된 세포의 존재하에 치명적 GVHD가 발병된 마우스도 이와 마찬가지이며 반응속도론은 미처리된 그룹보다 느리다.
ECP 처리와 유효량 이하 용량의 항-TNFα 처리의 병용은 단독의 처리보다 우수하다. 공여자 T 세포를 수용하였지만 ECP와 함께 0.1mg의 cV1q mAb가 투여된 CBA 수용자는 약 60%의 생존율을 나타내며 MST는 대조군과 유의적으로 상이한 약 70일이다. 또한, 이중 처리된 생존성 마우스는 명백한 GVHD 증상(예: 주름진 모피, 피부 병변, 구부정한 자세 또는 설사)을 나타내지 않으며 이의 체중은 ATBM 이식된 대조군보다 5 내지 12% 낮은 범위의 비교적 일정한 수준이다. 이중 치료요법의 존재하에 치명적 GVHD가 발병한 마우스도 이와 마찬가지이며 반응속도론은 미처리된 그룹보다 느리고 단독의 ECP 또는 항-TNF 처리된 그룹보다도 느리다.
MHC 장벽을 넘어서는 GVHD에 대한 항-TNFα mAb 의 효과
cV1q 처리에 의한 TNFα의 중화가 전체 MHC 장벽을 넘어서 GVHD의 과정에 영 향을 줄 수 있는지를 결정하기 위해 일배수동종(haploidentical) C3Ha(B6xC3H)F1 마우스를 사용한다. C3H T 세포(CD4+ 및 CD8+ 둘다; 5×106)와 ATBM 세포(2×10 6)를 심각한 체중 손실 및 조기 치사(약 5일의 MST)를 특징으로 하는 신속한 급성 GVHD 반응을 유도하는 치사량의 방사선(13 Gy, 분리 선량)이 조사된 (B6xC3H)F1 마우스에게 정맥내로 이식한다. 유사한 결과는 대조군 MT412 mAb로 처리된 수용자에서 수득되만, cVlq (-1일째에 1mg이 복강내 투여 및 0, 4, 8 및 12일째에 0.5mg이 투여)로 처리된 마우스는 약 40%의 장기간 생존율을 나타내며, MST는 미처리되었거나 MT412 처리된 대조군과 비교하여 유의적으로 상이한 약 40일이다. cV1q 0.1mg 처리는 GvHD 발병에 유의적이진 않지만 주목할만한 효과를 미친다.
실험적 ECP는 BMT와 동일한 날 및 3일 이후에 동복자 대조군 마우스로부터의 107 동계 비장세포를 주사하여 실시한다. 공여자 T 세포를 수용하였지만 ECP-처리된 세포가 투여된 CBA 수용자는 약 20%의 생존율을 나타내며 MST는 대조군과 유의적으로 상이한 10일이다. 또한, 생존성 ECP-처리된 마우스는 감소된 GVHD 증상(예: 주름진 모피, 피부 병변, 구부정한 자세 또는 설사)의 증거를 나타내며 이의 체중은 ATBM 이식된 대조군의 수준보다 5 내지 20% 낮은 범위의 비교적 일정한 수준이다. ECP-처리된 세포의 존재하에 치명적 GVHD가 발병된 마우스도 이와 마찬가지이며 반응속도론은 미처리된 그룹보다 느리다.
ECP 처리와 유효량 이하 용량의 항-TNFα 처리의 병용은 단독의 처리보다 우수하다. 공여자 T 세포를 수용하였지만 ECP와 함께 0.1mg의 cV1q mAb가 투여된 CBA 수용자는 약 60%의 생존율을 나타내며 MST는 대조군과 유의적으로 상이한 약 70일이다. 또한, 이중 처리된 생존성 마우스는 명백한 GVHD 증상(예: 주름진 모피, 피부 병변, 구부정한 자세 또는 설사)을 나타내지 않으며 이의 체중은 ATBM 이식된 대조군보다 5 내지 12% 낮은 범위의 비교적 일정한 수준이다. 이중 치료요법의 존재하에 치명적 GVHD가 발병한 마우스도 이와 마찬가지이며 반응속도론은 미처리된 그룹보다 느리며 단독의 ECP 또는 항-TNF 처리된 그룹보다도 느리다.
체중 손실의 측면에서, 방사선 조사 조건화로 인해 처음 몇일간 약간 체중이 감소한 후에, 대조군 ATBM 마우스는 나머지 실험일 전반에 걸쳐서 꾸준히 체중이 증가한다. 반면에, 공여자 T 세포가 이식된, 미처리된 그룹 및 MT412-처리된 그룹은 초기 체중감소로부터 회복되지 않으며 대신에 사망할 때까지 급속한 체중 손실이 지속된다. 그러나, cV1q 항-TNFα 처리된 마우스는 9일까지 다소 회복되며 37일 후에 생존한 동물들은 나머지 실험 과정 동안 체중 증가가 지속되며 ATBM 그룹보다 약 6 내지 12% 낮다. cV1q 0.1mg으로 처리된 동물은 대조군 동물과 비유의적으로 상이하지만 단지 약간 양호한 반응속도론으로 체중이 손실된다. ECP 처리된 동물은 체중 증가가 유의적으로 증가되며, 항-TNF와 ECP의 병용은 BMT를 투여받지 않은 대조군 동물 또는 1mg 항-TNF 그룹과 실질적으로 동일하다.
CD4 + T 세포 매개성 GVHD에 미치는 항-TNFα의 효과
공여자 CD4+ T 세포 반응이 C3Ha(B6xC3H)F1 모델에서 GVHD의 발병보다 우세하며 완전한 T 세포 접종물이 이식된 경우에 항-TNFα mAb 처리의 중간정도 효과가 초기에 관찰되었기 때문에, 본 발명자들은 CD 매개성 GVHD 성분에 주목할 것이다. 3×106 C3H CD4+ T 세포와 함께 2×106 ATBM 세포를 방사선(13 Gy, 분리 선량) (B6xC3H)F1 마우스에게 주사하면 대다수의 미처리된(약 75%; 10일 내지 30일의 MST) 및 대조군 MT412-처리된(약 80%; 10일 내지 30일의 MST) 마우스가 중증 급성 GVHD로 사망하게 된다. 대조적으로, cVlq 항-TNFα mAb(-1일째에 1mg이 복강내 투여 및 0, 4, 8 및 12일째에 0.5mg이 투여)로 처리된 마우스의 100%는 60일이 경과해서도 생존한다. 이들 마우스는 어떠한 가시적 GVHD 증상도 나타내지 않으며 방사선 조사 후의 초기 체중 손실로부터 빠르게 회복되며 실험 말일까지 ATBM 대조군과 필적하게 지속적으로 체중이 증가한다. CD4 매개성 GVHD에서 생존성에 미치는 cV1q 처리의 매우 유의적인 효과는, 완전한 공여자 T 세포 접종물의 전달시에 이미 관찰된 보다 적절한 효과가 CD8-매개성 항-MHC I형 반응을 보다 덜 억제하기 때문일 수 있음을 제시한다. 그러나, 이는 상기 모델에서는 직접적으로 시험될 수 없는데, 이는 정제된 C3H CD8+ T 세포가 CD4+ T 세포의 부재하에 단독으로 치명적 GVHD를 매개할 수 없기 때문이다.
cV1q 항-TNFα 항체 처리는 GVHD를 억제하는데 있어 가장 적절한 효과를 갖는다. 동물의 약 40%가 60일이 경과한 후에도 생존한다. 생존한 마우스는 GVHD의 초기 징후를 나타내지 않지만 쇠약해지며, 체중 손실은 1mg cV1q 그룹에서만큼 신속히 개선되지 않지만 대조군과 유의적으로 상이하다.
실험적 ECP는 BMT와 동일한 날 및 3일 이후에 동복자 대조군 마우스로부터의 107 동계 비장세포를 주사하여 실시한다. 공여자 T 세포를 수용하였지만 ECP-처리된 세포가 투여된 F1 수용자는 약 20%의 생존율을 나타내며 MST는 대조군과 유의적으로 상이한 10 내지 25일이다. 또한, 생존한 ECP-처리된 마우스는 감소된 GVHD 증상(예: 주름진 모피, 피부 병변, 구부정한 자세 또는 설사)의 증거를 나타내며 이의 체중은 ATBM 이식된 대조군의 수준보다 5 내지 20% 낮은 범위의 비교적 일정한 수준이다. ECP-처리된 세포의 존재하에 치명적 GVHD가 발병된 마우스도 이와 마찬가지이며 반응속도론은 미처리된 그룹보다 느리다.
ECP 처리와 유효량 이하 용량의 항-TNFα 처리의 병용은 단독의 처리보다 우수하다. 공여자 T 세포를 수용하였지만 ECP와 함께 0.1mg의 cV1q mAb가 투여된 CBA 수용자는 60일째에 약 90%의 생존율을 나타내는데, 이는 대조군과 유의적으로 상이하다. 또한, 이중 처리된 생존한 마우스는 명백한 GVHD 증상(예: 주름진 모피, 피부 병변, 구부정한 자세 또는 설사)을 나타내지 않으며 이의 체중은 ATBM 이식된 대조군보다 5 내지 12% 낮은 범위의 비교적 일정한 수준이다. 이중 치료요법의 존재하에 치명적 GVHD가 발병한 마우스도 이와 마찬가지이며 반응속도론은 미처리된 그룹보다 느렸으며 통계학적으로 유의적이진 않지만 단독의 ECP 또는 항-TNF 처리된 그룹보다도 느리다.
실시예 7(단독의 항-TNFα 치료요법을 공동상승시키고 이의 독성을 저하시키기 위한 사람 적용)(예후적)
실시예 요약
본 실시예는 ECP와 병용된 집중적 항-TNFα 요법이 문헌에 제안된 요법보다 유의적으로 우수한 독성 프로필을 가짐을 입증한다. 초기에 1mg/kg의 인플릭시마브 항-TNFα가 사용된다. 그러나, 유용한 용량의 범위는 0.1mg/kg 내지 10mg/kg의 범위이다.
환자
환자는 부위에 따라 결정된 표준 요법 및 동의된 프로토콜을 사용하여 동종 조혈 줄기 세포(HSC) 이식체를 수용하며 경구 및 정맥내 코르티코스테로이드, 사이클로스포린, 타크롤리무스, 시롤리무스, 미코페놀레이트 모페틸(MMF)를 포함하나 이에 제한되지 않는 의약이 투여된다. 골수 비절제성(nonmyeloablative) HSC 이식체를 수용한 환자는 부술판 및 플루다라빈을 이용한 조건화 화학요법 및 전반적으로 상이한 GVHD 예방 요법을 받는다. 공여자-수용자 쌍의 CMV 혈청형 및 중간 추적 시간은 유사하다. ECP를 HSC 후 및 가능하게는 HSC 후의 다양한 시점에서 표준 과정을 이용하여 실시한다. 인플릭시마브를 HSC 후에 0.5mg/kg의 용량으로 투여한다. 환자를 조사하고 변형된 글룩스버그 척도(Glucksberg scale)와 같은 표준 방법을 사용하여 스코어를 매기고, GVHD 예방 요법, 발병일 및 최대 종합 등급 및 기관-특이적 등급에 대한 데이타를 수집한다.
IFI는 2002년 유럽암연구치료기구(European Organisation for Research and Treatment of Cancer; EORTC)/미국 국립 알레르기 및 전염병 연구소(The National Institute of Allergy and Infectious Diseases) 국제 합의에 따라 분류된다. IFI의 사례는 연구집단내의 식별된 모든 환자의 의학 기록을 검토하고 모든 병리학, 미생물학, 감염 관리 및 방사선학 데이타베이스를 검토하여 확인한다. 내과의는 인플릭시마브 노출에 대해 알지 못하는 상태에서 이들의 조사결과를 문서화한다. 칸디다 종 때문이 아닌 증명된 또는 가능한 IFI만이 분석용으로 고려된다. IFI 날짜는 진단 과정이 입증된 IFI에 대해 수행된 날 또는 가능한 IFI에 대해 임상의가 방사선학 및 미생물학 데이타 둘다를 이용할 수 있게 된 날로서 문서화된다. IFI의 진단이 사망 후에 이루어진 경우, IFI 날짜는 사망일로서 고려되지만, 가능한 IFI 진단이 사후 검사시에 확인되는 경우, IFI 날짜는 가능한 IFI 진단이 이루어진 날로서 문서화된다.
중증 GVHD를 앓는 환자에게 투여된 임의의 코르티코스테로이드의 모든 용량은 코르티코스테로이드 등가 표(equivalence table)를 사용하여 프레드니손 해당량으로 환산한다. 체중에 맞게 조절된 누적 코르티코스테로이드 용량을 조혈 줄기 세포 이식(HSCT)일로부터 사망일까지, IFI 발병일까지, 연구집단 추적 기간의 종결시까지 또는 코르티코스테로이드를 30일 이상 동안 20mg/d 이하로 점차 감소시키는 경우에 계산한다. 실험적 및 예방적 항진균제 사용을 문서화한다.
생존한 환자들은 그날에 검열하거나 그날 전 마지막 방문일에 검열한다. 연구는 적절한 행정/조절 단위에 의해 승인된다.
통계학적 분석
2측면 피셔의 정확도 검정(2-sided Fisher exact test), 윌콕슨 검정 또는 t 검정을 기선 특징의 비교를 위해 적절히 사용한다. IFI 발생율 및 발생율 비를 HSCT 연구집단에서는 이식일로부터 및 중증 GVHD가 발병한 연구집단에서는 GVHD의 발병일로부터 상이한 노출 카테고리에 따라 계산하며, 환자는 사망시 또는 추적기의 사망시에 또는 추적기의 종결 전에 마지막 방문일에 검열한다. 발생율 및 방생율 비의 신뢰구간은 각각 핸스제(Haensze) 및 바이어(Byar) 방법을 사용하여 계산한다. 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 곡선을 생존율 및 이식일로부터 IFI까지의 시간에 대해 계산한다. 중증 GVHD을 앓는 환자에서, 급성 GVHD의 발병으로부터 IFI까지의 시간을 또한 계산한다. 사건까지의 시간은 로그 순위검정을 사용하여 비교한다. 중증 GVHD를 앓는 환자에 대한 변수 간에 교란(confounding) 또는 상호작용을 통제하기 위해, GVHD의 발병으로부터 IFI까지의 시간에 대한 시간 의존적 콕스 회귀 분석을 수행한다. 단일변량 콕스 모델을 중증 GVHD를 앓는 환자 간에 모든 가능한 위험 요소에 대해 계산한다. IFI의 단일변량 콕스 분석상에서 2미만의 P 값을 갖는 모든 공변량을 다변수 콕스 모델에서 고려한다. 인플릭시마브는 시간 의존적 변수로서 모델링하고, 이의 노출은, 일단 주 1회 주입이 개시되면, 일정한 것으로 가정한다. 유의적 교란이 주지되지 않는 한, 최종 모델에서 IFI와 통계학적으로 유의적으로 연관되는(P<.05) 후보 변수만을 유지시킨다. 윈도우 버전 8.01용 SAS 시스템(SAS Institute, Carey, NC)를 상기 분석용으로 사용한다.
결과
급성 GVHD의 발생율 및 이를 위한 치료
ECP는 HSC 전 -10일째 내지 -4일째에 약 2회 실시한다. 또한, ECP 치료요법은 이식 후 처음 100일 동안 대략 1주마다 실시하여, 급성 GVHD의 발병을 추가로 예방한다. 예비 조사는 GVHD를 앓지 않는 환자 및 I등급 내지 II등급 GVHD를 앓는 환자 간에 유사한 생존율 및 IFI 비율을 입증하며, 따라서 이들 그룹을 GVHD를 앓지 않거나 중증이 아닌 GVHD를 앓는 그룹으로 분류한다. 중증 GVHD는 III 또는 IV의 종합 등급으로서 정의된다. 연구집단의 약 20%에서 급성 중증 GVHD가 발병한다. 비관련 공여자의 비율은 연구집단의 나머지와 비교하여 중증 GVHD를 앓는 환자에서 보다 높으며, 그렇지 않다면 기선 특징은 유사하다. 골수절제성 및 골수 비절제성 HSC 이식체 공여자 중에서, 임의의 정도의 GVHD 또는 중증 GVHD의 비율은 유사하다.
중증 GVHD를 앓는 것으로 진단된 환자는 MMF 및 코르티코스테로이드를 포함할 수 있는 다수의 의약을 2mg/kg/d 이상의 초기 용량으로 투여하고 반응시까지 그 양을 점차 줄이고 칼시뉴린 억제제 또는 시롤리무스를 첨가하거나 이의 용량을 증가시킬 수 있다.
인플릭시마브 투여는 급성 GVHD로 초기 진단된지 약 10일 내지 50일 후에 개시한다. 환자는 1주마다 또는 2주마다 1mg/kg의 용량을 2 내지 15회 투여받는다. 인플릭시마브가 투여되지 않은 환자와 비교할 때, 수용자는 GVHD의 징후 및 증상을 가질 가능성이 크다.
연구집단의 IFI
칸디다 종(아스페르길루스, 접합균증 등) 때문이 아닌 증명된 또는 가능한 IFI를 관찰 기간 동안 연구집단에서 진단한다.
중증 GVHD를 앓는 환자 간에 전반적 IFI는 약 1가지 사례/1000명의 GVHD 환자 - 경과일이다. 기선 특징 중에서, 골수 비절제성 HSCT는 약 3가지 사례/1000명의 GVHD 환자 - 경과일의 유의적으로 증가된 IFI IR과 연관되는 반면에, 중증 GVHD가 발병한 골수절제성 HSC 이식체 수용자는 IFI IR이 1가지 사례/1000명의 GVHD환자 - 경과일 미만이다. 조건화 요법, 말초혈 줄기 세포의 수용 및 GVHD 예방을 위한 사이클로스포린 사용과 같은 골수 비절제성 HSCT 프로토콜의 특징은 또한 약간 높은 IFI 위험성과 관련된다.
중증 GVHD를 앓는 환자 간에 GVHD의 발병으로부터 IFI까지의 시간은 10mg/kg 인플릭시마브 사용으로 계층화한다. 인플릭시마브 수용자는 유의적으로 높은 IFI 가능성이 있다. ECP 처리는 IFI의 통계학적으로 유의적인 증가를 나타내지 않는다.
중증 GVHD를 앓는 환자에서의 IFI의 발병에 대한 시간 의존적 콕스 회귀 분석 모델을 개발한다. 단일변량 위험 비(HR)를 모든 가능한 IFI 위험 요소에 대해 계산한다. 0.20 미만의 비조정 HR P 값을 갖는 특징만이 다변량 모델에서 고련된다.
기재된 골수 비절제성 HSCT와 동일 선상에 있는 변수는 별도로 포함되지 않으며, 10개의 IFI가 분석된다면 보다 높은 HR 및 0.05 미만의 P 값을 갖는 2개의 공변량이 최종 모델에서 유지된다. 인플릭시마브가 바람직하게는 중증 위장관 GVHD을 앓는 환자에게 투여되고 위장관 장기-특이적 등급 3 또는 4가 단일변량 콕스 상에서 IFI와 유의적으로 연관되는 것으로 밝혀진다면, 이 공변량이 기타 모델링된 공변량의 존재하에서는 유의적이지 않게 되더라도 이 공변량을 최종 모델에서 유지시켜 징후에 의한 교란(confounding by indication)을 최소화한다. 시간 의존적 공변량으로서 인플릭시마브 사용의 조정 HR은 약 14이고, 골수 비절제성 HSCT의 조정 HR은 약 8이다. 중증 위장관 기관 특이적 등급 3 또는 4의 GVHD의 조정 HR은 인플릭스마브 사용 및 공변량으로서 이식체 유형의 존재하에 약 4이다. 10mg/kg 인플릭시마브 노출의 IFI 위험까지의 시간 함수 플롯은 시간에 따라 증가되는 위험을 나타낸다. 1mg/kg 미만의 인플릭시마브의 사용은 HR의 유의적 증가를 나타내지 않는다. 단독의 ECP는 표준 요법만으로 처리된 환자와 유의적으로 상이하지 않은 HR을 나타낸다. 저용량 인플릭시마브와 ECP의 병용은 단독의 고용량 인플릭시마브보다 유의적으로 낮은 HR을 갖는다. 증가된 효능과 함께 이러한 치료 요법은 보다 효과적이며 안전한 치료 방식이다.
생존성
추적 기간의 종결시 전체 연구집단의 중간 생존 기간은 약 250 내지 400일이다. GVHD 중증도에 따라 계층화된 경우, 중증 GVHD를 앓는 환자의 중간 생존 기간은 GVHD를 앓지 않거나 중증이 아닌 GVHD를 앓는 환자의 중간 생존 기간에 비해 유의적으로 낮다. 중증 GVHD를 앓는 환자 중에서, 10mg/kg 인플릭시마브 수용자의 중간 생존 기간은 비-수용자의 중간 생존 기간에 비해 현저하게 낮다. ECP 처리된 환자는 표준 요법 환자 또는 저용량 인플릭시마브만을 투여한 환자보다 유의적인 생존 패턴을 갖는다. 표준 ECP 요법과 함께 인플릭시마브 용량을 1mg/kg로 저하시키는 것은 GVHD의 스코어의 유의적 개선을 유도하지만, 보다 고수준의 인플릭시마브와 연관된 IFI는 급격하게 통계학적으로 감소된다.
본 발명에 의해, 체외 광분리반출법과 TNFα 길항제를 병용하여 자가면역 질환 또는 반응, 아토피 질환, GVHD 또는 이식 거부반응을 앓는 피험자를 치료하는 방법이 제공된다.

Claims (18)

  1. (a) 환자 혈액의 일부분으로부터 수득되어, 광활성화가능한 화합물과 함께 당해 광활성화가능한 화합물을 활성화시키는 파장의 광을 사용하는 체외 광분리반출법 (extracorporeal photopheresis; ECP) 공정으로 처리된 세포 집단; 및
    (b) 3 mg/kg 미만의 인플릭시마브를 포함하는,
    이식편 대 숙주 질환 (GVHD)의 치료 또는 이의 하나 이상의 증상의 개선을 위한 배합 제제.
  2. 제1항에 있어서, 세포가 자가 백혈구인 배합 제제.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 광활성화가능한 화합물이 프소랄렌이고 광이 UVA인 배합 제제.
  5. 제4항에 있어서, 프소랄렌이 8-메톡시프로소랄렌 (8-MOP)인 배합 제제.
  6. 삭제
  7. 삭제
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