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KR101094032B1 - 약학적 등급의 플라스미드 ｄｎａ의 제조 방법 - Google Patents

약학적 등급의 플라스미드 ｄｎａ의 제조 방법 Download PDF

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KR101094032B1
KR101094032B1 KR1020067005411A KR20067005411A KR101094032B1 KR 101094032 B1 KR101094032 B1 KR 101094032B1 KR 1020067005411 A KR1020067005411 A KR 1020067005411A KR 20067005411 A KR20067005411 A KR 20067005411A KR 101094032 B1 KR101094032 B1 KR 101094032B1
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니꼴라 마에스뜨랄리
다비 가이야
띠에리 기이멩
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센텔리옹 에스아에스
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Abstract

본 발명은 pDNA를 회수하기 위한 박테리아 현탁액의 연속 알칼리 용해법을 제공한다. 본 발명은 또한 용해물 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 삼중 나선 친화성 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피를 비롯한 선택적인 추가 정제 단계들을 제공한다. 상기한 선택적 정제 단계들을 상기 연속 용해법과 병용되어, gDNA, RNA, 단백질, 내독소 및 기타 오염물을 실질적으로 포함하지 않는 고도로 정제된 pDNA 생성물을 생성할 수 있다.

Description

약학적 등급의 플라스미드 ＤＮＡ의 제조 방법{METHOD OF PREPARATION OF PHARMACEUTICALLY GRADE PLASMID DNA}
본 발명은 고도로 정제된 플라스미드 DNA의 제조 방법, 특히 플라스미드 기반 치료법에 사용하기 위한 약학적 등급의 플라스미드 DNA의 제조 및 분리 방법에 관한 것이다.
분자 생물학의 발달은 특히 백신 분야 및 인간 유전자 치료법 분야에 있어서 플라스미드 기반 치료법이 질병을 치료하기 위한 효과적인 방법이 될 수 있음을 분명히 시사한다. 그러나 이러한 기법에 있어 심각한 장애는, 관심있는 유전자를 세포로 전달하는 효율적인 방법의 개발에 있다. 정상 유전자를 인간 세포로 안전하고 효과적으로 전달하는 전도 유망한 방법 중 하나는 플라스미드 DNA를 매개로 하는 방법이다. 플라스미드 DNA는 관심있는 DNA 서열이 삽입될 수 있는, 폐쇄된 원형의 박테리아 DNA이다. pDNA는 일단 인간 세포로 전달되면, 이 pDNA는 삽입된 DNA 서열의 카피를 복제 및 생산하기 시작한다. 따라서, 연구자들은 플라스미드 DNA를 각종 질병 상태를 치료하기 위해 정상 유전자를 인간 세포로 전달하기 위한 유망한 수송체로서 간주하고 있다.
이러한 신규 기술 및 인간 치료법을 이행하기 위해서는 연구 개발에 막대한 양의 플라스미드 DNA가 필요하다. 유전자 치료법 및 기타 임상 분야에 사용되는 플라스미드 DNA는 일반적으로 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli; E. coli)와 같은 박테리아에 의해 생산되기 때문에, 박테리아 세포의 게놈 DNA(gDNA)로부터 플라스미드 DNA를 효과적으로 분리하여야 할 뿐 아니라 박테리아 세포 중의 내독소 및 단백질로부터 효과적으로 분리해야 할 필요가 있다. 따라서, 박테리아 세포로부터 다량의 플라스미드 DNA를 분리하는 데 이용될 수 있는 간단하고 견실하며 확대가 가능한 정제 방법에 대한 요구가 증가하고 있다.
임의의 플라스미드 정제 과정에 있어서 한 가지 중요한 단계는 그로부터 pDNA를 분리할 수 있는 세포 내용물을 방출시킬 수 있도록 박테리아 세포를 용해시키는 과정을 포함한다. 실제로, 먼저 세포 재현탁, 세포 용해와 숙주 오염물의 중화 및 침전의 3 단계를 수행할 필요가 있다. 세포 재현탁은 일반적으로 세포를 재현탁 완충액에 재현탁시키기 위해 수작업 교반 또는 자기 교반기와, 균질화기 또는 임펠러 혼합기를 이용한다. 세포 용해는 재현탁된 세포와 용해액(희석된 알칼리(염기) 및 계면활성제로 구성됨)을 혼합하기 위해 수작업 교반 또는 자기 교반을 수행하고, 이어서 이 혼합물을 실온(20∼25℃)에서 유지하거나 얼음 위에서 일정 시간(예를 들어, 5분) 동안 유지하여 용해를 완결함으로써 수행할 수 있다. 전술한 바와 같이, 수작업 교반 및 자기 교반은 확대가 불가능하다. 세 번째 단계는 숙주 오염물의 중화 및 침전이다. 두 번째 단계로부터의 용해물은 일반적으로 약한 교반 또는 자기 교반에 의해 저온 중화 용액과 혼합하여 용해물을 산성화한 다음, 얼음 속에 10∼30분간 두어 고분자량의 염색체 DNA, 숙주 단백질 및 기타 숙주 분자의 변성 및 침전을 촉진한다. 수작업 교반 및 자기 교반 둘 다 확대가 불가능하다.
일반적으로, 세포벽은 알칼리 처리 또는 아세트산칼륨(KOAc) 처리에 의해 또는 라이소자임으로 단시간 동안 처리하여 분해시킨다. RNase 역시 박테리아 현탁액의 RNA를 분해시키기 위해 일반적으로 첨가된다. 이러한 화학적 단계는 소규모로 세포를 용해시키는 데에는 효율적일 수 있다. 그러나, 점도가 증가하게 되면 대규모 처리 작업은 매우 어려워지게 된다. 플라스미드를 얻기 위한 대안의 간단하고 신속한 방법은 박테리아를 라이소자임으로 처리한 뒤, 적절한 완충액 중에서 약 100℃로 20∼40초간 끓여서 게놈 DNA, 단백질 및 세포 잔해물의 불용성 덩어리를 형성하고 주 오염물로서의 RNA와 함께 용액 중에 플라스미드를 남게 하는 과정을 포함한다. 그 후, 세포질막을 용해시키기 위해 NaOH 및 소듐 도데실 설페이트(SDS)의 혼합 용액을 첨가한다. NaOH는 DNA를 부분적으로 변성시키고 RNA를 부분적으로 변성시키며, SDS는 세포막을 용해시키고 단백질을 변성시키는 작용을 한다. 이어서, SDS-단백질 복합체 및 세포 잔해물은 5 N 아세트산칼륨(pH 4.8)을 첨가하여 침전시킨다. 이 시점에서, pH는 상기 조작에 사용된 NaOH를 중화시키고 플라스미드를 재생시키는 데 있어서 중요하다. 그러나, 이 기법은 다량의 박테리아 발효로 규모를 확대하는 데에는 적합하지 않으며, 이 기법은 5 리터 미만의 발효물에 의도된 기법이다. 그 후, 침전물을 제거하기 위해 원심분리를 실시하여, 상청액에서 플라스미드를 얻는다. 또한, 이와 같은 일련의 조작은 박테리아 염색체 DNA가 더 작은 단편 및 응집물로 분해됨으로 인하여 플라스미드를 오염시키는 것을 방지하기 위해 천천히 신중하게 혼합할 것을 요하며, 따라서 대규모 처리 공정의 이행은 곤란하다.
알칼리 용해로 알려진, 널리 이용되는 또 다른 세포 용해 방법은 박테리아 세포의 현탁액(용액 1)을 알칼리 용해액(용액 2)과 혼합하는 과정으로 구성된다. 용액 2는 박테리아 세포를 용해시켜 세포내 물질을 방출시키기 위한 계면활성제, 예를 들어 소듐 도데실 설페이트(SDS) 및 세포의 단백질 및 핵산(특히 gDNA 및 RNA)을 변성시키기 위한 알칼리, 예를 들어 수산화나트륨으로 구성된다. 세포가 용해되고 DNA가 변성됨에 따라, 용액의 점도가 급격히 증가하게 된다. 변성 후에는, 산성 용액, 예를 들어 아세트산칼륨(용액 3)을 첨가하여 수산화나트륨을 중화시켜 핵산의 재생을 유도한다. gDNA의 긴 단편은 무작위적으로 재회합하여 응집물로서 침전되는 망상조직을 형성하여, 단백질, 지질 및 기타 핵산을 포획한다. 도데실 설페이트의 칼륨염 역시 침전되어, 이것과 회합된 단백질을 침전시킨다. 서로 꼬여 있는 pDNA(플라스미드 DNA)의 두 가닥은 일반적으로 재회합하여 초기 플라스미드를 재형성하며, 이것이 용액 중에 남는다.
종래 기술은 일반적으로 회분식 방식의 용해 기법을 개시하는데, 즉, 용액을 용기 또는 탱크에 순차적으로 첨가하여 서로 다른 용액을 혼합하는 용해 기법을 개시한다. 알칼리 용해물은 조작이 매우 까다로운 점탄성 유체이기 때문에, 이 방법에 의하면 개별 용액들의 혼합이 어렵다는 문제가 있다. 전단 응력이 gDNA의 단편화를 유발하고, 이는 pDNA로부터 분리하기가 매우 어려워지기 때문에, 유체에 전단 응력이 가해지는 것을 방지하기 위한 방법이 필요하다. 또한, 대형 pDNA(즉, 10 kb쌍 초과)는 또한 혼합 과정에서 전단 손상에 노출되기 쉽다. 세포 현탁액을 함유하는 용액을 용해액과 혼합한 후에, 점탄성 알칼리 용해물은 중화액과 혼합한다. 이 혼합 과정 역시, 용액의 점탄성 특성으로 인하여 문제가 될 수 있다.
게다가, 회분식 용해 공정을 확대하는 데 있어서의 또 다른 문제점은 gDNA의 단편화를 방지하기 위해 전단 응력을 제한하면서 개별 유체들의 혼합 효율성을 유지하는 것에 있다. 전술한 바와 같이, 단편화된 게놈 DNA의 크로마토그래피 거동은 pDNA의 것과 매우 유사하여, 표준 정제 공정에 의해 제거하는 것이 실질적으로 불가능하다. 따라서, 박테리아 세포를 용해시키기 위해 회분식 공정을 이용하는 것에는, 예를 들어 규모 확대, 단편화된 gDNA에 의한 오염에 기인한 회수된 pDNA의 품질 불량 및 상대적으로 낮은 pDNA 수득량과 같은 여러 가지 단점이 있다.
회분식 방법과는 달리, 일련의 정적 혼합기를 사용하여 다양한 세포 용해액을 연속적으로 혼합하는 여러 방법들 역시 제안된 바 있다. 이러한 방법에 따르면, 세포 현탁액과 세포 용해액을 동시에 정적 혼합기에 첨가한다. 그 후, 제1 정적 혼합기로부터 배출된 용해된 세포 용액과 침전 용액은 동시에 제2 정적 혼합기에 첨가된다. 이러한 제2 혼합기로부터 배출되는 용액은 침전된 용해물 및 플라스미드를 포함한다(WO 97). 세포를 용해시키는 다른 연속적 방법은 현탁된 세포를 70∼100℃로 가열하는 유통(flow-through) 열 교환기를 사용하는 것을 포함한다. 열 교환기에서의 세포 용해 후에, 배출 스트림은 연속 흐름 또는 회분식 원심분리에 적용되며, 이 과정에서 세포 잔해물 및 게놈 DNA가 침전되어, 상청액 중에 플라스미드 DNA가 남게 된다.
따라서 다량의 미생물 발효액으로부터의 플라스미드 DNA의 대규모 분리 및 정제에는 개선된 플라스미드 조제 공정의 개발이 요구된다.
박테리아 세포를 용해시키기 위해 현재 다수의 방법이 이용되고 있지만, 이 방법들 중 어느 방법도 혼합 단계에서 발생하는 전단력 및 유체의 점탄성 특성에 의해 유발되는 문제점들을 해결하지 못한다. 따라서 본 발명은 박테리아 세포 현탁액의 대규모 연속 알칼리 용해를 위한 신규 방법에 관한 것이며, 전단력을 제한하는 데 있어서 큰 장점을 제공한다.
플라스미드 DNA 제조 과정에 있어서 또 다른 중요한 단계는 플라스미드 단리 또는 분리 및 정제 단계이다. 박테리아 발효액으로부터 플라스미드 DNA를 분리 및 정제하기 위한 전통적 기법은 소규모 또는 실험실 규모의 플라스미드 제조에 적합하다. 이 플라스미드를 포함하는 박테리아 숙주 세포를 파괴한 후에, 아세테이트 중화를 실시하여 숙주 세포 게놈 DNA의 침전을 유발하고, 일반적으로 예를 들어 원심분리에 의해 단백질을 제거한다. 액체상은 플라스미드 DNA를 포함하며, 플라스미드 DNA는 알콜에 의해 침전시킨 뒤, 에티디움 브로마이드 존재 하에 CsCl을 사용한 등밀도 원심분리에 적용하여, 다양한 형태의 플라스미드 DNA, 즉 수퍼코일형, 열린 원형 및 선형의 형태를 분리한다. 잔류 에티디움 브로마이드를 제거하기 위해서는 부탄올을 사용한 추가 추출이 필요하며, 그 뒤 알콜을 사용하여 DNA를 침전시킨다. 숙주 세포 단백질을 제거하기 위해서는 추가적인 정제 단계를 수행한다.
플라스미드 DNA를 분리하기 위한 상기와 같은 현행 방법은 여러 가지 단점을 갖고 있다. 예를 들어, 다량의 가연성 유기 용매(예를 들어, 에탄올 및 이소프로판올) 및 독성 화학물질, 예를 들어 에티디움 브로마이드, 페놀 및 클로로포름의 사용을 수반하는 정제 방법은 일반적으로 플라스미드 DNA의 대규모 분리 및 정제에 바람직하지 않다. 플라스미드 DNA 정제를 위해 염화세슘 원심분리에 대한 대안의 방법, 예컨대 크기 배제 크로마토그래피, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 및 역상 또는 음이온 교환에 기초한 다양한 크로마토그래피적 방법이 이용될 수 있다. 이러한 대안의 방법들은 실험실 규모의 소량의 연구 재료의 제조에는 적합할 수 있지만, 일반적으로 규모 확대가 용이하지 않으며 다량의 플라스미드 DNA를 생산할 수 없다.
전술한 일련의 조작에 의하면, 비교적 고순도의 플라스미드를 얻는 것이 가능하다(이하에서는, 상기한 핵산 분리 및 정제 방법을 화학적 분리 방법이라 칭한다). 그러나, 화학적 분리 방법에 의하면, 분리 및 정제 과정이 복잡하고, 다량의 유기 용매를 사용하여야 하며, 이로 인하여 폐용매의 처리 등과 같은 여러 가지 문제점이 발생한다.
화학적 분리 및 정제 방법 이외에도, 전기영동에 의한 플라스미드 분리 방법이 있다. 전기영동법에는 종이 전기영동 및 겔 전기영동이 있으며, 겔 전기영동이 현재 일반적으로 이용되고 있다. 전기영동법은 고순도의 플라스미드를 얻을 수 있다는 장점을 갖지만, 분리 시간이 길고 수집이 어려우며 샘플 로딩량이 적다는 등의 많은 문제점을 갖고 있다. 그 결과, 전기영동 분리는 상기 화학적 분리 및 정제 방에 의해 정제된 플라스미드 분획의 순도를 추가로 개선하고자 하는 경우에만 이용되는 것이 현 실정이다.
플라스미드 DNA의 두 가지 형태를 분리하기 위해 현재 이용되고 있는 방법은 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 계면활성제 및 기타 성분(예를 들어, 헥사민 코발트, 스퍼미딘 및 폴리비닐피롤리돈(PVP))과 같은 첨가제의 사용과 병행하여, 이온 교환 크로마토그래피(Duarte et al., Journal of Chromatography A, 606 (1998), 31-45) 또는 크기 배제 크로마토그래피(Prazeres, D.M., Biotechnology Techniques Vol. 1, No. 6, June 1997, p 417-420)를 이용한다. 그러나 현재 알려진 방법은 수퍼코일형 및 열린형(또는 풀린형) DNA의 능률적이고 비용 효율적인 방법을 제공할 수 없다. 또한, 공지된 방법들 중 다수는 PEG 또는 기타 첨가제를 사용한다는 단점을 내포하고 있는데, 이러한 첨가제들은 추가적인 분리, 폐기 및 품질 관리 방법을 요하며, 이는 난해하고 더 시간 소모적이고 더 고비용을 수반하기 때문에, 플라스미드 DNA의 제조에는 바람직하지 않을 수 있다. 수퍼코일형 및 풀린형의 플라스미드 DNA의 분리를 위한 공지의 방법의 또 다른 형태는, 역시 처리 과정에서 아세토니트릴, 에탄올 및 기타 성분, 예컨대 트리에틸아민 및 테트라부틸 암모늄 포스페이트를 사용하는 매우 고가이며 독점적인 수지를 이용한다. 수퍼코일형 및 풀린형 DNA를 분리하기 위한 다른 방법은 크기 배제 크로마토그래피에 기초하는데, 이 방법은 작은 크기 차이에 기초하여 두 가지 형태의 플라스미드 DNA를 분리하는 과정을 포함한다. 이러한 컬럼들은 비교적 길고, 심각한 규모 확대 문제를 내포하여, 대규모 생산을 이행하는 데 부적합하다. 게다가 크기 배제 방법은 DNA의 높은 점성으로 인하여 플라스미드 DNA 용액을 사용하여 얻기에는 부적합한 농축된 샘플 용액을 필요로 한다. 플라스미드 DNA 제조물은 박테리아 제조물로부터 생산되며, 풀린형 플라스미드 DNA와 수퍼코일형 플라스미드 DNA의 혼합물을 포함하는 경우가 많고, FDA에 의해 요구되는 바와 같이, 내독소 제거를 요하는데, 왜냐하면 다수의 박테리아 숙주에 의해 생산된 내독소는 이 플라스미드 DNA를 수용한 숙주에서 발열 또는 패혈증과 같은 염증성 반응을 유발하는 것으로 알려져 있기 때문이다. 이러한 내독소는 일반적으로 리포폴리사카라이드 또는 이들의 단편이며, 이것들은 그램 음성 박테리아의 외막의 성분으로서 숙주 세포의 DNA 제조물 및 숙주 세포막 또는 거대분자 중에 존재한다. 따라서 내독소의 제거는 치료적 또는 예방적 용도를 위한 플라스미드 DNA의 정제에 있어서 중요하고 필수적인 단계이다. 플라스미드 DNA 용액으로부터의 내독소의 제거는 내독소의 음으로 하전된 구조를 주로 이용하였다. 그러나 플라스미드 DNA 역시 음으로 하전되어 있으며 따라서 분리는 통상적으로 이들 분자 둘 다에 결합하고 특정 조건 하에서는 내독소에는 결합하지만 플라스미드 DNA는 차별적으로 용출시키는 음이온 교환 수지를 사용하여 수행한다. 이러한 분리에 의하면, 유의적인 양의 내독소가 플라스미드 DNA와 함께 용출되기 때문에 단지 부분적 제거만 이루어지고/지거나, 플라스미드 DNA의 회수율이 매우 낮다.
따라서 다량의 미생물 발효물로부터의 플라스미드 DNA의 대규모 분리 및 정제에는 개선된 플라스미드 제조 방법의 개발이 필요하다. 다량의 플라스미드 DNA를 더 간단한 방식으로 더 짧은 시간에 분리 및 정제하는 방법 역시 요구된다. 또한, 플라스미드에 기초한 연구 및 치료법에 사용하기 위해서는, 재현 가능한 방식으로 동일한 구조를 유지하는 핵산을 분리 및 정제할 수 있는 것이 바람직하며, 인체에 대한 불순물의 유해 효과를 방지하기 위해 고순도로 분리 및 정제된 핵산이 필요하다.
그러나 상기 종래의 방법에는 충분히 고순도의 핵산, 특히 플라스미드 DNA를 다량으로 얻을 수 없다는 문제점이 있다. 따라서, 본 발명의 목적은, 단시간에 최고 순도로 다량의 플라스미드 DNA를 분리할 수 있는, 적어도 2 단계의 크로토그래피 단계를 이용하는 분리 방법을 제공하는 것이다.
발명의 개요
본 발명은 고도로 정제된 플라스미드 DNA를 제조 및 분리하기 위한 방법을 발견하여 이루어진 것이다. 본 발명의 방법에 의해 제조 및 분리된 플라스미드 DNA는 오염성 염색체 DNA, RNA, 단백질 및 내독소를 아주 소량 함유한다. 본 발명에 따라 제조된 플라스미드 DNA는 플라스미드 기반 치료법을 위한 충분한 순도를 갖는다.
따라서, 본 발명은 (a) 세포를 용해시키는 용액과 세포 현탁액을 신속하게 혼합하는 난류 수단; 및 (b) (a)에서 형성된 혼합물을 실질적인 교반없이 항온처리(incubate)할 수 있도록 하는 층류 수단이 존재하는 세포 용해 단계를 포함하며, (a)에서 형성된 혼합물은 난류 수단으로부터 층류 수단으로 유입되는 것인, 고도로 정제된 플라스미드 DNA를 제조 및 분리하는 방법을 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 메카니즘은 용해액을 중화시키는 제2 용액을 첨가하는 수단을 더 포함할 수 있는데, 이때 (b)에서 항온처리된 상기 혼합물은 층류 수단으로부터 제2 용액을 첨가하는 수단으로 유입된다.
또 다른 구체예에서, 본 메카니즘은 (a) 난류 수단 내에서 세포를 알칼리 용해액과 혼합하는 단계; 및 (b) 산성 용액을 첨가하여 알칼리 용해액을 중화시키는 단계를 포함하는, 세포로부터 플라스미드 DNA를 분리하기 위한 방법에 이용될 수 있다.
본 발명은 또한 실질적으로 오염물을 포함하지 않기 때문에 약학적 등급의 DNA가 될 수 있는 고도로 정제된 플라스미드 DNA를 제조 및 분리하는 방법을 포함한다.
본 발명의 또 다른 목적은 핵산 및 플라스미드 DNA를 분리 및 정제하기 위한 방법에 관한 것이다. 보다 상세히 말하면, 본 발명은 연구 및 플라스미드 기반 치료법에 유용한 약학적 등급의 핵산 및 플라스미드 DNA를 분리하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따라 분리된 플라스미드 DNA 제조물은 적어도 삼중 나선 친화성 크로마토그래피를 포함하고 음이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피를 추가로 포함할 수 있는 정제 단계에 적용될 수 있다.
따라서 이 방법들은 후속의 음이온 교환 크로마토그래피 및 삼중 나선 친화성 크로마토그래피와, 추가의 소수성 상호작용 크로마토그래피와 병행되는, 본원에 기술된 연속 알칼리 용해 단계를 포함한다.
따라서 이 방법들은 또한 음이온 교환 크로마토그래피, 삼중 나선 친화성 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피의 후속 단계들이 병행되는, 본원에 기술된 연속 알칼리 용해 단계를 포함한다. 용해물 여과 또는 다른 응집물 제거가 1차 크로마토그래피 단계에 선행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 숙주 세포/플라스미드 DNA 조합으로부터의 플라스미드 DNA의 수율을 최대화하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 박테리아 숙주 RNA를 실질적으로 포함하지 않는 플라스미드 DNA 제조물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 박테리아 숙주 단백질을 실질적으로 포함하지 않는 플라스미드 DNA 제조물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 박테리아 숙주 염색체 DNA를 실질적으로 포함하지 않는 플라스미드 DNA 제조물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 박테리아 숙주 내독소를 실질적으로 포함하지 않는 플라스미드 DNA 제조물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 연구 및 플라스미드 기반 치료법에 사용할 수 있도록 고순도이고 대규모 제조로의 규모 확대에 적절한 약학적 등급의 플라스미드 DNA를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
따라서 본 발명은 실질적으로 오염물이 포함되어 있지 않고 종래 기술에 비하여 고순도이며 무결한 상태인 약학적 등급의 플라스미드 DNA를 포함하며, 이 DNA는 벡터 골격, 치료 유전자 및 관련 조절 서열을 포함한다.
본 발명은 또한, 실온에서 장기간 동안 안정하고 분해되지 않은 상태로 유지되어, 연구 및 관련 인체 치료법에 사용되는 플라스미드 DNA의 보관에 유용한 플라스미드 DNA 액체 제제에 관한 것이다.
마지막으로 본 발명은 알칼리 용액을 세포 현탁액과 반대 방향에서 주입할 수 있는 제1 혼합기 또는 주입기, 상기 혼합물 중에 난류를 발생시키는 소직경의 제1 튜브, 상기 혼합물 중에 층류를 발생시키는 대직경의 제2 튜브, 한쪽 말단에서 중화 용액을 주입하고 다른 쪽 말단에서 혼합물을 회수하는 제2 혼합기 또는 주입기를 포함하는, 연속 알칼리 세포 용해 장치에 관한 것이다.
본 발명의 추가적인 목적 및 장점은 후술하는 상세한 설명에 일부 기재되어 있으며, 이 상세한 설명으로부터 부분적으로 명확히 이해할 수 있거나, 또는 본 발명의 실시에 의해 습득할 수 있을 것이다. 본 발명의 목적 및 장점은 첨부하는 특허 청구의 범위에 구체적으로 기재된 구성요소 및 조합에 의해 실현되고 달성될 것이다.
전술한 일반적 설명 및 후술하는 상세한 설명은 단지 예시 및 설명을 위한 것으로 청구되는 본 발명을 제한하려는 의도는 아니다.
본 명세서에 포함되고 본 명세서의 일부를 구성하는 첨부 도면은 본 발명의 한 가지(여러 가지) 구체예(들)를 설명과 함께 예시하며, 본 발명의 원리를 설명하는 데 도움이 된다.
도 1은 본 발명의 연속식 세포 용해 방법에 사용될 수 있는 장치의 개략도이다.
도 2는 연속식 세포 용해 장치에서의 혼합기 M1의 개략도이다.
도 3은 음이온 교환 크로마토그래피(AEC)의 단일 단계, 또는 삼중 나선 친화성 크로마토그래피(THAC)와 병용되는 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 이용한 2 단계 방법, 및 음이온 교환 크로마토그래피 단계, 삼중 나선 친화성 크로마토그래피 단계 및 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 단계를 함께 포함하는 3 단계 방법을 이용한 gDNA, RNA, 단백질, 내독소 오염물의 정제 수율을 비교한 표이다. ND는 측정되지 않았음을 의미한다(저감도 분석 방법).
도 4는 음이온 교환 크로마토그래피(AEC), HAC, 히드록시아파타이트 크로마토그래피(HAC), 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 역상 크로마토그래피(RPC), 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 삼중 나선 친화성 크로마토그래피(THAC)를 단독으로 또는 병용하는 것과 같은, 플라스미드 DNA의 분리 및 정제를 위한 다양한 방법들과 본 발명에 따른 방법을 비교한 표이다. 정제된 플라스미드 DNA의 품질에 있어서의 결과를 여기에 수록하였다. ND: 검출되지 않음(저감도 분석 방법).
도 5A 및 도 5B는 +25℃∼+5℃에서 최대 90일간 보관된 플라스미드 DNA의 탈퓨린화율 및 열림률(nicking rate)(개방 원형 플라스미드 형태의 형성)을 보여주는 그래프이다.
정의
산성이란 산을 의미하거나, 산을 포함하는 것, pH 7 미만인 것을 의미한다.
알칼리(성)이란 알칼리 또는 염기를 의미하거나, 염기를 포함하는 것, pH가 7보다 큰 것을 의미한다.
연속적이란 중단되지 않는 것, 끊임이 없는 것을 의미한다.
게놈 DNA란 염색체로부터 유래하거나 염색체 내에 존재하는 DNA를 의미한다.
층류란 각 입자가 모든 입자에 대해 평행한 방향으로 이동하는 수용액류 중의 흐름의 유형을 의미한다.
용해물이란 세포 용해 과정에서 생성된 물질을 의미한다. 용해란 용어는 용해제를 함유하는 용액을 사용한 화학적 처리에 의해 완충된 용액(즉, 세포 현탁액) 중에 존재하는 세포벽 및/또는 세포막을 파괴하는 작용을 의미한다. 용해제에는, 예를 들어 알칼리, 계면활성제, 유기 용매 및 효소가 포함된다. 바람직한 구체예에서, 세포의 용해는 숙주 세포로부터 무손상 플라스미드를 방출시키기 위해 수행된다.
중화란 (용액을) 중성으로 만들거나 (산 또는 염기/알칼리)가 중화되도록 하는 것이다. 이 용어에 의하면, 용액을 중화시키는 물질은 용액의 pH를 pH 5∼7, 바람직하게는 약 7, 보다 바람직하게는 이전보다 7에 더 가깝게 하는 것이다.
뉴톤 유체란 유체 중의 전단 응력이 속도 기울기에 비례하고 전단면에 수직인 유체이다. 비례 상수는 점도로서 알려져 있다. 뉴톤 유체의 예로는 액체 및 기체가 포함된다.
비뉴톤 유체는 유체 중의 전단 응력이 단지 속도 기울기에 비례하지 않고 전단면에 수직인 유체이다. 비뉴톤 유체는 잘 정의된 점도를 갖지 않을 수 있다. 비뉴톤 유체는 플라스틱 고체, 파워-로(power-law) 유체, 점탄성 유체(점성과 탄성을 둘 다 갖는 것) 및 시간 의존적 점도 유체를 포함한다.
플라스미드 DNA는 염색체가 아닌 DNA의 고리로 구성된 작은 세포 함유물을 의미하며, 이것은 자신에게 삽입된 비내인성 DNA 단편을 보유하는 능력을 가질 수 있다. 플라스미드 구성을 위한 방법은 문헌[Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]에 기재된 것들을 포함한다.
본 발명의 목적상, 흐름(유동)이란 용어는 특정 유량(즉, 리터/분)에서, 통 상적으로 펌프 작용에 의해 혼합기를 통해 액체를 통과시키는 것을 의미한다. 혼합기를 통과하는 유량은 용해, 침전 및 혼합의 효율에 영향을 주는 것으로 생각된다.
"열린형(nicked)" 또는 "풀린형(relaxed)" DNA는 수퍼코일형이 아닌 DNA를 의미한다. "수퍼코일형(supercoiled)" DNA는 당분야에 널리 알려진 용어이다.
"오염성 불순물"은 DNA로부터 분리 또는 단리할 필요가 있는 임의의 물질이다. 오염성 불순물은, 이에 국한되는 것은 아니지만, 숙주 세포 단백질, 내독소, 숙주 세포 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 오염성 불순물로 간주되는 것은 본 발명의 방법이 실시되는 내용에 따라 달라질 수 있는 것으로 이해되어야 한다. "오염성 불순물"은 숙주 세포에서 유래된 것일 수도 있고 아닐 수도 있는데, 즉, 숙주 세포 불순물일 수도 있고 아닐 수도 있다.
제1 성분(예컨대 DNA)을 "분리하는" 또는 "정제하는"이란 처음에 제1 성분과 함께 발견되는 다른 성분들로부터 제1 성분을 농축시키는 것을 의미한다. 원하는 및/또는 달성 가능한 정제 정도는 본원에서 제시한다.
"실질적으로 포함하지 않는"과, "고도로 정제된"이란 순도가 약 95%, 바람직하게는 98.99%를 초과하거나 오염물이 없는 것, 또는 5% 미만, 바람직하게는 1∼2% 미만의 오염물을 보유하는 것을 의미하는 것으로 본원에서 정의된다.
본원에서 약학적 등급의 DNA는 약 5% 이하, 바람직하게는 약 1∼2% 이하의 세포 성분, 예를 들어 세포막을 포함하는 DNA 제조물로서 정의된다.
본원에서 약학적 등급의 DNA는 게놈 DNA, RNA 및 단백질 오염물을 백만분율, 즉 ppm(< 0.0001%, 즉 < 0.0001 mg/100 mg 플라스미드 DNA) 수준으로 포함하는 DNA 제조물로서 정의된다.
보다 정확하게는, 본원에서 약학적 등급의 플라스미드 DNA는 약 0.01% 미만, 또는 0.001% 미만, 바람직하게는 0.0001% 미만, 또는 바람직하게는 0.00008% 미만(< 0.00008%, 즉 < 0.00008 mg/100 mg 플라스미드 DNA)의 염색체 DNA 또는 게놈 DNA를 함유하는 DNA 제조물을 의미한다.
본원에서 약학적 등급의 플라스미드 DNA는 약 0.01% 미만, 또는 0.001% 미만, 바람직하게는 0.0001% 미만, 또는 바람직하게는 0.00002% 미만(< 0.00002%, 즉 < 0.00002 mg/100 mg 플라스미드 DNA)의 RNA 오염물을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다.
약학적 등급의 플라스미드 DNA는 약 0.0001% 미만, 가장 바람직하게는 0.00005% 미만(< 0.00005%, 즉 < 0.00005 mg/100 mg 플라스미드 DNA)의 단백질 오염물을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다.
본원에서 약학적 등급의 DNA는 0.1 EU/mg 미만의 내독소를 함유하는 DNA 제조물을 의미한다.
본원에서 약학적 등급의 DNA란 바람직하게는 형태가 주로 원형인 DNA 제조물, 보다 정확히는 폐쇄 원형 플라스미드 DNA를 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 이상 포함하는 DNA 제조물을 의미한다.
T 튜브는 T 형상의 튜브 구조를 의미하며, 여기서 T 형상은 그 구조 내에 생성된 1 조각의 튜브에 의해 또는 그 구조를 생성하도록 조합된 1 조각 이상의 튜브에 의해 형성된다. T 튜브는 3개의 팔과 팔이 연결되는 중심부를 갖는다. T 튜브는 두 유체가 각각 T의 팔 중 한쪽으로 유입되고 중심부에서 합류되고 세 번째 팔에서 유출되기 때문에 성분들을 혼합하는 데 이용될 수 있다. 혼합은 유체가 합류할 때 일어난다.
난류란 주 흐름 방향에 대해 횡방향으로의 유체 입자의 불규칙적이고 무작위적인 이동을 의미하며, 난류 중에서는 특정 지점에서 속도의 크기 및 방향이 돌발적으로 변화한다.
점탄성 유체란 점성과 탄성을 둘 다 가지는 유체를 의미한다.
본 발명은 약학적 등급의 플라스미드 DNA를 고수율로 제조하기 위한 규모 확대가 가능한 방법을 발견한 것에 기초한 것이다. 특히, 본 발명은 숙주 세포의 연속적 알칼리 용해를 이용하여 고도로 정제된 플라스미드 DNA를 제조 및 분리하기 위한 방법의 발견에 기초한 것이다.
제1 단계로서, 숙주 세포를 접종하는데, 즉, 지수 성장기 세포에서 플라스미드 DNA로 형질전환시키고, 테트라사이클린과 같은 항생제 함유 LB 배지를 포함하는 평판 위에 도말한다. 그 후 평판으로부터 단일 콜로니들을 떼어내어, 개별 멸균 플라스틱 Erlenmeyer 플라스크에서 적절한 항생제(테트라사이클린)가 보충된 20 ml LB 배지에 각각 접종하고, 진탕 배양기에서 37℃에서 12∼16 시간 동안 배양한다. 그 후, 이 배양물들을 2 L Erlenmeyer 플라스크에서 보충된 멸균 LB 배지 200 ml를 접종하는 데 사용하였다. 이것은 진탕 배양기에서 37℃ 및 200 rpm으로 배양하여 두 개의 Erlenmeyer 플라스크를 접종하는 데 사용하고, 진탕 배양기에서 30℃ 및 200 rpm으로 배양하여, 중지수기에서 5 시간 후 OD 600 nm가 2 유닛일 때 발효기를 접종하는 데 사용하였다.
숙주 세포 배양 및 접종에 관해서는 당분야에 널리 알려져 있다. 일반적으로, 숙주 세포는, 다량의 플라스미드 DNA를 보유하도록 높은 생물량에 도달하여 세포가 지수 성장이 될 때까지 배양한다. 두 가지의 상이한 방법, 즉 회분식 발효와 유가식(반회분식) 발효를 이용할 수 있다.
회분식 발효에 의하면 성장 온도 및 사용되는 탄소원의 조작을 통해 성장 속도를 제어할 수가 있다. 본원에서 사용되는 "회분식 발효"란 용어는 세포 성장 및 배양된 세포에 포함된 플라스미드의 생산을 위해 요구되는 모든 영양분이 접종 시에 용기 내에 과량 존재하는(예를 들어, 종래 기술의 영양분 농도보다 10배 과량) 세포 배양 방법으로서, 이에 의하면, 멸균후 멸균 용기에 영양분을 첨가할 필요가 없고 복잡한 공급 모델 및 전략이 필요하지 않다.
본 발명에 따라 유용한 또 다른 유형의 발효는 유가식 발효로서, 이 방식에서는 세포가 성장하는 중에 배양물에 영양분을 첨가하여 세포 성장 속도를 조절한다. 본원에서 사용되는 "유가식 발효"란 발효 중에 배양물에 첨가되는 대사산물을 신중하게 모니터하여 성장 속도를 조절하는 세포 배양 방법을 의미한다. 본 발명에 따른 유가식 발효에 의하면, 세포 배양물이 회분식 발효보다 더 높은 생물량에 도달할 수 있다.
발효 공정의 예와 대표적인 공급물 첨가 속도는 50 L 제조물에 대하여 하기에 기재하였다. 그러나, 예를 들어 10 L, 50 L 또는 500 L를 초과하는 다른 용량들도, 장치의 규모에 따라, 후술하는 예시적인 공급 속도를 이용하여 처리할 수 있다.
고도로 농축된 회분식 배지 및 유가식 배지 발효는, 지수 성장기에 있으면서 비(specific) 플라스미드 수율을 최대화하고 높은 생물량으로 회수가 가능하게 하는 고밀도 세포 배양물의 생산에 적합하다.
유가식 발효는 탄소원으로서 글루코스 또는 글리세롤을 사용한다. 발효는 초기 탄소 기질(글루코스)가 소모될 때까지 회분식으로 수행한다. 이 시점은 DO의 급격한 상승에 의해 인식되며, 이 사건 직후에 취한 샘플의 글루코스 분석에 의해 확인된다. 그 후 사전에 프라이밍한 공급물 배지 펌프를 가동한다. 펌프 속도는 Curless 등(Bioeng. 38: 1082-1090, 1991)으로부터 도출된 모델에 의해 결정하며, 상기 문헌은 본원에서 그 전문을 참고 문헌으로 인용한다. 이 모델은 유가식 공정의 공급 단계의 조절을 용이하게 하기 위해 고안된 것이다. 초기 회분식 공정에서는, 최고 비 성장 속도, max로 성장하는 세포에 의해 비억제 농도의 기질이 소모되어, 접종 후에 생물량 수준이 급격히 상승한다. 배양물은 독성 대사산물의 축적으로 인하여 이 속도에서 무한 증식할 수는 없다(Fieschio et al., "Fermentation Technology Using Recombinant Microorganisms. "In Biotechnology, eds. H.J. Rhem and G. Reed. Weinheim: VCH Verlagsgesellschaft mbH 7b: 117-140, 1989). 연속적인 대수적 성장을 위해서는, 이 모델은, 생육 제한 탄소 기질의 시간 기준 공급 속도를 계산하여, 피드백 제어에 대한 요구 없이, 조작자에 의한 설정에서 유가식 성장 단계를 제공한다. 이것은 억제성 이화 생성물의 축적을 유발하지 않고 높은 생물량을 제공하기에 충분한 수준에서 선택된다.
일반적으로, 회분식 발효는 농축된 회분 배지에 존재하는 다량의(예를 들어 종래 기술 농도보다 4배 이상) 전구체를 사용한다. 특히, 농축된 회분 배지 중의 효모 추출물의 양은 5 g/L(LB 배지에서와 같이)∼20 g/L이며, 다량의 성장 인자 및 핵산 전구체를 제공한다. 배지에는 또한 유기 질소의 공급원으로서 작용하는 황산암모늄(5 g/L)을 보충한다. 유가식 발효에서 공급 과정 동안의 전구체(황산암모늄 형태의 유기 질소)의 첨가는 플라스미드 품질에 대한 해로운 효과를 방지하도록 계획된다.
본 발명에 따른 방법의 또 다른 중요한 측면은 세포 용해이다. 따라서, 본 발명은 (a) 세포 현탁액(도 1에서 용액 1)을, 세포를 용해시키는 용액(도 1에서 용액 2)과 신속하게 혼합하는 난류 수단; 및 (b) (a)에서 형성된 혼합물을 실질적인 교반없이 항온처리할 수 있도록 하는 층류 수단(이때, (a)에서 형성된 혼합물은 난류 수단으로부터 층류 수단으로 유입된다)이 존재하는 세포 용해 단계를 포함하는, 고도로 정제된 플라스미드 DNA의 제조 및 분리 방법을 포함한다.
본 발명의 한 구체예에 따르면, 이 메카니즘은 용해액을 중화시키는 제2 용액(도 1에서 용액 3)을 첨가하는 수단을 추가로 포함할 수 있는데, 여기서 (b)에서 항온처리된 혼합물은 층류 수단으로부터 제2 용액을 첨가하는 수단으로 유입된다.
또 다른 구체예에서, 이 메카니즘은 (a) 난류 수단에서 알칼리 용해액과 세포를 혼합하는 단계; 및 (b) 산성 용액을 첨가함으로써 알칼리 용해액을 중화시키는 단계를 포함하는, 세포로부터 플라스미드 DNA를 분리하기 위한 방법에 이용될 수 있다.
박테리아 세포를 용해시키기 위해 현재 이용되고 있는 수 많은 방법에도 불구하고, 이들 방법 중 어떠한 방법도 혼합 단계 중에 발생하는 전단력과 유체의 점탄성 특성에 의해 유발되는 문제점들을 해결하지 못하였다. 본 발명의 한 가지 대상은 점탄성 유체가 발생하기 전에 세포 현탁액(용액 1)과 알칼리성 용액(용액 2)을 균일하게 매우 신속히 혼합하기 위해 T 튜브를 사용하는 방법이다. 따라서, 본 발명에 따른 연속적 용해는 전단력을 제한하는 데 있어서 중요한 장점을 제공한다. T 튜브는 혼합된 유체의 접촉 시간을 증가시키기 위해 일반적으로 직경이 1 cm 이하, 바람직하게는 약 2∼8 mm, 보다 바람직하게는 약 6 mm인 작은 직경의 튜브를 가지지만, 이 방법은 튜브를 통과함으로써 유도되는 혼합을 이용하지는 않는다. 하기 표 1은 각각 난류, 층류 및 난류를 발생시키는 수단의 파라미터 B1a, B1b, B2의 변화량과, 도 1에 도시된 바와 같은 이들의 해당 유량 S1, S2 및 S3를 제시한다.
[표 1]
B1a(60 L/h) B1b(60 L/h) B2(90 L/h) 유량
직경 길이 직경 길이 직경 길이 S1, S2, S3 범위
5∼7 mm 2∼6 m 12.5∼19 mm 13∼23 m 5∼8 mm 2∼4 m 60/60/90 L/h ±20%
본 발명의 또 다른 대상은 용해액으로의 세포의 분산을 가능하게 하는, T 이외의 튜브를 갖는 혼합기 또는 주입기이다. 따라서, 튜브를 통과하는 유체 상에 가해지는 기계적 응력은, 예를 들어 탱크에서 패들에 의해 유체가 교반될 때와 비교하여 크게 감소된다. 혼합의 초기 효율은 이어지는 수초간의 효율을 더욱 더 증가시키는데, 그 이유는 이 유체가 아직 점탄성을 보유하지 않고 소직경의 튜브에 의해 이루어지는 혼합이 매우 효율적이기 때문이다. 이와는 달리, T 튜브가 혼합에 이용될 경우, 초기 혼합은 단지 미약한 한편, 유체는 급속히 점탄성이 되어, 튜브 내에서 흐르는 동안에 심각한 문제점을 유발하게 된다. 이러한 부분적 혼합은 단지 일부분의 세포만을 용해시키게 되어, 중화 전에 플라스미드의 일부분만을 방출시킬 수 있다.
본 발명에 따르면, 본 발명자들은 용해 단계 중에 두 단계, 즉 단계 I 및 단계 II로 명명되는 두 단계를 확인하였다. 이러한 두 단계는 I) 세포의 용해 및 II) 핵산의 변성에 해당하는 것으로, 점탄성 유체를 형성하는 레올로지 거동에 큰 변화를 유발한다. 튜브의 직경을 조절하는 것에 의하면 상기 두 단계의 요구를 충족시킬 수 있다. 작은 직경의 튜브(B1a) 내에서 혼합은 증대된다. 이는 단계 I에 사용되는 구조이다. 큰 직경의 튜브(B1b) 내에서 혼합(및 이로 인한 전단 응력)은 감소된다. 이는 단계 II에 이용되는 구조이다.
따라서, 본 발명자들은 도 2에 도시된 M1로 명명된 혼합기를 사용한다. 본 발명에 따라 세포 현탁액을 분산시키기 위해 임의의 T형 장치를 사용할 수도 있다. 이 혼합기를 사용하여, 효율적 분산이 이루어지도록 하나 이상의 소직경 구멍을 통해 용액 1을 알칼리 용해액으로 역방향 흐름으로 주입한다. 이러한 구멍의 직경은 약 0.5∼2 mm이며, 바람직하게는 도시된 구조에서 약 1 mm이다.
혼합물은 혼합기 M1으로부터 방출되어 단시간 동안(약 2.5초) 소직경의 튜브를 통과한다(도 1). 난류를 유지하기 위한 직경과 유동 시간의 조합은 쉽게 계산할 수 있다. 이러한 파라미터의 변화량의 예를 표 1에 제시하였다. 튜브 직경의 모든 값은 튜브의 외경이 아니라 튜브벽 자체의 두께를 포함하는 튜브의 내경을 의미한다. 튜브 내에서의 이와 같은 일시적인 체류 시간은 용액 1과 용액 2의 매우 신속한 균질화를 가능케 한다. 용액 1과 용액 2가 단계 I 중에 여전히 뉴톤 유체라고 간주하면, 균질화 단계 중에 흐름의 양상은 난류이다. 이 튜브로부터 방출됨에 따라 용액 1과 용액 2는 균질화되며 현탁액 중의 세포의 용해가 시작된다.
그 후 균질화된 혼합물은 훨씬 더 큰 직경의 제2 튜브(B1b)를 통과하게 되며(도 1), 여기에서 세포의 용해 및 점탄성 유체의 형성이 일어난다. 이 단계 중에 혼합은 최소화될 수 있으며, 그렇지 않으면 gDNA를 단편화하게 되는 임의의 전단 응력을 최소화하기 위해 용액은 가능한 한 많이 난류를 제한하도록 "정치"시킬 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 세포 용해를 완료하고 핵산을 변성시키기 위해서는 약 1∼3분, 약 2분, 바람직하게는 1분 20초의 접촉 시간이면 충분하다. 변성 단계 중에 유체의 흐름 양상은 층류이며, 이는 세포 성분들을 향한 SDS 및 수산화나트륨의 느린 확산을 촉진시킨다.
그 후 이렇게 얻어진 용해물 및 중화 용액 3은 M2로 명명된 Y 혼합기를 사용하여 혼합한다. 본 발명의 한 구체예에서, Y 혼합기의 내경은 약 4∼15 mm, 또는 약 6∼10 mm이며, 약 6 mm 또는 약 10 mm일 수 있다. 소경 튜브(예를 들어, 약 6 mm 튜브)는 용액 3과 용해물의 신속하고(1초 미만) 효과적인 혼합이 가능하도록 Y 혼합기의 유출구에 배치된다. 그 후 중화된 용액은 회수 탱크에서 수집한다. 중화 과정 중에, pH를 신속히 낮추는 것은 응집물 형성(즉, 덩어리 또는 응괴물의 형성)을 유도한다. 다른 한편, 부분적으로 변성된 플라스미드는 매우 빨리 재생되어 용액 중에 남는다. 응집물은 회수 탱크 내에서 서서히 침전되어, 오염물 덩어리를 침전시킨다.
도 1의 개략도는 연속적 용해(Continuous Lysis; CL) 시스템의 한 구체예를 도시한다. 연속적 용해는 그 자체로만 또는 추가적인 공정과 함께 이용될 수 있다.
본 발명의 방법은 후에 정제하고자 하는 표적 세포로부터 원하는 플라스미드 DNA를 방출시키는 것과 같은, 용해와 관련된 임의의 목적을 위해 임의의 유형의 세포(즉, 원핵 또는 진핵)를 용해시키는 데 이용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 플라스미드를 방출시키기 위해 플라스미드를 함유하는 숙주 세포를 용해시키는 데 이용된다.
본 발명에 따른 연속적 알칼리 용해 단계의 과정은 정지 단계에 아직 도달하지 않아서, 아직 지수적 성장 단계(2∼10 g 건조 중량/리터)에 있는 세포의 생물량으로 성장된 발효액으로부터 회수된 세포에 대해 수행할 수 있다. 연속적 알칼리 용해 단계는 또한 높은 세포 생물량으로 성장하였으나 더 이상 지수적 성장 단계에 있지 않지만, 정지 단계에 도달한 발효액, 즉 세포 농도가 약 10∼200 g 건조 중량/리터, 바람직하게는 12∼60 g 건조 중량/리터인 발효액으로부터 회수된 세포에 대해 수행할 수 있다.
본 발명은 또한 실질적으로 오염물을 포함하고 있지 않아서 약학적 등급의 DNA가 되는 고도로 정제된 플라스미드 DNA를 제조 및 분리하는 방법을 포함한다. 본 발명의 방법에 의해 제조 및 분리된 플라스미드 DNA는 매우 극소량의, 즉 백만분율(ppm)의 오염성 염색체 DNA, RNA, 단백질 및 내독소를 함유하며, 폐쇄된 원형의 플라스미드 DNA를 주로 함유한다. 본 발명에 따라 제조된 플라스미드 DNA는 연구 및 플라스미드 기반 치료법에 사용하기에 충분한 순도를 갖는다.
본 발명의 방법은 추가적인 이온 교환 크로마토그래피 단계를 병용하는 삼중 나선 친화성 크로마토그래피를 포함하는 정제 단계를 포함하며, 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 겔 투과 크로마토그래피를 추가로 포함할 수 있다. 이온 교환 크로마토그래피 단계는 유동상 이온 교환 크로마토그래피 및 축상 및/또는 방사상 고분해능 음이온 교환 크로마토그래피 둘 다로 이용될 수 있다.
따라서 본 방법은 후속 이온 교환 크로마토그래피, 삼중 나선 친화성 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계를 기재된 순으로 병용하는 전술한 바와 같은 알칼리 용해 단계를 포함한다. 용해물 여과 또는 기타 응집물 제거가 1차 크로마토그래피 단계에 선행될 수 있다. 플라스미드 DNA를 정제하기 위한 전술한 본 발명의 방법은 확대가 가능하며 따라서 대규모 제조로의 확대가 용이하다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 연속적 용해는 pDNA를 함유하는 고순도 생성물을 얻기 위해 추가적인 정제 단계들과 병용될 수 있다. 이것은, 예를 들어 응집물 제거 방법 중 하나 이상(예컨대 용해물 여과, 침강 또는 원심분리), 이온 교환 크로마토그래피(예컨대 음이온 또는 양이온), 삼중 나선 친화성 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피와 병용될 수 있다. 한 구체예에서, 연속적 용해에 이어 음이온 교환 크로마토그래피, 삼중 나선 친화성 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피가 열거된 순으로 수행된다. 또 다른 구체예에서, 연속적 용해에 이어 용해물 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 삼중 나선 친화성 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피가 열거된 순서로 수행된다. 이러한 단계들은 진정으로 규모 확대가 가능한 플라스미드 제조 공정을 가능케 하며, 이 공정에 의하면, 이전에는 얻을 수 없었던 순도로 다량의 pDNA를 생성할 수 있다. 숙주 DNA 및 RNA뿐 아니라 단백질도 ppm 이하의 범위로 존재한다.
본 발명의 방법은 또한 본 발명에 따라 전술한 바와 같은 단계들과 병용되는, SEC, 역상 크로마토그래피, 히드록시아파타이트 크로마토그래피 등의 추가 단계들을 이용할 수 있다.
생성된 pDNA 생성물에 더 높은 순도를 제공하기 위해서는 응집물 제거가 이용될 수 있다. 이 단계는 침전된 물질(응집물)의 덩어리를 제거하는 데 이용될 수 있다. 응집물 제거를 수행하는 한 가지 메카니즘은 용해물 여과 단계, 예컨대 1∼5 mm, 바람직하게는 3.5 mm 그리드 필터에 통과시킨 후에, 폴리싱(polishing) 여과 단계와 같은 심층 여과를 수행한다. 응집물 제거를 수행하는 다른 방법은 원심분리 또는 침강에 의한 방법이다.
이온 교환 크로마토그래피는 생성된 pDNA 생성물에 더 높은 순도를 제공하기 위해 이용될 수 있다. 오염물의 성질 및 용액의 pH에 따라 음이온 교환을 선택할 수 있다.
음이온 교환 크로마토그래피는 생성된 pDNA 생성물에 더 높은 순도를 제공하기 위해 이용될 수 있다. 음이온 교환 크로마토그래피는 양으로 하전된 지지체에 음으로 하전된(또는 산성) 분자를 결합시킴으로써 작용한다. 그 후, 이온 교환 크로마토그래피를 이용하면 분자들을 이들의 전하에 따라 분리할 수 있다. 분자들의 동족체(산성, 염기성 및 중성)는 이 기법에 의해 쉽게 분리할 수 있다. 초기 분획에서 다수의 오염물이 용출되고 나중의 분획에서 pDNA가 용출되도록 하는 단계적 용출 계획을 이용할 수도 있다. 음이온 교환 크로마토그래피는 pDNA 제조물로부터 단백질 및 내독소를 제거하는 데 매우 효율적이다.
이온 교환 크로마토그래피의 경우, 충전 재료 및 그러한 재료의 제조 방법뿐 아니라 음이온 교환 크로마토그래피의 제조, 중합 및 작용기화 방법과 이를 통해 플라스미드 DNA를 용출 및 분리하는 방법 역시 당분야에 잘 알려져 있다.
음이온 교환 크로마토그래피용 충전재에 사용되는 기본 재료의 합성에 이용될 수 있는 화합물로는, 기본 재료가 합성된 후에 후-반응에 의해 소수성을 나타내는 다양한 작용기 또는 다양한 이온 교환기가 도입될 수 있다면, 임의의 화합물이 사용될 수 있다. 일작용성 단량체의 예로는 스티렌, o-할로메틸스티렌, m-할로메틸스티렌, p-할로메틸스티렌, o-할로알킬스티렌, m-할로알킬스티렌, p-할로알킬스티렌, α-메틸스티렌, α-메틸-o-할로메틸스티렌, α-메틸-m-할로메틸스티렌, α-메틸-p-할로메틸스티렌, α-메틸-o-할로알킬스티렌, α-메틸-m-할로알킬스티렌, α-메틸-p-할로알킬스티렌, o-히드록시메틸스티렌, m-히드록시메틸스티렌, p-히드록시메틸스티렌, o-히드록시알킬스티렌, m-히드록시알킬스티렌, p-히드록시알킬스티렌, α-메틸-o-히드록시메틸스티렌, α-메틸-m-히드록시메틸스티렌, α-메틸-p-히드록시메틸스티렌, α-메틸-o-히드록시알킬스티렌, α-메틸-m-히드록시알킬스티렌, α-메틸-p-히드록시알킬스티렌, 글리시딜 메타크릴레이트, 글리시딜 아크릴레이트, 히드록시에틸 아크릴레이트, 히드록시메타크릴레이트 및 비닐 아세테이트를 포함한다. 가장 바람직한 화합물은 방향족 고리 상에서 Cl, Br, I 및 F와 같은 할로겐으로 치환된 할로알킬기 및 2∼15개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 및/또는 분지쇄의 포화 탄화수소이다. 다작용성 단량체의 예로는 디비닐벤젠, 트리비닐벤젠, 디비닐톨루엔, 트리비닐톨루엔, 디비닐나프탈렌, 트리비닐나프탈렌, 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, 에틸렌 글리콜 디아크릴레이트, 디에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, 디에틸렌 글리콜 디아크릴레이트, 메틸렌비스메타크릴아미드 및 메틸렌비스아크릴아미드를 포함한다.
후-반응에 의해 다양한 이온 교환기가 도입될 수 있다. 기본 재료의 제조는 일작용성 단량체 및 다작용성 단량체를 적절한 비율로 칭량하고 형성된 입자 내의 공극을 조정하기 위한 목적으로 사용되는 희석제 또는 용매를 정확히 칭량하고 마찬가지로 정확히 칭량된 중합 개시제를 첨가한 후에 충분히 교반하는 제1 단계를 포함한다. 그 후 이 혼합물로 수중유 유형의 현탁 중합을 실시하는데, 이때 혼합물은 사전에 정확히 칭량된 수용액 용해 현탁액 안정화제에 첨가하고, 교반기를 사용하여 혼합하여 원하는 크기의 오일 소적을 형성하며, 혼합 용액을 서서히 가온하여 중합을 수행한다. 다작용성 단량체에 대한 일작용성 단량체의 비는, 기본 재료의 연질 입자를 얻기 위해, 일반적으로 일작용성 단량체 약 1 mol 및 다작용성 단량체 약 0.01∼0.2 mol로 한다. 중합 개시제 역시 특별히 제한되지는 않으며, 통상적으로 사용되는 아조비스류 및/또는 퍼옥시드류가 사용된다.
이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제 및 양쪽성을 갖는 중합체 또는 이의 혼합물과 같은 현탁 안정화제 역시 오일 소적끼리의 응집을 방지하는 데 이용될 수 있다.
플라스미드 DNA를 정제하기 위한 이온 교환 크로마토그래피에 사용될 수 있는 충전 재료는 비교적 공극 직경이 큰 것이 바람직하며, 특히 직경의 범위가 1500∼4000Å 내인 것이 바람직하다. 기본 재료에 이온 교환기를 도입하기 위한 표면 변형법은 당분야에 잘 알려져 있다.
이온 교환 크로마토그래피에는 두 가지 유형의 용출제가 사용될 수 있다. 저농도의 염을 함유하는 제1 용출제와 고농도의 염을 사용하는 제2 용출제가 사용될 수 있다. 용출 방법은 제1 용출제를 제2 용출제로 단계적으로 전환하는 것과, 제1 용출제에서부터 제2 용출제로 조성을 연속적으로 변화시키는 구배 용출 방법으로 구성된다. 이온 교환 크로마토그래피를 위해 이러한 용출제에 일반적으로 사용되는 완충액 및 염이 사용될 수 있다. 저농도의 염을 함유하는 제1 용출제의 경우, 완충액 농도가 10∼50 mM이고 pH 값이 6∼9인 수용액이 특히 바람직하다. 고농도의 염을 함유하는 제2 용출제의 경우, 용출제 C에 첨가된, 0.1∼2 M의 나트륨염을 함유하는 수용액이 특히 바람직하다. 나트륨 염에는, 염화나트륨 및 황산나트륨이 사용될 수 있다.
또한, 에쉐리키아 콜라이의 용해물 중의 DNA 분해 효소에 의한 플라스미드의 분해를 억제하기 위해, 예를 들어 에틸렌디아민-테트라아세트산과 같은 2가 금속 이온에 대한 킬레이트제를 사용할 수 있다. 2가 금속 이온에 대한 킬레이트제의 농도는 0.1∼100 mM인 것이 바람직하다.
이에 국한되는 것은 아니지만 POROS 음이온 교환 수지(Anion Exchange Resins), 퀴아젠(Qiagen), 토소 하스(Toso Haas), 스테로진(Sterogene), 스페로덱스(Spherodex), 뉴클레오팩(Nucleopac), 및 파마시아(Pharmacia)로부터 입수 가능한 것들을 비롯하여 시판되는 다양한 음이온 교환 매트릭스가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 예를 들어, 컬럼(Poros II PI/M, 4.5 mm x 100)은 먼저 20 mM Bis/TRIS 프로판(pH 7.5) 및 0.7 M NaCl로 평형화시킨다. 샘플을 로딩하고 동일한 초기 완충액으로 세척한다. 그 후 약 25배 컬럼 부피로 0.5 M∼0.85 M NaCl의 용출 구배를 적용하여 분획들을 수집한다. 바람직한 음이온 교환 크로마토그래피는 Fractogel TMAE HiCap을 포함한다.
플라스미드 DNA를 분리 및 정제하는 방법의 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명은 고순도의 핵산을 다량으로 효율적으로 얻기 위해 이온 교환 크로마토그래피 및 삼중 나선 친화성 크로마토그래피를 병용하여 핵산 및/또는 플라스미드 DNA를 분리 및 정제하는 방법에 관한 것이다.
삼중 나선 친화성 크로마토그래피에 대해서는 특히 미국 특허 제6,319,672호, 제6,287,762호 및 본 출원인의 국제 특허 출원 공개 공보 W0 02/77274에 기재되어 있다.
삼중 나선 친화성 크로마토그래피는 올리고뉴클레오티드와 이중 가닥 DNA 내의 표적 서열의 특이적 하이브리드화에 기초한 것이다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 하기의 염기들을 포함할 수 있다:
- 티미딘(T), 이중 가닥 DNA의 A.T 이중체와 삼중체를 형성할 수 있음(Rajagopal et al., Biochem 28 (1989) 7859);
- 아데닌(A), 이중 가닥 DNA의 A.T 이중체와 삼중체를 형성할 수 있음;
- 구아닌(G), 이중 가닥 DNA의 G.C 이중체와 삼중체를 형성할 수 있음;
- 양성자화된 시토신(C+), 이중 가닥 DNA의 G.C 이중체와 삼중체를 형성할 수 있음(Rajagopal et al., loc. cit.);
- 우라실(U), A.U 또는 A.T 염기쌍과 삼중체를 형성할 수 있음.
바람직하게는, 사용되는 올리고뉴클레오티드는 시토신 풍부 호모피리미딘 서열을 포함하며, DNA 내에 존재하는 특이적 서열은 호모퓨린-호모피리미딘 서열이다. 시토신의 존재는 그것이 시토신이 양성자화되는 산성 pH에서 안정한 상태로 있다가 시토신이 중화되는 알칼리성 pH에서 탈안정화되는 삼중 나선을 가질 수 있게 한다.
DNA 내에 존재하는 특이적 서열과 올리고뉴클레오티드는 삼중 나선의 형성이 가능하도록 상보성인 것이 바람직하다. 최상의 수율 및 최상의 선택성은 완전 상보성인 올리고뉴클레오티드와 특이적 서열을 사용하여 얻을 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 폴리(CTT) 및 특이적 서열 폴리(GAA)가 있다. 바람직한 올리고뉴클레오티드는 서열 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (GAGG(CTT)7 (서열 번호 1)을 가지며, 여기에서 염기 GAGG는 삼중 나선을 형성하지 않지만 올리고뉴클레오티드가 커플링 팔, 서열 (CTT)7로부터 이격되도록 할 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 특이적 서열을 포함하는 상보성 단위(GAA)와 삼중 나선을 형성할 수 있다. 해당 서열은, 특히 실시예에 기재된 바와 같은 7, 14 또는 17 GAA 단위를 포함하는 영역일 수 있다.
유용한 또 다른 특정 서열은 서열 5'-AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-3' (서열 번호 2)이다. 이 서열은 올리고뉴클레오티드 5'-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3' (서열 번호 3) 또는 5'-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3' (서열 번호 4)와 삼중 나선을 형성한다. 이 경우, 올리고뉴클레오티드는 폴리퓨린 가닥과 반평형 배향으로 결합한다. 이러한 삼중 나선은 Mg2+ 존재 하에서만 안정하다(Vasquez et al., Biochemistry, 1995, 34, 7243-7251; Beal and Dervan, Science, 1991, 251, 1360-1363).
전술한 바와 같이, 특이적 서열은 이중 가닥 DNA 내에 자연적으로 존재하는 서열, 또는 이중 가닥 DNA 내에 인공적으로 도입된 합성 서열일 수 있다. 이중 가닥 DNA 내에, 예를 들어 플라스미드 복제 기점 내에 또는 마커 유전자 내에 자연적으로 존재하는 서열과 삼중 나선을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것이 특히 유리할 수 있다. 이와 관련하여, 이러한 DNA의 일부 영역, 특히 복제 기점의 일부 영역이 호모퓨린-호모피리미딘 영역을 보유할 수 있다는 것이 서열 분석을 통해 알려져 있다. 이러한 자연적 호모퓨린-호모피리미딘 영역과 삼중 나선을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오티드의 합성은 본 발명의 방법이 비변형 플라스미드에, 특히 pUC, pBR322, pSV 등의 유형의 시판되는 플라스미드에 적용될 수 있게 한다. 이중 가닥 DNA에 자연적으로 존재하는 호모퓨린-호모피리미딘 서열 중에서도, 이. 콜라이 플라스미드 ColE1의 복제 기점 내에 존재하는 서열 5'-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3' (서열 번호 5)의 전부 또는 일부를 포함하는 서열을 들 수 있다. 이 경우, 삼중 나선을 형성하는 올리고뉴클레오티드는 서열: 5'-GAAGGGCTTCCCTCTTTCC-3' (서열 번호 6)을 보유하며, Beal 및 Dervan(J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 4976-4982)과 Jayasena 및 Johnston(Nucleic Acids Res. 1992, 20, 5279-5288)에 의해 개시된 바와 같이, 이중 나선의 두 가닥에 선택적으로 결합한다. 플라스미드 pBR322 β-락타마제 유전자의 서열 5'-GAAAAAGGAAGAG-3'(서열 번호 7) 역시 예로 들 수 있다(Duval-Valentin et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 1992, 89, 504-508).
특정 올리고뉴클레오티드와 삼중 구조를 형성할 수 있는 적절한 표적 서열을 플라스미드 ColE1뿐 아니라 플라스미드 pCOR의 복제 기점에서 확인하였다. pCOR 플라스미드는 조건적 복제 기점을 갖는 플라스미드이며, 특히 US 2004/142452 및 US 2003/161844에 기재되어 있다. ColE1 유래의 플라스미드는 플라스미드 복제에 관여하는 RNA-II 전사체의 상류에 맵핑된 12량체 호모퓨린 서열(5'-AGAAAAAAAGGA-3')(서열 번호 8)을 포함한다(Lacatena et al., 1981, Nature, 294, 623). 이 서열은 12량체 상보성 5'-TCTTTTTTTCCT-3'(서열 번호 9) 올리고뉴클레오티드와 안정한 삼중체 구조를 형성한다. pCOR 골격은 pCOR의 γ 기점 레플리콘의 A+T 풍부 분절에 위치하는 14개의 비반복적 염기(5'-AAGAAAAAAAAGAA-3')(서열 번호 10)의 호모퓨린 스트레치를 포함한다(Levchenko et al., 1996, Nucleic Acids Res., 24, 1936). 이 서열은 14량체의 상보성 올리고뉴클레오티드 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3'(서열 번호 11)와 안정한 삼중체 구조를 형성한다. 상응하는 올리고뉴클레오티드 5'-TCTTTTTTTCCT-3'(서열 번호 8) 및 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3'(서열 번호 11)는 ColE1 ori 또는 pCOR(ori γ)의 복제 기점 내에 위치하는 개개의 상보성 서열을 효율적이고 특이적으로 표적으로 한다. 실제로, 단일의 비정규형(non-canonical) 3조(T*GC 또는 C*AT)는 삼중체 구조의 완전한 불안정화를 초래할 수 있다.
복제 기점 또는 마커 유전자 내에 존재하는 서열과 삼중 나선을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오티드의 사용이 특히 유리한데, 그 이유는 이것이 동일한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 상기 복제 기점 또는 상기 마커 유전자를 포함하는 임의의 DNA를 정제하는 것을 가능하게 하기 때문이다, 따라서, 인공 특이 서열을 그 안에 혼입시키기 위해 플라스미드 또는 이중 가닥 DNA를 변형시킬 필요가 없다.
완전 상보성 서열이 바람직하긴 하지만, 올리고뉴클레오티드 서열과 DNA 내의 서열 간에 약간의 불일치도 허용될 수 있다. 다만, 이러한 불일치가 친화성을 너무 많이 손실시키지 않아야 한다. 이. 콜라이 β-락타마제 유전자 내에 존재하는 서열 5'-AAAAAAGGGAATAAGGG-3' (서열 번호 12)를 언급할 수 있다. 이 경우, 폴리퓨린 서열에 개입하는 티미딘은 세번째 가닥의 구아닌에 의해 인식됨으로써, 두 개의 T*AT 삼중체가 측접할 때 안정하게 되는 G*AT 삼중체를 형성할 수 있다(Kiessling et al., Biochemistry, 1992, 31, 2829-2834).
특정 구체예에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 서열 (CCT)n, 서열 (CT)n 또는 서열(CTT)n을 포함하며, 여기서 n은 1∼15의 정수이다. 유형 (CT)n 또는 (CTT)n의 서열이 특히 유리하다. 본 출원인은, 실제로, 정제 수율이 이 올리고뉴클레오티드 내의 C의 양에 의해 영향을 받는다는 것을 확인하였다. 특히, 실시예 7에 제시된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드가 더 적은 시토신을 포함할 경우 정제 수율은 증가한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 또한 (CCT), (CT) 또는 (CTT) 단위를 조합할 수 있다.
사용된 올리고뉴클레오티드는 천연(비변형 천연 염기로 구성됨) 또는 화학적으로 변형된 것일 수 있다. 특히, 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제에 대한 내성 또는 방어, 또는 특정 서열에 대한 친화성을 증가시킬 수 있도록 특정 화학적 변형을 보유하는 것이 유리할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레아제에 대한 내성을 더 크게 하기 위해 골격의 변형을 겪은 임의의 연결된 연속 뉴클레오시드를 의미하는 것으로 이해된다. 가능한 변형 중에서, DNA와 삼중 나선을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오티드 포스포로티오에이트(Xodo et al., Nucleic Acids Res., 1994, 22, 3322-3330)와, 포름아세탈 또는 메틸포스페이트 골격을 보유하는 올리고뉴클레오티드(Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc., 1991, 113, 7767-7768)를 들 수 있다. 뉴클레오티드의 α 아노머로 합성된 올리고뉴클레오티드를 형성하는 것도 가능하며, 이 역시 DNA와 삼중 나선을 형성한다(Le Doan et al., Nucleic Acids Res., 1987, 15, 7749-7760). 골격의 또 다른 변형은 포스포아미데이트 결합이다. 예를 들어, DNA와 특히 안정한 삼중 나선을 형성하는 올리고뉴클레오티드를 제공하는, Gryaznov 및 Chen에 의해 소개된 N3'-P5' 뉴클레오티드간 포스포아미데이트 결합(J. Am. Chem. Soc., 1994, 116, 3143-3144)을 들 수 있다. 또한 골격의 다른 변형들 중에서도 2'-O-메틸리보스, 포스포디에스테르 등의 리보뉴클레오티드의 사용(Sun and Helene, Curr. Opinion Struct. Biol., 116, 3143-3144)을 들 수 있다. 마지막으로, 인을 기초로 한 골격을, PNA에서와 같이 폴리아미드 골격으로 대체하거나(역시 삼중 나선을 형성할 수 있음)(Nielsen etal., Science, 1991, 254, 1497-1500; Kim et al., J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 6477-6481) 또는 DNG에서와 같이 구아니딘계 골격으로(deoxyribonucleic guanidine, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 6097-6101), 또는 역시 삼중 나선을 형성하는 DNA의 다중 양이온성 유사체로 대체할 수 있다.
제3 가닥의 티미딘은 또한, DNA에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화성을 증가시키는 5-브로모우라실로 대체될 수 있다(Povsic and Dervan, J. Am. Chem. Soc., 1989, 111, 3059-3061). 제3 가닥은 또한 비천연 염기를 포함할 수 있으며, 이러한 비천연 염기로는 7-데아자-2'-데옥시잔토신(Milligan et al., Nucleic Acids Res., 1993, 21, 327-333), 1-(2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-3-메틸-5-아미노-1H-피라졸로[4,3-d]피리딘-7-온(Koh and Dervan, J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 1470-1478), 8-옥소아데닌, 2-아미노퓨린, 2'-O-메틸슈도이소시티딘, 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 변형(참고 문헌: Sun and Helene, Curr. Opinion Struct. Biol., 1993, 3, 345-356)을 들 수 있다.
또 다른 유형의 올리고뉴클레오티드 변형은 보다 구체적으로 올리고뉴클레오티드와 특정 서열 간의 상호작용 및/또는 친화성을 개선시키는 것을 목적으로 한다. 특히, 본 발명에 따른 가장 유리한 변형은 올리고뉴클레오티드의 시토신을 메틸화하는 것으로 구성된다. 이렇게 메틸화된 올리고뉴클레오티드는 중성에 더 가까운 pH 범위(≥5)에서 특이적 서열과 안정한 삼중 나선을 형성하는 두드러진 특성을 나타낸다. 따라서, 종래 기술의 올리고뉴클레오티드보다 더 높은 pH 값에서, 즉, 플라스미드 DNA의 분해 위험이 훨씬 더 적은 pH 값에서 작동하는 것이 가능하게 된다.
본 발명의 방법에 사용되는 올리고뉴클레오티드의 길이는 5∼30 염기의 길이이다. 10개 염기보다 더 긴 길이의 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것이 유리하다. 길이는 원하는 선택성 및 상호작용의 안정성을 충족하도록 각 경우에 맞게 당업자가 채택할 수 있다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 임의의 공지된 기법으로 합성할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 핵산 합성기를 사용하여 제조할 수 있다. 당업자에게 공지된 임의의 다른 방법이 이용될 수 있음은 자명하다.
지지체에 대한 공유 결합을 가능하게 하기 위해서는, 올리고뉴클레오티드를 일반적으로 작용기화시킨다. 따라서, 이것은 5' 또는 3' 위치에 티올, 아민 또는 카르복실 말단기로 변형시킬 수 있다. 특히, 티올, 아민 또는 카르복실기의 첨가는, 예를 들어 올리고뉴클레오티드를 디설파이드, 말레이미드, 아민, 카르복실, 에스테르, 에폭시드, 시아노젠 브로마이드 또는 알데히드 작용기를 보유하는 지지체에 커플링시키는 것을 가능하게 한다. 이러한 커플링은 올리고뉴클레오티드와 지지체 간의 디설파이드, 티오에스테르, 에스테르, 아미드 또는 아민 결합의 성립에 의해 형성된다. 예를 들어 이작용성 커플링제와 같은 당업자에게 공지된 임의의 다른 방법을 이용할 수도 있다.
또한, 커플링된 올리고뉴클레오티드와의 하이브리드화를 개선시키기 위해, 올리고뉴클레오티드가 "팔"과 "스페이서" 염기 서열을 포함하도록 하는 것이 유리할 수 있다. 팔을 사용하게 되면, 실제로, 지지체로부터 소정의 거리에 있는 올리고뉴클레오티드에 결합하여, DNA와의 상호작용의 조건을 개선시킬 수 있다. 팔은 1∼18개, 바람직하게는 6개 또는 12개의 (CH)2 기를 포함하는 선형 탄소 사슬과, 컬럼에 대한 결합을 가능케 하는 아민으로 구성되는 것이 유리하다. 이 팔은 올리고뉴클레오티드 또는 하이브리드화를 간섭하지 않는 염기로 구성된 "스페이서"의 포스페이트에 결합된다. 따라서, "스페이서"는 퓨린 염기를 포함할 수 있다. 일례로서, "스페이서"는 서열 GAGG를 포함할 수 있다. 이 팔은 6개 또는 12개의 탄소 원자를 포함하는 선형 탄소 사슬로 구성되는 것이 유리하다.
삼중 나선 친화성 크로마토그래피는 RNA 및 게놈 DNA를 제거하는 데 매우 효율적이다. 이들은 벌크로 또는 컬럼에 예비 충전된 작용기화된 크로마토그래피 지지체, 작용기화된 플라스틱 표면 또는 작용기화된 라텍스 비드, 자성체 등일 수 있다. 크로마토그래피 지지체를 사용하는 것이 바람직하다. 일례로서, 사용될 수 있는 크로마토그래피 지지체는 예를 들면 아가로스, 아크릴아미드 또는 덱스트란과 이들의 유도체(예컨대, 세파덱스, 세파로스, 수퍼로스 등), 중합체, 예컨대 폴리(스티렌/디비닐벤젠), 또는 그래프팅 또는 비그래프팅 실리카이다. 크로마토그래피 컬럼은 확산 또는 관류 방식으로 작동할 수 있다.
보다 나은 정제 수율을 달성하기 위해서는, 플라스미드에 올리고뉴클레오티드와의 몇 개의 하이브리드화 위치를 포함하는 서열을 사용하는 것이 특히 유리하다. 몇 개의 하이브리드화 위치의 존재는, 실제로, 상기 서열과 올리고뉴클레오티드 간의 상호작용을 촉진하여, 정제 수율의 개선을 유도한다. 따라서, (CCT), (CT) 또는 (CTT) 모티프의 n 반복체를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 경우, 적어도 n개의 상보성 모티프, 바람직하게는 n + 1개의 상보성 모티프를 포함하는 DNA 서열을 사용하는 것이 바람직하다. 따라서 n + 1개의 상보성 모티프를 보유하는 서열은 올리고뉴클레오티드와의 2개의 하이브리드화 위치를 제공한다. DNA 서열이 최대 11개의 하이브리드화 위치, 즉 n + 10개의 상보성 모티프를 포함하는 것이 유리하다.
본 발명에 따른 방법은 임의의 유형의 이중 가닥 DNA를 정제하는 데 이용될 수 있다. 이중 가닥 DNA의 예로는 원형 DNA, 예컨대 일반적으로 치료적 중요성을 가지는 1개 이상의 유전자를 보유하는 플라스미드가 있다. 이 플라스미드는 또한 복제 기점, 마커 유전자 등을 보유할 수 있다. 본 발명의 방법은 세포 용해물에 직접 적용될 수 있다. 이 구체예에서, 형질전환에 이어 세포 배양에 의해 증폭된 플라스미드는 세포를 용해시킨 직후에 정제한다. 본 발명의 방법은 또한 투명한 용해물, 즉, 세포 용해물의 중화 및 원심분리 후에 얻어지는 상청액에 적용될 수 있다. 이것이 공지의 방법에 의해 사전 정제한 용액에 적용될 수 있음은 자명하다. 이 방법에 의하면 중요한 서열을 보유하는 선형 또는 원형 DNA를 상이한 서열의 DNA를 포함하는 혼합물로부터 정제하는 것이 가능하다. 본 발명에 따른 방법은 또한 두 가닥 DNA의 정제에 이용될 수 있다.
세포 용해물은 원핵 또는 진핵 세포의 용해물일 수 있다.
원핵 세포로는, 이. 콜라이(E. coli), 비. 서브틸리스(B. subtilis), 에스. 티피뮤리움(S. typhimurium) 또는 스트렙토마이세스(Streptomyces)와 같은 박테리아를 예로 들 수 있다. 진핵 세포로는, 동물 세포, 효모, 진균류 등과, 보다 구체적으로는 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 또는 사카로마이세스(Saccharomyces) 효모 또는 COS, CHO, C127, NIH3T3 등의 세포를 예로 들 수 있다.
적어도 삼중 나선 친화성 크로마토그래피 단계를 포함하는 본 발명의 방법은 생성된 pDNA 생성물에 더 높은 순도를 제공하기 위해 이용될 수 있다. 삼중 나선 친화성 크로마토그래피에서, 올리고뉴클레오티드는 크로마토그래피 수지 또는 기타 매트릭스와 같은 지지체에 결합시킨다. 그 후 정제하려는 샘플을 크로마토그래피 수지에 결합된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 등의 방식에 의해, 결합된 올리고뉴클레오티드와 혼합한다. 샘플 중의 소정의 플라스미드는 올리고뉴클레오티드에 결합하여 삼중체를 형성한다. 올리고뉴클레오티드와 플라스미드 간의 결합은 후그스틴(Hoogsteen) 결합일 수 있다. 이 단계는 20분 이상의 접촉 시간 동안 높은 염 농도에서 pH ≤ 5에서 일어날 수 있다. 세척 단계를 이용할 수 있다. 마지막으로, 중성 완충액 중에서 시토신 탈양성자화가 일어나서, 올리고뉴클레오티드가 결합된 수지로부터 플라스미드가 용출된다.
가장 바람직한 구체예에 따르면, 핵산 및/또는 플라스미드 DNA를 분리 및 정제하는 방법은 이온 교환 크로마토그래피, 삼중 나선 친화성 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계를 함께 포함한다.
소수성 상호작용 크로마토그래피는 정제를 위해 샘플 중의 분자 내의 소수성 영역을 끌어 당기도록 기질 상에 소수성 부분을 이용한다. 이러한 HIC 지지체가 "클러스터링" 효과에 의해 작용하며, 이들 분자가 회합할 때 어떠한 공유 또는 이온 결합도 형성되거나 공유되지 않는다는 점에 주목하여야 한다. 소수성 상호작용 크로마토그래피는, 개방 원형 플라스미드 형태 및 기타 오염물, 예컨대 gDNA, RNA 및 내독소를 매우 효율적으로 제거하기 때문에 유익하다.
소수성 상호작용 크로마토그래피를 위한 기본 재료의 합성과, 소수성 상호작용 크로마토그래피를 제조, 중합 및 작용기화하고 이를 통해 플라스미드 DNA를 용출 및 분리하는 방법은 당분야에 널리 알려져 있으며, 특히 본원에서 참고로 인용하는 미국 특허 제6,441,160호에 기재되어 있다.
소수성 상호작용 크로마토그래피용 충전 재료에 사용되는 기본 재료의 합성에 사용될 수 있는 화합물로는, 소수성을 나타내는 다양한 작용기 또는 다양한 이온 교환기가 기본 재료가 합성된 후에 후-반응에 의해 도입될 수 있다면, 어떠한 화합물도 될 수 있다. 일작용성 단량체의 예로는 스티렌, o-할로메틸스티렌, m-할로메틸스티렌, p-할로메틸스티렌, o-할로알킬스티렌, m-할로알킬스티렌, p-할로알킬스티렌, α-메틸스티렌, α-메틸-o-할로메틸스티렌, α-메틸-m-할로메틸스티렌, α-메틸-p-할로메틸스티렌, α-메틸-o-할로알킬스티렌, α-메틸-m-할로알킬스티렌, α-메틸-p-할로알킬스티렌, o-히드록시메틸스티렌, m-히드록시메틸스티렌, p-히드록시메틸스티렌, o-히드록시알킬스티렌, m-히드록시알킬스티렌, p-히드록시알킬스티렌, α-메틸-o-히드록시메틸스티렌, α-메틸-m-히드록시메틸스티렌, α-메틸-p-히드록시메틸스티렌, α-메틸-o-히드록시알킬스티렌, α-메틸-m-히드록시알킬스티렌, α-메틸-p-히드록시알킬스티렌, 글리시딜 메타크릴레이트, 글리시딜 아크릴레이트, 히드록시에틸 아크릴레이트, 히드록시메타크릴레이트 및 비닐 아세테이트를 포함한다. 가장 바람직한 화합물은 방향족 고리 상에서 Cl, Br, I 및 F와 같은 할로겐으로 치환된 할로알킬기 및 탄소 원자수 2∼15의 직쇄 및/또는 분지형의 포화 탄화수소이다.
다작용성 단량체의 예로는 디비닐벤젠, 트리비닐벤젠, 디비닐톨루엔, 트리비닐톨루엔, 디비닐나프탈렌, 트리비닐나프탈렌, 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, 에틸렌 글리콜 디아크릴레이트, 디에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, 디에틸렌 글리콜 디아크릴레이트, 메틸렌비스메타크릴아미드 및 메틸렌비스아크릴아미드를 포함한다.
후-반응에 의해 다양한 소수성 작용기 또는 다양한 이온 교환기를 도입할 수 있다. 기본 재료 자체에 의해 나타나는 소수성에 기인한 분리하고자 하는 표적 생성물에 대한 영향을 최소화하기 위해, 또는 염 농도의 변화 또는 pH 값의 변화에 기인한 기본 재료 자체의 팽창 또는 수축을 최소화하기 위해, 기본 재료는 비교적 친수성의 단량체, 예컨대 글리시딜 메타크릴레이트, 글리시딜 아크릴레이트, 히드록시에틸 아크릴레이트, 히드록시메타크릴레이트 및 비닐 아세테이트를 사용하여 제조하는 것이 바람직하다. 기본 재료의 제조는 일작용성 단량체와 다작용성 단량체를 적절한 비율로 칭량하고 형성된 입자 내의 공극을 조정하기 위한 목적으로 사용되는 희석제 또는 용매를 정확히 칭량하고 마찬가지로 정확히 칭량된 중합 개시제를 첨가한 후에 충분히 교반하는 제1 단계를 포함한다. 그 후 이 혼합물로 수중유 유형의 현탁 중합을 실시하는데, 이때 혼합물은 사전에 정확히 칭량된 수용액 용해 현탁액 안정화제에 첨가하고, 교반기를 사용하여 혼합하여 원하는 크기의 오일 소적을 형성하며, 혼합 용액을 서서히 가온하여 중합을 수행한다.
다작용성 단량체에 대한 일작용성 단량체의 비는, 기본 재료의 연질 입자를 얻기 위해, 일반적으로 일작용성 단량체 약 1 mol 및 다작용성 단량체 약 0.01∼0.2 mol로 한다. 기본 재료의 경질 입자를 얻기 위해 다작용성 단량체의 비를 약 0.2∼0.5 mol로 증가시킬 수 있다. 더욱 더 경질의 입자를 얻기 위해서는 다작용성 단량체만을 사용할 수 있다.
중합 개시제 역시 특별히 제한되지는 않으며, 통상적으로 사용되는 아조비스류 및/또는 퍼옥시드류가 사용된다.
이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제 및 양쪽성을 갖는 중합체 또는 이의 혼합물과 같은 현탁 안정화제 역시 오일 소적끼리의 응집을 방지하는 데 이용될 수 있다.
형성된 입자의 직경은 일반적으로 약 2∼500 ㎛이다. 바람직한 입자 직경은 2∼30 ㎛, 보다 바람직하게는 약 2∼10 ㎛이다. 고순도의 핵산을 다량으로 얻고자 할 때는, 입자 직경이 약 10∼100 ㎛이고, 미정제 모액으로부터 생성물을 분리하고자 할 때는, 입자 직경이 100∼500 ㎛, 보다 바람직하게는 약 200∼400 ㎛이다. 입자 직경을 조정하기 위해서는, 중합 과정 중에 교반기의 회전 속도를 조정할 수 있다. 소직경의 입자가 필요할 경우 회전수를 증가시킬 수 있고, 대직경의 입자가 필요할 경우 회전수를 감소시킬 수 있다. 이때, 사용되는 희석제가 형성된 입자 내의 공극을 조정하는 데 사용되기 때문에, 용매의 선택은 특히 중요하다. 중합에 사용되는 용매에 대한 기본적인 개념으로서, 단량체에 대해 우수한 용매인 용매와 단량체에 대해 열등한 용매인 용매를 다양하게 조합하여 조정을 실시한다. 공극 직경의 크기는 분리하고자 하는 핵산의 분자 크기에 따라 적절히 선택할 수 있지만, 소수성 상호작용 크로마토그래피용 충전 재료의 경우 500∼4000Å의 범위 내인 것이 바람직하고, 이온 교환 크로마토그래피에 대한 충전 재료의 경우 1500∼4000Å의 범위 내인 것이 바람직하다.
소수성 상호작용 크로마토그래피에서, 각각 상이한 소수성을 갖는 충전 재료를 이용함으로써 상이한 소수성을 갖는 핵산을 분리하기 위해서는, 기본 재료의 표면 변형이 중요하다.
소수성 기는 탄소 원자수가 2∼20인 포화 탄화수소기 또는 불포화 탄화수소기를 갖는 장쇄 또는 분지쇄 중에서 선택할 수 있다. 탄화수소기 내에 방향족 고리가 포함될 수도 있다.
소수성 기는 또한 하기 화학식을 갖는 화합물 중에서 선택할 수 있다.
Figure 112006018859832-pct00001
상기 식에서, n은 0∼약 20이고, 메틸렌기는 직쇄 또는 분지쇄일 수 있으며, m은 0∼약 3이고, 탄화수소기는 직쇄 또는 분지쇄일 수 있으며, A는 C=O 또는 에테르기이며, 단, 메틸렌기는 A 없이 기본 재료에 직접 결합될 수 있다.
소수성 기는 0∼10개의 반복 단위로 구성된 탄소 원자수 2∼20의 알킬렌 글리콜의 에테르기를 추가로 포함할 수 있으며, 이때, 기본 재료와 반응하는 작용기의 반대쪽 말단은 OH 기 그대로이거나 또는 탄소 원자수 1∼4의 알킬기로 캡핑될 수 있다.
상술한 소수성 기는 표면을 변형시키기 위해 단독으로 또는 혼합물로 사용될 수 있다.
플라스미드와 같이 소수성이 낮은 경우 탄소 원자수 6∼20의 알킬기 쇄가 바람직하다. 에쉐리키아 콜라이로부터 유래된 RNA와 인간 및 동물 세포의 RNA와 같이 높은 소수성을 갖는 화합물을 분리하기 위해서는 탄소 원자수가 2∼15인 알킬기의 장쇄가 바람직하다. 에쉐리키아 콜라이 유래의 DNA와 인간 및 동물 세포의 DNA와 같이 비교적 낮은 소수성을 갖는 화합물을 분리하기 위해서는 탄소 원자수 4∼18의 알킬기가 바람직하다.
이들 화합물을 분리한 후에, 상기 예시에 국한됨이 없이 표면을 변형시키기 위한 화합물을 적절히 선택할 수 있다. 실제로, 충전 재료의 소수성 정도는 흡착을 위한 용출제 중의 염 농도 또는 매질 중의 염 농도에 따라 달라진다. 또한, 충전 재료의 소수성 정도는 기본 재료로 도입된 기의 양에 따라 달라지기도 한다.
소수성 상호작용 크로마토그래피용 기본 재료의 공극 직경은 500∼4000 Å인 것이 바람직하나, 분리하고자 하는 핵산의 분자 크기에 따라 상기 범위로부터 적절히 선택할 수 있다. 일반적으로, 충전 재료 상에서의 핵산의 보유율 및 흡착 용량[샘플 유도(leading)]은 공극 직경에 따라 달라지기 때문에, 분자 크기가 큰 핵산의 경우 공극 직경이 큰 기본 재료를 사용하는 것이 바람직하고 분자 크기가 작은 핵산의 경우 공극 직경이 작은 기본 재료를 사용하는 것이 바람직하다.
예를 들어 스티렌 기본 재료는, 할로겐 함유 화합물 및/또는 카르보닐 할라이드 및 촉매(예컨대 FeCl3, SnCl2 또는 AlCl3)를 사용하고 프리델-크래프트 반응을 이용하여 알킬기의 장쇄를 포함하는 소수성 기와 반응시킬 수 있으며, 탈할로겐화 화합물 및/또는 아크릴화 화합물로서 기본 재료 중의 방향족 고리에 적접 첨가하는 것이 가능하다. 기본 재료가 할로겐기를 포함하는 입자인 경우, 예를 들어 첨가하려는 작용기에 포함된 OH를 갖는 화합물(예를 들어, 부탄올)을 이용하고 NaOH 또는 KOH와 같은 알칼리 촉매와의 윌리엄슨(Williamson) 반응을 이용하여, 에테르 결합을 통해 작용기를 도입할 수 있다. 첨가하고자 하는 작용기가 헥실아민과 같은 아미노기 함유 화합물인 경우, NaOH 또는 KOH와 같은 알칼리 촉매를 사용하고 탈할로겐화 산 반응을 이용하여 첨가하는 것이 가능하다. OH 기를 함유하는 기본 재료의 경우, 역으로, 에폭시기, 할로겐기 또는 카르보닐 할라이드기를 첨가하고자 하는 작용기에 사전에 도입한다면, 에테르 또는 에스테르 결합을 통해 작용기를 도입하는 것이 가능하다. 에폭시기를 포함하는 기본 재료의 경우, 첨가하고자 하는 작용기에 포함된 OH 기 또는 아미노기를 갖는 화합물과 반응시킨다면, 에테르 또는 아미노 결합을 통해 작용기를 도입하는 것이 가능하다. 뿐만 아니라, 할로겐기를 포함하는 작용기를 도입하고자 하는 경우, 산 촉매를 사용하여 에테르 결합을 통해 작용기를 첨가하는 것이 가능하다. 기본 재료에 도입되는 작용기의 비율은 분리하고자 하는 대상 생성물의 소수성에 의해 영향을 받기 때문에, 이에 제한되는 것은 아니나, 건조된 기본 재료 1 g당 첨가되는 작용기가 약 0.05∼0.4 mmol인 충전 재료가 적합하다.
표면 변형과 관련하여, 기본 재료 또는 입자의 형성 후에 후-반응을 통해 작용기를 첨가하는 방법은 기술된 바와 같다. 표면 변형은 동일한 방법에 따라 수행되며, 여기서 기본 재료는 중합 전에 첨가된 상기 작용기를 갖는 단량체를 사용하여 중합 후에 형성한다.
기본 재료는 또한 다공성 실리카 겔일 수 있다. 실리카 겔을 제조하는 방법은 문헌["Latest High-Speed Liquid Chromatography", page 289 ff. (written by Toshio Nambara and Nobuo Ikegawa, published by Tokyo Hirokawa Bookstore in 1988)]에 기재된 방법에 따라 제조된 입자 위에 직접 알킬트리메톡시실란과 같은 화합물을 사용하여 실시하는 실란 커플링을 포함한다. 에폭시기 함유 실란 커플링제를 사용하여 실란을 커플링하기 전 또는 후에, 전술한 방법에 따라 작용기를 추가할 수 있다. 도입되는 작용기의 비율은 건조된 기본 재료 1 g당 약 0.05∼4.0 mmol이 적합하다.
소수성 상호작용 크로마토그래피 분리 또는 정제 단계에는 용출제가 사용된다. 일반적으로, 두 가지 유형의 용출제가 사용된다. 제1 유형의 용출제는 고농도의 염을 함유하는 반면, 제2 유형의 용출제는 저농도의 염을 함유한다. 용출 방법은 고농도의 염을 갖는 용출제로부터 저농도의 염을 갖는 용출제로 단계적으로 전환시키는 것과, 한 용출제에서 다른 용출제로 연속적으로 조성을 변화시키는 구배 용출 방법이 이용될 수 있다. 소수성 상호작용 크로마토그래피에 일반적으로 사용되는 완충액 및 염이 사용될 수 있다. 고농도의 염을 함유하는 용출제의 경우, 염 농도가 1.0∼4.5 M이고 pH 값이 6∼8인 수용액이 특히 바람직하다. 저농도의 염을 함유하는 용출제의 경우, 염 농도가 0.01∼0.5 M이고 pH 값이 6∼8인 수용액이 특히 바람직한 염이다. 일반적으로, 황산암모늄 및 황산나트륨이 염으로서 사용될 수 있다.
소수성 상호작용 크로마토그래피 플라스미드 DNA 정제 단계는 소수성이 작은 작용기가 도입된 충전 재료와 소수성이 큰 작용기가 도입된 충전 재료를 순차적으로 조합하여 수행할 수 있다. 실제로, 배지에서 배양된 에쉐리키아 콜라이는 다당류, 에쉐리키아 콜라이 게놈 DNA, RNA 플라스미드 및 단백질과 같은 소수성이 상이한 다양한 성분들을 다량 함유한다. 핵산 간에도 소수성에 차이가 있다는 것 역시 알려져 있다. 불순물이 되는 단백질은 플라스미드와 비교하여 더 큰 소수성을 나타낸다.
Fractogel 프로필, Toyopearl, Source 이소프로필, 또는 소수성 기를 갖는 임의의 다른 수지와 같은, 다수의 소수성 상호작용 크로마토그래피 수지가 시판되고 있다. Toyopearl 벌크 중합체 매체가 가장 바람직한 수지이다. Toyopearl은 기계적 및 화학적 안정성이 큰 메타크릴 중합체이다. 수지는 비작용기화된 "HW" 시리즈 수지로서 시판되며, 이온 교환 크로마토그래피 또는 소수성 상호작용을 위한 표면 화학작용으로 유도체화할 수 있다. 상이한 표면 화학작용과 상이한 수준의 소수성을 특징으로 하는 4 가지 유형의 Toyopearl HIC 수지가 이용될 수 있다. Toyopearl HIC 수지의 소수성은 에테르, 페닐, 부틸 및 헥실 시리즈를 통해 증가한다. 공극 직경이 1000 Å인 바람직한 Toyopearl HIC 수지, 즉 Toyopearl HW-65의 구조는 다음과 같이 표시된다.
Figure 112006018859832-pct00002
전술한 Toyopearl 수지는 다양한 입자 크기 등급을 가질 수 있다. Toyopearl 650C는 입자 크기가 약 50∼150 ㎛, 바람직하게는 약 100 ㎛인 한편, Toyopearl 650M은 입자 크기가 약 40∼90 ㎛, 바람직하게는 약 65 ㎛이고, Toyopearl 650S는 입자 크기가 약 20∼50 ㎛, 바람직하게는 약 35 ㎛이다. 입자 크기가 분해능에 영향을 미친다는 사실, 즉 분해능은 C에서 M에서 S로 입자 크기 등급을 개선시키고, 따라서 입자 크기가 더 작을수록 증가한다는 것은 잘 알려져 있다. 본 발명에 따른 플라스미드 DNA의 분리 및 정제 과정의 HIC 크로마토그래피 단계에 사용되는 가장 바람직한 Toyopearl 수지는 토소 바이오사이언스에서 시판되는 Toyopearl 부틸-650S이다.
바람직한 구체예에 따르면, 추가의 정용여과(diafiltration) 단계가 수행된다. 이 공정에는 당분야에 공지된 표준 기법에 따라 시판되는 표준 정용여과 재료가 적합하다. 바람직한 정용여과 방법은 플라스미드 크기에 따라 분자량 컷오프 범위가 30,000∼500,000인 한외여과 막을 사용하는 정용여과법이다. 이러한 정용여과 단계에 의해 완충액 교환이 이루어지고 그 후 농축이 수행된다. 단계 12의 용출액은 접선 흐름 여과(막 컷오프, 30 kDa)에 의해 3∼4배 농축되어 목표 농도 약 2.5∼3.0 mg/mL로 농축되고, 이 농축물은 10배 부피의 염수(saline)로 일정한 부피로 정용여과에 의해 완충액을 교환하여, 염수를 사용하여 목표 플라스미드 농도로 조정한다. NV1FGF 농도는 농축물 샘플의 260 nm에서의 흡광도로부터 계산한다. NV1FGF 용액은 0.2 ㎛ 캡슐 필터를 통해 여과하여 몇 개의 분액으로 나누고, 이것을 추가 가공 전까지 2∼8℃의 저온실에서 용기에 넣어 보관한다. 이것은 수퍼코일형 플라스미드의 플라스미드 DNA 농도가 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 바람직하게는 99%인 정제된 농축물을 산출한다. 이 과정에 의한 전체 플라스미드 회수율은 적어도 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 및 80%이며, 평균 회수율은 60%이다.
이 구체예에 따르면, 정용여과 단계는 하기의 조건에 따라 수행되며, 단계 a)를 위한 완충액과 단계 b)를 위한 완충액이 사용된다:
i) 12.5∼13.0배 부피의 50 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4(완충액 I로 명명)에 대한 1차 정용여과(단계 a)
ii) 상기 단계 a)로부터의 보유물로 3.0∼3.5배 부피의 염수 부형제(150 mM NaCl)에 대하여 2차 정용여과(단계 b)를 실시함. 본 발명에 따른 이러한 바람직한 정용여과 단계는 황산암모늄 및 EDTA를 효율적으로 철저히 제거한다. 또한, 이러한 정용여과 단계에 이어, 적절한 생리학적 NaCl 농도(약 150 mM) 및 1 mM 이하의 최종 Tris 농도(20 μM 및 1 mM)가 얻어진다.
이러한 정용여과 단계를 이용하여 얻어진 플라스미드 DNA 제제는 pH 값을 7∼7.5로 유지 또는 조절하기 위해 염수 부형제로서의 NaCl과 적절한 농도의 Tris 완충액을 포함한다. 본 발명에 따른 플라스미드 DNA 제제는, 이 플라스미드 DNA가 놀랍게도 5℃∼최대 25℃, 즉 실온에서 장기간 동안 상기 조건 하에 분해되지 않은 안정한 형태로 보관될 수 있다는 점에서 특히 유용하다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 고순도의 플라스미드 DNA를 분리하는 방법은 종래의 방법에 비해 더 간단한 조작으로 다량으로 얻을 수 있다.
플라스미드를 정제하는 방법은 전술한 바와 같은 연속적인 용해 방법에 이어, 또는 당분야에 공지된 임의의 다른 용해 방법에 이어 이용될 수 있다. 예를 들어, 플라스미드를 함유하는 미생물 세포의 유통 열 용해가 이용될 수 있다. 이 방법은 특히 국제 공보 WO 96/02658에 기재되어 있다. 특정 열 교환기는 코일로 성형된 10 ft. x 0.25 인치 O.D. 스테인레스 강철관으로 구성되었다. 이 코일은 일정한 고온의 수욕에 완전히 침지시킨다. 코일의 수용 부피는 약 50 mL이다. 유입구 및 유출구 온도와 수욕 온도를 측정하기 위해 각각 열전대 및 온도계를 사용하였다. 실리콘 튜브가 구비된 Masterflex 연동 펌프를 사용하여 가열 코일로 펌핑한다. 세포 용해물이 코일로부터 유출되고 그 후 Beckman J-21 회분 원심분리기에서 원심분리하여 투명하게 만든다. 원심분리 후, 본 발명에 따른 정제 방법을 이용하여 플라스미드 DNA를 정제할 수 있다.
대안의 세포 용해는 일련의 정적 혼합기를 이용할 수 있다. 실제로, W0 97/23601(본원에서 참고로 인용함)에 기재된 바와 같이, 제1 정적 혼합기를 통한 세포의 용해 및 제2 정적 혼합기를 통한 세포 용해물의 침전을 위한 제1 정적 혼합기는 본 발명에 따른 플라스미드 DNA를 정제하는 방법 이전에 세포를 용해시키기 위한 대안의 방법으로서 이용될 수 있다. 상기 정적 혼합기를 사용하고 라인내에서 다량의 세포를 부드럽게 연속적으로 용해시킬 수 있으며, 다른 정적 혼합기는 희석 및 침전과 같은 다른 기능을 수행하기 위해 라인내에 배치한다. 본 발명의 방법에 유용한 적합한 정적 혼합기는 본 발명의 방법을 가능케 하기에 충분한 길이의, 정적 또는 부동 혼합기로서 당분야에서 불리는 임의의 유통 장치를 포함한다. 예를 들어, 세포를 용해시키기 위해, 정적 혼합기는 혼합기를 통과하는 중에 대상 세포의 용해를 유발하기에 충분한 용해액과 세포 간의 접촉 시간을 제공하는 길이(5)를 가질 필요가 있다. 바람직한 구체예에서, 적절한 정적(5) 혼합기는 액체를 난류 중에서 서로 혼합시키도록 두 액체를 대향 회전 흐름으로 서로 접촉시키는 내부 나선형 구조를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 플라스미드 DNA를 분리 및 정제하는 방법은 임의의 크기를 갖는 임의의 유형의 벡터를 분리 및 정제하는 데 이용될 수 있다. 본 발명에 따른 방법에 의해 분리될 수 있는 플라스미드 DNA의 크기 범위는 약 5 kb∼약 50 kb, 바람직하게는 15 kb∼50 kb이며, 상기 DNA는 약 3 kb의 벡터 골격, 치료 유전자 및 관련된 조절 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명에 유용한 벡터 골격은 약 10∼50 kb 이상의 삽입체를 보유할 수 있다. 이 삽입체는 임의의 유기체로부터 유래된 DNA를 포함할 수 있으나, 바람직하게는 포유동물 유래의 것이며, 치료 단백질을 코딩하는 유전자 이외에도, 프로모터, 폴리 아데닐화 서열, 인핸서, 좌 조절 영역 등과 같은 조절 서열을 포함할 수 있다. 치료 단백질을 코딩하는 유전자는 게놈 유래의 것일 수 있으며, 따라서 게놈 조직화에서 반영되는 바와 같이 엑손 및 인트론을 포함하거나, 또는 상보성 DNA로부터 유래될 수 있다. 그러한 벡터는 예를 들어 치료 유전자, 선별 마커를 코딩하는 유전자, 예를 들어 SupPhe tRNA, 테트라사이클린 가나마이신 내성 유전자의 삽입을 위한 폴리링커를 갖는, 높은 복제 카피수로 복제할 수 있는 벡터 골격을 포함할 수 있으며, 물리적으로 소형이고 안정하다. 플라스미드의 벡터 골격은 포유동물 단편, 다른 진핵, 원핵 또는 바이러스 DNA의 삽입을 가능하게 하는 것이 유리하며, 생성된 플라스미드는 정제하여 생체내 또는 생체외 플라스미드 기반 치료법에서 사용될 수 있다. 비교적 카피수가 큰, 즉 20∼40 카피/세포에서 최대 1000∼2000 카피/세포를 갖는 벡터가 본 발명에 따른 방법에 의해 분리 및 정제될 수 있다. 예를 들어, 본 방법에 따르면 pUC 복제 기점을 포함하는 벡터가 바람직하다. pUC 복제 기점은 플라스미드 DNA의 보다 효율적인 복제를 가능하게 하며, 예를 들어 pBR322 기점에 비해 세포당 플라스미드 카피수를 10배 증가시킨다. 바람직하게는, US 2003/1618445에 기재된 바와 같은 조절적 복제 기점을 갖는 플라스미드 DNA 또는 pCOR이 본 발명에 따른 방법에 의해 분리될 수 있다. 생성된 고카피수는 염색체 DNA, RNA, 세포 단백질 및 보조 인자에 대한 플라스미드 DNA의 비를 크게 증가시키고 플라스미드 수율을 향상시키며, 하류 정제를 보다 용이하게 한다. 따라서, 본 발명에 따르면 임의의 벡터(플라스미드 DNA)가 사용될 수 있다. 대표적인 벡터로는 NV1FGF 플라스미드를 들 수 있으나 이에 국한되는 것은 아니다. 말기 말초 동맥 폐색성 질환(PAOD) 또는 말초 동맥 질환(PAD)을 가진 환자를 치료하는 데 유용한 산성 섬유아세포 성장 인자 또는 섬유아세포 성장 인자 유형 1(FGF-1)을 코딩하는 플라스미드인 NV1FGF는 안전성 요건을 충족시킨다. Camerota 등의 문헌[J. Vasc. Surg., 2002, 35, 5: 930-936]은 휴식기 통증 또는 조직 괴사가 있는 재생 불가능한 51명의 말기 PAD 환자에게 허혈성 대퇴부 및 장딴지로 단일 용량 또는 반복 용량의 NV1FGF를 용량을 증가시키면서 근육 주사하였다. 그 후에 경피성 산소 압력, 발목 및 발가락 상완 지수, 통증 평가 및 궤양 치유와 같은 다양한 파라미터를 측정하였다. NV1FGF 투여 후에 상완 지수의 유의적인 증가, 통증 감소, 궤양 크기의 축소 및 관류 향상이 관찰되었다.
본 발명에 따라 유용한 숙주 세포는 임의의 박테리아 균주, 즉 그램 양성 균주 및 그램 음성 균주 둘 다, 예컨대 전술한 고카피수의 플라스미드(예를 들어 20∼200 카피수)를 유지할 수 있는 이. 콜라이 및 살모넬라 티피뮤리움 또는 바실러스일 수 있다. 이. 콜라이 숙주 균주가 본 발명에 따라 사용될 수 있으며, 이것은 HB101, DH1, 및 DH5αF, XAC-1 및 XAC-1pir 116, TEX2, 및 TEX2pir42(W0 04/033664)를 포함한다. F 플라스미드 또는 F 플라스미드 유도체를 포함하는 균주(예를 들어, JM109)는 일반적으로 바람직하지 않은데, 그 이유는 F 플라스미드는 치료용 플라스미드 생성물과 동시에 정제될 수 있기 때문이다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 또한 오염물을 실질적으로 포함하지 않거나 오염물이 ppm 이하의 범위로 존재하기 때문에 약학적 등급의 DNA가 되는 고도로 정제된 플라스미드 DNA를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 따라서 본 발명에 따른 약학적 등급의 플라스미드 DNA 조성물은 ppm 이하(< 0.0001%, 즉 < 0.0001 mg/100 mg 플라스미드 DNA) gDNA, RNA 및 단백질 오염물을 포함한다.
따라서, 약학적 등급의 플라스미드 DNA 조성물은 약 0.01% 미만, 또는 0.001% 미만, 바람직하게는 0.0001% 미만, 또는 바람직하게는 0.00008% 미만(< 0.0008%, 즉 < 0.0008 mg/100 mg 플라스미드 DNA)의 염색체 DNA 또는 게놈 DNA를 포함한다.
따라서, 약학적 등급의 플라스미드 DNA 조성물은 약 0.01% 미만, 또는 0.001% 미만, 바람직하게는 0.0001% 미만, 또는 바람직하게는 0.00002% 미만(< 0.0002%, 즉 < 0.0002 mg/100 mg 플라스미드 DNA)의 RNA 오염물을 포함한다.
따라서, 약학적 등급의 플라스미드 DNA 조성물은 약 0.0001% 미만, 가장 바람직하게는 0.00005% 미만의 단백질 오염물을 함유한다.
따라서, 약학적 등급의 DNA 조성물은 0.1 EU/mg 미만의 내독소를 함유한다.
따라서, 약학적 등급의 DNA 조성물은 주로 원형 플라스미드 DNA를 함유하며, 보다 정확하게는 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%를 초과하는 폐쇄 원형 플라스미드 DNA를 함유한다.
본 발명은 또한 실온에서 장기간 동안 안정한 상태로 존재하고 분해되지 않은 상태로 유지되기 때문에 연구 및 관련 인간 치료법에 사용되는 플라스미드 DNA의 보관에 유용한 플라스미드 DNA 액체 제제에 관한 것이다.
따라서 본 발명은 플라스미드 DNA, 매우 희석된 완충액 및 염수 부형제를 포함하는 안정한 플라스미드 DNA 제제에 관한 것으로, 이때 상기 완충액은 상기 제제 또는 조성물의 pH를 7∼7.5로 유지하기 위한 농도로 존재한다.
조성물의 pH를 7∼7.5로 유지할 수 있는 완충액은 트리스[트리스(히드록시메틸)-아미노메탄], 또는 리신 및 강산(예를 들어, 염산) 또는 약산(예를 들어, 말레산, 말산 또는 아세트산)으로부터 선택되는 산을 포함하는 산/염기 시스템, 또는 Hepes [2-(4-(2-히드록시에틸피페라진)-1-일)에탄설폰산] 및 강염기(예를 들어, 수산화나트륨)를 포함하는 산/염기 시스템으로 구성된다. 완충액은 또한 Tris/HCl, 리신/HCl, Tris/말레산, Tris/말산, Tris/아세트산, 또는 Hepes/수산화나트륨을 포함할 수 있다.
바람직하게는, pH는 7∼7.5로 유지하며, 특히 약 7.2로 유지한다.
본 발명의 제제에 사용될 수 있는 염수 부형제는 바람직하게는 농도가 100∼200 mM이며, 바람직하게는 약 150 mM인 NaCl이다. 다른 염수 부형제는 아세테이트, 포스페이트, 카르보네이트, SO2- 4, Cl-, Br-, N03 -, Mg2+, Li+, Na+, K+, 및 NH4 +로 구성된 군에서 선택되는 음이온 및 양이온을 포함할 수 있다.
완충액의 몰 농도는 pH 값이 7∼7.5에서 안정화되는 부피 및 한계 내에서 완충 효과를 나타내도록 결정된다. 따라서 본 발명에 따른 안정한 플라스미드-DNA 보관 조성물은 플라스미드 DNA, 염수 부형제 및 완충액을 포함하며, 이때 완충액은 상기 제제 또는 조성물의 pH가 7∼7.5로 유지되도록 최대 1 mM, 바람직하게는 250 μM∼1 mM, 또는 바람직하게는 400 μM∼1 mM의 농도로 존재한다. 본 발명에 따른 완충액 시스템 중에서, 400 μM 농도의 Tris 완충액은 특히 만족스러운 결과를 제공하며, 따라서 본 발명의 플라스미드 제제에 바람직하다.
하기 실시예에 제시된 바와 같이, 본 발명에 따른 플라스미드 DNA 제제는 4℃뿐 아니라 실온, 예를 들어 20∼25℃에서도 탁월한 안정성을 나타낸다. 특히, 플라스미드 DNA 제제는 4℃ 및 25℃, 즉 RT에서 1 개월, 2 개월, 3 개월에서 6 개월 및 최대 12 개월의 장기간 동안 유용하다.
따라서 본 발명은 플라스미드 DNA, 완충액 및 염수 부형제를 포함하는 조성물에 관한 것이며, 여기서 상기 완충액은 4∼25℃에서 플라스미드 DNA를 안정한 형태로 보존하기에 충분한 농도로 존재한다.
본 발명은 또한 플라스미드 DNA, 완충액 및 염수 부형제를 포함하는 조성물에 관한 것이며, 여기서 상기 완충액은 4∼25℃에서 1 개월, 2 개월, 3 개월 내지 6 개월 및 최대 12 개월의 장기간 동안 플라스미드 DNA를 안정한 형태로 보존하기에 충분한 농도로 존재한다.
실제로, 5℃ 또는 실온에서 장기간 동안 보관되는 플라스미드 DNA는 1 개월당 20%, 15%, 10%, 5% 또는 ≤ 1%보다 낮은 매우 낮은 탈퓨린율 및 개방 원형률을 나타낸다.
본 발명에 따른 조성물은 보조제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 플루로닉, 또는 폴리솔베이트 당, 또는 알콜 중에서 선택되는 중합체를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 측면에 따르면 본 발명은 a) 정제된 플라스미드 DNA 샘플을 조제하는 단계 및 b) 염수 부형제 및 생성된 조성물의 pH를 7∼7.5로 유지하는 완충액과 상기 정제된 플라스미드 DNA 샘플을 배합하는 단계를 포함하는, 조성물 중에서 플라스미드 DNA를 보존하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 a) 정제된 플라스미드 DNA 샘플을 조제하는 단계, b) 상기 정제된 플라스미드 DNA 샘플을 염수 부형제 및 완충액(이 완충액은 1 mM 미만, 또는 250 μM∼1 mM, 바람직하게는 400 μM의 농도로 존재함)과 배합하는 단계, 및 c) 약 4℃∼약 20℃의 온도에서 플라스미드 DNA 조성물을 보관하는 단계를 포함하는, 최대 약 20℃의 온도에서 조성물 중에 플라스미드 DNA를 보존하는 방법에 관한 것이다.
클로닝 및 분자 생물학의 일반적 기법
제한 효소를 사용한 분해, 겔 전기영동, 이. 콜라이에서의 형질전환, 핵산의 침전 등과 같은 분자 생물학의 전통적 방법은 문헌에 공지되어 있다(Maniatis et al., T., E.F. Fritsch, and J. Sambrook, 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, second edition. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Ausubel F.M., R. Brent, R.E. Kinston, D.D. Moore, J.A. Smith, J.G. Seidman and K. Struhl. 1987. Current protocols in molecular biology 1987-1988. John Willey and Sons, New York.). 이미 공개된 프로토콜에 따라 사슬 종결법에 의해 뉴클레오티드 서열을 결정하였다(Ausubel et al., 1987).
제한 효소는 매사추세츠주 비버리 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)에 의해 공급되었다.
결찰을 수행하기 위해, DNA 단편을 T4 DNA 리가제(Biolabs) 존재 하에 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP를 포함하는 완충액 중에서 항온처리한다.
시아노에틸기에 의해 β 위치에서 보호된 포스포아미다이트로 포스포아미다이트 화학 반응을 이용하여 제조업자의 권고에 따라 Biosearch 8600 자동 DNA 합성기를 사용하여 올리고뉴클레오티드를 합성한다(Sinha, N.D., J. Biernat, J. McManus and H. Koster, 1984. Polymer support oligonucleotide synthesis, XVIII: Use of β-cyanoethyl-N,N-dialkylamino-/N-morpholino phosphoramidite of deoxynucleosides for the synthesis of DNA fragments simplifying deprotection and isolation of the final product. Nucl. Acids Res., 12, 4539-4557: Giles, J.W. 1985. Advances in automated DNA synthesis. Am. Biotechnol., Nov./Dec.).
형질전환 효율을 테스트하고자 하는 결찰된 RNA 또는 DNA를 사용하여 하기 균주를 형질전환시켜 적격성(competent)으로 만든다:
이. 콜라이 DH5α[F/endA1, hsdR17, supE44, thi-1, recA1, gyrA96, relA1, Δ(lacZYA-arqF) U169, deoR, Φ80dlac (lacZΔM15)] (임의의 Col E1 플라스미드용); 또는 이. 콜라이 XAC-pir (임의의 pCor 유래 플라스미드용).
플라스미드 DNA의 소량 조제 과정은 Klein 등의 프로토콜(1980)에 준하였다.
이. 콜라이 균주의 배양을 위해서는 LB 배양 배지를 사용한다(Maniatis et al., 1982). 균주는 37℃에서 배양한다. 박테리아를 적절한 항생제가 보충된 LB 배지 접시에 도말한다.
실시예 1
사용된 유량에 대한 직경의 조정은 연속 용해 시스템의 코일 내의 레이놀드수의 계산값을 따랐다. 하기의 분석은, 유체의 거동이 뉴톤성이라고 가정하였기 때문에, 하기에 기록된 수치는 B1a에서만 완벽하게 유효하고 B2에서는 어느 정도만 유효하다.
레이놀드수의 값에 의해 당업자는 접하게 되는 거동의 유형을 특정할 수 있다. 여기서는 튜브 내의 유체 흐름만을 다룰 것이다(수력 공학).
1) 비뉴톤 유체
산업에서 가장 흔하게 접하게 되는 비뉴톤 유체의 두 가지 유형은 빙엄(Bingham) 및 오스트왈드 드 웰(Ostwald de Waele)이다.
이 경우, 레이놀드수(Re)는 다음과 같이 계산한다:
ReN은 일반화된 레이놀드수이다.
ReN = (1/(2n-3)) x (n/3n+1)n x ((ρx Dn x w2-n)/m) (1)
D: 횡단면의 내경(m)
ρ: 유체의 부피 질량(kg/m3)
w: 유체의 공간 속도(m/s)
n: 흐름 거동 지수(무차원)
m: 유체 점조도 계수(dynㆍsn/cm2)
n 및 m은 실험적으로 결정된다(레올로지 거동의 연구)
2) 뉴톤 유체
제1 섹션에 관하여, 식 (1)에서 다음과 같이 정의된다:
n 및 m은 μ의 함수이므로, Re = f(내경, μ, ρ 및 u)
Re = (u x D x ρ)/μ (2)
ρ: 유체의 부피 질량(kg/m3)
μ: 유체의 점도(Pa.s, 및 1 mPa.s = 1 cP)
D: 횡단면의 내경(m)
u: 유체의 평균 공간 속도(m/s)
식 (1)은 n = 1인 경우, 식 (2)로 감소된다.
Q = 유량(m3/h) 및 S = 횡단면의 표면적(m2)이고 μ가 cP로 주어질 경우,
Re = (4 x (Q/3600) x ρ)/(μ/1000) x II x D) (3)
원형 도관에서, 레이놀드수가 2500 이하인 경우 흐름은 층류이며, 레이놀드 수가 2000∼500,000인 경우 흐름은 수력학적으로 평활한 난류이다. 이 한계는 2000∼2500 사이에서 불확실하며, 여기서 두 가지 유형의 거동을 이용하여 다음에 일어날 수 있는 것을 결정하고, 그 선택은 귀납적으로 이루어진다.
3) 계산
n 및 m은 일반적으로 알고 있지 않기 때문에, 하기의 근사값을 이용하여 흐름을 추정한다:
뉴톤 유체(모든 횡단면에서)
ρ: 1000 kg/m3(모든 유체에 대하여)
μ = B1a에서는 5 cP, B1b에서는 40 cP(본 발명자들의 데이터)
B2에서는 2.5 cP(본 발명자들의 데이터)
하기의 계산값은 구조 1 및 구조 2로 명명되는 테스트된 두 개의 표준 튜브 구조에 대하여 식 (3)을 이용하여 수행하였다(B1b 튜브 없이):
[표 2]
코일
 구조 1 구조 2
B1a B2 B1a B2
점도*(cP) 5 2.5 5 2.5
직경(mm) 12.7 9.5 6 6
유량(L/h) 60 105 12 21
레이놀드수 334 1564 141 495
진행 층류 층류 층류 층류
이러한 두 가지 구조에서, 흐름은 모든 단계에서 층류이고 용액은 서로 적절히 혼합되지 않는다.
다른 튜브 구조의 경우(B1b 튜브 없음)는 다음과 같다:
[표 3]
코일
 고속/표준 직경 고속/16 mm ID 고속/6 mm ID
B1a B2 B1a B2 B1a B2
점도*(cP) 5 2.5 5 2.5 5 2.5
직경(mm) 12 10 16 16 6 6
유량(L/h) 120 210 120 210 120 210
레이놀드수 707 2971 531 1857 1415 4951
진행 층류 난류 층류 층류 층류 난류
B1a 및 B1b 튜브 둘 다가 존재하는 다양한 튜브 구조에 대하여 식 (3)을 이용하여 유사한 계산을 수행하였다:
[표 4]
코일
 고속 고속/최대 진탕
B1a B1b B2 B1a B1a B1a
점도*(cP) 5 5 2.5 5 5 5
직경(mm) 6 16 6 3 2 3
유량(L/h) 120 120 210 120 120 160
레이놀드수 1415 531 4951 2829 4244 3773
진행 층류 층류 난류 난류 난류 난류
분명히, 소정의 레이놀드 값은 튜브 직경 및 유량을 조정하여 얻을 수 있다.
당업자는 B2에 대하여 또는 B1의 두 섹션(B1a 및 B1b)에 대하여 다수의 직경 및 길이의 조합을 고려할 수 있다. 예를 들어, B1의 제1 섹션은 길이를 감소시키고 진탕을 증가시키기 위해 6 mm에서 3 mm로 감소시킬 수 있다. 또한, n 및 m은 유체의 레올로지 거동의 연구로부터 결정하여, 튜브의 정확한 특성을 결정하는 데 이용할 수 있다.
진탕 효율 이외에도, 진탕 시간을 고려할 수 있는데, 이는 본 발명의 몇몇 구체예에서 코일의 길이를 조정함으로써 얻어진다.
튜브의 직경 또는 유체 속도는 비뉴톤 유체의 경우 식 (1)에 지배되지 않는 것으로 보인다(데이터는 나타내지 않음). 즉, 식 (1)이 B1b 및 B2 내에서 계산에 사용된다면 유량을 변경하기보다 직경을 변경하는 것이 더 효과적인 것으로 보이지 않는다. 높은 유량이 바람직한 경우라면, 직경은 유량에 따라 변화시킬 수 있다.
이러한 원리는 gDNA의 단편화를 방지하기 위해 B1b 및 B2에서 가능한 한 많이 진탕을 제한하기 위한 기초로서 이용될 수 있다.
용해 과정 중에, 진탕은 gDNA가 변성되지 않는 한 아주 세게 실시할 수 있다. B1의 시작부에 직경을 감소시키는 것은 세포와 용액 2를 충분히 혼합하기 위해 진탕을 증가시키는 것(증가된 Re)을 가능하게 한다. 반면에, 세포가 용해될 경우, 벽에 대한 마찰력 및 진탕은 핵산 단편화를 방지하기 위해 감소시킬 수 있다. 직경을 증가시키는 것은 진탕을 감소시키고(감소된 Re) 마찰력을 감소시킬 수 있게(감소된 속도) 한다.
M1: 유체를 혼합함
B1a: 용해 초반부에 혼합을 미세하게 조정함: 대류 현상(대량 혼합)
B1b: 변성이 발생하고 확산 현상이 발생함(미세 혼합)
일반화된 레이놀드수는 전통적 레이놀드수가 뉴톤 유체에 대하여 가지는 것과 동일한 의미를 비뉴톤 유체에 대하여도 갖는 것으로 가정한다. 특히, 원형 횡단면의 도관에서의 층류 상황에 대한 한계가 ReN < 2300인 것으로 가정한다.
중화는 B2 내에서 수행된다. 높은 유량은 너무 강한 진탕을 유발하거나 벽에서의 마찰력(기계적 응력)에 의해 게놈 DNA의 단편화를 증가시키는 것으로 생각된다. 대직경 튜브를 사용하는 것은 진탕(Re) 및 마찰력(속도)을 감소시킬 수 있다. 본 발명자들은 불충분한 진탕이 일어나는 것을 방지하기 위해 소직경 튜브(6 mm)를 배치하였다. 본 발명자들의 관찰에 의하면, 중화된 용해물을 "강하고 신속하게" 진탕시키기 위해 B2에 대해서는 단지 소직경의 튜브를 갖는 것이 최상인 것으로 나타났다.
실시예 2
CL 시스템은 5 단계로 세분할 수 있다. 한 가지 특정 구체예에서, 구조는 다음과 같았다:
1) 혼합: 세포(용액 1 중) + 용액 2(M1 + 6 mm 튜브 3 m)
SDS에 의해 세포 용해를 시작한다. 변성되지 않는 한 DNA의 단편화는 발생하지 않는다.
2) gDNA의 용해 및 변성을 종결한다(16 mm 튜브 13 m)
3) 혼합: 용해물 + 용액 3(M2 + 16 mm 튜브 3 m)
4) 4℃에서 중화된 용해물을 회수한다.
5) 4℃에서 응집물과 gDNA의 대형 단편들을 밤새 침전시킨다.
연속 용해를 수행하기 위해 하기의 조건을 이용할 수 있다:
- 용액 1: EDTA 10 mM, 글루코스(Glc) 9 g/l 및 Tris HCl 25 mM, pH 7.2
- 용액 2: SDS 1% 및 NaOH 0.2 N
- 용액 3: 아세트산 2 M 및 아세트산칼륨 3 M
- 유량 60 l/h: 용액 1 및 용액 2
- 유량 90 l/h: 용액 3
- 용액 1로 세포를 38.5 g/l로 조정함
용액 1 중의 세포는 3개의 노즐을 통과하여, 반대 방향으로부터 도달되는 용액 2로 유입된다.
- 혼합기 M1은 두 가지 유체의 혼합을 최적화할 수 있도록 하는 기하구조를 갖는다(도 2 참조, 혼합기의 개략도)
- 혼합기 M1 다음의 튜브의 제1 섹션은 B1a이며, 다음 섹션은 B1b이다.
B1a: 길이 3 m, 직경 6 mm, 체류 시간 2.5초
B1b: 길이 13 m, 직경 16 mm, 체류 시간 77초
본 발명의 방법은 효율성의 측면에서 다음과 같이 요약되는 장점들을 갖는다: 분산성, 단순하고 강한 혼합 및 확산에 의해 약한 혼합.
본 발명의 방법을 이용하면, 용해된 세포의 수가 증가하며, 따라서 pDNA의 회수량이 증가한다.
확산이라는 아이디어는 유체의 특성, 특히 점탄성으로 인하여 이들 유체를 혼합하는 것이 어렵기 때문에 특히 중요하다.
본 발명의 방법은 전단 응력을 제한하는 것을 가능하게 하고 이로써 gDNA의 단편화를 제한하여, 후속 크로마토그래피 정제 과정 중의 제거를 촉진한다.
그 후에 용액 3과의 혼합이 수행되는데, 용액 3은 4℃로 냉각시킬 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 방법은 하기를 이용한다:
- 내경의 Y가 약 10 mm인 혼합기 M2
- 혼합기 M2 다음에 배치된 튜브 B2의 섹션
B2: 6 mm 튜브 2 m; 체류 시간 1초
하기 표 5는 회분식 용해와 비교하여 본 발명의 연속식 방법의 장점을 보여주는 비교 시험에서 얻어진 결과를 제시한다.
[표 5]
용해물 중의 gDNA/pDNA의
비		 세포 1 g당 추출된
플라스미드의 양(mg/g)
회분식 용해 16.9 1.4
실시예 1에 기재된 CL
시스템을 사용한 연속식 용해		 1.6 1.9
실시예 3
사용된 컬럼은 연동 펌프에 연결된 NHS(N-히드록시숙신이미드, 파마시아)로 활성화된 1 ml HiTrap 컬럼이다(산출량 < 1 ml/분).
사용된 특이적 올리고뉴클레오티드는 5' 말단에 NH2 기가 있고, 그 서열은 다음과 같다: 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (서열 번호 1)
이 실시예에서 사용된 완충액은 다음과 같다:
커플링 완충액: 0.2 M NaHC03, 0.5 M NaCl, pH 8.3.
완충액 A: 0.5 M 에탄올아민, 0.5 M NaCl, pH 8.3.
완충액 B: 0.1 M 아세테이트, 0.5 M NaCl, pH 4.
이 컬럼을 1 mM HCl 6 ml로 세척한 후에, 커플링 완충액(1 ml 중 50 nmol)에 희석시킨 올리고뉴클레오티드를 컬럼에 적용하고, 실온에서 30분간 방치한다. 이 컬럼을 6 ml의 완충액 A로 3회 연속 세척한 뒤에 6 ml의 완충액 B로 세척한다. 이로써 올리고뉴클레오티드는 CONH 결합을 통해 컬럼에 공유 결합된다. 이 컬럼은 PBS, 0.1% NaN3 중 4℃에서 보관하며, 적어도 4회 사용할 수 있다.
다음과 같은 두 개의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다:
올리고뉴클레오티드 4817:
5'-GATCCGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGG-3'
(서열 번호 13) 및
올리고뉴클레오티드 4818:
5'-AATTCCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCG-3'
(서열 번호 14)
이들 올리고뉴클레오티드는, 플라스미드로 하이브리드화 및 클로닝될 때, 전술한 바와 같이 호모퓨린-호모피리미딘 서열(GAA)17 (서열 번호 15)를 상응하는 플라스미드로 도입한다.
이들 두 개의 하이브리드화된 올리고뉴클레오티드에 상응하는 서열은 암피실린 내성 유전자를 보유하는 플라스미드 pBKS+(스트라타진 클로닝 시스템, 캘리포니아주 라 졸라)의 다중 클로닝 부위에 클로닝하였다. 이를 위해, 올리고뉴클레오티드를 다음과 같은 방법으로 하이브리드화하였다: 상기 두 개의 올리고뉴클레오티드 1 ㎍을 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 10 mM MgCl2를 포함하는 최종 완충액 40 ml에 함께 첨가하였다. 이 혼합물을 95℃로 가열하고, 그 후 온도가 서서히 하락하도록 실온에 두었다. 하이브리드화된 올리고뉴클레오티드의 혼합물 10 ng을, 최종 30 ㎕로 BamHI 및 EcoRI으로 분해된 20 ng의 플라스미드 pBKS+(스트라타진 클로닝 시스템, 캘리포니아주 라 졸라)와 결찰시켰다. 결찰 후, 분액을 DH5α로 형질전환시켰다. 형질전환 혼합물을 암피실린(50 mg/l) 및 X-gal(20 mg/l)이 보충된 L 배지에 도말하였다. 재조합 클론은 이 배지 상에서 청색을 발현하지 않았으며, 이는 이. 콜라이 β-갈락토시다제의 단편 ω의 α-보완을 허용하는 모 플라스미드(pBKS+)와 대조적이다. 6개 클론으로부터 플라스미드 DNA를 소량 조제한 후에, 이들은 모두 pBKS+의 EcoRI 및 BamHI 사이에 위치하는 PstI 부위의 소실과, 다중 클로닝 부위를 포함하는 448 bp PvuII 밴드의 분자량의 증가를 나타내었다. 한 클론을 선택하고, 해당 플라스미드를 pXL2563으로 명명하였다. 클로닝된 서열은 플라스미드 pBKS+(스트라타진 클로닝 시스템, 캘리포니아주 라 졸라)에 대하여 프라이머 -20(5'-TGACCGGCAGCAAAATG-3' (서열 번호 16)를 사용한 서열분석에 의해 확인하였다(Viera J. and J. Messing. 1982. The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene, 19, 259-268). 플라스미드 pXL2563은 위저드 메가프렙(Wizard Megaprep) 키트(프로메가 코포레이션, 위스콘신주 매디슨)에 따라 공급업자의 권고에 따라 정제하였다. 이러한 플라스미드 DNA 제조물은 이후에 하기 실시예에서 사용하였다.
플라스미드 pXL2563은 플라스미드 pBKS+ 역시 포함하는 용액으로부터, 1.1.에 기재된, 올리고뉴클레오티드에 커플링된 HiTrap 컬럼 상에서 정제하였다. 이 정제에 사용된 완충액은 다음과 같다:
완충액 F: 2 M NaCl, 0.2 M 아세테이트, pH 4.5∼5.
완충액 E: 1 M Tris-HCI, pH 9, 0.5 mM EDTA.
이 컬럼은 6 ml의 완충액 F로 세척하고, 플라스미드(완충액 F 400 ㎕ 중의 pXL2563 20 ㎍ 및 pBKS+ 20 ㎍)를 컬럼에 적용하고, 실온에서 2 시간 동안 항온처리하였다. 컬럼을 완충액 F 100 ml로 세척하고 완충액 E로 용출을 수행한다. 1% 아가로스 겔 전기영동과 에티디움 브로마이드 염색 후 플라스미드를 검출한다. 용액 중의 플라스미드의 비율은 이. 콜라이에 대한 형질전환 활성을 측정하여 추정한다.
pXL2563 30% 및 pBKS+ 70%를 포함하는 혼합물로부터 출발하여, pXL2563 100%를 함유하는 용액을 컬럼 유출구에서 회수한다. 260 nm 및 280 nm에서의 OD 비에 의해 추정되는 순도는 1.9∼2.5이며, 이는 오염성 단백질이 이 방법에 의해 제거되었음을 나타낸다.
실시예 4
컬럼에 대한 올리고뉴클레오티드 (5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3') (서열 번호 1)의 커플링은 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행한다. 커플링을 위해, 올리고뉴클레오티드를 6개의 탄소 원자를 포함하는 팔에 의해 스페이서의 포스페이트에 결합된 아민기로 5' 말단에서 변형시킨다(Modified Oligonucleotide Eurogentec SA, 벨기에). 위저드 메가프렙 키트(프로메가 코포레이션, 위스콘신주 메디슨)을 이용하여 공급업자의 권고에 따라 pXL2563을 정제하였다. 이 실시예에서 사용된 완충액은 다음과 같다:
완충액 F: 0∼2 M NaCl, 0.2 M 아세테이트, pH 4.5∼5.
완충액 E: 1 M Tris-HCI pH 9, 0.5 mM EDTA.
컬럼을 6 ml의 완충액 F로 세척하고, 완충액 F 400 ㎕ 중에 희석된 플라스미드 pXL2563 100 ㎍을 컬럼에 적용하여 실온에서 2 시간 동안 항온처리한다. 이 컬럼을 10 ml의 완충액 F로 세척하고, 그 뒤 완충액 E로 용출한다. 플라스미드는 260 nm에서 흡광도를 측정하여 정량한다.
이 실시예에서, 결합은 NaCl에 대한 몰 농도가 0 M에서 2 M로 변화되는 완충액(완충액 F) 중에서 수행한다. 정제 수율은, NaCl의 몰 농도가 하락할 때 감소한다. 결합 완충액의 pH는 4.5에서 5로 변화될 수 있으며, 정제 수율은 4.5에서 우수하다. 염기성 pH의 다른 용출 완충액을 사용하는 것도 가능한데, 따라서 50 mM 보레이트, pH 9, 0.5 mM EDTA를 포함하는 완충액으로 수행하였다. 컬럼에 대한 올리고뉴클레오티드 (5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (서열 번호 1)의 커플링은 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행한다. 위저드 메가프렙 키트(프로메가 코포레이션, 위스콘신주 메디슨)를 사용하여 공급업자의 권고에 따라 플라스미드 pXL2563을 정제하였다. 이 실시예에 사용된 완충액은 다음과 같았다:
완충액 F: 0.1 M NaCl, 0.2 M 아세테이트, pH 5.
완충액 E: 1 M Tris-HCI pH 9, 0.5 mM EDTA.
컬럼을 6 ml의 완충액 F로 세척하고, 400 ㎕의 완충액에 희석시킨 100 ㎍의 플라스미드 pXL2563을 컬럼에 적용한 후, 실온에서 1 시간 동안 항온처리한다. 이 컬럼을 10 ml의 완충액 F로 세척하고, 그 뒤 완충액 E로 용출시킨다. 올리고뉴클레오티드 컬럼을 통과하기 전과 후의 플라스미드 샘플 중에 존재하는 게놈 또는 염색체 이. 콜라이 DNA의 함량을 측정한다. 상기 게놈 DNA는 이. 콜라이 galK 유전자 내의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 정량한다. 하기 프로토콜에 따른다. 이러한 프라이머의 서열은 Debouck 등의 문헌[Nucleic Acids Res. 19 85, 13, 1841-1853]에 기재되어 있다:
5'-CCG AAT TCT GGG GAC CAA AGC AGT TTC-3' (서열 번호 17) 및
5'-CCA AGC TTC ACT GTT CAC GAC GGG TGT-3' (서열 번호 18).
반응 매질은 25 ㎕의 PCR 완충액(프로메가 프랑스, Charbonnieres) 중에 1.5 mM MgCl2; 0.2 mM dXTP(파마시아, 오르세이); 0.5 μM 프라이머; 20 U/ml Taq 폴리머라제(프로메가)를 포함한다. 이 반응은 하기 순서에 따라 수행한다.
- 95℃에서 5분
- 95℃에서 10초간, 60℃에서 30초간, 78℃에서 1분간 30 사이클
- 78℃에서 10분
124 염기쌍 길이의 증폭된 DNA 단편을 SybrGreen I(몰리큘러 프로브스, 미국 유진) 존재 하에 3% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 분리한 뒤, 이. 콜라이 균주 B로부터의 Ultrapur 게놈 DNA 시리즈(시그마, refD4889)를 기준으로 하여 정량한다.
실시예 5
이 실시예는 소위 "미니프렙(소량정제)" 규모로, 박테리아 배양물의 투명한 용해물로부터 플라스미드 DNA를 정제하는 방법을 기재한다: pXL2563을 포함하는 DH5α 균주를 밤새 배양한 배양물 1.5 ml를 원심분리하고, 펠릿을 50 mM 글루코스, 25 mM Tris-HCl, pH 8, 10 mM EDTA로 구성된 100 ㎕에 재현탁시킨다. 0.2 M NaOH, 1% SDS로 구성된 200 ㎕를 첨가하고, 튜브를 뒤집어 혼합한 후에, 3 M 아세트산칼륨(pH 5) 150 ㎕를 첨가하고, 튜브를 뒤집어 혼합한다. 원심분리 후, 상청액을 회수하고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 얻은 올리고뉴클레오티드 컬럼에 로딩한다. 결합, 세척 및 용출은 실시예 3에 기재된 바와 동일하다. 1.5 ml의 배양물로부터 대략 1 ㎍의 플라스미드를 회수한다. 수득된 플라스미드는 아가로스 겔 전기영동 및 에티디움 브로마이드 염색에 의한 분석에 의하면, "수퍼코일" 원형 DNA의 단일 밴드의 형태를 취한다. 이 방법에 의해 정제된 플라스미드에서 고분자량(염색체) DNA 또는 RNA의 흔적은 검출되지 않는다.
실시예 6
이 실시예는, pXL2563을 포함하는 DH5α 균주의 박테리아 배양물 20 ml로부터 출발하여, 실시예 5와 동일한 조건 하에 수행되는 플라스미드 DNA 정제 실험에 대해 기재한다. 세포 펠릿을 50 mM 글루코스, 25 mM Tris-HCI, pH 8, 10 mM EDTA로 구성된 1.5 ml에 용해시킨다. 용해는 2 ml의 0.2 M NaOH, 1% SDS로 수행하며, 중화는 1.5 ml의 3 M 아세트산칼륨(pH 5)으로 수행한다. 그 후 DNA를 3 ml의 2-프로판올로 침전시키고, 펠릿을 0.5 ml의 0.2 M 아세트산나트륨(pH 5.0), 1 M NaCl에 용 해시키고, 상기 실시예에 기재된 바와 같이 얻은 올리고뉴클레오티드 컬럼에 로딩한다. 결합, 컬럼의 세척 및 용출은 상기 실시예에 기재된 바와 같이 수행하되, 단, 세척 완충액의 경우 NaCl의 몰 농도가 0.1 M이다. 수득된 플라스미드는, 아가로스 겔 전기영동 및 에티디움 브로마이드 염색에 의해 분석 시, "수퍼코일" 원형 DNA의 단일 밴드의 형태를 취한다. 이 방법에 의해 정제된 플라스미드에서 고분자량(염색체) DNA 또는 RNA의 흔적은 검출되지 않는다. 제한 효소로 플라스미드를 분해하면, 예상 분자량 3 kb에서 단일 밴드가 나타난다. 사용된 플라스미드는 사이토메갈로바이러스 프로모터, 루시퍼라제에 대한 코딩 유전자 및 플라스미드 pXL2563으로부터 유래된 호모퓨린-호모피리미딘 서열(GAA)17(서열 번호 15)을 포함하는 카세트를 포함한다. 이 플라스미드를 포함하는 균주 DH1(Maniatis et al., 1989)을 7 리터의 배양기에서 배양한다. 200 g의 세포로부터 투명한 용해물을 마련한다. 세포 펠릿을 25 mM Tris, pH 6.8, 50 mM 글루코스, 10 mM EDTA를 포함하는 2 리터에 용해시키고, 여기에 0.2 M NaOH, 1% SDS를 포함하는 2 리터를 첨가한다. 이 용해물에 3 M 아세트산칼륨 1 리터를 첨가하여 중화시킨다. 정용여과 후, 이 용해물 4 ml를, 실시예 3에 기재된 방법에 따라 올리고뉴클레오티드 서열 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (서열 번호 1)에 커플링된 5 ml HiTrap-NHS 컬럼에 적용한다. 세척 및 용출은 상기 실시예에 기재된 바와 같이 수행한다.
실시예 7
이 실시예는 메틸화된 시토신을 보유하는 올리고뉴클레오티드의 사용에 관해 기재한다. 올리고뉴클레오티드의 서열은 다음과 같다:
5'-GAGGMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCCTMeCTTMeCTT-3' (서열 번호 19)
이 올리고뉴클레오티드는 5' 말단에 NH2기를 보유한다. MeC = 5-메틸시토신. 이 올리고뉴클레오티드는 pH 5의 결합 완충액을 사용하여 실시예 1의 조건 하에 플라스미드 pXL2563을 정제할 수 있게 한다(이로써 플라스미드의 분해 위험이 감소된다).
실시예 8
상기 실시예에서 사용된 올리고뉴클레오티드를, 6개의 탄소 원자를 포함하는 팔을 통해 포스페이트에 결합된 아민기[NH2-(CH2)6]를 사용하여 5'-말단을 변형시킨다. 이 실시예에서, 아민기는 12개의 탄소 원자를 포함하는 팔을 통해 5' 말단의 포스페이트에 결합된다: NH2-(CH2)12. 올리고뉴클레오티드의 커플링과 컬럼의 통과는 완충액 F: 2 M NaCl, 0.2 M 아세테이트(pH 4.5)를 사용하여 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행한다. 이 올리고뉴클레오티드에 의하면 더 우수한 정제 수율: 즉 53%의 수율이 얻어지는 반면, 6개 탄소 원자를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 사용하면, 이 수율이 동일한 조건 하에 약 45%가 된다.
실시예 9
실시예 3에 기재된 클로닝 방법에 따라, 호모퓨린-호모피리미딘 서열을 보유하는 또 다른 두 개의 플라스미드를 구성하였다: 서열 (GGA)16 (서열 번호 20)을 포 함하는 플라스미드 pXL2725 및 서열 (GA)25 (서열 번호 21)를 포함하는 플라스미드 pXL2726.
플라스미드 pXL2563과 유사한 플라스미드 pXL2725 및 pXL2726은 실시예 3에 기재된 클로닝 방법에 따라, 하기의 올리고뉴클레오티드쌍을 사용하여 구성하였다:
5986: 5'-GATCC(GA)25GGG-3' (서열 번호 22)
5987: 5'-AATTCCC(TC)25G-3' (서열 번호 23)
5981: 5'-GATCC(GGA)17GG-3' (서열 번호 24)
5982: 5'-AATT(CCT)17CCG-3' (서열 번호 25)
올리고뉴클레오티드쌍 5986 및 5987은 pBKS+(스트라타진 클로닝 시스템, 캘리포니아주 라 졸라)의 BamHI 및 EcoRI 부위에서 올리고뉴클레오티드를 클로닝하여 플라스미드 pXL2726을 구성하는 데 사용된 반면, 올리고뉴클레오티드 5981 및 5982는 플라스미드 pXL2725를 구성하는 데 사용되었다. 플라스미드 pXL2563의 구성에 대한 것과 동일한 실험 조건을 이용하였고, 다만 올리고뉴클레오티드쌍은 변화시켰다. 마찬가지로, 클로닝된 서열은 플라스미드를 서열분석하여 검증하였다. 이로써, 플라스미드 pXL2725가 예상 서열에 비해 변형을 보유한다는 것을 알 수 있었다: 서열 GGA가 17번 반복되는 대신에, GGAGA(GGA)15 (서열 번호 26)가 존재한다.
실시예 10
이러한 호모퓨린 서열과 삼중 나선을 형성하는 올리고뉴클레오티드는 실시예 1.1에 기재된 기법에 따라 HiTrap 컬럼에 커플링하였다. 올리고뉴클레오티드 서열 5'-AATGCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCT-3' (서열 번호 27)는 플라스미드 pXL2725의 정제를 위해 사용한 반면, 올리고뉴클레오티드 서열 5'-AGTGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT-3' (서열 번호 28)는 플라스미드 pXL2726의 정제를 위해 사용하였다.
이렇게 하여 얻은 두 개의 컬럼에 의해, 하기 완충액을 사용하여 실시예 2에 기재된 기법에 따라 해당 플라스미드를 정제할 수 있었다:
완충액 F: 2 M NaCl, 0.2 M 아세테이트, pH 4.5.
완충액 E: 1 M Tris-HCl, pH 9, 0.5 mM EDTA.
얻어진 수율은 pXL2725의 경우 23%, pXL2726의 경우 31%이다.
실시예 11
이 실시예는 플라스미드 내에 존재하는 특정 서열의 길이가 정제 수율에 미치는 영향을 예시한다.
본 발명 조성물의 활성을 입증하기 위해 이 실험에 사용된 리포터 유전자는 루시퍼라제(Luc)를 코딩하는 유전자이다.
플라스미드 pXL2621은, 루시퍼라제에 대한 유전자 코딩 영역의 상류에 클로닝된 제한 효소 MluI 및 HindIII로 절단하여 벡터 pGL 기본 벡터(프로메가 코포레이션, 위스콘신주 메디슨)로 클로닝된 pcDNA3(인비트로젠 코포레이션, 캘리포니아주 샌 디에고)로부터 추출된, 661 bp 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터를 포함하는 카세트를 포함한다. 이 플라스미드는 분자 생물학의 표준 기법을 이용하여 구성하였다.
플라스미드 pXL2727-1 및 pXL2727-2는 하기 방법으로 구성하였다:
2 ㎍의 플라스미드 pXL2621을 BamHI으로 선형화하였다; 이 효소는 65℃에서 10 분간 처리하여 불활성화시켰다. 동시에, 올리고뉴클레오티드 6006 및 6008을 플라스미드 pXL2563의 구성에 대하여 기재된 바와 같이 하이브리드화하였다.
6006: 5'-GATCT(GAA)17CTGCAGATCT-3' (서열 번호 29)
6008: 5'-GATCAGATCTGCAG(TTC)17A-3' (서열 번호 30)
상기 하이브리드화 혼합물을 플라스미드 pXL2621의 BamHI 말단에 클로닝하고, DH5α로 형질전환한 후, 올리고뉴클레오티드가 PstI 부위를 도입하기 때문에 PstI 효소 제한 분석에 의해 재조합 클론을 확인하였다. 두 개의 클론을 선별하고, 클로닝된 단편의 뉴클레오티드 서열을 서열분석 반응 프라이머로서 프라이머(6282, 5'-ACAGTCATAAGTGCGGCGACG-3' (서열 번호 31))를 사용하여 확인하였다(Viera J. and J. Messing, 1982. The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene, 19, 259-268).
제1 클론(pXL2727-1)은 10번 반복되는 서열 GAA를 포함한다. 제2 클론(pXL2727-2)은 서열 5'-GAAGAAGAG(GAA)7GGAAGAGAA-3' (서열 번호 32)를 포함한다.
실시예 3에 기재된 것과 같고, 올리고뉴클레오티드 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (서열 번호 1)에 커플링된 컬럼이 사용된다.
플라스미드 pXL2727-1은 서열 GAA의 14개 반복체를 보유한다. 상기 올리고뉴 클레오티드는 상응하는 하이브리드화 서열 CTT의 7개 반복체만을 포함하며, 따라서 8개의 상이한 위치에서 플라스미드와 하이브리드화할 수 있다. 이와는 달리, pXL2727-2는 컬럼에 결합된 올리고뉴클레오티드의 것과 동일한 길이의 하이브리드화 서열 (GAA)7 (서열 번호 36)을 보유한다. 따라서 이 올리고뉴클레오티드는 pXL2727-2 상의 단 하나의 위치에서 하이브리드화할 수 있다.
이 실험은 실시예 4에 기재된 것과 유사하되, 하기 완충액을 사용한다:
완충액 F: 2 M NaCl, 0.2 M 아세테이트, pH 4.5.
완충액 E: 1 M Tris-HCl, pH 9, 0.5 mM EDTA.
정제 수율은 플라스미드 pXL2727-1의 경우 29%이고 pXL2727-2의 경우 19%이다.
사용된 세포는 NIH 3T3 세포이며, 실험 하루 전에 24웰 배양 평판에 50,000 세포/웰을 기준으로 접종하였다. 이 플라스미드를 150 mM NaCl에 희석하고 리포텍턴트(lipofectant) RPR115335와 혼합한다. 리포텍턴트 양전하/DNA 음전하의 비는 6으로 한다. 혼합물을 와동 혼합하고, 실온에서 10분간 방치하고, 태아 소 혈청 비함유 배지에 희석시킨 뒤, 배양 웰당 DNA 1 ㎍의 비율로 세포에 첨가한다. 37℃에서 2 시간 경과 후, 10% 부피/부피 소 태아 혈청을 첨가하고, 5% CO2 존재 하에 37℃에서 48 시간 동안 항온처리한다. 세포를 PBS로 2회 세척하고, 공지된 프로토콜(프로메가 키트, 프로메가 코포레이션, 위스콘신주 메디슨)에 따라 Lumat LB9501 발광계(EG 앤드 G 버톨드, 에버리) 상에서 루시퍼라제 활성을 측정한다. 실시예 8.2 에 기재된 바와 같이 정제된 플라스미드 pXL2727-1은 위저드 메가프렙 키트(프로메가 코포레이션, 위스콘신주 메디슨)를 사용하여 정제된 동일한 플라스미드에 의해 얻어지는 것보다 2배의 형질감염 수율을 산출한다.
실시예 12
하기 실시예는 삼중 나선 친화성 크로마토그래피를 사용한 pCOR 유래 플라스미드의 정제 방법을 예시한다. 이 기법은 종래의 크로마토그래피 방법에 의해서는 얻을 수 없었던 수준으로 핵산 오염물(특히 숙주 게놈 DNA 및 RNA)을 제거하는 것으로 나타났다.
삼중 나선 친화성 겔은 크로마토그래피 매트릭스로서 세파크릴 S-1000 SF(아머샴-파마시아 바이오텍)를 사용하여 합성하였다. 세파크릴 S-1000은 먼저 0.2 M 아세트산나트륨(pH 4.7) 중의 나트륨 m-퍼요오데이트(3 mM, 실온, 1 시간)로 활성화시켰다. 그 후, 공지의 단백질 커플링 방법에 따라 아스코르브산(5 mM) 존재 하에 환원적 아민화에 의해 올리고뉴클레오티드를 5'-NH2 말단 부분을 통해 활성화된 매트릭스의 알데히드기에 커플링하였다(Hornsey et al., J. Immunol. Methods, 1986, 93, 83-88). 상기 실험에 사용된 호모피리미딘 올리고뉴클레오티드(유로젠텍으로부터 입수, HPLC 정제된 것)는 pCOR 플라스미드의 복제 기점(ori γ)에 존재하는 짧은 14량체의 호모퓨린 서열 (5'-AAGAAAAAAAAGAA-3') (서열 번호 10)에 상보적인 서열을 가졌다(Soubrier et al., Gene Therapy, 1999, 6, 1482-1488). 전술한 바와 같이, 호모퓨린 올리고뉴클레오티드의 서열은 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (서열 번호 11)이다.
하기 플라스미드로 크로마토그래피를 수행하였다: pXL3296(이종유전자가 없는 pCOR, 2.0 kpb), pXL3179(pCOR-FGF, 2.4 kpb), pXL3579(pCOR-VEGFB, 2.5 kbp), pXL3678(pCOR-AFP, 3.7 kbp), pXL3227(pCOR-lacZ, 5.4 kbp) 및 pXL3397(pCOR-B 결실 FVIII, 6.6 kbp). 상기한 모든 플라스미드는 실시예 4에 기재된 바와 같이 얻은 투명한 용해물로부터 2 단계의 음이온 교환 크로마토그래피 단계에 의해 정제하였다. CsCl에서의 한외 원심분리에 의해 정제된, ColE1 유래 플라스미드인 플라스미드 pBKS+(pBluescript II KS + 스트라타진으로부터 입수) 역시 연구하였다. 사용된 모든 플라스미드는 수퍼코일형(> 95 %)의 위상적 상태로 존재하였다.
각 플라스미드 DNA 정제 실험에서, 2 M NaCl, 0.2 M 아세트산칼륨(pH 5.0) 6 ml 중의 플라스미드 DNA 300 ㎍을 전술한 올리고뉴클레오티드 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (서열 번호 11)를 포함하는 친화성 컬럼 상에 30 cm/h의 유량으로 로딩하였다. 컬럼을 5배 부피의 동일한 완충액으로 세척한 후, 결합된 플라스미드를 1 M Tris/HCI, 0.5 mM EDTA(pH 9.0)로 용출시키고, UV(260 nm) 및 밀리포어 Gen-Pak 컬럼을 사용한 이온 교환 크로마토그래피로 정량하였다(Marquet et al., BioPharm, 1995, 8, 26-37). 수집된 분획 중의 플라스미드 회수량은 pXL3296의 경우 207 ㎍, pXL3179의 경우 196 ㎍, pXL3579의 경우 192 ㎍, pXL3678의 경우 139 ㎍, pXL 3227의 경우 97 ㎍, pXL 3397의 경우 79 ㎍이었다.
pBKS를 이 컬럼에서 크로마토그래피하였을 때에는 플라스미드 결합은 검출할 수 없었다(< 3 ㎍). 이는 올리고뉴클레오티드 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (서열 번호 11)가pOCR 내에 존재하는 상보성 14량체 서열 5'-AAGAAAAAAAAGAA-3' (서열 번호 10)(oriγ)와 안정한 삼중 구조를 형성하지만, pBKS 내에 존재하는 아주 밀접한 서열 5'-AGAAAAAAAGGA-3' (서열 번호 8)과는 그렇지 않다는 것을 나타낸다. 이는 단일 비정규형 3조(이 경우 T*GC)의 도입이 삼중 구조를 완전히 탈안정화시킨다는 것을 암시한다.
대조군으로서, 아주 유사한 조건 하에 올리고뉴클레오티드 없이 합성된 블랭크 컬럼 상에서 pXL3179가 크로마토그래피되었을 때에는 플라스미드 결합이 관찰되지 않았다(< 1 ㎍).
본원에 기재된 조건에서 이러한 친화성 정제 컬럼을 수행함으로써, 숙주 게놈 DNA에 의한 오염 수준이 pXL3296의 제조물의 경우 2.6%에서 0.07%로 감소되었다. 마찬가지로 숙주 DNA에 의한 오염 수준은, 샘플이 동일한 친화성 컬럼을 통해 크로마토그래피되었을 때 pXL3179의 제조물의 경우 0.5%에서 0.008%로 감소되었다.
실시예 13
하기 실시예는 삼중 나선 친화성 크로마토그래피를 이용하는 ColE1 유래 플라스미드의 정제 방법을 예시한다. 이 기법은 핵산 오염물(특히 숙주 게놈 DNA 및 RNA)을 통상적인 크로마토그래피 방법에 의해 얻을 수 없었던 수준으로 낮추는 것으로 확인되었다.
상기 실시예에 기재된 바와 같이 퍼요오데이트-산화 세파크릴 S-1000 SF 상에 서열 5'-TCTTTTTTTCCT-3' (서열 번호 9)를 갖는 올리고뉴클레오티드를 커플링하여 삼중 나선 친화성 겔을 합성하였다.
플라스미드 pXL3296(이종 유전자를 포함하지 않은 pCOR) 및 pBKS, ColE1 유래 플라스미드를 실시예 9에 기재된 조건 하에 올리고뉴클레오티드 5'-TCTTTTTTTCCT-3' (서열 번호 9)를 포함하는 1 ml 컬럼 상에서 크로마토그래피하였다. 수집된 분획 중의 플라스미드 회수율은 pBKS의 경우 175 ㎍이었고, pXL3296의 경우 < 1 ㎍이었다. 이는 올리고뉴클레오티드 5'-TCTTTTTTTCCT-3' (서열 번호 9)가 pBKS에 존재하는 상보성 12량체 서열 (5'-AGAAAAAAAGGA-3') (서열 번호 8)과 안정한 삼중 구조를 형성하지만, pCOR에 존재하는 아주 밀접한 12량체 서열 (5'-AGAAAAAAAAGA-3') (서열 번호 34)과는 그렇지 않다는 것을 나타낸다. 이는 단일 비정규형 3조(이 경우 C*AT)의 도입이 삼중 구조를 완전히 탈안정화시킨다는 것을 나타낸다.
실시예 14
비격벽형 Erlenmeyer 플라스크에서 하기 방법에 의해 종자 배양물을 생성하였다. 유효 세포 뱅크를, M9modG5 배지를 함유하는 Erlenmeyer 플라스크에 0.2% v/v의 접종률로 접종하였다. 이 균주를, 글루코스가 고갈될 때까지 약 18±2 시간 동안 37±1℃의 회전형 진탕기에서 220 rpm으로 배양하였다. 그 결과 200 ml의 종자 배양물을 얻었다. 이 배양물의 흡광도는 A600 약 2∼3으로 예상된다.
그 후 1차 배양기에서 예비 배양물을 생성한다. 종자 배양물은 접종률이 0.2%(v/v)가 되도록 M9modG5 배지를 함유하는 예비 배양기로 무균 상태에서 이전하 고 통기 상태에서 교반하면서 배양한다. pO2는 포화도 40% 이상으로 유지한다. 이 배양물은, 16 시간 후 글루코스가 소모될 때 회수한다. 그 결과 약 30 리터의 예비 배양물을 얻었다. 이 배양물의 흡광도는 A600 약 2∼3으로 예상된다.
그 후 2차 발효기에서 주 배양물을 생성한다. 예비 배양물 30 리터를 접종률이 약 10%(v/v)가 되도록 멸균 FmodG2 배지 270 리터가 채워진 발효기에 무균 상태에서 이전한다. 이 배양물은 약간의 생물량이 형성되도록 회분식 모드에서 출발한다. 글루코스 공급은 초기 당이 약 4 시간 후에 소모되면 시작한다. 통기, 교반, pO2(40%), pH (6.9±0.1), 온도(37±1℃) 및 글루코스 공급은 비 성장 속도가 0.09 h-1에 가깝게 유지되도록 조절한다. 이 배양은 공급 약 35 시간 후에 종료한다. 이로써 약 400 리터의 배양물을 얻었다. 이 배양물의 흡광도는 A600 약 100으로 예상된다.
세포 회수 단계라 칭하는 1차 분리 단계를 수행한다. 생물량은 디스크 스택 원심분리기로 회수한다. 배양액은 사용된 배양 배지를 제거하기 위해 3∼4배 농축시키고, 400 리터의 멸균 S1 완충액에 연속하여 재현탁시킨다. 그 결과 예비 컨디셔닝한 생물량 약 500 리터를 얻었다. DCW = 25±5 g/L.
농축 단계라 칭하는 제2 분리 단계를 수행한다. S1 완충액 중에서의 재현탁/균질화 후에, 세포를 분리기로 다시 처리하여 농축된 슬러리를 얻는다. 그 결과 세척 및 농축된 슬러리 약 60∼80 리터를 얻었다. DCW = 150±30 g/L; pDNA = 300± 60 mg/L.
그 후 동결 단계를 수행한다. 슬러리를 20 L FlexboyTM 백(용량의 50%까지 채움)에 무균 분주하고, 이어서 -20±5℃에서 동결한 후에 추가적인 하류 처리를 수행한다. 이로써 동결된 생물량을 얻었다. pDNA = 300±60 mg/L; 수퍼코일형 > 95%.
그 후, 세포 해동 단계를 수행한다. 냉동된 백을 20℃까지 가온하고, 세포 슬러리를 100 mM Tris 염산염, 10 mM EDTA, 20 mM 글루코스를 함유하는 40 g/L, pH 8.0으로 희석시키고, 이 현탁액을 20±2℃에서 1 시간 동안 진탕시킨 다음 세포를 용해시킨다. 이로써 해동된 생물량 슬러리를 얻었다. pH = 8.0±0.2.
이 단계에서는 약 20℃의 온도를 이용할 수 있다.
그 후 알칼리 용해 단계를 수행한다. 세포 용해 단계는 희석된 세포 현탁액을 인라인(in-line) 혼합기를 통해 0.2 N NaOH-35 mM SDS(용액 S2)로 펌핑한 후에, 코일형 튜브에서 연속 접촉 단계를 실시하는 것으로 구성된다. 연속 접촉 단계에 의하면 완벽한 세포 용해 및 게놈 DNA 및 단백질의 변성이 확보된다. 용해된 세포의 용액을 냉각 3 M 아세트산칼륨-2 N 아세트산의 용액 3(S3)과 라인내에서 혼합한 후에, 냉각 진탕 용기에서 수집한다. 용액 S3의 첨가는 게놈 DNA, RNA, 단백질 및 KDS의 침전을 유발한다.
그 다음으로 용해물 여과를 수행한다. 그 후 중화된 용해물을 진탕없이 5±3℃에서 2∼24 시간 동안 항온처리하고, 3∼5 mm 그리드 필터에 통과시켜 여과하여 침전된 물질(응집물 상태)의 덩어리를 제거한 뒤에, 마무리 여과 단계로서 심층 여과를 실시한다. 이로써 투명해진 용해물을 얻었으며, 여기에는 수퍼코일형 플라스미드의 농도가 90%를 초과한다.
그 후 음이온 교환 크로마토그래피를 수행한다. 투명한 용해물 용액을 정제수로 희석시켜 목표 전도율 값을 50 mS/cm로 조정하고, 이중층 필터(3∼0.8 ㎛)를 통해 여과하여, 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 로딩한다. 11.0 L Fractogel(등록상표) TMAE HiCap(M) 수지(머크; #1.10316.5000)를 충전한 300 mm 컬럼을 사용한다. 투명한 용해물을 컬럼에 로딩하고, NaCl의 단계 구배를 이용하여 용출을 수행한다. 컬럼에 결합된 오염물 덩어리를 약 61 mS/cm로 NaCl 용액을 사용하여 용출시키고, 약 72 mS/cm로 NaCl 용액으로 DNA 플라스미드를 용출시킨다. 그 결과 고농도의 플라스미드 DNA를 함유하는 이온 교환 크로마토그래피 용출물을 얻었다.
그 다음 단계로 삼중 나선 친화성 크로마토그래피를 수행한다. 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼으로부터의 용출물은 4.8 M NaCl을 함유하는 500 mM 아세트산나트륨 용액(pH 4.2) 약 0.5배 부피로 희석시키고, 2 M NaCl을 함유하는 50 mM 아세트산나트륨(pH 4.5)으로 평형화시킨 삼중 나선 친화성 크로마토그래피 컬럼에 주입하여 통과시켰다. 이 컬럼은 직경이 300 mm이며, 10.0 L의 THAC SephacrylTM S-1000 겔(아머샴 바이오사이언시즈; 뉴저지주 피스카타웨이)을 함유한다. 이 컬럼을 1 M NaCl을 함유하는 50 mM 아세트산나트륨(pH 4.5) 용액으로 세척하고, 0.5 mM EDTA를 함유하는 100 mM Tris(pH 9.0)로 용출시킨다. 그 결과 고농도의 플라스미드를 함유하는 삼중 나선 친화성 크로마토그래피 용출물을 얻었다.
그 다음 단계로 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행한다. 친화성 크로마토그래피 컬럼의 용출물을 3.6배 부피의 Tris(pH 8.0) 중의 3.8 M 황산암모늄 용액으로 희석시킨다. 0.45 ㎛ 필터에 통과시켜 여과한 후, 여과물을 9.0 L Toyopearl(등록상표) 부틸-650S 수지(토소 코포레이션, 오하이오주 그로브 시티)가 충전된 소수성 상호작용 컬럼(직경 300 mm)에 60 cm/h로 로딩한다. 이 컬럼을 약 240 mS/cm 유속의 황산암모늄 용액으로 세척하고, NV1FGF를 220 mS/cm 유속의 황산암모늄으로 용출시킨다. 이로써 풀린 형태가 없는 HIC 용출물을 얻었다.
바람직한 구체예에 따르면, 추가의 정용여과 단계를 수행한다. 시판되는 표준 정용여과 재료는 당분야에 공지된 표준 기법에 따라 이 방법에 사용하기에 적합하다. 바람직한 정용여과 방법은 플라스미드 크기에 따라 분자량 컷오프 범위가 30,000∼500,000인 정용여과 막을 사용하는 정용여과이다. 이러한 정용여과 단계에 의해 완충액 교환을 수행하고 그 다음으로 농축을 수행한다. 단계 12의 용출물은 접선 흐름 여과에 의해(막 컷오프, 30 kDa) 3∼4배로 농축시켜 목표 농도 약 2.5∼3.0 mg/mL로 만들고, 이 농축물은 10배 부피의 염수를 사용하여 일정한 부피로 정용여과하여 교환하고, 염수를 사용하여 목표 플라스미드 농도로 조정한다. NV1FGF 농도는 농축물 샘플의 260 nm에서의 흡광도로부터 계산한다. NV1FGF 용액은 0.2 ㎛ 캡슐 필터에 통과시켜 여과하여 2∼8℃의 저온실에서 후속 처리할 때까기 용기에 보관한다. 이로써 수퍼코일형 플라스미드의 플라스미드 DNA 농도가 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 및 바람직하게는 99%인 정제된 농축물을 얻었다. 이 방법에 의한 전반적인 플라스미드 회수율은 적어도 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 및 80%이며, 평균 회수율은 60%이다.
실시예 15
이온 교환 크로마토그래피 단계, 삼중 나선 친화성 크로마토그래피 단계 및 소수성 크로마토그래피 단계를 포함하는 상기 실시예의 방법에 의하면 종래의 공지된 방법에 비해 더 정제된 플라스미드 DNA 제조물을 얻게 된다. 이 신규 방법은 종래의 공지된 방법과 비교하였으며, 게놈 DNA, RNA, 단백질 및 내독소의 양이 훨씬 더 적은 pDNA 제조물을 산출하였다. 이는 도 6에 반영되어 있다. 이러한 실험들은 AEC, THAC 및 HIC가 모든 오염물의 효과적 제거에 대하여 2-단계 조합 중 몇 가지와 비교하여 놀라울 정도로 더 높은 정제 수율을 제공한다는 것을 보여준다. 상기 단계들의 조합은 단백질 및 내독소, RNA 및 게놈 DNA와 같은 기타 생물학적 물질 및 오염물뿐 아니라 개방 원형 플라스미드로부터의 플라스미드 DNA의 분리 효율 측면에서 분명한 시너지를 제공한다. 또한, 시너지 단계의 조합, 즉 본 발명에 따른 AEC/THAC/HIC는 고도로 정제된 약학적 등급의 플라스미드 DNA를 얻을 수 있게 할 뿐 아니라, 플라스미드 DNA의 80%, 85%, 90%, 95% 및 99% 이상이 고순도이고 완전한 수퍼코일형 플라스미드 DNA인 조성물을 얻을 수 있게 한다.
실시예 16
고도로 정제된 플라스미드 DNA 제조물의 제조를 위해 이온 교환 크로마토그래피 단계, 삼중 나선 친화성 크로마토그래피 단계 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계를 포함하는 상기 실시예의 방법을 종래의 공지된 방법와 비교한다. 도 3 에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 방법에 의하면, 게놈 DNA, RNA, 단백질 및 내독소를 ppm 이하의 수준으로 훨씬 더 적은 양 함유하는 pDNA 제조물을 얻을 수 있다. 또한, 도 4에 도시된 바와 같이, 본 발명의 방법에 의하면 얻어진 생성물 품질이 최대 10 g이다.
실시예 17
실시예 14에 기재된 바와 같은 정용여과 단계를 하기 조건에 따라 수행한다: 단계 a 및 단계 b를 위한 완충액을 사용하여 하기를 위한 최적 조건을 결정하였다:
iii) 12.5∼13.0배 부피의 50 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4(완충액 I로 명명)에 대한 1차 정용여과(단계 a), 및
iv) 3.0∼3.5배 부피의 염수 부형제(150 mM NaCl)에 대하여 상기 단계 a)로부터의 보유물의 2차 정용여과를 수행한다(단계 b).
본 발명에 따른 이러한 선택적 정용여과 단계는 황산암모늄 및 EDTA를 효율적이고 철저히 제거한다. 또한, 이러한 정용여과 단계 이후에, 약 150 mM의 적절한 목표 NaCl 농도 및 400 μM∼1 mM의 최종 Tris 농도가 얻어진다. 플라스미드 DNA 제제의 예는 하기 표 6에 제시하였다.
[표 6]
종
 최종 농도
1차 정용여과 2차 정용여과 활성 약학적 성분
황산암모늄 10 μM < 1 μM < 1 μM
EDTA 4 μM < 1 μM < 1 μM
Tris 50 mM 1.48 mM 740 μM
NaCl 154 mM 154 mM 154 mM
실시예 18
LS06으로 명명되는 플라스미드 DNA NV1FGF API(활성 약학적 성분)의 기술적 회분을 실시예 17에 기재된 정용여과 공정 단계에 의해 실시예 13에 따라 제조한다. 이 용출물은 먼저 약 13배 부피의 완충액 I에 대하여 약 2 mg의 API/mL로 정용여과하고, 수득된 보유물은 약 3배 부피의 염수 부형제에 대하여 정용여과하였다. 그 후 최종 보유물은 0.2 ㎛ 필터에 통과시켜 여과하여 1 mg/mL로 조정한다. 최종 API(pH 7.24)는 DP 제조 시까지 Duran 유리병에 넣어 ±5℃에서 보관하였다.
Duran 유리병(API)뿐 아니라 약품 제조에 사용되는 8 mL 바이알에 보관된 LS06의 샘플에 대하여 안정성 시험을 수행하였다. +5℃에서 90일 경과 후, 모든 샘플에 대하여 탈퓨린화 및 개방 원형화 정도를 거의 검출할 수 없었다(≤0.3%). +25℃에서 90일 경과 후, LS06 샘플의 탈퓨린화율 및 개방 원형화율 역시 매우 낮았다. 이러한 시험으로부터 계산된 탈퓨린화율 및 개방 원형화율은 ≤ 1%/월이었다.
이 시험은 플라스미드 DNA NV1FGF의 안정성 프로필이, pH 값이 약 7∼7.5로 유지되는 본 발명의 제제에서 매우 안정하다는 것을 입증하였다. 탈퓨린화율 및 플라스미드 열림률은 +25℃에서 일반적으로 매우 가속되지만, 본 출원인은 플라스미드가 RT에서도 장기간 동안 분해되지 않은 형태로 안정하게 유지된다는 것을 보여주었다.
본 명세서는 본 명세서에 인용된 참고문헌의 교시에 비추어 이해되어야 한다. 본 명세서에 포함된 구체예는 본 발명의 구체예를 예시하기 위한 것이며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 당업자라면 다른 많은 구체예 가 본 발명에 의해 포괄된다는 것을 쉽게 인식한다. 본 명세서에 인용된 모든 간행물 및 특허는 본원에서 그 전문을 참고로 인용한다. 인용문헌에 포함된 소재가 본 명세서와 모순되거나 일치하지 않는 정도까지, 본 명세서는 임의의 그러한 소재를 대신한다. 본원에서의 참고문헌의 인용은 그 참고문헌이 본 발명의 종래 기술이라는 것을 인정하는 것은 아니다.
달리 명시하지 않는다면, 특허청구범위를 포함하여 본 명세서에 사용된 성분들의 양, 반응 조건 등을 표현하는 모든 수치는 모든 예에서 "약"이라는 용어에 의해 수식될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 달리 나타내지 않는다면, 수치 파라미터는 근사값이며, 본 발명에 의해 달성하고자 하는 원하는 특성에 따라 달라질 수 있다. 적어도, 특허청구범위에의 균등론의 적용을 제한하지 않는 범위에서, 각 수치 파라미터는 유의적인 아라비아 숫자 또는 통상적인 반올림 근사값으로 간주되어야 한다.
달리 나타내지 않는다면, 일련의 구성 요소 앞에 사용된 "적어도"란 용어는 일련의 구성 요소 전부에 적용되는 것으로 이해되어야 한다. 당업자라면 본 명세서에 기재된 본 발명의 특정 구체예에 대한 여러 균등 범위를 이해할 수 있거나 통상적인 실험만으로 확인할 수 있을 것이다. 그러한 균등 범위는 하기의 특허청구의 범위에 포함된다.
Figure 112006018859832-pct00003
<110> Gencell SAS <120> Method of Preparation of Pharmaceutical Grade Plasmid DNA <130> GC03001-PCT <150> US 60/503,464 <151> 2003-09-17 <150> US 60/563,008 <151> 2004-04-19 <160> 34 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 1 gaggcttctt cttcttcttc ttctt <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 2 aagggaggga ggagaggaa <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 3 aaggagagga gggagggaa <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 4 ttggtgtggt gggtgggtt <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 5 cttcccgaag ggagaaagg <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 6 gaagggcttc cctctttcc <210> 7 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 7 gaaaaaggaa gag <210> 8 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 8 agaaaaaaag ga <210> 9 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 9 tctttttttc ct <210> 10 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 10 aagaaaaaaa agaa <210> 11 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 11 ttcttttttt tctt <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 12 aaaaaaggga ataaggg <210> 13 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 13 gatccgaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga agaagaagaa gaagaagg <210> 14 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 14 aattccttct tcttcttctt cttcttcttc ttcttcttct tcttcttctt cttcttcg <210> 15 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 15 gaagaagaag aagaagaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga a <210> 16 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 16 tgaccggcag caaaatg <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 17 ccgaattctg gggaccaaag cagtttc <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 18 ccaagcttca ctgttcacga cgggtgt <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 5-methylcytosine <400> 19 gaggcttctt cttcttcttc ttctt <210> 20 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 20 ggaggaggag gaggaggagg aggaggagga ggaggaggag gaggagga <210> 21 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 21 gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga <210> 22 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 22 gatccgagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagaggg <210> 23 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 23 aattccctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctcg <210> 24 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 24 gatccggagg aggaggagga ggaggaggag gaggaggagg aggaggagga ggaggagg <210> 25 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 25 aattcctcct cctcctcctc ctcctcctcc tcctcctcct cctcctcctc ctcctccg <210> 26 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 26 ggagaggagg aggaggagga ggaggaggag gaggaggagg aggaggagga <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 27 aatgcctcct cctcctcctc ctcct <210> 28 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 28 agtgctctct ctctctctct ctctct <210> 29 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 29 gatctgaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga agaagaagaa gaagaactgc agatct <210> 30 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 30 gatcagatct gcagttcttc ttcttcttct tcttcttctt cttcttcttc ttcttcttct tcttca <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 31 acagtcataa gtgcggcgac g <210> 32 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 32 gaagaagagg aagaagaaga agaagaagaa ggaagagaa <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 33 gaagaagaag aagaagaaga a <210> 34 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synethtic oligonucleotide <400> 34 agaaaaaaaa ga

Claims (73)

  1. 세포 현탁액의 흐름과 반대 방향에서 용해 용액을 주입할 수 있는 제1 혼합기 또는 주입기;
    혼합물 내에 난류를 발생시키는 제1 내부 직경을 갖는 제1 튜브;
    혼합물 내에 층류를 발생시키는 제1 내부 직경보다 큰 제2 내부 직경을 갖는 제2 튜브; 및
    한쪽 말단에서는 중화 용액을 주입하고 다른 쪽 말단에서는 혼합물을 회수하는 제2 혼합기 또는 주입기
    를 포함하는 연속 알칼리 세포 용해 장치.
  2. 제1항에 있어서, 튜브 및 주입기의 내부 직경은 난류 및 층류 내에서 혼합물의 유량을 조절하도록 선택되는 것인 연속 알칼리 세포 용해 장치.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 알칼리 용액의 흐름과 반대 방향에서 접촉하도록 세포 현탁액을 주입하는 펌프를 더 포함하는 연속 알칼리 세포 용해 장치.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 혼합기 또는 주입기는 혼합될 유체가 튜브 라인으로 직접 주입되는 인라인(in-line) 혼합기 또는 주입기인 연속 알칼리 세포 용해 장치.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 혼합기 또는 주입기는 T 튜브인 연속 알칼리 세포 용해 장치.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포 현탁액과 용해 용액의 혼합물은 난류로 제1 튜브를 통해 유동하는 것인 연속 알칼리 세포 용해 장치.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 튜브는 직경이 1 cm 이하이며, 길이가 1∼10 m인 연속 알칼리 세포 용해 장치.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 혼합물은 1∼10초 동안 난류 중에 있는 것인 연속 알칼리 세포 용해 장치.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제2 튜브는 코일형 튜빙인 연속 알칼리 세포 용해 장치.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제2 튜브에서의 연속 접촉 시간은 30초∼2분인 연속 알칼리 세포 용해 장치.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제2 튜브는 직경이 2 cm 이하이며, 길이가 5∼30 m인 연속 알칼리 세포 용해 장치.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제2 혼합기 또는 주입기는 게놈 DNA, RNA 및 단백질을 침전시키는 용액을 주입하기 위한 Y형 혼합기인 연속 알칼리 세포 용해 장치.
  13. 제1항 또는 제2항에 따른 장치를 통해 세포를 유동시키는 것을 포함하는 세포의 용해 방법.
  14. 제13항에 있어서, 용해액은 알칼리, 계면활성제, 유기 용매 및 효소 또는 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 용해제를 함유하는 용액인 세포의 용해 방법.
  15. 제13항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피, 삼중 나선 친화성 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 중에서 선택되는 2 이상의 크로마토그래피 단계를 더 포함하고, 상기 크로마토그래피 단계를 중화 단계 이후에 수행하는 것인 세포의 용해 방법.
  16. 제15항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피, 삼중 나선 친화성 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이 순서대로 수행하는 것인 세포의 용해 방법.
  17. 제15항에 있어서, 크로마토그래피 단계를 중화 단계 직후에 수행하는 것인 세포의 용해 방법.
  18. 제16항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피를 중화 단계 직후에 수행하는 것인 세포의 용해 방법.
  19. (a) 플라스미드 함유 숙주 세포를 난류를 발생시키는 제1 내부 직경을 갖는 제1 튜브로 유동시켜, 세포 현탁액을 세포를 용해시키는 용액과 혼합하는 단계;
    (b) 세포를 층류를 발생시키는 제1 내부 직경보다 큰 제2 내부 직경을 갖는 제2 튜브로 유동시켜, 상기 단계 (a)에서 형성된 혼합물을 항온처리(incubate)하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)에서 항온처리된 세포 혼합물을 용해 용액을 중화하는 제2 용액과 접촉시키기 위해, 세포를 제2 용액을 첨가하기 위한 수단으로 유동시켜, 세포로부터 플라스미드를 방출시키는 단계
    를 포함하는 고순도 플라스미드 DNA의 제조 방법으로서,
    상기 단계 (a)에서 형성된 세포 혼합물은 상기 제1 튜브로부터 제2 튜브로 유동하고, 상기 단계 (b)에서 형성된 항온처리된 세포 혼합물은 상기 제2 튜브로부터 상기 제2 용액을 첨가하기 위한 수단으로 유동하며, 세포로부터 방출된 플라스미드는 음이온 교환 크로마토그래피, 삼중 나선 친화성 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이 순서대로 수행하는 것에 의해 분리되는 것인 고순도 플라스미드 DNA의 제조 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 단계 (c)에서 형성된 용액을 그리드 필터 및 심층 여과에 통과시키는 것에 의해 응집물을 제거하는 사전 단계를 더 포함하는 고순도 플라스미드 DNA의 제조 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계 이후에 정용여과 단계를 더 포함하는 고순도 플라스미드 DNA의 제조 방법.
  22. 제21항에 있어서, 정용여과 단계는 염, 완충액 및 pH의 목표값에 도달하기 위해 수행되는 것인 고순도 플라스미드 DNA의 제조 방법.
  23. 제21항에 있어서, 정용여과 단계는 마지막 크로마토그래피 단계로부터 용액을 회수하는 단계; 및 Tris/NaCl 완충액에 대하여 1차 정용여과 단계를 수행하는 단계를 포함하는 것인 고순도 플라스미드 DNA의 제조 방법.
  24. 제19항 또는 제20항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피, 삼중 나선 친화성 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계는 크로마토그래피 분리용의 다공성, 초다공성 또는 비다공성의 유기, 무기 또는 복합 물질로 이루어진 고체 지지체 상에서 수행되며, 상기 지지체는 폴리(알켄 글리콜), 알칸, 알켄, 알킨, 아렌 또는 이 지지체에 소수성을 부여하는 기타 분자로 유도체화된 것인 고순도 플라스미드 DNA의 제조 방법.
  25. 제19항 또는 제20항에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 고정상 또는 유동상으로 수행되는 것인 고순도 플라스미드 DNA의 제조 방법.
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