KR101072663B1

KR101072663B1 - 천초근 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101072663B1
Application number: KR1020090000936A
Authority: KR
Inventors: 김영호; 전도연; 우현주; 우미희; 양재하
Original assignee: 대구한의대학교산학협력단
Priority date: 2009-01-06
Filing date: 2009-01-06
Publication date: 2011-10-11
Anticipated expiration: 2029-01-06
Also published as: WO2010079914A2; WO2010079914A3; KR20100081627A

Abstract

본 발명은 천초근 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 천초근 추출물로부터 분리된 화합물은 마우스 대식세포인 RAW264.7 세포에서 LPS로 유도되어진 NO 생성량, p-IkBα, iNOS 및 COX-2의 단백질 발현을 감소시킬 뿐만 아니라 iNOS, COX-2, TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 mRNA 발현과 같은 친염증성 사이토카인들의 발현 함량을 유의적으로 감소함을 확인함으로써, 상기 조성물을 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품으로 유용하게 이용할 수 있다.

NO 생성, p-IkBα, iNOS, 친염증성 사이토카인, 염증성 질환

Description

천초근 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물 {A composition comprising the compound isolated from the extract of Rubiae Radix for preventing and treating inflammatory disease}

본 발명은 천초근 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

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[문헌 3] Graeme B, et al., Acute Inflammation, American Journal of Pathology, 86(1), pp.185-274, 1977

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[문헌 5] Brocklehurst WE, Role of Kinins and Prostaglandins in Inflammation, Proc. Roy. Soc. Med., 64, pp.4-6, 1971

[문헌 6] Esmon CT, The interactions between inflammation and coagulation. British Journal of Haematology, 131, pp.417-430, 2005

[문헌 7] Huang AL, et al., Effects of Systemic Inflammation on Endothelium-Dependent Vasodilation, Trends Cardiovasc. Med., 16, pp.15-20, 2006

[문헌 8] Renauld JC, New insights into the role of cytokines in asthma, J. Clin. Pathol, 54, pp.577-589, 2001

[문헌 9] Blake GJ, et al., Tumour necrosis factor-α, inflammatory biomarkers, and atherogenesis, Eur. Heart J., 23, pp.345-347, 2002

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[문헌 11] Mordan LJ, et al., Inhibitors of endogenous nitrogen oxide formation block the promotion of neoplastic transformation in C3H10T1/2 fibroblasts, Carcinogenesis, 14, pp.1555-1559, 1993

[문헌 12] Lirk P, et al., Inducible nitric oxide synthase. Time for reappraisal, Curr. Drug. Targets. Inflamm. Allergy., 1, pp.89-108, 2002

[문헌 13] Hattori Y, et al., Lipopolysaccharide activates Akt in vascular smooth muscle cells resulting in induction of inducible nitric oxide synthase through nuclear factor-kappa B activation, Eur. J. Pharmacol, 481, pp.153-158, 2003

[문헌 14] Kim SH, et al., Selenium attenuates lipopolysaccharide- induced oxidative stress responses through modulation of p38 MAPK and NF-κB signaling pathways, Exp. Biol. Medicine, pp.565-701, 2004

[문헌 15] Robinson MJ, et al., Mitogen-activated protein kinase pathways, Cur. Opi. Cell Biol., 9, pp.180-186, 1997

[문헌 16] 박종희, 한약백과도감(하), 도서출판 신일상사, p.796-797, 2002

[문헌 17] Jun DY, et al., Apoptogenic activity of Zanthoxylum schinifolium toward human acute leukemia Jurkat T cells is associated with ER stress-mediated caspase-8 activation that stimulates mitochondria- dependent or -independent caspase cascade, Carcinogenesis, 28, pp.1303-1313, 2007

[문헌 18] Wang S et al., J. Ethnopharmacol., 114(3), pp.458-462, 2007

[문헌 19] Heo et al., J. Immunol., 179(9), pp.6305-6310, 2007

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[문헌 21] Lee et al., J. Ethnopharmacol., 97, pp.561-566, 2005

염증반응은 병원체에 의한 감염이나 조직의 손상과 같은 다양한 요인에 의해 일어나는 생체방어반응으로 감염부위나 손상부위에만 피해를 국한시키기 위한 초기 보호작용을 수행한다. 대부분의 경우, 이러한 염증반응은 내재면역의 구성 요소를 이용한 병원성 요인의 제거 및 특이적 적응면역의 유도 등으로 이어진다 (Hawiger J., Innate Immunity and Inflammation: A Transcriptional Paradigm, Immunologic Research, 23, pp.99-109, 2001). 염증에 수반되는 특징으로서 알려진 발적 (rubor), 부종 (tumor), 열 (calor), 통증 (dolor) 등은 염증부위에서의 염증 매개체와 사이토카인 등의 작용에 의한 혈관의 확장에 따른 국소혈류의 증가 및 국소혈류속도의 감소, 혈관의 투과성증가에 따른 혈장성분의 혈관외 유출 증가, 혈관내피세포의 순환면역세포에 대한 부착성 증가에 따른 면역세포의 혈관외 유출 증가 및 화학주성에 의한 감염부위로의 이동 증가와 같은 연속적인 면역반응들의 결과이다(Gallo RL, et al., Biology and clinical relevance of naturally occurring antimicrobial peptides, J. Allergy. Clin. Immunol, 110, pp.823-831. 2002; Graeme B, et al., Acute Inflammation, American Journal of Pathology, 86(1), pp.185-274, 1977). 조직손상에 대한 반응으로서 일부 세포들에서 생성되는 히스타민, 그리고 혈액 내에서 비활성화 상태로 존재하다가 조직손상에 의해 활성화되는 저분자 펩티드성 키닌도 염증관련 혈관확장과 혈관의 투과성 증가에 기여한다(Yamaki K, et al., Characteristics of histamine-induced leukocyte rolling in the undisturbed microcirculation of the rat mesentry, British J. Pharmacol, 123, pp.390-399, 1998; Brocklehurst WE, Role of Kinins and Prostaglandins in Inflammation, Proc. Roy. Soc. Med., 64, pp.4-6, 1971). 특히 키닌의 일종인 브라디키닌은 피부의 통점을 자극하는 작용을 한다. 한편, 손상된 조직에서의 혈관의 확장과 혈관의 투과성 증가는 또한 혈액응고효소들이 조직으로 유출되게 하고 뒤이어 이들 효소의 연쇄반응에 의해 혈액응고의 주요 요소인 불용성의 섬유소가닥이 생성되게 한다. 응고된 섬유소 가닥은 손상된 조직부위를 통한 감염이 다른 부위로 확산되는 것을 차단하는 방어벽 역할을 한다 (Esmon CT., The interactions between inflammation and coagulation. British Journal of Haematology. 131, pp.417-430, 2005). 일반적으로 급성염증반응은 빠르게 진행되고 짧은 기간 유지되며, 급성염증에는 급성기 반응이라는 전신성 반응이 동반된다. 한편 감염이나 자가면역질환과 같은 일부 질환과 관련하여 지속적인 면역활성화의 결과로서 만성염증이 유발될 수 있으며, 대식세포 (macrophages)의 축적과 활성화는 만성염증반응의 증거가 된다 (Huang AL, et al., Effects of Systemic Inflammation on Endothelium-Dependent Vasodilation, Trends, Cardiovasc. Med., 16, pp.15-20, 2006). 그러나 지속적인 만성염증반응의 경우, 숙주세포나 조직에 심각한 손상을 유발할 수 있다.

감염부위에서의 염증반응은 병원체에 대한 대식세포의 반응에 의해 개시된다. 병원체에 의해 활성화된 대식세포가 생성하는 반응성 활성산소종 및 활성질소종, 프로스타글란딘, 루코트리엔 등과 같은 염증매개체, 그리고 TNF-α, IL-6 및 IL-1β 등과 같은 염증유발성 사이토카인 등이 염증반응에 관여되는 것으로 알려져 있다 (Renauld JC, New insights into the role of cytokines in asthma, J. Clin. Pathol., 54, pp.577-589, 2001; Blake GJ, et al., Tumour necrosis factor-α, inflammatory biomarkers, and atherogenesis, Eur. Heart J., 23, pp.345-347, 2002). 이러한 대식세포의 염증관련 작용에 있어서는 이들 염증매개체 유전자들의 발현을 유도하는 전사인자인 NF-κB의 활성화가 매우 중요하다. 대식세포 내에서 유도성 산화질소 합성효소 (inducible nitric oxide synthase, iNOS), 시클로옥시게나제 (cyclooxygenase, COX-2), TNF-α, IL-6, IL-1β 등의 염증관련 유전자들이 NF-κB에 의해 전사된다.

산화질소 (nitric oxide, NO)는 지속력이 짧은 자유라디칼로서 산화질소 합성효소 (nitric oxide synthase, NOS)의 촉매작용에 의해 L-아르기닌 (L-arginine)의 산화반응이 일어날 때, L-아르기닌으로부터 L-시트룰린 (L-citrulline)과 함께 산화질소가 생성된다는 사실은 이미 널리 알려져 있다. 생체 내에서 산화질소는 다양한 면역관련 기능을 나타내지만 (Moncada S, et al., Nitric oxide: Physiology, pathophysiology, and pharmacology. Pharmacol. Rev., 43, pp.109-142, 1991), 과도한 산화질소의 생성은 오히려 세포독성을 나타낼 수 있으므로 숙주세포 및 조직의 손상을 초래할 뿐만 아니라 동맥경화, 발암 등 다양한 병리적 현상에 관여할 수도 있다 (Mordan LJ, et al., Inhibitors of endogenous nitrogen oxide formation block the promotion of neoplastic transformation in C3H10T1/2 fibroblasts, Carcinogenesis, 14, pp.1555-1559, 1993; Lirk P, et al., Inducible nitric oxide synthase, Time for reappraisal, Curr. Drug. Targets. Inflamm. Allergy., 1, pp.89-108, 2002). NO 생성을 촉매하는 산화질소 합성효소 (NOS)에는 세 가지 유형이 알려져 있는데, 이들 중 신경 산화질소 합성효소 (neuronal NOS, nNOS, NOS1)와 내피 산화질소 합성효소 (endothelial NOS, eNOS, NOS3)는 구성적으로 항상 발현되는 반면, iNOS는 식세포 (phagocytes)가 세균성 내독소인 지질다당류 (lipopolysaccharide, LPS)에 의해 자극될 때 활성화되는 전사인자 NF-κB에 의해 비로소 전사되는 유도성이다.

대식세포 내에서 전사인자 NF-κB는 그 저해제인 IκB와 결합하여 불활성 상태로 세포질에 존재하지만, 세포표면의 Toll-유사 수용체 (Toll-like receptor)에 세균성 LPS가 결합할 때 유도되는 신호전달과정에 의해 IκB가 인산화되어 NF-κB/IκB로부터 해리되고 프로테아좀 분해작용에 의해 제거됨에 따라 NF-κB는 비로소 활성화 상태로 된다. 이어서 NF-κB는 핵으로 이동하여 다양한 염증 관련 유전자들의 전사를 유도한다. 이러한 NF-κB의 활성화에는 Akt 신호전달 (Hattori Y, et al., Lipopolysaccharide activates Akt in vascular smooth muscle cells resulting in induction of inducible nitric oxide synthase through nuclear factor-kappa B activation, Eur. J. Pharmacol, 481, pp.153-158, 2003)과 ERK, c-jun- 및 p38-MAPK 신호전달 경로가 관여하는 것으로 보고되었다 (Kim SH, et al., Selenium attenuates lipopolysaccharide- induced oxidative stress responses through modulation of p38 MAPK and NF-κB signaling pathways, Exp. Biol. Medicine., pp.565-701, 2004; Robinson MJ, et al., Mitogen-activated protein kinase pathways, Cur. Opi. Cell Biol., 9, pp.180-186, 1997).

염증반응에 있어서 iNOS의 전사단계에서의 발현조절은 NO의 지속시간과 생성정도를 결정하는데 있어서 대단히 중요하다. 그러므로 iNOS의 발현조절기전 및 iNOS의 효소활성은 만성염증관련 질환의 개선을 위한 새로운 항염증 약제를 분리하고자 하는 연구에서 약제작용의 표적으로 이용되고 있다.

천초근(草根, Rubiae Radix)은 꼭두서니과(Rubiaceae)의 꼭두서니 (Rubia akane Nakai, =R. cordifolia L. var. mangista Miq.) 및 갈퀴꼭두서니 (Rubia cordifolia L.)의 뿌리를 건조한 것으로 다른 이름으로 천초(草), 홍천근(紅根), 지소본(地蘇本), 천근(根), 토숙본초(土宿本草), 혈견수(血見愁), 활혈단(活血丹), 지소목(地蘇木), 천초(草), 모수(茅蒐), 여려(茹), 염비초(染緋草), 풍자초(風車草), 과산용(過山龍), 우만(牛蔓)으로 불리운다. 산지는 한국과 중국이며, 특이한 냄새에 맛은 조금 달며 성질은 찬 것이 특징으로, 성분은 안트라퀴논(anthraquinone)류에 속하는 알리자린(alizarin), 루비에리트릭 산(rubierythric acid, =alizarin-2- primeveroside), 퍼푸린(purpurin), 산토퍼푸린(xanthopurpurin), 문지스틴(munjistin), 프소이도퍼푸린(pseudopurpurin) 이다. 염색 재료로 사용하며, 지혈작용, 생리불순, 혈액순환장애, 어혈의 효과가 있으나(박종희, 한약백과도감(하), 도서출판 신일상사, p.796-797, 2002), 상기 문헌 어디에도 본 발명의 천초근 추출물로부터 분리된 화합물이 LPS의 처리에 의해 유도되는 NO 생성 및 친염증성 사이토카인들의 생성을 억제하여 염증성 질환의 예방 및 치료를 위한 조성물로서 사용가능하다고 교시되거나 개시된 바 없다.

이에 본 발명자는 마우스 대식세포주인 RAW264.7을 세균성 LPS로 처리할 때 일어나는 NO 생성 및 친염증성 사이토카인의 생성을 저해하는 새로운 약제를 찾기 위하여, 천초 (Rubia cordifolia L.)의 뿌리(천초근)로부터 분리 정제한 단일물질들을 대상으로 RAW264.7 세포의 NO 생성 및 친염증성 사이토카인의 생성에 대한 저해능을 조사한 결과, 천초근으로부터 분리된 화합물인 2-카르보메톡시-2,3-에폭시-3-프레닐-1,4-나프토퀴논(이하‘RA-MC-AA’라 함)등의 천초근 분리 화합물이 RAW264.7 세포에 있어서 LPS의 처리에 의해 유도되는 NO 생성 및 친염증성 사이토카인의 생성을 저해하는 항염증성 기능이 있음을 최초로 확인하였으며, 마우스 대식세포인 RAW264.7 세포에서 LPS로 유도되어진 NO 생성량, p-IkBα, iNOS 및 COX-2의 단백질 발현을 감소시킬 뿐만 아니라 iNOS, COX-2, TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 mRNA발현과 같은 친염증성 사이토카인들의 발현 함량을 유의적으로 감소함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 천초근 추출물로부터 분리된 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 천초근 추출물로부터 분리된 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 천초근으로부터 분리된 화합물은 2-카르보메톡시-2,3-에폭시-3-프레닐-1,4-나프토퀴논 (2-carbomethoxy-2,3-epoxy-3-prenyl-1,4-naphthoquinone), 3,3′-비스(3,4-디하이드로-4-하이드록시-6-메톡시-2H-1-벤조피란)(3,3′-bis(3,4-dihydro-4-hydroxy-6-methoxy-2H-1-benzopyran)), 에폭시몰루긴(Epoxymollugin), 소란지디올(Soranjidiol), 올레아놀릭 산(Oleanolic acid), 1-아세톡시-3-메톡시-9,10-안트라퀴논(1-acetoxy-3-methoxy-9,10-anthraquinone), 알리자린 2-메틸 아테르(Alizarin 2-methyl ether), 푸로놀루긴(Furonollugin), 몰루긴(mollugin)으로 구성된 군으로부터 선택된 화합물이며, 바람직하게는 2-카르보메톡시-2,3-에폭시-3-프레닐-1,4-나프토퀴논(2-carbomethoxy-2,3-epoxy-3-prenyl-1,4-naphthoquinone) 화합물임을 특징으로 한다.

본 발명의 화합물은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 염 및 용매화물로 제조될 수 있다.

약학적으로 허용 가능한 염으로는 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동일한 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.

이 때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p- 톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아 세트산, 시트르산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르빈산, 카본산, 바닐릭산 및 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비 용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

본 발명의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 본 발명의 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용 가능한 염으로는 하이드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포 네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조 방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 화합물들은 하기와 같은 제조방법으로 수득될 수 있다.

예를 들어, 먼저, 본 발명의 천초근 조추출물을 수득하는 방법을 설명하면, 우선 천초근을 세척하여 음건한 다음 세절하여 마쇄기로 갈아 미세분말화한 후, 천초근 시료 중량의 약 1 내지 20배, 바람직하게는 약 1 내지 7배에 달하는 부피의 물 및 메탄올, 에탄올, 부탄올 등과 같은 C1 내지 C4의 저급알콜 또는 이들의 혼합용매로, 바람직하게는 메탄올, 더욱 바람직하게는 50 내지 100% 메탄올로 10℃ 내지 100℃, 바람직하게는 50℃ 내지 90℃에서 1 내지 20시간, 바람직하게는 5 내지 15시간동안 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법, 바람직하게는 환류추출방법을 사용하여, 진공여과에 의해 상층액을 회수한 다음, 상기의 과정을 2 내지 7회, 바람직하게는 4회 반복 수행하여 상층액을 모으고 감압농축하여 본 발명의 천초근 메탄올 조추출물 수득할 수 있다.

상기에서 수득한 메탄올 조추출물을 물 및 메틸렌클로라이드의 혼합용매에 혼합하여 분획한 후, 감압 농축하여 본 발명의 천초근 수 가용성 분획물 및 메틸렌클로라이드 가용성 분획물을 각각 수득하였고, 상기 메틸렌클로라이드 가용성 분획물을 헥산 및 메틸렌클로라이드 혼합용매를 극성을 증가시키는 방법을 이용하여 플래쉬 컬럼크로마토그래피, RP C18 컬럼크로마토그래피 또는 실리카겔 오픈 컬럼크로마토그래피 등의 크로마토그래피를 이용한 정제방법을 선택적으로 수회 반복 수행하여 본 발명의 화합물들 즉, 2-카르보메톡시-2,3-에폭시-3-프레닐-1,4-나프토퀴논 (2-carbomethoxy-2,3-epoxy-3-prenyl-1,4-naphthoquinone), 3,3′-비스(3,4-디 하이드로-4-하이드록시-6-메톡시-2H-1-벤조피란)(3,3′-bis(3,4-dihydro-4-hydroxy-6-methoxy-2H-1-benzopyran)), 에폭시몰루긴(Epoxymollugin), 소란지디올(Soranjidiol), 올레아놀릭 산(Oleanolic acid), 1-아세톡시-3-메톡시-9,10-안트라퀴논(1-acetoxy-3-methoxy-9,10-anthraquinone), 알리자린 2-메틸 아테르(Alizarin 2-methyl ether), 푸로놀루긴(Furonollugin), 몰루긴(mollugin)을 수득할 수 있다.

본 발명은 상기의 제법으로 얻어진 천초근 추출물로부터 분리된 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 천초근은 오랫동안 식용되거나 생약으로 사용되어 오던 약재로서 본 발명의 천초근 추출물로부터 분리된 화합물 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없다.

본원에서 정의되는 추출물은 천초근의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물임을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는 상기 조추출물은 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 메탄올, 더욱 바람직하게는 50~100% 메탄올에 가용한 추출물을 포함한다.

본원에서 정의되는 상기 비극성용매 가용 추출물은 메틸렌클로라이드, 헥산, 클로로포름, 디클로로메탄 또는 에틸아세테이트, 바람직하게는 메틸렌클로라이드에 가용한 추출물을 포함한다.

본원에서 정의되는 염증성 질환은 상기 염증성 질환은 아토피피부염, 관절염, 요도염, 방광염, 동맥경화증, 알러지 질환, 비염, 천식, 급성통증, 만성통증, 치주염, 치은염, 염증성 장질환, 통풍, 심근경색, 울혈성 심부전, 고혈압, 협심증, 위궤양, 뇌경색, 다운증후군, 다발성 경화증, 비만, 당뇨, 치매, 우울증, 정신분열증, 결핵, 수면장애, 패혈증, 화상 또는 췌장염 등이며, 바람직하게는 아토피피부염, 관절염, 요도염, 방광염 또는 치주염이며, 더욱 바람직하게는 치주염, 요도염 또는 방광염인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.1 내지 50 중량 %로 포함한다.

본 발명의 화합물을 포함하는 약학조성물은, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일 리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록 시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 화합물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아 니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose), 락토오스 (lactose) 및 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트 및 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물 및 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리 에틸렌 글리콜 및 올리브 오일과 같은 식물성 기름 및 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용 될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지 및 글리 세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 0.0001 ~ 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.00 1 ~ 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 조성물에서 본 발명의 화합물은 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 ~ 50 중량%의 함량으로 배합될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식 은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 및 뇌혈관내 (intracere broventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 천초근 분리 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강기능 식품을 제공한다.

본 발명의 화합물은 염증성 질환의 예방 및 치료를 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제 및 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제 및 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 화합물은 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

본 발명의 상기 화합물은 염증성 질환의 예방 및 치료를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 화합물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 30 g, 바람직하게는 0. 3 내지 10 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 폴리 사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 화합물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 화합물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량 부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이 다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 천초근 추출물로부터 분리된 화합물은 마우스 대식세포인 RAW264.7 세포에서 LPS로 유도되어진 NO 생성량, p-IkBα, iNOS, 및 COX-2의 단백질 발현을 감소시킬 뿐만 아니라 iNOS, COX-2, TNF-α, IL-6, 및 IL-1β의 mRNA 발현과 같은 친염증성 사이토카인들의 발현 함량을 유의적으로 감소함을 확인함으로써, 상기 조성물은 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품으로 유용하게 이용할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 참고예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 천초근 조추출물의 제조

1-1. 천초근 조추출물의 제조

대구광역시 중구 봉산동 약령시장에서 구입한 천초근을 세척하여 음건한 다음 마쇄기로 갈아 미세 분말화 한 후, 미세 분말 시료 10 kg에 95% 메탄올(MeOH) 40.5 ℓ를 가하여 80℃에서 8 시간 추출한 다음, 진공 여과하여 상층액을 회수하였 다. 이 과정을 4 회 반복하여 상층액을 모은 후, 감압 농축하여 천초근 메탄올 조추출물 1048.4 g을 수득하였다.

1-2. 천초근 가용 조추출물의 제조

상기 실시예 1-1에서 얻은 천초근 메탄올 조추출물 1048.4g을 물 2.2 ℓ에 현탁시킨 후에, 메틸렌클로라이드 (CH₂Cl₂)로 용매 분획하였다. 먼저 물 2.2 ℓ에 현탁시킨 천초근 메탄올 가용 추출물에 메틸렌클로라이드 2 ℓ를 첨가하여 용해한 다음, 이를 분획여두에서 메틸렌클로라이드 층에 용해되는 성분만 분리해서 진공 건조하였다. 이 과정을 5 회 반복 수행하여 메틸렌클로라이드 가용 추출물 360 g을 수득하였다.

실시예 2. 천초근 추출물로부터 분리된 화합물의 분리

상기 실시예 1-2에서 수득한 메틸렌클로라이드 가용 추출물을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (flash column chromatography; YMC Gel ODS-A, 60A, 220 mesh)로 즉, 길이 75 cm, 직경 9 cm의 컬럼에 230~400 메쉬 (mesh) 실리카켈 (silica gel)을 채우고 100% 헥산 (Hexane)으로 용리 (elution)하여 고정상 (stationary phase)를 균일한 상태로 만든 후, 상기 실시예 1-2에서 수득한 메틸렌클로라이드 가용성 추출물 360g을 실리카겔 (70~230 메쉬) 720g에 흡착시켜 컬럼에 로딩하였다. 이어서, 헥산 : 메틸렌클로라이드 = 98 : 2, 95 : 5, 90 : 10, 85 : 15, 80 : 20, 60 : 40, 50 : 50 순으로 이동상 (mobilie phase)의 극성을 높이다가 메틸렌클로라이드 : 메탄올 = 99 : 1, 98 : 2, 96 : 4로 용리 (elution)시켜 TLC패턴을 기준으로 RA-MC-1 ~ RA-MC-34의 분획물을 분획하였다.

상기 분획물 중에 열다섯번째 분획물인 RA-MC-15 분획물을 RP C18 컬럼 크로마토그래피 (RP C18 column chromatography)를 실시하였으며 컬럼 (I.D. 57 cm X 3.5 cm)에 RP C18 (40~63㎛)을 약 22 cm 채우고 CH₃CN : H₂O = 3 : 7 혼합용액으로 용리하여 균일한 상채로 만든 후 RA-MC-15 분획 6.2 g을 100% CH₃CN에 완전히 녹여 로딩하였고, 이어서 CH₃CN의 비율을 단계적으로 높이면서 용리시켜서 얻은 일곱 번째 분획물인 RA-MC-15-7 분획물 약 1.2 g을 다시 규소 오픈 컬럼 크로마토그래피 (SiO₂ open column chromatography)를 실시하였다. 컬럼 (I.D. 53 cm X 2.3 cm)에 실리카겔 (70 메쉬이하)을 약 15 cm 정도 채우고 100% 헥산으로 용리시켜 균일한 상태로 만들고 샘플을 실리카겔 (70 메쉬 이하) 약 0.72 g에 흡착시켜 컬럼에 로딩하고 Hexane : EtOAc = 18 : 0.3 혼합용액으로 용리시켜 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 화합물 2-카르보메톡시-2,3-에폭시-3-프레닐-1,4-나프토퀴논 (2-carbomethoxy-2,3-epoxy-3-prenyl-1,4-naphthoquinone) 754 mg을 분리 정제하여 수득하였다. 또한 상기 분획물 중에 RA-MC 분획물을 사용하여 상기와 동일한 방법으로 본 발명의 화합물들인 3‘-비스(3,4-디하이드로-4-하이드록시-6-메톡시-2H-1-벤조피란)(3,3’-bis(3,4-dihydro-4-hydroxy-6-methoxy-2H-1-benzopyran)) 51 mg, 에폭시몰루긴 (Epoxymollugin) 36.4 mg, 소란지디올 (Soranjidiol) 30 mg, 올레아놀 릭 산(Oleanolic acid) 28 mg, 1-아세톡시-3-메톡시-9,10-안트라퀴논 (1-acetoxy-3-methoxy-9,10-anthraquinone) 31 mg, 알리자린 2-메틸 아테르 (Alizarin 2-methyl ether) 42 mg, 푸로몰루긴 (Furomollugin) 76 mg, 몰루긴 (Mollugin) 670 mg 을 차례로 분리 정제하여 수득하였다 (표 1 참조).

천초근 추출물로부터 분리되는 16가지의 화합물
Plant	Fraction	Chemical compound name
천초근 (Rubiae Radix)	RA-MC-AA	2-carbomethoxy-2,3-epoxy-3-prenyl-1,4-naphthoquinone
	RA-MC-BB	3,3′-bis(3,4-dihydro-4-hydroxy-6-methoxy-2H-1-benzopyran)
	RA-MC-CC	Epoxymollugin
	RA-MC-DD	Soranjidiol
	RA-MC-EE	Oleanolic acid
	RA-MC-FF	1-acetoxy-3-methoxy-9,10-anthraquinone
	RA-MC-GG	Alizarin 2-methyl ether
	RA-MC-Ha	Furonollugin
	RA-MC-Hb	mollugin

참고예 1. 실험재료의 준비

DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)과 FBS(fetal bovine serum)은 Hyclone사 (Gaithersbug, MD, USA)에서 구입하였으며, LPS (Lipopolysaccharide), Griess reagent, MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)는 Sigma 사(St. Louis, Mo, USA)에서 구입하였다. BCA 단백질 분석 시약(BCA Protein assay reagent)은 Pierce사 (Rockford, IL, USA)에서 구입하였고, ECL 웨스턴 블롯 시약은 Amersham사 (Arlington Heights, IL, USA)에서 구입하였다. 그밖의 실험에 사용된 1차 항체인 anti-IkBα, anti-p-Ikbα monoclonal antibody는 Cell signaling 사에서 구입하였고, mAb (iNOS monoclonal antibody)는 BD science 사에서, COX-2 antibody는 Santa Cruz Biotechnology사에서 구입하였으며, 2차 항체인 anti-mouse 또는 anti-goat IgG horseradish peroxidase (HRP)-conjugated antibody는 Amersharm사 (Arlington Heights, IL, USA)에서 구입하였다. 실험에 사용된 모든 시약은 분석용 등급이상으로 사용하였다.

참고예 2. 세포배양

마우스의 대식세포주인 RAW264.7 세포는 ATCC(American Type Culture Collection, NO. TIB-71)에서 분양받아서, 10% FBS과 100 μg/ml의 겐타마이신(gentamycin)을 포함하는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지에 37℃, 5% CO₂의 조건으로 배양하여 하기 실험에 사용하였다.

실험예 1. 세포독성 측정

상기 실시예 2에서 얻은 화합물들의 세포독성을 측정하기 위하여 MTT assay 방법을 이용하여 하기와 같은 실험을 하였다 (Jun DY, et al., Apoptogenic activity of Zanthoxylum schinifolium toward human acute leukemia Jurkat T cells is associated with ER stress-mediated caspase-8 activation that stimulates mitochondria- dependent or -independent caspase cascade, Carcinogenesis, 28, pp.1303-1313, 2007).

세포독성 분석을 위해 96-웰 플레이트(96-well plate)에 세포농도 2 × 10⁵ cells/well로 조절하여 RAW264.7 세포를 분주한 후 16시간 배양하고, 상기 실시예 2의 화합물들을 농도별로 1 시간 전처리하고 LPS 0.1 μg/ml을 처리한 후 12 시간 동안 배양한 후 50 μl의 MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-dip henyl tetrazolium bromide]를 첨가하고 4 시간 반응시켜 포르마잔(formazan)을 형성시킨 후, 2300 rpm에서 15분 원심 분리하여 상등액을 제거하고 DMSO 150 μl/well을 가하여 포르마잔을 녹인 다음 ELISA reader(Variokan, Thermo Electron) 를 이용하여 540 nm 파장에서 측정하였다.

실험결과, 표 2 및 도 1에서 나타내는 바와 같이 6.25 μg/ml 농도의 화합물 처리에 의해서는 RAW264.7 세포에 대한 세포생존율이 크게 영향을 받지 않았으나, RA-MC-AA 화합물의 경우, 12.5 μg/ml 농도에서는 세포생존율이 대조구에 비해 23.2% 정도로 감소되는 것으로 나타나 12.5 μg/ml 농도에서는 대식세포 RAW264.7 세포에 대하여 세포독성 효과가 있음을 확인하였다(표 2 및 도 1 참조).

분획물	세포 생존율 (Cell viability, %)
분획물	6.25 μg/ml	12.5 μg/ml
RA-MC-AA	85	23
RA-MC-BB	93	112
RA-MC-CC	108	111
RA-MC-DD	112	110
RA-MC-EE	110	93
RA-MC-FF	106	110
RA-MC-GG	108	102
RA-MC-Ha	108	109
RA-MC-Hb	120	115
LPS 단독 투여군	100
대조군 (No treatment)	114

실험예 2. NO의 생성량 측정

NO의 생성량을 측정하기 위해 문헌 (Wang S et al., J. Ethnopharmacol., 114(3), pp.458-462, 2007)에 기재되어 있는 방법을 이용하여 하기와 같이 실험하였다.

NO생성량 측정을 위해 96-웰 플레이트(96-well plate)에 세포농도 2 × 10⁵ cells/well 로 희석하여 RAW264.7 세포를 분주한 후 16 시간 배양하고, 상기 실시예 2의 화합물을 농도별로 1 시간 전처리하고, LPS 0.1 μg/ml을 처리한 후 16 시간 동안 배양한 후 상등액 100 μl를 회수하여 그리스 반응액 (Griess Reagent) 100μl을 넣어주고 15분간 상온에서 빛을 차단한 상태로 반응 시킨 후 Automatic ELISA reader (precision microplate reader, Molecular Devices, BIO-TEX EL800uv-PC, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 아질산 나트륨 (sodium nitrite)의 농도별 표준곡선을 이용하여 배양액 내의 NO 농도를 결정하였다.

실험결과, 표 3 및 도 2에 나타난 바와 같이 RA-MC-AA 화합물은 6.25 μg/ml 농도조건에서 마우스 대식세포주 RAW264.7의 NO 생성은 거의 99% 정도로 현저히 저해하는 효과를 나타내었으므로(표 3 및 도 2 참조), RAW264.7 세포의 NO 생성을 저해할 수 있는 최소농도를 규명하기 위하여 RA-MC-AA 화합물을 1 μg/ml, 2 μg/ml 또는 4 μg/ml 농도로 첨가하는 경우에도 LPS에 의한 RAW264.7 세포의 NO 생성이 저해되는지를 확인하였다.

그 결과, 도 3-A에서 나타내는 바와 같이 1 μg/ml, 2 μg/ml 또는 4 μg/ml 농도 조건에서는 LPS에 의한 RAW264.7 세포의 NO 생성이 농도 의존적으로 저해되어 58%, 82% 및 99%로 각각 저해 되는 것으로 확인하였으며(도 3-A 참조), 동일한 농도조건에서 MTT assay로 확인한 RA-MC-AA 화합물은 도 3-B에서 나타내는 바와 같이 세포독성이 나타나지 않음을 확인하였다(도 3-B 참조).

Fraction	NO 생성 저해율 (NO synthesis inhibition, %)
Fraction	6.25 μg/ml	12.5 μg/ml
RA-MC-AA	99	100
RA-MC-BB	8	10
RA-MC-CC	3	7
RA-MC-DD	6	4
RA-MC-EE	19	40
RA-MC-FF	7	5
RA-MC-GG	7	6
RA-MC-Ha	10	6
RA-MC-Hb	43	92
LPS 단독 투여군	0

실험예 3. 웨스턴 블롯 분석법 (Western blot analysis)

Ik Bα, p-IkBα, COX-2 또는 iNOS 단백질 발현 측정을 하기 위해 허 등의 방법 (Heo et al., J. Immunol., 179(9), pp.6305-6310, 2007)을 이용하여 웨스턴 블롯 분석법을 하기와 같이 수행하였다.

참고예 2의 방법으로 배양된 4 × 10⁶세포에 PBS(ice-cold phosphate buffered saline: 2.7 mM KCl, 137 mM NaCl, 10 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄, pH 7.4)으로 3회 세척한 후, 용해 완충액 (lysis buffer: 137 mM NaCl, 15 mM EGTA, 1 mM sodium orthovanadate, 15 mM MgCl2, 0.1 % Triton X-100, 25mM MOPS, 2.5 μg/ml proteinase inhibitor E64, pH 7.2)으로 현탁하고 초음파 분쇄기로 파쇄한 다음, 4℃에서 30분간 반응시키고 14000rpm에서 20분간 원심 분리하여 상층액을 모았다. 동일한 양의 단백질을 4~12% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리시킨 후, 단백질을 Immobilon-P 멤브레인(membrane)에 전이 (transfer)하였다. 이 멤브레인을 항체의 비특이적 결합을 차단하기 위하여 블로킹 용액 (blocking buffer: 3% non-fat milk와 0.1% Tween 20을 함유한 TBS 용액)에서 1시간 동안 반응시킨 후, 각 단백질에 대한 항체 (anti-iNOS 및 anti-COX2)를 가하여 1 내지 2 시간 동안 반응시켰다. 이어서 0.1% Tween 20을 함유한 TBST 용액으로 10 분씩 3회 세척한 다음, 2차 항체 (anti-mouse 또는 anti-rabbit IgG horseradish peroxidase-conjugated antibody)로 90 분에서 2 시간 동안 반응시켰다. 이어서 ECL 시스템으로 반응 시킨 후에 X-ray 필름 (AGFA, Belgium) 상에서 단백질을 확인하였다. 각 시료의 단백질 정량은 Micro BCA 단백질 에세이키트 (Micro BCA protein assay kit)를 사용하여 562 nm에서 흡광도를 측정하여 실시하였다.

참고로, 대식세포는 염증반응의 개시와 확대에서 중요한 역할을 하는 세포로서, 세균성 LPS에 의해 세포표면의 Toll-유사 수용체 (Toll-like receptor)가 자극되는 대식세포는 세포내 신호전달과정을 통해 전사인자인 NF-κB를 활성화하며, 이어서 활성화된 NF-κB의 작용으로 유도성 산화질소생성효소 (iNOS)의 발현을 증가시킨다. 그 결과, 세포내에서 증가된 iNOS의 촉매작용으로 L-아르기닌(L-arginine)으로부터 염증매개체 중의 하나인 NO의 생성이 증진됨을 알 수 있다(Haiqi He, et al., Molecular Immunology, 43, p.783, 2006).

실험결과, 도 4에 나타난 바와 같이, LPS의 처리에 의해 전사인자 NF-κB의 활성화와 관련된 iNOS의 발현 및 COX-2의 발현 수준은 RA-MC-AA 화합물에 의해 농도 의존적으로 감소되는 경향을 나타내었으며(도 4 참조),

또한, 도 5에 나타난 바와 같이 동일한 조건하에서 NF-κB의 활성화와 관련된 IκB 단백질의 인산화는 현저히 증가하였으나 RA-MC-AA 화합물의 존재하는 조건에서는 농도 의존적으로 IκB의 인산화가 현저히 감소함을 확인하였다(도 5 참조).

실험예 4. 역전사중합효소연쇄반응(RT-PCR)

RA-MC-AA 화합물의 NO 생성 억제능이 iNOS mRNA 및 친염증성 사이토카인들의 발현 억제에 의한 것인지 확인하기 위해 기존의 문헌에 기재된 방법 (Lee et al., J. Ethnopharmacol., 97, pp.561-566, 2005)을 이용하여 RT-PCR을 하기와 같이 수행하였다.

RAW264.7 세포에 실시예 2의 화합물 RA-MC-AA(2-carbomethoxy-2,3-epoxy-3-prenyl-1,4-naphthoquinone)을 1~4 μg/ml의 농도로 1 시간 처리하여 반응시킨 후, 0.1 μg/ml의 LPS 4시간 전처리하여 NO 생성을 유도하였다. LPS 처리하고 4시간 경과 후, 세포를 트립신(Trypsin)-EDTA를 처리하여 회수하고 total RNA를 트리졸(TRIzole: Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 분리하였다. 첫 번째 가닥 cDNA는 총 RNA의 2μg으로부터 MMLV-역전사 효소(reverse transcriptase: Gibco BRL)를 사용하여 합성하였다. 프라이머(Primer)의 염기서열은 하기의 표 4에 나타내었다.

genes		oligonucleotide sequence	size
iNOS	sense	5-ATGTCCGAAGCAAACATCAC-3	449 bp
	antisense	5-TAATGTCCAGGAAGTAGGTG-3
COX-2	sense	5-CAGCAAATCCTTGCTGTTCC-3′	490 bp
	antisense	5-TGGGCAAAGAATGCAAACATC-3
TNF-α	sense	5-TACTGAACTTCGGGGTGATCGGTCC-3	295 bp
	antisense	5-CAGCCTTGTCCCTTGAAGAGAACC-3
IL-6	sense	5-GAAATGATGGATGCTTCCAAACTGG-3	414 bp
	antisense	5-GGATATATTTTCTGACCACAGTGAGG-3
IL-1β	sense	5-CAAGGAGAACCAAGCAAC-3	350 bp
	antisense	5-GGGGAAGGCATTAGAAAC-3
GAPDH	sense	5-CCACTGGCGTCTTCACCAC-3	349 bp
	antisense	5-CCTGCTTCACCACCTTTTG-3

PCR은 98 ℃에서 2 분간 가열한 후 98 ℃에서 10 초, 50 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 1 분간 반응하는 순서로 20 회 반복하고, 이후에 72 ℃에서 5 분간 반응하였다. PCR 생성물은 1.2% 아가로스 젤 (agarose gel)에서 전기영동하고 EtBr(ethidium bromide: 0.5 μg/ml)로 염색하여 확인하였다.

실험결과, 도 6에서 나타내는 바와 같이 LPS를 처리한 RAW264. 7 세포에서는 iNOS mRNA 발현 수준이 현저히 증가하였으나 RA-MC-AA 화합물와 LPS를 함께 처리한 경우에는 RA-MC-AA 화합물의 농도 의존적으로 iNOS와 COX-2 mRNA 수준이 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, 친염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β mRNA 수준도 LPS를 처리한 RAW264. 7 세포에서 현저히 증가하였으나, RA-MC-AA 화합물와 LPS를 함께 처리한 경우에는 RA-MC-AA 화합물에 의해 농도 의존적으로 감소됨을 확인하였다(도 6 참조).

따라서, 마우스 대식세포주인 RAW264.7 세포에 있어서 LPS 처리에 의해 유도되는 NO 생성에 대한 RA-MC-AA 화합물의 저해효과는 iNOS 유전자의 발현과 관련된 전사인자 NF-κB의 활성화 억제를 통해서 이루어짐을 시사하며, 이러한 NF-κB의 활성화 억제는 NF-κB의 저해인자인 IkB 단백질의 불활성화 기전인 그 인산화를 방해하여 일어나는 것임을 나타낸다. LPS 처리에 의해 대식세포 내에서 유도되는 전사인자 NF-κB의 활성화에 미치는 RA-MC-AA 화합물의 억제 효과는, NF-κB의 전사활성에 의해 유도되는 다양한 친염증성 사이토카인들인 TNF-α, IL-6, IL-1β mRNA 수준의 감소현상으로도 확인되었다.

이러한 결과는, 도 7에서 나타내는 바와 같이 천초근 추출물로부터 분리되는 단일물질인 2-carbomethoxy-2,3-epoxy-3-prenyl-1,4-naphthoquinone (RA-MC-AA)는 IκB의 인산화를 감소시킴으로 LPS에 의해 유도되는 RAW264.7 세포내의 전사인자인 NF-κB 활성화를 저해하며, 이를 통해 LPS에 의해 유도되는 iNOS, COX-2 및 친염증성 사이토카인들인 TNF-α, IL-6, IL-1β의 유전자 전사를 저해함으로써 iNOS, COX-2 및 친염증성 사이토카인들인 TNF-α, IL-6, IL-1β 단백질의 수준을 낮출 수 있고, 따라서 LPS 처리에 의한 NO 생성을 저해하는 효과 즉 항염증 효과를 나타낼 수 있음을 보여준다(도 7 참조).

본 발명의 화합물을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

RA-MC-AA 화합물 300 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제 제예 2. 정제의 제조

RA-MC-BB 화합물 300 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

RA-MC-CC 화합물 300 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

RA-MC-DD 화합물 300 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

RA-MC-EE 화합물 300 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬 향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색 병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

RA-MC-FF 화합물 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B₁ 0.13 ㎎

비타민 B₂0.15 ㎎

비타민 B₆ 0.5 ㎎

비타민 B₁₂0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

RA-MC-Hb 화합물 300 ㎎

비타민 C 15 g

비타민 E(분말) 100 g

젖산철 19.75 g

산화아연 3.5 g

니코틴산아미드 3.5 g

비타민 A 0.2 g

비타민 B₁ 0.25 g

비타민 B₂ 0.3 g

물 정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동 안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

[이 발명을 지원한 국가연구개발사업]

[과제고유번호]

B0009-008

[부처명]

지식경제부

[연구사업명]

지역혁신센터 사업

[연구과제명]

한약재 유래 천연물 소재의 면역조절작용 기전규명 및 산업화 기술개발

[주관기관]

대구한의대학교 산학협력단

[연구기간]

2008년 03월 01일 ~ 2010년 02월 28일

도 1는 천초근 추출물로부터 분리된 화합물들의 세포독성을 나타낸 도이며(0, 6.25, 12.5 ug/ml),

도 2은 천초근 추출물로부터 분리된 화합물들의 NO 생성감소량을 나타낸 도이고(0, 6.25, 12.5 ug/ml),

도 3-A는 RA-MC-AA 화합물의 NO 생성감소량을 나타낸 도이며(0, 1, 2, 4 ug/ml),

도 3-B는 RA-MC-AA 화합물의 세포독성을 나타낸 도이고(0, 1, 2, 4 ug/ml),

도 4은 RA-MC-AA 화합물의 염증성 관련 단백질의 생성감소량을 나타낸 도이며(iNOS, COX-2),

도 5은 RA-MC-AA 화합물의 염증성 관련 단백질의 생성감소량을 나타낸 도이고(p-IkBα, IkBα),

도 6은 RA-MC-AA 화합물의 iNOS, COX-2, TNF-α, IL-6, IL-1β mRNA발현 억제를 나타낸 도이며(0, 1, 2, 4 ug/ml),

도 7는 대식세포주 Raw264.7의 염증성 신호전달을 모식화한 도이다.

Claims

천초근 추출물로부터 분리된 2-카르보메톡시-2,3-에폭시-3-프레닐-1,4-나프토퀴논(2-carbomethoxy-2,3-epoxy-3-prenyl-1,4-naphthoquinone), 3,3′-비스(3,4-디하이드로-4-하이드록시-6-메톡시-2H-1-벤조피란)(3,3′-bis(3,4-dihydro-4-hydroxy-6-methoxy-2H-1-benzopyran)), 에폭시몰루긴(Epoxymollugin), 소란지디올(Soranjidiol), 1-아세톡시-3-메톡시-9,10-안트라퀴논(1-acetoxy-3-methoxy-9,10-anthraquinone), 알리자린 2-메틸 아테르(Alizarin 2-methyl ether), 푸로놀루긴(Furonollugin) 및 몰루긴(mollugin)으로 구성된 군으로부터 선택된 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 아토피피부염, 요도염, 방광염 또는 치주염의 예방 및 치료용 약학조성물.
제 1항에 있어서, 상기 천초근 추출물로부터 분리된 화합물은 2-카르보메톡시-2,3-에폭시-3-프레닐-1,4-나프토퀴논 (2-carbomethoxy-2,3-epoxy-3-prenyl-1,4-naphthoquinone) 화합물인 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 추출물은 천초근의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물임을 특징으로 하는 약학조성물.
제 3항에 있어서, 상기 조추출물은 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매에 가용한 추출물을 포함함을 특징으로 하는 약학조성물.
제 3항에 있어서, 상기 비극성용매 가용 추출물은 메틸렌클로라이드, 헥산, 클로로포름, 디클로로메탄 또는 에틸아세테이트에 가용한 추출물을 포함함을 특징으로 하는 약학조성물.
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천초근 추출물로부터 분리된 2-카르보메톡시-2,3-에폭시-3-프레닐-1,4-나프토퀴논(2-carbomethoxy-2,3-epoxy-3-prenyl-1,4-naphthoquinone), 3,3′-비스(3,4-디하이드로-4-하이드록시-6-메톡시-2H-1-벤조피란)(3,3′-bis(3,4-dihydro-4-hydroxy-6-methoxy-2H-1-benzopyran)), 에폭시몰루긴(Epoxymollugin), 소란지디올(Soranjidiol), 1-아세톡시-3-메톡시-9,10-안트라퀴논(1-acetoxy-3-methoxy-9,10-anthraquinone), 알리자린 2-메틸 아테르(Alizarin 2-methyl ether), 푸로놀루긴(Furonollugin) 및 몰루긴(mollugin)으로 구성된 군으로부터 선택된 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 아토피피부염, 요도염, 방광염 또는 치주염의 예방 및 개선용 건강기능식품.
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