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KR101042965B1 - 카테콜 폴리에틸렌글리콜 유도체와 단백질 또는 펩타이드의 접합체 및 이의 제조방법 - Google Patents

카테콜 폴리에틸렌글리콜 유도체와 단백질 또는 펩타이드의 접합체 및 이의 제조방법 Download PDF

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KR101042965B1
KR101042965B1 KR1020100107264A KR20100107264A KR101042965B1 KR 101042965 B1 KR101042965 B1 KR 101042965B1 KR 1020100107264 A KR1020100107264 A KR 1020100107264A KR 20100107264 A KR20100107264 A KR 20100107264A KR 101042965 B1 KR101042965 B1 KR 101042965B1
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Abstract

본 발명은 카테콜을 갖는 폴리에틸렌글리콜 유도체를 이용하여 단백질 또는 펩타이드의 특정부위인 N-말단에 폴리에틸렌글리콜 유도체를 단일접합시킨 단백질- 또는 펩타이드-카테콜 폴리에틸렌글리콜 유도체의 접합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 카테콜-PEG 유도체가 단백질 또는 펩타이드의 특정부위인 N 말단 아민 그룹에 위치특이적이면서도 단일 분자로 결합하여, 균일한 단백질 또는 펩타이드와 폴리에틸렌글리콜의 접합체를 높은 수율로 수득할 수 있다. 수득된 접합체는 종래기술에 비하여 단백질 자체의 화학적 변형이 없으면서도 단백질 활성도 저해를 최소화할 수 있어 접합체의 약학적 효과가 뛰어나며, 그 균질성에 의해 생체 내에서의 생물학적 약효성이 균일하게 예측되고, 가수분해에 강하여 생체 내 지속시간이 길어지므로, 단백질 약물의 체내 약효 및 안정성을 증진시키는 효과가 있다.

Description

카테콜 폴리에틸렌글리콜 유도체와 단백질 또는 펩타이드의 접합체 및 이의 제조방법{Conjugates of protein- or peptide-catechol modified polyethyleneglycol, and a method for preparing the same}
본 발명은 카테콜을 갖는 폴리에틸렌글리콜 유도체를 이용하여 단백질 또는 펩타이드의 특정부위인 N-말단에 폴리에틸렌글리콜 유도체를 단일접합시킨 단백질 또는 펩타이드-카테콜 폴리에틸렌유도체의 접합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
생체 내에서는 우리 몸의 성장 및 분화와 관련된 다양한 종류의 단백질 또는 펩타이드들이 발현되게 된다. 이러한 단백질 또는 펩타이드들은 세포벽에 존재하는 수용체와 결합하여 다양한 신호전달물질(signaling molecules)의 발현을 유도함으로써 생체 항상성(homeostasis)을 유지하는 역할을 한다. 그러나, 이러한 단백질 또는 펩타이드의 양이 생체 내 적정 수준을 유지하지 못할 경우, 생체 내 신호전달물질의 부족 현상이나 과발현 현상에 의하여 생체 항상성에 문제가 생겨, 다양한 문제점이 나타나게 된다. 예를 들어, 인간 성장과 관련된 성장 호르몬이나 상처 치유에 관련된 표피 성장 인자 등의 농도가 낮을 경우, 키가 자라지 않거나 상처가 잘 아물지 않는 경우가 발생할 수 있다.
1962년 캔필드(R. Canfield), 1985년 에취 (F. Esch), 1962년 코헨 (S. Cohen), 1985년 멧프 (D. Metcalf) 등은 아미노산으로 구성된 단백질 인자인 라이소자임(Lysozyme), 섬유아세포성장호르몬(bFGF), 표피성장인자(EGF), 과립구콜리니자극인자(G-CSF) 등을 발견하였으며 각각의 아미노산 배열을 또한 확인하였다 (R. Canfield, J. Biol . Chem . 238, 2698., 1963;F. Esch, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 82, 6507., 1985;S. Cohen, J. Biol . Chem . 237, 1555., 1962;D. Metcalf, Science 229, 16, 1985).
이러한 단백질 인자들은 상처치료(Lysozyme/bFGF/EGF), 백혈구 형성(G-CSF)에 영향을 미치는 것으로 알려져 있어서, 당뇨병 환자에게 발생하기 쉬운 족부궤양 치료제나 항암 치료후 호중구 감소증(Neutropenia) 치료제로 상용될 수 있다.
그러나, 이러한 단백질의 경우, 혈액 및 조직 내에서 그 체내 반감기(half-life)가 매우 짧은 것으로 알려져 있어서, 치료용으로 단백질을 투여할 경우, 생체 내 약효 지속성과 안정성이 매우 떨어지는 것이 큰 문제로 대두된다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여, 최근 10년간 생체적합성 고분자인 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol;PEG)을 단백질 또는 펩타이드 물질에 접합시키려는 시도가 계속해서 이어져 왔다 (G. Pasut & F. M. Veronese Prog . Polym . Sci . 32, 933, 2007; F. M. Veronese, Biomaterials 22, 405.2001; P. Bailon, Pharm . Sci . Tech. Today 1, 352, 1998).
폴리에틸렌글리콜(PEG)은 생체 내에서 면역반응을 일으키지 않는 생체적합성이 뛰어난 고분자로서 미국식품의약안정청(FDA)이 승인한 합성 고분자중의 하나이다. 이 합성 고분자를 이용하여 단백질 접합체를 제조함으로써, 증가된 분자량을 가진 단백질 폴리에틸렌글리콜 접합체를 얻을 수 있으며, 이에 따라, 신장에서의 거름(filtration) 효과에 의한 단백질의 투과를 억제할 수 있다. 또한, 폴리에틸렌글리콜의 스텔스 작용(stealth effect)을 통하여 생체 내의 단백질 효소들에 의한 분해를 억제하는 효과를 나타냄으로써, 궁극적으로 생체 내에서의 반감기 및 안정성을 증가시키게 된다. 이러한 방법으로 약효를 증진시킨 단백질들은 인간성장호르몬, 에리트로포이틴, 인터페론, 인슐린, 인터루킨, 칼시토닌 등, 그 종류가 다양하다.
그러나, 단백질 약물의 체내 안정성 및 지속성 향상을 위하여 폴리에틸렌글리콜을 사용할 때, 폴리에틸렌글리콜이 단백질 약물이 가지고 있는 복수개의 결합부위와 반응함으로써, 결과적으로 생성되는 산물이 불균일한 다중 접합체 혼합물(a mixture of multi-PEGylated species)이 되는 문제점이 있어왔다. 특히, 불균일한 다중 접합체 혼합물의 경우, 약물의 지속효과와 안정성을 측정하는데 많은 문제점을 발생시킨다.
한편, 조건을 엄격하게 조절하여 일분자의 폴리에틸렌글리콜이 결합된 (mono-PEGylated) 접합체를 제조한다 할지라도, 그 결합부위에 따라 약물의 생물학적 또는 체내 활성도가 현격히 영향을 받는다는 점이 문제이다. 이를 해결하기 위하여, 대부분의 치료용 단백질 (therapeutic proteins, EPO, G-CSF, growth hormone, etc)은 활성부위(active site)가 N-말단 (N-terminal)의 인접부위에 위치해 있지 않으므로, 단백질 또는 펩타이드의 N-말단에 PEG를 결합시키려는 시도가 있어왔다. 왜냐하면 N-말단 페길화 반응은 페길화 반응의 가장 큰 단점인 단백질 활성화 저하를 최소화 할 수 있는 기술이기 때문이었다.
따라서, 위와 같은 N-말단 위치특이적 단일 페길레이션을 실현하기 위하여, 여러 가지 방법을 사용하여 단백질 또는 펩타이드의 N-말단 아민기의 1차 아민(primary amine)에 위치 특이적(site-specific)이게 폴리에틸렌글리콜을 단일체로(mono-PEG) 접합시키려는 시도가 있어왔다.
종래 이러한 시도에 이용되었던 폴리에틸렌글리콜은 1차 아민에 특이적으로 반응하는 물질인 N-하이드록시석신이미드 (N-hydroxysuccinimide) 또는 N-석신이미딜프로피오네이트 (succinimidyl propionate)가 한쪽 말단에 붙어있는 메톡시폴리에틸렌글리콜 유도체였다 (T. H. Kim, Biomaterials , 23, 2311, 2002;H. Lee, Pharm. Res ., 19, 845, 2002). 석신이미드 폴리에틸렌글리콜 유도체를 사용하여 제조된 모노-페길레이티드(mono-PEGylated) 접합체의 경우, 체내 활성도 변화도가 매우 낮은 것으로 알려져 있으나, 단백질 또는 펩타이드와 접합하는 반응 도중 N-하이드록시석신이미드 또는 N-석신이미딜프로피오네이트의 가수분해(hydrolysis)가 빠르게 일어나, 단백질 또는 펩타이드 접합체를 만드는 공정상에 어려움이 있어 접합체를 획득하는 수율이 낮은 문제가 있었다.
또한, Site-specific protein mutation (single mutation)을 이용한 또 다른 시도로써, 95%이상의 Cysteine을 단백질 (펩타이드)약물의 N-말단에 도입하여 페길레이션 (PEGylation)을 수행하는 기술이 시도되어왔다. 단, 상기 기술에 의할 경우, 단백질 약물을 화학적으로 변형시키는 것이므로, 변형에 따른 약물의 생활성 감소 등 부수적 문제를 안고 있어왔다.
나아가, Aldehyde-PEG를 이용한 N-terminal 특이적 PEGylation이 시도된 바 있다. 이는 Amgen사(社)의 Neulasta(R)의 생산에 적용된 방법이다. 그러나 상기 기술의 경우, 그 공정에 있어 반응 조건이 반드시 산성조건이어야 한다는 제약이 있으며, (pH 4-6, 보통 pH 5.0~5.5) 반드시 환원제인 NaBH4를 같이 사용하여야 하므로, 이러한 제한된 반응 조건으로 인한 제한성이 문제되어 왔다.
이에 본 발명자들은 카테콜을 갖는 화합물이 결합된 PEG 유도체를 이용하여 단백질 또는 펩타이드와 상기 PEG 유도체의 접합체를 제조할 경우, 공정이 간단하고, 결과물이 가수분해에 강하면서도, 특히, 단백질 또는 펩타이드의 N-말단의 1차 아민 (primary amine)에 위치 특이적 (site-specific)으로 단일-PEG (mono-PEGylated) 접합되어 있는 접합체를 높은 수율로 생성할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 단백질 또는 펩타이드의 특정부위인 N-말단 아민기에 폴리에틸렌글리콜 유도체를 단일접합시킨 단백질 또는 펩타이드와 폴리에틸렌글리콜 유도체의 접합체 및 이의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 카테콜을 갖는 화합물이 결합된 폴리에틸렌글리콜 유도체, 상기 유도체가 단백질 또는 펩타이드의 특정부위인 N-말단아민기에 단일접합되어 있는 (mono-PEGylated), 단백질 또는 펩타이드와 폴리에틸렌글리콜 유도체의 접합체 및 이의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 카테콜-PEG 유도체가 단백질 또는 펩타이드의 특정부위인 N 말단 아민 그룹에 위치특이적이면서도 단일 분자로 결합하여, 균일한 단백질 또는 펩타이드와 폴리에틸렌글리콜의 접합체를 높은 수율로 수득할 수 있다. 수득된 접합체는 종래기술에 비하여 단백질 자체의 화학적 변형이 없으면서도 단백질 활성도 저해를 최소화할 수 있어 접합체의 약학적 효과가 뛰어나며, 그 균질성에 의해 제조 공정을 단순화 시킬 수 있으며, 또한 생체 내에서의 생물학적 약효성이 균일하게 예측되고, 가수분해에 강하여 생체 내 지속시간이 길어지므로, 단백질 약물의 체내 약효 및 안정성을 증진시키는 효과가 있다.
도 1은 메톡시 폴리에틸렌글리콜과 3,4-디하이드록시시나믹산의 반응 모식도이다.
도 2는 힌지-3 펩타이드의 아미노산 서열이다.
도 3은 mPEG-CT 및 힌지-3을 혼합한 결과의 RP-HPLC 결과이다.
도 4는 mPEG-CT 및 힌지-3을 혼합한 결과의 MALDI-TOF 결과이다.
도 5는 힌지-3에 존재하는 페길레이션 후보지(candidate)를 나타낸 모식도이다.
도 6은 PEG-힌지-3의 트립신 분해 이후 절편들에 대한 RP-HPLC 결과 그래프로, 검은 선 13분의 피크는 T1절편, 붉은선 13분의 피크는 희석미비의 결과, 23.5분의 피크는 페길레이션된 절편들을 나타낸다.
도 7은 PEG-힌지-3의 트립신 분해 이후 MALDI-TOF 결과 그래프로, mPEG (MW : 5000) 또는 mPEG와 T1절편이 더해진 값 (MW : 5883)에 피크가 나타났다.
도 8은 카테콜 그룹과 숙신이미딜 숙신산의 결합 형태에 대한 모식도이다.
도 9는 숙신이미딜 숙신산-PEG-라이소자임 (3열) 및 카테콜-PEG-라이소자임 (4열)의 SDS-PAGE 결과로, 단일 결합된 카테콜-PEG-라이소자임은 하나의 밴드만을 나타냄을 보인다.
도 10은 숙신이미딜 숙신산-PEG-bFGF (2열) 및 카테콜-PEG-bFGF (3열)의 SDS-PAGE 결과 (10A), bFGF의 트립신 분해의 MALDI-TOF 결과 (MW : 2495, 10B) 및 카테콜-PEG-bFGF의 트립신 분해의 MALDI-TOF 결과 (MW : 7468, 10C)이다.
도 11은 숙신이미딜 숙신산-PEG-G-CSF (2열) 및 카테콜-PEG-G-CSF (3열)의 SDS-PAGE 결과 (11A), G-CSF의 트립신 분해의 MALDI-TOF 결과 (MW : 1792, 11B) 및 카테콜-PEG-G-CSF의 트립신 분해의 MALDI-TOF 결과 (MW : 6792, 11C)이다.
도 12는 라이소자임 단백질 페길레이션 반응시, pH 6.0에서, 카테콜에 대해 0, 0.5, 1, 1.5, 2 : 1의 비율로 NalO4를 첨가한 결과의 SDS-PAGE 젤 사진이다.
도 13은 라이소자임 단백질 페길레이션 반응시, pH 6.0에서 카테콜에 대해 0, 0.5, 1, 1.5, 2 : 1의 비율로 NalO4를 첨가한 경우 페길레이션 수율의 상대값을 나타낸 그래프이다.
도 14는 mPEG-CT와 EPO 반응 결과 혼합물 (2열, 2개 밴드) 및 FPLC 시스템을 이용한 정제된 mPEG-CT-EPO (PEG-EPO, 3열, 1개 밴드)의 SDS-PAGE 결과이다.
도 15는 RP-HPLC 결과 그래프로, 검은 선의 피크는 mPEG-CT-EPO(98분), EPO 혼합물 (140분)을 의미하며, 붉은 선의 피크는 각 단일-PEG(105분), 이중-PEG(98분), 다중-PEG(85분)을 의미한다.
도 16은 단일-PEG-EPO, 다중-PEG-EPO, EPO의 생체 내 반감기를 나타낸 그래프이다.
도 17은 단일-PEG-EPO와 EPO의 적혈구의 상대적 용적 비율 (hematocrit)을 측정한 그래프이다.
본 발명은 하기 화학식 1의 카테콜(catechol)을 갖는 화합물이 결합된 폴리에틸렌글리콜 유도체와 상기 유도체가 단백질 또는 펩타이드의 N-말단 아민기에 단일체로 선택적으로 접합되어 있는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드-폴리에틸렌글리콜 유도체의 접합체를 제공한다:
Figure 112010070721967-pat00001
본 발명의 발명자들은 상기 공지 기술의 문제점들을 해결하기 위하여 연구하던 중, 단백질의 N-말단 아민기와 특이적으로 결합하는 작용기를 발견하였고, 이는 도파기(3,4-dihydroxy-L-phenylalanine group)로서, 홍합 접착물질에 많이 포함되어 있는 아미노산 (amino acid)으로 알려져 있다. 도파민 혹은 더 넓게는 카테콜에 대한 연구로는 본 발명의 발명자에 의하여 발표된 연구 논문을 통해 다양한 표면에 카테콜기가 흡착될 수 있음을 증명하였고, 이러한 접착력을 이용하여 단백질들을 선택적으로 다양한 표면에 코팅할 수 있다는 점을 증명하였다(H. Lee, PNAS , 103, 12999, 2006; H. Lee, Science , 318, 426, 2007; H. Lee, Adv . Mater. 21, 431, 2009).
따라서, 본 발명은 폴리에틸렌글리콜에 카테콜을 갖는 화합물을 결합시켜 반응성을 갖는 폴리에틸렌글리콜 유도체를 사용한다. 상기와 같은 폴리에틸렌글리콜 유도체는 단백질 또는 펩타이드 등의 N-말단 아민기에 선택적으로 결합하여 접합체를 형성할 수 있으며, 이 경우, 폴리에틸렌글리콜 유도체는 단백질 또는 펩타이드의 특정 부위에 단일분자로 접합 (site-specific mono-PEGylation)되어, 단백질 또는 펩타이드의 생리 활성도가 유지됨과 동시에, 생체 내에서 지속성과 안정성이 증가한 단백질 또는 펩타이드 제재를 제조할 수 있다. 또한, 단백질/펩타이드 등의 유도체를 제조할 때 발생하는 가수분해에 매우 안정적인 카테콜기를 이용함으로써 반응 효율이 장시간 유지될 수 있는 장점이 있다.
본 발명에 사용된 용어 "폴리에틸렌글리콜"은 당해업계에서 일반적으로 PEG, Polyethyleneglycol과 병용하여 사용되는 용어이며, 또한 아래 메톡시알데히드폴리에틸렌글리콜 등의 유도체의 개념을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 폴리에틸렌글리콜은 메톡시알데히드폴리에틸렌글리콜, 숙신이미드프로피온산폴리에틸렌글리콜, 메톡시숙신이미드부탄산폴리에틸렌글리콜, 메톡시숙신이미딜숙신산폴리에틸렌글리콜, 메톡시벤조트리아졸카르본산폴리에틸렌글리콜, 메톡시에폭시드폴리에틸렌글리콜, 메톡시카르보닐이미다졸폴리에틸렌글리콜, 메톡시p-니트로페닐카르본산폴리에틸렌글리콜, 메톡시이소시안산폴리에틸렌글리콜, 1차아민을 포함하는 메톡시아민폴리에틸렌글리콜, 메톡시하이드라지드폴리에틸렌글리콜 및 카르복실기를 포함하는 메톡시카르복실폴리에틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기의 폴리에틸렌글리콜은 아민기 또는 카복실기와 반응을 할 수 있어, 카테콜기와 결합하여 유도체를 형성할 수 있다.
또한, 상기 폴리에틸렌글리콜은 직선형, 가지형, 브러시형, 또는 스타형과 같은 모든 종류의 폴리에틸렌글리콜을 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 카테콜을 갖는 화합물은 카복실기와 아민기를 포함하는 3,4-다이하이드록시-L-페닐알라닌 (3,4-dihydroxy-L-phenylalanine), 아민기를 포함하는 3-하이드록시-타이라민 (3-hydroxy-tyramine), 카복실기를 포함하는 3,4-다이하이드록시하이드로시나믹산 (3,4-dihydroxyhydrocinnamic acid), 알데히드기를 포함하는 3,4 다이하이드록시벤즈알데히드(3,4-dihydroxybenzaldehyde) 및 노어에피네프린 (Norepinephrine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것이 아니다. 나아가, 본 발명에서 사용되는 카테콜을 갖는 화합물의 분자량은 1,000 이하인 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 폴리에틸렌글리콜 유도체의 분자량은 500 내지 100,000 인 것이 바람직하고, 2,000 내지 40,000인 것이 더욱 바람직하다. 분자량이 100,000을 초과하는 폴리에틸렌글리콜 유도체를 확보하는 것이 곤란하여 제조상의 문제가 있고, 500 미만일 경우 폴리에틸렌글리콜이 액상 형태가 되어 물리적 성질로 인한 문제가 있는 등, 반응 효율성이 떨어지는 문제가 있다.
폴리에틸렌글리콜 유도체가 단백질에 접합될 경우, 증가된 분자량을 가진 단백질-폴리에틸렌글리콜 유도체의 접합체를 얻을 수 있고, 이에 따라 신장에서의 거름(filtration) 효과에 의한 단백질의 투과를 억제할 수 있는 장점이 있다. 또한, 폴리에틸렌글리콜의 스텔스작용(stealth effect)을 통하여 생체 내의 단백질 효소들에 의한 분해를 억제하는 효과를 나타내며, 이는 곧, 생체 내에서의 반감기 및 안정성을 증가시키는 장점을 의미한다.
본 발명에 따른 단백질 또는 펩타이드-폴리에틸렌글리콜 유도체의 접합체는 상기와 같이 특정부위에 단일분자로 접합하므로, 불균일한 접합체 혼합물이 생성되는 문제를 방지할 수 있는 장점이 있다. 이를 통하여, 약물의 지속효과와 안정성을 측정할 경우 신뢰할 만한 데이터를 얻을 수 있으며, 원하는 생물학적 활성 또는 체내 활성을 갖는 약물을 용이하게 제조할 수 있도록 하는 장점이 있다. 또한 N-말단이라는 특정부위에 접합하므로, 단백질 약물의 화학적 변형이 전혀 없이 약리학적 효과를 최대화할 수 있는 장점이 있다.
본 발명에서 사용되는 상기 단백질은 라이소자임(lysozyme), 섬유아세포성장호르몬(bFGF), 과립구콜리니자극인자(GCSF), 에리스로포이에틴(EPO), 상피세포성장인자(EGF), 인간성장호르몬(hGH), 인터페론(IFN), 인터루킨-2(IL-2), 혈관표피세포성장호르몬(VEGF), 루트르이틴호르몬발현호르몬(LHRH), 성장호르몬발현호르몬(GHRH), 유리케이즈(mammalian urate oxidase, uricase), 및 아르기닌 디이미네이즈(arginine deiminase, ADI)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니고, 이때 사용되는 라이소자임, bFGF, EGF, GCSF 등과 같은 단백질은 유전자 재조합 방법에 의하여 생산된 것으로, 포유동물에서 추출하는 방식과, 유전자의 DNA 벡터로부터 복제한 후 원핵생물, 또는 진핵생물 숙주의 발명을 통하여 얻을 수 있다. 한편, 상기에서 사용되는 원핵생물의 숙주는 대장균 (Escherichia coli)를 포함하고, 진핵생물의 숙주는 한세눌라 폴리모르파 (Hanesnula polymorpha), 사카로마이세스, 세레비시에를 포함하며, 포유동물은 쥐, 개, 및 돼지 등으로부터 각 단백질을 얻을 수 있다.
본 발명에서 사용되는 상기 펩타이드는 힌지-7(Hinge-7), 힌지-3(Hinge-3), 부포린(buforin), 히스토닌(histonin), 프로테그린(protegrin), 인돌리시딘(indolicidin), 히스타틴(histatin), BIP, 마가이닌 2(magainin 2), 글루카곤 유사 펩타이드(glucagon-like peptide: GLP-1), GNRH/LHRH 경쟁자(GNRH/LHRHagonist), 소마토스타틴 유사체(somatostatin analogue), 면역조절 펩타이드인 글라티라머(glatiramer), 살몬 칼시토닌(salmon calcitonin), 데스모프레신(desmopressin), 혈소판 응고 억제 펩타이드, 엡티피바타이드(eptifibatide), 및 HIV 세포 유입억제제인 엔푸버타이드(enfuvirtide)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은
(a) 반응조 내의 극성유기용매에 폴리에틸렌글리콜을 용해시키는 단계;
(b) 다른 반응조 내의 극성유기용매에 가교제 및 화학식 1의 카테콜을 갖는 화합물을 용해시키는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 제조된 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (N,N-Diisopropylethylamine; DIPEA)를 첨가하여 반응시키는 단계; 및
(d) 상기 (a) 단계의 용액에 상기 (c) 단계의 용액을 첨가하여 반응시키는 단계를 포함하는,
단백질 또는 펩타이드의 N-말단 아민기에 단일체로 접합할 수 있는, 상기 화학식 1의 카테콜(catechol)을 갖는 화합물이 결합되어 있는 폴리에틸렌글리콜 유도체의 제조방법을 제공한다.
이하 본 발명을 각 단계별로 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 단계 (a) 및 단계 (b)는 반응물질의 용액을 각각 제조하는 단계이다. 물질을 용해시키는 용매로써 극성 유기용매를 사용할 수 있는데, 바람직하게는 알콜, DMSO(Dimethyl sulfoxide), DMF(Dimethylformaldehyde), 아세톤(Acetone) 및 NMP(N-Methylpyrrolidone)를 이용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 DMF를 사용할 수 있다. DMF는 카테콜기의 산화를 방지할 수 있다.
카테콜을 갖는 화합물의 용액에 첨가되는 가교제는 벤조트리아졸릴옥시트리스 (다이메틸아미노) 포스포니움 헥사플루오로포스페이트 (Benzotriazolyloxytris (dimethylamino) phosphonium Hexafluorophosphate; BOP), 하이드록시벤조트리아졸 (Hydroxybenzotriazole; HOBt), 에틸-(다이메틸아미노)프로필카르보이미드 하이드로클로라이드 (ethyl-(N', N'-dimethylamino)propylcarboiimide hydrochloride; EDC), 다이싸이클로헥실카르보이미드 (Dicyclohexylcarbodiimide; DCC), N-하이드록시숙시니미드(N-Hydroxysuccinimide; NHS) 및 소듐 사이아노보로하이드라이드(Sodium Cyanoborohydride)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 아민기와 카르복실기의 결합에 이용되는 가교제의 바람직한 일례로, HOBt 및 BOP; EDC 및 NHS; 또는 DCC 및 NHS일 수 있다. 아민기와 알데히드기의 결합에 이용되는 가교제의 바람직한 일례로, 소듐 사이아노보로하이드라이드(Sodium Cyanoborohydride)일 수 있다.
예컨대, BOP 및 HOBt는 제로오더(zero order) 가교제로서 첨가된다. 가장 바람직한 양태로써, BOP : HOBt : 카테콜을 갖는 화합물의 몰비는 1 : 1 : 1 내지 10 : 10 : 1의 범위인 것이 바람직하다. 몰비가 상기 범위를 벗어나는 경우 반응성이 떨어지는 문제가 있을 수 있기 때문이다.
본 발명에 따른 단계 (c)는 단계 (b)에서 제조된 카테콜을 갖는 화합물 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민(N,N-Diisopropylethylamine: DIPEA)을 첨가하여 반응시키는 단계이다. 본 단계에서 DIPEA는 유기 베이스(base)로서 카테콜을 갖는 화합물 용액에 첨가되며, 첨가 후 약 10 내지 20 분동안 반응시키는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 단계 (d)는 상기 단계 (a)에서 제조된 용액에 상기 단계 (c)에서 제조된 용액을 첨가하여 반응시키는 단계이다. 본 단계의 반응은 상온에서 약 10 내지 14 시간 동안 수행되는 것이 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 단계에 의하여 메톡시 폴리에틸렌글리콜과 카테콜을 갖는 화합물이 접합되어 폴리에틸렌글리콜 유도체가 형성되는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명에 따른 단계 (d)의 용액을 투석하는 (e) 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 단계 (e)는 반응이 끝난 후, 미반응 물질을 제거하기 위하여 투석하는 단계이다. 상기 투석은 분자량 제거량이 2,000 내지 10,000인 투석막을 이용하여 10 내지 14 시간 동안 수행되는 것이 바람직하다. 이때 사용되는 투석 용액은 pH가 1 내지 6인 증류수를 사용하는 것이 바람직하다. 투석과정에서의 pH가 상기 범위를 벗어나는 경우, 카테콜이 산화가 되는 문제가 생길 수 있어 바람직하지 않다.
또한, 본 발명에 따른 단계 (e)에서 투석된 용액을 동결 건조하는 (f) 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 단계 (f)는 백색 가루 형태의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 얻기 위하여, 투석이 완료된 용액을 동결건조하는 단계이다. 이는 당업자에게 자명한 동결건조 방법으로 수행될 수 있으며, 이를 통하여 용매가 승화된 후, 백색 가루 형태의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 얻을 수 있다. 이때, 용매의 완전한 제거를 위하여 추가적인 건조가 수행될 수 있다.
본 발명은 또한,
(a) 반응조 내에 단백질 또는 펩타이드를 용해시키는 단계;
(b) 다른 반응조 내에 하기 폴리에틸렌글리콜 유도체를 용해시키는 단계; 및
(c) 상기 (a) 단계의 용액을 (b) 단계의 용액에 첨가하여 반응시키는 단계를 포함하는,
폴리에틸렌글리콜 유도체가 단백질 또는 펩타이드의 N-말단 아민기에 단일체로 접합되어 있는 단백질 또는 펩타이드와 폴리에틸렌글리콜 유도체의 접합체의 제조방법을 제공한다.
이하, 각 단계를 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 단계 (a)는 N-말단 아민기를 갖는 단백질 또는 펩타이드를 반응조 내에 용해시키는 단계이다. 바람직하게는 완충용액에 용해시킬 수 있으며, 사용되는 완충용액은 인산염 완충용액, 이미다졸 완충용액, 트리메틸필다인 완충용액, 트리에타놀아민 완충용액, 소디움 다이에틸바비투레이트 완충용액, 비신 완충용액, 아미노메틸프로페인다이올 완충용액 중에서 선택된 어느 하나를 사용할 수 있다. 또한, 상기 완충용액의 pH는 5.5 내지 10인 것이 바람직하다. 완충용액의 pH가 5.5 미만일 경우 반응성이 떨어지는 문제점이 있고, 10을 초과하는 경우 단백질 또는 펩타이드 약물의 안정성이 떨어지는 문제점이 있다.
본 발명에 따른 단계 (b)는 본 발명에서 제공하는 폴리에틸렌글리콜 유도체를 다른 반응조 내에 용해시키는 단계이다. 바람직하게는 상기 단계 (a)와 같은 완충용액에 용해시킬 수 있다.
본 발명에 따른 단계 (c)는 본 발명에 따른 단계 (a)의 용액을 (b) 단계의 용액에 첨가하여 반응시키는 단계로, 페길레이션 반응을 수행하는 단계이다. 상기 페길레이션(PEGylation) 반응은 2 내지 100 시간동안, 4 내지 35 ℃에서 수행되는 것이 바람직하다.
또한 폴리에틸렌글리콜 유도체의 활성도를 증가 시킬수 있는 산화제는 바라람직하게는 NaIO4, MnCl2, FeCl2, FeCl3, KMnO4, H2O2, Na2Cr2O7, Na3VO4로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다. 산화제는 폴리에틸렌글리콜 유도체의 용해시에 첨가하여 반응을 진행 할 수 있으며, 이때 첨가되는 산화제는 카테콜기와 1 : 1 내지 1 : 10 의 몰비를 갖는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는 NaIO4를 1.5 : 1의 몰비로 첨가하여 반응을 진행시킬 수 있다. 반응시간이 2 시간 미만이면 폴리에틸렌글리콜의 접합 효율이 낮아지는 문제가 있고, 100 시간을 초과하면 단백질 또는 펩타이드의 안정성이 떨어지는 문제가 있다. 또한, 반응온도가 4 ℃ 미만이면 반응속도가 너무 느려지는 문제가 있고, 35 ℃를 초과하는 경우 단백질 또는 펩타이드가 변형될 수 있는 문제가 있다.
또한, 본 발명에 따른 단계 (c) 이후, (c) 단계의 용액을 투석한 다음 접합체를 분리하는 (d) 단계를 추가로 실시하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 (d) 단계는 상기 페길레이션 반응 완료 후, 미반응 물질을 제거하기 위하여 투석하거나, 또는 액상크로마토그래피(HPLC 또는 FPLC)를 이용하여 분리하는 단계이다. 상기 단계는 당업자에게 자명한 투석방법, 또는 액상크로마토그래피 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아닌 것은 당업자에게 자명할 것이다.
카테콜- 폴리에틸렌글리콜 ( PEG ) 유도체의 합성
카테콜을 갖는 화합물이 결합된 폴리에틸렌글리콜(PEG) 유도체를 합성하기 위하여, PEG의 일례인 메톡시폴리에틸렌글리콜을 사용하고, 카테콜을 갖는 화합물의 일례인 3,4-디하이드록시시나믹산을 이용하였다.
아민기를 말단에 가지고 있는 메톡시폴리에틸렌글리콜 (methoxy-polyethyleneglycol;m-PEG, MW:5k) 1000 mg을 반응조 내의 15 ml의 극성유기용매인 DMF(dimethylformamide) 용액 내에서 3,4-디하이드록시시나믹산 (HCA), 하이드록시벤조트리아졸(HOBt), 벤조트리아졸릴옥시트리스 포스포니움 헥사플루오로포스페이트(BOP), N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA)와 함께 저어 720분간 반응시켰다. 사용된 화합물의 양은 각각 38 mg, 110 mg 및 44㎕ 이었다. 한편, 용매로 사용된 DMF 는 HCA의 카테콜 기의 산화를 방지할 수 있어 반응에 유리하였다.
도 1에 나타난 바와 같은 반응이 완료된 후, 남아있는 미반응물질을 제거하기 위하여, 24시간 동안 투석 과정을 거친 후 동결건조하여, 백색가루 형태의 3,4-디하이드록시시나믹산-PEG를 수득하여, 카테콜을 가지고 있는 PEG 유도체 (이하, mPEG-CT)를 합성하였음을 확인하였다.
mPEG - CT 를 이용한 PEG - 힌지 -3 접합체의 제조 및 제조형태 확인
(1) mPEG - CT 를 이용한 PEG - 힌지 -3 접합체의 제조
폴리에틸렌글리콜 유도체와 펩타이드를 접합시키기 위해 실시예 1의 방법과 같은 방법으로 mPEG-CT를 준비하였다 (도 1). 즉, mPEG-amine (MW:5k) 및 HCA를 DMF 용액 내에서 HOBt, BOP, DIPEA와 함께 반응시켜 mPEG-CT를 수득하였다.
그 후, 약산성 조건에서 (pH 6.5), mPEG-CT 및 힌지-3 펩타이드 (도 2 참조)을 4도에서 혼합하여 반응시켰다. 그 결과, PEG-힌지-3 접합체가 성공적으로 제조되었다.
(2) RP - HPLC 및 MALDI - TOF 를 통한 단일 페길레이션 여부 확인
상기 실시예 2-(1)에서 제조된 PEG-힌지-3 접합체의 형태가 힌지-3 펩타이드에 PEG가 단일체로 접합한 형태인 것인지 여부를 확인하기 위하여, RP-HPLC(Reverse phase-High performance liquid chromatography) 및 MALDI-TOF(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight) 분석을 수행하였다.
HPLC system 은 Agilent 1200 series 를 사용하였으며 column 은 supelco Discovery® BIO Wide Pore C18 5cm * 4.6mm, 3㎛ 를 사용하였다. 이동상은 물 (0.1% TFA) : 아세토나이트릴(0.1% TFA) = 95 : 5에서부터 30분까지 물(0.1% TFA) : 아세토나이트릴 (0.1% TFA) = 5 : 95 로 흘려주고 35분까지 다시 물 95% 로 맞추어 흘려주었다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, RP-HPLC 결과 단 2개의 피크만이 검출되었다. 이 두 피크는 각각 변형되지 않은 힌지-3(16.2분), 단일 페길레이티드 힌지-3(17분)을 나타내는 것으로, 다중 페길레이션 없이 단일 페길레이션만이 일어났음을 확인할 수 있었다.
MALDI-ToF 분석을 위해 아세토나이트릴 (Acetonitrile) 용액 (0.1% 트리프로로아세트산(trifluoroacetic acid : TFA))을 물(0.1% 트리프로로아세트산(trifluoroacetic acid : TFA)) 과 1 : 1 비율이 되게 섞어 준 후, zip tip을 사용하여 tip 끝에 있는 고정상에 단백질을 흡착시킨 뒤 물로 씻어주어 완충용액에 들어있는 염들을 제거하고 1:1의 아세토나이트릴, 물의 혼합액을 사용하여 순수한 PEG-힌지-3 만을 정제하여 MALDI-ToF 용 plate 에 올려 시료를 준비한 후, 분석을 수행하였다. MALDI-ToF 분석 기기는 Applied Biosystems, Inc 사의 Voyager DE-STR 기기를 사용하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, MALDI-TOF 분석 결과 역시 PEG (MW : 5000) 및 단일 PEG-힌지-3 (MW : 7238)만이 검출된 바, 카테콜-폴리에틸렌글리콜 유도체를 이용하여 펩타이드-폴리에틸렌글리콜 접합체를 제조할 경우, 폴리에틸렌글리콜이 단일체로 펩타이드에 접합되었음을 확인하였다.
(3) 트립신 분해를 통한 단일 페길레이션 위치 확인
상기 실시예 2-(1)에서 제조된 PEG-힌지-3 접합체의 형태가 힌지-3 펩타이드의 N-말단 위치에 특이적으로 접합된 형태인 것인지를 확인하기 위하여 tryptic 분해 방법 후 RP-HPLC 및 MALDI-ToF 분석을 시행하였다.
힌지-3이라고 명명된 펩타이드는 20개의 아미노산을 가지고 있다 (도 2 참조). 한편, 노출된 1차 아민, 잠재적 페길레이션 위치는 총 7개로, 라이신(K)의 6개의 엡실론-아민 그룹과 N-말단의 알파-아민 그룹이다. 모든 아민은 페길레이션 자리의 후보자이다 (도 5 참조). 따라서 이 위치들 중 N-말단의 알파-아민그룹에만 페길레이션 되었는지를 확인하였다. 힌지-3 서열은 단 하나의 트립토판 아미노산을 함유하므로(도 2 참조), 트립신 분해로 힌지-3 단백질이 분해될 경우 N-말단에만 PEG가 접합되었는지 여부를 그 절편의 형태를 통해 확인할 수 있었다.
힌지-3 (hinge-3) 펩타이드는 시스테인을 가지고 있지 않기 때문에 4M 유레아 (Urea) 에 녹인 상태로 소량의 염화 칼슘 (CaCl2) 의 첨가 후, 바로 트립신의 양을 단백질의 1/20의 비율로 맞춰 용해시키고 37℃에서 12시간 동안 트립신 분해과정을 실행하였다. 그 후, RP-HPLC 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 6과 같은 그래프가 관측되었다. 280nm UV에서, 트립토판 잔기만이 검출되었다. 이것이 분해된 힌지-3이, T1 절편 (검정 13min)에서 단일피크만을 보이는 이유이다. 만약, 카테콜이 엡실론-아민 (K12, K13, K16, K17, K20)과 반응하였다면, 단일 절편의 피크는 바뀌지 않을 것이다. 그러나, 도 6에 나타난 결과와 같이, 단일 절편의 피크는 확실히 감소하였다 (붉은선). 즉, 카테콜 그룹에 의하여, 피크의 강도는 T1 절편이 존재할 때만 증가하였다. 전 피크 (13분, 붉은선)의 존재는 충분한 희석을 거치지 못하였기 때문이다 (MWCO : 6000에서 희석됨).
RP-HPLC 분석 이후에, 페길레이션 후보자들은 K9와 N-말단 아민만이 남게 된다. 만약에 mPEG-CT가 K9와 반응하였다면, 트립신이 페길레이션된 라이신 (K9)를 인식할 수 없기 때문에, 페길레이티드되고 소화된 절편, 즉 mPEG-CT와 T1+2 절편이 더해진 분자량은 6254.49일 것이다. 따라서 MALDI-ToF 분석을 통하여 mPEG-CT가 어떠한 위치에 페길레이션되었는지를 분석하였다. 분석 방법은 상기 실시예 2-(2)에서 수행된 방법과 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과를 도 7에 도시하였다. 도 7에 따르면 2개의 피크만이 존재한다: 5000, 5883. 이 결과에 따르면, 5000 피크는 mPEG-CT이고, 5883 피크는 mPEG-CT와 힌지-3의 T1 절편 (MW : 899)이 더해진 것이라는 것이 확실하며, mPEG-CT와 T1+2 절편이 더해진 분자량 6254.49는 관측되지 않았으므로, 이 5883 피크는 N-말단 페길레이션의 확실한 증거이다. 이로써, 실시예 2-(1)에서 mPEG-CT를 이용하여 제조된 PEG-힌지-3 접합체는 힌지-3 펩타이드의 N-말단에 PEG가 단일체의 형태로 접합된 형태임을 확인하였다.
mPEG - SS 및 mPEG - CT 를 이용한 PEG - 라이소자임 접합체와의 비교
(1) mPEG - SS 를 이용한 PEG - 라이소자임 접합체의 제조
펩타이드뿐 아니라, 단백질도 N-말단 페길레이션 될 수 있다. 종래, 아민 페길레이션시키는 가장 유용한 방법은 표면 노출된 일차 아민 그룹과 공유결합을 생성할 수 있는 수시니미딜 숙신산 (succinimidyl succinate)를 사용하는 것이었다. 그러나 이러한 방법은 위치 특이적이지 않는 문제가 있었다. 카테콜 그룹과는 달리, 수시니미딜 숙신산은 무작위적인 일차 아민기와 반응하기 때문이다 (도 8). 따라서, 단백질의 예시로서 라이소자임을 이용하여, 카테콜그룹과 수시니미딜 숙신산을 비교하기 위하여, mPEG-SS를 이용하여 PEG-라이소자임 접합체를 제조하였다.
일반적으로 알려진 조건인 pH 8.5에서 mPEG-SS 20mg 과 라이소자임 5mg 을 넣어 4℃에서 12시간 반응을 시켜 PEG-라이소자임 접합체를 제조하였다.
그 결과, PEG-라이소자임 접합체가 제조되었음을 확인하였다.
(2) mPEG - CT 를 이용한 PEG - 라이소자임 접합체의 제조
실시예 1의 mPEG-CT를 이용하여 PEG-라이소자임 접합체를 제조하기 위해서, 실시예 2-(1)과 같은 방법으로 제조하되, 단백질의 특성을 고려하여 pH 8.5에서 mPEG-CT (5k) 5mg을 라이소자임 5mg 과 함께 섞어주고 4도에서 12시간 동안 혼합해 주었다.
그 결과, PEG-라이소자임 접합체가 제조되었음을 확인하였다.
(3) SDS - PAGE Gel 분석 방법을 이용한 단일 또는 다중 페길레이션 여부 확인
상기 실시예 3-(1) 및 3-(2)의 PEG-라이소자임 접합체에 대해 SDS-PAGE Gel분석을 수행하여, 상기 접합체가 단일 페길레이션된 형태인지, 아니면 다중 페길레이션된 형태인지를 확인하였다.
아크릴아마이드(Acrylamide) 분율이 15% 인 SDS PAGE Gel 을 제조하여 전압을 걸어 주어 라이소자임 및 PEG-라이소자임 접합체를 크기에 따라 분리하였다.
그 결과를 도 9에 도시하였다. 도 9의 제1열은 라이소자임만을 대조군으로 건 것이고, 제2열은 실시예 3-(1)의 PEG-라이소자임 접합체, 제3열은 실시예 3-(2)의 PEG-라이소자임 접합체를 로딩한 결과이다. 그 결과, 제2열의 메톡시-폴리에틸렌글리콜 수시니미딜 숙신산 (mPEG-SS)을 이용하여 제조한 접합체는 3개의 아민기와 반응하였다 (밴드가 3개 나타남) (K33, K97, K116). 그러나 제3열에서 확인할 수 있듯이, mPEG-CT를 이용하여 제조한 PEG-라이소자임 접합체는 단 하나의 밴드만을 보인 바, 단 하나의 아민기와 반응하였음을 알 수 있었다. 이로써, 수시니미딜 숙신산-PEG 유도체와는 달리, 카테콜-PEG 유도체의 경우 단백질과 접합됨에 있어, 단일체의 형태로 접합되었음을 확인하였다.
mPEG - CT 를 이용한 PEG - bFGF 접합체의 제조 및 제조형태 확인
(1) mPEG - CT 또는 mPEG - SS 를 이용한 PEG - bFGF 접합체의 제조
bFGF (MW : 17.1 kDa)은 basic Fibroblast Growth Factor이며, FGF의 한 종류이다. 성체 기관에서, 상처 반응 및 조직 재생에 대해 기능 한다. 상기 실시예 2-(1)에서 사용한 방법과 동일한 방법으로 mPEG-CT를 이용하여 PEG-bFGF 접합체를 제조하였으며, 그 결과 PEG-bFGF 접합체가 제조되었음을 확인하였다.
한편, 실시예 3-(1)과 같은 방법으로 mPEG-SS를 이용하여 PEG-bFGF 접합체를 제조하였다.
(2) SDS PAGE Gel 분석을 통한 단일 페길레이션 여부 확인
실시예 2-(2)와 같은 방법으로 PEG-bFGF의 SDS-PAGE 분석 및 MALDI-ToF 분석을 통하여 단일체로 페길레이션되었는지 여부에 대하여 확인하였다. 단 pH 값은 다르게 실험하였다. N-말단 아민의 모든 환경은 다르기 때문에 서로 다른 pKa 값을 가지기 때문이다. bFGF는 pH 6.5에서 페길레이션 여부를 관찰하였다.
그 결과를 도 10A에 도시하였다.
10A 의 2열에 로딩된 단백질은 mPEG-CT 을 사용하여 pH 6.5에서 페길레이션을 한 결과 인데, 기존 bFGF 의 밴드와 모노 페길레이션된 PEG-bFGF 접합체의 밴드, 두 개의 밴드를 관찰 할 수 있었고 3열에 로딩된 단백질은 이를 FPLC 로 분리하여 정제한 모노페길레이션 된 PEG-bFGF 접합체이다. 이로써, 카테콜-폴리에틸렌글리콜 유도체를 이용하여 단백질-폴리에틸렌글리콜 접합체를 제조할 경우, 폴리에틸렌글리콜이 단일체로 단백질에 접합됨을 확인하였다.
(3) 트립신 분해를 통한 페길레이션 위치 확인
실시예 2-(3)과 같은 방법으로 PEG-bFGF의 트립신 분해를 통하여 페길레이션 위치를 확인하였다.
그 결과, 도 10C에 나타난 바와 같이, T1 절편 피크는 7468에서 관찰되었다. 변형되지 않은 bFGF의 T1 절편의 분자량은 2495이므로 (도 10B), 7468 피크는 mPEG-CT (MW : 5000)와 bFGF의 T1 절편 (MW : 2495)이 더해진 것이라는 것이 확실한 바, 이 7468 피크는 N-말단 페길레이션의 확실한 증거이다. 이로써, mPEG-CT를 이용하여 제조된 PEG-bFGF 접합체는 bFGF 단백질의 N-말단에 PEG가 단일체의 형태로 접합된 형태임을 확인하였다.
mPEG - CT 를 이용한 PEG -G- CSF 접합체의 제조 및 제조형태 확인
(1) mPEG - CT 또는 mPEG - SS 를 이용한 PEG -G- CSF 접합체의 제조
G-CSF (Granulocyte Colony-Stimulating Factor; MW : 18.8kDa) 또한 인간 혈액 시스템의 가장 중요한 단백질로써, 골수를 자극하여, 혈류로 방출되도록 하는 역할을 한다. 상기 실시예 2-(1)과 같은 방법으로 PEG-G-CSF 접합체를 제조하였으며, 그 결과 PEG-G-CSF 접합체가 제조되었음을 확인하였다.
한편, 실시예 3-(1)과 같은 방법으로 mPEG-SS를 이용하여 PEG-G-CSF 접합체를 제조하였다.
(2) SDS - PAGE Gel 분석을 통한 페길레이션 여부 확인
실시예 2-(2)와 같은 방법으로 PEG-bFGF의 SDS-PAGE Gel 분석 및 MALDI-ToF 분석을 통하여 단일체로 페길레이션되었는지 여부에 대하여 확인하였다.
그 결과를 도 11에 도시하였다.
도 11A 에 나타난 바와 같이, mPEG-CT 을 사용하여 페길레이션 시킨 결과 기전 G-CSF 와 모노 페길레이션된 G-CSF 밴드만을 관찰할 수 있었고(2열), 이를 FPLC 로 정제한 결과 모노 페길레이션된 G-CSF 만을 분리해 낼 수 있었다(3열). 이로써, G-CSF 단백질에 대하여 단일체로 페길레이션되었음을 확인하였다.
(3) 트립신 분해를 통한 N-말단에 단일 페길레이션되는지 여부 확인
실시예 4-(3)과 같은 방법으로, G-CSF 및 PEG-G-CSF의 트립신 분해를 통하여 페길레이션 위치를 확인하였다.
그 결과, 도 11B에 나타난 바와 같이, G-CSF의 트립신 분해의 MALDI-TOF 결과 T1 절편의 분자량은 1792으로 나타났다. 한편, 도 11C에 나타난 바와 같이 카테콜-PEG-G-CSF의 트립신 분해의 MALDI-TOF 결과 T1의 분자량은 6792로 나타났다. 따라서 위 결과는 T1 절편과 PEG (MW : 5000)이 더해진 결과로 생각되므로, 이로부터 수시니미딜 숙신산-PEG 유도체와는 달리, 카테콜-PEG 유도체의 경우 단백질과 접합됨에 있어, 단일체의 형태로 접합되었음을 확인하였다.
상기 실시예 1 내지 5를 통하여 성공적으로 카테콜을 갖는 화합물이 결합된 폴리에틸렌 유도체(PEG-CT)를 합성하였으며, PEG-CT를 단백질 또는 펩타이드에 접합시킬 경우 단일체의 형태로 N-말단 특이적으로 결합이 가능함을 확인하였다.
소듐 페리오데이트(Sodium Periodate)를 이용한 페길레이션 효율 증진
페길레이션 효율을 증진시키기 위하여, 산화제인 소듐 페리오데이트를 사용하였다. 낮은 pH 조건에서 알파 아민 (N-말단 아민)은 엡실론 아민 (라이신 잔기 아민)에 비하여 NH3+ 양이온 형태로 존재하는 비율이 높다. 그러므로, N-말단 아민만이 페리오데이트에 의해 산화된 퀴논과 반응할 수 있다. 따라서 각기 다른 소듐 페리오데이트 비율 조건에서 페길레이션을 수행하였다.
pH 6.0 의 버퍼용액에 5mg 의 라이소자임, 5mg 의 mPEG-CT 을 녹이고 4℃에서 720분간 반응시켰다. 이때 소듐 페리오데이트는 mPEG-CT 와 각 0, 0.5, 1, 2 : 1 의 비율로 첨가하였다.
대조군 실험은 실시예 3-(2) 와 같이 실험하였다.
그 결과를 도 12, 13에 pH 6.0 이하에서 서로 다른 페리오데이트 비율에서 페길레이션 효율을 비교하여 나타내었다. SDS-PAGE gel의 마지막 컬럼 및 그래프의 pH 8.5의 페길레이션 수율의 값은 화학반응 없이 이루어진 대조군이다. 실험 결과, 가장 수율이 높은 것은 페리오데이트 : 카테콜이 1.5 : 1일 때인 57.94%로 나타났다.
PEG - EPO 접합체의 생체 내 지속시간 확인 ( in vivo )
(1) mPEG - CT 또는 mPEG - SS 를 이용한 PEG - EPO 접합체의 제조 및 확인
에리트로포이에틴 (MW : 30kDa)는 신장에서 생성되는 호르몬으로, 골수에서 적혈구의 생성을 촉진한다. 가장 중요한 기능은 적혈구의 분화와 발생을 촉진하는 것이다. 본 실험에서는 mPEG-CT (MW : 30kDa)를 사용하였는데, 그 이유는 적어도 20kDa의 PEG를 부착하는 페길레이션이 in vivo 환경에서 효과가 있을 수 있기 때문이다.
실시예 2-(1) 및 3-(1)에 기재된 방법으로 제조하되, mPEG-CT와 EPO를 반응시킬 때, 소듐 페리오데이트를 1.5:1의 비율로 첨가하였으며, pH 환경은 7.5였다. pKa 값이 단백질마다 다르므로, 라이소자임에 비하여 다소 높은 pH 조건을 사용하였다. 반응이 끝난 후 PEG 접합된 EPO를 FPLC 시스템 (Shephacryl TM Hiprep 26/60 S-200-HR 320ml)을 이용하여 정제하였다.
그 결과를 도 14 및 도 15에 도시하였다. SDS-PAGE gel 결과에서 알 수 있는 바와 같이, FPLC 과정 이후, EPO 혼합물 (도 15 검은 선, 140분) 및 mPEG-CT-EPO (PEG-EPO, 도 14 2번째 line 또는 도 15 검은선, 98분)이 완벽하게 정제되었다 (도 14 3번째 line). 페길레이션 수득률은 77%였다. MALDI-ToF 결과에서 단일-페길레이티드 EPO를 확인할 수 있었다(data not shown).
mPEG-SS (MW: 20kDa)을 단백질 다중-페길레이션 대조군으로 사용하였다. 단일 페길레이티드 EPO는 105분에서, 2중 페길레이티드 EPO는 95분에서 검출되었으며, FPLC로 정제하였다 (도 15, 붉은 선). 피크는 85분에서 검출되었으며, 이는 접합된 단백질 및 다중-페길레이티드 단백질을 나타내는 것이다. 페길레이션은 mPEG-CT에 비하여 mPEG-SS가 훨씬 낮은 수율로 이루어졌으나, 비교 편의를 위하여 도면에서는 높이를 조정하여 표시하였다.
(2) In vivo 지속 시간 확인
In vivo 약물동태학(pharmacokinetic) 실험을 위하여, 긍정 대조군으로 다중-페길레이티드 EPO, 즉, 상기 실시예 7-(1)에서 제조한 mPEG-SS를 이용하여 제조한 다중 PEG-EPO를 사용하였다.
쥐에 대해 100ug 단백질/kg (쥐 몸무게)의 양을 정맥주사로써 EPO를 투입한 후 In vivo를 순환하는 시간을 측정하였다. 각 단백질에 대하여 다섯 마리의 쥐를 사용했으며, 각 쥐에 ~2.5ug의 단백질을 주입하였다. 이는 컨버젼 인자가 2.56 * 104 mIU 이라고 가정하였을 때, 6.4 * 104 mIU의 EPO에 해당하는 양이다. 플라스마의 단백질들은 ELISA로 정량하였으며, 정량값은 각 단백질 샘플, 즉 PEG-EPO, 다중PEG-EPO와 EPO의 각기 다른 ELISA 항체의 친화도에 따라 조정하였다.
그 결과를 도 16에 도시하였다. 도 16에 나타난 바와 같이 모든 단백질샘플의 반감기는 약 4~96시간으로 측정되었다. 초기 (0.25~4시간)에서 비슷한 경향을 보이기는 하였으나, 정확한 반감기를 측정하기에는 다소 부정확한 결과로 파악된다. 중기 (4~48시간)동안 EPO는 순환하고 있으며, 6시간의 반감기를 가진다. 또한 주사 이후 72시간 동안 혈장 (plasma)에서 검출되지 않았다. 다중 PEG-EPO는 보다 반감기가 길었다 (30시간). 단, 후기 (48~96시간)동안 보다 빠른 반감기를 가졌다 (15시간). 반면에, 단일 PEG-EPO는 가장 긴 반감기 (30시간)을 가졌으며, 가장 긴 시간 (96시간)동안 관찰되었다. 이 결과로부터, 다중 PEG-EPO와 단일 PEG-EPO는 긴 반감기로 인해 보통의 EPO보다 뛰어난 효능을 보였으며, 단일 PEG-EPO가 다중 PEG-EPO보다 뛰어난 반감기를 가짐을 확인하였는 바, 생체 내에서 지속시간이 길어 단백질 약물의 체내 약효 및 안정성을 극대화할 수 있음을 예측 가능하였다.
(3) 생물학적 활성 측정
생물학적 활성을 측정하기 위하여, 피 샘플에 있는 혈액의 용적에 대한 적혈구의 상대적 용적 비율 (hematocrit)을 측정하였다.
쥐로부터 추출한 피에 EDTA 를 섞어 응고를 막은 뒤 VetScan HM5 (회사 : Abaxis) 를 사용하여 적혈구의 상대적 용적 비율 (hematocrit) 을 측정하였다.
그 결과, 도 17에 나타난 바와 같이, 주사 이후 0일에서 3일 동안, EPO와 PEG-EPO는 비슷한 활성을 가졌으며, 7~10일 후에도 그러하였다. 단, EPO는 in vivo 활성을 14일차에 대부분 상실한 반면, PEG-EPO의 경우, 여전히 효과가 유지되었다. 이 결과로부터, 단백질 약물의 화학적 변형이 없는 본 발명에 의할 경우, 단백질 약물의 체내 약효가 뛰어날 것임을 예측 가능하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점을 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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  8. 하기 화학식 1의 카테콜을 갖는 화합물이 결합되어 있는 폴리에틸렌글리콜 유도체의 카테콜이 단백질 또는 펩타이드의 N-말단 아민기에 단일체로 접합되어 있는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드와 상기 폴리에틸렌글리콜 유도체의 접합체:
    [화학식 1]
    Figure 112011025961346-pat00003
    .
  9. 제8항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜은 메톡시알데히드폴리에틸렌글리콜, 숙신이미드프로피온산폴리에틸렌글리콜, 메톡시숙신이미드부탄산폴리에틸렌글리콜, 메톡시숙신이미딜숙신산폴리에틸렌글리콜, 메톡시벤조트리아졸카르본산폴리에틸렌글리콜, 메톡시에폭시드폴리에틸렌글리콜, 메톡시카르보닐이미다졸폴리에틸렌글리콜, 메톡시p-니트로페닐카르본산폴리에틸렌글리콜, 메톡시이소시안산폴리에틸렌글리콜, 1차아민을 포함하는 메톡시아민폴리에틸렌글리콜, 메톡시하이드라지드폴리에틸렌글리콜 및 카르복실기를 포함하는 메톡시카르복실폴리에틸렌글리콜로 이루어진 군에서 선택되는 하나인 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드와 폴리에틸렌글리콜 유도체의 접합체.
  10. 제8항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜은 직선형, 가지형, 브러시형 및 스타형으로 이루어진 군에서 선택되는 하나인 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드와 폴리에틸렌글리콜 유도체의 접합체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 카테콜을 갖는 화합물은 카복실기와 아민기를 포함하는 다이하이드록실페닐알라닌 (3,4-dihydroxy-L-phenylalanine), 아민기를 포함하는 3-하이드록시-타이라민 (3-hydroxy-tyramine), 카복실기를 포함하는 3,4-다이하이드록시하이드로시나믹산 (3,4-dihydroxyhydrocinnamic acid), 알데히드기를 포함하는 3,4 다이하이드록시벤즈알데히드(3,4-dihydroxybenzaldehyde) 및 노어에피네프린 (Norepinephrine)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나인 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드와 폴리에틸렌글리콜 유도체의 접합체.
  12. 제8항에 있어서, 상기 카테콜을 갖는 화합물의 분자량은 1,000 Da 이하인 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드와 폴리에틸렌글리콜 유도체의 접합체.
  13. 제8항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜 유도체의 분자량은 500 내지 100,000 Da 인 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드와 폴리에틸렌글리콜 유도체의 접합체.
  14. 제8항에 있어서, 상기 단백질은 라이소자임(lysozyme), 섬유아세포성장호르몬(bFGF), 과립구콜리니자극인자(GCSF), 에리스로포이에틴(EPO), 상피세포성장인자(EGF), 인간성장호르몬(hGH), 인터페론(IFN), 인터루킨-2(IL-2), 혈관표피세포성장호르몬(VEGF), 루트르이틴호르몬발현호르몬(LHRH), 성장호르몬발현호르몬(GHRH), 유리케이즈(mammalian urate oxidase, uricase), 및 아르기닌 디이미네이즈(arginine deiminase, ADI)로 이루어진 군에서 선택되는 하나인 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드와 폴리에틸렌글리콜 유도체의 접합체.
  15. 제8항에 있어서, 상기 펩타이드는 힌지-7(Hinge-7), 힌지-3(Hinge-3), 부포린(buforin), 히스토닌(histonin), 프로테그린(protegrin), 인돌리시딘(indolicidin), 히스타틴(histatin), BIP, 마가이닌 2(magainin 2), 글루카곤 유사 펩타이드(glucagon-like peptide: GLP-1), GNRH/LHRH 경쟁자(GNRH/LHRHagonist), 소마토스타틴 유사체(somatostatin analogue), 면역조절 펩타이드인 글라티라머(glatiramer), 살몬 칼시토닌(salmon calcitonin), 데스모프레신(desmopressin), 혈소판 응고 억제 펩타이드, 엡티피바타이드(eptifibatide), 및 HIV 세포 유입억제제인 엔푸버타이드(enfuvirtide)로 이루어진 군에서 선택되는 하나인 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드와 폴리에틸렌글리콜 유도체의 접합체.
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  23. 다음의 단계를 포함하는, 하기 화학식 1의 카테콜을 갖는 화합물이 결합되어 있는 폴리에틸렌글리콜 유도체의 카테콜이 단백질 또는 펩타이드의 N-말단 아민기에 단일체로 접합되어 있는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드와 상기 폴리에틸렌글리콜 유도체와의 접합체를 제조하는 방법:
    [화학식 1]
    Figure 112011025961346-pat00022
    .
    (a) 반응조 내에 단백질 또는 펩타이드를 용해시키는 단계;
    (b) 다른 반응조 내에 상기 폴리에틸렌글리콜 유도체를 용해시키는 단계; 및
    (c) 상기 (a) 단계의 용액을 (b) 단계의 용액에 첨가하여 반응시키는 단계.
  24. 제23항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜은 메톡시알데히드폴리에틸렌글리콜, 숙신이미드프로피온산폴리에틸렌글리콜, 메톡시숙신이미드부탄산폴리에틸렌글리콜, 메톡시숙신이미딜숙신산폴리에틸렌글리콜, 메톡시벤조트리아졸카르본산폴리에틸렌글리콜, 메톡시에폭시드폴리에틸렌글리콜, 메톡시카르보닐이미다졸폴리에틸렌글리콜, 메톡시p-니트로페닐카르본산폴리에틸렌글리콜, 메톡시이소시안산폴리에틸렌글리콜, 1차아민을 포함하는 메톡시아민폴리에틸렌글리콜, 메톡시하이드라지드폴리에틸렌글리콜 및 카르복실기를 포함하는 메톡시카르복실폴리에틸렌글리콜로 이루어진 군에서 선택되는 하나인 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드와 폴리에틸렌글리콜 유도체의 접합체의 제조방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 카테콜을 갖는 화합물은 카복실기와 아민기를 포함하는 다이하이드록실페닐알라닌 (3,4-dihydroxy-L-phenylalanine), 아민기를 포함하는 3-하이드록시-타이라민 (3-hydroxy-tyramine), 카복실기를 포함하는 3,4-다이하이드록시하이드로시나믹산 (3,4-dihydroxyhydrocinnamic acid), 알데히드기를 포함하는 3,4 다이하이드록시벤즈알데히드(3,4-dihydroxybenzaldehyde) 및 노어에피네프린 (Norepinephrine)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나인 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드와 폴리에틸렌글리콜 유도체의 접합체의 제조방법.
  26. 제23항에 있어서, 상기 (c) 단계의 용액을 투석한 다음 접합체를 분리하는 (d) 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드와 폴리에틸렌글리콜 유도체의 접합체의 제조방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 (d) 단계에서 접합체를 분리하는 방법은 액상크로마토그래피를 이용하는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드와 폴리에틸렌글리콜 유도체의 접합체의 제조방법.
  28. 제23항에 있어서, 상기 (b) 단계는 폴리에틸렌글리콜 유도체와 산화제를 1:1 내지 1:10의 몰비로 하여 반응조 내에서 용해시키는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드와 폴리에틸렌글리콜 유도체의 접합체의 제조방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 산화제는 NaIO4, MnCl2, FeCl2, FeCl3, KMnO4, H2O2, Na2Cr2O7, Na3VO4로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드와 폴리에틸렌글리콜 유도체의 접합체의 제조방법.
  30. 제23항에 있어서, 상기 (b) 단계의 반응은 2 내지 100 시간동안 4 내지 25도의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드와 폴리에틸렌글리콜 유도체의 접합체의 제조방법.

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