KR100976098B1 - Ｃｈｏ 세포에서 재조합 단백질의 발현 방법 - Google Patents
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Abstract
쥐 IgG 2A 유전자 좌위를 포함하는 발현 벡터를 사용하여 CHO 세포에서 재조합 단백질을 발현시키는 방법.
CHO 세포, 발현 벡터, 재조합 단백질, 트랜스펙션, mCMV 프로모터
Description
본 발명은 CHO 세포주에서 재조합 산물 유전자를 발현하는 방법 및 재조합 CHO 숙주세포 및 신규의 발현 벡터 구조체에 관한 것이다.
중국 햄스터의 난소세포(Chinese Hamster ovary cell, CHO) 포유동물 발현 시스템은 재조합 단백질 생산에 널리 사용된다. 하이브리도마 세포주 등의 림프계 세포주를 제외하면, 이는 동물 세포의 간단하고도 효율적인 고밀도 현탁 회분식 배양(high-density suspension batch culture)을 가능하게 하는 소수의 세포 종류중 하나이다. 게다가, 이들은 매우 높은 생성물 수율을 허락하며, 림프계 세포가 공업적 스케일로 배양하기 좀 더 어려운 반면, 대사적 스트레스에 대하여도 비교적 강하다. 생산 비용이 상당한 것을 가정하면, 가동되는 생물반응기 (bioreactor) 당 재조합 단백질의 수율을 최대화시키는 것이 가장 중요한 문제이다. 배양 배지 조성 및 생물반응기 디자인 및 작동 선택은 수율에 영향을 미치며 최적화하기가 꽤 복잡할 수 있는 변수들이다. 좀 더 예상가능하게는, 생산 단백질의 발현을 제어하는 프로모터 (promoter) 의 세기 (strength) 또는 전사 활성을 증가시키면 수율이 강화된다. 단일 세포 수준에서의 점증적 증가는, 고밀 도 회분식 또는 유가식 (fed-batch) 배양에서 정지기 (stationary phase) 의 유전자 발현이 106 내지 107 세포/㎖ 범위의 세포 밀도로 나타나는, 생산물 수율의 상당한 향상으로 나타날 것이다.
미국 특허 제 5,866,359 호에는, 약(弱) 프로모터로부터 아데노바이러스성 E1A 단백질을 공동 발현시킴으로써 CHO 및 NSO 세포에서 기존의 강(强) hCMV 프로모터로부터의 발현을 강화시키는 방법이 기술되어 있다. E1A 는 세포주기 조절에 작용할 수 있고 독립적인 전사 활성화 및 억제의 기능성 영역들을 모두 가진 다기능성 전사 인자이다. 세포 주기 진행에 대하여 어떠한 부정적인 영향을 주지 않으면서 유전자 간의 전이활성(transactivation) 에 있어서의 이상적인 균형을 성취하기 위하여, E1A 발현을 적당한 낮은 수준의 발현으로 미세조정하는 것이 공동 발현 접근법의 성공에 결정적이다. 단점으로서, E1A 발현을 이끄는 프로모터를 신중히 선택해야 하는 것을 차치하고라도, 이 시스템은 관심의 재조합 단백질을 발현하기 보다는 오히려 E1A 이 발현되는 세포의 단백질 합성 용량의 일부를 차단한다.
WO 95/17516 에는 발현 벡터 구조체를 B-세포 계통의 림프계 세포, 예컨대 널리 사용되는 NSO 골수종 세포 내의 고도로 활성인 유전자 좌위를 표적으로 하도록 하는데 있어서의 쥐 (murine) 면역글로불린 감마 2A 유전자 좌위 (locus) 의 용도가 기술되어 있다. NSO 세포는 본질적으로 쥐의 혈장 또는 B-세포의 종양 세포주이다. B-세포에서만이, 상기 면역글로불린 좌위를 내포하고 있는 염색질이 충분히 활성적인 열린 상태로 있어서, 본래의 면역글로불린 프로모터 또는 이들의 유전자 좌위 내로 통합된 재조합 발현 구조체의 전사 활성이 높다.
단점으로서, 상동 재조합의 원리에 기인한 것으로서, 상기 표적화 서열은 재조합적으로 핫스팟(hot spot)인 영역을 내포하고 있는 상기 감마 2A 표적화 서열의 서열과 일치하는 쥐 세포주에서만 효율적으로 표적화할 것인데; 고도의 발현을 위하여는, 상기 감마 2A 좌위 부위는 그의 상동 재조합에 대한 유효성이 B-세포 유형으로만 제한되는, 전사적으로 활성인 유전자 부위이어야 한다.
본 발명의 목적은 표준 프로모터로부터의 발현이 강화되게 하는, 생물공학에서 CHO 단백질 발현을 위한 또 하나의 발현 시스템을 고안하는 것이다. 본 발명에 따르면, 이 목적은 놀랍게도 CHO 세포를 위한 유전자 발현 벡터에, 최초에 쥐의 B-세포에서의 상동 재조합을 위하여 고안된 유전자 표적화 서열을 부여함으로써 성취된다.
본 발명의 가능한 구현예가 도면에 나타나 있다. 나타난 것은 하기이다:
도 1. CHO-K1 세포의 일시적 트랜스펙션 (transient transfection) 에서 IgG 2A 핫스팟 서열의 존재하에서 hCMV 프로모터로부터의 녹색 형광 단백질 (GFP) 의 상대적인 발현 수준 및 hCMV 프로모터.
도 2. 안정적으로 트랜스펙션된 CHO-K1 세포에서 IgG 2A 핫스팟 서열의 존재하에서 hCMV 프로모터로부터의 상대적인 GFP 발현 수준 및 hCMV 프로모터.
도 3. IgG 2A 표적화 서열을 운반하는 hCMV-MIE 발현 벡터의 플라스미드 지 도.
본 발명에 따르면, 포유동물 세포에서 재조합 유전자의 발현을 위한 DNA 서열은 재조합 산물 유전자 및 상기 재조합 산물 유전자를 발현시키는 프로모터, 바람직하게는 CMV 프로모터를 포함하며, 상기 프로모터로부터의 발현을 강화시킬 수 있는 쥐 면역글로불린 감마 2A 좌위 DNA 서열 또는 이의 절편 또는 서열 변이체를 추가로 포함한다. 본 발명에 따르면, 상기와 같은 DNA 서열은 CHO 세포에서의 재조합 산물 유전자 발현을 위한 유용한 발현 벡터 구조체이다.
본 발명에 따르면, 재조합 단백질을 발현하는 방법은 하기 단계를 포함한다:
a. CHO 세포에서 활성이며 재조합 산물 단백질의 발현을 이끄는 프로모터를 포함하고, 상기 프로모터의 활성을 강화시키는 상기 쥐 IgG 2A 유전자 좌위 DNA 또는 이의 DNA 서열 변이체 또는 DNA 절편을 추가로 포함하는 발현 벡터로 트랜스펙션된 CHO 세포를 배양하는 단계, 및
b. 상기 산물 단백질을 수확하는 단계.
본 발명에 따르는 재조합 산물 유전자는 다량으로 발현 및 수확하고자 하는 산물 단백질이다. 이는 임의의 관심 단백질, 예컨대 인터루킨 등의 치료용 단백질 또는 효소 또는 항체 또는 이의 절편 등의 복합체 단백질의 소단위체일 수 있다. 상기 재조합 산물 유전자는 숙주 생산자 세포로부터 일단 발현된 폴리펩티드가 분비되게 하는 신호서열 코딩 (coding) 서열 부분을 포함할 수 있다. 본 발명의 추가적으로 바람직한 구현예에서, 상기 산물 단백질은 분비된 단백질이다. 좀 더 바람직하게는, 상기 첫번째 또는 산물 단백질은 항체 또는 유전자 조작된 항체 또는 이들의 절편이며, 가장 바람직하게는, 이는 면역글로불린 G (IgG) 항체이다.
상기 쥐 면역글로불린 감마 2A 유전자 좌위 (IgG 2A) 의 DNA 서열은, 상기 재조합 산물 유전자의 발현이 높게 나타나는 안정적 재조합 림프계 B-세포주를 생성하기 위한 표적화 게놈 서열로서의 사용을 위한 것으로서 WO 95/17516 에서 최초에 고안되었다. B 림프구 또는 혈장 세포는, 정상적으로는 Ig 중쇄 좌위로부터의 면역글로불린 RNA를 매우 높은 수준으로 발현하는데, 세포-유형 특이적 인핸서(enhancer)/전사 인자 활성 및 열린 염색질 구조에 기인하는 것으로 추정된다. 본 발명의 바람직한 쥐 면역글로불린 감마 2A 유전자 서열은 WO 95/17516 에서 사용된 표적화 서열과 동일한 것이다. 이는 쥐 Ig 감마 2A 의 코딩 부위에서 CH1 엑손의 대부분의 5’부분을 제외한 모든 부분을 포함하는 5.1 kb BamHI 게놈 절편이다(Yamawaki-Kataoka, Y. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.(1982) 79:2623-2627; Hall, B. 등, Molecular Immunology (1989) 26:819-826; Yamawaki-Kataoka, Y. 등, Nucleic Acid Research (1981) 9:1365-1381). 본 발명에 따르면, 부위특이적 (site-directed) 상동 재조합을 촉진시키는 것은 면역글로불린 감마 2A 유전자 서열 (IgG 2A) 의 관련 특성이 아니다. 따라서, CHO 세포에서의 일시적 또는 안정적 발현 둘 다의 조건하에서 상기 프로모터, 바람직하게는 하기 개시된 바와 같은 hCMV 프로모터로부터의 재조합 산물 유전자 발현을 강화시키는데 기능하거나 또는 강화시킬 수 있는 상기 IgG 2A 유전자 서열 또는 서열 절편의 임의의 서 열 변이체 또는 변이체 서열 절편 역시 본 발명에 포함된다.
이러한 '기능적인' 변이체는, 예컨대, 염기 삽입, 결실 또는 점 돌연변이(point mutation) 를 포괄하며, 당업계에 주지된 방법, 예컨대, 프라이머(primer)-유도 PCR, '오류-유발성' PCR, '유전자 뒤섞기 (gene shuffling)' 로 불리는 중복되는 DNA 절편들의 PCR-재집합으로, 또는 세균성 클론의 생체내 무작위 돌연변이 후 CHO 세포에서 라이브러리 이입(移入) 및 기능적 선별로 생성된다. 예를 들어, 무작위 돌연변이는 Experiments in Molecular Genetics (Miller, J., Cold Spring Harbor Laboratory, 1972) 에 기술된 바와 같이 화학물질을 알킬화시킴으로 또는 UV-조사로 수행될 수 있다. 임의적으로는, 숙주 세균의 천연 변이자주 (mutator-strain) 를 사용할 수 있다.
바람직하게는, 이러한 변이체 서열 또는 서열 절편은, 천연 쥐 면역글로불린 감마 2A 유전자 좌위의 해당 부분에 대하여 DNA 서열에 있어서 65 % 이상, 좀 더 바람직하게는 75 %, 가장 바람직하게는 90 % 의 상동성을 가진다. 예를 들어, 막 엑손 2 (M2) 로부터 39 bp 상류에 존재하는 자연발생적인 Stu I 부위에 Sal I 제한효소 절단부위를 삽입하여 상기 쥐 면역글로불린 감마 2A 서열내에 선형화를 위한 유일한 부위를 제공하는 것이 가능한데; 이러한 서열 변이체는 최초에는 부위특이적 재조합 표적화를 위하여 고안되었으나, 본 발명의 맥락에서 또한 이용될 수 있다.
'프로모터'는 RNA 중합효소 (RNA polymerase) 를 DNA에 결합하도록 지휘하고 RNA 합성을 개시하는 DNA 서열로 정의된다. 본 발명에 따르면, 이는 CHO 세포 에서 활성인 프로모터이다. 이와 같은 프로모터는 바람직하게는 강(强) 프로모터이다. 강(强) 프로모터는 CHO-KI 세포에서 mRNA가 hCMV 코어 (core) 프로모터/인핸서 절편의 빈도수와 같거나 더 높은 빈도수로 개시되게 하는 프로모터이다(US5168062 에 기술됨). 이러한 프로모터는 US5589392 에 언급된 바와 같은 세포 유형 의존성 강(强) 프로모터일 수 있으며, 또는 바람직하게는 어디에서나 활성인 강(强) 프로모터이고, 좀 더 바람직하게는 예컨대 SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터, 인간 거대세포바이러스 (human cytomegalovirus, hCMV) 또는 쥐 거대세포바이러스 (mCMV) 의 극초기 (immediate early) 프로모터, 단순포진바이러스(Herpes Simplex virus) 의 티미딘 인산화효소(thymidine kinase) 프로모터 (TK) 또는 라우스 육종 (Rous Sarcoma) 바이러스 긴 말단 반복서열 프로모터 (RS-LTR) 등의 구조적으로 활성인 바이러스성 프로모터이고, 좀 더 바람직하게는 이는 US 5,385,839 및/또는 EP-323997-A1 에 기술된 2.1 kb Pst I 절편에 의하여 정의되는 hCMV-MIE 프로모터 또는 프로모터 활성을 갖는 이의 기능성 부분이다. EP-323997-A1 에 개시된 바와 같은, hCMV 의 주요 극초기 (MIE) 유전자의 첫번째 기능적 인트론을 완전하게 포함하고 있는 hCMV 프로모터 구조체는 본 발명의 특히 바람직한 구현예이다.
바람직하게는 본 발명에서 이용되는 hCMV 프로모터는 상기 프로모터의 상류의 '조절자' 서열 부분/인핸서 부분을 결여하고 있다. 상기 '조절자' 서열은 CHO 세포에서 hCMV 프로모터 활성에 해로운 것으로 밝혀졌으며, 특히 일시적 트랜스펙션에서, MIE 전사 시작 부위에 대하여 -750 위치에서부터 -1150 위치까지에 걸 쳐 있다(Meier 등, 1996, Intervirology 39:331-342, Regulation of hCMV immediate-early gene expression). 상기 조절자 서열이 없을 때, (조절자 음성의 또는 축약하여 mod-) hCMV 프로모터에 대한 IgG 2A 숙주 스팟 서열이 존재함으로 인한 강화 효과는 훨씬 더 분명하다.
일시적 트랜스펙션은 벡터 매개성 선별 표지자를 위한 임의의 선택압 (selection pressure) 을 적용하지 않는 것이 특징이다. 일시적 트랜스펙션에서 비롯된 세포 풀 (pool) 또는 뱃치 (batch) 는 상기 외래 DNA를 흡수하여 발현시키는 세포 및 상기 외래 DNA를 흡수하지 못하는 세포를 포함하는 풀화된 세포 집단이다. 상기 외래 발현 카세트 (cassette) 를 발현하는 세포는 보통 상기 트랜스펙션된 DNA를 게놈내로 통합시키지 못하였으며, 상기 외래 DNA를 유실하는 경향이 있고, 상기 일시적 트랜스펙션이 가해진 세포 풀을 배양시 상기 집단내에서 트랜스펙션된 세포가 과성장하는 경향이 있다. 따라서, 발현은 트랜스펙션 직후의 기간동안 가장 강하며, 시간에 따라 감소한다. 바람직하게는, 본 발명에 따르는 일시적 형질전환체 (transient transfectant) 를, 선택압의 부재하에서 트랜스펙션후 90 시간까지 세포 배양액에 유지된 세포로 이해하는 것이다.
바람직하게는, 본 발명에 따르는 트랜스펙션된 CHO 숙주세포는 안정적 트랜스펙션이 가해진 숙주세포이고, 특히 상기 기술한 바와 같은 hCMV 프로모터와 결합된 것이다. 안정적 트랜스펙션은, 새롭게 도입한 외래 DNA를, 일반적으로 무작위의 비상동성 재조합에 의하여 게놈 DNA 내로 통합시키는 것을 의미하는데; 벡터 서열인 경우, 본 발명에 따르는 안정적 트랜스펙션으로, 상기 재조합 산물 유전자 의 발현과 직접적인 관련이 없는 벡터 서열 일부, 예컨대 게놈 통합시에 불필요하게 되는 세균 복제수 제어 부위 등이 유실될 수 있다. 트랜스펙션된 숙주세포에 상기 발현 벡터의 적어도 일부 또는 상이한 부분들이 게놈내로 통합된다. 이와 마찬가지로, 적어도 생체내에서 적당한 프로모터 및 핫스팟 IgG 2A 서열의 제어하에, 본 발명의 발현 벡터의 본질적 요소의 기능적 등가물, 즉 산물 유전자를 일으키는 둘 또는 여러 DNA 절편으로 CHO 세포를 트랜스펙션시키는 것이 상기 트랜스펙션된 숙주세포의 정의에 포함된다. 절편화된 DNA 주입 후 기능적 DNA 서열을 생체내에서 조립하는 것이, 예컨대 WO 99/53046 에 기술되어 있다. 이러한 안정적 통합은, 유전자 증폭을 위한 추가적인 선택압에 노출될 때, CHO 세포에서 이배체 (double minute) 염색체를 야기할 수 있다. 이는 '안정적'이라는 용어의 본 발명에서의 의미에 포함된다. 본 발명의 발현 벡터를 CHO 내로 무작위 게놈 통합시킬 때, 표적화 서열이 존재할 경우 재조합 산물 단백질 발현에 대한 프로모터 활성이 강화된다. 이러한 효과는, 형질세포종(plasmacytoma)/골수종 세포주를 포함하는 성숙한 쥐의 B-세포주에서의 상동 유전자 표적화시에는 관찰되지 않았거나 예상할 수 없었던 것이다; 이 점에서, IgG 2A 좌위가 재조합적 '핫스팟'인 것으로 판명된 바, 상기 IgG 2A 표적화 서열만이 홀로 고수율의 상동 통합 성분의 빈도수를 증가시키는데 기능하였다. 앞서 언급한 바와 같이, 면역글로불린 게놈 부위의 염색질은 적당히 표적화된 B-세포주에서는 열려있는 매우 활성인 상태이다.
'발현 벡터'는 본 발명에서, 적절한 포유동물 숙주 세포주에서 벡터로 트랜 스펙션후 전사 및 대응 mRNA 번역에 필요한 DNA 서열로 정의된다. 적절히 구축된 발현 벡터는 보통 하기를 포함한다: 동물 세포에서 선택가능한 하나 이상의 발현 가능 표지자, 프로모터 상류 부위의 제어하에 재조합 산물 유전자를 위한 발현 카세트를 삽입하기 위한 한정된 수의 유용한 제한효소 절단부위. 특히 일시적/에피솜 (episome) 내 발현에만 사용할 경우, 이는 추가적으로 Eppstein Barr 바이러스 (EBV) 또는 SV40 바이러스 원점 (origin) 등의, 진핵 숙주세포에서 자율 복제/에피솜 상태 유지를 위한 복제 원점을 포함할 수 있으나, 선별가능 표지자는 결여할 수 있다. 발현 벡터는, 예를 들어, 이에 한정되는 것은 아니나, 선형 DNA 절편, 핵 표적화 서열을 포함하는 DNA 절편 등이거나, 또는 트랜스펙션 시약과의 상호작용에 특별히 최적화된 것, 동물 바이러스 또는 세균에 수송되어 생산될 수 있는 적당한 플라스미드이다. 티미딘 인산화효소 (tk), 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 또는 글루타민 합성효소 (GS) 등의 흔히 이용되는 임의의 선별 표지자를 사용할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 발현가능한 GS 선별 표지자가 이용된다(Bebbington 등, 1992, High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable selectable marker, Bio/Technology 10:169-175; Cockett 등, 1990, High level expression of tissue inhibitor of metalloproteinases in Chinese Hamster Ovary (CHO) cells using Glutamine synthetasegene amplification, Bio/Technology 8:662-667). 상기 GS-시스템은 치료용 단백질의 생산에 특히 중요한 단 두 가지 시스템 중 하나이다. 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 시스템과 비교할 때, 상기 GS 시스템은, 초기의 형질전환체로부터 종종 생산성이 높은 세포주가 생성되어, 유전자를 증폭시키기 위하여 선택성제의 농도를 증가시키면서 수 회의 선별 단계를 거칠 필요가 없기 때문에, 많은 시간적인 잇점이 있다(Brown 등, 1992, Process development for the production of recombinant antibodies using the glutamine synthetase (GS) system, Cytotechnology 9:231-236). 상기 표지자 유전자 발현을 위한 두번째 전사 단위에 상당하게, 발현 단위가, 예컨대, 당업계에서 일상적으로 이용되는 내부 리보좀 진입 부위 (internal ribosome entry site) 를 이용함으로써, 상기 산물 유전자 및 표지자 유전자 둘 다를 위한 단일 시스트론성 (monocistronic) 발현 카세트를 사용할 수 있는 것은 물론이다. 역으로, 본 발명의 핫스팟 IgG 2A 서열 및 프로모터 및/또는 표지자 카세트를 포함하는, 산물 단백질을 위한 발현 카세트가 단일 발현 벡터에 대하여 시스 (cis) 로 작용할 필요가 없는데; 상기 요소들은 별개의 공동 주입된 벡터 또는 DNA 절편 상으로 운반될 수 있으며 이는 그 후 단일 환상 (concatemeric) 통합 부위에서 염색체 차원에서 통합될 수 있다.
본 발명의 추가적인 목적은 본 발명의 DNA 서열로 트랜스펙션된 CHO 숙주세포이다. 추가적인 목적은 이러한 숙주세포의 트랜스펙션 방법 및 상기 숙주세포에서 재조합 산물 유전자의 발현 방법이다. 본 발명의 명세서의 바람직한 구현예에 기술된 설명 및 참조문헌은 상기 본 발명의 모든 추가적인 목적에도 관련된 것이다. 본 발명의 DNA 서열 또는 벡터로 트랜스펙션된 숙주세포는 일시적으로 또는 안정적으로 트랜스펙션된 세포주인 것으로 해석되어야 함을 주의하여야 한다. 주어진 숙주세포 유형에 적절할 경우, 당업계에 주지된 것들, 예컨대 전기천공법 (electoporation), 인산칼슘 침전법, DEAE-덱스트란 트랜스펙션법, 리포펙션 (lipofection) 등의 임의의 트랜스펙션법을 본 발명에 따라서 이용할 수 있다.
적당한 숙주 세포주는 임의의 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포주일 수 있다(Puck 등, 1958, J. Exp. Med. 108:945-955). '숙주세포'라는 용어는 배양액에서 성장할 수 있고 목적하는 단백질 재조합 산물 단백질을 발현할 수 있는 세포를 지칭한다. 적당한 세포주로는, 예컨대, CHO K1 (ATCC CCL-61), CHO pro3-, CHO DG44, CHO P12 또는 상기 dhfr-CHO 세포주인 DUK-BII(Chassin 등, PNAS 77, 1980, 4216-4220) 또는 DUXB11 (Simonsen 등, PNAS 80, 1983, 2495-2499) 일 수 있다. CHO 세포에서, 면역글로불린 유전자 좌위는 불활성이며, 따라서 염색질은 조밀하게 싸여진 또는 닫혀진 상태이다. 따라서, 상기 특이적인 염색질 상태로 인하여, 상기 발현 카세트의 양측의 염색질의 개방을 촉진시키는 인접 좌위 제어 부위 (flanking locus control region) 를 자체적으로 포함하고 있지 않는 한, 상기 면역글로불린 좌위에 어떠한 유전자 구조체가 통합되더라도 높은 수준의 재조합 단백질 발현을 유도할 수 없을 것이다. 게다가, 면역글로불린 유전자 서열, 및 특히 이의 인트론 부분은 종들 (species) 사이에서, 예컨대 쥐에서 햄스터까지 상당한 차이를 보인다. 면역글로불린 좌위의 프로모터 또는 인핸서 요소는 종 및 조직 둘 다에 특이적이며, B-세포에서만 활성이어야 한다. 본 발명의 쥐 IgG 2A 서열은, 완전한 IgG 중쇄에 대하여 코딩하는 전장 (full-length) 전사물을 야기하는 임의의 천연 면역글로불린 프로모터의 부재하에서도 CHO 세포에서의 유전자 발현을 강화시킨다. 바람직하게는, 본 발명의 IgG 2A 서열은 이러한 프로모터를 결여한다. 놀랍게도, 쥐 IgG 2A 표적화 서열은 심지어 본 발명에 따른 발현 벡터로 CHO 세포을 일시적으로 트랜스펙션시켰을 때 CHO 세포에서의 유전자 발현을 향상시켰는데(도 1); 이러한 일시적 발현은 본 발명에 따르는 방법의 추가적인 바람직한 구현예이다. 통상 트랜스펙션후 약 20 내지 50 시간에 수행하는 일시적 발현 분석법에서, 상기 주입된 벡터는 에피솜내의 요소로 유지되며 그 때까지는 게놈내로 통합되지 않는다.
포유동물 세포주용으로 적당한 배지 및 배양 방법은 당업계에 주지되어 있는데, 예를 들어 US 5633162에 기술된 것과 같다. 특정 세포 유형의 필요에 맞게 준비된 실험 플라스크용 또는 저밀도 세포 배양용 표준 세포 배양 배지의 예는 예를 들어 다음과 같다: Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 배지 (Morre, G., The Journal of the American Medical Association, 199, p 519 f.1967), L-15 배지 (Leibovitz, A. 등, Amer. J. of Hygiene, 78, 1p. 173 ff, 1963), 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM), 이글 최소 배지 (Eagle's minimal essential medium, MEM), Ham's F12 배지 (Ham, R. 등, Proc. Natl. Acad. Sc. 53, p288 ff. 1965) 또는 알부민, 트랜스페린 (transferrin) 및 레시틴 (lecithin) 이 결여된 이스코브 변형 DMEM (Iscoves 등, J. Exp. med. 1, p.923 ff., 1978). 예를 들어, Ham's F10 또는 F12 배지는 특히 CHO 세포 배양을 위하여 고안되었다. CHO 세포 배양에 특히 적합하게 제조된 다른 배지는 EP-481 791 에 기술되어 있다. 이러한 배양 배지를 소 태아 혈청 (FBS, 송아지 혈청(fetal calf serum, FCS) 으로도 불림) 으로 보충할 수 있는 것이 공지되어 있는데, 후자는 과다 호르몬 및 성장 인자의 천연 원천을 제공한다. 포유동물 세포의 세포 배양은 요즘에는 과학 교과서 및 안내서에 잘 기술되어 있는 일상적인 작업인데, 이는, 예컨대, Culture of Animal cells, a manual, 4번째 판, (R. Ian Fresney, Wiley-Liss/N.Y., 2000) 에서 상세히 다루고 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따르는 세포 배양 배지는 송아지 혈청 (FCS 또는 FBS) 이 결여된 것이며, 이를 이후 '무혈청'으로 지칭할 것이다. 무혈청 배지 중의 세포는 최적의 성장을 위하여 일반적으로 무혈청 배지내에 인슐린 및 트랜스페린을 필요로한다. 트랜스페린을 적어도 부분적으로는, WO 94/02592 에 기술된 바와 같은 트로폴론(tropolone) 등의 비펩티드 킬레이트제 또는 사이더로포어(siderophore) 또는, 이롭게는 비타민 C 등의 항산화제와 함께의 증가된 수준의 무기 철 원천으로 치환할 수 있다. 대부분의 세포주는, 예컨대 표피성장인자 (EGF), 섬유아세포 성장인자(FGF), 인슐린 유사 성장인자 I 및 II (IGFI, IGFII) 등을 포함하여 하나 이상의 합성 성장인자(재조합 폴리펩티드 함유)를 필요로한다. 필요할 수 있는 다른 부류의 인자로는 하기가 있다: 프로스타글란딘 (prostaglandin), 수송 및 결합 단백질 (예컨대, 세룰로플라스민(ceruloplasmin), 고- 및 저밀도 지질단백질, 우 혈청 알부민 (BSA)), 스테로이드성 호르몬을 포함하는 호르몬 및 지방산. 폴리펩티드 인자 검사는 성장 자극적인 것으로 밝혀진 것들의 존재하에서 신규의 폴리펩티드 인자들을 시험하는 순차적 양식으로 수행하는 것이 가장 좋다. 상기 성장인자들은 합성적이거나 재조합된 것이다. 여 러 방법론적 접근법이 동물 세포 배양에서 주지되어 있으며, 실례가 하기에 기술된다. 초기 단계는 혈청-보충 배양 배지로부터 이동시킨 후 3 내지 6 일동안 세포가 생존하거나 및/또는 느리게 성장할 조건을 획득하는 것이다. 대부분의 세포 유형에서, 이는 적어도 부분적으로는 접종 농도의 기능이다. 최적의 호르몬/성장인자/폴리펩티드 보충물이 발견되면, 생존에 필요한 접종 농도는 감소될 것이다. 좀 더 바람직한 구현예에서, 상기 세포 배양 배지는 단백질이 없는 것인데, 즉, 태아 혈청 및 개별 단백질 성장인자 보충물 또는 재조합 트랜스페린 등의 다른 단백질 둘 다가 없는 것이다.
본 발명의 한 가지 방법, 즉 재조합 산물 단백질 발현 및 수확의 가능한 구현예는, 예를 들어 공업적 유가식 생물반응기에서, 상기 동물 숙주세포의 고밀도 성장이다. 그 후, 통상적인 분리정제 (downstream processing) 를 적용할 수 있다. 따라서, 고밀도 성장 배양 배지를 이용하여야 한다. 이러한 고밀도 성장 배지는 보통 전체 아미노산 등의 영양물, 주어진 범위의 포도당 등의 에너지원, 무기염, 비타민, 미량원소 (trace element) (통상 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로 정의됨), 완충제, 4 개의 뉴클레오시드 또는 이들의 대응 뉴클레오티드, 항산화제, 예컨대 글루타치온 (환원), 비타민 C, 및 예컨대 콜레스테롤 또는 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine) 등의 중요 막지질 또는, 예컨대 콜린 또는 이노시톨 등의 지질 전구체 등의 기타 성분들로 보충될 수 있다. 고밀도 배지는 상기 화합물 대부분 또는 전부로 보충될 것이며, 본질적으로 등장인 배지의 삼투압을 조절하는 무기염을 제외하고는, RPMI 1640 과 비교해 볼 때, GB2251 249 로부터 유추할 수 있는 바, 상기 언급한 표준 배지보다 이들을 더 많은 (강화된) 양으로 함유할 것이다. 바람직하게도, 본 발명에 따르는 고밀도 배양 배지는, 트립토판을 제외한 모든 아미노산이 배양 배지 하나당 75 ㎎ 을 초과한다는 점에서 균형적으로 강화된다. 바람직하게는, 일반적인 아미노산 요구와 관련하여, 글루타민 및/또는 아스파라긴은 고밀도 배양 배지 하나당 1 g, 좀 더 바람직하게는 2 g 을 초과한다. 본 발명의 맥락에서, 고밀도 세포 배양은 생존 세포의 밀도가 일시적으로 105 세포/㎖ 이상 또는 이를 초과하는, 바람직하게는 106 세포/㎖ 이상 또는 이를 초과하는 동물 세포 개체군으로 정의되며, 상기 개체군은, 배양물 부피가 일정하거나 증가하는 세포 배양 배지에서, 생존 세포 밀도가 좀 더 낮은 단일 세포 또는 접종원 (inoculum) 으로부터 지속적으로 성장해 온 것이다.
추가적인 바람직한 구현예에서, 상기 유가식 배양은, GB2251249 에 기술된 바와 같이, 별도의 공급에 의하여 포도당 농도를 조절하는 것은 별문제로 하고, 상기 배지에서 세포 농도를 유지시키기 위하여 상기 세포 배양액에 임의적으로는 하나 또는 여러 개의 다른 아미노산, 바람직하게는 글리신과 함께, 적어도 글루타민을 공급하는 배양 시스템이다. 좀 더 바람직하게는, EP229 809-A 에 기술된 바와 같이, 상기 세포 배양물에 글루타민과 임의적으로 하나 또는 여러 개의 아미노산을 공급하는 것을, 포도당 등의 하나 이상의 에너지원을 공급하는 것과 겸한다. 공급은 보통 배양 시작 후 25 내지 60 시간에 시작되는데; 예를 들어, 세포 농도가 약 106 세포/㎖ 에 도달했을 때 공급을 시작하는 것이 유용하다. 배양된 동물세 포에서, '글루타민분해 (glutaminolysis)'가 증식기 동안 중요한 에너지원이 될 수 있다는 것이 당업계에 주지되어 있다(McKeehan 등, 1984, Glutaminolysis in animal cells, in: Carbohydrate Metabolism in Cultured Cells, ed. M. J. Morgan, Plenum Press, New York, pp.11-150). 글루타민 및/또는 아스파라긴 (글루타민을 아스파라긴으로 치환시, 참조: Kurano, N. 등, 1990, J. Biotechnology 15,113-128) 총 공급량은 보통 배양물 부피 1 ℓ당 0.5 내지 10, 바람직하게는 1 내지 2 g 범위이고; 상기 공급물에 존재할 수 있는 다른 아미노산은 배양물 1 리터당 총 공급량 10 내지 300 ㎎ 의 범위이고, 특히 글리신, 라이신, 아르기닌, 발린, 이소류신 및 류신이 통상 다른 아미노산과 비교하여 150 내지 200 ㎎ 이상의 더 많은 양으로 공급된다. 상기 공급물은 한 번의 공급 (shot-addition) 으로 또는 지속적으로 주입되는 공급으로 첨가할 수 있는데, 바람직하게는 상기 공급물을 상기 생물반응기에 거의 지속적으로 주입시킨다. 생물반응기에서의 유가식 배양 동안에 pH 를 염기 또는 완충제를 첨가하여 주어진 세포주에 최적인 대략적으로 생리학적인 pH 로 주의깊게 조절하는 것은 말할 것도 없다. 에너지원으로 포도당을 사용할 때, 총 포도당 공급량은 보통 배양물 1 리터당 1 내지 10, 바람직하게는 3 내지 6 그램이다. 아미노산 포함여부는 차치하고, 상기 공급물은 바람직하게는 배양물 1 리터당 5 내지 20 ㎎ 범위의 적은 양의 콜린을 함유한다. 좀 더 바람직하게는, US 6048728 에 기술된 바와 같이, 이러한 콜린 공급을 필수적으로 에탄올아민 공급, 특히 글루타민 공급과 겸한다. 내인적으로 생산된 것 외의 과량의 글루타민 축적은 암모니아 생산 및 부수적인 독성을 야기할 것이기 때문에, 비-GS 발현 시스템과 비교하여 GS-표지자 시스템 사용시 보다 적은 양의 글루타민이 필요하리라는 것은 물론이다. GS 에 있어서, 배지 또는 공급물 중의 글루타민은 대부분 그의 등가물 및/또는 전구체, 즉 아스파라긴 및/또는 글루타메이트로 치환된다.
본 발명의 추가적인 독립적인 목적은, 숙주세포에서 발현시 산물 단백질을 일으키는 산물 유전자를 위한 하나 이상의 (첫번째) 전사 단위체를 포함하고, 상기 전사 단위체는 마우스 거대세포바이러스 프로모터 (mCMV 프로모터) 의 제어하에 있으며, 추가적으로 글루타민 합성효소 (GS) 표지자 유전자를 포함하는 두번째 전사 단위체를 포함하는 발현 벡터를 고안하는 것이다. 이와 같은 산물 유전자 또는, 지칭될 수 있는 바, 관심 유전자 (GOI) 는, 예컨대 면역글로불린 코딩 서열일 수 있다. 글루타민 합성효소 표지자 유전자는 효소적으로 활성인 임의의 GS 코딩 서열인데, 이는 천연의 유전자 서열이거나 이의 변이체이다. 상기 개시한 바와 같은 '기능적 변이체'의 상기한 정의는 본원에서 바람직한 범위의 서열 유사체를 또한 포함하여 적용된다. 바람직하게는, 상기 GS 표지자 유전자는 포유동물 GS 표지자 유전자이거나 이의 유도체이다. 놀랍게도, 이러한 발현 벡터는 CHO 세포에 주입시, 예컨대 상기 관심 유전자를 가진 첫번째 전사 단위체가 hCMV 프로모터의 제어하에 있는 발현 벡터보다 트랜스펙션율이 훨씬 더 높다. CHO 세포에서, 상기 mCMV 프로모터의 전사 활성이 hCMV 프로모터의 전사 활성보다 훨씬 더 높은 사실에도 불구하고, 보통 트랜스펙션시, 대사 부하가 더 높을 경우 트랜스펙션시 클론 생존을 감소시키고, 이는 형질전환체의 수를 감소시키는 것으로 여겨 진다. 따라서, 상기 효과는, 발현되는 산물 단백질의 양 또는 형질전환체의 증식에 부정적 영향을 끼칠 가능성이 있는 예기치 못한 독성과는 명백한 방식으로는 관련이 없을 수 있다. 실제로, 상기 발견은 당업계의 숙련된 자의 어떠한 예상과도 정반대되는 것이다.
본 발명에 따르는 추가적인 목적은, 에피솜 내의 요소로 유지되거나 또는 게놈 내로 안정적으로 통합될 수 있는 상기와 같은 발현 벡터 및 각각의 트랜스펙션 방법으로 트랜스펙션된 동물 숙주세포, 특히 CHO 세포이다. 마찬가지로, 동물 세포, 특히 CHO 세포를, 생체내에서 본 발명의 본 목적의 전사 단위체의 기능성 등가물을 일으키는 두 개 이상의 유전자 절편으로 트랜스펙션시키는 것은 이러한 트랜스펙션된 숙주세포의 정의에 속한다. 바람직하게는, 상기 숙주세포는, 상기 첫번째 및 두번째 전사 단위체가 염색체 내로 통합되는 것을 의미하는 안정적으로 트랜스펙션된 세포이다.
추가적인 목적은, 바람직하게는, 산물 유전자를 위한 적어도 하나 이상의 전사 단위체를 포함하고, 글루타민 합성효소 (GS) 표지자 유전자를 추가적으로 포함하며, 이때 첫번째 단위체가 숙주세포에서 발현시 산물 단백질을 야기하고 상기 첫번째 전사 단위체는 추가적으로 쥐 거대세포바이러스 프로모터 (mCMV 프로모터) 의 제어하에 있는 발현 벡터를 사용할 때, CHO 세포에서 트랜스펙션율을 강화시키기 위하여 mCMV 프로모터를 사용하는 것이다. 또한, 상기 첫번째 및 두번째 발현 단위체가 상이한 벡터들에 내포된 것을 트랜스펙션하거나 또는 개별적인 발현 단위체를 포함하고 있는 분리된 유전자 절편으로 트랜스펙션하는 것도 가능하다. 추가적으로, GS 에 대하여 이미 재조합형이며 GS 를 발현하는 CHO 세포를 mCMV 를 포함하고 있는 첫번째 전사 단위체를 이용하여 트랜스펙션시키는 것도 가능할 수 있다. 본 발명에 따르면, '트랜스펙션율 강화'는, 본 발명에 따르는 mCMV 프로모터 및 발현 벡터의 존재하에서의 트랜스펙션율을, 상기 발현 벡터에서 상기 mCMV 프로모터를 US 5658 759 에서 정의된 바 및 예컨대 본 발명의 서열번호 3 에 개시된 바와 같은 hCMV-첫번째 인트론 인핸서/프로모터 구조체로 치환시킨 것을 제외하고는 동일한 트랜스펙션 조건 및 세포 배양 조건하에서의 상기 동일 발현 벡터 및 숙주세포의 트랜스펙션율과 비교함으로써 정의된다. 주어진 동일한 산물 유전자에 대한 이러한 hCMV-인트론 MIE-프로모터 구조체는 강화된 트랜스펙션율의 청구된 효과를 결정하는 기준으로 기능한다. 바람직하게는, mCMV 프로모터를 사용하면 트랜스펙션율이 10 배 이상 강화된다.
상기 추가적으로 제시된 모든 관련 정의는 본 발명의 현(現) 독립적인 목적에 마찬가지로 적용된다. 본 발명의 본 목적이 필수 조건으로 쥐 IgG 2A 표적화 서열의 존재를 필요로하지 않는다는 것이 강조되어야 한다.
쥐 거대세포바이러스 (mCMV) 는 매우 다양한 헤르페스 바이러스 (Herpesviridae) 군의 일원이다. 상기 상이한 숙주 종의 거대세포바이러스들 중에서조차 편차가 넓을 수 있다. 예를 들어, mCMV 는 생물학적 특성, 극초기 (IE) 유전자 구성 및 전체 뉴클리오티드 서열에 있어서 인간 거대세포바이러스 (hCMV) 와는 상당히 다르다. mCMV 의 235-kbp 게놈 역시 hCMV 의 특징인, 큰 내부 및 말단 반복 부분을 결여하고 있다. 따라서, mCMV 게놈의 어떠한 이성질체도 존재하지 않는다(Ebeling, A. 등, (1983), J. Virol. 47,421-433; Mercer, J. A. 등, (1983), Virology 129, 94-106). 본 발명에 따르면, 본질적으로 US 4968615 에 기술된 2.1 kb 의 큰 PstI 절편 또는 이의 임의의 기능성 절편에 해당하는 프로모터 부위를 이용하는 것이 가능하다. 좀 더 바람직한 구현예에서, 이용되는 mCMV 프로모터 절편은 전사 시작 부위 (+0) 를 포함하며 약 -500 위치까지 상류로 확장된다. 놀랍게도, 이러한 절편은 -500 위치 초과의 상류로 추가로 800 bp 확장된 프로모터 카세트보다 더 강력한 발현을 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 가장 바람직한 구현예에서, 전사 시작 부위로부터 상류로, 상기 천연 전사 시작 부위로부터 약 -150 위치에 있는 Xho I 제한효소 절단부위까지 확장되거나 심지어 상기 천연 전사 시작 부위로부터 약 -100 위치까지 확장되는 코어 프로모터 부위를 이용한다. 상기 재조합 산물 유전자의 삽입을 위한 적당한 제한효소 절단부위를 포함하도록 하기 위하여 상기 전사 시작 부위를 유전자 조작할 수 있음은 말할 것도 없다.
본 발명에 따르면, 상기 mCMV 프로모터의 제어하에 있는 상기 첫번째 전사 단위체는 하나 이상의 인트론 서열을 내포하고 있다. RNA 전사물을 안정시키고 상기 대응 mRNA 로부터의 효율적인 단백질 합성을 촉진하기 위한 방법은 당업계에 주지되어 있다. 그러나, 청구된 트랜스펙션율의 효과와 관계없이 효율적인 단백질 합성을 위하여는, 상기 mCMV 프로모터 구조체 내에 mCMV 의 첫번째 천연 인트론을 포함하는 것은 현명하지 않다. hCMV 프로모터를 이용한 상황 (US 5591639 참조) 과는 대조적으로, 이러한 mCMV 의 천연 첫번째 인트론은 mCMV 프로모터로부 터 재조합 유전자 발현을 감소시키는 것으로 나타났으며, 따라서 추가적인 바람직한 구현예에서 배제된다.
GS 표지자 유전자 카세트의 가능한 바람직한 구현예의 예가 서열목록에서 제공된다. 서열번호 1 (pEE 15.1 hCMV/GFP + 핫스팟) +2 (pEE 14.4 hCMV/GFP) 는, 상기 hCMV 프로모터의 제어하에 있는 GFP (녹색 형광 단백질) 를 위한 발현 카세트를 추가로 포함하는 약한 내지 중간 수준의 프로모터인 SV40 (각각 초기 및 후기) 프로모터로부터 발현되는 적당한 GS-유전자 카세트의 예를 제공한다. 서열번호 1 은 도 3 에 좀 더 상세히 기술된, SV40 초기 프로모터의 제어하에 있는 GS cDNA 서열을 기술한다. 서열번호 2 는 SV40 후기 프로모터의 제어하에 있는 인트론을 포함하는 인공적인 GS-소형 유전자 (GS-minigene) 를 상술한다. CHO 세포는 자연적으로는 글루타민 요구적 (glutamine auxotrophic)이지 않으며, 따라서, 예컨대 High level expression of tissue inhibitor of metalloproteinases in Chinese Hamster Ovary (CHO) cells using Glutamine synthetase gene amplification (Cockett 등, 1990, Bio/Technology 8:662-667) 에 기술된 바와 같은 선별 전략을 적용할 수 있다. CHO 세포를 위한 적당한 트랜스펙션 방법의 예는 상기 문헌에 동일하게 제시되어 있는데; 예컨대, 고전적인 인산칼슘 침전법 또는 좀 더 현대적인 리포펙션 기법을 이용하는 것이 가능하다. 트랜스펙션율은 통상, 트랜스펙션이 가해진 세포 풀로부터 수득한 양성적으로 트랜스펙션된 세포 (일시적 트랜스펙션) 또는 클론 (선별 기간 후의 안정적 트랜스펙션) 의 수로 정의된다. 본 발명의 본 목적의 취지된 효과는, 예컨대, CHO-K1 세포를 서열번 호 3 (pEE 12.4 hCMV-GFP + SV40 초기 프로모터/GS cDNA) 또는 서열번호 4 (pEE 12.4 mCMV-GFP + SV40 초기 프로모터/GS cDNA) 둘 중 하나의 플라스미드를 이용한 리포펙션으로 트랜스펙션시킴으로써 알 수 있다. 트랜스펙션된 세포는 임의의 통상적인 배양 배지에서 증식시킬 수 있다. 상기 배양 배지는 상기 정의한 바와 같이, 태아 혈청-보충된 또는 무혈청의 배지일 수 있다. 바람직하게는, 상기 세포 배양 배지는 혈청-보충된 배지이며, 좀 더 바람직하게는 1 % (v/v) 이상의, 송아지 혈청 또는 우태아혈청 등의 태아 혈청이 보충된 세포 배양 배지, 가장 바람직하게는 5 % (v/v) 이상의 태아 혈청이 보충된 배지이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 수행되는 트랜스펙션 방법은 전기천공법이다.
실험
실험 1
CHO-K1 세포에서 핫스팟 서열을 포함하는 GFP 벡터의 일시적 및 안정적 발현
CHO-K1 세포 (ATCC CCL-61) 를 10 % FCS 를 함유한 정상 세포 배양 배지 GMEM-S (Gibco, UK) 에 적응시키고 거기에서 배양하였다. GS 선별을 위하여는, 상기 배지를 하기 표 1에 개시한 바와 같이 글루타민이 완전히 제거되어 있어야 하는데; 이는 투석된 FCS 를 사용을 요한다. 모든 배양은 36.5 ℃ 의 진탕 플라스크에서 125 rpm 의 회전 진탕으로 수행하였다. 트랜스펙션을 위하여 리포펙션 (Superfectinz, Gibco, UK) 을 사용하였고, 488 nm 에서의 자극을 가진 FACS 에서 형질전환체 풀의 녹색 형광을 측정하였다. 모든 GS/GFP 벡터 구조체에 대하 여, 트랜스펙션을 독립적으로 5 번씩 수행하였는데, 모든 자료는 독립적으로 분석된 5 개의 풀로부터의 평균치이다. 트랜스펙션 후 48 시간째의 일시적 형질전환체로 시작하여 세포수 대 형광성 도표에서 생존 세포 풀 중 발현성이 높은 상위 10 % 의 세포들을 선별하여 평균 형광성을 측정하였다(도 1). 전방 대 측방 산란 도표에서 게이팅 (gating) 으로 생존 세포 개체군을 예비 선별하였다.
안정한 형질전환체를 생성하기 위하여, 25 μM 의 MSX (메치오닌 술폭시민, Crockett 등, ibd.) 이 함유된 글루타민-제거된 배지를 보충하고 배양물을 정기적으로 분리하면서 26 일간 세포 배양을 계속하여 트랜스펙션 후 24 시간째에 GS 표지자를 선별하였다. 다른 아미노산의 배지 수준이 선별을 위한 MSX 의 효력에 미치는 영향을 주의하여야 한다(참조: Bebbington 등, US 5827 739). 그 후 상기 개요한 바의 형광 분석을 다시 수행한다(도 2).
트랜스펙션되지 않은 세포는 음성 대조군으로 기능하였다. CMV 의 첫번째 완전한 인트론을 포함하는 hCMV 프로모터의 제어하에 GFP 발현을 이끄는 핫스팟 벡터 (pEE 15.1 'hCMV + 핫스팟') 이 서열번호 1에 제시되어 있으며, 이는 본질적으로 GFP 서열이 폴리링커 (polylinker) 내의 Eco RI 제한효소 절단부위 내로 삽입된, 도 3 에 나타난 pEE 15.1 벡터이다. 서열번호 3 에 해당하는 pEE 12.4 'hCMV'는, IgG 2A 서열을 내포하고 있는 5.1 kb Bam H1 절편을 포함하지 않는 것을 제외하고는, pEE 15.1 'hCMV + 핫스팟'과 동일하다. pEE 12.4 는 벡터 대조군으로 기능하였다. 번역 시작 부위와 일치하는 클로닝 부위의 Kozak 서열 (GCCGCCA
CC
ATG
G) 을 프라이머 특이 돌연변이 (primer directed mutagensis) 를 이 용하여 격자이동된 (frameshifted) 기능성 Kozak 서열 (ACCATG
GTCC
ATG
G) 로 변이시켜 (Sambrook 등, Molecular cloning, Cold Spring Harbor 1983) 본래의 Kozak 및 번역 시작 부위가 희박한 추가적인 벡터 대조군인 pEE 12.4 'hCMV(Kozak-)'을 생성하였다. 서열번호 1 의 벡터를 추가적으로 유전자 조작하여 hCMV 인핸서 부분의 400 bp 조절자 (modulator) 부위를 제거하여 상기 전사 시작 부위로부터 -750 위치의 상류에 있는 인핸서 요소들을 제거함으로써 pEE 15.1 'hCMV(mod-)/GS cDNA'를 일으켰다. pEE 15.1 의 GS cDNA 카세트 (도 3 참조) 를 서열번호 2 에 해당하는 pEE 14.4 'hCMV(mod-)'/GFP 의 GS 소형 유전자로 교환함으로써, 벡터 pEE 15.1 'hCMV(mod-)/GS 소형 유전자'를 생성하였다. 따라서, 트랜스펙션된 모든 세포는 상기 GFP 코딩 서열을 포함하는 플라스미드 벡터를 내포하였다. GS 소형 유전자는 상기 GS 유전자의 단일한 첫번째 인트론 및 SV40 후기 프로모터의 제어하에 있는 약 1 kb 의 3' 말단 DNA를 포함하는데; 상기 게놈 GS DNA 의 3' 부분은 형질전환된 세포에서 벡터 DNA, 따라서 GS 의 복제수를 높이는 것으로 여겨진다(참조: US4770359, Bebbington 등). 본 연구에 이용된 모든 hCMV 벡터가 그의 cDNA 서열로부터 GS 표지자 유전자를 발현하므로, GS 복제수 및 발현 수준의 잠재적 효과를 배제하기 위하여 추가적인 대조군으로서 상기 GS 소형 유전자 사용을 추가하였다.
안정적으로 트랜스펙션된 CHO 세포의 생성 및 발현을 위하여, 선형화된 핫스팟 벡터인 pEE 15.1 'hCMV+핫스팟' 벡터를 이용하여 트랜스펙션을 수행하였다. Sal I 선형화 플라스미드의 IgG 2A 포함 서열 부위를 절단하고, 상기 DNA 말단 부분과 어느 정도 상동성을 공유하는 게놈 부위로의 재조합을 잠재적으로 자극하는 유리된 DNA 말단을, 햄스터 CHO 세포 내에서 쥐 IgG 2A 의 잠재적 표적화 효과가 있는지에 대하여 검사하였다. Pvu I 로 세균성 락타마제 (bacterial lactamase) 표지자 유전자를 절단하여 이종 (heterogenous) 무작위 재조합을 촉진시킬 수 있었다. 실제로, 평균 형광성은 Pvu I 선형화 형질전환체들에서 더 높았는데, 이들은 다소간의 벡터 선형화의 영향 및 CHO 세포 내의 면역글로불린 좌위에 대한 표적화 둘 다를 나타내었으며, 이는 본 발명의 효과를 설명하지 못할 수 있다. 덧붙여, 강화된 프로모터 활성의 효과는 일시적으로 형질전환된 세포 개체군에서는 일관되게 관찰되었는데, 이는 개별 벡터 구조체들의 관련 세기와 적절히 관련된다. 분명히, 게놈 통합은 트랜스펙션의 이러한 초기 단계에 연루된 것은 아니다.
도 3 은 대략 12,830 bp 인 pEE 15.1 벡터를 나타낸다. GS 표지자 및 hCMV-p/인트론 발현 카세트에 대한 상세한 설명은 US5827739 및 US5591639 에서 찾을 수 있다. pEE 15.1 은, 상기 재조합 산물 단백질에 대하여 코딩하는 DNA 서열이 아직 상기 폴리링커 부위에 삽입되지 않은 것을 제외하고는, 본 발명에 따르는 발현 벡터의 가능한 구현예이다. GFP 를 내포한 상기 pEE 15.1 구조체 의 완전한 13,535 bp 서열이 서열번호 1 에 제시되어 있다: 거기에서, 상기 GFP 코딩 서열을 염기 위치 12,814 에 위치한 Eco R I 제한효소 절단부위 내로 인프레임 (inframe) 으로 삽입시켰다; ATG 시작 코돈 (codon) 을 내포하며 상기 시작 코돈의 Kozak 서열 환경을 최적화하는 유일한 제한효소 절단부위를 도입하는 것은 US 5591639 에 상세히 기술되어 있다. 따라서, GFP 단백질 발현은, hCMV-주요 극초기 유전자 프로모터 (hCMV-MIE 또는 짧은 서열을 위하여는 hCMV) 의 제어하에 있으며, 그 직후에 hCMV-MIE 유전자의 첫번째 인트론이 뒤따르고, 그 다음 Nco I 부위가 뒤따른다(참고: US5591 639). 아데닐중합체형성 (polyadenylation) 은 상기 폴리링커 삽입 부위의 더 하류에 위치하는 SV40 폴리 A 부위에 의하여 보증된다. pEE 15.1 은 추가적으로, SV 40 초기 프로모터의 제어하에 있으며 SV40 인트론 + 폴리 A 서열이 뒤따르는, 햄스터 유래의 글루타민 합성효소 (GS) 를 코딩하는 cDNA 서열을 내포한다. 이의 IgG 2A 유전자 좌위 또는 '핫스팟' 서열 (중쇄 불변부위, 경첩 (hinge), 막 고정체 (membrane anchor)를 나타내는 사선무늬 박스 CH1, Hi, CH2, CH3, M1, M2) 은 WO 9517516 및 그에 인용된 참조문헌들에 이미 기술된 쥐 IgG 2A 좌위의 5.1 kb BamH I 절편이다. 유일한 제한효소 절단부위인 Pvu I 및 Sal I 가 보여진다.
실험 2
mCMV pl2.4-GFP 구조체 (서열번호 4) 를 이용한 CHO 세포의 전기천공
고정된 CHO-K1 세포 (ATCC CCL-61) 을, EP-481 791 에 기술한 바와 같이 필수적으로 2 mM 의 글루타민을 함유하며 추가적으로 10 % FCS 가 보충된 이스코브 DMEM 배지에서 배양하였다. 선택적으로, 실험 1 에서와 같은 GS 표지자 선별에 앞서, 표 1 에 언급되어 있으며, 2 mM 의 글루타민을 추가로 포함하는 G-MEM 배지를 사용할 수 있다. 세포를 분리시키고, 펠렛화한 후, 무혈청 배지에서 두 번 재현탁하여 최종적으로 5.3 x 106 세포/㎖ 의 밀도가 되게 하였다. 전기천공 뱃치 750 ㎕ 당, 총 4 x 106 세포를 전기천공하였다. 전기천공은 Methods in Molecular Biology, ed. JA Nickoloff ed, Humana Press 1995, Vol. 48/Chap. 8: Animal cell electroporation and electrofusion protocols 에 기술된 바대로 수행하였다. pl2.4 mCMV-GFP 벡터 DNA (서열번호 4) 가 선형화되었다. 50 ㎕ (20㎍) DNA를 전기천공 큐벳 (cuvette) 내의 750 ㎕ 의 세포에 첨가하고, 약 12 내지 14 msec 의 전기천공 시간을 예상하면서 300 볼트/750 μFd 로 전기천공하였다. 전기천공 후, 800 ㎕ 부피의 세포를 T75 플라스크 내의 GS 선별을 위한 25 ㎖ 의 변형 Glasgow-MEM (GMEM, Gibco) 배양 배지 (10 % 태아 혈청 함유 및 글루타민 무함유, 상세한 것을 표 1 참조) 로 옮겼다. 12.9 ㎖ 를 두번째 플라스크로 이동시켜 2 개의 T75 플라스크로 나누고 10% C02 하, 37 ℃ 에서 밤새 배양하였다.
다음 날, 10% FBS + 33.3 μM MSX (메치오닌 술폭시민) 이 보충된 GS-선별 GMEM 배양 배지 37.5 ㎖ 를 첨가하였다. 따라서, MSX 는 최종적으로 약 25 μM 가 되었다. 26 일간 추가로 배양 후, 플라스크당 집락 수로 형질전환체들을 카운팅하였다. 배양 플라스크 검사를 위한 표준 도립 현미경 (standard inverted microscope) 으로의 현미경 검사시, 양성 집락들이 연녹색으로 밝게 빛났으며, 쉽게 카운팅할 수 있었다.
서열번호 4 의 mCMV 구조체는 병행으로 서열번호 3 의 hCMV 구조체로 트랜스펙션된 세포보다 20 배까지의 더 많은 반점 (foci) 을 산출하였다. 상기 벡터 구조체들은 GFP 발현을 구동하는 CMV 프로모터 요소들에 있어서만 차이가 있으며, 상기 벡터들의 나머지 벡터 부분들은 동일하였다(GS-표지자 포함; pl2.4 의 cDNA GS-표지자 카세트). 트랜스펙션 직후 세포들을 96 웰 플레이트 내로 희석시킨 경우, hCMV로 트랜스펙션된 세포들로부터 (약 45 개의 집락) 보다는 mCMV로 트랜스펙션된 세포들로부터 (400 개 이상이 집락) 좀 더 많은 집락들이 출현하였다.
표 1:
GS 선별용 배지
A. 보존 용액
1. 두 번 증류한 고압멸균된 증류수 400 ㎖ 분취량
2. 글루타민 부재의 10 x Glasgow MEM (GMEM) (GIBCO: 042-2541, UK). 4 ℃ 에서 저장한다.
3. 7.5 % 탄산수소나트륨 (GIBCO: 043-05080, UK; 670-5080, US). 4 ℃ 에서 저장한다.
4. 100 x 불필수 아미노산 (NEAA) (GIBCO: 043-01140, UK; 320-1140, US). 4 ℃ 에서 저장한다.
5. 100 x 글루타메이트 + 아스파라긴 (G + A): 600 ㎎ 글루탐산 및 600 ㎎ 아스파라긴 (Sigma) 첨가한다. 증류수로 100 ㎖ 를 채우고 멸균 2 μm 필터 (Nalgene) 을 통과시켜 멸균시킨다. 4 ℃ 에서 저장한다.
6. 100 mM 피브루산 나트륨 (GIBCO: 043-01360, UK; 320-1360, US)
7. 50 x 뉴클레오시드: 35 ㎎ 아데노신
35 ㎎ 구아노신
35 ㎎ 사이티딘
35 ㎎ 유리딘
12 ㎎ 티미딘
(각각 Sigma 사로부터임). 물로 100 ㎖ 를 채우고, 필터 멸균한 후, 10 ㎖ 분취량으로 -20 ℃ 에서 저장한다.
8. 투석된 FCS (GIBCO: 014-06300). 56 ℃ 에서 30 분간 열-불활성화시키고 -20 ℃ 에서 저장한다. GS 선별을 사용할 때는 투석된 FCS 를 사용하는 것이 필수적이다.
9. 5000 단위/㎖ 의 페니실린-스트렙토마이신 (P/S: GIBCO: 043-05070, UK; 600-5070, US).
10. 100 mM L.MSX (Sigma): PBS 중의 18 ㎎/㎖ 용액을 제조한다. 필터 멸균한 후 -20 ℃ 에서 저장한다.
B. 배지 제조
멸균 기법을 이용하여 하기를 주어진 순서대로 첨가하여 GMEM-S 배지를 제조한다.
1. 물 400 ㎖
2. 10 x GMEM 50 ㎖
3. 탄산수소나트륨 18.1 ㎖
4. NEAA 5 ㎖
5. G + A 5 ㎖
6. 피브루산 나트륨 5 ㎖
7. 뉴클레오시드 10 ㎖
8. 투석된 FCS 50 ㎖
9. 페니실린-스트렙토마이신 5 ㎖
GMEM-S 는 불필수 아미노산들인, 알라닌, 아스파테이트, 글리신, 프롤린 및 세린 (100 μM), 글루타메이트 및 아스파라긴 (500 μM), 및 아데노신, 구아노신, 사이티딘 및 유리딘 (30 μM), 및 티미딘 (10 μM) 을 함유한다.
<110> Lonza Biologics plc.
<120> Method of expressing recombinant protein in CHO cells
<130> LBP30+31
<140> NA 25/01
<141> 2002-07-10
<160> 4
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 6679
<212> DNA
<213> Hamster sp.
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(6679)
<223> Seq. ID. No. 4: circular plasmid GS vector p12.4 short mCMV-GFP /
clone 3
<400> 1
gaattcattg atcataatca gccataccac atttgtagag gttttacttg ctttaaaaaa 60
cctcccacac ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt 120
gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa 180
agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca 240
tgtctggcgg ccgcgacctg caggcgcaga actggtaggt atggaagatc cctcgagatc 300
cattgtgctg gcggtaggcg agcagcgcct gcctgaagct gcgggcattc ccagtcagaa 360
atgagcgcca gtcgtcgtcg gctctcggca ccgaagtgct atgattctcc gccagcatgg 420
cttcggccag tgcgtcgagc agcgcccgct tgttcctgaa gtgccagtaa agcgccggct 480
gctgaacccc caaccgttcc gccagtttgc gtgtcgtcag accgtctacg ccgacctcgt 540
tcaacaggtc cagggcggca cggatcactg tattcggctg caactttgtc atgcttgaca 600
ctttatcact gataaacata atatgtccac caacttatca gtgataaaga atccgcgcca 660
gcacaatgga tctcgaggtc gagggatctc tagaggatcc atattcgcgg gcatcaccgg 720
cgccacaggt gcggttgctg gcgcctatat cgccgacatc accgatgggg aagatcgggc 780
tcgccacttc gggctcatga gcgcttgttt cggcgtgggt atggtggcag gccccgtggc 840
cgggggactg ttgggcgcca tctccttgca tgcaccattc cttgcggcgg cggtgctcaa 900
cggcctcaac ctactactgg gctgcttcct aatgcaggag tcgcataagg gagagcgtcg 960
acctcgggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 1020
aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 1080
tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 1140
gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 1200
cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 1260
cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 1320
atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 1380
tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat 1440
ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 1500
acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 1560
aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 1620
aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 1680
tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga 1740
cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 1800
catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg 1860
ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat 1920
aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat 1980
ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg 2040
caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc 2100
attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa 2160
agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc 2220
actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt 2280
ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag 2340
ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt 2400
gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag 2460
atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac 2520
cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc 2580
gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca 2640
gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg 2700
ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat 2760
gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggccctga tggctctttg cggcacccat 2820
cgttcgtaat gttccgtggc accgaggaca accctcaaga gaaaatgtaa tcacactggc 2880
tcaccttcgg gtgggccttt ctgcgtttat aaggagacac tttatgttta agaaggttgg 2940
taaattcctt gcggctttgg cagccaagct agatccggct gtggaatgtg tgtcagttag 3000
ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt 3060
agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca 3120
tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa 3180
ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag 3240
aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag 3300
gcctaggctt ttgcaaaaag ctagcttggg gccaccgctc agagcacctt ccaccatggc 3360
cacctcagca agttcccact tgaacaaaaa catcaagcaa atgtacttgt gcctgcccca 3420
gggtgagaaa gtccaagcca tgtatatctg ggttgatggt actggagaag gactgcgctg 3480
caaaacccgc accctggact gtgagcccaa gtgtgtagaa gagttacctg agtggaattt 3540
tgatggctct agtacctttc agtctgaggg ctccaacagt gacatgtatc tcagccctgt 3600
tgccatgttt cgggacccct tccgcagaga tcccaacaag ctggtgttct gtgaagtttt 3660
caagtacaac cggaagcctg cagagaccaa tttaaggcac tcgtgtaaac ggataatgga 3720
catggtgagc aaccagcacc cctggtttgg aatggaacag gagtatactc tgatgggaac 3780
agatgggcac ccttttggtt ggccttccaa tggctttcct gggccccaag gtccgtatta 3840
ctgtggtgtg ggcgcagaca aagcctatgg cagggatatc gtggaggctc actaccgcgc 3900
ctgcttgtat gctggggtca agattacagg aacaaatgct gaggtcatgc ctgcccagtg 3960
ggaactccaa ataggaccct gtgaaggaat ccgcatggga gatcatctct gggtggcccg 4020
tttcatcttg catcgagtat gtgaagactt tggggtaata gcaacctttg accccaagcc 4080
cattcctggg aactggaatg gtgcaggctg ccataccaac tttagcacca aggccatgcg 4140
ggaggagaat ggtctgaagc acatcgagga ggccatcgag aaactaagca agcggcaccg 4200
gtaccacatt cgagcctacg atcccaaggg gggcctggac aatgcccgtg gtctgactgg 4260
gttccacgaa acgtccaaca tcaacgactt ttctgctggt gtcgccaatc gcagtgccag 4320
catccgcatt ccccggactg tcggccagga gaagaaaggt tactttgaag accgcggccc 4380
ctctgccaat tgtgacccct ttgcagtgac agaagccatc gtccgcacat gccttctcaa 4440
tgagactggc gacgagccct tccaatacaa aaactaatta gactttgagt gatcttgagc 4500
ctttcctagt tcatcccacc ccgccccaga gagatctttg tgaaggaacc ttacttctgt 4560
ggtgtgacat aattggacaa actacctaca gagatttaaa gctctaaggt aaatataaaa 4620
tttttaagtg tataatgtgt taaactactg attctaattg tttgtgtatt ttagattcca 4680
acctatggaa ctgatgaatg ggagcagtgg tggaatgcct ttaatgagga aaacctgttt 4740
tgctcagaag aaatgccatc tagtgatgat gaggctactg ctgactctca acattctact 4800
cctccaaaaa agaagagaaa ggtagaagac cccaaggact ttccttcaga attgctaagt 4860
tttttgagtc atgctgtgtt tagtaataga actcttgctt gctttgctat ttacaccaca 4920
aaggaaaaag ctgcactgct atacaagaaa attatggaaa aatattctgt aacctttata 4980
agtaggcata acagttataa tcataacata ctgttttttc ttactccaca caggcataga 5040
gtgtctgcta ttaataacta tgctcaaaaa ttgtgtacct ttagcttttt aatttgtaaa 5100
ggggttaata aggaatattt gatgtatagt gccttgacta gagatcataa tcagccatac 5160
cacatttgta gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa 5220
acataaaatg aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa 5280
ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg 5340
tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg atctctagct tcgtgtcaag 5400
gacggtgagg cgcgcctact gagtcattag ggactttcca atgggttttg cccagtacat 5460
aaggtcaata ggggtgaatc aacaggaaag tcccattgga gccaagtaca ctgagtcaat 5520
agggactttc cattgggttt tgcccagtac aaaaggtcaa tagggggtga gtcaatgggt 5580
ttttcccatt attggcacgt acataaggtc aataggggtg agtcattggg tttttccagc 5640
caatttaatt aaaacgccat gtactttccc accattgacg tcaatgggct attgaaacta 5700
atgcaacgtg acctttaaac ggtactttcc catagctgat taatgggaaa gtaccgttct 5760
cgagccaata cacgtcaatg ggaagtgaaa gggcagccaa aacgtaacac cgccccggtt 5820
ttcccctgga aattccatat tggcacgcat tctattggct gagctgcgtt ctacgtgggt 5880
ataagaggcg cgaccagcgt cggtaccgtc gcagtcttcg gtctgaccac cgtagaacgc 5940
agaagcttgc cgccaccatg gtgagcaagc agatcctgaa gaacaccggc ctgcaggaga 6000
tcatgagctt caaggtgaac ctggagggcg tggtgaacaa ccacgtgttc accatggagg 6060
gctgcggcaa gggcaacatc ctgttcggca accagctggt gcagatccgc gtgaccaagg 6120
gcgcccccct gcccttcgcc ttcgacatcc tgagccccgc cttccagtac ggcaaccgca 6180
ccttcaccaa gtaccccgag gacatcagcg acttcttcat ccagagcttc cccgccggct 6240
tcgtgtacga gcgcaccctg cgctacgagg acggcggcct ggtggagatc cgcagcgaca 6300
tcaacctgat cgaggagatg ttcgtgtacc gcgtggagta caagggccgc aacttcccca 6360
acgacggccc cgtgatgaag aagaccatca ccggcctgca gcccagcttc gaggtggtgt 6420
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<213> Hamster sp.
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(8251)
<223> Seq. ID. No. 3: circular plasmid GS vector p12.4 hCMVp-GFP /clone
13
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<212> DNA
<213> Hamster sp.
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(10369)
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gctggacaat gcccgtggtc tgactgggtt ccacgaaacg tccaacatca acgacttttc 5100
tgctggtgtc gccaatcgca gtgccagcat ccgcattccc cggactgtcg gccaggagaa 5160
gaaaggttac tttgaagacc gccgcccctc tgccaattgt gacccctttg cagtgacaga 5220
agccatcgtc cgcacatgcc ttctcaatga gactggcgac gagcccttcc aatacaaaaa 5280
ctaattagac tttgagtgat cttgagcctt tcctagttca tgccaccccg ccccagctgt 5340
ctcattgtaa ctcaaaggat ggaatatcaa cggtcttttt attcctcgtg cccagttaat 5400
ccttgctttt attggtcaga atagaggagt caagttctta atgcctatac accaacctca 5460
tttcttttct atttagcttt ctacgtgggg gtgggagggg tagggagggg taggcgaagg 5520
gaacgtaacc acatgcttca tctcatcagg aatgccatgt ccagtaggca gagctgccac 5580
agagtgggtg tatttgtgga ggaggacttt ttcttcagga cagttaaaag agcaggtcca 5640
ctgcttggat tgacaattcc cctataggta gagagcttgc tagttcttca ggtaaaccaa 5700
ctttctattc caaatggaag ttaggtgagg agtagtggag gagttaatgc cctccatgaa 5760
gacagctcag tgtatcacct gagacagatg ggtagcccta ctgtaaaaga aggaaaagtt 5820
atttctgggt cctccattta taacacaaag cagtagtatt tttatattta aatgtaaaaa 5880
caaaagttat atatatgata tgtggatata tgtgtatttc taattcagaa accatcctag 5940
ttactgggtt tgccaagttt gaagagcttg gttaacaaga aaggatctct tgagtagagg 6000
tgggggtgca gtaccaggaa aggtggttat ctggggctca gcgctttatt actatgtggg 6060
gtttcccctg cccactctgc aggagcagat gctggacagg tagcagggtg ggacaccagt 6120
gcttgccacc acctgtccct gtgcttaggc taagatgcat atgtatccac acagagttag 6180
caggatggag ttggctggtc aacttgaaca ttgttactga taggggtggg tggggtttat 6240
tttttggtgg gactagcatg tcactaaagc aggccttttg atatattaaa ttttttaaag 6300
caaaacaagt tcagctttta atcaactttg tagggtttct aactttacag aattgcctgt 6360
ttgtttcagt gtctccatcc actttgctct tggaggaacg gaggacaggc agacctggag 6420
ttaaaacatt tgtcattttg tgtcatagtg tctactttct cccagcagaa tattcctttc 6480
cttcttagga gtcctatgga gttttgtttt tgtttttttt ctattacgat aaacataccc 6540
cacctccatt ctggcttgcc ctgctgttct ctggttgttt gtgtgctgtc cgcagcaggc 6600
tgcctgtggt tttctcttgc catgacgact tctaattgcc atgtacagta tgttcagtta 6660
gataactcct cattgtaaac agactgtaac tgccagagca gcgcttataa atcaacctaa 6720
catttataag atttcctctt gacttgtttc tttgtggttg ggggaggaag aaaaaaaaaa 6780
gcgtgcagta tttttttgtt ccttcatttc ctatcaaaag aaaggggagt ggttctgttt 6840
tgtttactcg caaaataagc tagcttatct attggctttt cttttttttt ttttttttaa 6900
acgggctttt tcttgtacct ataatttggg gtaaggtgtg agagttttta tagttttttg 6960
agacagggtc ttggtgtata cccttggctg gcctggagct aactatgtag actgggctag 7020
cctttaactt gcagttctgc tttcaattag ggtttataca tttagtcttg gcaattccta 7080
gttccacgtt taatctcttt acatttcaaa gcagtgttat ctgaagagtt caggcgcaga 7140
gtcaattcaa tagagttaca caaaaaccta aaaaacaagt tttaaatacc aagttatgtt 7200
ggcctggcca cttttcacag ctgtccacaa ctcaatgtga caaggctaca aattggatat 7260
actagaattt cctggtgatt tggaacccct gcttcatttc ccggaaccag ggcttttggt 7320
gacagtccta gcttatcaga ttatttaaaa cagttactct tcctgccctt cttcctgaga 7380
cctttgtcca gctgccatga gccatctaca cagtacttgc ttccctgttg aagtcactga 7440
aggcacatca gcccaagaca taaaggcttg tcccggattc actagcctgg tgaacttgtg 7500
gttctctgat gttttgtcct gttttgttgt gatttagtct caaatttccc agcctggttt 7560
gaaaatctgg gctcccagcc ttcaataagg aggactacag atatgtacga ctgagccttg 7620
attccagcct catgtttata cgtctgtgct cagctccctg aaggttccag tttgaaactc 7680
aataatccag gggtcagaaa gtcttgatct tatccccaca gtatggcacc aagcctggct 7740
gagccttctg acttagtctg ccctgttgct atttaagcac ttttcttcac taggctaaaa 7800
ataaaaggag cttcctcctt tgccatggcg ctgtgcatga taggaaaagg tagctatcta 7860
ctagcatatt aactccactg tttttgcttt gtgtgtttgg tttttgagga agggtctcaa 7920
ctgtgtatcc ctggctggcc tggccggatc tagcttcgtg tcaaggacgg tgaggcgcgc 7980
caatattggc tattggccat tgcatacgtt gtatccatat cataatatgt acatttatat 8040
tggctcatgt ccaacattac cgccatgttg acattgatta ttgactagtt attaatagta 8100
atcaattacg gggtcattag ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac 8160
ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac 8220
gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt 8280
acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat 8340
tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga 8400
ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt 8460
ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca 8520
ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg 8580
tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta 8640
tataagcaga gctcgtttag tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt 8700
tgacctccat agaagacacc gggaccgatc cagcctccgc ggccgggaac ggtgcattgg 8760
aacgcggatt ccccgtgcca agagtgacgt aagtaccgcc tatagagtct ataggcccac 8820
ccccttggct tcttatgcat gctatactgt ttttggcttg gggtctatac acccccgctt 8880
cctcatgtta taggtgatgg tatagcttag cctataggtg tgggttattg accattattg 8940
accactcccc tattggtgac gatactttcc attactaatc cataacatgg ctctttgcca 9000
caactctctt tattggctat atgccaatac actgtccttc agagactgac acggactctg 9060
tatttttaca ggatggggtc tcatttatta tttacaaatt cacatataca acaccaccgt 9120
ccccagtgcc cgcagttttt attaaacata acgtgggatc tccacgcgaa tctcgggtac 9180
gtgttccgga catgggctct tctccggtag cggcggagct tctacatccg agccctgctc 9240
ccatgcctcc agcgactcat ggtcgctcgg cagctccttg ctcctaacag tggaggccag 9300
acttaggcac agcacgatgc ccaccaccac cagtgtgccg cacaaggccg tggcggtagg 9360
gtatgtgtct gaaaatgagc tcggggagcg ggcttgcacc gctgacgcat ttggaagact 9420
taaggcagcg gcagaagaag atgcaggcag ctgagttgtt gtgttctgat aagagtcaga 9480
ggtaactccc gttgcggtgc tgttaacggt ggagggcagt gtagtctgag cagtactcgt 9540
tgctgccgcg cgcgccacca gacataatag ctgacagact aacagactgt tcctttccat 9600
gggtcttttc tgcagtcacc gtccttgaca cgaagcttgc cgccaccatg gtgagcaagc 9660
agatcctgaa gaacaccggc ctgcaggaga tcatgagctt caaggtgaac ctggagggcg 9720
tggtgaacaa ccacgtgttc accatggagg gctgcggcaa gggcaacatc ctgttcggca 9780
accagctggt gcagatccgc gtgaccaagg gcgcccccct gcccttcgcc ttcgacatcc 9840
tgagccccgc cttccagtac ggcaaccgca ccttcaccaa gtaccccgag gacatcagcg 9900
acttcttcat ccagagcttc cccgccggct tcgtgtacga gcgcaccctg cgctacgagg 9960
acggcggcct ggtggagatc cgcagcgaca tcaacctgat cgaggagatg ttcgtgtacc 10020
gcgtggagta caagggccgc aacttcccca acgacggccc cgtgatgaag aagaccatca 10080
ccggcctgca gcccagcttc gaggtggtgt acatgaacga cggcgtgctg gtgggccagg 10140
tgatcctggt gtaccgcctg aacagcggca agttctacag ctgccacatg cgcaccctga 10200
tgaagagcaa gggcgtggtg aaggacttcc ccgagtacca cttcatccag caccgcctgg 10260
agaagaccta cgtggaggac ggcggcttcg tggagcagca cgagaccgcc atcgcccagc 10320
tgaccagcct gggcaagccc ctgggcagcc tgcacgagtg ggtgtaata 10369
<210> 4
<211> 13535
<212> DNA
<213> Hamster sp.
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(13535)
<223> Seq. ID. No. 1: circular plasmid GS + IgG 2A hot spot targetting
vector pEE 15.1 hCMVp-GFP /clone 11
<400> 4
gaattcattg atcataatca gccataccac atttgtagag gttttacttg ctttaaaaaa 60
cctcccacac ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt 120
gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa 180
agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca 240
tgtctggcgg ccgcgacctg caggcgcaga actggtaggt atggaagatc cctcgagatc 300
cattgtgctg gcggtaggcg agcagcgcct gcctgaagct gcgggcattc ccagtcagaa 360
atgagcgcca gtcgtcgtcg gctctcggca ccgaagtgct atgattctcc gccagcatgg 420
cttcggccag tgcgtcgagc agcgcccgct tgttcctgaa gtgccagtaa agcgccggct 480
gctgaacccc caaccgttcc gccagtttgc gtgtcgtcag accgtctacg ccgacctcgt 540
tcaacaggtc tagggcggca cggatcactg tattcggctg caactttgtc atgcttgaca 600
ctttatcact gataaacata atatgtccac caacttatca gtgataaaga atccgcgcca 660
gcacaatgga tctcgaggtc gagggatctc tagaggatcc atattcgcga atatgccggc 720
atcaccggcg ccacaggtgc ggttgctggc gcctatatcg ccgacatcac cgatggggaa 780
gatcgggctc gccacttcgg gctcatgagc gcttgtttcg gcgtgggtat ggtggcaggc 840
ccgtggccgg gggactgttg ggcgccatct ccttgcatgc accattcctt gcggcggcgg 900
tgctcaacgg cctcaaccta ctactgggct gcttcctaat gcaggagtcg cataagggag 960
agcgtcgagt cctccgtgtt cgaagcgatc cctgtccagt ggtgtgcaca ccttcccagc 1020
tgtcctgcag tctgacctct acaccctcag cagctcagtg actgtaacct cgagcacctg 1080
gcccagccag tccatcacct gcaatgtggc ccacccggca agcagcacca aggtggacaa 1140
gaaaattggt gaggaaaaca aggggagtag aggttcacaa gtgattagtc taaggcctta 1200
gcctagctag accagccagg atcagcagcc atcaccaaaa atgggaactt ggcccagaag 1260
agaaggagat actgactgtg actccctctt ggaaacttct aactatgacc acctaccttc 1320
aaggtcatga tcctctagga tagatgtcct tggtcatttc caggatcatc ctgacctaag 1380
gccataccca gggacaaagt ccctggtttg gtgccttttc tccttcaaac ttgagtaacc 1440
cccagccttc tctctgcaga gcccagaggg cccacaatca agccctgtcc tccatgcaaa 1500
tgcccaggta agtcactaga ccagagctcc acccgggaga atggtaagtg ctgtaaacat 1560
ccctgcacta gaggataagc catgtacaga tccatttcca tctctcctca tcagcaccta 1620
acctcttggg tggaccatcc gtcttcatct tccctccaaa gatcaaggat gtactcatga 1680
tctccctgag ccccatagtc acatgtgtgg tggtggatgt gagcgaggat gacccagatg 1740
tccagatcag ctggtttgtg aacaacgtgg aagtacacac agctcagaca caaacccata 1800
gagaggatta caacagtact ctccgggtgg tcagtgccct ccccatccag caccaggact 1860
ggatgagtgg caaggagttc aaatgcaagg tcaacaacaa agacctccca gcgcccatcg 1920
agagaaccat ctcaaaaccc aaaggtgaga gctgcagcct gactgcatgg gggctgggat 1980
gggcataagg ataaaggtct gtgtggacag ccttctgctt cagccatgac ctttgtgtat 2040
gtttctaccc tcacagggtc agtaagagct ccacaggtat atgtcttgcc tccaccagaa 2100
gaagagatga ctaagaaaca ggtcactctg acctgcatgg tcacagactt catgcctgaa 2160
gacatttacg tggagtggac caacaacggg aaaacagagc taaactacaa gaacactgaa 2220
ccagtcctgg actctgatgg ttcttacttc atgtacagca agctgagagt ggaaaagaag 2280
aactgggtgg aaagaaatag ctactcctgt tcagtggtcc acgagggtct gcacaatcac 2340
cacacgacta agagcttctc ccggactccg ggtaaatgag ctcagcaccc acaaaactct 2400
caggtccaaa gagacaccca cactcatctc catgcttccc ttgtataaat aaagcaccca 2460
ccaatgcctg ggaccatgta aaactgtcct ggttctttcc aaggtataga gcatagctca 2520
caggctgata tttctggcca gggttggagg acagccttgt ctataggaag agaatgaggt 2580
ttttgcactg caggactcag agctcattag ttatcctgcc ttggagtgtt ggggcttggc 2640
tttaggcagt gccttttcct tgccttccta cgaaccagca gctgccatac atagagataa 2700
tcctaggaag cctcaaatgg agaaggacac aaacccacct ccctcaggct gttcctctat 2760
cccggcccca cttctttacc taggggtttc tctgagtcta ttgtggagtt acacatggcc 2820
aggggcattc cagagaccct tgtcatccat acactcaact caggcagctt tgcacaaaca 2880
aagtctgcac acccatacag atggctcact cttgcctgtg ccatgtaggg ctgaggcaca 2940
tggctcttgc tgccccaagg gagggactat tagatagcca cactcatgct gaatcctggc 3000
ccattcaaat tagcctgctg aacaccatcc agtccatata gcacatgtat ccacatgcac 3060
gtgtgcacaa aacgcattta atacactggg acaacaattc tgtgccctgc acagcaccta 3120
tatccagcaa tgtatcacca tacacacgac caaaaaaatt caatgcccac gtttctgcca 3180
tcacaaacag acacatcttt cctctctgtg gccactgcat tatatgctca acacaagacc 3240
tctgaagcca gatccatctc tggcacctcg gggtcatgct tcaaccccac atgaattatg 3300
caaaccatag ccataatggt ctgaatcact tcacactggg atgttcccaa gttcaggcaa 3360
gacgagccac aggctctgct gatgactgaa ggacagcaaa gggtcagtcc agctgtatag 3420
ccactgttga cctgggtcac aggccctgct gaccctccac cttctcctgt actgaaggaa 3480
tgaaagatga gacaagcata gagggcactt gaataatcca ggtcactctg aggtccaccc 3540
aaggcattat tggactcagg tgggaagctg agactggtgt cccagaggga aaggaaggaa 3600
agcaggcccc ggggagggtc tgctgtccca gtcaggctgg agatctctcc tctgaatcca 3660
tgcagacatg tctgcctcac agggaatctc tcccagcacc aaccatgttg ggacaaacac 3720
tgactgtcct ctctgttcag ggctagacct ggatgatgtc tgtgctgagg cccaggacgg 3780
ggagctggac ggcctctgga cgaccatcac catcttcatc agcctcttcc tgctcagcgt 3840
gtgctacagc gcctctgtca cactcttcaa ggttggcact gtctcccacc ctctgctgtg 3900
atggctacac tgaccacaaa atgtcctctc actcctcccc agatgtagta ggacgttact 3960
ttgctgcccc tactctgtcc cacacaccat ttcctccatt ccctgagcca tcccacattg 4020
ttctatgtga ctccacattg tgtcccatac agtctgccct tctgtctctc tggctgtcct 4080
gcgtgatcct gatactgtct tatgagacca aacctccttg cattccacac tagccttcat 4140
gaggttcaat gctgtcttac acacaatccc ctcagcctca ccatggctca aggtactctg 4200
tgagctatcc tcataccatc tccacctcaa ctcccacaat atctccactc tgacccctcc 4260
catacccagt ctcctacctg tatgaaggga attgaaggag agacaggtcg acctctgtct 4320
ttcccacaga ttggagggtc tgagcatggg cgtggtctct gactttctct cacttcccca 4380
caggtaaagt ggatcttctc ctctgtggtg gagctgaagc agacgatctc ccctgactac 4440
agaaacatga ttgggcaggg agcctaggcc acttcctctg ggatcagaag agcttcctag 4500
gccctgcaga agcccatcca tcctactgtg cagcctaaca gggaggccac actctagccc 4560
tatgactctc tgatcagaac tcccatggtc tcctctttgg aggaccacgt gcagtgcagg 4620
ctttgcccag acctaaacac ttccacagca gtcgccagat atctaactac tccggaccag 4680
aagaaccatc tccttccaaa ccagcactag ggatctgaga tctcagaatg tttgcctaag 4740
aagagctgga aatccaggct tcctgtgttc tgctacaagg acatcagcct ggatttgacc 4800
tggaccacac attttcatct aaatgagttt tccacaaagg acacgtttca gatccttgaa 4860
tgagacctct acatggaaga ccagagtcac tatacccaaa ggtcactctg tatccttgca 4920
ccagctatac tggacagctt ccttcctggt acttcagtga ccctggctga ggaaaggatc 4980
tgtgacctca actgtttgga gagcctctgg aagatgtagt cttctcttcc tgctaccacc 5040
aacatgctgg atctcagatg cagaatccaa tccacagaca ccactgacca cacaacctga 5100
agacaaggcc attgccacct ccacagagat gccatccaca ctctgtggag aaataaggag 5160
tgctttgtgc agcctctgca aagctctggc agggattaga gtatacacac tgagtactga 5220
ctaggtgacc aggcagaaaa acctccagga gaaggaacaa tgggggagag atgtgaacag 5280
atagttagaa aaagcatggt gtcacaggtc tgctctgtgg actgatttcc agattggacc 5340
acctacagca gaaaccatcg gttgcagtgg caatctagga ggaccaacct ggaataggag 5400
ggctgctgtg gtcaatggag agtagacctg tatctatttc tccactgcct cttatgacca 5460
ataagaagcc agagtctcca gacagaaaga aagaaagaaa gaaagaaaga aagaaagaaa 5520
gaaagagaga gagagagaga gagagagaga gaggaaggaa ggaaggaagg aaggaaggaa 5580
ggaaggaagg aggaggagga ggaggaggag gaggaggaga gagagagaga gagagagaga 5640
gagagagaga gagcaccagc ttttctgtga ctggaaggaa atgcttagag agcttggatc 5700
tttaaagctt cttttttcta gagaccatga atgtctttgt tctctctctc tctctctctc 5760
tctctctctc tctctctctc tctctctgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgcg 5820
tgcatgcacg ctattgtttt ggcatttgaa acaataaaac attcttttaa tattctgtat 5880
ctcatggttc cccttctgtg tggatcagcc ctaacaccca ggaacagggg acaataaaca 5940
gaccacagcc atgtacagcc ttctacctcc cttctggttc tgacctccca gaggtccctc 6000
agtgggcccc tcacagctgg gtttcttccc tggcagtgcc accaagagct caggcacctc 6060
tgagctggag gctgtcctga tgccataggc aggctatgga gcagagatga tgaccacggt 6120
ggactccagg tgagccaggc aaagcctccc atgccagaag agaagcgtgt ggtactcact 6180
ggcctcgggc tgctacggat tcagcaaaga gcatggatcg cttcgaagcc tccaagctcg 6240
acctcgggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 6300
aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 6360
tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 6420
gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcaa tgctcacgct gtaggtatct 6480
cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 6540
cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 6600
atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 6660
tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat 6720
ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 6780
acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 6840
aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 6900
aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 6960
tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga 7020
cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 7080
catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg 7140
ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat 7200
aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat 7260
ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg 7320
caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc 7380
attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa 7440
agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc 7500
actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt 7560
ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag 7620
ttgctcttgc ccggcgtcaa cacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt 7680
gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag 7740
atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac 7800
cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc 7860
gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca 7920
gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg 7980
ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat 8040
gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggccctga tggctctttg cggcacccat 8100
cgttcgtaat gttccgtggc accgaggaca accctcaaga gaaaatgtaa tcacactggc 8160
tcaccttcgg gtgggccttt ctgcgtttat aaggagacac tttatgttta agaaggttgg 8220
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gccacctcag caagttccca cttgaacaaa aacatcaagc aaatgtactt gtgcctgccc 8700
cagggtgaga aagtccaagc catgtatatc tgggttgatg gtactggaga aggactgcgc 8760
tgcaaaaccc gcaccctgga ctgtgagccc aagtgtgtag aagagttacc tgagtggaat 8820
tttgatggct ctagtacctt tcagtctgag ggctccaaca gtgacatgta tctcagccct 8880
gttgccatgt ttcgggaccc cttccgcaga gatcccaaca agctggtgtt ctgtgaagtt 8940
ttcaagtaca accggaagcc tgcagagacc aatttaaggc actcgtgtaa acggataatg 9000
gacatggtga gcaaccagca cccctggttt ggaatggaac aggagtatac tctgatggga 9060
acagatgggc acccttttgg ttggccttcc aatggctttc ctgggcccca aggtccgtat 9120
tactgtggtg tgggcgcaga caaagcctat ggcagggata tcgtggaggc tcactaccgc 9180
gcctgcttgt atgctggggt caagattaca ggaacaaatg ctgaggtcat gcctgcccag 9240
tgggaactcc aaataggacc ctgtgaagga atccgcatgg gagatcatct ctgggtggcc 9300
cgtttcatct tgcatcgagt atgtgaagac tttggggtaa tagcaacctt tgaccccaag 9360
cccattcctg ggaactggaa tggtgcaggc tgccatacca actttagcac caaggccatg 9420
cgggaggaga atggtctgaa gcacatcgag gaggccatcg agaaactaag caagcggcac 9480
cggtaccaca ttcgagccta cgatcccaag gggggcctgg acaatgcccg tggtctgact 9540
gggttccacg aaacgtccaa catcaacgac ttttctgctg gtgtcgccaa tcgcagtgcc 9600
agcatccgca ttccccggac tgtcggccag gagaagaaag gttactttga agaccgcggc 9660
ccctctgcca attgtgaccc ctttgcagtg acagaagcca tcgtccgcac atgccttctc 9720
aatgagactg gcgacgagcc cttccaatac aaaaactaat tagactttga gtgatcttga 9780
gcctttccta gttcatccca ccccgcccca gagagatctt tgtgaaggaa ccttacttct 9840
gtggtgtgac ataattggac aaactaccta cagagattta aagctctaag gtaaatataa 9900
aatttttaag tgtataatgt gttaaactac tgattctaat tgtttgtgta ttttagattc 9960
caacctatgg aactgatgaa tgggagcagt ggtggaatgc ctttaatgag gaaaacctgt 10020
tttgctcaga agaaatgcca tctagtgatg atgaggctac tgctgactct caacattcta 10080
ctcctccaaa aaagaagaga aaggtagaag accccaagga ctttccttca gaattgctaa 10140
gttttttgag tcatgctgtg tttagtaata gaactcttgc ttgctttgct atttacacca 10200
caaaggaaaa agctgcactg ctatacaaga aaattatgga aaaatattct gtaaccttta 10260
taagtaggca taacagttat aatcataaca tactgttttt tcttactcca cacaggcata 10320
gagtgtctgc tattaataac tatgctcaaa aattgtgtac ctttagcttt ttaatttgta 10380
aaggggttaa taaggaatat ttgatgtata gtgccttgac tagagatcat aatcagccat 10440
accacatttg tagaggtttt acttgcttta aaaaacctcc cacacctccc cctgaacctg 10500
aaacataaaa tgaatgcaat tgttgttgtt aacttgttta ttgcagctta taatggttac 10560
aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt 10620
tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct ggatctctag cttcgtgtca 10680
aggacggtga ctgcagtgaa taataaaatg tgtgtttgtc cgaaatacgc gttttgagat 10740
ttctgtcgcc gactaaattc atgtcgcgcg atagtggtgt ttatcgccga tagagatggc 10800
gatattggaa aaatcgatat ttgaaaatat ggcatattga aaatgtcgcc gatgtgagtt 10860
tctgtgtaac tgatatcgcc atttttccaa aagtgatttt tgggcatacg cgatatctgg 10920
cgatagcgct tatatcgttt acgggggatg gcgatagacg actttggtga cttgggcgat 10980
tctgtgtgtc gcaaatatcg cagtttcgat ataggtgaca gacgatatga ggctatatcg 11040
ccgatagagg cgacatcaag ctggcacatg gccaatgcat atcgatctat acattgaatc 11100
aatattggcc attagccata ttattcattg gttatatagc ataaatcaat attggctatt 11160
ggccattgca tacgttgtat ccatatcata atatgtacat ttatattggc tcatgtccaa 11220
cattaccgcc atgttgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt 11280
cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc 11340
ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag 11400
taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc 11460
acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg 11520
gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc 11580
agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca 11640
atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca 11700
atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg 11760
ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctc 11820
gtttagtgaa ccgtcagatc gcctggagac gccatccacg ctgttttgac ctccatagaa 11880
gacaccggga ccgatccagc ctccgcggcc gggaacggtg cattggaacg cggattcccc 11940
gtgccaagag tgacgtaagt accgcctata gagtctatag gcccaccccc ttggcttctt 12000
atgcatgcta tactgttttt ggcttggggt ctatacaccc ccgcttcctc atgttatagg 12060
tgatggtata gcttagccta taggtgtggg ttattgacca ttattgacca ctcccctatt 12120
ggtgacgata ctttccatta ctaatccata acatggctct ttgccacaac tctctttatt 12180
ggctatatgc caatacactg tccttcagag actgacacgg actctgtatt tttacaggat 12240
ggggtctcat ttattattta caaattcaca tatacaacac caccgtcccc agtgcccgca 12300
gtttttatta aacataacgt gggatctcca cgcgaatctc gggtacgtgt tccggacatg 12360
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cggtgctgtt aacggtggag ggcagtgtag tctgagcagt actcgttgct gccgcgcgcg 12720
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gtgttcacca tggagggctg cggcaagggc aacatcctgt tcggcaacca gctggtgcag 12960
atccgcgtga ccaagggcgc ccccctgccc ttcgccttcg acatcctgag ccccgccttc 13020
cagtacggca accgcacctt caccaagtac cccgaggaca tcagcgactt cttcatccag 13080
agcttccccg ccggcttcgt gtacgagcgc accctgcgct acgaggacgg cggcctggtg 13140
gagatccgca gcgacatcaa cctgatcgag gagatgttcg tgtaccgcgt ggagtacaag 13200
ggccgcaact tccccaacga cggccccgtg atgaagaaga ccatcaccgg cctgcagccc 13260
agcttcgagg tggtgtacat gaacgacggc gtgctggtgg gccaggtgat cctggtgtac 13320
cgcctgaaca gcggcaagtt ctacagctgc cacatgcgca ccctgatgaa gagcaagggc 13380
gtggtgaagg acttccccga gtaccacttc atccagcacc gcctggagaa gacctacgtg 13440
gaggacggcg gcttcgtgga gcagcacgag accgccatcg cccagctgac cagcctgggc 13500
aagcccctgg gcagcctgca cgagtgggtg taata 13535
Claims (17)
- CHO 세포에서 활성이며 재조합 산물 단백질의 발현을 이끄는 프로모터를 포함하고, 상기 프로모터의 활성을 강화시키는 쥐 (murine) IgG 2A 유전자 좌위 (locus) DNA 유래의 부분을 추가로 포함하는 발현 벡터로 트랜스펙션된 CHO 세포.
- 제 1 항에 있어서, 상기 벡터는 선별가능 표지자를 인코딩하는 전사 단위체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 CHO 세포.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 CHO 세포는 안정적으로 트랜스펙션되는 것을 특징으로 하는 CHO 세포.
- 하기 단계를 포함하는, 재조합 단백질을 발현시키는 방법:a. CHO 세포에서 활성이며 재조합 산물 단백질의 발현을 이끄는 프로모터를 포함하고 상기 프로모터의 활성을 강화시키는 쥐 IgG 2A 유전자 좌위 DNA 또는 이의 DNA 서열 변이체 또는 DNA 절편을 추가로 포함하는 발현 벡터로 트랜스펙션된 CHO 세포를 배양하는 단계, 및b. 상기 산물 단백질을 수확하는 단계.
- 제 4 항에 있어서, 상기 프로모터는 바이러스성 강(强) 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 IgG 2A 유전자 좌위 부분은 천연 면역글로불린 프로모터를 결여하고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4 항에 있어서, 상기 프로모터는 hCMV 프로모터이거나 또는 프로모터 활성을 가진 이의 기능성 부분이며, 이때 상기 프로모터 또는 기능성 부분은, MIE 전사 시작 부위에 대하여 -750 위치에서부터 -1150 위치까지에 걸쳐 있는 것으로 밝혀진 바의, 상류의 '조절자' 서열/인핸서 부분을 결여하고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 산물 유전자를 위한 하나 이상의 첫번째 전사 단위체를 포함하고, 상기 전사 단위체는 mCMV 프로모터의 제어하에 있으며, 글루타민 합성효소 (GS) 표지자 유전자를 포함하는 두번째 전사 단위체를 추가로 포함하는 포유동물 발현 벡터로 트랜스펙션된 CHO 세포.
- 산물 유전자를 위한 하나 이상의 첫번째 전사 단위체를 포함하고, 상기 전사 단위체는 mCMV 프로모터 또는 이의 기능성 절편의 제어하에 있으며, 글루타민 합성효소 (GS) 표지자 유전자를 포함하는 두번째 전사 단위체를 추가로 포함하는 포유동물 발현 벡터.
- 제 9 항에 있어서, 상기 mCMV 프로모터 또는 이의 기능성 절편이 천연의 전사 시작 부위 (+0) 를 포함하며 -500 위치까지 상류로 확장되는 벡터.
- 제 10 항에 있어서, 상기 mCMV 프로모터 또는 이의 기능성 절편이 천연의 Xho I 제한효소 절단부위까지 확장되는 벡터.
- 제 10 항에 있어서, 상기 전사 시작 부위가 재조합 유전자 산물의 삽입을 위한 적절한 제한효소 절단부위를 포함하도록 유전자 조작되는 벡터.
- 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 상기 첫번째 전사 단위체가 하나 이상의 인트론 (intron) 서열을 내포하는 벡터.
- 제 13 항에 있어서, 상기 인트론이 상기 mCMV 프로모터의 첫번째의 천연 인트론이 아닌 벡터.
- CHO 세포에서 트랜스펙션율을 강화시키기 위하여 제 9 항의 벡터를 사용하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 벡터는 글루타민 합성효소 (GS) 표지자를 인코딩하는 전사 단위체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 CHO 세포.
- 제 4 항에 있어서, 상기 프로모터는 hCMV 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
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