KR100906789B1 - 인간 신경전구체세포에 대한 단일클론항체 및 그의 이용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 신경전구체세포를 특이적으로 인식하는 단일클론항체 및 이를 분비하는 하이브리도마에 관한 것이다. 상기 단일클론항체는 신경전구체세포의 neutral glycolipid를 특이적으로 인식하는 항체로, 인간 신경전구체세포 및 줄기세포에서 유래한 인간 신경전구체 분리에 효과적으로 사용할 수 있다.

신경전구체세포, 단일클론항체, 52-A11

Description

인간 신경전구체세포에 대한 단일클론항체 및 그의 이용{Monoclonal specific to human neural precursor cell and its use}

도 1은 Zhang 방법(Zhang et al., Nat. Biotechnol., 19: 1129 - 1133, 2001)을 이용하여 배양한 인간 신경전구체 세포 Miz-hES1에 대한 생쥐 단일 클론항체 제조에 대한 모식도이고,

도 2는 다양한 신경세포와 배아줄기세포 및 신경전구체세포에 대한 단일클론항체 52-A11의 결합력을 유세포 분석기로 분석한 것이고,

도 3은 다양한 형태의 신경전구체세포에 대한 단일클론항체 52-A11의 결합력을 면역세포화학적 방법으로 관찰한 것이고,

도 4는 다양한 신경세포와 배아줄기세포 및 신경전구체세포에 대한 단일클론항체 52-A11의 결합력을 면역세포화학적 방법으로 관찰한 것이고,

도 5는 또 다른 인간배아줄기세포인 HSF6에서 유도된 미분화 신경전구체세포 에 대한 네스틴, TuJ1, 52-A11의 발현도를 면역세포화학적 방법으로 관찰한 것이고,

도 6는 Glioblastoma 세포주 A172에서 분리한 glycolipid에 대한 단일클론항체 52-A11의 의 결합력 관찰한 것으로, glycolipid는 acidic glycolipid와 neutral glycolipid로 나누어 thin layer chromatography로 전개한 뒤 Orcinol/H₂SO₄ 로 염색하거나, 단일클론항체 52-A11으로 면역염색을 실시하였다.

본 발명은 인간 신경전구체세포를 특이적으로 인식하는 단일클론항체 및 이를 분비하는 하이브리도마에 관한 것이다.

줄기세포(stem cell)는 생물의 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화(differentiation)되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭한다. 줄기세포는 분화 자극(환경)에 의하여 특정 세포로 분화가 진행되며, 세포분열이 정지된 분화된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있어 증식(proliferation; expansion)하는 특성이 있으며, 다른 환경 또는 다른 분화 자 극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다.

줄기세포는 크게 배아(embryo)에서 얻어지고 모든 세포로 분화될 수 있는 잠재력(totipotent)을 지닌 전분화능(pluripotency)의 배아줄기세포(embryonic stem cell, ES cell)와 각 조직에서 얻어지는 다분화능(multipotency)의 성체줄기세포(adult stem cell)로 구분된다. 배아발생 초기인 포배기(blastocyte)의 세포내괴(inner cell mass)는 장차 태아를 형성할 부분으로서, 이 세포 내괴로부터 형성된 배아줄기세포는 이론적으로 한 개체를 구성하는 모든 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재력을 지닌 줄기세포이다. 즉, 배아줄기세포는 무제한적으로 증식이 가능한 미분화 세포이고, 모든 세포로 분화할 수 있으며 성체줄기세포와 달리 배(germ) 세포도 만들 수 있어 다음세대로 유전될 수 있다. 이에 반하여, 태아 발생과정이 진행되어 각 장기가 형성되는 과정에 도입되면 각각의 장기에는 그 장기에 특이한 줄기세포(tissue specific stem cells; primary stem cells)가 존재하여 각 장기를 형성하는 분화 과정에 참여하게 된다. 이와 같이 조직 특이적 줄기세포는 일반적으로 분화할 수 있는 그 분화능력이 그 조직을 구성하는 세포로만 한정되게 되며(multipotent or unipotent), 성인이 된 후에도 대부분의 장기에는 각 장기에 특이한 줄기세포가 남아 있게 되어 정상적 또는 병리적으로 발생하는 세포의 손실을 보충하게 된다.

인간 배아줄기세포는 인간 배아(blastocyst) 형성시 세포내괴(inner cell mass)만을 분리하여 배양함으로써 제조되는데, 현재 전 세계적으로 만들어진 인간 배아줄기세포는 불임시술 뒤 남은 냉동배아로부터 얻어졌다. 이 세포의 특징은 모든 세포로 분화가능한 잠재력(totipotent)을 갖고 있어, 어떠한 조직 세포로도 분화될 수 있으며, 또한 사멸하지 않고(immortal) 미분화 상태에서 배양가능하며 배 세포(germ cell)의 제조도 가능하므로 다음세대로 유전될 수 있는 특징을 가지고 있다(Thomson et al., Science, 282: 1145-1147, 1998; Reubinoff et al., Nat . Biotechnol., 18: 399-404, 2000). 배아줄기세포의 배양은, 1981년 처음으로 생쥐의 배아줄기세포 배양법이 확립된 후(Evans et al., Nature, 292: 151-156, 1981), 1996년 영장류에서의 전분화능 배아줄기세포 배양법(Thomson et al., Biol . Reprod., 55: 254-259, 1996)이 개발되었고, 1998년 미국의 톰슨(Thomson) 등에 의해 인간 배아줄기세포 배양법이 확립되었다(Thomson et al., Science, 282: 1145-1147, 1998). 생쥐 배아줄기세포 연구에 비해 인간 배아줄기세포 연구는 아주 짧은 역사를 지니고 있지만, 인간 배아줄기세포 연구를 통해 인간의 난치성 질병을 치유하거나 인간의 초기발생 기전을 밝힐 수 있으므로, 현재 그 연구가 활발히 진행되고 있다.

파킨슨병(Parkinson's disease), 알쯔하이머병, 탈수초질환(demyelinating disease), 루게릭병(amyotro- phic lateral sclerosis) 및 척추손상에 의한 사지마비 등의 뇌신경 퇴행성 질환은 뇌신경조직에 특정 신경세포의 영구적 손실 및 기능장애에 의해 초래되며 뇌신경조직은 손상 시 스스로의 재건이 상당히 제한되어 있으므로 현재까지 이들 질환에 대한 근본적인 치료법이 없는 실정이다. 뇌 신경조직이 신경세포 간의 시냅스에 의한 회로에 의해 그 기능을 담당하고 있다는 점을 고려할 때, 손상된 뇌조직의 재건을 위해서는 신경줄기세포로부터 신경세포의 분화 유도, 분화된 신경세포로부터 표적물로 축색의 연장 및 새로운 기능적 시냅스 형성이 도모되어야 한다. 아직까지 이들 각 단계가 어떤 기전에 의한 것인지 알려지지 않았는데 이는 적절한 실험 시스템이 구축되지 않았기 때문이다.

초기 신경 배양물(primary neuronal culture)이나 암 유전자를 도입한 신경세포주는 이미 분화가 끝났거나 암 세포주라는 이유로 그 이용에 한계가 있으나 신경줄기세포는 시험관 내(in vitro)에서 미토겐(mitogen)에 의해 증식을 유도할 수 있고, 여러 가지 방법으로 분화도 유도할 수 있으므로 이를 이용한 연구는 다양한 뇌질환 치료에 응용할 수 있을 것이다(Rosaria, et al., J. Neurochem. 89, 286-306, 2004).

한편, 인간 신경줄기세포는 태아나 성인조직에서 얻을 수 있으나 이는 윤리적인 문제가 따르며, 많은 환자들에게 필요한 만큼의 충분한 양을 얻을 수 없다. 중뇌(midbrain)의 흑질(substantia nigra)에 위치한 도파민성 신경세포(dopaminergic neuron)가 점차적으로 죽거나 손상되면서 야기되는 퇴행성 뇌신경질환인 파킨슨병이 태아의 중뇌조직 이식으로 뚜렷한 호전을 보였으나, 환자 한 사람당 발생 6 내지 10주된 낙태아 6 내지 10명 정도의 뇌 조직에서 분리한 전구세포가 필요하는 등의 실질적인 어려움이 있다(Kordower et al., J. Comp. Neurobiol ., 370: 203-230, 1996). 배아줄기세포로부터 다수의 도파민성 신경세포의 전구세포(dopaminergic neuronal precursor cells)를 배양해 낼 수 있다면 윤리적 문제도 피할 수 있고, 무제한적으로 유도해 낼 수 있음으로 그 치유의 길은 아주 밝은 편 이다. 실제로 생쥐 배아줄기세포 연구에서 밝혀진 결과에 의하면, 줄기세포로부터 얻어진 동일한 네스틴(Nestin)-양성의 줄기세포는 적당한 분화조건에 따라 신경세포세포로 분화될 수 있으며, 질환동물모델 생쥐에다 이식하였을 때 그 병세가 호전될 수 있는 것으로 보고 된 바 있다(Kim et al., Nature , 418: 50-56, 2002; Lee et al., Nature Biotechnol. 18: 675-679, 2000). 이러한 연구결과는 인간 배아줄기세포에서 얻어진 네스틴-양성 세포로부터 기능성 신경세포를 배양해 낼 수 있음을 시사해 주었다. 실제로 인간 배아줄기세포에서 신경 전구세포를 유도하여 다양한 기능성 신경세포로 분화시킬 수 있음이 보고 되었다(Zhang et al., Nat . Biotechnol ., 19: 1129 - 1133, 2001; Reubinoff et al., Nat. Biotechnol ., 19: 1134 - 1140, 2001).

뇌질환 세포 치료법에서 배아줄기세포를 이용하여 신경줄기세포로의 분화 유도가 이루어지면 그 다음 중요한 것은 다량의 신경 줄기세포만을 순수 분리해 내 직접 사용하거나 다음 단계의 기능성 신경세포로 분화를 유도하는 것이다. 현재까지 인간 신경줄기세포를 동정하기 위한 마커들은 대부분 세포내 존재하는 것으로 중간적 필라멘트인(intermediate filament) 네스틴(Nestin)(Lendhal, et al., Cell 60:585-595, 1990), Vimentin(Kilpatrick et al., Neuron 10:255-265, 1993), A2B5(Mujtaba, et al., Dev. Biol. 214:113-127, 1999), RNA 결합 단백질 Musashi-1(Good, et al Genomics 2:382-384, 1998)등이 있으며, 세포표면에 존재하는 마커로는 PSA-NCAM(polysialylated neuronal cell adhesion molecule)과 CD133(Uchida, et al., PNAS 97:14720-14725, 2000)이 있다. PSA-NCAM 항체는 메닝고코커스 그룹 B(Meningococcus Group B) 다당류에 대해 만들어진 단일클론항체로서, 생쥐의 배아 또는 성체에서 약 180kD 당단백질인 NCAM의 폴리시알로실(polysialosyl) 단위를 인식하며, 유세포분석기(Flow cytometry)에 이용이 불가능하여 세포분리에는 이용할 수 없다(Rougon, G. et al., J. Cell. Biol. 103, 2429-2437, 1986). CD133 항체는 사람 조혈모세포인 CD34 양성세포에서 발현하는 약 97 kD 단백질을 인식하는 항체로서, CD133은 신경줄기세포에서도 발현이 확인되었다. 그러나, 이들 마커와 이에 대한 항체로는 복잡한 신경전구체의 분화과정을 정확히 규정하기 힘들며, 표면 분자인 CD133을 제외하고는 신경줄기세포를 온전하게 분리하는데 응용할 수 없다. 따라서 신경줄기세포의 연구와 응용 및 분리를 위한 더 많은 세포표면 마커의 개발이 절실하다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자는 인간 배아줄기세포에서 분화를 유도한 인간 신경전구체세포의 표면 분자를 특이적으로 인식하는 단일클론항체 및 이를 분비하는 하이브리도마 세포를 선별해내고, 상기 하이브리도마로부터 생산되는 항체가 신경전구체세포의 다분화능을 포함한 특성분석 및 줄기세포를 이용한 세포 치료법에 응용하기 위한 신경전구체세포 분리에 사용될 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 인간 신경전구체세포에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공하는 것이다. 특히 상기 항체는 신경전구체세포의 neutral glycolipid를 특 이적으로 인식하는 항체이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 단일클론항체를 분비하는 하이브리도마를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 단일클론항체를 포함하는 인간 신경전구체세포 분리용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 단일클론항체를 포함하는 인간 신경전구체세포 검정 키트를 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 인간 신경전구체세포에 특이적으로 결합하는 단일클론항체에 관한 것이다. 보다 특히, 상기 항체는 신경전구체세포의 neutral glycolipid를 특이적으로 인식하는 항체이다.

구체적 양태에서, 본 발명은 수탁번호 KCTC 10744BP의 하이브리도마에 의해 분비되는, 인간 신경전구체세포에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 52-A11를 제공한다.

본 발명에서 용어 “단일클론항체”란 단일한 항원성 부위(단일 에피토프)에 대해서 지시되어 이와 특이적인 결합을 하는 단백질 분자를 의미한다.

항원의 특정 에피토프를 인식하여 항원-항체 복합체를 형성하는 항체의 주요 부위는 중쇄 및 경쇄의 가변 영역, 특히 CDR(complementarity determining region)이 이러한 복합체 형성에 기여하므로, 본 발명은 상기한 본 발명의 단일클론항체의 가변 영역, 특히 CDR을 포함하는 이의 키메릭 항체, 인간화 항체 등을 본 발명의 범위에 포함한다. 또한, 본 발명은, 상기한 바와 같은 결합 특성을 갖는 한, 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')₂ 및 Fv 등이 있다.

본 발명자는 미분화된 인간 배아줄기세포에서 분화 유도한 인간 신경전구체세포에 특이적인 단일클론항체를 생산하기 위해, 인간 신경전구세포구를 대량으로 배양하고 그 특성을 분석한 후 배양 세포가 인간 신경전구체세포임을 확인하고, 이를 생쥐에 면역 주사한 후 분리한 비장세포를 암세포와 융합하여 제조한 하이브리도마로부터 본 발명의 단일클론항체 52-A11를 분리, 정제하고, 상기 항체가 인간 신경전구체세포에 특이적으로 결합함을 확인하였다. 특히, 본 발명의 단일클론항체는 공지된 CD1333 항체 및 NCAM 항체가 인식하는 항원과는 다른 항원을 인식하는 새로운 항체임을 확인하였는데, 실시예 5 내지 8에서 기술된 바와 같이 본 발명의 따른 항체는 미분화된 신경전구체세포의 neutral glycolipid를 특이적으로 인식함을 확인하였다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 바와 같은 본 발명의 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마에 관한 것이다.

구체적 실시에서, 본 발명의 하이브리도마는 인간 신경전구체세포를 스크래퍼로 긁어 모아 DNAse를 처리한 후 잘게 쪼갠 후 생쥐에 복강에 주입한 후 상기 생쥐의 비장에서 림파구를 분리하여 상기 림파구를 골수종 암세포와 융합하여 제조하였다.

상기의 특징을 가지는 단일클론항체 52-A11을 분비하는 하이브리도마를 하이브리도마 52-A11(수탁번호: KCTC 10744BP)라 명명하고, 이를 2004년 12월 9일자로 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, 대한민국 대전시 유성구 어은동 52번지 한국생명공학연구원)에 수탁하였다.

단일클론 항체를 분비하는 하이브리도마는 이를 시험관내에서 또는 생체 내에서 대량으로 배양할 수 있다.

상기한 하이브리도마가 생산하는 단일클론 항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 본 발명이 속하는 기술 분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 고순도(예컨대, 95% 이상)로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 정제 기술로는, 예를 들어 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 크로마토그래피 등의 정제 방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액(ascites fluid)으로부터 분리될 수 있다.

본 발명의 구체적 실시에서는 본 발명의 단일클론항체의 대량 생산을 위해, 하이브리도마를 생쥐의 복강에 주사하여 복수액에서 배양하고 이를 단백질 G-세파로스(sepharose) 컬럼 크로마토그래피을 이용하여 분리하였다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 단일클론항체를 포함하는 인간 신경전구체세포 분리용 조성물에 관한 것이다. 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 단일클론항체를 사용하여 인간 신경전구체세포를 분리하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 단일클론항체는 세포치료를 위해 이식될 세포 중에 존재하는 신경전구체세포가 아닌 세포를 제거하기 위해 사용될 수 있으며, 신경전구체세포 만을 선택적으로 분리하기 위해서, 본 발명의 단일클론항체를 공지의 겔과 직접 또는 링커 등을 통하여 간접적으로 커플링(예를 들어, 공유결합)시킬 수 있다. 그 외도 구슬(bead)이나 폴리머(polymer)등이 있으나 이로 제한되지는 않는다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 단일클론항체를 포함하는 인간 신경전구체세포의 검정 키트에 관한 것이다.

본 발명의 단일클론항체는 항원-항체 복합체 반응을 통해 인간 신경전구체세포를 특이적으로 검출하기 위해 사용될 수 있다.

이러한 검정 키트에는 본 발명의 단일클론항체 뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함된다. 이러한 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함하나 이로 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들 어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.

항원-항체 복합체의 형성 및 분석법은 유세포 분석법(flow cytometry), 조직면역염색, 면역세포화학법, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법 (ELISA), 웨스턴 블럿(Western Blotting), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산 분석법(Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 단백질 칩(protein chip)등에 의해 이루어 질 수 있으며 이로 제한되지 않는다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 유세포 분석법, 면역세포화학법, 웨스턴 블랏으로 항원-항체간 특이적인 인식부위를 확인하였다.

항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하는 라벨에는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소등이 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되 지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K₄ W(CN)₈ , [Os(bpy)₃]²⁺ , [RU(bpy)₃]²⁺, [MO(CN)₈]^4- 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁸⁶Re 등이 있으며 이로 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 인간 신경전구체세포의 배양

본 발명자들은 인간 배아줄기세포 Miz-hES1을 성삼의료재단 미즈메디병원으로부터 분양 받아서, 인간 배아줄기세포로부터 Zhang 등의 방법으로 (Zhang et al., Nat . Biotechnol., 19: 1129 - 1133, 2001) 인간 신경전구체세포로 분화시켜 hNP1이라 명명하였다(도 1). 상기의 인간 신경전구체세포를 N2 배지(DMEM/F12, 25㎍/㎖ 인슐린(insulin, Sigma), 100㎍/㎖ 트랜스페린(transferrin, Sigma), 60μM 푸트레신(putrescine, Sigma), 20nM 프로게스테론(progesterone, Sigma), 30nM 소듐셀레나이트(sodium selenite, Sigma), 2㎍/㎖ 헤파린(heparin, Sigma), 20ng/㎖ bFGF(Invitrogen))에서 배양하고, 배지는 2일에 한번씩 교체 배양하였으며, 6일 간격으로 계대배양하였다. 계대배양은 0.25% 트립신(trypsin)/0.1 mM EDTA 2㎖을 넣고 37℃에서 3분간 처리한 후, 트립신 활성을 억제하기 위하여 10%혈청이 포함된 N2 배지 8㎖에 부유시킨 다음 1200rpm, 3분 동안 원심분리하여 상기의 신경전구체세포만을 분리한 후, 0.1% 폴리-L-오르니틴(Poly-L-orithine)과 1㎍/㎖의 피브로넥틴(Fibrinectin)으로 코팅된 100㎜ 플레이트에 2 × 10⁶개의 세포를 접종시킨 후 배양하였다.

< 실시예 2> 생쥐 하이브리도마의 제조

<2-1> 생쥐에 인간 신경전구체세포의 면역주사

상기 실시예 <1>의 방법으로 배양한 인간 신경전구체세포를 스크래퍼(scraper)로 긁어모아 파이펫팅을 수행하여 단일세포로 분리한 후, 37℃에서 30분간 DNase(80 Units/㎖)를 처리한 다음, PBS로 2회 세척하였고, 약 2× 10⁶의 세포를 200㎕의 PBS에 부유시킨 상기 신경전구체세포를 Balb/c 생쥐(한국생명공학연구원 실험동물실)의 복강에 3주 간격으로 3회 반복 투여한 후 채혈하여 항체형성을 확인하였다. 항체형성의 확인은 FACS를 수행하였고, 세포융합 3일 전에 상기 세포 부유물을 추가로 주사하였다.

<2-2> 단일클론 항체를 생산하는 생쥐 하이브리도마의 제조

피더(feeder) 세포를 채취하기 위하여, 세포융합 하루 전에 건강한 생쥐의 복막에 DMEM(GIBC0) 배지를 20㎖을 채웠다 다시 빨아내는 방법으로 복강 내에 있는 세포를 채취한 다음 원심분리하여 얻은 세포와 정상 비장을 갈아서 추출한 세포를 섞은 다음 20% 우태아혈청을 넣고 웰당 1× 10⁵개 세포가 되도록 96웰 플레이트에 분주하여 37℃, CO₂ 배양기에서 배양하였다. 비장세포와 융합할 NS1 골수종 세포주(myeloma, ATCC, USA)는 10%의 우태아혈청이 함유된 RPMI-1640(GIBCO사) 배지에서 2주 동안 배양하여 준비하였다.

상기 실시예 <2-1>에서와 같이 인간 신경전구체세포로 면역시킨 생쥐로부터 비장을 채취하여 RPMI-1640(GIBCO사) 배지로 세척하고 유리봉으로 분쇄한 후 세포 부유물을 15㎖ 튜브로 옮긴 후 수분동안 방치하여 가라앉으면 상층액을 새 튜브로 옮긴 후 세포수를 계수하였고, NS1 세포를 원심분리하여 취한 후 10 ㎖ RPMI-1640에 현탁하여 세포수를 계수하였다. 1×10⁷개의 NS1 세포와 1×10⁸개의 비장세포를 50㎖ 튜브에 옮겨 섞은 다음 200×g로 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고, 37℃의 물이 채워진 비이커에 2분간 방치한 후 천천히 흔들면서 1 ㎖ PEG 용액(GIBCO사)을 1분 동안 첨가하였다. 100×g, 2분간 원심분리하여 상등액을 제거한 후 5 ㎖의 RPMI-1640 배지를 3분에 걸쳐 서서히 넣은 후, 다시 5㎖의 RPMI-1640 배지를 2분에 걸쳐 서서히 첨가하였다. 200×g로 원심분리하여 세포들을 회수하고, 20% 우태아혈청이 함유된 RPMI-1640 배지 30 ㎖에 조심스럽게 현탁하였다. 37℃, CO₂ 배양기에서 30분간 방치한 후 미리 배양하여 둔 MEF 세포(피더 세포)가 깔린 96웰 플레이트에 웰당 70㎕씩 1×10⁵개의 세포가 되도록 접종하여 37℃, CO₂ 배양기에서 배양하였다. 다음날 70 ㎕ HAT를 첨가하고 3일 간격으로 HAT 배지에서 2주 이상 키우면서 자라는 콜로니를 관찰하였다.

항체가 발현되는 클론을 선별하기 위하여 샌드위치 ELISA(Sandwich Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 방법을 사용하였다. 항-마우스 IgG 또는 IgM 항체를 2㎍/㎖로 코팅한 플레이트에 하이브리도마 배양액 100 ㎕을 첨가해 37℃에서 1시간 동안 반응시키고, 다시 항-마우스 IgG 또는 IgM의 HRP(horseradish peroxidase, Sigma사)의 1/5,000 희석액을 넣어 1시간 동안 반응시켰다. 0.05%의 트윈-20(Tween-20, Sigma)을 첨가한 PBS로 플레이트를 3회 세척하고, OPD(Sigma)와 H₂O₂가 포함된 기질용액을 첨가한 후, 492 ㎚에서 흡광도를 측정하여 항체를 생산하는 클론을 우선적으로 선별하였다.

< 실시예 3> 인간 신경전구체세포에 결합하는 단일클론항체의 제조

<3-1> 인간 신경전구체세포에 결합하는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 클론의 선발

상기 <실시예 2>의 방법으로 제조한 클론 중에서, 비교적 안정하게 항체들을 분비하는 하이브리도마 상층액의 인간 신경전구체세포에 대한 결합능을 조사하였 다. 구체적으로, 배양한 인간 신경전구제세포에 세포분리 완충액(cell dissociation buffer, GIBCO)으로 37℃, 40분 동안 처리하여 뭉쳐 있는 인간 신경전구체세포를 단일세포로 분리한 뒤, 40 ㎕ 스트레이너(strainer)를 통과시켜 2 × 10⁵개의 세포를 유세포 분석기(Flow cytometry)에서 분석하였다. 먼저 단일세포화된 인간 신경전구체세포를 PBA(1%의 BSA를 PBS에 용해)용액에 부유시키고 각각의 항체 상층액을 4℃에서 30분간 반응시켰다. 4℃에서 1300rpm으로 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거한 후 PBA로 2회 세척하였다. 여기에 항-마우스 Ig-FITC(BD)를 200배 희석해서 4℃, 30분 동안 반응시킨 다음 PBA 용액으로 2회 세척하고, PI(Propidium Iodide) 음성인 세포들만 골라 FACS 칼리버(caliber)가 장착된 유세포 분석기로 인간 신경전구체세포에 대한 결합능을 분석하였다.

그 결과, 인간 신경전구체세포에 결합하는 항체를 분비하고, 확실하게 안정성을 유지하는 인간 신경전구체세포에 대한 특이성을 유지한 항체를 분비하는 하이브리도마 52-A11를 선발하였다.

상기 단일클론항체 52-A11를 분비하는 하이브리도마를 하이브리도마 52-A11(수탁번호: KCTC 10744BP)라 명명하고, 이를 2004년 12월 9일자로 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, 대한민국 대전시 유성구 어은동 52번지 한국생명공학연구원)에 수탁하였다.

<3-2> 생쥐 단일클론항체의 정제

상기 실시예 <3-1>에서 선별한 하이브리도마에서 단일클론항체 52-A11를 분리하였다. 구체적으로, 52-A11 항체를 정제하기 위하여, 일주일 전에 0.5 ㎖의 프리스탄(pristane)을 접종한 Balb/c 생쥐의 복강에 상기 하이브리도마 세포를 ㎖당 1 X 10⁷개의 세포수로 0.5 ㎖의 인산완충액에 용해시켜 주사하고, 주사 10-14일 후 주사기로 복수를 추출하고, 상기 복수를 원심분리하여 상층액만 모았다. 상기 복수액 1 ㎖에 인산완충액을 첨가하여 2 ㎖로 희석시켰다. 또한, 1 nM의 EDTA와 0.02%의 NaN₃을 상기 복수액에 첨가하고, 0.22 ㎛ 여과기로 여과하였다. 단백질 G-세파로스 컬럼(Pharmacia, 스웨덴)을 사용하여 4℃에서 2시간 동안 회전하면서 항체를 결합시키고 컬럼을 똑바로 세워서 혈청 분리관을 이용하여 컬럼의 벽면을 세척액(0.5 M의 NaCl, 0.1 M의 Tris, pH 8.0)으로 세척하고, 컬럼을 페리스타틱 펌프(peristatic pump)에 연결하여 세척액으로 충분히 세척하였다. 세척 완료 후, 0.2M의 글리신(glycin)-HCl(pH 2.7)으로 항체를 용출하였다. 이때, 미리 준비한 1M의 Tris(pH 9.0)를 포함한 튜브에 상기 용출액을 완충시켰다.

< 실시예 4> 단일클론항체의 특이성 분석

상기 실시예<3-2>에서 정제한 52-A11 항체의 인간 신경전구체세포 (hNP1)에 대한 결합능을 형광 세포염색을 통하여 상기 실시예<3-1>과 동일한 방법으로 조사하였다(도 2). 그 결과, 단일클론항체 52-A11가 신경전구체세포에 결합하는 것을 볼 수 있다. 인간신경전구체세포 이외의 세포에 대한 결합능을 알아보기 위해, 인 간신경줄기세포주인 HB1.F3와 embryonic carcinoma 세포주인 Ntera2, neuroblastma인 SHSY5Y, primary glioblastoma, 인간배아줄기세포인 Miz-hES1 및 PBL(peripheral blood lymphocyte)을 분리, 배양한 후, 단일클론항체 52-A11과 반응시켜 본 결과, 상기 항체 52-A11이 HB1.F3, Ntera2, SHSY5Y, primary glioblastoma, Miz-hES1와는 결합하고 PBL과는 결합하지 않는 결과를 보여 주었다(도 2). 도 2에서 회색바탕은 음성대조군으로 2차 항체만 포함한 것이고, 실선은 52-A11 항체의 각 세포에 대한 결합도이다.

< 실시예 5> 인간 태아 유래의 신경전구체에 대한 특이성 분석

<5-1> 인간 태아 신경 전구체 배양

Cambrex (www.cambrex.com)사에서 구입한 인간 신경 전구체 세포 (NHNP)를 Cambrex사의 배양키트 NPMM을 사용하여 sphere상태로 유지하면서 배양하고, 일주일 단위로 glass pipette을 이용하여 하나의 sphere를 4-5개 조각으로 나누고, 이틀 간격으로 배지를 교체 배양하였다. 배양한 인간 전구체 세포는 24 well plate에서 Poly-Orinithine (15μg/ml)으로 밤새 코팅하고, PBS로 두 차례 세척하고, Laminin (1μg/ml) 밤새 코팅하고, 다시 PBS로 두 차례 세척한 12mm cover slip 위에 신경전구체세포의 신경구를 성장배지에 부유시켜 접종하고, 접종한 다음날 항원-항체간 특이부위를 염색하여 현미경으로 관찰하였다.

<5-2> 인간 신경전구체 세포의 분열 및 마커 확인

분열하는 신경 전구체를 관찰하기 위해, 배양된 세포를 10 μM BrdU (5'-bromodeoxyuridine)로 2시간 동안 배양한 후, 4% paraformaldehyde (PFA)로 10분 동안 고정하고, 2 N HCl로 10분 실온에서 반응시켰다. 이 세포를 0.1 M sodium borate buffer (pH 8.3)로 10분 동안 중화시키고, 인산완충용액(PBS, pH 7.4)으로 세척하고, anti-BrdU antibody (1:500 dilution Sigma)와 토끼 anti-nestin 항체로 37C에서 2시간 동안 반응시킨 후 fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated anti-mouse IgG antibody (1:200 dilution; Vector)와 FITC-conjugated anti-rabbit IgG 로 1시간동안 실온에서 반응을 수행하였다. 4',6-diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride (DAPI)로 대조 염색하고, Vectashield로 mounting한 후 현미경에서 관찰하였다. 그 결과, 인간신경전구체세포가 분열하는 세포를 염색하는 BrdU에 염색이 되고, 신경전구체세포에서 발현되는 nestine이 염색됨을 알 수 있었다.(도 3A). 인간 전구체세포에서 단일클론항체 52-A11 항원이 발현하는지 관찰하기 위하여 먼저 상기 신경전구체세포를 실시예 <5-1>과 동일한 방법으로 코팅한 cover slip위에 배양하고, 4% 파라포름알데하이드로 실온에서 20분 동안 고정하고 0.1%BSA/PBS로 5분 동안 3회 세척하고, 10% normal goat serum, 0.3% triton X-100, 0.1% BSA를 함유한 PBS 용액으로 실온에서 1시간동안 블라킹하고, 10% normal goat serum, 0.1% BSA을 함유한 PBS 용액에서 1차 항체인 52-A11(1:100)를 4℃에서 밤새 반응시켰다. PBS 용액으로 수차례 세척하고, 2차 항체를 반응시켰다. 사용한 2차 항체 는 52-A11 (IgM)항체 경우 FITC 결합된 anti-생쥐 IgM (Vector)를 200배 희석하여 차광된 조건하에서 사용하였다. 0.1% BSA/PBS로 5분씩 3회 세척 후, 물로 2회 세척하고, DAPI가 포함된 Vectashield로 마운팅(mounting)하여 형광현미경으로 염색을 관찰하였다. 그 결과, 신경구 전체 중 가운데 일부에서 단일클론 항체 52-A11에 염색됨을 관찰하였고(도 3B), 이 세포가 migration 하면서 뻗어나온 neurite 경우에는 52-A11항원이 다량 관찰됨을 알 수 있었다 (도 3C).

< 실시예 6> 다른 신경전구체 세포에 대한 반응성

Zhang등의 방법으로 (Zhang et al., Nat . Biotechnol ., 19: 1129 - 1133, 2001)로 배양한 Miz-hES1을 배아체(Embryoid Body, EB)로 만든 후, 배양접시에서 매일 배지를 교체 배양하면서 4일 동안 배양하고, 15ml 튜브으로 옮겨 EB를 가라앉히고, HBSS로 2회 세척 후, 0.1% 폴리-L-오르니틴(Poly-L-orithine)과 1㎍/㎖의 피브로넥틴(Fibrinectin)으로 코팅 (O/F coating) 된 배양접시에서 bFGF가 함유된 N2배지로 이틀에 한번 교체배양하면서 14일간 배양하였다. 약 14일 내지 21일 사이에rosette가 많이 생긴 것을 확인한 후, 100 mm 배양 접시에 2ml의 트립신을 약 3분간 처리하여 배양접시로부터 세포를 떨어뜨린 후, trypsin inhibitor가 함유된 N2 배지를 첨가하여 트립신 반응을 종결시켰다. 세포를 15ml 튜브에 옮겨 살짝 가라앉히고, 가라앉은 rosette만 사용하여 다른 O/F로 코팅된 배양접시로 옮겨주면 rosette가 바닥에 붙어 뻗아 나갔다. 바닥에 붙어 뻗다가 약 1주일 내지 2주일 지나면 신경구(sphere)가 생기기 시작하였다. media는 2일에 한 번씩 교체 배양하거나, bFGF를 적정농도로 첨가하였다. 그런 후에, 신경줄기세포 마커인 CD133 항체(1:10)로 염색해보니 세포 중 일부가 염색됨을 볼 수 있었다(도 3E). 또 이 rosette를 단일클론항체 52-A11을 사용하여 상기 방법으로 염색해보니, 대부분의 세포가 염색되는 것이 관찰 되었다(도3D). 또, 인간 신경 전구체로 만든 세포주에 대한 단일클론항체 52-A11 항체의 염색결과에서는 대부분의 세포에서 염색됨을 관찰할 수 있었다(도 3F).

다른 인간배아줄기세포인 HSF6(Abeyta, et al. Hum. Mol. Genet. 13:601-608, 2004)에서 유래한 인간 신경전구체세포에 대한 결합능도 면역세포화학적(immunocytochemistry) 분석을 통하여 조사하였다(도 4). HSF6세포를 CF1 피더에서 배양 후 1주일 간격으로 collagenase IV 30분 처리하고, 스크래퍼로 긁어서 가라앉은 cell을 사용하여 계대하였다. HSF6를 지지세포인 PA6에서 1주일 동안 ITSA배지 (2.5 μg/㎖ insulin, 25 μg/㎖ transferrin, 30 nM sodium selenite, 0.2 mM ascorbic acid)에서 키우고 collagenase를 처리하여 PA6-shh(shh이 transfection된 cell)에서 1주일 배양하고 다시 collagenase처리하여 O/F(폴리-L-오르니틴(15 μg/ml)과 피브로넥틴(1 μg/ml)) 코팅된 접시에서 ITSA와 bFGF 20ng/ml로 1주 내지 2주 동안 배양하여 신경 전구체 세포를 만들었다 (Park, et al., J. Neurochem. 92:1265-1276, 2005). 이 세포들 4% 파라포름알데하이드로 실온에서 20분 동안 고정하고 0.1%BSA/PBS로 5분 3회 세척하고, 10% normal goat serum, 0.3% triton X-100 및 0.1% BSA가 함유된 PBS 완충용액으로 실온에서 1시간 동안 블라킹 한 후, 1차 항체를 10% normal goat serum 및 0.1% BSA가 함유된 PBS 완충 용액에서 4℃ 조건으로 밤새 반응시켰다. 이중염색을 위하여, 52-A11 외 1차 항체는 생쥐 항-네스틴(nestin)(1:1000), 토끼 항-TuJ1(1:2000), 토끼 항- GFAP(1:400)등을 사용하였고, 그에 상응하는 2차 항체로, 52-A11 (IgM)항체 경우 FITC 결합된 anti-생쥐 IgM (Sigma)를 100배 희석해 사용하였다. 0.1% BSA/PBS로 5분씩 3회 세척 후 물로 2회 세척하고 DAPI가 포함된 Vectashield로 마운팅(mounting)하여 형광현미경으로 염색을 관찰하였다.

그 결과, 52-A11 항체와 인간 신경전구체세포의 마커인 네스틴의 염색부위가 거의 일치하였으며(도4A), 초기 뉴런의 마커인 TuJ1와의 이중염색에서는 일치되는 부분이 달랐고(도4B), astrocyte마커인 GFAP와의 이중 염색에서는 염색되는 부위가 확연히 다름을 알 수 있었다(도4C). 이런 결과로부터 52-A11항체가 분화되기 전의 신경전구체세포의 마커를 인식하는 새로운 항체임을 확인할 수 있었다.

< 실시예 7> 분화 유도된 신경전구체 세포에서 52-A11항원의 발현

상기 실시예 6 에서처럼 HSF6 인간배아줄기세포에서 인간 신경 전구체 세포를 만든 다음 bFGF를 뺀 상태에서 ITSA 배지로 일주일 이상 O/F coating 한 배양접시에서 배양하면서 분화를 유도하였다. bFGF를 빼기 전 상태를 0 day로 한 후 1일 3일 7일 을 배양하면서 상기 실시예 6과 동일한 방법으로, 항체 52-A11, 생쥐 항-네스틴(nestin)(1:1000), 토끼 항-TuJ1(1:2000)와 DAPI로 각 분화 유도된 인간 신경 전구체 세포를 날짜 0,1,3,7일 별로 염색을 하였다. 도 5에서 보이는 것처럼 분화 유도 후 날짜가 지날수록 뉴런 분화마커인 TuJ1은 점점 증가하였으나, 신경 전구체 마커인 nestin의 발현은 점점 감소하였고, 52-A11항원의 발현도 점점 감소하는 것을 볼 수 있다. 이런 결과는 52-A11 항원이 신경전구체 마커인 nestin처럼 미분화 상태의 신경전구체에 특이적으로 발현되는 새로운 마커임을 말해준다.

< 실시예 8> 신경종양 세포주에서 52-A11항원의 분석

<8-1> 모든 지질 추출법

glioblastoma 세포주 A172를 배양 한 후 수확하고 PBS로 2회 세척하고 Wet weight 측정하여 (모든 이하 볼륨은 이 wet weight를 기준으로) 20 volume의 chloroform:methanol(2:1)로 세포를 부유시키고, 3분 동안 sonication 하고, vortex 하고, 4℃에서 12시간 이상 반응시킨 후, 윈심분리해서 (2,000 x g, 5min, 4℃) 상층액을 냉장보관하였다 (1차 상층액). 침전물을 20 volume의 chloroform:methanol (1:1)로 세포를 부유시키고, 3분 동안 sonication 하고, vortex 하고, 4℃에서 12시간 이상 반응시킨 후, 원심분리(2,000 x g, 5 min, 4℃)해서 상층액을 다시 냉장보관하였다 (2차 상층액). 다시 침전물에 20 volume의 chloroform:methanol (1:2)로 세포를 부유시킨 후, 3분 동안 sonication 하고, vortex 하고, 4℃에서 12시간 이상 반응시킨 후, 원심분리(2,000 x g, 5min, 4℃)해서 상층액을 냉장보관하였다(3차 상층액). 1, 2, 3차 상층액을 혼합하여 유리비이커에 옮겨 담고, N2 gas로 1/4 vol까지 건조시켰다. 단백질을 침전시키기 위하여 -20℃에서 밤새 방치하였다. 원심분리(3,000 x g, 15min, 4℃)한 후 상층액을 유리 비이커에 옮겨 담고, N2 gas로 완전히 건조시켰다. 10 volume의 chloroform:methanol (2:1) 넣고, chloroform:methanol volume의 0.2 vol NaCl 첨가하고 4분 동안 Sonication하고, 3분 동안 vortex한 후, 원심분리(2,000 x g, 10min, 4℃)하여 상층액과 하층액으로 나눴다.

상층액(hydophilic phase = acidic lipids)은 long neutral glycolipid, ganglioside, sulfatide를 포함하는 액으로 새 유리 비이커로 옮긴 후 10 volume의 chloroform:methanol(2:1) 넣고, chloroform:methanol volume의 0.2 volume의 NaCl 첨가하여 부유 한 후 4분 동안 Sonication하고, 3분 동안 vortex한 후, 원심분리(2,000xg, 10min, 4℃)하여 상층액만 새 유리 비이커로 옮겼다. 하층액(hydophobic phase)은 short neutral glycolipid, sphingomyelin, ceramide를 포함하는 층으로 10 volume의 chloroform:methanol (2:1) 넣고, chloroform:methanol volume의 0.2 volume NaCl 첨가 부유시킨 후, 4분 동안 Sonication하고, 3분 동안 vortex한 후, 원심분리(2,000xg, 10min, 4℃)하여 상층액을 버리고 하층액만 새 유리 비이커로 옮겼다.

이 두 상하층액을 1-2 ml 정도 남을 때 까지 N2 gas로 말리고, 최종 부피가 1-2ml 정도 남았을 때 에펜돌프 튜브로 옮긴 후 액체질소에 급속냉동 시키고 Speed-Vec을 이용하여 완전히 건조시켰다. 완전히 건조시킨 lipid sample을 methanol:chloroform(1:1,v/v)용액 200- 500 ul에 부유시켰다.

< 8-2> Glycolipids 항원의 immunoblotting

polyisobutylmethacrylate (PIBM)을 chloroform : n-hexane(1:9)에 넣고 밤새 스터링하며 녹인 후 0.4%로 희석하여 준비하였다. HPTLC plate를 0.4% PIBM로 실온에서 1분간 coating하고, chloroform/n-hexane이 완전히 증발시키기 위하여 플레이트를 후드에서 30분 동안 건조시켰다. 이 플레이트를 Orcinol-H₂SO₄로 전개된 시료를 검출 분석하였다(도 6A). 그 결과 산성 지질(acid lipid)과 중성지질 (neutral lipid)이 잘 분리되어 전개되어 있음을 알 수 있었다. 또 immunoblotting을 수행하기 위해 1% BSA가 함유된 PBS용액(pH 7.4)으로 실온에서 1 시간 블라킹을 수행하고, 단일클론항체 52-A11 (1.7 ug/ml)를 1:1000배 희석하여 1 차 항체에 대한 반응을 수행하고, PBST(0.1% Tween 20 in PBS) 용액으로 1분간 4회 세척하고, 항-생쥐 IgM-HRP를 1:2000희석 하여 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 PBST용액으로 1분간 4회 세척한 후, ECL 검출 용액 (Amersham)으로 발색하여 관찰하였다 (도 6B). 그 결과 단일클론항체 52-A11이 인식하는 항원은 중성 당지질(neutral glycolipid)임을 알 수 있었고, 좀 더 작은 크기의 밴드는 큰 분자의 중성 당지질처럼 같은 항원을 포함하는 또 다른 중성 당지질이거나 큰분자의 중성 당지질의 단편으로 추정된다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 단일클론항체는 인간 신경전구체세포를 특이적으로 인식하므로, 인간 신경전구체세포의 연구 및 세포 치료시 인간 신경전구체 분리에 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (6)

1. 삭제
2. 수탁번호 KCTC 10744BP의 하이브리도마에 의해 분비되는, 인간 신경전구체세포에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 52-A11.
3. 수탁번호 KCTC 10744BP로 수탁된 하이브리도마.
4. 제2항의 항체를 포함하는, 인간 신경전구체세포 분리용 조성물.
5. 제2항의 항체를 포함하는, 인간 신경전구체세포 검정 키트.
6. 제 4항의 조성물을 포함하는, 인간신경전구체세포 분리 키트.

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