JPH08208698A - モノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 悪性腫瘍に対する特異性高く、発生早期の悪
性腫瘍にも高い感受性を示すモノクローナル抗体並びに
その製造方法及び用途を提供する。 【構成】 血液凝固を阻害するとともに中性糖脂質を認
識するモノクローナル抗体と、そのモノクローナル抗体
を産生し得るハイブリドーマと、そのハイブリドーマを
培養し、培養物からモノクローナル抗体を採取してなる
モノクローナル抗体の製造方法と、上記モノクローナル
抗体を含んでなる悪性腫瘍検出剤と、被検者の血液、尿
及び／又は組織に上記モノクローナル抗体を作用せし
め、免疫反応により悪性腫瘍を検出する悪性腫瘍検査方
法を要旨とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は新規なモノクローナル
抗体に関するものであり、詳細には、血液凝固を阻害す
るとともに中性糖脂質を認識するモノクローナル抗体に
関する。

【０００２】

【従来の技術】現代の医療現場においては、主としてＸ
線検査、超音波検査及び組織検査の結果を総合的に判断
して悪性腫瘍の診断がなされている。医療施設に依って
は、これらの検査と並行して、補助的にモノクローナル
抗体による免疫学的検査の行なわれることがある。

【０００３】斯かる免疫学的検査においては、ＡＦＰ、
ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１９−９及びフェリチンなど
の腫瘍マーカに対するモノクローナル抗体が頻用される
が、いずれも悪性腫瘍に対する特異性が低いうえに、発
生早期の悪性腫瘍に対する感受性が充分でない欠点があ
る。すなわち、クリストフ・ワゲナーらは『ザ・ジャー
ナル・オブ・イムノロジー』、第１３０巻、第２，３０
８乃至２，３１５頁（１９８３年）において、ＣＥＡに
対するモノクローナル抗体が腫瘍組織以外に正常な組織
や白血球にも反応したと報告している。一方、バーバラ
・エフ・アトキンソンらは『キャンサー・リサーチ』、
第４２巻、第４，８２０乃至４，８２３頁（１９８２
年）において、ＣＡ１９−９に対するモノクローナル抗
体が複数の健常人の肝臓から採取した組織のほぼ７０％
に反応したと報告している。

【０００４】斯くして、モノクローナル抗体を用いる免
疫学的検査は、未だ、悪性腫瘍診断の決手たり得ないの
が現状である。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】斯かる状況に鑑み、こ
の発明の目的は悪性腫瘍に対する特異性高く、発生早期
の悪性腫瘍に対しても高い感受性を示すモノクローナル
抗体を提供することにある。

【０００６】この発明の別の目的は、斯かるモノクロー
ナル抗体を産生し得るハイブリドーマを提供することに
ある。

【０００７】この発明のさらに別の目的は、斯かるハイ
ブリドーマを用いるモノクローナル抗体の製造方法を提
供することにある。

【０００８】この発明のさらに別の目的は、上記モノク
ローナル抗体を含んでなる悪性腫瘍検査剤を提供するこ
とにある。

【０００９】この発明のさらに別の目的は、上記モノク
ローナル抗体を用いる悪性腫瘍検査方法を提供すること
にある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】この発明は、前記第一の
目的を、血液凝固を阻害するとともに中性糖脂質を認識
するモノクローナル抗体により解決するものである。

【００１１】この発明は、前記第二の目的を、斯かるモ
ノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマにより解
決するものである。

【００１２】この発明は、前記第三の目的を、前記モノ
クローナル抗体を産生し得るハイブリドーマを培養し、
培養物からモノクローナル抗体を採取するモノクローナ
ル抗体の製造方法により解決するものである。

【００１３】この発明は、前記第四の目的を、前記モノ
クローナル抗体を含んでなる悪性腫瘍検査剤により解決
するものである。

【００１４】この発明は、前記第五の目的を、被検者の
血液、尿及び／又は組織に前記モノクローナル抗体を反
応せしめ、陽性反応により悪性腫瘍を検出する悪性腫瘍
検査方法により解決するものである。

【００１５】

【作用】この発明のモノクローナル抗体は血液凝固を阻
害するとともに、中性糖脂質を認識する。この発明のモ
ノクローナル抗体は悪性腫瘍に対する特異性高く、発生
早期の悪性腫瘍にも高い感受性を示す。

【００１６】この発明のハイブリドーマは、培養する
と、斯かるモノクローナル抗体を産生する。

【００１７】この発明の製造方法により、前記モノクロ
ーナル抗体の所望量が容易に得られる。

【００１８】被検者から採取した血液、尿及び／組織を
この発明の検査剤により試験すると、前記モノクローナ
ル抗体が悪性腫瘍に特異的に作用し、免疫反応を呈す
る。

【００１９】被検者から採取した血液、尿及び／又は組
織をこの発明の検査方法にしたがって試験すると、前記
モノクローナル抗体が悪性腫瘍に特異的に作用し、免疫
反応を呈する。

【００２０】以下、実施例等を参照しながらこの発明を
説明するに、この発明のモノクローナル抗体は血液凝固
を阻害するとともに、中性糖脂質を認識するという、従
来公知のモノクローナル抗体には見られない独特の性質
を具備している。この発明はＩｇＭのクラスに属する後
述のモノクローナル抗体ＦＳ−０２ｍＡｂを始めとし
て、斯かる性質を具備するモノクローナル抗体全般を包
含するものとし、そのクラス、出所、由来は問わない。
なお、血液凝固を阻害する性質の有無は、後述のよう
に、例えば、ヒト扁平上皮癌やヒト結腸腺癌由来の細胞
を培養し、その培養細胞又は培養上清に健常人から採取
した血漿とともにモノクローナル抗体を加えるか、加え
ることなく作用させたときに、血漿が凝固するに要する
時間を測定する。細胞の種類やモノクローナル抗体の量
に依っても変わるが、この発明のモノクローナル抗体が
共存すると、血漿の凝固に要する時間が約１．１倍以
上、通常、１．５倍以上に延長される。一方、この発明
のモノクローナル抗体が認識する中性糖脂質は本質的に
糖質と脂質が共有結合してなり、一般に、ジエチルアミ
ノエチル基などの陰イオン性解離基を有するイオン交換
体に親和性を示さない。そして、その糖質部分は、通
常、フコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミ
ン及びグルコースを含んでなる。

【００２１】この発明のモノクローナル抗体は、例え
ば、次のようにして得ることができる。すなわち、ま
ず、中性糖脂質を含む抗原により哺乳動物を免疫感作
し、その哺乳動物から脾細胞を採取する。哺乳動物に
は、通常、マウスが使用されるが、この発明のモノクロ
ーナルを産生し得るハイブリドーマが得られるかぎり、
マウスに限定されない。抗原には中性糖脂質又はその中
性糖脂質を含む細胞若しくは細胞破砕物を使用し得る
が、通常、細胞そのもの、望ましくは、ヒト扁平上皮癌
又はヒト結腸腺癌由来の細胞、さらに望ましくは、犬房
らが『ヒューマン・セル』、第５巻、第３号、第２８７
乃至２９１頁（１９９２年）に報告しているヒト扁平上
皮癌由来のＬＫ−５２細胞やヒト結腸腺癌由来の、例え
ば、ＤＬＤ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２２１）やＣＯ
ＬＯ２０１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２２４）が好適であ
る。哺乳動物の種類に依っても変わるが、通常、斯かる
細胞を約１０⁵乃至１０⁸個／匹／回の接種量で、２日乃
至５週間の間隔を置いて２乃至７回接種すれば所期の免
疫感作が得られる。

【００２２】つぎに、斯くして得られた抗体産生細胞と
しての脾細胞と自立増殖能を有する細胞を細胞融合さ
せ、生成するハイブリドーマからこの発明のモノクロー
ナル抗体を産生するクローンを選択する。自立増殖能を
有する細胞とは、培養培地又はヒト以外の温血動物体内
で半永久的に増殖し続ける哺乳動物由来の細胞を意味
し、通常、Ｐ３−ＮＳ１−Ａｇ４−１細胞（ＡＴＣＣ
ＴＩＢ１８）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８細胞（ＡＴＣＣ
ＴＩＢ９）及びＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ１５８１）などのマウス骨髄腫由来の細胞株又は
その変異株が使用される。この発明のモノクローナル抗
体を産生するクローンは、斯くして得られるハイブリド
ーマを、必要に応じて、例えば、限界希釈法などにより
適宜希釈した後、培養し、その培養物中のモノクローナ
ル抗体を血液凝固の阻害及び中性糖脂質の認識を指標に
してクローニングすることにより得ることができる。

【００２３】斯くして得られたハイブリドーマは、生体
内外で培養すると、この発明のモノクローナル抗体を産
生する。培養には、斯界において慣用の方法が用いら
れ、例えば、生体外の培養培地で培養したときには、そ
の培養物からモノクローナル抗体を採取すればよく、一
方、ヒト以外の温血動物を利用して培養したときには、
その腹水及び／又は血液からモノクローナル抗体を採取
すればよい。後述のハイブリドーマＦＳ−０２（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１４６８１）は生体内外で容易に培養でき、し
かも、モノクローナル抗体の産生能も高いので、この発
明によるモノクローナル抗体の製造に有利に用い得る。
培養物又は腹水若しくは血液からモノクローナル抗体を
採取するには、モノクローナル抗体一般を精製するため
の斯界における慣用の方法が用いられる。個々の方法と
しては、例えば、塩析、透析、濾過、濃縮、ゲル濾過ク
ロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ア
フィニティークロマトグラフィー、吸着クロマトグラフ
ィー、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラ
フィー、ゲル電気泳動及び等電点電気泳動を挙げること
ができ、これらは必要に応じて組合せて適用される。精
製したモノクローナル抗体は、その後、濃縮・乾燥し、
用途に応じて液状又は固状とする。

【００２４】この発明のモノクローナル抗体は、悪性腫
瘍の検査を必要とする諸分野に広範な用途を有する。す
なわち、適宜の放射性同位元素、酵素及び／又は蛍光物
質により標識したこの発明のモノクローナル抗体は、公
知の方法、例えば、競合法、非競合法によるラジオイム
ノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ又は蛍光イムノ
アッセイなどの標識イムノアッセイによる悪性腫瘍の検
査剤として有用である。斯かる検査剤は、イーディー・
ハーロー、デビット・レインら編、『アンタイボディズ
・ア・ラボラトリー・マニュアル』、１９８８年、コー
ルド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行に記載
された方法に準じて得ることができる。

【００２５】前述のとおり、この発明のモノクローナル
抗体は従来公知のものと比較して悪性腫瘍に対する特異
性高く、しかも、発生早期の悪性腫瘍にも高い感受性を
示す。したがって、この発明による悪性腫瘍の検査剤及
び検査方法は、医療現場等における悪性腫瘍の検査にき
わめて有用である。検査そのものはモノクローナル抗体
を用いる通常一般の免疫学的検査と同様であり、通常、
被検者から採取した血液、尿及び／又は組織にこの発明
による検査剤を作用させた後、染色、放射能及び／又は
蛍光により免疫反応を検出して悪性腫瘍の有無を判定す
る。

【００２６】この発明のモノクローナル抗体は、いわゆ
る、悪性腫瘍のミサイル療法にも有用である。すなわ
ち、この発明のモノクローナル抗体に、必要に応じて、
血清アルブミン、ポリ−Ｌ−グルタミン酸、デキストラ
ン、プルラン又はエルシナンなどの中間支持体を介し
て、例えば、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、シク
ロフォスファミド、アクラルビシン、アドリマイシン、
メトトレキセート、ダウノマイシン、植物由来のリシ
ン、ジフテリア毒素などの抗腫瘍剤や毒素を結合させて
悪性腫瘍に罹患した患者に投与するときには、これら抗
腫瘍剤又は毒素単独では容易に達成し得ない顕著な治療
効果が達成される。

【００２７】以下に、実施例に基づきこの発明を説明す
るが、斯界において、斯かる実施例は多種多様に改変可
能である。斯かる状況に鑑み、この発明が下記の実施例
のみに限定されないことは言うまでもない。

【００２８】

【実施例１ ハイブリドーマＦＳ−０２の調製】

【００２９】

【実施例１−１ 細胞融合】８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマ
ウスの腹腔内に、ヒト扁平上皮癌由来のＬＫ−５２細胞
を約１×１０⁷個／匹／回の接種量で２週間ごとに４回
注射した。最後の注射から３日目にマウスから脾臓を摘
出し、血清無含有のＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．
４）により分散・洗浄した。

【００３０】別途、マウス骨髄腫由来のＳｐ２／Ｏ−Ａ
ｇ１４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）を血清無含有
のＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）２０ｍｌに細胞
密度約１．５×１０⁶個／ｍｌになるように浮遊させ、
浮遊液に上記で調製したマウス脾細胞を約８×１０⁶個
／ｍｌ含む血清無含有のＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ
７．４）を２０ｍｌ加え、暫時静置した後、遠心分離し
た。沈澱した細胞を採取し、よくほぐした後、５０％
（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール５０００を含むＲＰ
ＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）を１ｍｌ加え、３７℃
で２分間インキュベートした。１分後、反応物の全量が
４０ｍｌになるまで血清無含有のＲＰＭＩ１６４０培地
（ｐＨ７．４）を滴々加え、細胞融合を完了した。

【００３１】反応物を遠心分離して採取したハイブリド
ーマを１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６
４０培地（ｐＨ７．４）４０ｍｌに浮遊させ、５％ＣＯ
²インキュベータ中、３７℃で２４時間培養後、常法に
したがってハイブリドーマをＨＡＴ培地に移し、９６ウ
ェルマイクロプレートに０．２ｍｌ／ウェルずつ分注
し、５％ＣＯ₂インキュベータ中、３７℃で培養した。
この状態で１０日間培養したところ、ほとんど全てのウ
ェルにおいてハイブリドーマの生育が観察された。

【００３２】

【実施例１−２ 中性糖脂質の調製】常法にしたがっ
て、ヒト扁平上皮癌由来のＬＫ−５２細胞を５％（ｖ／
ｖ）牛胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ
７．４）を使用し、５％ＣＯ₂インキュベータ中、３７
℃で１０日間単層培養した。培養物をＥＤＴＡ−トリプ
シンで処理した後、遠心分離して細胞を採取し、５倍容
のイソプロパノール／ヘキサン／水混液（混合比５５：
２５：２０で混和して得られる下層部）に浮遊させ、常
法にしたがってホモゲナイザ及び超音波破砕機により破
砕した後、遠心分離して上清と沈澱部を分離した。分離
した沈澱部を５倍容のイソプロパノール／ヘキサン／水
混液（混合比５５：２５：２０で混和して得られる下層
部）に浸漬し、室温下で一晩静置して抽出後、遠心分離
し、上清を採取する一方、新たに生じた沈澱部を５倍容
のクロロホルム／メタノール混液（混合比２：１）に移
し、上記と同様に抽出後、遠心分離した。得られた上清
を採取するとともに、沈澱部を５倍容のクロロホルム／
メタノール混液（混合比１：１）でさらに抽出し、遠心
分離して上清を採取した。

【００３３】以上のようにして得られた４種類の上清を
プールし、エバポレータにより乾固した後、クロロホル
ム／メタノール／水混液（混合比１：２：０．８）に溶
解し、溶液を分液ロートにとり、０．９％（ｗ／ｖ）塩
化ナトリウム水溶液及びクロロホルムをそれぞれ等量ず
つ加え、暫時静置した後、有機層を採取した。この有機
層に除去した水層と等量のクロロホルム／メタノール／
水混液（混合比１：５０：４９）を加え、上記と同様に
処理した後、新たに生じた有機層を回収した。この有機
層をエバポレータにより乾固し、得られた糖脂質を含む
固状物をクロロホルム／メタノール／水混液（混合比３
０：６０：８）に溶解し、溶液を予め新鮮な同一混液で
平衡化しておいた東ソー製イオン交換クロマトグラフィ
ー用ゲル『ＤＥＡＥ−トヨパール』１５０ｍｌのカラム
に負荷した。カラムに５倍量の新鮮な同一混液を通液
し、溶出液を回収し、エバポレータで乾固させたとこ
ろ、粗中性糖脂質が細胞湿重量１ｇ当たり約０．０６ｇ
の収率で得られた。

【００３４】粗中性糖脂質の一部をとり、少量のクロロ
ホルム／メタノール混液（混合比１：１）に溶解し、溶
液をワットマン製薄層クロマトグラフィー用プレート
『ダイアモンドＫ６Ｆプレート』にスポットし、クロロ
ホルム／メタノール／０．２％（ｗ／ｖ）塩化カルシウ
ム水溶液（混合比６０：３５：８）により展開した。プ
レートを乾燥し、Ｒｆ０．１５乃至０．２５に相当する
部分のゲルを掻取り、クロロホルム／メタノール混液
（混合比１：１）に暫時浸漬した後、上清を採取した。
残渣をメタノール／水混液（混合比９５：１）により同
様に抽出し、上清を採取する一方、残渣を水で２回抽出
した。すべての上清をプールし、エバポレータにより乾
固し、クロロホルム／メタノール混液（混合比２：１）
に溶解し、溶液をダイアヤトロン製クロマトグラフィー
用ゲル『イアトロビーズ』により夾雑シリカゲルを除去
したところ、精製中性糖脂質約０．１ｍｇを含む溶液が
得られた。

【００３５】精製中性糖脂質の一部をとり、常法にした
がってエンドグリコセラミダーゼにより糖質部分と脂質
部分とを切断した後、その糖質部分につき、ヒロシ・タ
ケモトらが『アナリティカル・バイオケミストリー』、
第１４５巻、第２４５乃至２５０頁（１９８５年）に報
告している方法に準じて分析したところ、フコース、ガ
ラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン及びグルコー
スを含んでなることが判明した。

【００３６】

【実施例１−３ ハイブリドーマＦＳ−０２のクローニ
ング】実施例１−２で調製した粗中性糖脂質を適量と
り、エチルアルコールに０．５μｇ／ｍｌになるように
溶解した。溶液を９６ウェルマイクロプレートに１００
μｌ／ウェルずつ分注し、減圧乾固し、０．３Ｍ蔗糖水
溶液を１００μｌ／ウェルずつ加え、室温下にて１０分
間静置した後、吸引により蔗糖水溶液を除去した。マイ
クロプレートに実施例１−１で調製したハイブリドーマ
の培養上清を１００μｌ／ウェルずつとり、室温下で６
０分間静置し、吸引によりウェル内の溶液を除去した
後、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含むＰＢＳに
よりウェル内を繰返し洗浄した。

【００３７】つぎに、マイクロプレートに西洋ワサビ由
来のパーオキシダーゼで標識した濃度２μｇ／ｍｌのウ
サギ由来の抗マウスイムノグロブリン抗体を５０μｌ／
ウェル加え、室温下で３時間振盪し、吸引によりウェル
内の溶液を除去し、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０
を含むＰＢＳによりウェル内を繰返し洗浄した後、０．
５ｍｇ／ｍｌ ｏ−フェニレンジアミンと０．０３％
（ｗ／ｖ）過酸化水素を含む０．１Ｍクエン酸−燐酸緩
衝液（ｐＨ５．０）を１００μｌ／ウェルずつ加え、室
温下で１５分間反応させた。マイクロプレートに２Ｎ硫
酸を１００μｌ／ウェルずつ加えて反応を停止させた
後、４９０ｎｍにおける反応物の吸光度を測定し、吸光
度約０．３以上の培養上清を与えたハイブリドーマを選
別した。

【００３８】このようにして一次スクリーニングして得
た９６株のハイブリドーマをそれぞれ別個に１０％（ｖ
／ｖ）牛胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐ
Ｈ７．４）に接種し、５％ＣＯ₂インキュベータ中、３
７℃で２４時間培養後、遠心分離により上清を採取し
た。得られた９６種類の培養上清につき、粗中性糖脂質
に代えて上記で調製した精製中性糖脂質を濃度０．１μ
ｇ／ｍｌにして用いた以外、上記と同様に二次スクリー
ニングしたところ、ハイブリドーマＦＳ−０２が、後述
のとおり、血液凝固を阻害するとともにＬＫ−５２細胞
由来の中性糖脂質を認識するモノクローナル抗体を産生
することが判明した。なお、ハイブリドーマＦＳ−０２
は、平成６年１２月１日より、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−
１４６８１で茨城県つくば市東１丁目１番３号にある通
商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所、特許微生
物寄託センターに寄託されている。

【００３９】

【実施例２ モノクローナル抗体ＦＳ−０２ｍＡｂの調
製】実施例１で調製したハイブリドーマＦＳ−０２を１
０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０
培地（ｐＨ７．４）に接種し、逐次スケールアップしな
がら５％ＣＯ₂インキュベータ中、３７℃で培養した。
所期の細胞密度に達した時点で、ハイブリドーマＦＳ−
０２を予めプリスタンを投与しておいた１０週齢のＢＡ
ＬＢ／ｃマウスの腹腔内に約１×１０⁷個／匹接種し、
７日間、通常の方法で飼育した。

【００４０】その後、マウスの腹腔内から腹水を採取
し、５０％飽和硫酸アンモニウムにより塩析し、生成し
た沈澱を採取し、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０
ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解し、溶液を新鮮な
同一緩衝液に対して４℃で一晩透析した後、透析内液を
採取した。これを予め０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む
１００ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．８）により平衡化して
おいた生化学工業製吸着クロマトグラフィー用ゲル『ギ
ガパイト』のカラムに負荷し、カラムを新鮮な同一緩衝
液で洗浄した後、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む１５
０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．８）を通液した。溶出液か
らモノクローナル抗体を含む画分を採取し、ＰＢＳに対
して４℃で一晩透析して精製モノクローナル抗体ＦＳ−
０２ｍＡｂを含む水溶液を得た。収量は、マウス１匹当
たり５ｍｇであった。なお、オクタロニー法により試験
したところ、モノクローナル抗体ＦＳ−０２ｍＡｂはＩ
ｇＭのクラスに属していた。

【００４１】

【実施例３ モノクローナル抗体ＦＳ−０２ｍＡｂの理
化学的性質】

【００４２】

【実施例３−１ 血液凝固の阻害】実施例２の方法によ
り得たモノクローナル抗体ＦＳ−０２ｍＡｂを適量と
り、ＰＢＳに濃度２００μｇ／ｍｌになるように溶解し
た。別途、常法にしたがってヒト扁平上皮癌由来のＬＫ
−５２細胞を単層培養し、培養後、傾瀉により上清を採
取した。この上清をプラスチック容器に２５μｌずつと
り、上記モノクローナル抗体溶液を２５μｌずつ加え、
３７℃で１０分間インキュベートした。その後、正常ヒ
ト血漿を５０μｌずつ加え、３７℃でさらに１分間イン
キュベートし、２５ｍＭ塩化カルシウム水溶液を５０μ
ｌずつ加え、血漿が凝固するに要する時間を血液凝固自
動測定装置により測定した。

【００４３】別途、ヒト結腸腺癌由来のＤＬＤ−１細胞
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２２１）及びＣＯＬＯ２０１細胞
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２２４）を単層培養し、５０ｍＭ
ＥＤＴＡにより培養物から細胞を採取し、ハンクス液に
細胞密度約２×１０⁵個／２５μｌになるように浮遊さ
せた。ＬＫ−５２細胞の培養上清に代えてこれらの細胞
浮遊液を用いた以外、上記と同様にして血漿が凝固する
に要する時間を測定した。合わせて、モノクローナル抗
体ＦＳ−０２ｍＡｂを加えない系をそれぞれ設け、上記
と同様に処置して対照とした。結果を表１に示す。

【００４４】

【表１】

【００４５】表１の結果に見られるように、モノクロー
ナル抗体ＦＳ−０２ｍＡｂが共存しないときの血漿凝固
時間が、ＬＫ−５２細胞の場合約３０秒、ＤＬＤ−１細
胞の場合約２５秒、ＣＯＬＯ２０１細胞の場合約４０秒
であったところ、モノクローナル抗体ＦＳ−０２ｍＡｂ
を共存せしめると、血漿凝固に要する時間が、それぞ
れ、約７０秒、約８０秒又は約７０秒に延長された。こ
のことは、特定の癌細胞又はその培養上清の存在下にお
いて、この発明のモノクローナル抗体に健常人の血漿が
凝固するのを阻害する作用、すなわち、血液凝固を阻害
する作用のあることを示している。

【００４６】

【実施例３−２ 中性糖脂質の認識】実施例１−２の方
法により得た精製中性糖脂質を適量とり、実施例１−２
と同様にしてシリカゲルプレート上に展開した。プレー
トを乾燥し、０．４％（ｗ／ｖ）ポリイソブチルメタク
リル酸を含むクロロホルム／ヘキサン混液（混合比２
１：４）５０ｍｌに室温下で１分間浸漬し、乾燥後、実
施例２の方法により得た１０μｇ／ｍｌモノクローナル
抗体ＦＳ−０２ｍＡｂ、大日本製薬製ブロッキング剤
『ブロックエース』０．４％（ｗ／ｖ）、０．０５％
（ｖ／ｖ）ツイーン２０及び０．２Ｍ塩化ナトリウムを
含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に室温
下で１．５時間浸漬した。滅菌蒸留水を噴霧して洗浄
し、西洋ワサビパーオキシダーゼで標識したウサギ由来
の抗マウスイムノグロブリン抗体２μｇ／ｍｌを含む溶
液に室温下で２時間浸漬し、滅菌蒸留水を噴霧して洗浄
した後、１５ｍｇジメチルアミノベンチジン、８μｌ過
酸化水素水及び０．２Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に室温下で１分間浸
漬して染色した。

【００４７】その結果、実施例１−２で得た精製中性糖
脂質に相当するＲｆ０．２０±０．０５のバンドのみが
顕著に染色された。このことは、モノクローナル抗体Ｆ
Ｓ−０２ｍＡｂが糖質部分にフコース、ガラクトース、
Ｎ−アセチルグルコサミン及びグルコースを含んでなる
中性糖脂質を認識することを裏付けている。

【００４８】

【実施例３−３ 悪性腫瘍由来の細胞株に対する反応
性】実施例２の方法により得たモノクローナル抗体ＦＳ
−０２ｍＡｂにつき、谷口克編集『実験医学』、第６
巻、第１０号、第８９乃至９８頁（１９８８年）に報告
されている間接蛍光抗体法及びフローサイトメトリー法
により、表２に示す１６種類の悪性腫瘍由来のヒト細胞
株と４種類の正常ヒト線維芽細胞又は正常ヒト細胞株に
対する反応性を試験した。結果を表２に示す。

【００４９】

【表２】

【００５０】表２の結果に見られるように、モノクロー
ナル抗体ＦＳ−０２ｍＡｂは試験に供した悪性腫瘍細胞
株１６株すべてに顕著な反応性を示しながらも、正常な
ヒト線維芽細胞乃至ヒト細胞株にはまったく反応しなか
った。このことは、この発明のモノクローナル抗体が悪
性腫瘍のみに特異的に反応することを示唆している。

【００５１】

【実施例３−４ 悪性腫瘍組織に対する反応性】実施例
２の方法により得たモノクローナル抗体ＦＳ−０２ｍＡ
ｂにつき、スー−ミン・スーらが『ザ・ジャーナル・オ
ブ・ヒストケミストリー・アンド・サイトケミストリ
ー』、第２９巻、第５７７乃至５８０頁（１９８１年）
に報告しているアビジン／ビオチン／パーオキシダーゼ
法により、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、大腸癌
又は膀胱癌に罹患した患者から採取した腫瘍組織に対す
る反応性を試験した。胃癌、膀胱癌、大腸癌及び乳癌に
ついては、進行度の相違する腫瘍組織をそれぞれ４種類
ずつ準備し、上記と同様に試験した。結果を表３に示
す。結果は陽性率（％）をもって判定することとし、そ
の陽性率は個々の検査系に参加した被検者数に対する陽
性者数の百分率とする。

【００５２】

【表３】

【００５３】表３に見られるように、モノクローナル抗
体ＦＳ−０２ｍＡｂは悪性腫瘍患者から採取した腫瘍組
織のみに顕著に反応しつつ、その周囲の正常組織には実
質的に反応しなかった。また、モノクローナル抗体ＦＳ
−０２ｍＡｂは、従来、モノクローナル抗体による検出
が難しいとされてきた発生早期の悪性腫瘍にも顕著に反
応した。

【００５４】これらの事実は、この発明のモノクローナ
ル抗体が悪性腫瘍に対する特異性高く、発生早期の悪性
腫瘍に対しても高い感受性を示すことを裏付けている。
なお、モノクローナル抗体ＦＳ−０２ｍＡｂは、弱いな
がら、胃又は十二指腸の粘膜基底部及び気管支粘液腺の
細胞の一部に反応したが、これは、悪性腫瘍の検査を妨
げるようなものではなかった。

【００５５】

【実施例４ 悪性腫瘍検査剤】実施例２の方法により得
たモノクローナル抗体ＦＳ−０２ｍＡｂを適量とり、Ｐ
ＢＳに２０μｇ／ｍｌになるように溶解した。溶液をエ
ンザイムイムノアッセイ用マイクロプレートに１００μ
ｌ／ウェルずつ分注し、室温下で３時間静置した。ウェ
ルから溶液を除去し、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２
０を含むＰＢＳで洗浄し、１％（ｖ／ｖ）牛胎児アルブ
ミンを含むＰＢＳを１００μｌ／ウェル加え、４℃で一
晩静置してモノクローナル抗体をブロッキングした後、
ＰＢＳを除去して固相抗体を得た。

【００５６】別途、ウサギの静脈にヒト扁平上皮癌由来
のＬＫ−５２細胞を約１×１０⁶個／匹／回、２週間お
きに４回注射投与した。最後の注射から１週間後に採血
し、血清を採取した。血清を予め０．１ｍ燐酸緩衝液
（ｐＨ８．０）により平衡化しておいたファルマシア製
アフィニティークロマトグラフィー用カラム『プロテイ
ンＡセファロース４ファーストフローカラム』に負荷
し、カラムに０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３．
０）を通液して得られる溶出液をＰＢＳに対して透析し
てポリクローナル抗体を得た。このポリクローナル抗体
を佐内豊『実験医学』、第６巻、第９２５乃至９３１頁
（１９８８年）に報告されている過沃素酸酸化方法によ
り西洋ワサビ由来のパーオキシダーゼで標識し、予めＰ
ＢＳで平衡化させておいたファルマシア製『セファクリ
ルＳ−３００ＨＲ』を用いるゲル濾過クロマトグラフィ
ーにより精製して標識抗体とした。

【００５７】このようにして得た固相抗体及び標識抗体
を組合せてなる検出剤は、悪性腫瘍に罹患した患者の血
液、尿及び組織に作用させると、染色剤としてのｏ−フ
ェニレンジアミンの存在下で顕著な染色を呈する。した
がって、本例の検査剤は、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、
膵臓癌、大腸癌、膀胱癌及び肝臓癌を含む悪性腫瘍一般
の免疫学的検査にきわめて有用である。

【００５８】

【実施例５ 悪性腫瘍検査剤】実施例２の方法により得
たモノクローナル抗体ＦＳ−０２ｍＡｂを適量とり、Ｐ
ＢＳに１０μｇ／ｍｌになるように溶解した。溶液に住
友ベークライト製ラジオイムノアッセイ用ポリスチレン
ビーズを約５個／ｍｌの割合で加え、室温下で２時間静
置してポリスチレンビーズにモノクローナル抗体を結合
させた後、ポリスチレンビーズを１％（ｖ／ｖ）牛血清
アルブミンを含むＰＢＳで繰返し洗浄してラジオイムノ
アッセイ用固相抗体を得た。別途、実施例４の方法によ
り得たポリクローナル抗体をボルトン−ハンター法によ
り放射性同位元素¹²⁵Ｉで標識して標識抗体とした。

【００５９】このようにして得た固相抗体及び標識抗体
を組合せてなる検出剤は、悪性腫瘍に罹患した患者の血
液、尿及び組織に作用させると、ポリスチレンビーズに
顕著な放射能を呈する。したがって、本例の検査剤は、
肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、大腸癌、膀胱癌及
び肝臓癌を含む悪性腫瘍一般の免疫学的検査にきわめて
有用である。

【００６０】つぎに、実施例４乃至５による悪性腫瘍検
査剤を用いて行った悪性腫瘍検査について述べる。

【００６１】

【検査例１ 血液を被検体とする悪性腫瘍検査】健常人
４名、胃癌患者１０名及び大腸癌患者６名からそれぞれ
採血し、血清を分離した。通常のエンザイムイムノアッ
セイに準じてこれら血清に実施例４の方法により得た悪
性腫瘍検査剤を作用させた後、ｏ−フェニレンジアミン
で染色した。

【００６２】その結果、実施例４による悪性腫瘍検査剤
は、健常人の血清にまったく反応することなく、胃癌患
者及び大腸癌患者から採取した血清に対して、それぞ
れ、６０％又は５０％の陽性率を示した。

【００６３】

【検査例２ 尿を被検体とする悪性腫瘍検査】健常人２
０名、胃癌患者２０名、大腸癌患者１７名、乳癌患者６
名及び肺癌患者６名から尿を採取した。通常のライジオ
イムノアッセイに準じてこれら尿に実施例５の方法によ
り得た悪性腫瘍検査剤を作用させた後、ガンマカウンタ
によりポリスチレンビーズの放射能を測定した。

【００６４】その結果、実施例５による悪性腫瘍検査剤
は、健常人、胃癌患者、大腸癌患者、乳癌患者及び肺癌
患者の尿に対して、それぞれ、１０％、７５％、５９
％、５０％又は６７％の陽性率を示した。

【００６５】

【発明の効果】叙上のように、この発明のモノクローナ
ル抗体は悪性腫瘍に対する特異性高く、発生早期の悪性
腫瘍に対しても高い感受性を示す。これにより、この発
明のモノクローナル抗体は、医療現場等において、悪性
腫瘍の検査やミサイル療法による悪性腫瘍の治療に格別
な効果を発揮する。斯くも有用なるモノクローナル抗体
は、ハイブリドーマを用いるこの発明の製造方法によ
り、所望量を容易に得ることができる。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成８年２月１９日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２２】つぎに、斯くして得られた抗体産生細胞と
しての脾細胞と自己増殖能を有する細胞を細胞融合さ
せ、生成するハイブリドーマからこの発明のモノクロー
ナル抗体を産生するクローンを選択する。自己増殖能を
有する細胞とは、培養培地又はヒト以外の温血動物体内
で半永久的に増殖し続ける哺乳動物由来の細胞を意味
し、通常、Ｐ３−ＮＳ１−Ａｇ４−１細胞（ＡＴＣＣ
ＴＩＢ１８）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８細胞（ＡＴＣＣ
ＴＩＢ９）及びＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ１５８１）などのマウス骨髄腫由来の細胞株又は
その変異株が使用される。この発明のモノクローナル抗
体を産生するクローンは、斯くして得られるハイブリド
ーマを、必要に応じて、例えば、限界希釈法などにより
適宜希釈した後、培養し、その培養物中のモノクローナ
ル抗体を血液凝固の阻害及び中性糖脂質の認識を指標に
してクローニングすることにより得ることができる。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２７

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２７】以下、実施例に基づきこの発明を説明する
が、斯界において、斯かる実施例は多種多様に改変可能
である。斯かる状況に鑑み、この発明が下記の実施例の
みに限定されないことは言うまでもない。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３１

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３１】反応物を遠心分離して採取したハイブリド
ーマを１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６
４０培地（ｐＨ７．４）４０ｍｌに浮遊させ、５％ＣＯ
₂ インキュベータ中、３７℃で２４時間培養後、常法に
したがってハイブリドーマをＨＡＴ培地に移し、９６ウ
ェルマイクロプレートに０．２ｍｌ／ウェルずつ分注
し、５％ＣＯ₂ インキュベータ中、３７℃で培養した。
この状態で１０日間培養したところ、ほとんど全てのウ
ェルにおいてハイブリドーマの生育が観察された。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５６

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５６】別途、ウサギの静脈にヒト扁平上皮癌由来
のＬＫ−５２細胞を約１×１０⁶ 個／匹／回、２週間お
きに４回注射投与した。最後の注射から１週間後に採血
し、血清を採取した。血清を予め０．１ｍＭ燐酸緩衝液
（ｐＨ８．０）により平衡化しておいたファルマシア製
アフィニティークロマトグラフィー用カラム『プロテイ
ンＡセファロース４ファーストフローカラム』に負荷
し、カラムに０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３．
０）を通液して得られる溶出液をＰＢＳに対して透析し
てポリクローナル抗体を得た。このポリクローナル抗体
を佐内豊『実験医学』、第６巻、第９２５乃至９３１頁
（１９８８年）に報告されている過沃素酸酸化法により
西洋ワサビ由来のパーオキシダーゼで標識し、予めＰＢ
Ｓで平衡化させておいたファルマシア製『セファクリル
Ｓ−３００ＨＲ』を用いるゲル濾過クロマトグラフィー
により精製して標識抗体とした。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/534 33/535 33/574 Ｂ 33/577 Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｔ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 血液凝固を阻害するとともに中性糖脂質
   を認識するモノクローナル抗体。
2. 【請求項２】 中性糖脂質における糖質部分がフコー
   ス、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン及びグル
   コースを含んでなる請求項１に記載のモノクローナル抗
   体。
3. 【請求項３】 下記の性質を有する請求項１又は２に記
   載のモノクローナル抗体。 （１） ヒト結腸癌由来のＷｉＤｒ細胞（ＡＴＣＣ Ｃ
   ＣＬ２１８）、ＣＯＬＯ２０１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ
   ２２４）及びＤＬＤ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２２
   １）、ヒト胃癌由来のＫＡＴＯＩＩＩ細胞（ＡＴＣＣ
   ＨＴＢ１０３）並びにヒト乳癌由来のＳＫ−ＢＲ−３細
   胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ３０）及びＭＣＦ７細胞（ＡＴＣ
   Ｃ ＨＴＢ２２）に反応する。 （２） ヒト胃癌、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト肺癌、
   ヒト食道癌、ヒト膵臓癌及びヒト膀胱癌に反応する。 （３） 正常なヒト胃及びヒト十二指腸の粘膜基底部の
   粘液腺並びにヒト気管支の粘液腺と弱いながら反応す
   る。 （４） 正常なヒト肺及びヒト大腸の線維芽細胞に反応
   しない。
4. 【請求項４】 ＩｇＭのクラスに属する請求項１、２又
   は３に記載のモノクローナル抗体。
5. 【請求項５】 モノクローナル抗体がＦＳ−０２ｍＡｂ
   である請求項１、２、３又は４に記載のモノクローナル
   抗体。
6. 【請求項６】 請求項１乃至５に記載のモノクローナル
   抗体を産生し得るハイブリドーマ。
7. 【請求項７】 ハイブリドーマがＦＳ−０２（ＦＥＲＭ
   Ｐ−１４６８１）である請求項６に記載のハイブリド
   ーマ。
8. 【請求項８】 請求項１乃至５に記載のモノクローナル
   抗体を産生し得るハイブリドーマを培養し、培養物から
   モノクローナル抗体を採取するモノクローナル抗体の製
   造方法。
9. 【請求項９】 培養物から塩析、透析、濾過、濃縮、ゲ
   ル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフ
   ィー、アフィニティークロマトグラフィー、吸着クロマ
   トグラフィー、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロ
   マトグラフィー、ゲル電気泳動及び／又は等電点電気泳
   動によりモノクローナル抗体を採取する請求項８に記載
   のモノクローナル抗体の製造方法。
10. 【請求項１０】 ハイブリドーマがＦＳ−０２（ＦＥＲ
    Ｍ Ｐ−１４６８１）である請求項８又は９に記載のモ
    ノクローナル抗体の製造方法。
11. 【請求項１１】 請求項１乃至５に記載のモノクローナ
    ル抗体を含んでなる悪性腫瘍検査剤。
12. 【請求項１２】 モノクローナル抗体が放射性同位元
    素、酵素及び／又は蛍光物質で標識されている請求項１
    １に記載の悪性腫瘍検査剤。
13. 【請求項１３】 被検者の血液、尿及び／又は組織に請
    求項１乃至５に記載のモノクローナル抗体を作用せし
    め、免疫反応により悪性腫瘍を検出する悪性腫瘍検査方
    法。
14. 【請求項１４】 モノクローナル抗体が放射性同位元
    素、酵素及び／又は蛍光物質で標識されている請求項１
    ３に記載の悪性腫瘍検査方法。