KR100904844B1 - 인유두종 바이러스（ｈｐｖ）유전자를 포함하는자궁경부암의 치료 또는 예방용 ｄｎａ 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인유두종 바이러스(HPV)의 E5 유전자를 포함하는 자궁경부암 치료용 DNA 백신, 및 상기 E5 유전자와 함께 HPV 바이러스의 L1 및/또는 L2 유전자를 포함하는 자궁경부암의 예방 및 치료용 복합 DNA 백신에 관한 것이다.

인유두종바이러스, HPV, 자궁경부암, E5 유전자, 치료백신, 복합백신

Description

인유두종 바이러스（ＨＰＶ）유전자를 포함하는 자궁경부암의 치료 또는 예방용 ＤＮＡ 백신{A DNA Vaccine for treating or preventing cervical cancer comprising a gene encoding HPV protein}

본 발명은 자궁경부암 예방 및 치료백신으로서의 DNA 백신에 관한 것으로, 구체적으로 자궁경부암의 100%에서 발견되는 인유두종 바이러스(HPV: human papillomavirus)의 캡시드 L1 유전자와 E5 유전자를 이용한 복합 DNA 백신에 관한 것이다.

인유두종 바이러스는 8 kb의 환상의 이중나선 바이러스로서, 모든 유형의 HPV 바이러스는 유사한 성질의 단백질을 합성하는 DNA 부분인 열린해독틀(open reading frames, ORFs)을 가지며, 크게 초기 유전자(early gene)와 후기 유전자(late gene)로 구분된다. 약 4.5 kb의 초기 유전자는 바이러스 DNA 복제와 관련된 유전자(E1), 숙주 세포의 악성화 변형(malignant transformation)을 야기하는 단백질을 형성하는 DNA의 작용을 유발하거나 억제하는 유전자(E2), 숙주세포와 바이러스 성장과 관련된 단백질의 합성과 관련된 유전자(E4), EGF(epidermal growth factor)와 CSF(colony stimulator factor) 수용체의 작동유발과 관련된 유전자(E5), 세포의 영구생존 및 암 유전자의 활성과 암 억제인자의 비활성화 기전에 의한 악성화 변형과 관련된 유전자(E7) 등으로 나눌 수 있다. 특히 HPV가 숙주의 상피세포를 감염시킨 후에 발현되는 종양원성(oncogenic) 단백질인 E6와 E7은 각각 숙주세포의 종양 억제 단백질인 p53과 pRB와 결합하여 이들 종양억제 단백질의 기능을 억제함으로써, 결과적으로 감염 세포의 형질전환에 따른 종양형성으로 발전하는 것으로 규명되고 있다.

한편, 2.5 kb의 후기 유전자는 바이러스 주외피 단백질(L1)과 부외피 단백질(L2)의 합성을 담당하는 DNA와 이들의 전사와 번역 기능을 조절하는 비발현 부분(non-coding region)인 1 kb 크기의 LCP(long control region)로 이루어져 있다.

최근 분자생물학적 기법의 급속한 발전에 따라 HPV의 유전학적 구조가 밝혀지면서 많은 유형(genotype)의 HPV 게놈 염기서열이 밝혀지고 있다. HPV는 E6, E7, 및 L1 유전자의 열린해독틀(ORF) 서열의 차이에 따라 유형이 결정되는데, 상기 ORF의 뉴클레오티드 서열이 10% 이상 다르면 새로운 유형으로 정의되고, 2% 이상 10% 미만 다르면 아형(subtype)으로, 2% 미만으로 다른 경우에는 변이체(variant)로 정의된다. 이와 같은 구분에 따라 현재까지 HPV는 120여종 이상의 유형이 알려져 있다.

HPV는 항문생식기암과 후두암 및 설암 등과 관련이 있을 뿐 아니라, 특히 자 궁경부암(Cervical Cancer)에 있어서는 발암 개시 및 암의 필수적 유지인자로 규명되고 있다. 자궁경부암은 자궁경부에서 발생하는 악성종양으로 전체 자궁암 발생빈도의 95% 이상을 차지하고 있으며, 전 세계 여성 암 가운데 유방암 다음으로 발생빈도가 높아 해마다 약 44만 건 정도가 신규로 보고되고 있다.

그 중에서 HPV-16, -18, -26, -30, -31, -34, -35, -39, -45, -51, -52, -53, -56, -58, -59, -61, -66, -67, -68, -69, 70, 및 -73과 같은 유형의 HPV는 자궁경부암으로의 진행률이 상대적으로 높은 것으로 밝혀져 있어 ‘고위험군(high-risk)’ HPV로 분류되며, HPV -2, -3, -6, -7, -10, -13, -32, -40, -42, -43, -44, -55, -54 및 -57과 같은 유형의 HPV는 자궁경부암으로의 진행률이 낮아 ‘저위험군(low-risk)’?HPV로 분류되고 있다.

이와 같은 HPV의 감염과 자궁경부암과의 밀접한 관련성 및 자궁경부암에 의한 높은 사망률로 인하여 자궁경부암의 예방 및 치료를 위한 효과적인 백신의 개발이 모색되고 있다.

예방 백신(prophylactic vaccine)은 인유두종 바이러스에 감염되기 전에 투여하여 바이러스 중화 항체를 유도함으로써 바이러스의 점막 침입을 막는 것이 목적이고, 치료 백신(therapeutic vaccine)은 상피세포가 HPV에 이미 감염된 사람을 대상으로 하여 세포 매개 면역 반응을 유도하는 것으로, 바이러스 복제(viral replication) 시에 투여된 치료백신은 후기 유전자를 발현하는 세포를 제거하고, 바이러스 함입(viral integration) 시에 투여된 경우는 E6, E7 유전자의 종양 단백 질을 목표로 하여 HPV 연관 종양의 성장을 조절 혹은 억제할 수 있다. 따라서 예방 백신은 HPV에 감염되기 전에 투여되어야 하고, 치료 백신은 감염 혹은 HPV로 인해 생긴 병변이 있을 때 투여되는 차이가 있으며, 또한 HPV 감염의 분자생물학적 발병기전에 따른 백신 작용의 목표점도 예방 백신은 L1 또는 L2이며 이에 대한 중화 항체를 생성하는 것인 반면, 대부분의 치료 백신은 E6 또는 E7을 이용한다는 차이점이 있다.

그런데, 예방 백신만을 사용하면 기저층에 있는 세포와 이미 전환된 세포에 있는 인유두종바이러스는 치료될 수 없다는 단점이 있었다. 예방 백신은 항원항체 반응을 유도하는데, 이미 감염된 세포는 체액성 면역으로 치료될 수 없고 세포성 면역반응에 의해서만 치료될 수 있기 때문이다. 이러한 예방 백신의 치료적 한계로 인하여 치료 백신의 개발이 필요하며, 대부분의 치료 백신은 기저층에 있는 세포와 전환된 세포에서도 발현이 잘되는 E6와 E7 단백질을 목표로 하고 있다.

전암 손상은 대개 침습성 악성보다 적은 암세포를 포함하기 때문에, 초기에 유도되는 면역 반응은 더욱 효과적으로 종양세포를 박멸시킬 수 있는 기회를 제공할 것이라고 추측된다. 게다가 암 발생 초기 단계가 지나면 MHC classⅠ과 MHC class Ⅱ의 발현율이 낮아져 종양 항원 단백질의 표출이 감소되며, 이로 인해 면역 반응이 감소하게 된다. 또한 HPV16 E5에 대한 림프구 증식은 상피내 종양형성 손상(SILs) 정도와 반비례함이 몇몇 연구에서 밝혀졌다. 따라서 SILs 및 콘딜로마(condyloma)와 같은 E5 발현 전암 손상에서, HPV 감염의 초기에 발현되는 E5를 특이하게 죽일 수 있는 살상세포를 유도하여 살상세포에 의한 E5를 백신 타겟 으로 이용하는 것이 악성 자궁경부암으로 진행되는 것을 초기에 막을 수 있는 합리적인 방법이라고 할 수 있다.

한편, L1 단백질은 세포 감염 후기에 생산되는 단백질로서 감염된 세포의 분화가 이루어진 상피세포에서 바이러스 증식에 따라 바이러스 자손이 만들어질 때 어셈블리에 관여하는 단백질로서 체액성 및 세포성 면역반응을 효과적으로 유도한다는 연구결과가 발표 되었다. 따라서, E5 유전자 뿐만 아니라 L1 유전자를 함께 사용하면 바이러스 감염 전 단계를 통해 L1-특이 세포성 면역반응의 유도로 효율적인 치료효과를 기대할 수 있다.

이에 본 발명자는 E5를 표적으로 하여 조기에 효과적으로 종양을 박멸할 수 있는 HPV 치료 백신을 개발하고자 하였으며, 또한 상기 백신에 HPV의 외피 단백질인 L1 및/또는 L2를 코딩하는 유전자를 함께 포함함으로써 예방 및 바이러스 감염 전 단계를 거쳐 치료 효과를 모두 갖는 DNA 복합 백신을 개발하고자 하였다. 그 결과, HPV의 E5 유전자 및 L1 및/또는 L2 유전자를 포함하는 DNA 백신이 체액성 면역 반응과 세포성 면역 반응을 효과적으로 유도함을 확인하여 본 발명을 완성하였으며, 또한, 상기 백신의 투여 시에 문신기구(tattoo device)를 이용하여 백신을 진피내로 주사함으로써, 매우 적은 양의 항원으로 짧은 기간 내에 면역반응 유도 효율을 현저히 높일 수 있음을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 인유두종 바이러스 E5 유전자를 포함하는 자궁경부암 치료용 DNA 백신을 제공하는 것을 첫 번째 목적으로 한다.

본 발명은 또한 HPV의 E5 유전자와 함께 HPV의 외피 단백질 L1 및/또는 L2를 코딩하는 유전자를 더 포함하는 자궁경부암의 치료 및 예방을 위한 DNA 복합 백신을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

본 발명은 또한 상기 백신 및 약제학적으로 유효한 담체를 포함하는 백신 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

나아가, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 백신의 면역효능을 높이기 위하여 상기 백신을 진피내로 주입하는 방법 및 진피 내 투여에 적합한 백신 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

하나의 양태로서, 본 발명은 인유두종 바이러스(HPV)의 E5 유전자를 포함하는 자궁경부암의 치료용 DNA 백신에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 치료 백신은 상피세포가 HPV에 의해 이미 감염된 사람을 대상으로 하여 세포 매개 면역 반응의 하나인 살상세포능을 유도하여 HPV 종양의 성장을 조절 혹은 억제함으로써 치료하고자 하는 백신을 의미한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 치료 백신은 HPV E5 유전자에 관한 PCR 프라이머를 제작하고 PCR을 통해 얻은 PCR 산물을 적절한 발현벡터에 클로닝한 후, 이를 숙주세포에 형질전환시켜 E5 유전자를 대량생산하여 제조하였다. 이때, 숙주세포로는 원핵 또는 진핵세포 중 어떤 것이라도 사용할 수 있으나, 편리하게 대장균(E.coli)과 같은 원핵세포를 이용하여 E5 유전자를 대량 생산할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 자궁경부암의 예방 및 치료를 위한 DNA 복합 항원 백신에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 “복합 항원 백신”은 치료 효과 뿐 아니라 예방 효과를 동시에 나타낼 수 있는 백신으로서, 치료 효과를 위한 E5 유전자 뿐 아니라 예방 효과를 위한 DNA 유전자를 더 포함하는 백신을 말한다. 바람직하게, 예방 효과를 위한 DNA 유전자는 HPV의 외피 단백질인 L1 및/또는 L2 유전자일 수 있다.

본 발명에 따른 복합 항원 백신은 예방 효과를 위한 L1 및/또는 L2 유전자와 치료 효과를 위한 E5 유전자를 각각의 플라스미드에 삽입하여 상기 각 유전자가 삽입된 플라스미드를 혼합함으로써 제조될 수 있거나, 또는 상기 유전자들을 동시에 발현할 수 있는 하나의 플라스미드에 상기 유전자들을 모두 삽입한 하나의 플라스미드를 포함함으로써 제조될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 복합 항원 백신은 E5 유전자와 L1 및/또는 L2 유전자를 각각의 플라스미드에 포함시켜 이들 플라스미드를 혼합하여 제조할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 인유두종 바이러스로 HPV 유전자형 16을 사용하였으나, 본 발명은 이에 제한되지 않고 다른 유형의 인유두종 바이러스의 E5 유전자를 사용할 수 있다. HPV 유전자형 16 이외에 자궁경부암으로의 진행률이 상대적으로 높은 고위험군 HPV로는 유전자형 18형, 26형, 30형, 31형, 33형, 34형, 35형, 39형, 45형, 51형, 52형, 53형, 56형, 58형, 59형, 61형, 66형, 67형, 69형, 70형 및 73형 등이 있다. 따라서, 자궁경부암의 예방 및 치료를 위한 DNA 백신은 상기 고위험군 HPV 유전자형으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 E5 유전자와 L1 및/또는 L2 유전자를 포함할 수 있다.

한편, 이때 사용되는 L1 및/또는 L2 유전자와 E5 유전자는 포유동물에서의 발현율을 높이기 위해 코돈 최적화된 것을 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 코돈 최적화된 L1 유전자(L1h)로서 서열번호 10에 나타난 바와 같은 염기 서열을 갖는 핵산 분자를 사용하였으며, 코돈 최적화된 L2 유전자(L2h)로서 서열번호 12에 나타난 바와 같은 염기 서열을 갖는 핵산 분자를 사용하였으며, 코돈 최적화된 E5 유전자는 서열번호 14에 나타난 바와 같은 염기 서열을 갖는 핵산 분자를 사용하였다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 복합 항원 백신을 제조하기 위하여, 먼저 HPV-16 L1 및 L2 유전자를 Im Neuenheimer Feld 280, D-69120 Heidelberg, Germany에 위치한 Deutsches Krebsforschungszentrum(독일 암 연구센터)로부터 연구 목적으로 제공받은 p16L1h 및 p16L2h 플라스미드로부터 얻어, 이를 pcDNA3.1(-)(Invitrogen, US)이라는 표유동물 발현 벡터에 각각 클로닝하여 pcDNA-L1h 및 pcDNA-L2h 플라스미드를 얻고, 그 후 이들 플라스미드를 E.coli에 형질전환하여 배양함으로써 L1 및 L2 유전자를 포함하는 플라스미드를 대량으로 얻었다(실시예 1-1 및 실시예 1-2, 실시예 6). 상기 pcDNA-L1h 및 pcDNA-L2h 플라스미드는 편의상 본원 명세서에서 pcL1h 또는 pcL2h 라는 명칭과 혼용하여 사용한다.

또한, HPV-16 E5 유전자는 알려진 유전정보를 이용하여 상기 유전자의 염기서열을 100% 포함하는 PCR 프라이머를 제작하여 overlapping PCR을 통해 얻은 PCR 산물을 pcDNA3.1A(Invitrogen, US)이라는 표유동물 발현 벡터에 클로닝하여 플라스미드 DNA 작제물 pcDNA-E5를 만들고, 이를 E.coli에 형질전환하여 배양함으로써 얻었다(실시예 1-3 및 실시예 6). 이와 같이 얻어진 pcDNA-E5라는 표현 또한 본원 명세서에서는 편의상 pcE5, pcE5(opti) 또는 pcDNA-E5(opti)라는 표현과 혼용될 수 있다.

이와 같이 얻어진 pcE5와 pcL1h를 혼합하여 면역화시킨 경우 L1 특이적인 항체의 양이 증가함을 확인할 수 있었고(도 16 참조), 또한 암 단백질 E5 및 캡시드 단백질 L1 특이 살상 세포능을 가진 CTL 세포가 유도됨을 알 수 있었다(도 19 등).

이러한 실험 결과를 통하여, E5 유전자를 포함하는 본 발명에 따른 DNA 백신이 자궁경부암에 대한 치료 백신으로 사용될 수 있음을 확인하였으며, 또한 L1 및/또는 L2 유전자를 더 포함하는 경우, 치료 및 예방 효과를 모두 가지는 DNA 복합 항원 백신으로 이용 가능함을 알 수 있었다.

따라서 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 백신 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 면역보조제를 포함하는 자궁경부암의 예방 또는 치료를 위한 백신 조성물을 제공한다.

본원 명세서에서 “면역 보조제”란, 개체에 투여되거나 시험관 내에서 테스트할 때 항원이 투여되는 피험체에서 항원에 대한 면역 반응을 증가시키거나 또는 면역계로부터의 세포의 특정 활성을 강화시키는 화합물을 말한다. 면역보조제로는 세포성 면역을 유도할 수 있으며 안전한 것으로서 당업계에 알려진 어떤 면역보조제라도 바람직하게 사용할 수 있다. 본원 실시예에서는, 면역보조제로서 IL-15, GM-CSF 및 LTB를 사용하였으나, 본 발명은 이에 제한되지 않는다.

상기 백신 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하고 인체 또는 수의용으로 제형화되어 다양한 경로로 투여될 수 있는데, 투여 경로는 경구, 복강, 정맥, 근육, 피하, 피내 등의 경로로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 주사제로 제형화하여 투여하는 것이다. 또한 특히 바람직하게는, 진피내로 주사되는 것이다.

본 발명의 구체적 실시예에서 본 발명에 따른 백신을 근육주사에 의한 근육 내 투여 또는 통상의 문신기구(tatoo device)를 이용한 진피 내로 투여한 경우를 비교한 결과, 문신기구를 이용한 진피 내 투여의 경우 면역반응 유도 효율이 더욱 높음을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 또 하나의 양태로서, 면역 유발능력을 높일 수 있는 상기 백신 조성물의 진피내 주사 방법 및 이에 적합한 백신 조성물을 제공한다.

주사제는 생리식염액, 링거액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스텔(예, 올레인산에칠 등), 알코올류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트퓸, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약제학적 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적 유효량으로 투여한다. 용어 "약제학적 유효량"이란 백신효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 투여될 항원에 따라 달라지며, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 1회 내지 수회 투여가능하다. 바람직하게, 본 발명의 백신 조성물은 실험생쥐의 경우 10 μg 내지 20 μg 의 투여량으로 투여되는 것이 바람직하다.

한편, 또 하나의 양태로서, 본 발명은 E5 암단백질을 안정적으로 발현할 수 있는 세포주를 제공한다. 본 발명에 따른 세포주는 E5 유전자를 TC-1 세포(Johns Hopkins University, School of Medicine으로부터 연구 목적을 위해 제공받음)에 형질전환시킴으로써 제조할 수 있었는데(실시예 4), 이러한 세포주가 E5 단백질을 안정적이고도 지속적으로 발현할 수 있음으로 인하여, 이는 종양 모델 시스템의 구축, 특히 HPV 바이러스 감염의 치료 또는 예방 효과를 확인하거나, 또는 HPV 감염 치료 약물 개발을 위한 스크리닝 등에 매우 효과적으로 이용될 수 있으며, 또는 지노믹스(genomics) 및/또는 프로테오믹스(proteomics)를 이용한 자궁경부암의 진단 및 예후를 결정할 수 있는 바이오마커 개발을 위한 시료로 사용 될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 E5 및 L1/L2 포함 복합 항원 백신을 이용하여 면역화한 경우, 빠르게는 최초 면역주사 후 4 주만에 L1 특이 항체가 형성되었고, 8주 만에 최초 CTL 어세이 결과 암 단백질 E5 특이 살상세포능을 가진 CTL 세포들이 유도되었으며, 이들 항체는 70% 정도의 중화능이 있었다. 또한 상기 복합 유전자백신을 진피내 경로를 통하여 주사하였을 때, 적은 양의 DNA(10㎍/dose 혹은 10ug/10ul volume)로 짧은 시간 내에 HPV L1 특이 중화항체와 E5 특이 살상세포가 형성됨을 알 수 있었다. 따라서 본 발명에 따른 상기 HPV E5 및/또는 L1/L2 복합 항원 백신은 자궁경부암의 치료 및 예방에 매우 효과적인 백신임을 알 수 있다.

실시예 1. 플라스미드 DNA 작제물

1-1. HPV -16 L1 플라스미드의 제작

HPV-16 L1 유전자는 Im Neuenheimer Feld 280, D-69120 Heidelberg, Germany에 위치한 Deutsches Krebsforschungszentrum(독일 암 연구센터)의 Martin Mulle 박사로부터 제공받은 p16L1h 플라스미드로부터 얻어진 것이다. 상기 플라스미드 내 L1 유전자인 L1h는 포유동물 세포에서의 발현율을 높이기 위해 코돈 최적화된 것이다. 상기 p16L1h 플라스미드 벡터에서 L1h 영역을 Not 및 HindШ 제한효소를 이용하여 절단한 후, 동일한 효소로 절단한 pcDNA3.1(-)(Invitrogen, US) 포유동물 발현벡터에 클로닝하여 pcDNA-L1h 플라스미드를 제작하였으며, 이 과정을 개략적으로 도 1a에 나타내었다. 한편, 상기 pcDNA-L1h 플라스미드는 편의상 이하 pcL1h라고도 명명된다. 이 pcL1h를 E.coli에 형질전환하였으며, 형질전환 여부를 벡터를 제한효소 처리하여 전기영동함으로써 확인하였다(도 2a). 또한 이러한 L1h의 유전자 염기서열을 pc16L1h의 염기서열과 비교하여 도 3a에 나타내고, 서열번호 10에 그 염기서열을, 서열번호 11에 그 아미노산 서열을 나타내었다.

1-2. HPV -16 L2 플라스미드의 제작

HPV-16 L2 유전자는 Im Neuenheimer Feld 280, D-69120 Heidelberg, Germany 에 위치한 Deutsches Krebsforschungszentrum(독일 암 연구센터)의 Martin Mulle 박사로부터 제공받은 p16L2h 플라스미드(Diana V. Pastrana et al,, 2004)로부터 얻어진 것이다. 이 작제물에 사용된 L2 유전자인 L2h는 포유동물 세포에서의 발현율을 높이기 위해 코돈 최적화된 것이다. 상기 p16L2h 플라스미드 벡터에서 L2h 영역을 Not I 및 HindШ 제한효소를 이용하여 절단한 후, 동일한 효소로 절단한 pcDNA3.1(-)(Invitrogen, US) 포유동물 발현벡터에 클로닝하여 pcDNA3.1(-)-L2h를 제작하였으며, 이 과정을 개략적으로 도 1b에 나타내었다. 상기 제작된 pcDNA3.1(-)-L2h를 본원 명세서에서는 간단히 pcL2h로도 명명한다. 상기 pcL2h 플라스미드를 E.coli에 형질전환 하였으며, 형질전환 여부를 벡터를 제한효소 처리하여 전기영동함으로써 확인하였다(도 2b). 또한 L2 유전자 염기서열을 pcL2h의 염기서열과 비교하여 도 3b에 나타내고 L2h의 염기서열은 서열번호 12로 그리고 아미노산 서열은 서열번호 13에 나타내었다.

1-3. HPV -16 E5 플라스미드의 제작

HPV-16 E5 유전자 100%의 염기서열을 포함하는 PCR 프라이머를 도 4에 나타낸 바와 같이 서열번호 8 및 9를 가지는 것으로 제작하였다. 그리고, overlapping PCR을 위한 프라이머로서 Disbrow et al Virology, 2003, Jun 20; 311(1) :105-14에서 보고된 염기서열을 근거로 하여 하기 서열번호 1 내지 7의 프라이머들을 합성하였다. 서열번호 1 내지 7의 프라이머들은 포유동물 세포에서 발현율을 높이기 위하여 코돈 최적화된 것이다.

HP5Hu.s1:82mer-ATGACAAATCTGGATACTGCATCCACAACACTGCTGGCGTGCTTTCTGCTGTGCTTTTGTGTGCTGCTGTGTGTCTGCCTGC (서열번호 1)

HP5Hu.s2: 86mer-

TGATCAGGCCCCTGCTGCTGTCTGTGTCTACATACACATCCCTGATCATCCTGGTGCTGCTGCTGTGGATCACAGCAGCCTCTGCC (서열번호 2)

HP5Hu.s3: 81mer-

TTTAGGTGTTTTATTGTGTATATTATCTTTGTGTATATCCCACTGTTTCTGATCCATACACATGCACGCTTTCTGATTACA (서열번호 3)

HP5Hu.as1: 43mer-

TGTAATCAGAAAGCGTGCATGTGTATGGATCAGAAACAGTGGG (서열번호 4)

HP5Hu.as2: 85mer-

ATATACACAAAGATAATATACACAATAAAACACCTAAAGGCAGAGGCTGCTGTGATCCACAGCAGCAGCACCAGGATGATCAGGG (서열번호 5)

HP5Hu.as3: 81mer-

ATGTGTATGTAGACACAGACAGCAGCAGGGGCCTGATCAGCAGGCAGACACACAGCAGCACACAAAAGCAC AGCAGAAAGC (서열번호 6)

HP5Hu.as4: 40mer-

ACGCCAGCAGTGTTGTGGATGCAGTATCCAGATTTGTCAT (서열번호 7)

상기 서열번호 1 내지 7의 프라이머들을 PAGE 정제한 후, pcDNA에 클로닝하기 위한 삽입물을 만들기 위하여 도 4의 프라이머(서열번호 8 및 서열번호 9)와 한 PCR 튜브에 넣고 Ampligase Thermostable DNA Ligase (Epicentre, US)를 이용하여 서로 어닐링, 라이게이션, 및 증폭되도록 PCR을 통하여 유전자를 인공 합성하였다. 따라서, 인공 제조된 PCR 산물 역시 포유동물 세포에서의 발현율을 높이기 위해 코돈 최적화된 것이다.

PCR을 통해 얻은 PCR 산물을 pcDNA3.1A(Invitrogen, US)에 클로닝하여 pcDNA-E5 플라스미드를 제작하였으며, 클로닝된 벡터를 E.coli에 형질전환시켰다. 그 후 형질전환된 E.coli로부터 플라스미드를 분리하고 제한효소로 절단하여 전기영동함으로써 클로닝 여부를 확인하였다(도 5). 도 5에 나타난 바와 같이, E5 유전자의 크기는 약 250 bp임을 확인하였다. 상기 유전자의 염기 서열을 확인하여 그 결과를 논문(G. L. Disbrow et al., Virology 311(2003), 105-114)에 발표된 코돈 최적화된 HPV-16 E5의 원래 염기 서열과 정렬하여 비교 확인하였으며(도 6), 그 염기서열을 서열번호 14에, 그 아미노산 서열을 서열번호 15에 나타내었다. 한편, 상기 pcDNA-E5 플라스미드는 편의상 본원 명세서에서 pcE5, pcE5(opti) 또는 pcDNA-E5(opti)로 명명되기도 한다.

실시예 2. pcDNA - L1h , E5 에 대한 IFA( Indirect Immunoflurescence Assay )

2-1. pcL1h 에 대한 IFA

실시예 1-1에서 제조된 pcL1h를 RD 세포(Rhabdomyosarcoma cell line: ATCC (cat No. CCL136) US)에 Fugene 6를 이용하여 transient transfection 한 후, 2일 후 IFA(간접형광항체법)를 수행하였다. 이때, 1차 항체로 HPV 16 L1-특이성 CamVir-1 항체를, 2차 항체로는 Alexa Fluor 488로 라벨된 항-생쥐 IgG를 사용하였다. 음성 대조군과는 달리 pcL1h가 형질도입된 세포에서는 핵을 중심으로 형광 신호가 관찰되는 것을 확인할 수 있었다(도 7).

2-2. pcE5 에 대한 IFA

실시예 1-3에서 제조된 pcE5도 실시예 2-1에서와 같은 RD 세포에 Fugene 6를 이용하여 transient transfection한 후, 2일 후 IFA를 수행하였다. 이때 1차 항체로 생쥐 항-His(Invitrogen, US)를 사용하였고, 2차 항체로는 Alexa Fluor 488 라벨된 항-생쥐 IgG를 이용하였다. 형광 신호로부터, E5 단백질이 음성 대조군과 비교할 때 세포질에서 발현하는 것을 확인할 수 있었다(도 8).

실시예 3. pcL1h 와 E5 의 웨스턴 블럿

3-1. pcL1h 의 웨스턴 블럿

pcL1h를 293TT 세포에 전기영동방법을 이용하여 transient transfection 한 후, 2일 뒤 세포를 용해시켜 (용해버퍼: MgCl₂, Brij58, Benzonase, Plasmid-Safe ATP-dependent DNase) 세포 용출물을 얻고, 이를 웨스턴 블럿을 수행하여 분석하였다. 이 때, 1차 항체로 CamVir-1 항체를 사용하였고, 2차 항체로는 생쥐 IgG-HPR(Sigma, US, 1:2000)을 이용하였다. 약 53 kDa에서 L1h 특이적 밴드가 검출되는 것을 확인함으로써(도 9, 레인 2), pcL1h 플라스미드가 in vitro에서 발현되는 것을 확인하였다. 도 9에서, 레인 1은 원래 독일에서 얻은 L1h 유전자를 포함하였던 p16L1h 플라스미드로 형질도입된 세포의 용출물을 분석한 것이고, 레인 3은 SEAP(Secreted Enhanced Alkaline Phosphatase) 리포터 유전자를 포함하는 수도비리온(pseudovirion) L1 VLP(Virus-like particle)를 Opti-prep 컬럼 정제를 통해 분리하여 웨스턴 블럿한 결과이다.

3-2. pcE5 의 웨스턴 블럿

pcE5를 293TT 세포에 칼슘 포스페이트(calcium phosphate) 방법을 이용하여 transient transfection 한 후, 2 일 뒤 RIPA 버퍼를 이용하여 세포를 용해시키고, 얻은 단백질을 이용하여 웨스턴 블럿을 수행하였다. 이때 1차 항체로 생쥐 항-V5(Invitrogen, US, 1:5000)를 이용하였고, 2차 항체로는 생쥐 IgG-HRP(Sigma, US, 1:2000)를 이용하였다. pcDNA만 transfection시킨 음성 대조군과 비교할 때 약 13 kD에서 특이적 밴드가 관찰 되었다(도 10).

실시예 4. TC -1/ E5 안정화된 세포주의 확립

Johns Hopkins University, School of Medicine으로부터 연구 목적을 위해 제공받은 TC-1 세포에 실시예 1-3에서 제조된 pcE5(opti)와 pPURO 플라스미드(Clontech, US)를 Fugene-6를 이용하여 공동-형질도입하고, 2 일 후 퓨로마이신 1.5 ㎍/㎖을 지속적으로 처리하여 선별하였다. 이렇게 선별하여 얻어진 TC-1/E5 세포주를 트라이졸(trizol)을 이용하여 RNA를 추출하고 E5 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 그 후 생산된 PCR 산물을 전기영동한 결과, 각 샘플에서 약 250 bp의 E5-특이적인 밴드가 관찰되었다(도 11).

이렇게 E5를 안정하게 발현하는 TC-1/E5 세포를 또한 IFA와 웨스턴 블럿을 통하여 E5 발현 여부를 단백질 수준에서 확인하였다. 그 결과, 도 12 및 도 13에 나타난 바와 같이, E5 단백질을 지속적이고도 안정적으로 발현함을 알 수 있었다. 이렇게 HPV-E5 단백질을 안정적으로 발현할 수 있는 세포주는, 아래 실시예에서와 같이, 종양모델시스템을 구축하는데 매우 유용하게 사용될 수 있으며, 특히 파필로마 바이러스 감염의 치료 및 예방 백신의 제조 및 효과 확인을 위하여 유용하게 사용될 수 있다. 뿐만 아니라 지노믹스(genomics) 및/또는 프로테오믹스(proteomics)를 이용한 자궁경부암 진단 및 예후를 결정할 수 있는 바이오마커(biomarker) 개발을 위한 시료로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명자는 상기 TC-1/E5#7 세포주를 2006년 8월 19일자로 서울대학교 암연구소 소재 한국세포주은행기관에 수탁번호 KCLRF-BP-00140로서 기탁하였다.

실시예 5. 종양 모델 시스템( Tumor model system )

실시예 1-1 및 1-3에서 만들어진 HPV L1h/E5 DNA 백신의 종양 감소(regression)와 예방 효과를 검정하기 위하여 생쥐 종양 모델 시스템을 구축하였다. 실시예 4에서 확립된 TC-1/E5 세포주를 C57BL/6 생쥐 뒷다리에 피하 주사하여 종양이 형성됨을 확인하였다(도 14a 및 14b).

실시예 6. 면역화와 ELISA( Immunization and ELISA )

실시예 1에서 제조된 플라스미드를 각각 E.coli에 형질전환시켜 배양한 후, 이로부터 얻은 플라스미드들을 DNA Endotoxin-free Giga prep kit(Qiagen)을 이용하여 정제하여 pcE5(opti)와 pcL1h 및 pcL2h를 대량으로 얻고, 이들 DNA를 이용하여 생쥐 면역화를 수행하였다.

하기 표 1 내지 3에 나타낸 바와 같이, 세 가지 면역화 실험을 수행하였는데, 표 1로 표시된 첫 번째 생쥐 면역화를 위해서는, C57BL/6(4주령) 생쥐 24 마리를 각 그룹 당 6 마리씩 4 개의 그룹으로 나누어 실험하였으며, 표 2로 표시된 두 번째 생쥐 면역화를 위해서는, C57BL/6(4주령) 생쥐 24 마리를 각 그룹 당 4 마리씩 6 개 그룹으로 나누어 실험하였으며, 표 3으로 표시된 세 번째 생쥐 면역화를 위해서는, C57BL/6(4주령) 생쥐 40 마리를 각 그룹 당 4 마리씩 10 개 그룹으로 나누어 실험하였다. 면역화 방법은 실험에 따라 문신 기구(tattoo device) 를 이용한 진피 내 면역화(intradermal immunization) 또는 근육주사를 통한 근육내 면역화(intramuscular immunization) 방법을 수행하였으며, 이에 대한 자세한 사항은 하기 기술된 내용 및 도 15를 참조하라.

	Immunogen
그룹 1(6)	pcL1h+pCE5(opti)
그룹 2(6)	pcL1h+pCE5(opti)+pcIL15
그룹 3(6)	pcL1h+pCE5(opti)+pcGM-CSF
그룹 4(6)	PBS

	Immunogen	Adjuvant
그룹1	pcL1h+pcE5 DNA (intradermal)	LTB 10
그룹2	pcL1h+pcE5 DNA(intradermal)	No
그룹3	pcL1h+pcE5 DNA(intramuscular)	LTB 10
그룹4	pcL1h+pcE5 DNA(intramuscular)	No
그룹5	pcDNA(intradermal)	No
그룹6	pcDNA(intramuscular)	No

	Immunogen and Immunization Route
그룹1	pcL1h+pcL2h DNA (intradermal)
그룹2	pcL1h+pcL2h DNA (intramuscular)
그룹3	pcE5 DNA(intradermal)
그룹4	pcE5 DNA(intramuscular)
그룹5	pcL1h+pcE5 DNA(intradermal)
그룹6	pcL1h+pcE5 DNA(intramuscular)
그룹7	pcL1h+pcL2h+pcE5 DNA(intradermal)
그룹8	pcL1h+pcL2h+pcE5 DNA(intramuscular)
그룹9	pcDNA(intradermal)
그룹10	pcDNA(intramuscular)

표 1 및 도 15a에 나타낸 바와 같이, 첫 번째 면역화에서 그룹1~3은 각각의 유전자(10μg) 모두로 진피를 통하여 면역화 되었고, IL-15 혹은 GM-CSF를 면역보조제로 사용하였다. 표 2 및 도 15b로부터 알 수 있는 바와 같이, 두 번째 면역화 실험에서는 진피내 면역과 근육내 면역을 수행하였는데, 진피내 면역그룹에서는 모든 유전자를 10 ㎍ 사용하였으며, 근육내 면역그룹에서는 각각의 유전자를 100 ㎍씩 사용하였다. 면역경로에 상관없이 면역보조제로 사용된 LTB는 10㎍을 사용하였다. 그룹 5 내지 그룹 6은 음성 대조군으로서 pcDNA로 면역화 하였다. 표 3 및 도 15c로부터 알 수 있는 바와 같이, 세 번째 면역화 실험에서도 진피내 면역과 근육내 면역을 수행하였으며, 진피내 면역그룹에서는 모든 유전자를 10㎍ 사용하였으며, 근육내 면역그룹에서는 각각의 유전자를 100㎍씩 사용하였다. 그룹 9 내지 그룹 10은 음성 대조군으로서 pcDNA로 면역화하였다.

상기 모든 실험에서 진피내 면역화는 3일 간격으로 3번씩 수행하였고, 근육주사는 2주 간격으로 주사하였다(도 15 참조). 이렇게 면역화된 생쥐에서 혈청을 추출하여 IgG 항체 ELISA를 수행하였다. 이때 L1 단백질인 VLP를 코팅하였다. 면역주사 횟수가 증가함에 따라 특이적인 항체의 양이 점차 증가하는 것을 알 수 있으며, pcDNA만 면역화한 음성 대조군과 비교하였을 때에도 그 차이가 확연히 나타나는 것을 확인할 수 있었다(도면 16a 및 16b). LTB의 면역보조제 효과는 볼 수 없었으나 진피내 면역주사한 결과 항체 형성이 근육주사를 하였을 때보다 더 빨리 그리고 더 높게(4배 정도 큼) 나타남을 알 수 있었다. 또한, 표 2의 실험에 사용된 혈청을 이용하여 중화 어세이(neutralization assay)를 수행하였다. 2차 출혈 샘플(bleeding sample)을 이용하여 중화 활성(neutralizing activity)을 측정하였을 때, 본 발명에 따른 pcE5와 pcL1h 플라스미드를 포함하는 백신 조성물이 약 30% 정도의 중화 활성을 가짐을 알 수 있었다(도 17).

실시예 7. ELIspot 어세이 및 CTL 어세이

실시예 6에서 표 1로 나타낸 첫 번째 면역화 실험에 사용된 각 그룹의 생쥐들을 안락사시켜 비장을 꺼내 배양한 후, 비장림프구를 이용하여 ELISpot 어세이를 수행하였다. 각 웰 마다 40,000 개의 비장림프구를 넣어주었고, 각 자극제(stimulator)의 농도는 10㎍/㎖로 사용하였다. 이때 자극제로는 E5 단백질의 CTL 에피토프인 펩타이드25와 펩타이드37을 이용하였고, 정제된 VLP 단백질도 자극제로 이용하였다. 도 18a 및 18b로부터 알 수 있는 바와 같이, 이들에 대해 ELISpot 어세이를 수행한 결과, 음성 대조군(그룹 4)에 비해 면역화된 샘플 그룹(그룹 1, 2, 3)에서 IFN-감마 분비 세포 스팟수가 현저히 많음을 확인할 수 있었다. 또한, 음성 자극제(5% RPMI 및 gag peptide)에 비해서도 HPV 특이적인 자극제가 더 많은 스팟을 유도했음을 알 수 있었다.

또한 이러한 비장림프구가 E5를 발현하는 세포를 특이적으로 사멸시키는 것을 확인하기 위해 CTL 어세이를 수행하였다. 비장림프구를 각 자극제로 자극한 후 실시예 4에서 제조된 타겟 세포인 TC-1/E5 세포와 공동으로 배양하여 어세이를 수행하였다. 이때, 타겟 세포인 TC-1/E5 세포를 각 well 당 5x10³을 사용하였다. 작동체 세포(effector cell)는 각기 비율에 따라 1:5(2.5x10⁴cells)부터 1:10(5x10⁴cells), 1:20(1x10⁵cells), 및 1:50(2.5x10⁵cells)의 비율로 사용하였다. 결과는 HPV16 E5 CTL 에피토프 펩타이드(펩타이드 25 및 펩타이드 37)로 자극한 실시예 6의 표 1에 나타난 그룹 1로부터 얻은 작동체 세포(effector cell)들이 음성 대조군(그룹4)(5 % RPMI 및 gag 펩타이드로 자극화된 비장림프구)보다 약 45% ~ 60% 높은 세포독성을 나타냄을 알 수 있었다(도 19a).

한편, L1 특이적 CTL 활성을 확인하기 위하여 동일한 실험을 L1 특이적 CTL 펩타이드(pep165)로 자극하여 제조된 타겟 세포를 이용하여 수행하였다.

L1 특이적 CTL 펩타이드로 자극된 타겟 세포를 확립하기 위하여, 실시예 4에서 언급한 것과 같은 TC-1 세포를 HPV L1의 CTL 에피토프로 알려진 펩타이드 165-171(AGVDNR)을 10㎍/㎖로 16시간 이상 처리해 주었다. 이렇게 펩타이드 처리하여 제작한 TC-1/pep165 세포를 L1에 대한 CTL 타겟 세포로 사용하였다. 또한, 실시예 6의 표 3에 나타난 동물 그룹 중 1, 2, 9 및 10 번 그룹의 생쥐를 안락사시켜 비장을 꺼내 배양한 후, 비장림프구가 L1을 발현하는 세포를 특이적으로 사멸시키는 것을 확인하기 위해 CTL 어세이를 수행하였다. 이때, 타겟 세포인 TC-1/pep165 세포를 각 well 당 5x10³을 사용하였다. 작동체 세포(effector cell)는 각기 비율에 따라 1:10(5x10⁴cells)부터 시작하여 1:20(1x10⁵cells) 및 1:50(2.5x10⁵cells)의 비율로 각기 사용하였다. 결과는 HPV16 L1 CTL 에피토프 펩타이드(펩타이드 165)로 자극한 실시예 6의 표 3의 그룹 1, 2로부터 얻은 작동체 세포(effector cell)들이 음성 대조군(그룹 9, 10)으로부터 얻은 작동체 세포(gag 펩타이드로 자극화된 비장림프구)보다 약 15% 높은 세포독성을 나타냄을 알 수 있었다(도 19b). 이러한 결과로부터, 항원으로 사용한 L1 단백질은 체액성 면역 반응 뿐만 아니라 L1 특이한 IFN-감마 사이토카인을 분비할 뿐 아니라 L1-특이적으로 살상세포능을 가지는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 L1-특이적 살상세포능이 E5에 의한 살상세포능의 효과를 배가하여 치료 백신으로서의 활용 가능성을 확인할 수 있었다.

도 1은 HPV의 L1h(도 1a) 및 L2h(도 1b) 유전자를 발현벡터에 클로닝하는 과정을 개략적으로 나타낸 도면이다.

도 2는 HPV의 L1h(도 2a) 및 L2h(도 2b) 유전자가 클로닝된 벡터를 제한효소 처리하여 전기영동한 결과를 나타낸 사진이다.

도 3a는 pcDNA-L1h 플라스미드에 삽입된 L1h 유전자의 염기서열과 원래의HPVpL1h 염기서열을 비교, 정렬하여 나타낸 것이고, 도 3b는 pcDNA-L2h 플라스미드에 삽입된 L2h 유전자의 염기서열과 원래의 HPVpL2h 염기서열을 비교, 정렬하여 나타낸 것이다.

도 4는 코돈 최적화된 HPV E5 유전자에 대한 PCR 프라이머를 도시한 것이다.

도 5는 E5 유전자가 클로닝된 벡터(pcDNA-E5)에 제한효소 처리하여 전기영동한 결과이다.

도 6은 pcDNA-E5에 삽입된 코돈 최적화된 E5 유전자의 염기서열을 코돈 최적화된 원래의 HPV-E5 유전자 염기서열과 비교 정렬하여 나타낸 도면이다.

도 7은 pcDNA-L1h를 트랜스펙션한 세포와 음성 대조군에 대해 IFA(간접형광항체법)를 수행한 결과이다.

도 8은 pcDNA-E5를 트랜스펙션한 세포와 음성 대조군에 대해 IFA를 수행한 결과이다.

도 9는 pcDNA-L1h 플라스미드의 발현을 웨스턴 블럿으로 확인한 사진이다 (레인 1: p16L1h 플라스미드로 형질 도입한 세포 용해물, 레인 2: pcDNA-L1h로 형질 도입된 세포 용해물, 레인 3: opti-prep을 통해 정제된 L1 단백질인 VLP(Virus-like Particle: 바이러스 유사 입자))

도 10은 pcDNA-E5 형질전환 세포 용출물에 대한 웨스턴 블럿 결과를 나타낸다.

도 11은 TC-1/E5 세포주의 E5 유전자에 대한 RT-PCR 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.

도 12는 TC-1/E5 세포주의 IFA 결과를 나타내는 사진이다.

도 13은 TC-1/E5 세포주의 웨스턴 블럿 분석 결과를 나타내는 도면이다.

도 14a는 본 발명에 따른 TC-1/E5 세포주를 C57BL/6 생쥐 뒷다리에 피하 주사하여 종양이 형성됨을 정상 생쥐와 비교하여 나타낸 사진이고, 도 14b는 상기 종양이 형성된 생쥐로부터 분리한 종양 조직들에 대한 사진이다.

도 15는 pcL1h/E5 면역화의 세 가지 in vivo 연구를 도식화한 것으로서, 도 15a는 각 그룹에 본 발명에 따른 pcL1h 및 pcE5 플라스미드를 문신기구로 투여하되, 그룹 2의 경우 pcIL15 플라스미드를 더 혼합하고, 그룹 3의 경우pcGM-CSF 플라스미드를 더 혼합 투여하였으며, 그룹 4는 음성 대조군으로서 PBS만을 투여한 경우를 나타내며, 도 15b는 문신기구를 이용한 진피 내 투여와 근육 주사에 의한 투여에 따른 효과를 비교하기 위하여 그룹 1과 그룹 2는 pcL1h 와 pcE5 플라스미드를 문신 기구로 투여하되 그룹 1의 경우 LTB를 더 포함하는 차이만 있고, 그룹 3과 그룹 4는 각각 그룹 1 및 그룹 2와 동일한 플라스미드 및 LTB를 투여하되 모두 근육주사에 의해 투여하였으며, 그룹 5와 그룹 6의 경우 음성 대조군 으로서 HPV 유전자를 포함하지 않는 빈 벡터인 pcDNA 플라스미드만을 진피 내 및 근육 주사로 투여한 경우를 나타낸다. 또한, 도 15c의 경우 그룹 1 및 그룹 2는 pcL1h 및 pcL2h의 혼합 플라스미드를 각각 진피 내 및 근육 주사하였고, 그룹 3과 그룹 4는 pcE5 만을 각각 진피 내 및 근육 주사하였으며, 그룹 5는 본 발명에 따른 pcL1h 및 pcE5 플라스미드를 진피 내로 투여하고 그룹 6은 pcL1h 및 pcE5를 근육 주사하였으며, 그룹 7은 pcL1h+pcL2h+pcE5를 진피 내로 투여하고 그룹 8은 pcL1h+pcL2h+pcE5 를 근육 주사하였으며, 그룹 9과 그룹 10은 음성 대조군으로서 pcDNA만을 진피 내 또는 근육 주사한 것을 나타낸다.

도 16a는 pcL1h/E5로 면역화된 생쥐의 혈청내 항원 L1h 특이 항체의 ELISA 및 항체역가 결과를 나타낸 것으로, 그룹 1(G1)은 pcL1h+pcE5+LTB를 진피 내로 투여한 결과이고, 그룹 2(G2)는 pcL1h+pcE5를 진피 내로 투여한 결과이며, 그룹 3(G3)은 pcL1h+pcE5+LTB를 근육 내로 주사한 결과이고, 그룹 4(G4)는 pcL1h+pcE5를 근육 내로 투여한 결과이다. 그룹 5(G5)는 음성 대조군으로서 pcDNA를 진피 내로 투여한 경우이며, 그룹 6(G6)은 음성 대조군으로서 pcDNA를 근육 내로 주사한 결과이다.

도 16b는 L1, L2, 혹은 E5의 조합에 따른 L1 특이 항체의 ELISA 결과를 나타낸 것으로서, 그룹 1(G1)과 그룹 2(G2)는 pcL1h+pcL2h를 각각 진피 내 및 근육 내로 투여한 경우를 나타내며, 그룹 3(G3)과 그룹 4(G4)는 pcE5를 각각 진피 내 및 근육 내로 투여한 경우를 나타내며, 그룹 5(G5)와 그룹 6(G6)은 pcL1h+pcE5를 각각 진피 내 및 근육 내로 주사한 경우이고, 그룹 7(G7)과 그룹 8(G8)은 pcL1h+pcL2h+pcE5를 각각 진피 내와 근육 내로 주사한 경우를 나타낸다. 그룹 9와 그룹 10은 음성 대조군으로서 빈 벡터인 pcDAN를 각각 진피 내와 근육 내로 주사한 결과를 나타낸다.

도 17은 pcL1h/E5로 면역화된 생쥐의 중화 항체능 어세이(neutralization assay)결과를 나타낸 그래프로서, 그룹 1은 pcL1h+pcE5+LTB를 진피 내로 투여한 경우, 그룹 2는 pcL1h+pcE5를 진피 내로 투여한 경우, 그룹 3은 pcL1h+pcE5+LTB를 근육 내로 주사한 경우, 그룹 4는 pcL1h+pcE5를 근육 내로 주사한 경우, 그리고 그룹 5와 그룹 6은 음성 대조군으로서 빈 벡터인 pcDNA를 각각 진피 내 및 근육 내로 주사한 결과를 나타낸다.

도 18a는 pcL1h/E5로 진피내 면역화된 생쥐의 ELISpot 어세이 결과를 나타낸 사진이고(그룹 1: pcL1h+pcE5, 그룹 2: pcL1h+pcE5+pcIL15, 그룹 3: pcL1h+pcE+pcGM-CSF, 그룹 4: 음성 대조군), 도 18b는 각 샘플 그룹의 IFN-감마 분비 세포 스팟 수에 대한 ELISpot 데이터를 나타낸 그래프이다.

도 19a는 pcL1h/E5로 면역화된 생쥐의 E5-특이적 CTL 어세이를 나타낸 것이고, 도 19b는 pcL1h/L2h로 면역화된 생쥐의 L1-특이적 CTL 어세이를 나타낸 것이다.

<110> SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY Foundation for Corporate Collaboration <120> A DNA Vaccine for treating or preventing cervical cancer comprising a gene encoding HPV protein <150> KR10-2006-0081645 <151> 2006-08-28 <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HP5Hu.s1:82mer(primer) <400> 1 atgacaaatc tggatactgc atccacaaca ctgctggcgt gctttctgct gtgcttttgt 60 gtgctgctgt gtgtctgcct gc 82 <210> 2 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HP5Hu.s2: 86mer(Primer) <400> 2 tgatcaggcc cctgctgctg tctgtgtcta catacacatc cctgatcatc ctggtgctgc 60 tgctgtggat cacagcagcc tctgcc 86 <210> 3 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HP5Hu.s3: 81mer(Primer) <400> 3 tttaggtgtt ttattgtgta tattatcttt gtgtatatcc cactgtttct gatccataca 60 catgcacgct ttctgattac a 81 <210> 4 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HP5Hu.as1: 43mer(Primer) <400> 4 tgtaatcaga aagcgtgcat gtgtatggat cagaaacagt ggg 43 <210> 5 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HP5Hu.as2: 85mer(Primer) <400> 5 atatacacaa agataatata cacaataaaa cacctaaagg cagaggctgc tgtgatccac 60 agcagcagca ccaggatgat caggg 85 <210> 6 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HP5Hu.as3: 81mer(Primer) <400> 6 atgtgtatgt agacacagac agcagcaggg gcctgatcag caggcagaca cacagcagca 60 cacaaaagca cagcagaaag c 81 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HP5Hu.as4: 40mer(Primer) <400> 7 acgccagcag tgttgtggat gcagtatcca gatttgtcat 40 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV16 E5 sense primer <400> 8 gccgccaagc ttgccgccac catgacaaat ctggatactg 40 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV16 E5 anti-sense primer <400> 9 atcgggctcg agttatgtaa tcagaaagcg tgc 33 <210> 10 <211> 1518 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV L1h codon optimized sequence <400> 10 atgagcctgt ggctgcccag cgaggccacc gtgtacctgc cccccgtgcc cgtgagcaag 60 gtggtgagca ccgacgagta cgtggccagg accaacatct actaccacgc cggcaccagc 120 aggctgctgg ccgtgggcca cccctacttc cccatcaaga agcccaacaa caacaagatc 180 ctggtgccca aggtgagcgg cctgcagtac agggtgttca ggatccacct gcccgacccc 240 aacaagttcg gcttccccga caccagcttc tacaaccccg acacccagag gctggtgtgg 300 gcctgcgtgg gcgtggaggt gggcaggggc cagcccctgg gcgtgggcat cagcggccac 360 cccctgctga acaagctgga cgacaccgag aacgccagcg cctacgccgc caacgccggc 420 gtggacaaca gggagtgcat cagcatggac tacaagcaga cccagctgtg cctgatcggc 480 tgcaagcccc ccatcggcga gcactggggc aagggcagcc cctgcaccaa cgtggccgtg 540 aaccccggcg actgcccccc cctggagctg atcaacaccg tgatccagga cggcgacatg 600 gtggacaccg gcttcggcgc catggacttc accaccctgc aggccaacaa gagcgaggtg 660 cccctggaca tctgcaccag catctgcaag taccccgact acatcaagat ggtgagcgag 720 ccctacggcg acagcctgtt cttctacctg aggagggagc agatgttcgt gaggcacctg 780 ttcaacaggg ccggcgccgt gggcgagaac gtgcccgacg acctgtacat caagggcagc 840 ggcagcaccg ccaacctggc cagcagcaac tacttcccca cccccagcgg cagcatggtg 900 accagcgacg cccagatctt caacaagccc tactggctgc agagggccca gggccacaac 960 aacggcatct gctggggcaa ccagctgttc gtgaccgtgg tggacaccac caggagcacc 1020 aacatgagcc tgtgcgccgc catcagcacc agcgagacca cctacaagaa caccaacttc 1080 aaggagtacc tgaggcacgg cgaggagtac gacctgcagt tcatcttcca gctgtgcaag 1140 atcaccctga ccgccgacgt gatgacctac atccacagca tgaacagcac catcctggag 1200 gactggaact tcggcctgca gccccccccc ggcggcaccc tggaggacac ctacaggttc 1260 gtgaccagcc aggccatcgc ctgccagaag cacacccccc ccgcccccaa ggaggacccc 1320 ctgaagaagt acaccttctg ggaggtgaac ctgaaggaga agttcagcgc cgacctggac 1380 cagttccccc tgggcaggaa gttcctgctg caggccggcc tgaaggccaa gcccaagttc 1440 accctgggca agaggaaggc cacccccacc accagcagca ccagcaccac cgccaagagg 1500 aagaagagga agctgtga 1518 <210> 11 <211> 505 <212> PRT <213> Human Papiloma Virus <400> 11 Met Ser Leu Trp Leu Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val 1 5 10 15 Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ala Arg Thr Asn 20 25 30 Ile Tyr Tyr His Ala Gly Thr Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro 35 40 45 Tyr Phe Pro Ile Lys Lys Pro Asn Asn Asn Lys Ile Leu Val Pro Lys 50 55 60 Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Ile His Leu Pro Asp Pro 65 70 75 80 Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr Gln 85 90 95 Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Val Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro 100 105 110 Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp 115 120 125 Thr Glu Asn Ala Ser Ala Tyr Ala Ala Asn Ala Gly Val Asp Asn Arg 130 135 140 Glu Cys Ile Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Leu Ile Gly 145 150 155 160 Cys Lys Pro Pro Ile Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Ser Pro Cys Thr 165 170 175 Asn Val Ala Val Asn Pro Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Asn 180 185 190 Thr Val Ile Gln Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met 195 200 205 Asp Phe Thr Thr Leu Gln Ala Asn Lys Ser Glu Val Pro Leu Asp Ile 210 215 220 Cys Thr Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Ile Lys Met Val Ser Glu 225 230 235 240 Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Tyr Leu Arg Arg Glu Gln Met Phe 245 250 255 Val Arg His Leu Phe Asn Arg Ala Gly Ala Val Gly Glu Asn Val Pro 260 265 270 Asp Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Ser Thr Ala Asn Leu Ala Ser 275 280 285 Ser Asn Tyr Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp Ala 290 295 300 Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His Asn 305 310 315 320 Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr 325 330 335 Thr Arg Ser Thr Asn Met Ser Leu Cys Ala Ala Ile Ser Thr Ser Glu 340 345 350 Thr Thr Tyr Lys Asn Thr Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Arg His Gly Glu 355 360 365 Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr 370 375 380 Ala Asp Val Met Thr Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Thr Ile Leu Glu 385 390 395 400 Asp Trp Asn Phe Gly Leu Gln Pro Pro Pro Gly Gly Thr Leu Glu Asp 405 410 415 Thr Tyr Arg Phe Val Thr Ser Gln Ala Ile Ala Cys Gln Lys His Thr 420 425 430 Pro Pro Ala Pro Lys Glu Asp Pro Leu Lys Lys Tyr Thr Phe Trp Glu 435 440 445 Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu 450 455 460 Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Lys Ala Lys Pro Lys Phe 465 470 475 480 Thr Leu Gly Lys Arg Lys Ala Thr Pro Thr Thr Ser Ser Thr Ser Thr 485 490 495 Thr Ala Lys Arg Lys Lys Arg Lys Leu 500 505 <210> 12 <211> 1422 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV L2 codon optimized sequence <400> 12 atgaggcaca agaggagcgc caagaggacc aagagggcca gcgccaccca gctgtacaag 60 acctgcaagc aggccggcac ctgccccccc gacatcatcc ccaaggtgga gggcaagacc 120 atcgccgacc agatcctgca gtacggcagc atgggcgtgt tcttcggcgg cctgggcatc 180 ggcaccggca gcggcaccgg cggcaggacc ggctacatcc ccctgggcac caggcccccc 240 accgccaccg acaccctggc ccccgtgagg ccccccctga ccgtggaccc cgtgggcccc 300 agcgacccca gcatcgtgag cctggtggag gagaccagct tcatcgacgc cggcgccccc 360 accagcgtgc ccagcatccc ccccgacgtg agcggcttca gcatcaccac cagcaccgac 420 accacccccg ccatcctgga catcaacaac accgtgacca ccgtgaccac ccacaacaac 480 cccaccttca ccgaccccag cgtgctgcag ccccccaccc ccgccgagac cggcggccac 540 ttcaccctga gcagcagcac catcagcacc cacaactacg aggagatccc catggacacc 600 ttcatcgtga gcaccaaccc caacaccgtg accagcagca cccccatccc cggcagcagg 660 cccgtggcca ggctgggcct gtacagcagg accacccagc aggtgaaggt ggtggacccc 720 gccttcgtga ccacccccac caagctgatc acctacgaca accccgccta cgagggcatc 780 gacgtggaca acaccctgta cttcagcagc aacgacaaca gcatcaacat cgcccccgac 840 cccgacttcc tggacatcgt ggccctgcac aggcccgccc tgaccagcag gaggaccggc 900 atcaggtaca gcaggatcgg caacaagcag accttgagga ccaggagcgg caagagcatc 960 ggcgccaagg tgcactacta ctacgacttg agcaccatcg accccgccga ggagatcgag 1020 ctgcagacca tcacccccag cacttacacc accaccagcc acgccgccag ccccaccagc 1080 atcaacaacg gcctgtacga catctacgcc gacgacttca tcaccgacac cagcaccacc 1140 cccgtgccca gcgtgcccag caccagcctg agcggctaca tccccgccaa caccaccatc 1200 cccttcggtg gcgcctacaa catccccctg gtgagcggcc ccgacatccc catcaacatc 1260 accgaccagg cccccagcct gatccccatc gtgcccggca gcccccagta caccatcatc 1320 gccgacgccg gcgacttcta cctgcacccc agctactaca tgctgaggaa gaggaggaag 1380 aggctgccct acttcttcag cgacgtgagc ctggccgcct ga 1422 <210> 13 <211> 473 <212> PRT <213> Human Papiloma Virus <400> 13 Met Arg His Lys Arg Ser Ala Lys Arg Thr Lys Arg Ala Ser Ala Thr 1 5 10 15 Gln Leu Tyr Lys Thr Cys Lys Gln Ala Gly Thr Cys Pro Pro Asp Ile 20 25 30 Ile Pro Lys Val Glu Gly Lys Thr Ile Ala Asp Gln Ile Leu Gln Tyr 35 40 45 Gly Ser Met Gly Val Phe Phe Gly Gly Leu Gly Ile Gly Thr Gly Ser 50 55 60 Gly Thr Gly Gly Arg Thr Gly Tyr Ile Pro Leu Gly Thr Arg Pro Pro 65 70 75 80 Thr Ala Thr Asp Thr Leu Ala Pro Val Arg Pro Pro Leu Thr Val Asp 85 90 95 Pro Val Gly Pro Ser Asp Pro Ser Ile Val Ser Leu Val Glu Glu Thr 100 105 110 Ser Phe Ile Asp Ala Gly Ala Pro Thr Ser Val Pro Ser Ile Pro Pro 115 120 125 Asp Val Ser Gly Phe Ser Ile Thr Thr Ser Thr Asp Thr Thr Pro Ala 130 135 140 Ile Leu Asp Ile Asn Asn Thr Val Thr Thr Val Thr Thr His Asn Asn 145 150 155 160 Pro Thr Phe Thr Asp Pro Ser Val Leu Gln Pro Pro Thr Pro Ala Glu 165 170 175 Thr Gly Gly His Phe Thr Leu Ser Ser Ser Thr Ile Ser Thr His Asn 180 185 190 Tyr Glu Glu Ile Pro Met Asp Thr Phe Ile Val Ser Thr Asn Pro Asn 195 200 205 Thr Val Thr Ser Ser Thr Pro Ile Pro Gly Ser Arg Pro Val Ala Arg 210 215 220 Leu Gly Leu Tyr Ser Arg Thr Thr Gln Gln Val Lys Val Val Asp Pro 225 230 235 240 Ala Phe Val Thr Thr Pro Thr Lys Leu Ile Thr Tyr Asp Asn Pro Ala 245 250 255 Tyr Glu Gly Ile Asp Val Asp Asn Thr Leu Tyr Phe Ser Ser Asn Asp 260 265 270 Asn Ser Ile Asn Ile Ala Pro Asp Pro Asp Phe Leu Asp Ile Val Ala 275 280 285 Leu His Arg Pro Ala Leu Thr Ser Arg Arg Thr Gly Ile Arg Tyr Ser 290 295 300 Arg Ile Gly Asn Lys Gln Thr Leu Arg Thr Arg Ser Gly Lys Ser Ile 305 310 315 320 Gly Ala Lys Val His Tyr Tyr Tyr Asp Leu Ser Thr Ile Asp Pro Ala 325 330 335 Glu Glu Ile Glu Leu Gln Thr Ile Thr Pro Ser Thr Tyr Thr Thr Thr 340 345 350 Ser His Ala Ala Ser Pro Thr Ser Ile Asn Asn Gly Leu Tyr Asp Ile 355 360 365 Tyr Ala Asp Asp Phe Ile Thr Asp Thr Ser Thr Thr Pro Val Pro Ser 370 375 380 Val Pro Ser Thr Ser Leu Ser Gly Tyr Ile Pro Ala Asn Thr Thr Ile 385 390 395 400 Pro Phe Gly Gly Ala Tyr Asn Ile Pro Leu Val Ser Gly Pro Asp Ile 405 410 415 Pro Ile Asn Ile Thr Asp Gln Ala Pro Ser Leu Ile Pro Ile Val Pro 420 425 430 Gly Ser Pro Gln Tyr Thr Ile Ile Ala Asp Ala Gly Asp Phe Tyr Leu 435 440 445 His Pro Ser Tyr Tyr Met Leu Arg Lys Arg Arg Lys Arg Leu Pro Tyr 450 455 460 Phe Phe Ser Asp Val Ser Leu Ala Ala 465 470 <210> 14 <211> 252 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV E5 codon optimized sequence <400> 14 atgacaaatc tggatactgc atccacaaca ctgctggcgt gctttctgct gtgcttttgt 60 gtgctgctgt gtgtctgcct gctgatcagg cccctgctgc tgtctgtgtc tacatacaca 120 tccctgatca tcctggtgct gctgctgtgg atcacagcag cctctgcctt taggtgtttt 180 attgtgtata ttatctttgt gtatatccca ctgtttctga tccatacaca tgcacgcttt 240 ctgattacat aa 252 <210> 15 <211> 83 <212> PRT <213> Human Papiloma Virus <400> 15 Met Thr Asn Leu Asp Thr Ala Ser Thr Thr Leu Leu Ala Cys Phe Leu 1 5 10 15 Leu Cys Phe Cys Val Leu Leu Cys Val Cys Leu Leu Ile Arg Pro Leu 20 25 30 Leu Leu Ser Val Ser Thr Tyr Thr Ser Leu Ile Ile Leu Val Leu Leu 35 40 45 Leu Trp Ile Thr Ala Ala Ser Ala Phe Arg Cys Phe Ile Val Tyr Ile 50 55 60 Ile Phe Val Tyr Ile Pro Leu Phe Leu Ile His Thr His Ala Arg Phe 65 70 75 80 Leu Ile Thr

Claims (20)

1. 인유두종 바이러스의 E5 유전자, L1 유전자 및 L2 유전자를 유효성분으로 하는 자궁경부암의 예방 및 치료를 위한 DNA 백신.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 인유두종 바이러스는 HPV 유전자형 16형, 18형, 26형, 30형, 31형, 33형, 34형, 35형, 39형, 45형, 51형, 52형, 53형, 56형, 58형, 59형, 61형, 66형, 67형, 69형, 70형 및 73형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 DNA 백신.
4. 제1항에 있어서, 인유두종 바이러스는 HPV 유전자형 16형인 DNA 백신.
5. 제1항에 있어서, 상기 유전자 중 하나 이상은 포유동물에서의 발현율을 높이기 위해 코돈 최적화된 것인 DNA 백신.
6. 제5항에 있어서, L1 유전자가 서열번호 10으로 나타낸 바와 같은 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 백신.
7. 제5항에 있어서, L2 유전자가 서열번호 12로 나타낸 바와 같은 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 백신.
8. 제5항에 있어서, E5 유전자가 서열번호 14로 나타낸 바와 같은 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 백신.
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 제5항에 있어서, E5 유전자, L1 유전자 및 L2 유전자가 각각 이들 유전자를 발현할 수 있는 별도의 플라스미드에 포함되어 있는 것인 DNA 백신.
13. 제1항의 DNA 백신 및 약제학적으로 유효한 담체 또는 면역보조제를 포함하는 백신 조성물.
14. 제 13항에 있어서, 면역보조제가 LTB, IL-15 또는 GM-CSF인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
15. 제 13항에 있어서, 진피 내 또는 근육 내로 투여하기 위한 백신 조성물.
16. 제 15 항에 있어서, 진피 내로 투여하기 위한 백신 조성물.
17. 제 16 항에 있어서, 문신 기구를 이용하여 진피 내로 투여하기 위한 백신 조성물.
18. 삭제
19. 삭제
20. 삭제

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