KR100865363B1 - 비피도박테리움 인팬티스 ｍａｅｉｌ－ｋ９ 비피더스유산균 및 그를 함유하는 건강기능성 식품 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 종래의 프로바이오틱 유산균의 기본적인 생리활성인 내산소성, 내산성, 내담즙성 및 우유 배양성 등이 뛰어나면서도, 특히 장 정착성이 우수하여, 장에서의 높은 증식능을 갖는 신규 비피더스 유산균 균주로서 비피도박테리움 인팬티스 MAEIL-K9 비피더스 유산균 KCTC 10294BP를 제공한다.
장 정착성, 비피더스 유산균, 비피도박테리움 인팬티스, 프로바이오틱 유산균
Description
도 1은 실험에 이용된 각 비피더스 유산균의 세포표면 소수성을 비교한 도면이고,
도 2는 실험에 이용된 각 비피더스 유산균의 세포 응집능을 비교한 결과이며,
도 3은 직접검경법을 이용한 비피더스 유산균의 Caco-2 세포 정착능을 확인한 결과이며,
도 4는 본 발명에서 선발한 비피더스 유산균인 MAEIL-K9이 Caco-2 세포에 정착된 광학현미경 사진이다(도 4에서, (A)는 비피도박테리움 인팬티스 MAEIL-K9의 형태(×1500)를 나타내며,(B)는 Caco-2 세포의 형태(×200)를 나타내고, (C)는 그람(Gram) 염색 후의 Caco-2 세포의 형태(×1500)를 나타내며, (D)는 Caco-2 세포에 정착된 비피더스 유산균의 형태(×1500)를 나타냄).
본 발명은 신규 비피더스 유산균 균주 및 그를 함유하는 기능성 식품에 관한 것이며, 더욱 상세하게는 종래의 프로바이오틱 유산균의 기본적인 생리활성인 내산소성, 내산성, 내담즙성 및 우유 배양성 등이 뛰어나면서도, 특히 장 정착성이 우수하여, 장에서의 높은 증식능을 갖는 신규 비피더스 유산균 균주에 관한 것이다.
사람의 장내에서 유용균으로서 가장 많이 알려진 유산균은 포도당 또는 탄수화물을 분해하여 생체에 유용한 유산을 생성하는 세균으로서 정의되고 있으며, 이들은 단백질을 분해하지만 부패시키지는 않으며, 인체에 해로운 물질들을 생성하지 않고 유익한 작용을 한다.
메치니코프는 장내 부패세균에 의해서 만들어지는 독소가 노화를 일으킨다는 것을 찾아냈으며, 부패세균의 작용을 억제함으로써 노화가 억제될 수 있다고도 주장하였다. 그는 이러한 작용이 비피더스균과 같은 유산균에 의해서 수행될 수 있음을 확인하였다. 즉, 비피더스 유산균은 대장 내에서 유산과 초산 등을 생성하여 장내의 pH를 산성으로 유지시키므로, 장내 부패균의 증식을 억제하여 이러한 노화억제 기능을 수행하는 것으로 보여졌다. 또한, 비피더스 유산균은 노화 억제작용 뿐만 아니라, 혈중 콜레스테롤 저하작용, 비타민 합성 기능, 변비 치료작용, 항암 작용, 면역 작용 및 설사 개선 작용 등의 기능도 갖고 있다고 알려졌다.
이러한 비피더스 유산균의 기능을 이용한 기능성 식품이 많이 개발되었으며 현재 시판되고 있다. 그러나, 현재까지 개발되거나 시판되고 있는 비피더스 유산균을 함유하고 있는 기능성 식품들은 비피더스 유산균이 장까지 살아서 들어가는 것에 대해서만 관심이 집중되었다. 즉, 소화기관을 통과하여 장까지 도달시킬 때, 소화기관에서의 산성 환경 및 효소분해 환경에 저항성을 갖는 비피더스 유산균 균주의 개발에만 관심이 집중되었다.
그러나, 사람의 대장에서는 인체에 필요한 비타민, 아미노산 및 단백질을 합성하며 감염 방어하는 등의 유익한 작용을 하는 유용균과, 암모니아, 페놀, 독소 등을 생성하여 건강을 해치는 유해균이 경쟁하고 있으며, 양자의 균형에 의하여 건강상태가 조절된다고 알려져 있다. 특히, 장에서 유산균의 점유상태가 생체 건강의 중요한 요인으로 작용한다고 알려져 있다.
따라서, 유산균이 장에서 충분한 기능을 발휘하기 위해서는 장까지의 생존성이 우수해야 할 뿐만이 아니라, 유해균과의 경쟁에서 더욱 많은 군집을 형성할 수 있기 위해서 장에서의 정착성(장 정착능)이 우수해야만 한다. 현재 식품에 이용되는 비피더스 유산균은 단지 장까지의 생존성만을 주로 고려하여 개발된 것이며, 아직까지는 장 정착능을 고려하여 균주를 개발하려는 시도는 거의 없었다.
이에, 본 발명자는 병원성 세균에 대한 장내에서의 1차적인 보호 장벽을 형성하는데 있어서, 유산균이 가져야 하는 가장 중요한 요소 중 하나인 장 정착성이 우수한 균주를 선발하고자 많은 연구를 수행한 결과, 모유 영양아(2개월)로부터 분리한 비피도박테리움 인팬티스 MAEIL-K9 비피더스 유산균(KCTC 10294BP)이 프로바이오틱 유산균이 가져야 하는 기본적인 생리활성인 내산소성, 내산성, 내담즙성, 우유 배양능이 우수하면서도, 공지된 균주들에 비해서 장 정착능이 매우 우수함을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 따라서, 본 발명의 목적은 장 정착능이 우수한 신규 비피더스 유산균을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 비피더스 유산균을 함유하는 건강기능성 식품을 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 종래의 프로바이오틱 유산균의 기본적인 생리활성인 내산소성, 내산성, 내담즙성 및 우유 배양성 등이 뛰어나면서도, 특히 장 정착성이 우수하여 장에서의 높은 증식능을 갖는 신규 비피더스 유산균 균주로서 비피도박테리움 인팬티스 MAEIL-K9 비피더스 유산균(KCTC 10294BP)을 제공한다.
상기 균주는 2개월된 모유영양아로부터 분리한 비피도박테리움 인팬티스 균주로서, 다음 방법에 의하여 분리하였다. 즉, 상기 영양아로부터 채집된 분변을 0.85% 멸균 생리식염수에 10% 희석하여 잘 용해한 후 화염 멸균된 백금이를 이용하여 BL agar(5% horse blood 함유)에 스트리킹(streaking)하였다. 이것을 37℃/72시간 혐기배양한 다음 비피더스균으로 인정되는 집락을 선정하여 그람 염색, 현미경하에서의 형태 비교, F6PPK 테스트에 의해 최종 비피더스균임을 확인하였다. 이를 2002년 6월 25일자로 생명공학연구소 유전자 은행에 기탁하여, 수탁번호 KCTC 10294BP를 수여받았다.
이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.
본 발명에서 선발된 비피도박테리움 인팬티스 MAEIL-K9 비피더스 유산균과 종래에 공지된 비피더스균 균주 및 그 외의 임상균주들의 세포표면 소수성, 장 정착성, 우유 배양능 및 프로바이오틱 유산균의 기초적 생리활성인 내산소성, 내산성 및 내답즙성 등의 내성을 평가한 결과를 하기 표 1에 나타냈다.
| 실 험 균 주 | 기 원 | 세포표면소수성 | 정착성 | 우유 배양능 | 내 성 |
| 비피도박테리움 애돌센티스 MAEIL-M1 | KCTC(KCTC3216) | - | - | ||
| 비피도박테리움 안구라툼 MAEIL-M2 | KCTC(KCTC3236) | + | - | ||
| 비피도박테리움 비피덤 MAEIL-M3 | KCTC(KCTC3202) | +++ | ++ | - | |
| 비피도박테리움 브레베 MAEIL-M4 | KCTC(KCTC3220) | ++ | - | ||
| 비피도박테리움 카테누라툼 MAEIL-M5 | KCTC(KCTC3221) | - | - | ||
| 비피도박테리움 인팬티스 MAEIL-M6 | KCTC(KCTC3249) | + | + | ||
| 비피도박테리움 롱검 MAEIL-M7 | KCTC(KCTC3215) | - | + | ||
| 비피도박테리움 롱검 MAEIL-M8 | 한국인(남성,20세) | - | + | +++ | |
| 비피도박테리움 롱검 MAEIL-M9 | 상업용균주 | +++ | + | ||
| 비피도박테리움 애니말리스 MAEIL-M10 | KCTC(KCTC3125) | - | ++ | ||
| 비피도박테리움 롱검 MAEIL-K1 | 한국인(남성,40세) | +++ | ++ | ||
| 비피도박테리움 롱검 MAEIL-K2 | 한국인(남성,20세) | ++ | + | ||
| 비피도박테리움 롱검 MAEIL-K3 | 모유영양아(3개월) | - | - | ||
| 비피도박테리움 브레베 MAEIL-K4 | 모유영양아(3개월) | - | - | ||
| 비피도박테리움 브레베 MAEIL-K5 | 우유영양아(1개월) | - | - | ||
| 비피도박테리움 애돌센티스 MAEIL-K6 | 한국인(여성,20세) | - | - | ||
| 비피도박테리움 애돌센티스 MAEIL-K7 | 모유영양아(2개월) | - | - | ||
| 비피도박테리움 애돌센티스 MAEIL-K8 | 한국인(여성,20세) | +++ | +++ | +++ | + |
| 비피도박테리움 인팬티스 MAEIL-K9 | 모유영양아(2개월) | +++ | +++ | +++ | +++ |
| 비피도박테리움 인팬티스 MAEIL-K10 | 모유영양아(2개월) | +++ | ++ | ||
| KCTC : Korean Collection for Type Cultures(유전자은행) | |||||
상기 표 1에서 +++ 는 아주 좋음을, ++ 는 좋음을, + 는 약간 좋음을, 그리고 - 는 좋지 않음을 나타낸다.
상기 표 1에서 보는 바와 같이, 본 발명에서 선발된 비피도박테리움 인팬티스 MAEIL-K9은 종래의 공지된 균주 및 여러 임상균주에 비해서 세포표면 소수성, 정착성, 우유 배양능 및 프로바이오틱 유산균의 기초적 생리활성인 여러 내성이 균 형있게 모두 우수하였다.
본 발명에서 선발된 비피도박테리움 인팬티스 MAEIL-K9은, 건강기능성 식품에 포함시키기 위한 비피더스 유산균 균주의 선발기준과는 다른 기준에 의해서 선발된 균주이다. 즉, 현재까지 건강기능성 식품용 유산균은 장까지 살아서 들어가는 것에 대해서만 그의 선발기준으로서 삼아왔지만, 비피더스 유산균을 포함한 모든 프로바이오틱 유산균은 장내에 정착하여 증식 및 서식할 수 있어야만 장내에서 기능을 발휘할 수 있으므로, 본 발명의 균주는 장 정착능을 충분히 고려하여 선발되었다. 따라서, 본 발명에서 선발된 균주는 장에서의 생존성, 정착성 및 증식성이 우수하므로, 이는 일차적으로 병원성 세균의 장벽 침입을 억제하고, 유용한 미생물이 생성하는 부산물에 의해서 병원성 세균의 성장을 억제시키며, 장 정착에 의한 면역체계 자극으로 인한 면역증강 등의 효과를 유발할 수 있다.
이러한 선별기준에 의한 균주의 선발은 종래에 그다지 많이 행하여 지지 않았고, 단지 몇몇 유산간균, 예를 들어 락토바실러스 GG 유산균, 락토바실러스 가세리 ADH, 락토바실러스 애시도필러스 BG2FO4 균주만이 장내 서식능에 대해서 연구되어 왔다. 현재까지 우수한 장 정착능력을 가진 것으로 알려진 프로바이오틱 유산간균으로서는 락토바실러스 GG 유산균, 락토바실러스 애시도필러스 LA1, 락토바실러스 애시도필러스 NCFB 1748, 락토바실러스 케이시아이 시로타 등의 유산간균을 들 수 있다. 이외에 일부 비피더스 유산균도 프로바이오틱 활성을 나타내는데, 실제로 비피도박테리움 랙티스 Bb-12의 점막 결합력은 락토바실러스 GG 유산균과 락토바실러스 델부뤼에키 불가리커스가 존재할 때 더욱 높아지는 것으로 밝혀졌다.
비피더스 유산균이 세포벽에 정착하는 기작은 현재 구체적으로 알려진 바는 없지만, 일반적으로는 단백질, 다당류, 이온전하, 리포테이콘산(lipoteichoic acid) 등의 정착인자의 농도와 균주간의 생리활성의 차이에 기인하는 것으로 알려져 있다. 즉, 유산균의 정착능은 장 상피세포인 Caco-2 세포의 기능성쇄자연(brush border)과 HT-29-MTX 점질물 분비 세포에 의해서 분비되는 점액질에 의해서 나타난다고 알려져 있다. 또한, 비피더스 유산균은 Caco-2 세포에 아무런 손상도 미치지 않으면서 첨단의 미세융모와 상호작용하며, 비피더스 유산균이 Caco-2 세포에 정착하는 과정에는 칼슘을 필요로 하지 않고, 비피더스 유산균 전체 세포와 배양 상등액에 존재하는 단백질성 정착능 증강인자에 의해서 매개된다. 또한, 이러한 정착능 증강 인자는 유산균의 정착능 촉진인자와 마찬가지로 균주 특이성을 나타낸다고 알려져 있다.
한편, 정착능이 우수한 비피더스 유산균은, 세포표면 소수성 검사, 세포 응집능 검사, 직접 검경법에 의한 비피더스 유산균의 장 상피세포 Caco-2에의 정착능 등을 조사함으로써 선발될 수 있다.
일반적으로, 유산균의 장 상피세포에의 정착능은 유산균과 상피세포 사이의 흡인력과 반발력의 상호작용의 결과로 볼 수 있으며, 이러한 상호작용에는 세포표면 소수성이 요구된다. 당업계에서는 일반적으로 정착능을 갖기 위해서는 85% 이상의 세포표면 소수성이 요구된다고 알려져 있으며, 세포표면 소수성은 균주 특이성에 의존한다는 것으로 당업계에 알려져 있다. 본 발명에 의하면, 본원 발명에서 선발된 비피도박테리움 인팬티스 MAEIL-K9은 매우 우수한 세포표면 소수성을 갖는 다.
본 발명에서는, 장 정착능을 조사하기 위한 세포 모델로서 Caco-2 세포를 이용하여 장 정착성 균주를 선발하였다. 인체 장내 상피세포 계열인 Caco-2 세포는 실험실 조건에서도 형태학적, 기능적 분화를 일으킬 수 있으며, 또한 극성화(polarization), 기능성 쇄자연(brush border) 및 장융모 첨단(microvilli)에서 분비하는 가수분해효소(hydrolase) 등의 성숙한 장 상피세포의 특성을 나타낸다. 또한, Caco-2 세포는 정상적인 소장 융모세포의 다양한 특성을 나타내므로, 여러가지 병원성 세균의 정착과 침입 기작에 대한 연구에 있어서 중요한 모델로서 제공될 수 있다. 즉, Caco-2 세포는 정상적인 장내균총 중에서 어떤 균종이 장에 정착하며, 장내균총이 병원성 세균 및 비피더스 유산균과 상호 경쟁하는 작용 기작을 연구하는데 훌륭한 세포 모델을 제공할 수 있기 때문에, 비피더스 유산균 등의 감염 및 정착의 연구에도 이용될 수 있다.
본 발명에서는 Caco-2 세포의 단일층에 비피더스 유산균 현탁액을 접종하여 그람 염색한 후, 현미경 하에서 계수하는 직접 검경법을 통해서 Caco-2 세포에 대한 정착능을 조사하여, 장 정착능이 우수한 비피더스 유산균 균주를 선발하였다. 그 결과, 본 발명에서 선발된 비피도박테리움 인팬티스 MAEIL-K9가 매우 우수한 Caco-2 세포에 대한 정착능, 즉 우수한 장 정착능을 갖는 균주로서 선발되었다.
한편, 본 발명에서 선발한 비피도박테리움 인팬티스 MAEIL-K9 균주는 내산소성, 내산성 및 내담즙성의 기초적인 프로바이오틱 유산균의 내성 특성 및 우유 배양능도 매우 우수하였다. 이러한 과정에서 선발된 프로바이오틱 유산균은 식품 내에서의 생존성, 섭취 후 장까지의 생존성, 장벽에의 정착능에서 우수한 특성을 가지게 되며, 따라서 프로바이오틱 유산균이 기본적으로 가져야 하는 모든 조건에 적합한 것으로 인정된다.
따라서, 본 발명에서 선발된 균주는 기존에 공지된 비피도박테리움 균주들 보다 더욱 우수한 장 정착능을 가지면서도, 기존의 균주들과 비슷하거나 더욱 우수한 프로바이오틱 생리활성을 가지고 있기 때문에, 건강기능성 식품에 포함되어 장에서 그의 활성을 충분히 발휘할 수 있다. 예를 들어, 비피도박테리움 인팬티스 MAEIL-K9 균주는 본 발명의 유음료, 발효유 제품, 분유 제품, 정장제, 생식 등에 함유되어 매우 유용한 건강기능성 식품을 제공할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 비피도박테리움 인팬티스 MAEIL-K9를 함유하는 건강 기능성 식품의 제조 및 그의 함량은 당업계에 공지된 통상적인 방법으로부터 용이하게 파악될 수 있으며, 당업자에게 자명하게 알려져 있는 섭취 후 장까지의 생존성 및 식품 내에서의 생존성을 유지하기 위한 다른 물질 등도 함유할 수도 있다.
[실시예]
이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 보다 용이하게 하기 위하여 제공되는 것이지만, 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.
상기 표 1에 기재된 20종의 비피더스 유산균을 이용하여 먼저 세포표면 소수성과 직접검경법(direct count)을 이용한 Caco-2 세포 정착능을 조사하였으며, 이때 비피도박테리움 애돌센티스 MAEIL-K8과 비피도박테리움 인팬티스 MAEIL-K9를 선 발하였다. 또한, 이 두 균주에 대한 내산소성, 내산성, 내담즙성, 우유 배양성 등을 조사하여 비피도박테리움 인팬티스 MAEIL-K9를 최종 선발하였다. 따라서, 본 발명에 의한 비피도박테리움 인팬티스 MAEIL-K9는 식품과 건강보조제 등에 다양하게 활용될 수 있다.
상기 비피도박테리움 인팬티스 MAEIL-K9의 선발과정은 다음과 같다. 즉, 2개월된 모유영양아로부터 채집된 분변을 0.85% 멸균 생리식염수에 10% 희석하여 잘 용해한 후 화염 멸균된 백금이를 이용하여 BL agar(5% horse blood 함유)에 스트리킹(streaking)하였다. 이것을 37℃/72시간 혐기배양한 다음 비피더스균으로 인정되는 집락을 선정하여 그람 염색, 현미경하에서의 형태 비교, F6PPK 테스트에 의해 최종 비피더스균임을 확인하였다.
한편, 상기 선발된 균주가 비피도박테리움 인팬티스 종에 속한다는 것을 보여주는 분류학적 실험 자료는 표 2에서 보는 바와 같다. 표 2는 동정을 위한 선별된 비피도박테리움 인팬티스 MAEIL-K9의 탄수화물 발효 패턴을 보여주고 있다.
| 탄수화물 | MAEIL-K9 | 탄수화물 | MAEIL-K9 |
| 대조군 | － | 에스쿨린 | + |
| 글리세롤 | － | 살리신 | + |
| 에리트리톨 | － | 셀로비오스 | － |
| D-아라비노오스 | － | 말토오스 | + |
| L-아라비노오스 | － | 락토오스 | + |
| 리보오스 | + | 멜리비오스 | + |
| D-크실로오스 | － | 사카로오스 | + |
| L-크실로오스 | － | 트리할로스 | － |
| 아도니톨 | － | 이눌린 | － |
| β-메틸-크실로시드 | － | 멜리시토스 | － |
| 갈락토오스 | + | D-라피노오스 | + |
| D-글루코오스 | + | 아미돈 | + |
| D-프록토오스 | + | 글리코겐 | + |
| D-만노오스 | + | 크실리톨 | － |
| L-소르보스 | － | β-겐티오비오스 | + |
| 람노오스 | － | D-튜라노오스 | + |
| 덜시톨 | － | D-릭소오스 | + |
| 이노시톨 | － | D-타가토오스 | － |
| 만니톨 | － | D-푸코스 | － |
| 소르비톨 | － | L-푸코스 | － |
| α-메틸-D-만노시드 | － | D-아라비톨 | － |
| α-메틸-D-글루코시드 | + | L-아라비톨 | － |
| N-아세틸 글루코사민 | + | 글루코네이트 | － |
| 아미그달린 | － | 2 케토-글루코네이트 | － |
| 아르부틴 | + | 5 케토-글루코네이트 | + |
| (비교) －:음성, +:양성, MAEIL-K9는 비피도박테리움 인팬티스로 동정되었음. | |||
한편, 상기 균주의 배양적 특성은 일반적인 비피더스균의 그것과 동일하며, 본 발명의 균주를 2002년 6월 25일자로 한국생명과학연구소 유전자 은행에 기탁하여 수탁번호 KCTC 10294BP를 수여받았다.
실시예 1. 비피더스 유산균의 세포표면 소수성(cell surface hydrophobicity, CSH %)
세포표면 소수성 검사 방법에 대해서 간략히 설명하면, 먼저 비피더스 균주 를 modified MRS broth에 2.0% 접종하여 혐기배양(37℃/15hr)시킨 후, 원심분리(×3,000rpm/10min)하였다. 그후 세포 덩어리를 50mM 인산염 완충액(22.2g K2HPO4·H2O, 7.26g KH2PO4, pH 7.0)으로 2회 수세 반복 후, 세포 현탁액 3ml에 동량의 hexadecane(Sima Co., USA)을 첨가하여 60초간 혼합한 후, 20분간 방치하여 층이 분리되도록 하였다. 분리된 층 중에서 하층의 수용성 층의 흡광도를 600nm에서 측정하여 세포표면 소수성(CHS)을 아래와 같이 계산하였다.
CHS(%)=(Ai-Af)×100/Ai
여기서 Ai=초기흡광도(OD=1.0±0.05), Af=최종 흡광도이다.
각 비피더스 유산균의 세포표면 소수성에 대한 결과는 도 1에 나타냈다. 일반적으로 모든 미생물의 장 상피세포 정착능은 유산균과 상피세포 사이의 흡인력 및 반발력과의 상호작용의 결과라고 할 수 있는데, 세포표면 소수성이 85% 이상이 되어야 정착능과 기타 생리활성 기능이 우수하다고 할 수 있다. 도 1의 결과에서는 20 균종의 비피더스 유산균 중에서 비피도박테리움 비피덤 MAEIL-M3, 비피도박테리움 애돌센티스 MAEIL-K8, 비피도박테리움 인팬티스 MAEIL-K9 만이 85% 이상의 높은 세포표면 소수성을 나타냈다. 이러한 세포표면 소수성은 아종(subspecies)에 의한 것이라기보다는 균주 특이성에 더욱 의존하는 것으로 보여졌다.
실시예 2. 비피더스 유산균의 세포 응집능(cell agglutination, CA)
세포 응집능은 세포표면 소수성과 유사한 세포표면 특성을 측정하는 방법으 로 인정되고 있다. 실험에 이용된 비피더스 유산균의 세포 응집능은 도 2에 나타냈다. 모든 실험균주에서의 세포 응집능은 31.45±0.54 건물중㎎/㎖로서 균주간에 커다란 차이를 나타내지 않았다. 따라서, 세포 응집능으로 비피더스 유산균의 세포표면 특성에 따른 균주간의 특이성을 구분하기는 힘든 것으로 밝혀졌다.
실시예 3. 비피더스 유산균의 Caco-2 세포 정착능
장 상피세포에 대한 프로바이오틱 유산균의 정착능은 생리활성 증진 효과의 기본적인 조건으로 알려져 있다. 본 실시예에서는 Caco-2 세포에 대한 각 비피더스 유산균의 정착능을 직접 검경법으로 확인함으로써 각 균주의 장 정착능을 확인하였다.
간략히 설명하면, 원형 플라스틱 플레이트(round plastic plate)에 형성된 Caco-2 세포의 단일층(monolayer)에 610nm에서의 흡광도값이 1.0인 비피더스 유산균 현탁액을 100㎕ 접종하여 2시간 동안 반응시킨 후, 그람(Gram) 염색법으로 염색한 다음, 현미경 하에서 직접적으로 계수하였다. Caco-2 세포에 대한 20종의 각 비피더스 유산균의 장 상피세포에 대한 정착능을 도 3에 나타냈다. 도 3에서 보는 바와 같이, Caco-2 세포 100개당 100개 이상의 균수가 측정된 장 정착능이 우수한 비피더스 유산균은 비피도박테리움 비피덤 MAEIL-M3, 비피도박테리움 애니말리스 MAEIL-M10, 비피도박테리움 롱검 MAEIL-K1, 비피도박테리움 롱검 MAEIL-K2, 비피도박테리움 애돌센티스 MAEIL-K8, 비피도박테리움 인팬티스 MAEIL-K9, 비피도박테리움 인팬티스 MAEIL-K10 균주이었다.
도 3에서, 장 정착능은 균종에 따라서 일관성 없이 차이를 나타났다. 따라 서, 비피더스 유산균 균주마다 Caco-2 세포 정착능이 서로 상이하게 나타나는 것은 일반적으로 단백질 성분, 다당류, 이온전하, 리포테이콘산(lipoteichoic acid) 등의 정착인자의 농도와 균주 자체의 생리활성 특성 차이에 기인하는 것으로 보여졌다.
한편, 세포표면 소수성(CSH), 세포 응집능(CA) 및 정착능의 결과를 비교하면 비피도박테리움 비피덤 MAEIL-M3, 비피도박테리움 애돌센티스 MAEIL-K8, 비피도박테리움 인팬티스 MAEIL-K9가 세포 정착성에 관련된 모든 특성이 우수한 것으로 나타났다. 이러한 선발 과정에서, 비피도박테리움 인팬티스 MAEIL-M10의 경우에 정착능은 우수하였지만 세포표면 소수성이 매우 낮기 때문에 선발에서 제외하였다. 또한, 비피도박테리움 롱검 MAEIL-K1은 세포표면 특성과 정착능이 우수하였지만, 균주 자체의 활력(일상적으로 균주의 성장 조건에 대한 민감성, 예를 들어 배양이 어렵거나 성장이 매우 안되는 경우에는 균주 자체의 활력이 낮다고 표현함)이 매우 낮기 때문에 선발에서 제외하였다.
도 4는 비피도박테리움 인팬티스 MAEIL-K9(A), Caco-2 세포(B), 염색된 Caco-2 세포(C), 비피도박테리움 인팬티스 MAEIL-K9가 정착된 Caco-2 세포(D)의 모습을 광학현미경으로 촬영한 사진을 나타낸 것이다. 광학현미경으로 확인한 결과, 비피더스 유산균의 Caco-2 세포 정착부위는 매우 다양하지만, 여기서는 세포 상단의 기능성쇄자연(brush border, microvilli)과 세포와 세포 사이의 세포 분지점(tight junction)에 비피더스 유산균이 정착하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 정착능이 우수한 비피더스 유산균의 선발
미생물의 세포표면 특성인 세포표면 소수성(CSH)과 세포 응집능(CA) 및 직접검경법(direct count)에 의한 Caco-2 세포에 대한 정착능을 기준으로 하여 장 정착능이 우수한 것으로 선발된 균주는 비피도박테리움 비피덤 MAEIL-M3, 비피도박테리움 애돌센티스 MAEIL-K8, 비피도박테리움 인팬티스 MAEIL-K9이었다. 이들 균주의 세포표면 소수성(CSH)과 세포 응집능(CA) 및 Caco-2 세포에 대한 정착능에 대한 결과를 하기 표 3에 나타냈다. 대조군으로는 비피도박테리움 롱검 MAEIL-M8을 이용하였다.
| 실험균주 | 생균수(cfu/㎖) | 세포표면 소수성(%) | 세포 응집능(㎎/㎖) | 정착성(/100cell ) |
| MAEIL-M3 | 1.2×108 | 93.87±1.87 | 30.98±1.00 | 263±9 |
| MAEIL-M8 | 2.3×108 | 6.73±1.59 | 31.09±0.71 | 45±8 |
| MAEIL-K8 | 1.5×108 | 96.10±2.69 | 32.11±0.48 | 121±5 |
| MAEIL-K9 | 1.9×108 | 97.30±1.04 | 30.76±0.85 | 110±14 |
상기 네 균주의 균 현탁액(흡광도 1.0, 610nm) 내의 균수는 1.2~2.3×108 cfu/㎖로서 거의 유사하였으며, 세포표면 소수성은 비피도박테리움 애돌센티스 MAEIL-M8을 제외하고는 90% 이상의 높은 결과를 나타냈다. 정착능에서도 비피도박테리움 애돌센티스 MAEIL-M8을 제외하고는 모두 100개 이상의 높은 결과를 나타냈고, 세포 응집능은 유의적인 차이를 보이지 않았다.
상기 표 3의 결과로부터, 자동응집반응(autoagglutination)과 혈구응집반응 이 측정되지 않고 세포표면 소수성이 높은 균주라고 할지라도 Caco-2 세포에 대한 정착능이 항상 우수한 것은 아니라는 것을 알 수 있다. 그러나, 일반적으로 장 세포에 대한 유산간균의 정착은 다양한 미생물 세포 표면 특성에 의존한다.
실시예 5. 우유 배양성 검사
우유 배양성 특성을 선발 기준에 포함시킨 이유는, 통상적으로 비피더스균은 혐기성 균이므로 우유 배양을 호기로 할 경우 균주 특성에 따라 성장이 되지 않는 경우가 매우 많으며, 따라서 우유 배양성 실험은 이러한 비피더스 균주를 차후에 상용화하는데 매우 필수적인 배양특성이라 할 수 있다.
우유 배양성 검사 방법에 대해서 간략히 설명하면, 다음과 같다.
정착능이 우수하다고 인정되는 비피도박테리움 비피덤 MAEIL-M3, 비피도박테리움 롱검 MAEIL-M8, 비피도박테리움 애돌센티스 MAEIL-K8 및 비피도박테리움 인팬티스 MAEIL-K9를 mMRS 액체배지에서 3회 계대배양하여 활력을 높인 후에, 그 배양물을 원심분리하여 인산완충생리식염수(phosphate-buffered saline, PBS)로 2회 세척후 동량의 PBS로 치환하였다. 또한, 실험에 이용된 우유로는 11% 멸균환원탈지유를 이용하였으며, 접종률은 1%, 배양조건은 호기와 혐기배양, 배양 조건은 37℃에서 24시간으로 하였다. 우유 배양성에 대한 결과는 표 4에 나타냈다. 비피도박테리움 비피덤 MAEIL-M3는 우유 배양성이 매우 열악하였지만 비피도박테리움 롱검 MAEIL-M8, 비피도박테리움 애돌센티스 MAEIL-K8 및 비피도박테리움 인팬티스 MAEIL-K9는 배양성이 우수하였다.
| 실험균주 | 접종균수 | 호기 배양(37℃/24시간) | 혐기 배양(37℃/24시간) | ||
| pH | 생균수(cfu/ml) | pH | 생균수(cfu/ml) | ||
| MAEIL-M3 | 2.6×106 | 6.04 | 1.9×107 | 6.18 | 3.5×107 |
| MAEIL-M8 | 1.6×106 | 5.30 | 2.2×107 | 5.41 | 7.2×107 |
| MAEIL-K8 | 7.2×106 | 5.35 | 4.1×107 | 5.61 | 3.2×107 |
| MAEIL-K9 | 7.4×106 | 5.34 | 5.5×107 | 5.53 | 4.7×107 |
실시예 6. 비피도박테리움 애돌센티스 MAEIL-K8과 비피도박테리움 인팬티스 MAEIL-K9의 기초적인 생리활성 특성 비교
비피도박테리움 애돌센티스 MAEIL-K8과 비피도박테리움 인팬티스 MAEIL-K9의 기초적인 생리활성을 조사하기 위하여 내산소성, 내산성 및 내담즙성을 조사하였으며, 그 결과를 하기 표 5에 나타냈다.
내산소성 실험 방법은, 균체를 1×108-9 cfu/ml 수준으로 BL agar에 도말하여 37℃ 호기배양기에서 6, 15, 24시간 전 배양시킨 후, 혐기배양기에서 37℃/7시간 배양하여 생존력을 측정하였다.
내산성 실험 방법은, 원심분리한 균체를 1N-HCl을 이용하여 pH를 조정한 0.05% L-cysteine-HCl이 함유된 50mM 인상염 완충액(pH 7.0, 3.0)에 1×107-8 cfu/ml 수준으로 접종하여 37℃ 혐기배양기에서 12시간 처리 후, 생존성을 BL agar에서 확인하였다.
내담즙성 실험 방법은, 0.05% L-cysteine-HCl이 함유된 pH 7.0의 50mM 인산 염 완충액에 0, 1.0%의 oxgall을 첨가한 후, 균체를 1×107-8 cfu/ml 수준으로 접종하여 37℃ 혐기배양기에 두고 12시간 처리 후, 생존성을 BL agar에서 확인하였다.
내산소성의 결과에서는 두 균주간에 차이가 없는 것으로 인정되었지만, 내산성과 내담즙성에서는 비피도박테리움 애돌센티스 MAEIL-K8보다 비피도박테리움 인팬티스 MAEIL-K9이 매우 우수한 것으로 나타났다.
| 내산소성 | 산소 노출시간 | 사멸율 (Log cell No.) | ||
| 0시간 | 15시간 | 24시간 | ||
| MAEIL-K8 | 8.90×108 | 1.47×108 | 4.80×107 | 1.27 |
| MAEIL-K9 | 1.65×109 | 6.23×108 | 6.23×107 | 1.43 |
| 내산성(HCl) | pH | 사멸율 (Log cell No.) | ||
| pH 7.0(0시간) | pH 7.0(2시간) | pH 3.0(2시간) | ||
| MAEIL-K8 | 1.51×108 | 1.53×108 | 4.25×107 | 0.65 |
| MAEIL-K9 | 3.53×107 | 3.07×107 | 2.89×107 | 0.09 |
| 내담즙성 | 담즙산 | 사멸율 (Log cell No.) | ||
| 0.0%(0시간) | 0.0%(15시간) | 1.0%(15시간) | ||
| MAEIL-K8 | 5.70×107 | 4.77×107 | 4.67×106 | 1.09 |
| MAEIL-K9 | 6.33×107 | 7.87×107 | 4.07×106 | 0.19 |
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서 선발한 비피더스 유산균인 비피도 박테리움 인팬티스 MAEIL-K9(기탁번호: KCTC 10294BP)은 종래의 프로바이오틱 유산균의 기본적인 생리활성인 내산소성, 내산성, 내담즙성 및 우유 배양성 등이 뛰어나면서도 특히 장 정착성이 우수하고, 장에서의 높은 증식능을 갖고 있기 때문에 건강기능성 식품에 포함시킬 경우 매우 우수한 장 건강촉진 효과를 얻을 수 있다.
Claims (3)
- 모유 영양아로부터 분리한 비피더스 유산균인 기탁번호 KCTC 10294BP의 비피도박테리움 인팬티스 MAEIL-K9.
- 제 1항에 따른 비피더스 유산균을 함유하는 건강기능성 식품.
- 제 2항에 있어서,상기 건강기능성 식품이 유음료, 발효유 제품, 분유 제품 또는 정장제인 것을 특징으로 하는 건강기능성 식품.
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- 2002-09-16 KR KR1020020056172A patent/KR100865363B1/ko not_active Expired - Lifetime
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