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KR100848930B1 - 양친매성 화합물을 이용한 자성 나노복합체의 제조방법 - Google Patents

양친매성 화합물을 이용한 자성 나노복합체의 제조방법 Download PDF

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KR100848930B1
KR100848930B1 KR1020070018601A KR20070018601A KR100848930B1 KR 100848930 B1 KR100848930 B1 KR 100848930B1 KR 1020070018601 A KR1020070018601 A KR 1020070018601A KR 20070018601 A KR20070018601 A KR 20070018601A KR 100848930 B1 KR100848930 B1 KR 100848930B1
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magnetic nanocomposite
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함승주
서진석
허용민
윤호근
양재문
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(주)에이티젠
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Abstract

본 발명은 양친매성 화합물을 이용한 자성 나노복합체의 제조방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 A) 나노입자를 용매에서 합성하는 단계; 및 B) 소수성 영역과 친수성 영역을 가지는 양친매성 화합물을 상기 나노입자 표면에 부가하여 양친매성 화합물과 나노입자를 결합시키는 단계를 포함하는 자성 나노복합체의 제조방법에 관한 것이다.
나노입자, 양친매성 화합물, 조영제

Description

양친매성 화합물을 이용한 자성 나노복합체의 제조방법{Process for preparing magnetic nanocomposite using amphiphilic compound}
도 1은 본 발명에 따른 자성 나노복합체의 응용분야를 도시한 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 양친매성 고분자를 이용한 자성 나노복합체의 제조방법을 도시한 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 에멀젼형 또는 서스펜선형 자성 나노복합체의 개념도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 포화지방산을 이용한 자성 나노입자의 투과전자현미경 사진 및 자기적 특성을 도시한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 다른 실시예에 따른 불포화지방산을 이용한 자성 나노입자의 투과전자현미경 사진 및 자기적 특성을 도시한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 지방산 양친매성 화합물을 이용한 자성 나노복합체의 제조방법을 도시한 모식도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 자성 나노입자와 자성 나노복합체의 적외선 분광법(FT-IR)의 결과를 도시한 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 지방산 양친매성 화합물의 수소핵자기공 명(1H-NMR)의 결과를 도시한 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 고분자들의 활성성분을 결합하여 친수활성성분 결합영역이 카르복실기로 치환된 생분해성 양친매성 고분자의 중합과정을 도시한 모식도이다.
도 10은 본 발명에 따른 친수활성성분 결합영역이 카르복실기로 치환된 생분해성 양친매성 고분자를 핵자기공명의 결과를 도시한 그래프이다.
도 11는 본 발명에 따른 친수활성성분 결합영역이 카르복실기로 치환된 생분해성 양친매성 고분자를 적외선 분광법의 결과를 도시한 그래프이다.
도 12는 본 발명에 따른 친수성 고분자의 활성성분을 통한 친수활성성분 결합영역이 카르복실기로 치환된 생분해성 양친매성 고분자의 중합과정을 도시한 모식도이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 양친매성 고분자의 적외선 분광법(FT-IR)의 결과를 도시한 그래프이다.
도 14는 본 발명의 다른 제조예에 따른 양친매성 고분자의 핵자기공명(1H-NMR)의 결과를 도시한 그래프이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노 입자 및 생분해성 양친매성 고분자를 이용한 에멀젼형 자성 나노복합체의 전자 현미경 사진 및 크기 분포를 나타내는 그래프이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노 입자 및 생분해성 양친매성 고분 자를 이용한 서스펜션형 자성 나노복합체의 전자 현미경 사진 및 크기 분포를 나타내는 그래프이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노 입자 및 지방산 양친매성 고분자를 이용한 에멀젼형 자성 나노복합체의 전자 현미경 사진 및 크기 분포를 나타내는 그래프이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 지방산 양친매성 화합물을 이용한 에멀젼형 자성 나노복합체의 자기이력곡선의 결과를 도시한 그래프이다.
도 19는 본 발명에 따른 자성나노입자가 카르복실폴리에틸렌글리콜-폴리락티드-코-글리콜라이드에 의해 봉입된 전자현미경 사진 및 나노복합체의 크기분포도를 도시한 그래프이다.
도 20은 본 발명에 따른 나노입자가 카르복실폴리에틸렌글리콜-폴리락티드-코-글리콜라이드에 의해 봉입된 질량비를 도시한 그래프이다.
도 21은 본 발명에 따른 나노자성입자와 자성나노복합체의 자기이력곡선이다.
도 22는 본 발명에 따른 서스펜션 방법에 의해 제조된 자성나노복합체의 전자현미경 사진 및 동적 레이저 광산란법에 의한 크기분포도를 도시한 그래프이다.
도 23은 본 발명에 따른 서스펜션방법에 의해 제조된 자성나노입자의 열중량분석 그래프이다.
도 24는 본 발명의 일 실시예에 따른 수용성 자성 나노복합체의 투과전자현미경 사진 및 동적 레이저 광산란법 결과를 도시한 그래프이다.
도 25은 본 발명의 일 실시예에 따른 수용성 자성 나노복합체의 적외선 분광법의 결과를 도시한 그래프이다.
도 26는 본 발명의 일 실시예에 따른 유기성 나노입자의 유기 용매에 대한 용해도 및 생분해성 양친매성 화합물을 이용한 수용성 자성 나노복합체의 수용액에 대한 용해도를 나타낸 것이다.
도 27은 본 발명의 일 실시예에 따른 유기성 나노입자의 유기 용매에 대한 용해도 및 지방산 양친매성 화합물을 이용한 수용성 자성 나노복합체의 수용액에 대한 용해도 및 외부 자기장에 반응하는 모습을 보여주는 사진이다.
도 28은 본 발명의 일 실시예에 따른 지방산 양친매성 화합물을 이용한 수용성 자성 나노복합체의 염 농도 및 pH에 따른 안정성 시험의 결과를 도시한 그래프이다.
도 29는 본 발명의 일 실시예에 따른 수용성 자성 나노복합체의 pH에 따른 입자 안정성 사진과 크기 변화 그래프이다.
도 30은 본 발명의 일 실시예에 따른 수용성 자성 나노복합체의 염농도에 따른 입자 안정성 사진과 크기 변화 그래프이다.
도 31는 본 발명의 일 실시예에 따른 생분해성 양친매성 화합물을 이용한수용성 자성 나노복합체의 농도에 따른 자기공명영상 신호(T2)의 변화를 도시한 그래프이다.
도 32는 본 발명의 다른 실시예에 따른 지방산 양친매성 화합물을 이용한수용성 자성 나노복합체의 농도에 따른 자기공명영상 신호(R2)의 변화를 도시한 그래 프이다.
도 33은 본 발명에 따른 서스펜션방법에 의해 제조된 자성나노입자가 분산된 용액의 자기공명영상을 농도에 따라 확인한 사진 및 R2값 변화 그래프이다.
도 34는 본 발명의 다른 실시예에 따른 수용성 자성 나노복합체의 세포독성 실험 결과를 도시한 그래프이다.
도 35는 본 발명의 일 실시예에 따른 수용성 자성 나노복합체를 사용하여 촬영한 동물모델에서의 자기공명영상이다.
본 발명은 양친매성 화합물을 이용한 자성 나노복합체의 제조방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 A) 나노입자를 용매에서 합성하는 단계; 및 B) 소수성 영역과 친수성 영역을 가지는 양친매성 화합물을 상기 나노입자 표면에 부가하여 양친매성 화합물과 나노입자를 결합시키는 단계를 포함하는 자성 나노복합체의 제조방법에 관한 것이다.
나노기술은 물질을 원자, 분자 수준에서 조절 및 제어하는 기술로서 신물질, 또는 신소자 창출에 적합하여 그 응용분야가 전자, 재료, 통신, 기계, 의약, 농업, 에너지, 및 환경 등 매우 다양하다.
현재 나노기술은 다양하게 발전하고 있으며 크게 세 가지 분야로 분류되어 있다. 첫째, 나노 소재로 극미세한 크기의 새로운 물질과 재료를 합성하는 기술에 관한 것이다. 둘째, 나노 소자인데 나노 크기의 재료들을 조합하거나 배열하여 일정한 기능을 발휘하는 장치를 제조하는 기술에 관한 것이다. 셋째, 나노-바이오라 불리는 나노기술을 생명공학에 응용하는 기술에 관한 것이다.
특히, 나노-바이오 분야에서 자성 나노입자들은 생체 물질의 분리, 자기공명 영상 진단 프로브, 거대자기저항센서를 포함한 바이오 센서, 마이크로 유체계 센서, 약물/유전자 전달, 및 자성 고온치료 등의 넓은 응용범위에 걸쳐 사용되고 있다.
구체적으로 자성 나노 입자는 분자 자기공명영상의 진단 프로브 (조영제)로 사용될 수 있다. 자성 나노 입자는 나노 입자 주변의 물분자의 수소원자의 스핀-스핀 이완시간을 단축시켜 자기공명영상 신호를 증폭시키는 효과를 나타내 지금까지 공명 영상 진단에 널리 사용되고 있다.
또한 자성 나노 입자는 거대 자기-저항 바이오센서 (Giant magnetic resistance (GMR) sensor) 의 프로브 물질로 작용할 수 있다. 자성 나노 입자가 거대자기저항 바이오 센서 표면에 패턴되어 있는 생체 분자를 감지하여 결합하면, 자성 입자에 의해 거대자기저항 센서의 전류 신호가 변하게 되고 이를 이용하면 생체분자를 선택적으로 검출이 가능하다. (US 6,452,763 B1; US 6,940,277 B2; US 6,944,939 B2; US 2003/0133232 A1).
또한 자성 나노 입자는 생체 분자의 분리에도 응용될 수 있다. 예를 들면, 특정한 생체 마커를 발현하는 세포와 다른 여러 가지 세포들이 섞여 있을 때, 자성 나노 입자가 특정한 생체 마커와 선택적으로 결합하게 한 후, 외부에서 자기장을 걸어주면 자기장 방향으로 원하는 세포만 분리할 수 있다 (Whitehead et al. US patent 4,554,088,US 5,665,582, US 5,508,164, US 2005/0215687 A1 ). 또한 세포의 분리 뿐만 아니라, 단백질, 항원, 펩타이드, DNA, RNA, 및 바이러스 등 다양한 생체 분자의 분리에 응용될 수 있다. 또한 자성 나노 입자는 자성 마이크로 유체 센서에 응용되어 생체 분자의 분리 및 검출할 수 있다. 칩 위에 매우 작은 채널을 만들어 그 안에 자성 나노 입자를 흘려줌으로써 마이크로 단위의 유체계에서 검출과 분리가 가능하다.
한편, 자성 나노 입자는 약물 또는 유전자의 전달을 통한 생체 치료에도 사용될 수 있다. 자성 나노 입자에 화학적인 결합 또는 흡착을 통해 약물 또는 유전자를 싣고 외부 자기장을 이용하여 원하는 위치로 이동시켜 특정부위에 약물 및 유전자를 방출을 가능하게 하여 선택적인 치료효과를 가져올 수 있게 한다 (US 6,855,749).
자성 나노 입자를 이용한 생체 치료로의 응용의 또 하나의 예로서, 자성 스핀 에너지를 이용한 고온 치료를 들 수 있다 (US 6,530,944 B2, US 5,411,730). 자성 나노 입자는 외부의 라디오주파수의 교류전류를 흘려주면 스핀 플립핑 (flipping) 과정을 통해 열을 방출하게 된다. 이때 나노 입자 주변의 온도가 40 oC 이상이 되면 세포가 높은 열에 의해 죽게 되어 질병 세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있다.
자성 나노입자들이 전술한 용도에 이용되기 위해서는 자기적 성질이 우수하고, 생체 내, 즉 수용성 환경에서 안정적으로 운반 및 분산되어야 하며, 생체 활성 물질과 쉽게 결합할 수 있어야 한다. 이러한 조건을 만족시키기 위하여 현재까지 다양한 기술들이 개발되어져 왔다.
미국특허공보 US 6,274,121호는 산화철과 같은 금속을 포함한 상자기성 나노입자에 관한 것으로 상기 나노입자의 표면에 조직 특이적인 결합 물질, 진단 또는 약제학적으로 활성인 물질과 커플링(coupling)될 수 있는 결합 자리를 포함하는 무기 물질을 부착한 나노입자를 개시하고 있다.
미국특허공보 US 6,638,494호는 산화철과 같은 금속을 포함한 상자기성 나노입자에 관한 것으로 상기 나노입자의 표면에 특정한 카르복실산을 부착하여 중력 또는 자기장에서 나노입자가 응집 및 침전되는 것을 방지하는 방법을 개시하고 있다. 상기 특정한 카르복실산으로는 말레산, 타르타르산, 또는 글루카르산과 같은 지방족 디카르복실산, 또는 시트르산, 시클로헥산, 또는 트리카르복실산과 같은 지방족 폴리디카르복실산이 이용되었다.
미국특허공개공보 US 2004/58457호는 단층(monolayer)으로 둘러싸인 기능성 나노입자에 관한 것으로 상기 단층에는 이기능성(bifunctional) 펩타이드가 부착되며 상기 펩타이드에는 DNA 및 RNA를 포함한 다양한 생폴리머(biopolymer)가 결합될 수 있다.
영국특허공보 GB 223,127호는 단백질 주형내에 자기 나노 입자 형성 스텝을 포함한 자기 나노 입자 성분의 제조 방법에 관한 것으로 아포페리틴에 자성 나노 입자를 캡슐화 하는 방법에 대해 기술하였다.
미국특허공보 US 2003/190,471호는 이중미셀 (bi-micellear vesicle)안에서 망간 아연 산화물을 나노 입자를 형성시키는 방법에 관한 것으로써 형성된 자성 나노 입자의 열처리 과정을 통해 향상된 성질을 나타내는 나노 입자를 기술하였다.
미국특허공보 US 2005/130,167는 16-머캅토헥사데카노산(16-mercaptohexadecanoic acid)으로 둘러싸인 수용성 자성 나노 입자의 합성과 합성된 자성 나노 입자에 상 전이제(transfection agent)인 TAT 펩티드(peptide)를 이용하여 세포내 자기적 라벨링(intracellular magnetic labeling)으로 실험 쥐 내의 바이러스 및 mRNA 검출에 관하여 기술하였다.
대한민국특허출원 제 10-1998-0705262호는 녹말 코팅과 임의의 폴리알킬렌 옥사이드 코팅을 구비한 초상자성 철 산화물 코어 입자를 포함하는 입자와 이를 포함하는 MRI 조영제를 개시하고 있다.
그러나 상기 방법들로 제조된 수용성 나노입자는 다음과 같은 단점을 갖고 있다. 미국특허공보 US 6,274,121호, US 6,638,494호, US 2004/58457호, 미국특허공보 US 2003/190,471호, 미국특허공보 US 2005/130,167, 영국특허공보 GB 223,127, 대한민국특허출원 제 10-1998-0705262호에서 개시된 나노 입자는 주로 수용액에서 합성하는데 이러한 경우 나노입자의 크기 조절이 어렵고 합성된 나노입자는 불균일한 크기 분포도를 나타낸다. 또한, 저온에서 합성되기 때문에 나노입자의 결정성이 낮으며, 비화학양론적 화합물(non-stoichiometric compound)이 형성되는 경향이 있다. 따라서 상기 방법들로 제조된 나노입자는 수용액에서 콜로이드 안정성이 떨어져 생체 응용 시 뭉침, 및 큰 비선택성 결합 등을 나타내는 문제점을 갖고 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 목적은 수용액에서 안정성이 높고 생체 독성이 적어서 생체의 진단 및 치료에 광범위하게 응용할 수 있는 자성 나노복합체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 양친매성 화합물을 이용한 자성 나노복합체의 제조방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 A) 나노입자를 용매에서 합성하는 단계; 및 B) 소수성 영역과 친수성 영역을 가지는 양친매성 화합물을 상기 나노입자 표면에 부가하여 양친매성 화합물과 나노입자를 결합시키는 단계를 포함하는 자성 나노복합체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 상기 자성 나노복합체의 특징은 나노입자의 표면에 양친매성 화합물을 부가하여 양친매성 화합물의 소수성 영역이 나노입자의 표면과 결합하고, 양친매성 화합물의 친수성 영역이 나노복합체의 최외곽에 분포하고 있는 것이다. 여기서 양친매성 화합물의 소수성 영역은 수소결합, 반데르발스력, 및 극성 인력 등의 물리적 결합에 의하여 나노입자의 표면과 결합한다. 따라서 상기 소수성 영역은 소수성 영역의 메트릭스 내에 나노입자를 분포시키거나, 나노입자의 표면과 결합하는 역할을 할 뿐만 아니라, 필요에 따라서 소수성영역의 메트릭스 내에 약물을 물리적으로 봉입하거나, 소수성 영역의 일 말단에 약물을 화학적으로 결합시킬 수 있다. 한편 양친매성 화합물의 친수성 영역은 나노복합체의 최외곽에 분포하여 수불용성의 나노입자를 수용성 매질 중에서도 안정화시켜 생체 이용율을 극대화시킬 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 자성 나노복합체의 다른 특징은 자성 나노입자인 금속, 자성 물질, 또는 자성 합금이 유기성 표면 안정제와 결합될 수 있다는 것이다. 여기서 상기 유기성 표면 안정제와 금속, 자성 물질, 또는 자성 합금의 결합은 금속, 자성 물질, 또는 자성 합금의 전구물질에 유기성 표면 안정제가 배위하여 착화합물 형성하여 이루어진다. 상기 유기성 표면 안정제는 양친매성 화합물의 소수성 영역을 안정화시키는 역할을 할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 자성 나노복합체의 또 다른 특징은 상기 소수성영역은 그 구조 내의 일부분에 하나 이상의 소수활성성분 결합영역(R1)을 가질 수 있고, 상기 친수성영역은 그 구조 내의 일부분에 친수활성성분 결합영역(R2)을 가질 수 있다는 것이다. 상기 친수활성성분 결합영역 및 소수활성성분 결합영역에 다양한 활성성분을 부착하는 경우 본 발명에 따른 자성 나노복합체는 암진단 지능형 조영제, 암진단 및 치료를 동시에 할 수 있는 약물전달체, 자성을 이용한 세포 및 단백질 분리용 제제 등 다양한 용도로 사용될 수 있고, 이에 관한 모식도를 도 1에 도시하였다.
상기와 같은 본 발명에 따른 상기 자성 나노복합체는 도 2에 도시된 바와 같이 그 제조방법에 따라 하나 이상의 자성 나노입자가 소수성 영역에 분포된 코어 및 친수성 영역을 함유하는 셀을 포함하는 자성 나노복합체(이하, 에멀젼형 자성 나노복합체)와 하나의 자성 나노입자가 소수성 영역과 결합된 코어 및 친수성 영역을 함유하는 셀을 포함하는 자성 나노복합체(이하, 서스펜션형 자성 나노복합체)를 포함한다.
상기 에멀젼형 및 서스펜션형 자성 나노복합체의 자성 나노입자는 모두 유기성 표면 안정제가 금속, 자성 물질, 또는 자성 합금과 배위 결합되어 있는 것이 바람직하고, 자성 나노입자와 양친매성 화합물의 소수성 영역이 물리적으로 결합되어 있는 것이 바람직하다.
또한 상기 에멀젼형 나노복합체의 바람직한 직경은 1nm 내지 500nm이고, 보다 바람직한 직경은 25nm 내지 100nm이며, 서스펜션형 자성 나노복합체의 바람직한 직경은 1nm 내지 50nm이고, 보다 바람직한 직경은 5nm 내지 30nm이다.
본 발명에 따른 자성 나노복합체의 “자성 나노입자(nanoparticles)”는 자성을 가지고, 직경이 1nm 내지 1000nm, 바람직하게는 2nm 내지 100nm인 입자라면 제한 없이 사용될 수 있으나, 금속 물질(metal material), 자성 물질(magnetic material), 또는 자성 합금(magnetic alloy)인 것이 바람직하다.
상기 금속은 특별히 제한되지는 않으나, Pt, Pd, Ag, Cu 및 Au로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
상기 자성 물질 역시 특별히 제한되지는 않으나, Co, Mn, Fe, Ni, Gd, Mo, MM'2O4, 및 MxOy (M 및 M'는 각각 독립적으로 Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd, 또는 Cr을 나타내고, 0 < x ≤3, 0 < y ≤5)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
또한 상기 자성 합금 역시 특별히 제한되지는 않으나 CoCu, CoPt, FePt, CoSm, NiFe 및 NiFeCo로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
또한 상기 금속, 자성 물질, 또는 자성 합금은 유기성 표면 안정제와 결합되어 있는 것이 바람직하다. 유기성 표면 안정제(surface stabilizer)는 본 발명의 나노입자의 상태와 크기를 안정화시킬 수 있는 유기 기능성 분자를 의미하며 대표적인 예로는 계면활성제가 포함된다.
상기 계면활성제는 알킬 트라이메틸암모늄 할라이드(alkyl trimethylammonium halide)을 포함하는 양이온 계면활성제; 올레산 (oleic acid), 라우르산(lauric acid), 또는 도데실산(dodecylic acid)과 같은 포화 또는 불포화 지방산, 트리옥틸포스핀 옥사이드(trioctylphosphine oxide: TOPO), 트리옥틸포스핀(trioctylphosphine: TOP), 또는 트리부틸포스핀(tributylphosphine)과 같은 트리알킬포스핀 또는 트리알킬포스핀옥사이드, 도데실아민, 올레익아민(oleic amine), 트리옥틸아민(trioctylamine), 또는 옥틸아민(octylamine)과 같은 알킬아민(alkyl amine), 또는 알킬티올(alkyl thiol)을 포함하는 중성 계면활성제; 및 소 디움 알킬 설페이트 (sodium alkyl sulfate), 또는 소디움 알킬 포스페이트 (sodium alkyl phosphate)을 포함하는 음이온 계면활성제를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
특히, 나노입자의 안정화 및 균일한 크기 분포를 고려할 때, 포화 또는 불포화 지방산 및/또는 알킬아민을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 양친매성 화합물은 하나 이상의 소수성 영역(P1)과 하나 이상의 친수성 영역(P2)을 가지는 화합물이라면 특별히 제한되지 않는다. 상기 양친매성 화합물에 있어서, 소수성영역(P1) 및 친수성영역(P2)은 다수 개 연결되어 부착될 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 양친매성 화합물은 P1-P2, P1-P2-P1, P2-P1-P2, P1-(P2-P1)n-P2, P1-(P2-P1)n-P1, P2-(P1-P2)n-P1, 또는 P2-(P1-P2)n-P2 등 다양한 형태를 가질 수 있으며, 구조 내에 소수성 영역 또는 친수성 영역이 반복하여 존재할 수 있음은 물론이다.
본 발명에 따른 양친매성 화합물의 소수성 영역은 화합물 또는 고분자로 구성될 수 있으며, 예를 들어 생체 친화적인 포화 또는 불포화 지방산, 또는 소수성 고분자 등을 사용할 수 있다.
상기 포화 지방산은 특별히 제한되지 않으나, 부티르산, 카프로산, 카프릴산, 카프릭산, 라우르산(도데실산), 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 에이코사노산, 및 도코사노산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있으며, 불포화 지방산 역시 특별히 제한되지 않으나, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 아라키돈산, 에이코사펜타노산, 도코사헥사노산, 및 에르크산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 양친매성 화합물에 사용 가능한 포화 또는 불포화지방산을 하기 표 1 및 표 2에 나타내었다.
명칭 화학식 탄소사슬 길이
Butyric (butanoic acid) CH3(CH2)2COOH C4
Caproic (hexanoic acid) CH3(CH2)4COOH C6
Caprylic (octanoic acid) CH3(CH2)6COOH C8
Capric (decanoic acid) CH3(CH2)8COOH C10
Lauric (dodecanoic acid) CH3(CH2)10COOH C12
Myristic (tetradecanoic acid) CH3(CH2)12COOH C14
Palmitic (hexadecanoic acid) CH3(CH2)14COOH C16
Stearic (octadecanoic acid) CH3(CH2)16COOH C18
Arachidic (eicosanoic acid) CH3(CH2)18COOH C20
Behenic (docosanoic acid) CH3(CH2)20COOH C22
영문명 화학식 탄소사슬 길이:이중결합수
Oleic acid CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH C18:1
Linoleic acid CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH C18:2
Alpha-linolenic acid CH3CH2CH(=CHCH2CH=)2CH(CH2)7COOH C18:3
Arachidonic acid CH3(CH2)4CH(=CHCH2CH)3=CH(CH2)3COOH C20:4
Eicosapentaenoic acid CH3CH2CH(=CHCH2CH)4=CH(CH2)3COOH C20:5
Docosahexaenoic acid CH3CH2CH(=CHCH2CH)5=CHCH2CH2COOH C22:6
Erucic acid CH3(CH2)7CH=CH(CH2)11COOH C22:1
한편, 본 발명에 따른 양친매성 화합물에 사용 가능한 상기 소수성 고분자는 특별히 제한되지 않으나, 폴리포스파젠, 폴리락티드, 폴리락티드-코-글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 폴리안하이드라이드, 폴리말릭산 또는 그 유도체, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리하이드록시부틸레이트, 폴리카보네이트, 폴리오르소에스테르, 소수성 폴리 아미노산 및 소수성 비닐계열 고분자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상인 것이 바람직하다. 또한 상기 소수성 고분자는 중량평균분자량이 100 내지 100000인 것이 바람직하다. 중량평균분자량이 100 미만이면 생체독성을 보이고, 100000을 초과하면 응용이 어렵다.
본 발명에 따른 양친매성 화합물의 친수성 영역은 화합물 또는 고분자로 구성될 수 있으며, 예를 들어 생체친화성 고분자 등을 사용할 수 있다.
상기 생체친화성 고분자는 특별히 제한되지 않으나, 폴리알킬렌글리콜(PAG), 폴레에테르이미드(PEI), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 친수성 폴리 아미노산 및 친수성 비닐계열 고분자로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것이 바람직하며, 폴리에틸렌글리콜이 보다 바람직하다. 또한 상기 생분해성 고분자는 중량평균분자량이 100 내지 100000인 것이 바람직하다. 중량평균분자량이 100 미만이면 생체독성을 보이고, 100000을 초과하면 응용이 어렵다.
특히 상기 폴리알킬렌글리콜은 폴리에틸렌글리콜(PEG) 또는 모노메톡시폴리에틸렌글리콜(mPEG)인 것이 바람직하고, 특히 카르복실 또는 아민으로 치환된 폴리에틸렌글리콜인 것이 보다 바람직하다.
또한 상기 소수성영역(P1)은 그 구조 내의 일부분, 바람직하게는 말단에 하나 이상의 소수활성성분 결합영역(R1)을 가지는 것이 바람직하고, 상기 친수성영역(P2)은 그 구조 내의 일부분, 바람직하게는 말단에 친수활성성분 결합영역(R2)을 가지는 것이 바람직하다.
상기 친수활성성분 결합영역(R2)은 일 예를 들어 종양마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질과 결합하는 경우 본 발명에 따른 자성 나노복합체는 암진단 지능형 조영제로 사용할 수 있다.
또한 소수활성성분 결합영역(R1) 또는 소수성 영역(P1)에 약물을 중합하거나 봉입하고, 동시에 친수활성성분 결합영역(R2)에 종양마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 동시에 결합하는 경우 본 발명에 따른 자성 나노복합체는 암진단 및 치료를 동시에 할 수 있는 약물전달체로 사용할 수 있다.
한편, 친수활성성분 결합영역(R2)에 기능성 세포, 줄기세포 또는 암세포 등의 표면 항원에 대한 특이한 항체, 또는 단백질을 결합하는 경우 본 발명에 따른 자성 나노복합체는 자성을 이용한 세포 및 단백질 분리용으로 사용할 수 있다.
상기 소수성영역(P1)의 소수활성성분 결합영역(R1)은 결합되는 소수활성성분의 종류에 따라 임의로 변화될 수 있으며, 대표적으로 -COOH, -CHO, -NH2, -SH, -CONH2, -PO3H, -PO4H, -SO3H, -SO4H, -OH, -숙신이미딜기, -말레이미드기, 및 -알킬기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 기능기를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 소수활성성분은 특별히 제한되지는 않으나, 생체 활성성분, 고분자, 및 무기 지지체로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있으며, 특히 상기 생체 활성성분은 항암제, 항생제, 호르몬, 호르몬길항제, 인터루킨, 인터페론, 성장 인자, 종양 괴사 인자, 엔도톡신, 림포톡시, 유로키나제, 스트렙토키나제, 조직 플라스미노겐 활성제, 프로테아제 저해제, 알킬포스포콜린, 방사선 동위원소로 표지된 성분, 계면활성제, 심혈관계 약물, 위장관계 약물 및 신경계 약물과 같은 약제학적 활성성분으로부터 선택된 하나 이상인 것이 바람직하다.
또한, 상기 친수성 영역(P2)의 친수활성성분 결합영역(R2) 역시 결합되는 친수활성성분에 따라 임의로 변화할 수 있으며, -COOH, -CHO, -NH2, -SH, -CONH2, -PO3H, -PO4H, -SO3H, -SO4H, -OH, -NR4 +X-, -술포네이트, -니트레이트, -포스포네이트, -숙신이미딜기, -말레이미드기, 및 -알킬기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상이 기능기를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 친수활성성분은 생체 활성성분, 고분자, 및 무기 지지체로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있으며, 특히 상기 생체 활성성분은 항원, 항체, RNA, DNA, 합텐(hapten), 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘 (neutravidin), 프로테인 A, 프로테인 G, 렉틴(lectin), 셀렉틴(selectin), 방사선동위원소로 표지된 성분, 또는 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질과 같은 조직 특이적 결합 성분들(tissue-specific binding substances)으로부터 선택된 하나 이상인 것이 바람직하다.
상술한 바와 같이 상기 친수성활성성분 결합영역 또는 소수성활성성분 결합영역의 작용기는 활성성분의 종류 및 이의 화학식에 따라 변화될 수 있으며, 그 구체 예를 하기 표 3에 나타내었다.
I II III
R-NH2 R'-COOH R-NHCO-R'
R-SH R'-SH R-SS-R
R-OH R'-(에폭시기) R-OCH2C(OH)CH2-R'
RH-NH2 R'-(에폭시기) R-NHCH2C(OH)CH2-R'
R-SH R'-(에폭시기) R-SCH2C(OH)CH2-R'
R-NH2 R'-COH R-N=CH-R'
R-NH2 R'-NCO R-NHCONH-R'
R-NH2 R'-NCS R-NHCSNH-R'
R-SH R'-COCH2 R'-COCH2S-R
R-SH R'-O(C=O)X R-OCH2(C=O)O-R'
R-(아지리딘기) R'-SH R-CH2CH(NH2)CH2S-R'
R-CH=CH2 R'-SH R-CH2CHS-R'
R-OH R'-NCO R'-NHCOO-R
R-SH R'-COCH2X R-SCH2CO-R'
R-NH2 R'-CON3 R-NHCO-R'
R-COOH R'-COOH R-(C=O)O(C=O)-R' + H2O
R-SH R'-X R-S-R'
R-NH2 R'CH2C(NH2 +)OCH3 R-NHC(NH2 +)CH2-R'
R-OP(O2 -)OH R'-NH2 R-OP(O2 -)-NH-R'
R-CONHNH2 R'-COH R-CONHN=CH-R'
R-NH2 R'-SH R-NHCO(CH2)2SS-R'
I: 활성성분 결합영역의 작용기 II: 활성성분 III: I과 II의 반응에 따른 결합예
본 발명에 따른 자성 나노복합체에 있어서, 양친매성 화합물은 적당한 가교제(cross linker)를 사용하여 친수성활성성분 결합영역 또는 소수성활성성분 결합영역을 친수성활성성분 또는 소수성활성성분과 결합할 수 있다.
이에 사용되는 가교제는 특별히 제한되지 않으나, 1,4-디이소티오시아나토벤젠(1,4-Diisothiocyanatobenzene), 1,4-페닐린 디이소시아네이트(1,4-Phenylene diisocyanate), 1,6-디이소시아나토헥산(1,6-Diisocyanatohexane), 4-(4-말레이미도페닐)뷰트릭산 노말-하이드록시숙신이미드 에스터(4-(4-Maleimidophenyl)butyric acid N-hydroxysuccinimide ester), 포스겐(Phosgene solution), 4-(말레이미도)페닐 이소시아네이트(4-(Maleinimido)phenyl isocyanate), 1,6-헥산디아민(1,6-Hexanediamine), 파라-니트로페닐클로로포르메이트(p-Nitrophenyl chloroformate), 노말-하이드록시숙신이미드(N-Hydroxysuccinimide), 1,3-디사이클로헥실카르보이미드(1,3-Dicyclohexylcarbodiimide), 1,1′-카르보닐디이미다졸(1,1′-Carbonyldiimidazole), 3-말레이미도벤조익산 노말-하이드록시숙신이미드 에스터(3-Maleimidobenzoic acid N-hydroxysuccinimide ester), 에틸렌디아민(Ethylenediamine), 비스(4-니트로페닐)카르보네이트(Bis(4-nitrophenyl) carbonate), 숙시닐 클로라이드(Succinyl chloride), N-(3-디메틸아미노프로필)-N′-에틸카르보이미드 하이드로클로라이드(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide Hydrochloride), N,N′-디숙신이미딜 카르보네이트(N,N′-Disuccinimidyl carbonate), N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate), 및 숙시닉 언하이드라이드(sucinic anhydride) 로 이루어진 그룹중에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 자성 나노복합체에 있어서, 양친매성 화합물은 소수성 영역-친수성 영역, 또는 친수성영역-소수성영역-친수성영역으로 이루어진 것이 바람직하다. 또한 친수성 및 소수성 영역에 각각의 활성성분결합영역이 포함되는 경우 소수활성성분 결합영역-소수성 영역-친수성 영역-친수활성성분 결합영역, 또는 친수활성성분 결합영역-친수성영역-소수성영역(-소수활성성분 결합영역)-친수성영역-친수활성성분 결합영역으로 이루어진질 수 있다. 특히 소수활성성분 결합영역-소수성 영역-NH2-친수성 영역-친수활성성분 결합영역과 같이 상기 친수성 영역과 소수성 영역에 -NH2- 같은 작용기가 있는 것이 바람직하다. 상기 친수성 영역과 소수성 영역에 존재하는 -NH2-기는 양친매성 화합물이 자성 나노입자의 표면에 부가되는 경우 보다 안정한 구조를 가질 수 있다.
또한 본 발명에 따른 자성 나노복합체에 있어서, 양친매성 화합물의 가장 바람직한 예는 카르복실폴리에틸렌글리콜-폴리락티드-코글리콜라이드 공중합체 또는 양 말단이 카르복시기로 치환된 폴리(에틸렌 옥사이드)-폴리(프로필렌 옥사이드)-폴리(에틸렌 옥사이드) 공중합체이다.
본 발명은 또한 상기 자성 나노복합체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조영제 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조영제 조성물에 사용되는 담체는 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함하며, 구체적으로 이온 교환, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 여러 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 조영제 조성물은 또한 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
한 양태로서, 본 발명에 따른 조영제 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있다. 바람직하게는 한스 용액(Hank’s solution), 링거 용액(Ringer’s solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.
본 발명의 조영제 조성물의 다른 바람직한 양태는 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액의 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예를 들면 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형화할 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액(예를 들면 1,3-부탄디올 중의 용액)일 수 있다. 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 비휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 비휘발성 오일은 그 어느 것도 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 조영제 조성물을 생체 또는 시료에 투여하는 단계; 및
상기 생체 또는 시료로부터 자성 나노복합체에 의해 발산되는 신호를 감지하여 영상을 수득하는 단계를 포함하는 조영제 조성물의 이용방법에 관한 것이다.
상기에서 사용된 용어 “시료”는 진단하고자 하는 대상으로부터 분리한 조직 또는 세포를 의미한다. 또한 상기 조영제 조성물을 생체 또는 시료에 주입하는 단계는 의약 분야에서 통상적으로 이용되는 경로를 통해 투여될 수 있으며, 비경구 투여가 바람직하고 예를 들어 정맥내, 복강내, 근육내, 피하 또는 국부 경로를 통하여 투여할 수 있다.
상기 이용방법에 있어서, 자성 나노복합체에 의해 발산되는 신호는 자기장을 이용하는 각종 장비들에 의해서 감지될 수 있으며, 특히 자기공명영상 장치(MRI)가 바람직하다.
자기공명영상 장치는 강력한 자기장 속에 생체를 넣고 특정 주파수의 전파를 조사하여 생체조직에 있는 수소 등의 원자핵이 에너지를 흡수하여 에너지가 높은 상태로 만든 후 상기 전파를 중단하여 상기 수소 등의 원자핵 에너지가 방출되게 하고 이 에너지를 신호로 변환하여 컴퓨터로 처리하여 영상화한 장치이다. 자기 또는 전파는 골에 방해를 받지 않기 때문에 단단한 골 주위 또는 뇌나 골수의 종양에 대하여 종단, 횡단, 임의의 각도에서 선명한 입체적인 단층상을 얻을 수 있다. 특히 상기 자기 공명 영상 장치는 T2 스핀-스핀 이완 자기 공명영상 장치인 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 A) 나노입자를 용매에서 합성하는 단계; 및
B) 소수성 영역과 친수성 영역을 가지는 양친매성 화합물을 상기 나노입자 표면에 부가하여 양친매성 화합물과 나노입자를 결합시키는 단계를 포함하는 자성 나노복합체의 제조방법에 관한 것이다.
이하 본 발명에 따른 자성 나노복합체의 제조방법의 각 단계를 보다 상세히 설명한다.
상기 나노입자를 용매에서 합성하는 단계 A)는 나노입자 전구체와 표면안정제를 반응시키는 단계로서,
a) 용매의 존재 하에 나노입자 전구체와 유기성 표면 안정제를 반응시키는 단계; 및
b) 상기 반응물을 열분해하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 단계 a)는 유기성 표면 안정제가 포함된 용매에 나노입자 전구체를 투입하여 나노입자 표면에 유기성 표면 안정제를 배위시키는 단계이다.
상기 단계 a)의 나노입자는 금속, 자성 물질, 또는 자성 합금을 사용하는 것이 바람직하고, 유기성 표면 안정제는 알킬 트라이메틸암모늄 할라이드(alkyl trimethylammonium halide), 포화 또는 불포화 지방산, 트리알킬포스핀 옥사이드(trialkylphosphine oxide), 알킬아민(alkyl amine), 알킬티올(alkyl thiol), 소디움 알킬 설페이트 (sodium alkyl sulfate), 및 소디움 알킬 포스페이트 (sodium alkyl phosphate)로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있다. 상기 금속, 자성물질, 자성 합금 및 유기성 표면 안정제의 구체적인 종류는 상술한 바와 같다.
상기 단계 a)의 나노입자 전구체는 금속과 -CO, -NO, -C5H5, 알콕사이드(alkoxide) 또는 기타 공지의 리간드가 결합된 금속화합물을 사용할 수 있으며, 구체적으로 아이언펜타카르보닐 (iron pentacarbonyl, Fe(CO)5), 페로센(ferrocene), 또는 망간카르보닐(Mn2(CO)10) 등의 금속 카르보닐계열의 화합물; 또는 철 아세틸아세토네이트 (Fe(acac)3) 등의 금속 아세틸아세토네이트 계열의 화합물등의 다양한 유기금속화합물들을 사용할 수 있다. 또한 나노입자 전구체는 금속과 Cl-, 또는 NO3- 등의 공지된 음이온과 결합된 금속이온을 포함한 금속염을 사용할 수 있으며, 구체적으로 삼클로로화철(FeCl3), 이클로로화철(FeCl2), 또는 철 나이트레이트 (Fe(NO3)3)등을 사용할 수 있다. 또한 합금 나노입자와 복합 나노입자 합성에서는 위에서 언급한 2종 이상의 금속의 전구체의 혼합물을 사용할 수 있다.
상기 a) 단계에서 사용 가능한 용매는 나노입자 표면에 유기성 표면 안정제가 배위된 착화합물의 열분해 온도에 근접하는 높은 끊는점을 가지는 것이 바람직하며, 예를 들어 에테르계 화합물, 헤테로고리화합물, 방향족화합물, 술폭사이드화합물, 아마이드화합물, 알코올, 탄화수소 및 물로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 사용할 수 있다.
구체적으로 상기 용매는 옥틸 에테르(octyl ether), 부틸 에테르(butyl ether), 헥실 에테르(hexyl ether), 또는 데실 에테르(decyl ether)와 같은 에테르계 화합물; 피리딘, 또는 테트라하이드로퓨란(THF)과 같은 헤테로고리화합물; 톨루엔, 자일렌, 메시틸렌, 또는 벤젠과 같은 방향족화합물: 디메틸술폭사이드(DMSO)와 같은 술폭사이드화합물; 디메틸포름아마이드(DMF)와 같은 아마이드화합물; 옥틸알코올, 또는 데칸올과 같은 알코올; 펜탄, 헥산, 헵탄, 옥탄, 데칸, 도데칸, 테트라데칸, 또는 헥사데칸과 같은 탄화수소, 또는 물을 사용할 수 있다.
상기 a) 단계의 반응 조건은 특별히 제한되지 않으며, 금속전구체 및
표면 안정제의 종류에 따라 적절히 조절할 수 있다. 반응은 실온 또는 그 이하의 온도에서도 형성될 수 있으나, 통상적으로는 약 30~200℃의 범위로 가열 및 유지시키는 것이 바람직하다.
상기 b) 단계는 나노입자 표면에 유기성 표면 안정제가 배위된 착화합물을 열분해하여 나노입자를 성장시키는 단계이다. 이 때 반응조건에 따라 균일한 크기 및 형상의 금속 나노입자를 형성할 수 있으며, 열분해 온도역시 금속전구체 및 표면 안정제의 종류에 따라 적절히 조절할 수 있다. 바람직하게는 약 50~500℃에 반응시키는 것이 적절하다. 상기 b) 단계에서 제조된 나노입자는 공지의 수단을 통하여 분리 및 정제할 수 있다.
본 발명에 따른 자성 나노복합체의 제조방법에 있어서, 단계 B)는 소수성 영역과 친수성 영역을 가지는 양친매성 화합물을 상기 나노입자 표면에 부가하여 양친매성 화합물과 나노입자를 결합시키는 단계이다.
상기 자성 나노입자의 표면에 양친매성 화합물을 부가하는 방법은 상술한 바와 같이 에멀젼에 의한 방법과 서스펜션에 의한 방법으로 구분되며 이에 관한 모식도를 도 2에 나타내었다.
보다 구체적으로, 상기 부가 단계 B)는
a) 나노입자를 유기용매에 용해시켜 오일상을 제조하는 단계;
b) 양친매성 화합물을 수성용매에 용해시켜 수용상을 제조하는 단계;
c) 상기 오일상과 수용상을 혼합하여 에멀젼을 형성하는 단계; 및
d) 상기 에멀젼으로부터 오일상을 분리하는 단계를 포함하는 것이 바람직하며, 상기 a) 내지 d)단계를 포함하는 방법에 의하여 본 발명에 따른 에멀젼형 자성 나노복합체를 제조할 수 있다.
또한 상기 부가 단계 B)는
e) 상기 나노입자를 양친매성 화합물이 용해된 용액에서 분산시켜 현탁액을 제조하는 단계; 및
f) 상기 현탁액으로부터 용매를 분리하는 단계를 포함하는 것이 바람직하며, 상기 e) 및 f)단계를 포함하는 방법에 의하여 본 발명에 따른 서스펜스형 자성 나노복합체를 제조할 수 있다.
상기 부가단계 B)에 있어서, 상기 소수성 영역은 포화 또는 불포화 지방산, 또는 소수성 고분자인 것이 바람직하고, 상기 친수성 영역은 생분해성 고분자인 것이 바람직하며, 이에 대한 구체적인 종류는 상술한 바와 같다.
한편, 부가 단계 B)에 있어서, 양친매성 화합물은 당업계에 공지된 방법에 의하여 제조할 수 있다. 일 예를 들어, 친수성기를 구성하는 디아민 폴리에틸렌 글리콜(diamine polyethylene glycol, NH2-PEG-NH2)과 소수성기를 구성하는 생분해성고분자의 일종인 폴리락타이드-코-글리콜라이드를 중합시켜 제조할 수 있다. 또한 양친매성 고분자의 아민기로 치환된 친수활성성분 결합영역에 노말-디숙신이미딜 카보네이트(N,N'-Disuccinimidyl carbonate)를 사용하여 친수활성성분 결합영역을 숙신이미딜기로 치환이 가능하다. 또한 친수성기를 구성하는 카르복실/아민 폴리에틸렌 글리콜(carboxyl/amine polyethylene glycol, NH2-PEG-COOH)과 소수성기를 구성하는 생분해성고분자의 일종인 폴리락타이드-코-글리콜라이드를 중합시켜 양친매성 고분자의 친수활성성분 결합영역이 카르복실기로 치환시킬수 있다. 또한 생분해성 양친매성 고분자는 락타이드를 단량체로 사용하여 개환 중합을 통하여 제조할 수 있다. 락타이드는 카르복실/아민 폴리에틸렌 글리콜의 아민기에 의해 개시가 일어나게 되며 촉매로는 옥탄산 제 1 주석(stannous octoate)을 사용할 수 있다. 중합은 질소 대기하에서 및 100 ~ 180℃의 조건으로 진행할 수 있다. 이때, 초기 매크로-개시제 인 카르복실/아민 폴리에틸렌 글리콜의 분자량과 양을 조절하여 공중합체의 분자량을 조절할 수 있다.
상기 단계 A) 및 B)에 의해 생성된 수용성 나노입자는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 분리할 수 있다. 일반적으로 수용성 나노입자는 침전물로 생성되기 때문에 원심분리 또는 여과를 이용하여 분리하는 것이 바람직하다.
한편, 자성 나노복합체 및 이를 포함하는 암의 동시진단 및 치료제의 제조를 위해 봉입되는 항암제는 물리적 봉입과 화학적 봉입으로 구분할 수 있으며, 이 둘의 조합 또한 가능하다. 에멀전 방법과 서스펜션 방법에 의해 자성 나노복합체가 제조되는 중에 양친매성 고분자의 소수활성성분과 항암제의 물리적인 결합을 통해 약물의 봉입이 이루어지게 된다. 또한 자성 나노복합체를 구성하는 양친매성 고분자의 소수활성성분 결합영역과 화학적 결합이 가능한 항암제의 경우 적당한 가교제를 사용하여 양친매성 고분자의 소수활성성분 결합영역과 항암제의 결합이 가능하여 자성 나노복합체에 약물의 봉입이 이루어 질 수 있다.
본 발명에 따른 치료 방법에서 이용될 수 있는 항암제로는 이에 제한되는 것은 아니지만 에피루비신(Epirubicin), 도세탁셀(Docetaxel), 젬시타빈(Gemcitabine), 파클리탁셀(Paclitaxel), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 택솔(taxol), 프로카르바진(procarbazine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 디악티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 에토포시드(etoposide), 탁목시펜(tamoxifen) 독소루비신(doxorubicin), 미토마이신(mitomycin), 블레오마이신(bleomycin), 플리코마이신(plicomycin), 트랜스플라티눔(transplatinum), 빈블라스틴(vinblastin) 및 메토트렉세이트(methotrexate) 등이 있다.
본 발명에 따라 형성된 자성 나노복합체를 이용하면 생체 분자의 분리, 진단, 치료 등의 나노 표지자 (probe) 및 약물 또는 유전자 전달체 (delivery vehicle)등에 이용될 수 있다.
자성 나노복합체를 이용한 생체 진단의 한 대표적인 예로서 분자 자기공명영상 진단 또는 자기 이완 센서 (magnetic relaxation sensor)를 들 수 있다. 자성 나노복합체는 그 크기가 커짐에 따라 더 큰 T2 조영효과를 나타내는데, 이러한 성질을 이용하면 생체 분자를 검출하는 센서로 사용될 수 있다. 즉, 특정한 생체 분자가 자성 나노복합체의 엉김을 유도하게 되면 이에 의해 T2 자기 공명 영상 효과가 증대된다. 이러한 차이를 이용하여 생체 분자를 검출한다.
또한 본 발명에 따른 자성 나노복합체는 거대 자기-저항 바이오센서 (Giant magnetic resistance (GMR) sensor)의 진단 물질이 될 수 있다. 자성 나노복합체는 기존의 마이크로 미터 (10-6 m) 크기의 비드 (US 6,452,763 B1; US 6,940,277 B2; US 6,944,939 B2; US 2003/0133232 A1)보다 더 우수한 자기적 특징, 수용액에서의 콜로이드 안정성, 낮은 비선택성 결합을 나타낼 수 있으므로, 기존 거대자기저항 바이오 센서의 검출한계를 크게 높일 수 있는 가능성을 갖고 있다.
또한 본 발명에 따른 자성 나노복합체를 외부자기장을 이용한 생체 분자의 분리법에 사용될 수 있다. 즉, 세포의 분리뿐만 아니라, 단백질, 항원, 펩타이드, DNA, RNA, 바이러스 등 다양한 생체 분자의 분리에 응용될 수 있다.
또한 본 발명에 따른 자성 나노복합체는 자성 마이크로 유체 센서를 이용한 분리 및 검출, 약물 또는 유전자의 전달, 자성 고온 치료법에 이용될 수 있다.
한편 본 발명에 따른 자성 나노복합체는 또한 다른 진단 프로브와 결합되어 이중 또는 다중 진단 프로브로 사용될 수 있다. 예를 들면, 수용성 자성 나노복합체에 T1 자기공명 영상 진단 프로브를 결합시키면 T2 자기공명영상 및 T1자기공명영상 진단을 동시에 진행할 수 있으며, 광학 진단 프로브를 결합시키면 자기공명 영상과 광학 이미징을 동시에 할 수 있으며, CT 진단 프로브를 결합시키면 자기공명영상과 CT 진단을 동시에 할 수 있다. 또한 방사선 동위원소와 결합시키면 자기공명영상과 PET, SPECT 진단을 동시에 할 수 있다.
상기 T1 자기공명 영상 진단 프로브로는 Gd 화합물, Mn화합물 등을 포함하며, 광학 진단 프로브로는 유기 형광 dye, 양자점, 혹은 dye labelled 무기 지지체 (예 SiO2, Al2O3))를 포함하며, CT 진단 프로브로는 I (요오드) 화합물, 금 나노 입자를 포함하며, 방사선 동위원소로는 In, Tc, F등을 포함한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 어떠한 의미로도 본 발명을 제한하지 않는다.
< 제조예 1> 포화 지방산을 이용한 고민감도 자성 나노입자의 제조
6 nm의 마그네타이트(Fe3O4)는 벤질에테르 용매에서 도데실산(0.6몰)과 도데실 아민(0.6몰) 및 철 트리아세틸아세토네이트 (Aldrich)를 290℃에서 열분해 화학반응(thermal decomposition)시켜 (30 분) 합성하였다. 12 nm 산화철 나노입자는 도데실산(0.2 몰), 도데실 아민(0.1 몰), 상기 6 nm 산화철 나노입자(10 mg/ml) 및 철 트리에세틸아세토네이트를 포함하는 벤질에테르 용액을 290 ℃에서 30 분 동안 가열하여 제조하였다. 망간페라이트(MnFe2O4)는 위의 반응에 망간 투아세틸아세토네이트를 첨가하여 제조하였다. 제조된 마그네타이트 및 망간페라이트의 투과전자현미경 사진을 각각 도 4a 및 b에 도시하였다. 상기 마그네타이트 및 망간페라이트의 자기적 특성은 VSM을 이용하여 측정하였으며 이를 각각 점선 및 실선으로 표시하여 도 4c에 도시하였다.
< 제조예 2> 불포화 지방산을 이용한 고민감도 자성 나노입자의 제조
6 nm의 마그네타이트(Fe3O4)는 벤질에테르 용매에서 올레인산(0.6 몰)과 올레일 아민(0.6몰) 및 철 트리아세틸아세토네이트 (Aldrich)를 290 ℃에서 열분해 화학반응(thermal decomposition)하여 (30 분) 합성하였다. 12 nm 산화철 나노입자는 올레인산(0.2 몰), 올레일 아민(0.1 몰), 상기 6 nm 산화철 나노입자(10 mg/ml) 및 철 트리에세틸아세토네이트를 포함하는 벤질에테르 용액을 290 ℃에서 30 분 동안 가열하여 제조하였다. 망간페라이트(MnFe2O4)는 위의 반응에 망간 투아세틸아세토네이트를 첨가하여 제조하였다. 제조된 마그네타이트 및 망간페라이트의 투과전자현미경 사진을 각각 도 5a 및 b에 도시하였다. 상기 마그네타이트 및 망간페라이트의 자기적 특성은 VSM을 이용하여 측정하였으며 이를 각각 점선 및 실선으로 표시하여 도 5c에 도시하였다.
< 제조예 3> 생분해성 양친매성 고분자 모노메톡시폴리에틸렌글리콜 - 폴리락티드 -코- 글리콜라이드의 중합
2 g의 모노메톡시폴리에틸렌글리콜(MPEG, 분자량 5000)을 감압하여 수분을 제거하였다. 촉매로서 2.0 mg의 옥탄산 제 1 주석을 수분이 제거된 톨루엔에 가한 후 100 ℃에서 20 내지 30분간 감압하고, 반응물에 1.15 g의 D,L-락티드와 0.93 g의 글리콜라이드를 가하고 140 ℃에서 12시간 동안 중합하였다. 생성된 블록 공중합체를 5 ml의 클로로포름을 가해 녹인 다음 과량의 디에틸에테르에 소량씩 떨어뜨리고 생성된 침전물을 여과하고, 디에틸에테르로 세척한 후 50 ℃에서 하루 동안 감압·건조하여 모노메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리락티드-코-글리콜라이드의 블록 공중합체를 얻었다(수율 72.5 %, 손실량 포함).
상기의 방법과 동일한 방법으로 하기 표 4에 기재된 각 성분을 사용하여 다양한 이중 블록 공중합체를 제조하였으며, 제조된 이중 블록 공중합체들의 제조량 및 수율은 다음과 같다.
블록 공중합체의 종류 반응물의 양 공중합체의 수율 (%)
mPEG (g) D,L-락타이드 (g) 글리콜라이드 (g) 옥탄산 제1주석 (mg)
MPEG(5000)-PLGA(1000) 2 0.2306 0.1856 50 69.3
MPEG(5000)-PLGA(5000) 2 1.1530 0.9280 50 68.6
MPEG(2000)-PLGA(1000) 2 0.5765 0.4640 50 71.3
MPEG(2000)-PLGA(5000) 2 3.4591 2.7840 50 70.1
제조된 블록 공중합체는 3.6 ppm 근처에서 폴리에틸렌글리콜의 피크를, 4.9 ppm과 1.6 ppm 근처에서 폴리락타이드-코-글콜라이드의 피크를 수소 핵자기공명(1H-NMR)로 확인하였다. 또한, 제조된 블록 공중합체의 겔 투과 크로마토그래피(GPC)에 의한 상대 분자량 및 분자량 분포를 하기 표 5에 나타내었다.
블록 공중합체의 종류 NMR GPC
Mn a Mn b Mw/Mn
MPEG(5000)-PLGA(1000) 6270 6710 1.19
MPEG(5000)-PLGA(5000) 10350 12470 1.21
MPEG(2000)-PLGA(1000) 3280 3720 1.15
MPEG(2000)-PLGA(5000) 9510 9980 1.11
a: 핵자기 공명 b: 겔투과 크로마토그래피 Mn: 수평균분자량 Mw: 질량평균 분자량
<제조예 4> 지방산 양친매성 화합물 모노메톡시폴리에틸렌글리콜-도데실산의 중합
지방산 양친매성 화합물 모노메톡시폴리에틸렌글리콜-도데실산의 중합 과정을 도 6에 도시하였다. 5 g의 평균분자량이 5,000인 모노메톡시폴리에틸렌글리콜(MPEG)와 0.6 g의 도데실산(DA)을 메틸렌클로라이드(methylene chloride)에 용해시킨 후 0.91 g의 1,3-디사이클로헥실카르보이미드(1,3-Dicyclohexylcarbodiimide)와 0.37 g의 4-디메틸아미노피리딘(4-Dimethylaminopyridine)을 첨가하여 반응을 진행하였다. 24시간 후, 생성된 부산물은 여과하여 제거하고 차가운 과량의 디에틸에테르(ethyl ether)를 첨가하였다. 생성된 침전물을 여과하고 디에틸에테르로 세척하여 감압 건조하여 모노메톡시폴리에틸렌글리콜-도데실산(MPEG-DA)의 양친매성 고분자를 제조하였다(수율 92.5 %). 적외선 분광법(FT-IR)과 수소핵자기공명(1H-NMR)을 통해 중합체의 구조를 확인하였고, 이를 각각 도 7 및 8에 도시하였다. 도 7에서 (a)는 모노메톡시폴리에틸렌글리콜, (b)는 도데실산, (c)는 모노메톡시폴리에틸렌글리콜-도데실산 그리고 (d)는 모노메톡시폴리에틸렌글리콜-도데실산을 이용한 수용성 자성나노복합체의 분광 스펙트럼을 나타낸다. 도 7에 도시된 바와 같이 적외선 분광법에서 도데실산의 카르복실산(-COOH)의 피크는 1695cm-1에서 확인하였고, 도데실산과 폴리에틸렌 글리콜의 결합부위인 에스테르 결합의 피크는 1734cm-1에서 확인하였다. 또한 도 8에 도시된 바와 같이 수소핵자기 공명(1H-NMR)을 이용하여 3.62 ppm에서 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜의 -CH2CH2O- 피크를 확인하였고, 1.27 ppm에서 도데실산의 피크를 확인하였다.
<제조예 5> 친수활성성분 결합영역이 카르복실기로 치환된 생분해성 양친매성 고분자의 합성
가. 고분자들의 활성성분을 결합하여 친수활성성분 결합영역이 카르복실기로 치환된 생분해성 양친매성 고분자의 합성
고분자들의 활성성분을 결합하여 친수활성성분 결합영역이 카르복실기로 치환된 생분해성 양친매성 고분자의 합성 과정을 도 9에 도시하였다. 0.05 몰의 폴리락타이드-코-글리콜라이드와 0.2 몰의 노말-하이드록시숙신이미드(NHS)와 1,3-디사이클로헥실카르보이미드(DCC)를 메틸렌클로라이드에 용해시킨 후 상온에서 질소 대기하에서 24시간동안 반응하였다. 반응물은 필터를 통해 거른후 차가운 디에틸테테르에 떨어뜨려 침전시켰다. 이 침전물은 디에틸에테르로 수차례 세척후 진공상태에서 보관하였다.
위의 방법으로 활성화된 고분자를 0.01 몰 취하여 8 ml의 메틸렌클로라이드에 용해 시킨후 양쪽 끝 말단 작용기가 아민기와 카르복실기로 치환된 폴리에틸렌글리콜 0.01 몰을 취하여 2 ml의 메틸렌클로라이드에 용해시켜 조금씩 떨어뜨리면서 반응하였다. 반응은 상온에서 질소 대기하에 12 시간동안 이루어 졌으며, 반응물은 위에 언급한 방법을 통해 세척, 보관하였다. 합성된 고분자의 구조는 수소 핵자기공명(1H-NMR)과 적외선분광(FT-IR)을 통해 분석하였으며, 이를 도 10 및 11에 도시하였다.
나. 친수성 고분자의 활성성분을 통한 친수활성성분 결합영역이 카르복실기로 치환된 생분해성 양친매성 고분자의 중합
친수성 고분자의 활성성분을 통한 친수활성성분 결합영역이 카르복실기로 치환된 생분해성 양친매성 고분자의 중합 과정을 도 12에 도시하였다. 0.2 g의 양쪽 끝 말단 작용기가 아민기와 카르복실기로 치환된 폴리에틸렌글리콜(분자량 3400)을 감압하여 수분을 제거하였다. 촉매로서 20 mg의 옥탄산 제 1 주석을 수분이 제거된 톨루엔에 가한 후 100 ℃에서 20 내지 30분간 감압하고, 반응물에 0.119 g의 D,L-락티드를 가하고 140 ℃에서 12시간 동안 중합하였다. 생성된 블록 공중합체를 5 ml의 클로로포름을 가해 녹인 다음 과량의 디에틸에테르에 소량씩 떨어뜨리고 생성된 침전물을 여과하고, 디에틸에테르로 세척한 후 50 ℃에서 하루 동안 감압·건조하여 카르복실폴리에틸렌글리콜-폴리락티드의 블록 공중합체를 얻었다(수율 87.2 %).
<제조예 6> 상용 계면활성제의 친수활성성분 결합영역이 카르복실기로 치환된 양친매성 고분자의 합성
플루오닉(Pluronic) 계열의 비이온성 상용계면활성제는 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드-폴리에틸렌옥사이드(PEO-PPO-PEO, 친수성-소수성-친수성)의 형태를 가지며, 이 계면활성제의 말단 하이드록실기(-OH)를 항체 등의 리간드를 붙일 수 있는 카르복실기로 치환하였다. 30 g 의 플루오닉 F-127과 카르복실기 치환제로 476.5 mg의 숙시닉 언하이드라이드 (succinic anhydride), 촉매로써 290.9 mg의 4-다이메틸아미노피리딘 (4-dimethylaminopyridine), 331.9 μl의 트리에틸아민 (triethylamine)을 용매인 500 ml의 1,4-다이옥산(1,4-dioxane)에 용해 시켜 24시간 동안 상온에서 반응을 진행하였다. 반응 후 동결건조를 통해 용매를 제거하고, 사염화탄소를 가한 후 필터를 통해 걸러 반응하지 않은 숙시닉 언하이드라이드 등을 제거하였다. 나머지 불순물을 제거하기 위해 걸러진 반응물을 차가운 디에틸에테르에 떨어뜨려 침전시켰다. 이 침전물을 디에틸에테르로 수차례 세척 후 보관하였다. 친수활성성분 결합영역이 카르복실기로 치환된 플루오닉 F-127은 적외선 분광법 및 핵자기공명(1H-NMR) 분석을 통해 확인하였으며, 이를 각각 도 13 및14에 도시하였다. 도 13에서 (a)는 친수활성성분 결합영역이 카르복실기로 치환된 플루오닉 F-127, (b) 플루오닉 F-127 및 (c) 숙시닉 언하이드라이드의 피크를 나타낸다. 한편, 도 14에서 14a는 본 발명의 다른 제조예에 따른 친수 활성성분 결합영역이 카르복실기로 치환되기 전의 플로오닉 F-127의 핵자기공명(1H-NMR)의 결과이고, 도 14b는 카르복실기로 치환된 F-127의 핵자기공명(1H-NMR)의 결과를 도시한 그래프이다.
<실시예 1> 생분해성 양친매성 고분자를 이용한 에멀젼형 자성 나노복합체의 제조
상기 <제조예 3>에서 제조한 100 mg의 양친매성 생분해성 고분자(모노메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리락티드-코-글리콜라이드)를 20 ml의 수용상인 초순수에 용해시키고, <제조예 1>에서 제조한 20 mg의 자성 나노입자를 오일상인 5 ml의 클로로포름(chloroform)에 용해시켰다. 상기 수용상과 오일상을 혼합시킨 후 이 혼합물을 300 W의 초음파에 의해 10 분 동안 포화시켰다. 상기 에멀젼을 12 시간 동안 교반하여 오일상을 증발시키고 원심분리와 겔 필트레이션 컬럼(Sephacryl S-300)을 통하여 분순물이 제거된 에멀젼형 자성 나노복합체를 제조하였다. 상기 생분해성 양친매성 고분자 모노메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리락티드-코-글리콜라이드를 이용한 에멀젼형 자성 나노복합체의 모식도를 도 3a에 도시하였다. 제조된 입자는 투과 전자 현미경과 동적 레이저 광 산란법을 사용하여 확인하였고 이를 각각 도 15a 및 b에 도시하였다.
<실시예 2> 생분해성 양친매성 고분자를 이용한 서스펜선형 자성 나노복합체의 제조
상기 <제조예 1>에서 제조한 3mg의 자성 나노입자를 <제조예 3>에서 제조한 50 mg의 양친매성 생분해성 고분자 모노메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리락티드-코-글리콜라이드가 용해되어 있는 클로로포름에 분산시켰다. 분산액을 교반하면서 40 ℃로 가열하여 용매를 증발시키고, 0.5 ml의 인산완충용액(PBS)용액에 재분산시켰다. 상기 용액을 30 ℃에서 6 시간 동안 가열/교반하여 현탁액을 완성하였다. 원심분리를 통해 자성입자를 포함하지 않고 있는 마이셀을 제거하고 0.5 ml의 PBS용액에 재 분산시켰다. 상기 생분해성 양친매성 고분자인 모노메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리락티드-코-글리콜라이드를 이용한 서스펜선형 자성 나노복합체의 모식도를 도 3b에 도시하였다. 제조된 입자는 투과 전자 현미경과 동적 레이저 광 산란법을 사용하여 확인하였고 이를 각각 도 16a 및 b에 도시하였다.
<실시예 3> 지방산 양친매성 화합물을 이용한 에멀젼형 자성 나노복합체의 제조
상기 <제조예 4>에서 제조한 600 mg의 지방산 양친매성 중합체 모노메톡시폴리에틸렌글리콜-도데실산을 20 ml의 수용상인 초순수에 용해시키고, <제조예 1>에서 제조한 20 mg의 자성나노입자를 오일상인 5 ml의 클로로포름에 용해시켰다. 상기 수용상과 오일상을 혼합시킨 후 이 혼합물을 300 W의 초음파에 의해 10 분동한 포화시켰다. 상기 에멀젼을 6 시간 동안 교반하여 오일상을 증발시키고 원심분리와 겔 필트레이션 컬럼(Sephacryl S-300)을 통하여 분순물이 제거된 고민감도 자기공명영상용 나노복합체를 제조하였다. 상기 지방산 양친매성 고분자인 모노메톡시폴리에틸렌글리콜-도데실산을 이용한 에멀젼형 자성 나노복합체의 모식도를 도 3c에 도시하였다. 제조된 입자는 투과 전자 현미경과 동적 레이저 광 산란법을 사용하여 확인하였고 이를 각각 도 17a 및 b에 도시하였다. 자기적 특성은 진동 시료 마그네토미터(vibration sample magnetometer)을 통하여 초상자성인 것을 확인하였고 이를 도 18에 도시하였다. 실선은 자성나노입자, 점선은 지방산 양친매성 화합물을 이용한 에멀젼형 자성 나노복합체의 자기 이력곡선을 나타낸다. 또한, 적외선 분광법을 통해 양친매성 중합체 모노메톡시폴리에틸렌글리콜-도데실산과 자성나노 입자의 존재 여부를 확인하고 이를 도 7d에 도시하였다.
<실시예 4> 생분해성 양친매성 고분자를 이용한 친수활성성분 결합영역이 카르복실기로 치환된 에멀젼형 자성 나노복합체의 제조
상기 <제조예 5, 가>에서 제조한 100 mg의 양친매성 생분해성 고분자를 수용인 20 ml의 수용상인 초순수에 용해시키고, <제조예 1>에서 제조한 20 mg의 자성나노입자인 마그네타이트 및 망간페라이트를 독소루비신 2 mg과 함께 오일상인 5ml의 클로로포름에 용해시켰다. 상기 수용상과 오일상을 혼합시킨 후 이 혼합물을 300W의 초음파에 의해 10 분 동안 포화시켰다. 상기 에멀젼을 12 시간동안의 교반하여 오일상을 증발시키고 원심분리와 겔 필트레이션 컬럼(Sephacryl S-300)을 통하여 불순물이 제거된 자성 나노복합체를 제조하였다. 상기 항암제가 봉입되어 있고 친수활성성분 결합영역이 카르복실기로 치환된 에멀젼형 수용상 자성나노복합체의 모식도를 도 3d에 도시하였다. 제조된 입자는 동적 레이저 광 산란법과 투과 전자 현미경을 사용하여 확인하고, 이를 도 19에 도시하였다. 도 19에서 (a)는 마그네타이트(Fe3O4)가 봉입된 에멀젼형 자성 나노복합체, (b)는 망간 페라이트(MnFe3O4)가 봉입된 에멀젼형 자성 나노복합체, (c)는 자성 나노 복합체의 크기분포도이다. 또한 봉입된 자성나노입자의 무게비율은 열중량분석 방법에 의해 분석되었으며 그 결과를 도 20에 도시하였다. 자기적 특성은 VSM을 이용하여 측정하였으며 이를 도 21에 도시하였다.
<실시예 5> 생분해성 양친매성 고분자를 이용한 친수활성성분 결합영역이 카르복실기로 치환된 서스펜션형 자성 나노복합체의 제조
상기 <제조예 1>에서 제조한 3mg의 자성 나노입자를 <제조예 5, 나>에서 제조한 50 mg의 양친매성 생분해성 고분자가 용해되어 있는 클로로포름에 분산시켰다. 분산액을 교반하면서 40 ℃로 가열하여 용매를 증발시키고, 0.5 ml의 인산완충용액(PBS)용액에 재분산시켰다. 상기 용액을 30 ℃에서 6 시간 동안 가열/교반하여 현탁액을 완성하였다. 원심분리를 통해 자성입자를 포함하지 않고 있는 마이셀을 제거하고 0.5 ml의 PBS용액에 재분산시켰다. 상기 친수활성성분 결합영역이 카르복실기로 치환된 서스펜션형 수용상 자성나노복합체의 모식도를 도 3e에 도시하였다. 제조된 입자는 동적 레이저 광 산란법과 투과 전자 현미경을 사용하여 확인하였고, 이를 도 22a 및 b에 도시하였다. 봉입된 자성나노입자의 무게비율은 열중량분석 방법에 의해 분석하였고 그 결과를 도 23에 나타내었다.
<실시예 6> 친수활성성분 결합영역이 카르복실기로 치환된 상용 계면활성제를 이용한 에멀젼형 자성 나노복합체의 제조
상기 제조예 6에서 제조한 1 g의 양친매성 고분자 중합체를 40 ml의 수용상인 초순수에 용해시키고, 상기 제조예 1에서 제조한 30 mg의 자성나노입자를 오일상인 5 ml의 핵산(hexane)에 용해시켰다. 상기 수용상과 오일상을 혼합시킨 후 이 혼합물을 190 W의 초음파를 가하면서 10 분동한 교반시켰다. 그 후 초음파 제거 상태로 30 분간 교반하고, 추가로 10 분간 600 W 초음파를 가하여 포화시켰다. 이 에멀젼은 24 시간동안의 교반을 통해 오일상을 증발시켜 고민감도 자기공명영상용 나노복합체를 제조하였다. 상기 친수활성성분 결합영역이 카르복실기로 치환된 상용 계면활성제를 이용한 에멀젼형 자성 나노복합체의 모식도를 도 3f에 도시하였다. 제조된 입자는 동적 레이저 광 산란법과 투과 전자 현미경을 사용하여 확인하였고, 이를 도 24에 도시하였다. 제조된 자성 나노복합체는 적외선 분광법을 통해 양친매성 중합체 플루오닉 F-127과 자성나노입자의 존재 여부를 확인하였고 이를 도 25에 도시하였다.
< 시험예 1> 생분해성 양친매성 고분자를 이용한 에멀젼형 자성 나노복합체의 안정성 실험
상기 <제조예 1>에서 제조된 유기 자성 나노입자를 헥산(Hexane)에 용해한 후 물을 부가하는 한편, <실시예 1>에서 제조된 생분해성 양친매성 고분자를 이용한 에멀젼형 자성 나노복합체를 물에 용해한 후 헥산을 부가하여 용해도 변화를 분석하고 이를 도 26에 도시하였다. 도 26에 나타낸 바와 같이 표면에 지방산 표면안정제를 가지는 유기성 나노입자(도 26a)가 수용성 나노 복합체(도 26b)로 변화된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 육안으로 관찰하였을 때 침전 또는 엉김이 발생되지 않았으므로 상기 수용성 산화철 나노입자가 수용액에서 잘 분산된다는 것을 알 수 있었다.
< 시험예 2> 지방산 양친매성 화합물을 이용한 서스펜선형 자성 나노복합체의 안정성 실험
상기 <제조예 1>에서 제조된 유기 자성나노입자를 헥산(Hexane)에 용해한 후 물을 부가하는 한편, <실시예 3>에서 제조된 생분해성 양친매성 고분자를 이용한 에멀젼형 자성 나노복합체를 물에 용해한 후 헥산을 부가하여 용해도 변화를 분석하고 이를 도 27에 도시하였다. 도 27에 나타낸 바와 같이 표면에 지방산 표면안정제를 가지는 유기성 나노입자(도 27a, 왼쪽)가 수용성 나노 복합체(도 27a, 오른쪽)로 변화된 것을 확인할 수 있었다. 그리고 외부 자기장 (Nd-B-Fe 자석, 0.35 T)을 가하였을 때 민감하게 반응하는 것을 확인할 수 있었다 (도 27b). 또한, 육안으로 관찰하였을 때 침전 또는 엉김이 발생되지 않았으므로 상기 수용성 산화철 나노입자가 수용액에서 잘 분산된다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 3>에서 제조된 나노복합체의 염 (NaCl) 농도와 pH에 따른 안정성 시험을 수행하고, 이를 도 28에 도시하였다. 도 28a는 나노복합체의 0.0 ~ 1.0 M의 농도에 따른 나노복합체의 크기변화 그래프이며, 농도에 따른 나노복합체의 크기 변화가 거의 없는 것을 확인 할 수 있었다. 그리고 도 28b는 나노복합체의 pH 5 ~ pH 10의 변화에 따른 나노복합체의 크기변화 그래프이며, pH에 따른 나노복합체의 크기 변화도 거의 없는 것을 확인 할 수 있었다.
< 시험예 3> 친수활성성분 결합영역이 카르복실기로 치환된 상용 계면활성제를 이용한 에멀젼형 자성 나노복합체의 안정성 실험
실시예 6에서 제조한 나노복합체의 pH에 따른 분산안정성 실험을 수행한 결과를 도 29에 도시하였다. 도 29에 도시된 바와 같이 상기 나노복합체는 pH 4 ~ 13의 범위에서 입자의 엉김은 확인할 수 없었으며, 입자의 크기 변화도 거의 없는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 염(NaCl)의 농도에 따른 안정성 시험을 수행하였으며, 이를 도 30에 도시하였다. 도 30에 도시한 바와 같이 0.005M의 농도에서부터 1.0M의 농도에 따른 입자의 엉김은 확인 할 수 없었으며 입자 크기 변화도 거의 없는 것을 확인 할 수 있었다.
< 시험예 4> 생분해성 양친매성 고분자를 이용한 에멀젼형 자성 나노복합체의 조영제로서의 가능성 확인
수용성 자성 나노복합체의 자기 공명 영상 조영 효과를 확인하기 위하여, 상기 <실시예 1>에서 제조된 수용성 자성나노복합체를 0.1, 0.05, 0.025 그리고 0.125 μg/μl의 농도로 적정하여 PCR 튜브에 주입하였다. 자기공명영상의 조영효과를 보기 위해 1.5 T(Intera; Philips Medical Systems, Best, The Netherlands) 시스템을 사용하였으며, micro-47 코일을 이용하였다. Fast Field Echo(FFE) 펄스열을 가지고 관상면의 영상을 얻었다. 구체적인 파라미터는 다음과 같았다: 해상도 156× 156㎛, 절편두께 0.6mm, TE = 20ms, TR =400ms, 영상여기횟수 1, 영상획득시간 6 분.
도 31에서 도시한 바와 같이 상기 수용성 자성 나노복합체의 농도가 높을수록 자기공명영상 신호가 증폭되는 것을 확인할 수 있었다.
< 시험예 5> 지방산 양친매성 화합물을 이용한 에멀젼형 자성 나노복합체의 조영제로서의 가능성 확인
수용성 자성 나노복합체의 자기 공명 영상 조영 효과를 확인하기 위하여, 상기 <실시예 3>에서 제조된 수용성 자성나노복합체를 적정하여 마이크로 튜브에 주입하였다. 자기공명영상의 조영효과를 보기 위해 1.5 T(Intera; Philips Medical Systems, Best, The Netherlands) 시스템을 사용하였으며, micro-47 코일을 이용하였다. Fast Field Echo(FFE) 펄스열을 가지고 관상면의 영상을 얻었다. 구체적인 파라미터는 다음과 같았다: 해상도 156× 156㎛, 절편두께 0.6mm, TE = 20ms, TR = 400ms, 영상여기횟수 1, 영상획득시간 6 분. 도 32에서 도시한 바와 같이 수용성 자성 나노복합체의 농도가 높을수록 자기공명영상 신호가 증폭되는 것을 확인 할 수 있었다.
< 시험예 6> 친수활성성분 결합영역이 카르복실기로 치환된 에멀젼형 자성 나노복합체의 조영제로서의 가능성 확인
친수활성성분 결합영역이 카르복실기로 치환된 에멀젼형 수용성 자성 나노복합체의 자기 공명 영상 조영 효과를 확인하기 위하여, 상기 <실시예 4>에서 제조된 수용성 자성나노복합체를 적정하여 마이크로 튜브에 주입하였다. 자기공명영상의 조영효과를 보기 위해 1.5 T(Intera; Philips Medical Systems, Best, The Netherlands) 시스템을 사용하였으며, micro-47 코일을 이용하였다. Fast Field Echo(FFE) 펄스열을 가지고 관상면의 영상을 얻었다. 구체적인 파라미터는 다음과 같았다: 해상도 156× 156㎛, 절편두께 0.6mm, TE = 20ms, TR = 400ms, 영상여기횟수 1, 영상획득시간 6 분. 도 33에서 도시한 바와 같이 수용성 자성 나노복합체의 농도가 높을수록 자기공명영상 신호가 증폭되는 것을 확인 할 수 있었다.
< 시험예 7> 지방산 양친매성 화합물을 이용한 에멀젼형 자성 나노복합체의 조영제로서의 세포 독성 실험
상기 <실시예 3>에서 제조된 수용성 자성 나노복합체의 세포독성을 확인하기 위해 NIH3T6.7세포를 대상으로 나노 복합체의 농도에 따른 세포 독성 분석을 진행하고, 이를 도 34에 도시하였다. 나노복합체의 농도는 10-4 ~ 100 mg/ml의 조건으로 실험하였으며 세포와 인큐베이션하는 시간을 0 ~ 72 시간동안 진행하여 세포 독성 여부를 확인해보았다. 도 34에 나타낸 바와 같이 상기 자성 나노복합체는 고농도에서도 세포 독성을 확인 할 수 없었다.
< 시험예 8> 동물 모델을 통한 지방산 양친매성 화합물을 이용한 에멀젼형 자성 나노복합체의 나노 조영제로서의 가능성 확인
누드마우스를 동물 모델로 하여 생체 내 실험을 진행하였다. NIH3T6.7세포를 주입하여 암세포를 발현 시키고, 10일이 지난 후 암세포의 크기가 30mm정도 되었을 때 <실시예 3>에서 제조된 나노복합체(80 μg Fe + Mn)를 주입하였다. 주입 전후의 자기공명영상을 도 35에 도시하였다. 상기 나노복합체 주입전(a), 주입직후(b), 주입 1시간 후(c), 주입 2시간 후(d), 주입 5시간 후(e)의 자기공명영상이다. 도 35에 나타낸 바와 같이 간과 암세포의 영상변화가 뚜렷하였으며 1시간, 2시간, 및 5시간이 경과한 뒤에도 조영효과가 유지되는 것을 확인 할 수 있었다. 상기 영상을 통해 시간에 따른 T2값의 변화를 그래프로 그려본 결과, 5시간이 지난 후에도 주입전과 T2값의 차이가 크게 유지되는 것을 확인 할 수 있었다 (도 35f).
본 발명에 따른 제조된 자성 나노복합체는 고민감도 자기공명영상 조영제로 사용할 수 있고, 친수성 영역에 종양마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 결합시켜 암진단 지능형 조영제로 사용할 수 있으며, 소수성 영역에 약물을 중합하거나 봉입함과 동시에 친수성 영역에 종양마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 결합하여 암진단 및 치료를 위한 약물전달체로 사용될 수 있고, 기능성 세포, 줄기세포 또는 암세포 등의 표면 항원에 대한 특이한 항체 또는 단백질을 결합하여 자성을 이용한 세포 및 단백질 분리용 제제로 사용할 수 있다.

Claims (17)

  1. A) a) 용매의 존재 하에 나노입자 전구체와 유기성 표면 안정제를 반응시키는 단계; 및 b) 상기 반응물을 열분해하는 단계를 포함하여, 자성 물질이 유기성 표면 안정제와 배위 결합되어 있는 자성 나노입자를 합성하는 단계; 및
    B) 소수성 영역과 친수성 영역을 가지는 양친매성 화합물을 상기 나노입자 표면에 부가하여 양친매성 화합물과 나노입자를 결합시키는 단계를 포함하되,
    상기 자성 물질이 Co, Mn, Fe, Ni, Gd, Mo, MM'2O4, 및 MxOy (M 및 M'는 각각 독립적으로 Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd, 또는 Cr을 나타내고, 0 < x ≤3, 0 < y ≤5)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 자성 나노복합체의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제 1 항에 있어서,
    유기성 표면 안정제는 알킬 트라이메틸암모늄 할라이드(alkyl trimethylammonium halide), 포화 또는 불포화 지방산, 트리알킬포스핀 옥사이드(trialkylphosphine oxide), 알킬아민(alkyl amine), 알킬티올(alkyl thiol), 소디움 알킬 설페이트 (sodium alkyl sulfate), 및 소디움 알킬 포스페이트 (sodium alkyl phosphate)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 자성 나노복합체의 제조방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    용매는 에테르계 화합물, 헤테로고리화합물, 방향족화합물, 술폭사이드 화합물, 아마이드 화합물, 알코올, 탄화수소 및 물로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 자성 나노복합체의 제조방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    용매는 옥틸 에테르(octyl ether), 부틸 에테르(butyl ether), 헥실 에테르(hexyl ether), 데실 에테르(decyl ether), 피리딘, 테트라하이드로퓨란(THF), 톨루엔, 자일렌, 메시틸렌, 벤젠, 디메틸술폭사이드(DMSO), 디메틸포름아마이드(DMF), 옥틸알코올, 데칸올, 펜탄, 헥산, 헵탄, 옥탄, 데칸, 도데칸, 테트라데칸, 헥사데칸, 또는 물인 것을 특징으로 하는 자성 나노복합체의 제조방법.
  10. 제 1 항에 있어서,
    단계 B)는
    a) 나노입자를 유기용매에 용해시켜 오일상을 제조하는 단계;
    b) 양친매성 화합물을 수성용매에 용해시켜 수용상을 제조하는 단계;
    c) 상기 오일상과 수용상을 혼합하여 에멀젼을 형성하는 단계; 및
    d) 상기 에멀젼으로부터 오일상을 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 자성 나노복합체의 제조방법.
  11. 제 1 항에 있어서,
    단계 B)는
    e) 상기 나노입자를 양친매성 화합물이 용해된 용액에서 분산시켜 현탁액을 제조하는 단계; 및
    f) 상기 현탁액으로부터 용매를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 자성 나노복합체의 제조방법.
  12. 제 1 항에 있어서,
    소수성 영역은 포화 또는 불포화 지방산, 또는 소수성 고분자인 것을 특징으로 하는 자성 나노복합체의 제조방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    포화 지방산은 부티르산, 카프로산, 카프릴산, 카프릭산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 에이코사노산, 및 도코사노산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 자성 나노복합체의 제조방법.
  14. 제 12 항에 있어서,
    불포화 지방산은 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 아라키돈산, 에이코사펜타노산, 도코사헥사노산, 및 에르크산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 자성나노복합체의 제조방법.
  15. 제 12 항에 있어서,
    소수성 고분자는 폴리포스파젠, 폴리락티드, 폴리락티드-코-글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 폴리안하이드라이드, 폴리말릭산 또는 그 유도체, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리하이드로옥시부틸레이트, 폴리카보네이트 및 폴리오르소에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리-L-라이신, 폴리글리콜라이드, 폴리 알킬(메타)아크릴레이트 및 폴리비닐 피롤리돈으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 자성 나노복합체의 제조방법.
  16. 제 1 항에 있어서,
    친수성 영역은 생분해성 고분자인 것을 특징으로 하는 자성 나노복합체의 제조방법.
  17. 제 16 항에 있어서,
    생분해성 고분자는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴레에테르이미드(PEI), 폴리비닐피롤리돈(PVP) 및 N-이소프로필아크릴아미드(NIPAM)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 자성 나노복합체의 제조방법.
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