KR100780324B1 - 신규 순수 숙신산 생성 변이 미생물 및 이를 이용한 숙신산제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 순수 숙신산 생성 신규 변이 미생물 및 상기 변이 미생물을 이용한 순수한 숙신산의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 숙신산 생산 미생물에서 피루브산-개미산 분해효소를 코딩하는 유전자(pfl)는 결실시키지 않고, 젖산 탈수소화효소를 코딩하는 유전자(ldhA), 포스포트랜스아세틸화 효소를 코딩하는 유전자(pta) 및 아세트산키나제를 코딩하는 유전자(ackA)를 결실시켜 수득되는 혐기적 조건에서 숙신산을 제외한 다른 유기산들은 거의 생성하지 않으면서 숙신산만을 고농도로 생산하는 특성을 가지는 변이 미생물 및 상기 변이 미생물을 이용한 숙신산의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 변이 미생물은 기존의 숙신산 생성 미생물보다 균주의 성장속도 및 숙신산 생산성이 높고, 다른 유기산을 생성하지 않으면서도 고농도로 숙신산을 생성하므로, 숙신산의 산업적 생산균주로 유용하다.
루멘 박테리아, 맨하이미아, 숙신산, ldhA, pta, ackA
Description
도 1은 본 발명에 따른 변이 미생물에서 숙신산이 합성되는 경로를 나타낸 모식도이다.
도 2는 상동성 재조합에 의한 ldhA 결실용 치환벡터(pMLKO-sacB)의 제작과정을 나타낸 것이다.
도 3은 상동성 재조합 방법으로 Mannheimia succiniciproducens MBEL55E에서 ldhA를 결실시킨 변이균주(M. succiniciproducens LK)를 제작하는 과정을 나타낸 것이다.
도 4는 상동성 재조합에 의한 pta 및 ackA 결실용 치환벡터(pPTA-sacB)의 제작과정을 나타낸 것이다.
도 5는 M. succiniciproducens LK에서 ldhA 및 pta-ackA를 결실시킨 변이균주(M. succiniciproducens PALK)를 제작하는 과정을 나타낸 것이다.
도 6은 M. succiniciproducens PALK에서 pta-ackA의 결실을 확인한 전기영동 사진으로, 레인 M은 1kb 마커를 나타낸 것이고, 레인 1 내지 레인 6은 PAU1 프라이 머 및 SP1 프라이머를 이용한 PCR 단편(1.1kb)을 나타낸 것이며, 레인 A 내지 레인 F는 프라이머 SP2 및 프라이머 PAD2를 이용한 PCR, 단편(1.5kb)을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 M. succiniciproducens PALK의 CO2로 포화된 혐기조건 하에서 배양특성을 나타낸 것이다.
본 발명은 순수 숙신산 생성 신규 변이 미생물 및 상기 변이 미생물을 이용한 순수한 숙신산의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 숙신산 생산 미생물에서 피루브산-개미산 분해효소를 코딩하는 유전자(pfl)는 결실시키지 않고, 젖산 탈수소화효소를 코딩하는 유전자(ldhA), 포스포트랜스아세틸화 효소를 코딩하는 유전자(pta) 및 아세트산키나제를 코딩하는 유전자(ackA)를 결실시켜 수득되는 혐기적 조건에서 숙신산을 제외한 다른 유기산들은 거의 생성하지 않으면서 숙신산만을 고농도로 생산하는 특성을 가지는 변이 미생물 및 상기 변이 미생물을 이용한 숙신산의 제조방법에 관한 것이다.
숙신산(HOOCCH2CH2COOH)은 4개의 탄소로 이루어진 다이카르복실산으로서 의약용, 식품용, 화장품 및 그 외 산업에서 사용되는 화학제품의 전구체로서 널리 사용되는 산업적·경제적 이용 가치가 매우 높은 유기산이다 (Zeikus et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 51:545, 1999; Song et al., Enzyme Microbial Technol., 39:352, 2006). 특히 최근 급격한 원유 가격의 상승과 더불어 생분해성 고분자의 주요 원료물질로서 숙신산의 사용가능성이 증명됨에 따라 급격한 수요증대가 예상되고 있다 (Willke et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 66:131, 2004).
숙신산은 화학합성과 발효에 의하여 생산할 수 있으나, 현재까지 산업적으로 사용되는 대부분의 숙신산은 BASF, DuPont, BP 케미칼 등 거대 화학회사와 중국 및 일본의 화학회사들에 의하여 원유에서 유래한 n-부탄(butane)과 아세틸렌(acetylene)을 원료물질로 사용하여 화학합성법으로 생산되고 있으며, 의약품 등 특수한 용도로 사용되어지는 소량의 숙신산만이 고전적인 미생물 발효법에 의하여 생산되고 있다. 이와 같은 숙신산의 화학적 합성법은 제조과정에서 다량의 유해성 폐기물, 폐용액 및 폐가스(일산화탄소 포함)를 배출한다는 문제점을 가지고 있으며, 특히 자원고갈의 가능성이 높은 화석원료를 기초물질로서 사용함으로 이를 대체할 숙신산 생산방법의 개발이 시급하다.
이와 같은 화학적 숙신산 합성공정에 따른 문제점들을 해결하기 위하여 미생물 발효를 통하여 재생 가능한 원료로부터 숙신산을 생산하는 연구가 많은 연구자들에 의해 집중적으로 수행되어 왔다. 발효를 통한 숙신산 생산에 사용하는 미생물은 매우 다양하나, 크게 재조합 대장균(recombinant Escherichia. coli)과 루멘 박테리아(ruminal bacteria: Actinobacillus, Anaerobiospirillum, Bacteroides, Mannheimia, Succinimonas, Succinivibrio 등)로 나눌 수 있다 (Song et al., Enzyme Microbial Technol., 39:352, 2006).
재조합 대장균을 이용한 숙신산 생산 연구들을 살펴보면, 먼저 미국 시카고 대학 연구팀이 대장균의 젖산(lactic acid) 및 개미산(formic acid) 생산에 관여하는 유전자들(ldh 및 pfl)을 제거함과 동시에 글루코스 전달시스템 유전자(ptsG)를 조작한 변이균주인 AFP111 (ATCC No. 202021)을 제작하여 숙신산 생산 증가를 시도하였다 (미국특허 5,770,435).
본 발명자들은 숙신산 생산에 관여하는 말릭 유전자(sfcA)를 ldh 유전자 및 pfl 유전자가 제거된 재조합 대장균인 NZN111 균주에 증폭시켜, NZN111 균주의 발효과정에서 축적되는 피루브산(pyruvic acid)을 억제함으로써 숙신산 생산을 증대시킨 바 있으며(Hong et al., Biotechnol. Bioeng., 74:89, 2001), 미국 조지아 대학 연구팀은 Rhizobium etli 균주의 피루브산 카르복실화 유전자(pyc)를 상기의 AFP111 균주에 발현시킴으로써 AFP111/pTrc99A-pyc 균주를 제작하고, 이를 숙신산 생산에 이용한 바 있다 (Vemuri et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 28:325, 2001). 최근에는 호기성 조건에서 숙신산 생산을 유도하기 위하여, 미국 라이스 대학 연구팀이 해당과정(Glycolysis), TCA사이클 및 글리옥실레이트 (Glyoxylate) 경로에 관여하는 유전자들을 조작한 재조합 대장균 균주들을 제작하여 발표하였다 (Lin et al., Metabol. Eng., 7:116, 2005; Lin et al., Biotechnol. Bioeng., 90:775, 2005).
숙신산 생산에 있어서는 루멘 박테리아의 일종인 Actinobacillus, Anaerobiospirillum 및 Mannheimia 균주가 가장 우수한 것으로 알려져 있으며, 이들 균주에 대한 연구가 상대적으로 많이 진행되어 왔다. 미국의 Michigan Biotechnology Institute(MBI) 연구진은 Actinobacillus succinogenes 130Z 균주 (ATCC No. 55618)를 발굴하여 숙신산 생산공정을 개발하였으며 (미국특허 5,504,004), 고전적인 화학적 돌연변이 방법을 이용하여 Anaerobiospirillum succiniciproducens의 다양한 변이균주들을 개발하여 이를 숙신산 생산 및 정제공정 개발에 이용하였다 (미국특허 5,521,075; 미국특허 5,168,055; 미국특허 5,143,834).
그러나 현재까지 개발된 미생물들의 발효를 통한 숙신산 생산 공정은 생산성이 2 g/L/h 이하로 매우 낮으며, 특히, 발효 시 숙신산과 더불어 부산물로서 각종 유기산과 에탄올을 동시에 다량 생산함으로써 막대한 분리 및 정제 비용이 요구되고 있다. 비록 상기 결과들이 일부 재조합 균주들에 있어서, 부산물인 젖산, 개미산, 초산(acetic acid) 및 에탄올의 생성을 어느 정도 감소시키는 효과를 보였으나, 이들을 완전히 제거하지는 못하였다. 또한 일부 재조합 변이균주에서는 균주의 성장속도가 매우 저하되어 전체적인 숙신산 생산성의 증가는 이루지 못하는 경우도 있었다. 따라서 높은 숙신산 생산성을 가지면서, 동시에 부산물의 생산을 차단할 수 있는 새로운 숙신산 생산 균주 시스템의 개발이 절실히 요구되고 있다 (Hong et al., Biotechnol. Lett., 22:871, 2000).
이와 같은 요구에 부응하는 새로운 숙신산 생산 균주를 개발하기 위해서는 우수한 숙신산 생산능력을 보유한 균주의 동정 및 균주의 유전정보(genome sequence) 확보, 균주의 대사 특성 파악 및 유전자 재조합 균주제작에 필요한 유전자 조작 기술의 확보가 선행되어야 한다. 현재까지 우수한 숙신산 생산능력을 보이 는 루멘 박테리아의 경우에는 M. succiniciproducens MBEL55E 균주만이 유전정보가 확보되어 있으나, Actinobacillus와 Anaerobiospirillum 등의 루멘 박테리아는 완전한 유전정보(full genome sequence)를 확보하지 못한 실정이다. 비록 A. succinogenes과 A. succiniciproducens의 phosphoenolpyruvate carboxykinase (pckA) 유전자를 대장균에 증폭하여 숙신산 생산을 시도한 경우가 보고되었으나(Kim et al., Appl. Environ. Microbiol., 70:1238, 2004; Laivenieks et al., Appl. Environ. Microbiol., 63:2273, 1997), 게놈 서열을 바탕으로 한 유전자 재조합 숙신산 생산균주의 개발은 시도된 적이 없다.
본 발명자들은 한우로부터 숙신산을 고효율로 생산하는 M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP) 균주를 동정하고, 상기 균주의 게놈서열 및 대사특성을 파악하여 발표한 바 있다 (Hong et al., Nature Biotechnol., 22:1275, 2004). 또한, 본 발명자들은 루멘 박테리아의 일종인 M. succiniciproducens MBEL55E에서 젖산과 개미산의 생성을 억제하기 위해 젖산 탈수소화효소 유전자(ldhA)와 피루브산-개미산 분해효소 유전자(pfl)를 결실시킨 변이균주인 M. succiniciproducens LPK (KCTC10558BP)를 제작하였으며, 더 나아가 초산의 생성을 저해하기 위해 상기 변이균주 M. succiniciproducens LPK에서 포스포트랜스아세틸화효소 유전자(pta)와 아세트산 키나제 유전자(ackA)를 결실시킨 변이균주 M. succiniciproducens LPK7 (KCTC10626BP)을 제작하여 이들을 혐기조건에서 배양하여 숙신산을 제조한 바 있다 (WO 05/052135 A1; Lee et al., Appl. Environ. Microbiol. 72:1939, 2006). 하지만 상기 변이균주들의 경우, 부산물인 개미산과 초산의 생성은 어느 정도 억제할 수 있었으나, 발효 시 부산물로서 다량의 피루브산 축적을 초래하였으며, 무엇보다도 야생균주와 비교하여 균주의 성장속도가 현저히 낮아져서 전체적으로 월등한 숙신산 생산성 향상을 얻을 수 없었다.
한편, 최근 피루브산-개미산 분해효소 유전자(pfl)가 피루브산으로부터 아세틸 보조효소 A(acetyl-CoA)로의 변환 과정에 관여함으로써 세포 성장과 피루브산의 재분배에 큰 영향을 미친다는 사실이 발표되었다(Wolfe, Microbial . Mol . Biol . Rev., 69:12, 2005).
이에, 본 발명자들은 미생물의 성장속도의 저하를 최소화하고, 동시에 피루브산을 포함한 다양한 부산물들의 생성을 완전히 차단하여 높은 수율로 순수한 숙신산을 제조할 수 있는 변이 미생물 및 발효방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 루멘 박테리아의 일종인 M. succiniciproducens MBEL55E 균주에서 피루브산-개미산 분해효소 유전자(pfl)는 결실시키지 않고, 젖산 탈수소화효소 유전자(ldhA), 포스포트랜스아세틸화효소 유전자(pta) 및 아세트산 키나제 유전자(ackA)는 결실시킨 변이균주 M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP)를 제작한 다음, 상기 균주를 혐기적 조건에서 글루코스와 글리세롤을 탄소원으로 사용하여 발효시킨 결과, 높은 수율과 높은 생산성으로 순수한 숙신산을 제조할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 성장속도 및 숙신산 생산성이 우수하면서도, 혐기적 조건 에서 배양 시 숙신산을 제외한 다른 유기산들은 거의 생성하지 않으면서 순수하게 숙신산만을 고농도로 생산하는 변이 미생물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 변이 미생물을 혐기조건하에서 글루코스 또는 글리세롤을 탄소원으로 사용하여 숙신산 이외의 다른 부산물을 생성하지 않고 순수한 숙신산을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 숙신산 생산 미생물에서 피루브산-개미산 분해효소를 코딩하는 유전자(pfl)는 결실시키지 않고, 젖산 탈수소화효소를 코딩하는 유전자(ldhA), 포스포트랜스아세틸화 효소를 코딩하는 유전자(pta) 및 아세트산키나제를 코딩하는 유전자(ackA)를 결실시켜 수득되는 혐기적 조건에서 숙신산을 제외한 다른 유기산들은 거의 생성하지 않으면서 숙신산 만을 고농도로 생산하는 특성을 가지는 변이 미생물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 숙신산 생산 미생물은 루멘 박테리아인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 루멘 박테리아는 맨하이미아 속(Mannheimia sp.), 액티노바실러스 속(Actinobacillus sp.) 및 언에어로바이오스피륨 속(Anaerobiospirillum sp.)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 변이 미생물은 부산물로서 다른 유기산은 생성하지 않으면서 순수하게 숙신산만을 생성하는 동형발효 균주인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 다른 유기산의 생성량은 숙신산의 1중량% 이하인 것을 특징으로 할 수 있 으며, 상기 다른 유기산은 젖산, 초산, 개미산 및 피루브산으로 구성된 그룹에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, Mannheimia succiniciproducens에서 피루브산-개미산 분해효소를 코딩하는 유전자(pfl)는 결실시키지 않고, 젖산 탈수소화효소를 코딩하는 유전자(ldhA), 포스포트랜스아세틸화 효소를 코딩하는 유전자(pta) 및 아세트산키나제를 코딩하는 유전자(ackA)를 결실시켜 수득되는 혐기적 조건에서 숙신산을 제외한 다른 유기산들은 거의 생성하지 않으면서 숙신산 만을 고농도로 생산하는 특성을 가지는 변이 미생물 Mannheimia succiniciproducens PALK (KCTC10973BP)을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 숙신산 생성 미생물의 게놈에서 상동성 재조합 방법으로 젖산 탈수소화효소를 코딩하는 유전자(ldhA)를 결실시켜, 젖산 탈수소화효소를 코딩하는 유전자(ldhA)가 결실된 변이 미생물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 젖산 탈수소화효소를 코딩하는 유전자(ldhA)가 결실된 변이 미생물의 게놈에서 상동성 재조합 방법으로 포스포트랜스아세틸화 효소를 코딩하는 유전자(pta) 및 아세트산키나제를 코딩하는 유전자(ackA)를 결실시켜, 젖산 탈수소화효소를 코딩하는 유전자(ldhA), 포스포트랜스아세틸화 효소를 코딩하는 유전자(pta) 및 아세트산키나제를 코딩하는 유전자(ackA)가 결실된 변이 미생물을 수득하는 단계.를 포함하는 제1항의 변이 미생물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 상동성 재조합은 결실된 ldhA를 포함하는 유전자 교환벡터를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 (b) 단 계의 상동성 재조합은 결실된 pta-ackA를 포함하는 유전자 교환벡터를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 결실된 ldhA를 포함하는 유전자 교환벡터는 pMLKO-sacB인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 결실된 pta-ackA를 포함하는 유전자 교환벡터는 pMPKO-sacB인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 변이 미생물을 혐기적 조건에서 배양하는 단계 및 상기 배양액으로부터 숙신산을 회수하는 단계를 포함하는 숙신산의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 배양은 글루코스 또는 글리세롤을 탄소원으로 사용하는 것을 특징으로 할 수 있고, 부산물로서 다른 유기산의 생성량은 숙신산의 1중량% 이하인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 변이 미생물 M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP)를 혐기적 조건에서 배양하는 단계 및 상기 배양액으로부터 숙신산을 회수하는 단계를 포함하는 숙신산의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 배양은 글루코스 또는 글리세롤을 탄소원으로 사용하는 것을 특징으로 할 수 있고, 부산물로서 다른 유기산의 생성량은 숙신산의 1중량% 이하인 것을 특징으로 할 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 있어서, 숙신산 생성 미생물은 에탄올이나 다른 유기산에 비하여 숙신산을 과량으로 생산하는 미생물로서, 발효에 의한 숙신산 합성에 산업적으로 사용될 수 있는 미생물을 의미한다.
대표적인 숙신산 생성 미생물로는 루멘 박테리아를 들 수 있으며, 루멘 박테리아의 일종인 Actinobacillus succinogenes와 Anaerobiospirillum succiniciproducens 및 현재까지 알려진 숙신산을 생산하는 다양한 루멘 박테리아들의 부분적인 유전정보 (16s rRNA), 효소분석 및 발효 결과를 살펴보면, 이들 루멘 박테리아의 숙신산 생산을 위한 탄소원의 주요 생합성 경로가 루멘박테리아의 일종인 맨하이미아 속의 숙신산 생산 생합성 경로와 거의 동일하다는 사실을 알 수 있다 (표 1; Van der Werf et al., Arch Microbiol., 167:332, 1997; Laivenieks et al., Appl. Environ. Microbiol., 63:2273, 1997; Samuelov et al., App. Environ. Microbiol., 65:2260, 1999; Kim et al., Appl. Environ. Microbiol., 70: 1238, 2004). 특히 숙신산 생성에 관여하는 모든 루멘 박테리아는 숙신산 생성 시 이산화탄소 고정화 효소들을 이용하여 C3 화학물질인 포스포에놀피루베이트(phosphoenolpyruvate)와 피로베이트(pyruvate)를 C4 화학물질인 옥살로아세테이트(oxaloacetate)와 말레이트(malate)로 전환한 후 최종적으로 숙신산이 생산된다. 또한 루멘 박테리아는 혐기조건하에서 발효 부산물로서 초산, 개미산 및 젖산을 생성한다. 그러므로 맨하이미아 속을 포함하는 모든 루멘 박테리아가 동일한 숙신산 생합성 경로를 가진다고 할 수 있다.
| 균주 | 참고 문헌 |
| Cytophaga succinicans | Anderson et al., J. Bacteriol., 81:130, 1961 |
| Fibrobacter succinogens | Wood et al., J. Cereal. Sci., 19:65, 1994 |
| Ruminococcus flavefaciens | Iannotti et al., Appl. Environ. Microbiol., 43:136, 1973 |
| Succinimonas amylolytica | Bryant, Bacteriol. Rev., 23:125, 1959 |
| Succinivibrio dextrinisolvens | Bryant, Bacteriol. Rev., 23:125, 1959 |
| Actinobacillus succinogenes | Glutter et al., Int. J. Syst. Bacteriol., 49:207, 1999 |
| Mannheimia succiniciproducens | Hong et al., Nature Biotechnol., 22:1275, 2004 |
본 발명에서는 숙신산 생산 미생물인 루멘 박테리아의 게놈을 변형시켜, 균주의 성장속도가 높으면서도, 다른 유기산을 생성하지 않고, 고농도로 숙신산을 생성하는 숙신산 생성 변이 미생물을 제작하였다. 즉, Mannheimia succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP)의 게놈 DNA에서 젖산 탈수소화효소를 코딩하는 유전자(ldhA), 포스포트랜스아세틸화 효소를 코딩하는 유전자(pta) 및 아세트산키나제를 코딩하는 유전자(ackA)를 결실시켜, 균주의 성장속도가 높고, 다른 유기산을 생성하지 않으면서도 고농도로 숙신산을 생성하는 변이균주인 Mannheimia succiniciproducens PALK (KCTC10973BP)를 제작하였다.
본 발명에서 상기 각 유전자의 결실은 상동성 재조합을 이용하여 유전자를 치환하여 불활성화시키는 방법을 사용하였으나, 해당 유전자에 의해 코딩되는 효소가 생성되지 못하도록 해당 유전자를 변형 또는 제거시킬 수 있는 유전자 조작 방법이라면 제한없이 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 숙신산 생성 변이 미생물의 배양 및 숙신산의 수득 과정은 종래 발효 공정에서 통상적으로 알려진 배양방법 및 숙신산의 분리 정제 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명에서 M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP)의 숙신산 생성능과 성장속도를 기존의 변이균주와 비교하기 위하여 사용한 변이균주인 M. succiniciproducens LPK7 (KCTC10626BP)는 Mannheimia 속 균주의 게놈에서 젖산 탈수소화효소를 코딩하는 유전자(ldhA), 피루브산-개미산 분해효소를 코딩하는 유전자(pfl), 포스포트랜스아세틸화 효소를 코딩하는 유전자(pta) 및 아세트산키나제를 코딩하는 유전자(ackA)가 결실되어 있는 변이 미생물로서, 본 발명에 따른 변이 미생물인 M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP)에서 피루브산-개미산 분해효소를 코딩하는 유전자(pfl)가 더 결실되어 있는 변이균주이다 (WO2005/052135; Lee et al., Appl. Environ. Microbiol. 72:1939, 2006).
본 발명에 따른 숙신산 생성 변이 미생물 M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP)는 숙신산 생산에 사용되는 야생형의 M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP) 및 기존에 확립된 변이 미생물인 M. succiniciproducens LPK7 (KCTC10626BP)과 비교하여, 숙신산 생산능이 뛰어나며, 젖산, 피루브산, 초산, 개미산 등의 부산물을 거의 생산하지 않아, 숙신산 생산균주로서 뛰어난 특징을 나타내며, 기존에 확립된 변이 미생물인 M. succiniciproducens LPK7 (KCTC10626BP)과 비교하여, 높은 균주의 성장속도와 숙신산 생산성 및 피루브산의 축적을 억제하여 순수한 숙신산만을 나타내어, 높은 수율로 숙신산을 생산할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
특히, 하기 실시예에서는 본 발명에 따른 유전자를 제거하기 위하여 특정 벡터와 숙주세포로 숙신산 생성 미생물인 맨하이미아 속 미생물만을 예시하였으나, 다른 종류의 숙신산 생성 미생물들을 사용하여도 순수 숙신산 생성 변이 미생물을 수득할 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 사항이라 할 것이다
실시예 1:
ldhA
결실벡터(pMLKO-sacB)의 제작
숙신산 생성 미생물의 게놈으로부터 ldhA를 상동성 재조합 방법으로 제거하기 위하여, 유전자 교환벡터를 다음과 같이 제작하였다. 먼저, M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP)의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 얻어진 ldhA 상동성 부위 1(L1)을 포함하는 PCR 절편을 SacI과 PstI으로 절단하고, 이를 pUC18벡터(New England Biolabs, Inc., USA)에 도입하여 pUC18-L1을 제작하였다.
서열번호 1: 5'-CAGTGAAGGAGCTCCGTAACGCATCCGCCG
서열번호 2: 5'-CTTTATCGAATCTGCAGGCGGTTTCCAAAA
또한, M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP)의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 3과 서열번호 4의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 얻어진 ldhA 상동성 부위 2(L2)를 포함하는 PCR 절편을 PstI과 HindIII으로 절단하고, 이를 상기에서 제작된 pUC18-L1에 도입하여 pUC18-L1-L2를 제작하였다.
서열번호 3: 5'-GTACTGTAAACTGCAGCTTTCATAGTTAGC
서열번호 4: 5'-GCCGAAAGTCAAGCTTGCCGTCGTTTAGTG
상기 pUC18-L1-L2에 선택마커로 카나마이신 내성 유전자(KmR)를 삽입하기 위하여, pUC4K벡터(Pharmacia, Germany)를 PstI로 절단하여 수득된 카나마이신 내성 유전자를, PstI으로 절단한 pUC18-L1-L2와 융합시켜 pUC18-L1-KmR-L2를 제작하였다. SacI으로 절단한 pUC18-L1-KmR-L2에 서열번호 5의 링커를 삽입하여 새로운 XbaI 절단부위를 만들었다.
서열번호 5: 5'-TCTAGAAGCT
상기 XbaI 절단부위가 삽입된 pUC18-L1-KmR-L2 벡터에 sacB 유전자를 삽입하기 위하여, pKmobsacB(Schafer et al., Gene, 145:69, 1994)를 주형으로 하고, 서열번호 6과 서열번호 7의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 수득된 sacB 유전자를 포함하는 PCR 단편을 XbaI으로 절단하고, 이를 상기 XbaI 절단부위가 삽입된 pUC18-L1-KmR-L2벡터의 새로운 XbaI 제한효소 자리에 삽입하여 ldhA 유전자 제거용 교환벡터 pMLKO-sacB를 제작하였다 (도 2).
서열번호 6: 5'-GCTCTAGACCTTCTATCGCCTTCTTGACG
서열번호 7: 5'-GCTCTAGAGGCTACAAAATCACGGGCGTC
실시예 2:
M. succiniciproducens
LK 균주의 제작
실시예 1에서 제작된 ldhA 유전자 제거용 교환벡터 pMLKO-sacB를 이용하여 Mannheimia succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP)의 게놈에서 ldhA를 결실시켜 변이균주를 제작하였다 (도 3).
즉, Mannheimia succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP)를 10g/L의 글루코스를 함유한 LB-글루코스 배지에 도말하여, 36시간 동안 37℃에서 배양한 후, 콜로니를 LB-글루코스 액체배지 10mL에 접종하여, 12시간 배양하였다. 배양이 끝난 세균배양액을 LB-글루코스 액체배지 100mL에 1% 접종하여 200 rpm, 37℃ 진탕 배양기에서 배양하였다.
약 4~5시간 후, 세균배양액의 OD600가 0.3 ~ 0.4 정도가 되면, 상기 세균배양액을 4℃, 4,500 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 세포를 수득한 다음, 4℃ 상태의 10% 글리세롤 용액 200mL로 세포를 재현탁하였다. 현탁된 세포용액 4℃, 5,500 rpm에서 20분 동안 다시 원심분리하여 세포를 수득하였다. 재현탁 시 사용되는 글리세롤 용액을 반으로 줄여가며 상기 과정을 두 번 더 반복한 후, 세포와 글리세롤 부피비가 1:1이 되도록 재현탁하여 세포 농축액을 수득하였다.
상기 수득된 세포 농축액과 실시예 1에서 제작한 유전자 교환벡터 pMLKO-sacB를 혼합하여, 1.8kV, 25μF, 200ohms의 조건으로 electroporation 방법으로, pMLKO-sacB를 배양된 Mannheimia succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP)에 도입시켰다. pMLKO-sacB가 도입된 세균에 LB-글루코스 액체배지 1mL을 가하여 200 rpm, 37℃ 진탕 배양기에서 1시간 동안 전배양한 후, 배양액을 항생제 카나마이신(최종농도 25㎍/mL)을 함유한 LB-글루코스 고체배지에 도말하여, 37℃에서 48시간 이상 배양하였다. 이중 교차(double crossover)가 일어난 콜로니를 선별하기 위하여, 형성된 콜로니를 카나마이신(25㎍/mL)과 100g/L의 수크로스를 함유한 LB-수크로스 고체배지에 도말한 다음, 24 시간 동안 배양한 후, 형성된 콜로니를 동일한 고체배지에 다시 도말하였다.
상기 배지에서 형성된 콜로니(변이주)를 항생제가 함유된 LB-글루코스 액체배지에서 배양하고, Rochelle 등의 방법(Rochelle et al., FEMS Microbiol. Lett., 100:59, 1992)을 응용하여 배양균주의 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동함으로써, 게놈 DNA의 ldhA유전자 결실여부를 확인하였다.
ldhA유전자의 결실여부는 하기와 같이 2번의 PCR을 수행하여 확인하였다. 먼저, 상기 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 8과 서열번호 9의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 8: 5'-GACGTTTCCCGTTGAATATGGC (KM1)
서열번호 9: 5'-CATTGAGGCGTATTATCAGGAAAC (LU1)
다음으로, 상기 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 10과 서열번호 11의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 10: 5'-GCAGTTTCATTTGATGCTCGATG (KM2)
서열번호 11: 5'-CCTCTTACGATGACGCATCTTTCC (LD2)
상기 두 차례의 PCR 반응에서 얻어진 PCR 단편을 전기영동하여 PCR 단편의 크기를 확인하여 ldhA의 결실여부를 확인하였다. ldhA가 결실된 게놈 DNA의 PCR 단편은 서열번호 8(KM1)과 9의 프라이머(LU1)를 이용한 PCR 결과물이 1.5kb로 얻어지고, 동시에 서열번호 10(KM2)과 11의 프라이머(LD2)를 이용한 PCR 결과물이 1.7kb로 얻어지는 것으로 확인할 수 있다. 상기 각 프라이머의 위치는 도 3에 표시하였다.
상기와 같은 방법으로 M. succiniciproducens MBEL55E의 게놈에서 ldhA를 결실시킨 변이균주 M. succiniciproducens LK를 제작하였다.
실시예 3:
pta
및
ackA
결실용 유전자 교환벡터(pPTA-sacB)의 제작
M. succiniciproducens LK 균주의 게놈에서 pta 및 ackA를 상동성 재조합 방법으로 결실시키기 위하여, 유전자 교환벡터를 다음과 같이 제작하였다. sacB 유전자를 함유한 벡터 pKmobsacB를 주형으로 하고, 서열번호 12와 서열번호 13의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 sacB 산물을 PstI과 BamHI으로 절단하고, 이를 pUC19(Stratagene Cloning Systems. USA)에 도입하여 pUC19-sacB를 제작하였다 (도 4).
서열번호 12: 5'-AGCGGATCCCCTTCTATCGCCTTCTTGACG
서열번호 13: 5'-GTCCTGCAGGGCTACAAAATCACGGGCGTC
한편, M. succiniciproducens LK의 게놈 DNA를 주형으로, 서열번호 14와 서열번호 15의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 얻어진 pta-ackA 상동성 부위 1을 포함하는 PCR 절편을 XbaI과 BamHI으로 절단하고, 서열번호 16와 서열번호 17의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 얻어진 pta-ackA 상동성 부위 2를 포함하는 PCR 절편을 XbaI과 SacI으로 절단한 다음, 이 절편들을 pUC19의 BamHI과 SacI의 site에 도입하여 pUC19-PTA12를 제작하였다.
서열번호 14: 5'-GCTCTAGATATCCGCAGTATCACTTTCTGCGC
서열번호 15: 5'-TCCGCAGTCGGATCCGGGTTAACCGCACAG
서열번호 16: 5'-GGGGAGCTCGCTAACTTAGCTTCTAAAGGCCA TGTTTCC
서열번호 17: 5'-GCTCTAGATATCCGGGTCAATATCGCCGCAAC
상기 pUC19-PTA12에 선택마커로 스펙티노마이신 내성유전자를 삽입하기 위하여, 스펙티노마이신 내성유전자(GenBank X02588; SpR)를 함유하는 플라스미드 pIC156(Steinmetz et al., Gene, 142:79, 1994)을 주형으로 하고, 서열번호 18과 서열번호 19의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 얻어진 SpR 유전자를 포함하는 PCR 단편을 EcoRV로 절단하고, 이를 상기 제작된 pUC19-PTA12에 도입하여 스펙티노마이신 내성유전자를 가진 pUC19-PTA1S2를 제작하였다. 상기 제작된 pUC19-PTA1S2를 SacI과 BamHI으로 절단한 다음, 앞서 제작한 pUC19-SacB에 도입하여, pta 및 ackA 유전자 제거용 교환벡터pPTA-sacB 벡터를 제작하였다 (도 4).
서열번호 18: 5'-GAATTCGAGCTCGCCCGGGGATCGATCCTC
서열번호 19: 5'-CCCGGGCCGACAGGCTTTGAAGCATGCAAATG TCAC
실시예 4:
M. succiniciproducens
PALK 균주의 제작
실시예 3에서 제작된 포스포트랜스아세틸화효소 유전자(pta)와 아세트산 키나제 유전자(ackA) 유전자 제거용 교환벡터 pPTA-sacB를 이용하여 M. succiniciproducens LK의 게놈에서 pta 및 ackA 유전자를 결실시켜 변이균주를 제작하였다 (도 4).
즉, 실시예 2에서 제작된 M. succiniciproducens LK를 10g/L의 글루코스를 함유한 LB-글루코스 배지에 도말하여, 36시간 동안 37℃에서 배양한 다음, 콜로니를 LB-글루코스 액체배지 10mL에 접종하여, 12시간 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 LB-글루코스 액체배지 100mL에 1% 접종하여 37℃ 진탕 배양기에서 배양하였다.
상기 배양액으로부터, 실시예 2와 동일한 방법으로, 세포 농축액을 수득한 다음, 이를 실시예 3에서 제작된 유전자 교환벡터 pPTA-sacB와 혼합한 다음, 2.5kV, 50μF, 200ohms의 조건으로 electroporation을 수행하여, pPTA-sacB를 M. succiniciproducens LK에 도입시켰다. pPTA-sacB가 도입된 세균에 LB-글루코스 액체배지 800mL를 가하여 37℃ 항온조에서 1시간 30분 동안 전배양한 후, 이중교차(double crossover)를 유도하기 위해, 배양액을 항생제 스펙티노마이신(최종농도 50㎍/ml)을 함유한 TSB-수크로스 고체 배지(100g/L의 수크로스를 함유한 Tryptic Soy Broth (Becton, Dickinson and Company) 고체 배지)에 도말하여, 37℃에서 48시간 이상 배양하였다. 콜로니가 형성되면, 이중교차가 일어난 것을 스크리닝하기 위하여, 각 콜로니들을 스펙티노마이신 50㎍/mL을 함유한 TSB-수크로스 배지와 암피실린 50㎍/mL을 함유한 TSB 배지에 도말하였다. 37℃에서 12 시간 정도 배양한 후, 이들 중 스펙티노마이신 50㎍/mL을 함유한 TSB-수크로스 배지에서는 자라지만 암피실린 50㎍/mL이 함유된 TSB 배지에서는 자라지 않는 콜로니를 선별하여 스펙티노마이신 50㎍/mL을 함유한 TSB-수크로스 배지에 도말하였다. 여기에서 형성된 콜로니들을 스펙티노마이신과 암피실린이 함유된 배지에서 다시 한번 선별하고, 원하는 결과를 보이는 콜로니들을 최종 선택하였다. 상기에서 선택된 균주의 게놈을 분리하여 주형으로 사용하여, PCR을 통하여 pta-ackA의 결실여부를 확인하였다.
pta-ackA의 결실여부는 하기 2번의 PCR을 통하여 확인하였다. 우선, 상기 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 20과 서열번호 21의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하고, 다음으로, 상기 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 22와 서열번호 23의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 20: 5'-CCTGCAGGCATGCAAGCTTGGGCTGCAGGTCG ACTC (SP1)
서열번호 21: 5'-GCTGCCAAACAACCGAAAATACCGCAATAAAC GGC (PAU1)
서열번호 22: 5'-GCATGTAACTTTACTGGATATAGCTAGAAAAGGCATCGGGGAG (SP2)
서열번호 23: 5'-GCAACGCGAGGGTCAATACCGAAGGATTTCGCCG (PAD2)
상기 두 차례의 PCR 반응에서 얻어진 반응물을 겔 전기영동하여 그 크기로 pta-ackA의 결실여부를 확인하였다 (도 6). pta-ackA의 결실은 서열번호 20과 서열번호 21의 프라이머(SP1 프라이머 및 PAU1 프라이머)를 사용한 PCR 산물이 1.1kb로 얻어지고, 동시에 서열번호 22와 서열번호 23의 프라이머(SP2 프라이머 및 PAD2 프라이머)를 사용한 PCR 산물이 1.5kb로 얻어지는 것으로 확인하였다. 상기 각 프라이머의 위치는 도 5에 표시하였다.
상기 방법으로 제작된 M. succiniciproducens LK의 게놈에서 pta-ackA가 결실된 변이균주 즉, M. succiniciproducens에서 ldhA, pta 및 ackA가 결실된 변이균주를 M. succiniciproducens PALK로 명명하고, 2006년 7월 26일자로 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC; 대한민국 대전시 유성구 어은동 52번지)에 기탁번호 'KCTC10973BP' 로 기탁하였다.
실시예 5:
M. succiniciproducens
PALK 균주를 이용한 순수 숙신산 생산
상기 실시예 4에서 제작된 M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) 균주를 5g/L 글루코스를 포함한 10mL의 합성배지에 접종하여 혐기조건으로 39℃에서 8시간 동안 배양한 후, 이를 다시 5g/L의 글루코스를 포함한 250mL의 합성배지에 옮겨 39℃에서 배양하였다. 이때, 항생제로 50㎍/ml의 스펙티노마이신을 첨가하였다. 발효는 상기의 250mL의 M. succiniciproducens PALK 배양액을 2.25 L의 합성배지(1g/L의 NaCl, 2g/L의 (NH4)2HPO4, 0.02g/L의 CaCl2??2H2O, 0.2g/L의 MgCl2??6H2O, 8.709 g/L의 K2HPO4, 0.5g/L의 cysteine, 0.5g/L의 methionine, 0.5g/L의 alanine, 0.5g/L의 asparagine, 0.5g/L의 aspartic acid, 0.5g/L의 proline, 0.5g/L의 serine, 0.005g/L의 nicotinic acid, 0.005g/L의 Ca-pantothenate, 0.005g/L의 pyridoxineㅇHCl, 0.005g/L의 thiamine, 0.005g/L의 ascorbic acid 및 0.005g/L의 biotin)를 함유한 미생물 반응기에 접종하여 수행하였으며, 발효 조건은 18.2g/L (100mM) 초기 글루코스 농도, 9.2g/L (100mM) 초기 글리세롤 농도로, 온도 39℃에서 발효시켰다. 발효 중 pH는 암모니아수를 사용하여 6.5로 조정하였으며, 항생제로 사용된 스펙티노마이신은 50㎍/mL의 농도로 첨가하였다. 고농도의 숙신산 생산을 위하여 글루코스가 완전히 소모되었을 경우에는, 필요시 농축된 글루코스 용액을 첨가하여 배양액의 글루코스 농도가 약 18.2g/L (100mM)가 되도록 조정하였다.
상기와 동일한 방법으로 M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP) 및 숙신산 생산용 변이균주인 M. succiniciproducens LPK7 (KCTC 10626BP)를 배양하여 숙신산을 발효시켰다.
배양액내의 세포농도는 분광광도계를 이용하여 측정하였으며, 미리 측정한 분광광도계의 흡광도와 건조세포의 중량 검증선을 이용하여 세포농도를 계산하였다. 발효과정 중 생물반응기로부터 주기적으로 샘플을 채취하였으며, 채취된 시료는 13,000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후, 상층액의 각종 대사산물 및 숙신산 농도, 글루코스와 글리세롤 농도를 액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다.
그 결과, 도 7 및 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP)는 M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP) 및 M. succiniciproducens LPK7 (KCTC10626BP)과 비교하였을 때, 보다 우수한 숙신산 생산성을 보일 뿐 아니라, 부산물로서 거의 모든 유기산 및 에탄올이 생성되지 않음을 알 수 있다. 비록 0.45g/L의 아세트산과 0.24g/L의 피루브산이 검출되었으나, 이는 균주의 성장을 위해 생성되는 최소한의 양이며 생산된 숙신산 대비 1중량% 이하의 극히 미미한 양으로 무시할 수 있다는 것이 당업자에게 자명한 사실이다.
| 균주 | MBEL55E (KCTC0769BP) | LPK7 (KCTC10626BP) | PALK (KCTC10973BP) |
| 최종 숙신산 농도 (g/L) | 10.49 | 13.40 | 45.79 |
| 글루코스 소모량 (g/L) | 22.50 | 19.98 | 53.00 |
| 숙신산 수율 (g 숙신산/ g 글루코스) | 0.47 | 0.67 | 0.86 |
| 야생균주(MBEL55E) 대비 숙신산 수율 증가율(%) | - | 42.55 | 82.98 |
| 최종 초산 농도 (g/L) | 4.96 | 0.53 | 0.45 |
| 최종 젖산 농도 (g/L) | 3.47 | 0.27 | 0.00 |
| 최종 피루브산 농도 (g/L) | 0.00 | 2.47 | 0.24 |
| 세포 비성장속도 (1/h) | 0.81 | 0.30 | 0.69 |
이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 성장속도가 빠르면서도, 혐기적 조건에서 배양 시 숙신산을 제외한 다른 유기산들은 거의 생성하지 않으면서 숙신산만을 고농도로 생산하는 숙신산 생성 변이 미생물 및 상기 변이 미생물을 이용한 숙신산의 제조방법을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 변이 미생물은 기 존의 숙신산 생성 미생물보다 균주의 성장속도 및 숙신산 생산성이 높고, 다른 유기산을 생성하지 않으면서도 고농도로 숙신산을 생성하므로, 숙신산의 산업적 생산균주로 유용하다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (18)
- 숙신산 생산 루멘박테리아에서 피루브산-개미산 분해효소를 코딩하는 유전자(pfl)를 함유하고, 젖산 탈수소화효소를 코딩하는 유전자(ldhA), 포스포트랜스아세틸화 효소를 코딩하는 유전자(pta) 및 아세트산키나제를 코딩하는 유전자(ackA)를 결실시켜 수득되는 혐기적 조건에서 숙신산 이외의 유기산은 숙신산의 1중량% 이하로 생성하면서, 숙신산만을 고농도로 생산하는 특성을 가지는 변이 루멘 박테리아.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 루멘 박테리아는 맨하이미아 속(Mannheimia sp.), 액티노바실러스 속(Actinobacillus sp.) 및 언에어로바이오스피륨 속(Anaerobiospirillum sp.)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 변이 루멘 박테리아.
- 제1항에 있어서, 변이 루멘 박테리아는 부산물로서 다른 유기산은 생성하지 않으면서 순수하게 숙신산만을 생성하는 동형발효 균주인 것을 특징으로 하는 변이 루멘 박테리아.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 숙신산 이외의 유기산은 젖산, 초산, 개미산 및 피루브산으로 구성된 그룹에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 변이 루멘 박테리아.
- Mannheimia succiniciproducens에서 피루브산-개미산 분해효소를 코딩하는 유전자(pfl)는 결실시키지 않고, 젖산 탈수소화효소를 코딩하는 유전자(ldhA), 포스포트랜스아세틸화 효소를 코딩하는 유전자(pta) 및 아세트산키나제를 코딩하는 유전자(ackA)를 결실시켜 수득되는 혐기적 조건에서 숙신산을 제외한 다른 유기산들은 거의 생성하지 않으면서 숙신산 만을 고농도로 생산하는 특성을 가지는 변이 루멘박테리아 Mannheimia succiniciproducens PALK (KCTC10973BP).
- 다음의 단계를 포함하는 상기 제1항의 변이 루멘 박테리아의 제조방법;(a) 숙신산 생성 루멘 박테리아의 게놈에서 상동성 재조합 방법으로 젖산 탈수소화효소를 코딩하는 유전자(ldhA)를 결실시켜, 젖산 탈수소화효소를 코딩하는 유전자(ldhA)가 결실된 변이 루멘박테리아를 수득하는 단계; 및 (b) 상기 젖산 탈수소화효소를 코딩하는 유전자(ldhA)가 결실된 변이 루멘박테리아의 게놈에서 상동성 재조합 방법으로 포스포트랜스아세틸화 효소를 코딩하는 유전자(pta) 및 아세트산키나제를 코딩하는 유전자(ackA)를 결실시켜, 젖산 탈수소화효소를 코딩하는 유전자(ldhA), 포스포트랜스아세틸화 효소를 코딩하는 유전자(pta) 및 아세트산키나제를 코딩하는 유전자(ackA)가 결실된 변이 루멘박테리아를 수득하는 단계.
- 제8항에 있어서, (a) 단계의 상동성 재조합은 결실된 ldhA를 포함하는 유전자 교환벡터를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제8항에 있어서, (b) 단계의 상동성 재조합은 결실된 pta-ackA를 포함하는 유전자 교환벡터를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 결실된 ldhA를 포함하는 유전자 교환벡터는 pMLKO- sacB인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 결실된 pta-ackA를 포함하는 유전자 교환벡터는 pMPKO-sacB인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항, 제3항, 제4항 및 제6항 중 어느 한 항의 변이 루멘박테리아를 혐기적 조건에서 배양하는 단계 및 상기 배양액으로부터 숙신산을 회수하는 단계를 포함하는 숙신산의 제조방법.
- 제13항에 있어서, 배양은 글루코스 또는 글리세롤을 탄소원으로 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
- M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP)를 혐기적 조건에서 배양하는 단계 및 상기 배양액으로부터 숙신산을 회수하는 단계를 포함하는 숙신산의 제조방법.
- 제16항에 있어서, 배양은 글루코스 또는 글리세롤을 탄소원으로 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제16항에 있어서, 부산물로서 다른 유기산의 생성량은 숙신산의 1중량% 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
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