KR100774999B1

KR100774999B1 - 이소옥사졸린 유도체 및 그의 제조 방법

Info

Publication number: KR100774999B1
Application number: KR1020060013107A
Authority: KR
Inventors: 신현익; 최형욱; 허태호; 이규웅; 이재훈; 박기숙
Original assignee: 주식회사 엘지생명과학
Priority date: 2005-02-26
Filing date: 2006-02-10
Publication date: 2007-11-09
Also published as: TWI377205B; NZ560805A; IL185226A0; MA29311B1; MX2007010338A; MY149181A; NO341347B1; AR055314A1; CN101128459B; PL1851214T3; AU2006217293B2; DK1851214T3; JP4961357B2; US20080262032A1; HK1111146A1; ES2394480T3; BRPI0607330A2; AP2374A; CA2598347A1; EP1851214A4

Abstract

본 발명은 캐스파제(Caspase) 저해제로서 사용되는 하기 화학식 1의 고리화 카복시산 헤미키탈 부분을 가진 이소옥사졸린 유도체, 그의 제조방법, 및 그를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

캐스파제, 이소옥사졸린, 헤미키탈

Description

이소옥사졸린 유도체 및 그의 제조 방법{Isoxazoline derivatives and novel process for its preparation}

도 1은 본 발명에 따른 화학식 1(R¹ = 이소퀴놀리닐기, R² = 이소프로필기)의 화합물의 결정형 구조의 X-선 회절 분석 스펙트럼이다.

도 2는 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물(R¹ = 이소퀴놀리닐기, R² = 이소프로필기)의 결정형(crystalline form)과 비결정형(amorphous form)의 안정성 시험결과를 도시한 그래프이다.

본 발명은 캐스파제(Caspase) 저해제로서 사용되는 고리화 카복시산 헤미키탈 부분을 가진 이소옥사졸린 유도체, 그의 제조방법, 및 그를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

캐스파제의 저해제는 캐스파제의 활동을 방해함(inhibition)으로써 캐스파제의 작용으로 인하여 유발되는 염증이나 세포자살현상(apoptosis)을 조절할 수 있는 화합물이다. 캐스파제 저해제 중에서 비가역적 저해제는 효소를 비가역적으로 비 활성화하여 세포 자살 현상을 억제하는 기전을 갖고 있어 더 효과적인 억제효과를 보여준다고 알려져 있다(Wu J. et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 1999, 17, 320). 현재 알려진 비가역적 저해제로는 아래의 화합물들이 있고, 공통적으로 3-아미노-5-플루오로-4-옥소펜탄산 부분을 가지고 있다.

이들을 투여하여 증상을 없애거나, 완화시킬 수 있는 질병으로는 예를 들어, 류마티스성 관절염(reumatoid arthritis), 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease), 이식편대숙주질환(Graft vs. host disease), 패혈증(sepsis), 골관절염(Osteoarthritis), 골다공증(Osteoporosis), 급성 및 만성 골수백혈병(acute and chronic myelogenous leukemia), 뇌막염(meningitis), 난관염(salpingitis), 패혈성 쇼크(septic shock), 담도염(cholangitis), 대장염(colitis), 뇌염(encephalitis), 심내막염(endocarditis), 사구체신염(glomerulonephritis), 간염(hepatitis), 심근염(myocarditis), 췌장염(pancreatitis), 타입 I 당뇨병(Type I diabetes mellitus), 다발성 경화증(Multiple sclerosis), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨씨병(Parkinson's disease), 간경화 (hepatocirrhosis) 등이 있다.

[참고문헌: 치매(Dementia): Arch Neurol 2003 Mar; 60(3): 369-76, Caspase gene expression in the brain as a function of the clinical progression of Alzheimer disease. Pompl PN, Yemul S, Xiang Z, Ho L, Haroutunian V, Purohit D, Mohs R, Pasinetti GM.;

뇌졸중(Cerebral stroke): Proc Natl Acad Sci USA 2002 Nov 12; 99(23): 15188-93, Caspase activation and neuroprotection in caspase-3-deficient mice after in vivo cerebral ischemia and in vitro oxygen glucose deprivation. Le DA, Wu Y, Huang Z, Matsushita K, Plesnila N, Augustinack JC, Hyman BT, Yuan J, Kuida K, Flavell RA, Moskowitz MA.;

AIDS 로 인한 뇌손상(Brain impairment due to AIDS): J Neurosci 2002 May 15; 22(10): 4015-24, Caspase cascades in human immunodeficiency virus-associated neurodegeneration. Garden GA, Budd SL, Tsai E, Hanson L, Kaul M, D'Emilia DM, Friedlander RM, Yuan J, Masliah E, Lipton SA.;

당뇨(Diabetes): Diabetes 2002 Jun; 51(6): 1938-48, Hyperglycemia-induced apoptosis in mouse myocardium: mitochondrial cytochrome C-mediated caspase-3 activation pathway. Cai L, Li W, Wang G, Guo L, Jiang Y, Kang YJ.;

위궤양(Gastric ulcer): J Physiol Pharmacol 1998 Dec; 49(4): 489-500, Role of basic fibroblast growth factor in the suppression of apoptotic caspase-3 during chronic gastric ulcer healing. Slomiany BL, Piotrowski J, Slomiany A.;

간염에 의한 뇌손상(Cerebral injury by hepatitis): J Viral Hepat 2003 Mar; 10(2): 81-6, Cerebral dysfunction in chronic hepatitis C infection. Forton DM, Taylor-Robinson SD, Thomas HC.;

인간 돌발성 간부전증(Fulminant hepatic failure): Gastroenterology 2000 Aug; 119(2): 446-60, Tumor necrosis factor alpha in the pathogenesis of human and murine fulminant hepatic failure. Streetz K, Leifeld L, Grundmann D, Ramakers J, Eckert K, Spengler U, Brenner D, Manns M, Trautwein C.;

패혈증(Sepsis): Nat Immunol 2000 Dec; 1(6): 496-501, Caspase inhibitors improve survival in sepsis: a critical role of the lymphocyte. Hotchkiss RS, Chang KC, Swanson PE, Tinsley KW, Hui JJ, Klender P, Xanthoudakis S, Roy S, Black C, Grimm E, Aspiotis R, Han Y, Nicholson DW, Karl IE.;

장기이식거부반응(Organ transplantation rejection): Xenotransplantation 2001 May; 8(2): 115-24, In vitro prevention of cell-mediated xeno-graft rejection via the Fas/FasL-pathway in CrmA-transducted porcine kidney cells. Fujino M, Li XK, Suda T, Hashimoto M, Okabe K, Yaginuma H, Mikoshiba K, Guo L, Okuyama T, Enosawa S, Amemiya H, Amano T, Suzuki S.;

류마티스성 관절염(Rheumatic arthritis): Prog Med Chem 2002; 39: 1-72, Caspase inhibitors as anti-inflammatory and antiapoptotic agents. Graczyk PP.;

허혈성 심장질환(Ischemic cardiac diseases): Am J Physiol Heart Circ Physiol 2002 Sep; 283(3): H990-5, Hypoxia-induced cleavage of caspase-3 and DFF45/ICAD in human failed cardiomyocytes. Todor A, Sharov VG, Tanhehco EJ, Silverman N, Bernabei A, Sabbah HN.;

항염증(Anti-inflammation): J Immunol 2003 Mar 15; 170(6): 3386-91, A broad-spectrum caspase inhibitor attenuates allergic airway inflammation in murine asthma model. Iwata A, Nishio K, Winn RK, Chi EY, Henderson WR Jr, Harlan JM.;

간경화: i) J Pharmacol Exp Ther. 2004 Mar; 308(3): 1191-6, The caspase inhibitor Idn-6556 attenuates hepatic injury and fibrosis in the bile duct ligated mouse. Canbay A., Fledstein A., Baskin-Bey E., Bronk FS. Gores GJ.; ii) Hepatology. 2004 Feb; 39(2): 273-8, Apoptosis: the nexus of liver injury and fibrosis. Canbay A, Friedman S, Gores GJ.; iii) Hepatology. 2003 Nov; 38(5): 1188-98, Kupffer cell engulfment of apoptotic bodies stimulates death ligand and cytokine expression. Canbay A, Feldstein AE, Higuchi H, Werneburg N, Grambihler A, Bronk SF, Gores GJ.]

한편, 캐스파제 저해제의 3-아미노-5-플루오로-4-옥소펜탄산 부분은 하기 반응식 1과 같은 합성법이 알려져 있다(Revesz et al., Tetrahedron Lett . 1994 , 35, 9693).

본 발명자들은 캐스파제에 대한 효과적인 저해제로 사용될 수 있는 화합물 및 그의 제조 방법에 대하여 지속적인 연구를 수행해왔다

그 결과, 본 발명에 따른 고리화 카복시산 헤미케탈 부분을 가진 이소옥사졸린 유도체가 우수한 캐스파제 저해 활성을 가지고, 이를 결정화-유도 동적 변환 반응(Crystallization-induced dynamic transformation)을 사용하여 고순도로 제조할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 고리화 카복시산 헤미키탈 부분을 가진 이소옥사졸린 유도체의 구조를 갖는 하기 화학식 1의 화합물 및 이를 효과적으로 제조하는 새로운 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 하기 화학식 1의 화합물을 제조하는 중간체인 하기 화학식 4의 아민 유도체 및 이를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 하기 화학식 1의 화합물를 함유하는 소염 또는 세포고사 방지용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 안정성이 우수한 하기 화학식 1의 화합물의 결정형을 제공하는 것이다.

본 발명을 설명하기에 앞서 다음의 몇 가지 중요한 용어부터 정의하기로 한다.

본 발명에서 사용되는 화학식과 반응식에서의 알킬기는 탄소수 1 내지 8개로 구성된 직쇄상 또는 분지상 단순알킬체인 화합물, 또는 탄소수 3 내지 10개로 구성된 단순 사이클로알킬체인으로 고리형 화합물을 의미한다.

또한, 본 발명에서 사용되는 화학식과 반응식에서의 아릴기는 아로메틱 그룹과 헤테로아로메틱 그룹, 그리고 그들의 부분적으로 환원된 유도체를 모두 포함한다. 상기 아로메틱 그룹은 단순 또는 융합고리형이며 고리는 5~15 각형으로 이루어져 있는 불포화 탄화수소를 의미하며, 상기 헤테로아로마틱 그룹은 산소, 황 및 질소로 구성된 그룹에서 선택된 1~5개의 헤테로 원자를 가진 아로메틱 그룹을 의미한다.

또한, 상기 알킬기와 상기 아릴기의 한 개 또는 그 이상의 수소가 다른 치환기로 치환될 수 있다. 예를 들면, 선택 가능한 치환기는 아실 (acyl), 아미노 (amino), 카보알콕시 (carboalkoxy), 카복시 (carboxy), 카복시아미노 (carboxyamino), 시아노 (cyano), 할로 (halo), 하이드록시 (hydroxy), 니트로 (nitro), 티올 (thiol), 알킬 (alkyl), 사이클로알킬 (cycloalkyl), 알콕시 (alkoxy), 아릴옥시 (aryloxy), 술폭시 (sulfoxy), 구아니도 (guanido)기 등을 들 수 있다.

본 발명은 캐스파제 저해제로 사용되는 하기 화학식 1의 고리화 카복시산 헤미키탈 부분을 가진 이소옥사졸린 유도체에 관한 것이다.

상기 식에서

R¹은 알킬기 또는 아릴기를 나타내고,

R²는 알킬기를 나타낸다.

보다 바람직하게는,

R¹은 이소퀴놀리닐기, 퀴놀리닐기 또는 나프틸기를 나타내고,

R²는 메틸기, 에틸기, 프로필기 또는 부틸기를 나타낸다.

특히 바람직하게는, R¹은 이소퀴놀리닐기를 나타내고, R²는 이소프로필기를 나타낸다.

R¹이 이소퀴놀리닐기를 나타내고, R²는 이소프로필기를 나타내는 화학식 1의 화합물은 하기와 같은 X-선 회절 패턴을 나타내는 결정형으로 존재할 수 있다:

본 발명은 또한

a) 하기 화학식 2의 화합물을 활성화시킨 다음 하기 화학식 4의 화합물과 반응시켜 하기 화학식 13의 화합물을 제조하는 단계;

(b) 하기 화학식 13의 화합물을 가수분해하여 화학식 14의 화합물을 제조하는 단계;

(c) 화학식 14 화합물을 탈보호화하는 단계; 및

(d) 결정화-유도 동적 변환반응(Crystallization-induced dynamic transformation)을 수행하는 단계를 포함하는 화학식 1의 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

[화학식 1]

상기식에서,

R¹은 알킬기 또는 아릴기를 나타내고,

R²는 알킬기를 나타내며,

R³과 R^'3은 각각 알킬기를 나타내거나,

R³과 R^'3은 이들이 부착된 산소원자와 함께 헤테로사이클을 형성하고,

R⁴는 알킬기를 나타낸다.

보다 바람직하게는,

R²는 메틸기, 에틸기, 프로필기 또는 부틸기를 나타내며,

R³과 R^'3은 각각 메틸기, 에틸기 또는 프로필기를 나타내거나,

R³과 R^'3은 이들이 부착된 산소원자와 함께 다이옥솔레인 또는 다이옥세인기를 형성하며,

R⁴는 메틸기, 에틸기, 프로필기 또는 부틸기를 나타낸다.

상기와 같은 화학식 1의 제조 방법을 단계별로 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

상기 단계 (a)에서 화학식 2의 화합물을 활성화시키는 활성화 시약은 옥살릴클로라이드, 트리메틸아세틸클로라이드, 포스포릴트리클로라이드 및 티오닐클로라이드로부터 선택된 것을 사용하는 것이 바람직하다.

또한 단계 (a)의 반응은 트리에틸아민, 트리(n-부틸)아민, 디이소프로필에틸아민, 피리딘, 4-디메틸아미노피리딘 및 4-(4-메틸-피페리딘-1-일)-피리딘으로부터 선택된 염기의 존재하에 수행하는 것이 바람직하며, 염기는 화학식 2의 화합물에 대해 1.0 내지 10.0 당량의 양으로 사용하는 것이 바람직하다.

또한 단계 (a)의 반응은 디클로로메탄, 클로로포름, 테트라하이드로퓨란, 디메톡시에탄, 디옥산 및 에틸아세테이트로 구성된 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 용매 중에서 수행하는 것이 바람직하다.

한편, 단계 (a)에서 사용되는 화학식 4의 화합물은 화학식 2의 화합물에 대해 1.0 내지 3.0 당량의 양으로 사용하는 것이 바람직하다.

단계 (b)의 가수분해는 수산화리튬 (바람직하게는, 무수 또는 단수결정), 수산화나트륨, 수산화칼륨 및 수산화칼슘으로부터 선택된 염기의 존재하에서 수행하는 것이 바람직하며, 염기는 화학식 13에 대해 0.1 내지 10.0 당량의 양으로 사용 하는 것이 바람직하다.

또한, 단계 (b)의 반응은 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, 테트라히드로퓨란, 디메톡시에탄, 디옥산 및 디클로로메탄으로 구성된 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 용매 중에서 수행하거나, 또는 상기 그룹으로부터 선택된 용매와 물의 혼합용매에서 수행하는 것이 바람직하다.

단계 (c)의 탈보호화 반응은 염산, 황산 및 트리플루오로아세트산으로부터 선택된 산의 존재하에서 수행하는 것이 바람직하며, 산은 화학식 14의 화합물에 대해 0.1 내지 20.0 당량의 양으로 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 단계 (c)의 탈보호화 반응은 디클로로메탄 또는 클로로포름으로부터 선택된 용매의 존재하에서 또는 용매의 부재하에서 수행하는 것이 바람직하다.

단계 (d)의 결정화-유도 동적 변환반응은 화학식 1의 화합물을 시드(seed)로 첨가하여 수행하거나, 시드와 촉매량의 염기의 존재하에 수행할 수 있다. 이때 염기로는 트리에틸아민, 트리(n-부틸)아민, 디이소프로필에틸아민, 디이소프로필아민, 피리딘, 4-디메틸아미노피리딘, 4-(4-메틸-피페리딘-1-일)-피리딘, 광학활성이 있는 1-페닐에틸아민 및 광학활성이 있는 1-나프틸에틸아민으로부터 선택된 아민인 것이 바람직하다.

단계 (d)에 있어서, 상기 아민의 양은 화학식 14의 화합물에 대해 0.001 내지 1.0 몰당량을 사용하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 0.03 내지 0.5 몰당량을 사용한다. 사용된 아민의 양이 너무 적으면 반응속도가 느려지고 너무 많으면 화학식 1의 화합물의 수율이 감소한다.

또한 단계 (d)의 결정화-유도 동적 변환반응은 톨루엔, 벤젠, 디클로로벤젠, 테트라하이드로퓨란, 디메톡시에탄, 디옥산, 에틸아세테이트, 디클로로메탄, 아세토나이트릴, t-부틸 메틸 에테르 및 디에틸에테르로 구성된 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 용매에서 수행하는 것이 바람직하다.

이하, 본원발명에 따른 화학식 1의 화합물의 제조방법을 반응식 2를 참조로 상세히 설명하면 다음과 같다.

높은 광학활성을 갖는 화학식 2의 이소옥사졸린 유도체를 본 출원인에 의해 2004년 8월17일자 출원되어 계류중인 PCT/KR2004/002060에 개시된 방법에 따라 합성한 후, 화학식 4의 화합물과 결합시켜 화학식 13의 화합물을 제조하고, 이어서 화학식 13의 화합물을 에스테르 가수분해시켜 화학식 14의 화합물을 제조하고, 화학식 14의 화합물로부터 알킬 키탈의 탈보호화 반응으로 화학식 15와 화학식 16의 화합물의 혼합물을 얻은 후, 화학식 1의 화합물을 효과적으로 결정화하여 얻을 수 있다.

구체적으로, 화학식 15와 화학식 16의 혼합물을 유기 용매에 녹인 후, 화학식 1의 화합물의 결정(seed)을 첨가하면, 혼합물 중 화학식 15의 화합물만을 화학식 1의 화합물로 변환시켜 고체로 분리해 낼 수 있다.

상기식에서, R¹은 알킬기 또는 아릴기를 나타내고,

R²는 알킬기를 나타내며,

R³과 R^'3은 각각 알킬기를 나타내거나, R³과 R^'3은 이들이 부착된 산소원자와 함께 헤테로사이클을 형성하고,

R⁴는 알킬기를 나타낸다.

또한 화학식 15와 화학식 16의 혼합물을 화합물의 결정(seed)과 함께 촉매량의 염기로 처리하면 화학식 15와 화학식 16의 화합물이 모두 화학식 1의 화합물로 변환되므로 보다 높은 수율로 화학식 1의 화합물을 제조할 수 있다 (반응식 3). 용액 중에 존재하는 염기에 의해 화학식 16과 화학식 15의 화합물이 평형을 이루고, 화학식 15의 화합물은 다시 화학식 17과 화학식 1의 화합물과, 그리고 화학식 16의 화합물은 화학식 18과 화학식 19의 화합물과 평형을 이룬다. 이중, 결정성이 좋은 화학식 1의 화합물이 선택적으로 침전함으로써 전체 화합물들의 평형이 화학식 1의 화합물로 이동하고, 결과적으로 화학식 15와 화학식 16의 화합물의 혼합물로부터 화학식 1의 화합물만을 선택적으로 높은 수율로 얻을 수 있다.

본 발명은 또한 하기와 같은 화학식 1의 화합물을 제조하는데 사용되는 중간체인 화학식 4의 화합물에 관한 것이다:

[화학식 4]

상기식에서,

R³과 R^'3은 각각 알킬기를 나타내거나,

R⁴는 알킬기를 나타낸다.

보다 바람직하게는,

R³ 및 R^'3는 각각 메틸기, 에틸기 또는 프로필기를 나타내거나,

R³ 및 R^'3는 이들이 부착된 산소원자와 함께 다이옥솔레인 또는 다이옥세인기를 형성하고,

R⁴는 메틸기, 에틸기, 프로필기 또는 부틸기를 나타낸다.

본 발명은 또한,

(a) 하기 화학식 9의 화합물을 보호화 및 탈보호화하여 하기 화학식 10의 화합물을 제조하는 단계;

(b) 하기 화학식 10의 화합물에 대하여 탄소-탄소 결합반응을 수행하여 화학식 11의 화합물을 제조하는 단계;

(c) 하기 화학식 11의 화합물을 벤질아민과 반응시키고 환원시켜 하기 화학식 12의 화합물을 제조하는 단계; 및

(d) 하기 화학식 12의 화합물을 수소화 반응시키는 단계를 포함하는 하기 화학식 4의 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

[화학식 4]

상기 식에서,

R³과 R^'3은 각각 알킬기를 나타내거나,

R³과 R^'3은 이들이 부착된 산소원자와 함께 헤테로사이클을 형성하며,

R⁴는 알킬기를 나타낸다.

보다 바람직하게는 R³ 및 R^'3는 각각 메틸기, 에틸기 또는 프로필기를 나타내거나, R³ 및 R^'3는 이들이 부착된 산소원자와 함께 다이옥솔레인 또는 다이옥세인기를 형성하고,

R⁴는 메틸기, 에틸기, 프로필기 또는 부틸기를 나타낸다.

상기와 같은 화학식 4의 화합물을 제조하는 방법을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

단계 (a)에 있어서, 화학식 9의 화합물은 트리메틸오르쏘포르메이트 또는 트리에틸오르쏘포르메이트를 사용하여 보호화 반응을 시키는 것이 바람직하며, 탈보호화 반응은 수산화나트륨, 수산화칼륨, 탄산나트륨 및 탄산수소나트륨으로부터 선택된 염기의 존재하에서 수행하는 것이 바람직하다. 한편, 상기 탈보호화 반응에서 염기는 화학식 9의 화합물에 대해 1.0 내지 2.0 당량의 양을 사용하는 것이 바람직하다.

또한 단계 (a)의 보호화 반응은 메탄올 또는 에탄올 용매에서 수행하는 것이 바람직하며, 탈보호화 반응은 메탄올, 에탄올, 디클로로메탄, 클로로포름 및 물로 구성된 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 용매에서 수행하는 것이 바람직하다.

단계 (b)의 반응은 n-부틸리튬, 리튬디이소프로필아민 또는 리튬헥사메틸디실라자이드으로부터 선택된 염기의 존재하에서 에틸클로로포르메이트 또는 메틸클로로포르메이트를 사용하여 반응시키는 것이 바람직하며, 염기는 화학식 10의 화합물에 대해 0.5 내지 3.0 당량 사용하는 것이 바람직하고, 에틸클로로포르메이트 또는 메틸클로로포르메이트는 화학식 10의 화합물에 대해 0.5 내지 3.0 당량 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 단계 (b)의 반응은 테트라하이드로퓨란, 에틸에테르 및 메틸-t-부틸에테르로부터 선택된 용매에서 수행하는 것이 바람직하다.

단계 (c)의 환원반응은 아세트산 및 소듐보로하이드라이드를 사용하여 수행하는 것이 바람직하며, 소듐보로하이드라이드는 화학식 11의 화합물에 대해 1.0 내지 5.0 당량 사용하는 것이 바람직하고, 아세트산은 화학식 11의 화합물에 대해 1.0 당량 내지 20.0 당량의 양으로 사용하는 것이 바람직하다.

또한 단계 (c)에서 벤질아민은 화학식 11의 화합물에 대해 1.0 내지 10.0 당량의 양으로 사용하는 것이 바람직하다.

한편, 단계 (c)의 반응은 에틸아세테이트, 테트라하이드로퓨란, 에틸에테르 및 메틸-t-부틸에테르로부터 선택된 용매의 존재하에서 또는 용매의 부재하에서 수행하는 것이 바람직하며, one-pot으로 반응이 수행될 수 있다.

단계 (d)의 반응은 금속 촉매의 존재하에서 수행하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 팔라듐계 촉매 또는 라니니켈계 촉매를 사용하는 것이다. 보다 구체적으로 탄소, 실리카 및 알루미나로 구성된 그룹으로부터 선택된 지지체에 담지된 형태로서, 1 내지 20 중량%의 팔라듐(Pd) 담지량 범위를 갖는 팔라듐계 촉매 또는 1 중량% 이상의 라니니켈 담지량 범위를 갖는 라니니켈계 촉매를 금속 성분을 기준으로 하여 화학식 12의 화합물에 대해 0.01 내지 10 중량%의 양으로 사용할 수 있다.

또한 단계 (d)의 반응은 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, 테트라히드로퓨란, 디메톡시에탄, 디옥산, 에틸아세테이트 및 디클로로메탄으로 구성된 그룹으로부터 선택된 1 종 이상의 용매 중에서 수행하는 것이 바람직하다.

한편, 단계 (d)의 수소화 반응은 0 내지 50 ℃의 온도 및 수소압력 1 내지 100 기압 하에서 수행하는 것이 바람직하다.

본 발명에서는 보다 높은 수율로 목적 화합물인 화학식 1의 화합물의 중간체인 화학식 4의 화합물을 얻을 수 있는 새로운 방법을 개발하였고, 이를 반응식 4에 도시하였다.

상기식에서,

R⁴는 알킬기를 나타낸다.

본 발명은 또한 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 상기 정의된 화학식 1의 화합물을 함유하는 소염 또는 세포고사 방지용 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 치매, 뇌졸중, AIDS로 인한 뇌손상, 당뇨, 위궤양, 간염바이러스에 의한 뇌손상, 간염바이러스에 의한 간질환, 급성 간염, 인간 돌발성 간부전증, 간경화, 패혈증, 장기이식거부반응, 류마티스성 관절염 또는 허혈성 심장질환에 의한 심장세포괴사에 대한 치료제 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 목적하는 바에 따라 다양한 약제학적 투여형태로 제형화될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물을 제조함에 있어서는, 유효량의 화학식 1의 화합물을 제조하고자 하는 제형에 따라 선택될 수 있는 다양한 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합한다.

화학식 1의 화합물은 목적하는 바에 따라 주사용 제제, 경피용 제제 또는 경구용 제제로 제형화될 수 있으며, 투여의 용이성 및 용량의 균일성 측면에서 바람직하게는 단일투여형으로 제조된다.

경구용 제제를 제조하는 경우에는 통상의 약제학적 담체를 사용할 수 있다. 예를 들어, 현탁액, 시럽제, 엘릭시르 및 용액제와 같은 경구용 액체 제제의 경우 물, 글리콜, 오일, 알콜 등을 담체로 사용할 수 있고; 산제, 환제, 캅셀제 및 정제와 같은 고체 제제의 경우에는 전분, 설탕, 카올린, 윤활제, 결합제, 붕해제 등을 사용할 수 있다. 투여의 용이성으로 인하여 정제 및 캅셀제가 가장 편리한 복용형태이며, 정제 및 환제는 장피제로 제조하는 것이 바람직하다.

비경구 제제의 경우 담체로는 통상 멸균수를 사용하며, 용해보조제와 같은 다른 성분도 포함시킬 수 있다. 주사용 제제, 예를 들면, 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액은 공지된 기술에 따라 적합한 분산제, 습윤제, 또는 현탁제를 사용하여 제조할 수 있다. 이를 위해 사용될 수 있는 용매에는 물, 링거액 및 등장성 NaCl 용액이 있으며, 멸균 고정오일도 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로서 사용한다. 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있으며, 또한 올레산과 같은 지방산도 주사용 제제에 사용할 수 있다.

경피 제제의 경우에는 담체로서 침투촉진제 및/또는 적당한 습윤제를 임의로 피부에 대한 자극성이 없는 적당한 첨가제와 함께 사용할 수 있다. 첨가제로는 피부를 통한 투여를 촉진시키고/시키거나 목적하는 조성물을 제조하는데 도움이 되는 것을 선택한다. 경피 제제는 경피용 패취, 점적제 또는 연고와 같은 다양한 방식으로 투여된다.

화학식 1의 화합물을 임상적인 목적으로 투여시에 단일용량 또는 분리용량으로 숙주에게 투여될 총 일일용량은 체중 1㎏ 당 0.1 내지 100㎎의 범위가 바람직하나, 특정 환자에 대한 특이 용량 수준은 사용될 특정 화합물, 환자의 체중, 성, 건강상태, 식이, 약제의 투여시간, 투여방법, 배설률, 약제혼합 및 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나 이들은 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

제조예 1

1- 플루오로 -4- 트리메틸실라닐 -3-부틴-2-온 (1- Fluoro -4- trimethylsilanyl -but-3-yn-2-one) (9)

트리메틸실릴아세틸렌 (trimethylsilyl acetylene; 49.1 g, 499 mmol)을 무수 테트라하이드로퓨란 (250 mL)에 녹이고 약 -55 ℃로 내부온도를 낮추고 부틸리튬 (2.5 M n-BuLi in n-hexane; 210 mL, 525 mmol)을 -30 ℃이하를 유지하면서 약 25분에 걸쳐 첨가하였다. 약 40 분간 교반한 후, 반응 혼합물에 에틸 플루오로아세테이트 (52.9 g, 499 mmol)을 내부온도 -25 ℃ 이하를 유지하면서 5 분간에 걸쳐 첨가하고, 계속해서 보론트리플루오로이써레이트 (BF₃·OEt; 74.4 g, 524 mmol)을 15 분간에 걸쳐서 내부온도를 -55 ℃에서 -65 ℃를 유지하면서 첨가하였다. 첨가 완료 후, 반응 혼합물을 약 20 ℃에서 2시간 동안 교반하고 10% 암모늄클로라이드 수용액 (250 mL)을 넣어 반응을 종결하였다. 유기층을 분리하고, 물층은 에틸아세테이트 (200 mL)로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 소금물 (250 mL)로 세척한 후, 감압하여 용매를 제거하였다. 잔류분을 10 mbar, 68 ℃에서 진공 증류하여 화학식 9의 투명한 액체인 표제화합물 (67.3 g, 85%)을 얻었다.

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): 4.90 (d, J = 47.1 Hz, 2H), 0.26 (s, 9H). ¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃): 181.0 (d, J = 21.5 Hz), 104.0, 98.1, 84.8 (d, J = 187 Hz)

제조예 2

4- 플루오로 -3,3- 디메톡시 -1-부틴 (4- Fluoro -3,3- dimethoxy -but-1- yne ) (10, R ³ , R ^'3 = 메틸 )

제조예 1에서 얻은 화학식 9의 화합물 (9; 50.0 g, 316 mmol)을 트리메틸 오르쏘포르메이트 (trimethyl orthoformate; 33.6 g, 316 mmol) 및 파라-토실산 모노하이드레이트(p-TsOH-H₂O; 6.0 g, 31.5 mmol)와 함께 메탄올 (260 mL)에 넣고 약 6 시간 동안 환류온도 (내부온도 60 ~ 64 ℃)에서 교반하였다. 반응 혼합물을 감압증류하여 약 130 mL의 용매를 제거한 후, 메틸렌클로라이드 (260 mL)로 희석하였다. 10% 탄산수소나트륨 수용액 (130 mL)을 첨가하고 층분리한 후, 물층을 메틸렌클로라이드 (130 mL)로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 감압증류하여 표제화합물 (10)의 전구체인 트리메틸실릴기가 보호된 화합물 (59.0 g, 92%)을 중간체로 얻었다. 이 화합물은 더 이상 정제하지않고 다음 단계 반응에서 사용하였다.

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): 4.38 (d, J = 47.1 Hz, 2H), 3.40 (s, 6H), 0.20 (s, 9H)

앞서 얻은 표제화합물 (10)의 전구체인 트리메틸실릴기가 보호된 화합물 (59.0 g, 289 mmol)을 메틸렌클로라이드 (280 mL)에 녹이고, 테트라-n-부틸암모늄브로마이드 (59 mg, 0.183 mmol)과 1 N 수산화나트륨 수용액 (347 mL, 347 mmol)을 첨가하여 약 2 시간 동안 반응시켰다. 유기층을 분리하고 물층을 메틸렌클로라이드 (110 mL)로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 소금물 (110 mL)로 세척하고 감압증 류하여 표제화합물 (10, R³, R^'3 = 메틸 ; 40.9 g, 정량적 수율)을 얻었다. 이 화합물은 더 이상 정제하지 않고 다음 단계 반응에서 사용하였다.

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): 4.42 (d, J = 47.1 Hz, 2H), 3.42 (s, 6H), 2.64 (s, 1H). ¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃): 96.1 (d, J = 20.3 Hz), 82.9 (d, J = 180 Hz), 77.5, 75.5, 51.0

제조예 3

에틸 5- 플루오로 -4,4- 디메톡시 -2- 펜티노에이트 (Ethyl 5- fluoro -4,4-dimethoxy-pent-2-ynoate) (11, R ³ , R ^'3 = 메틸 , R ⁴ = 에틸)

테트라하이드로퓨란 (270 mL)에 디이소프로필아민 (40.9 g, 405 mmol)을 넣고 0 ℃로 온도를 낮추고, n-부틸리튬 용액 (2.5 M n-BuLi in n-hexane, 112 g, 405 mmol)을 내부온도 14 ℃ 이하로 조절하면서 약 한 시간에 걸쳐서 첨가하였다. 반응 혼합액을 0 ℃에서 약 30 분간 교반한 후, - 78 ℃로 온도를 조절하였다. 테트라하이드로퓨란 (160 mL)에 제조예 2에서 수득한 화합물 (10, R³, R^'3 = 메틸; 41.0 g, 311 mmol)을 녹여 만든 용액을 약 2시간에 걸쳐서 내부온도 -40 ℃ 이하를 유지하면서 첨가하고, 연속적으로 에틸 클로로포르메이트 (ethyl chloroformate; 60.4 g, 557 mmol)을 약 1 시간에 걸쳐 내부온도 -40 ℃ 이하를 유지하면서 첨가한 후, 반응 혼합물을 0 ℃에서 약 2 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 10% 염화암모늄 수용액 (250 mL)를 넣어 반응을 종결하고, 유기층을 분리하였다. 물층을 에틸아세테이트 (100 mL)로 추출하고, 합쳐진 유기층을 소금물 (100 mL)로 세척하고 감압증류하여 불순물이 포함된 표제화합물 (11, R³ , R^'3 = 메틸, R⁴ = 에틸; 95.0 g, 계산된 수율 70%)을 얻었다. 이 화합물은 더 이상 정제하지 않고 다음 단계 반응에서 사용하였다.

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): 4.45 (d, J = 46.5 Hz, 2H), 4.25 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 3.43 (s, 6H), 1.31 (t, J = 7.3 Hz, 3H)

제조예 4

에틸 3-( 벤질아미노 )-5- 플루오로 -4,4- 디메톡시펜타노에이트 (Ethyl 3-(benzylamino)-5-fluoro-4,4-dimethoxypentanoate) (12, R ³ , R ^'3 = 메틸 , R ⁴ = 에틸)

제조예 3에서 얻은 불순물이 포함된 표제화합물 (11, R³ , R^'3 = 메틸, R⁴ = 에틸; 88 g, 431 mmol)을 메틸-t-부틸에테르 (MTBE; 430 mL)에 녹이고 0 ℃로 온도를 조절하였다. 반응 혼합물에 벤질아민 (benzylamine; 31.4 g, 293 mmol)을 첨가한 후, 20 ℃에서 약 1시간 동안 교반하고 메틸-t-부틸에테르 (450 mL)로 희석하였다. 다시 반응 혼합물의 온도를 0 ℃로 조절하고 소듐 보로하이드라이드 (NaBH₄; 33 g, 873 mmol)을 첨가하고 약 30 분간에 걸쳐서 아세트산 (259 g, 4320 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 0 ℃로 유지하고 3 N 수산화나트륨 수용액 (880 mL, 2640 mmol)을 약 2시간에 걸쳐서 서서히 첨가하였다. 유기층을 분리하고 분리된 유기층을 10% 염화암모늄 수용액 (880 mL)로 세척하고, 유기층에 1 N 염산 수용액 (880 mL)을 첨가하였다. 물층을 분리하여 메틸-t-부틸에테르 (400 mL)로 세척한 후, 10 N 수산화나트륨 수용액 (246 mL)로 염기화하여 메틸-t-부틸에테르 (700 mL x 2)로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 소금물 (400 mL)로 세척하고 감압증류하여 표제화합물 (12, R³, R^'3 = 메틸, R⁴ = 에틸; 60.0 g, 44%, 화학식 10의 화합물 (10)로부터는 65%)을 얻었으며, 이 화합물은 더 이상 정제하지않고 다음 단계 반응에서 사용하였다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): 7.35-7.21 (m, 5H), 4.53 (2dd, J = 46.8, 10.4 Hz, 2H), 4.13 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.80 (2d, J = 12.8 Hz, 2H), 3.53 (dd, J = 8.4, 4.0 Hz, 1H), 3.30 (s, 3H), 3.22 (s, 3H), 2.79 (dd, J = 15.6, 3.6 Hz, 1H), 2.40 (ddd, J = 15.6, 8.0, 1.6 Hz, 1H), 1.25 (t, J = 7.2 Hz, 3H)

실시예 1

에틸 3-아미노-5- 플루오로 -4,4- 디메톡시펜타노에이트 (ethyl 3-amino-5-fluoro-4,4-dimethoxypentanoate) (4, R ³ , R ^'3 = 메틸 , R ⁴ = 에틸)

제조예 4에서 수득한 화합물 (12, R³ , R^'3 = 메틸, R⁴ = 에틸; 18.3 g, 58.5 mmol)을 에탄올 (180 mL)에 녹여 수소 압력 50 psi에서 약 4 시간 동안 활성탄소 5% 팔라듐 촉매 (5% Pd/C)를 이용하여 탈벤질반응을 하였다. 셀라이트 (5.0 g)로 여과하고 에탄올 (90 mL)로 세척한 후, 감압 증류하여 표제화합물 (4, 12.8 g, 98%)를 얻었다. 이 화합물은 더 이상 정제하지않고 다음 단계 반응에서 사용하였다.

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): 4.53 (2dd, J = 46.5, 10.4 Hz, 2H), 4.14 (q, J = 7.3 Hz, 2H), 3.57 (dd, J = 11.0, 1.9 Hz, 1H), 3.29 (d, J = 11.7 Hz, 6H), 2.73 (dd, J = 16.5, 2.5 Hz, 1H), 2.36 (ddd, J = 16.5, 10.4, 2.5 Hz, 1H), 1.25 (t, J = 7.3 Hz, 3H).

제조예 5

5- 플루오로 -3-[(( R )-5-이소프로필-3-(1- 이소퀴놀리닐 )-4,5- 디히드로 - 이소옥사졸 -5-카르보닐)-아미노]-4,4-디메톡시-펜타노익 산 에틸 에스터 (5-Fluoro-3-[((R)-5-isopropyl-3- isoquinolin -1- yl -4,5- dihydro - isoxazole -5-carbonyl)-amino]-4,4-dimethoxy-pentanoic acid ethyl ester) (13, R ¹ =1- 이소퀴놀리닐 , R ² = 이소프로필, R ³ , R ^'3 = 메틸 , R ⁴ = 에틸)

(5R)-5-이소프로필-3-(1-이소퀴놀리닐)-4,5-디히드로-5-이소옥사졸카르복실 산 (2, R¹ = 1-이소퀴놀리닐, R² = 이소프로필; 15.5 g, 54.5 mmol)을 메틸렌클로라 이드 (150 mL)에 녹이고 0 ℃로 온도를 조절한 후, 옥살릴클로라이드 (oxalyl chloride; 7.1 mL, 81.7 mmol)와 디메틸포름아마이드 (DMF; 0.2 mL, 2.6 mmol)를 내부온도 12 ℃ 이하를 유지하면서 첨가하였다. 반응 혼합물을 20 ℃에서 약 2 시간 교반한 후, 감압증류하였다. 메틸렌클로라이드 (150 mL)로 희석한 후, 혼합물의 온도를 0 ℃로 조절하고, 트리에틸아민을 넣고 실시예 1에서 수득한 화합물 (4, R³, R^'3 = 메틸, R⁴ = 에틸; 12.8 g, 57.4 mmol)을 메틸렌클로라이드 (30 mL)에 녹인 용액을 20 분간에 걸쳐 서서히 첨가하였다. 반응 혼합물을 25 ℃에서 1.5 시간 동안 교반한 후, 10% 탄산수소나트륨 수용액 (120 mL)와 1 N 수산화나트륨 수용액 (60 mL)의 혼합 용액을 첨가하여 반응을 종결하였다. 유기층을 분리하고, 물층을 메틸렌클로라이드 (150 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 감압증류하여 표제화합물 (13, R¹=1-이소퀴놀리닐, R² = 이소프로필, R³ , R^'3 = 메틸, R⁴ = 에틸; 30.1 g, 정량적 수율)을 얻었다. 이 화합물은 더 이상 정제하지않고 다음 단계 반응에서 사용하였다.

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): 9.12 (q, 1H), 8.53 (m, 1H), 7.85-7.25 (m, 4H), 4.80 (m, 1H), 4.54-4.34 (m, 2H), 4.14 (q, J = 7.4 Hz, 2H), 3.99 (2d, J = 18.4 Hz, 1H), 3.81 (m, 1H), 3.78 (2d, J = 8.6 Hz, 1H), 3.33 (d, 3H), 3.20 (d, 3H), 2.75 (m, 3H), 2.53 (m, 1H), 2.39 (heptet, J = 6.7 Hz, 1H), 1.27 (t, J = 7.4 Hz, 1.5H), 1.07 (m, 6H), 0.97 (t, J = 7.4 Hz, 1.5H)

제조예 6

5- 플루오로 -3-[(( R )-5-이소프로필-3-(1- 이소퀴놀리닐 )-4,5- 디히드로 - 이소옥사졸 -5-카르보닐)-아미노]-4,4-디메톡시-펜타노익 산 (5-Fluoro-3-[((R)-5-isopropyl-3- isoquinolin -1- yl -4,5- dihydro - isoxazole -5-carbonyl)-amino]-4,4-dimethoxy-pentanoic acid) (14, R ¹ =1- 이소퀴놀리닐 , R ² = 이소프로필, R ³ , R ^'3 = 메틸 )

제조예 5에서 수득한 화합물 (13, R¹=1-이소퀴놀리닐, R² = 이소프로필, R³, R^'3 = 메틸, R⁴ = 에틸; 30.1 g, 61.6 mmol)을 첨가하고 수산화리튬 모노하이드레이트 (7.76 g, 185 mmol)와 함께 테트라하이드로퓨란 (168 mL)와 물 (42 mL)의 혼합용매에 첨가하고 약 40 ℃에서 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압증류하여 용매 중 테트라하이드로퓨란을 제거한 후, 1 N 수산화나트륨 수용액 (180 mL)를 첨가하고 톨루엔 (120 mL x 2)으로 혼합물을 세척하였다. 물층을 6 N 염산 수용액 (66 mL)로 산성화시키고 메틸렌클로라이드 (150 mL x 3)로 추출한 후, 유기층을 감압증류하여 표제화합물 (14, R¹=1-이소퀴놀리닐, R² = 이소프로필, R³, R^'3 = 메틸; 25.4 g, 89%)을 얻었다. 이 화합물은 더 이상 정제하지않고 다음 단계 반응에서 사용하였다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): 9.10-8.92 (m, 1H), 8.52 (m, 1H), 7.86-7.13 (m, 4H), 4.77 (m, 1H), 4.54-4.34 (m, 2H), 3.95 (2d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.75 (2d, J = 18.4 Hz, 1H), 3.35-3.16 (2d, 6H), 2.78 (2dd, J = 16.0, 4.4 Hz 1H), 2.54 (m, 1H), 2.39 (m, 1H), 2.35 (s, 1H), 1.06 (m, 6H).

실시예 2

(4 S ,5 S )-5- 플루오로메틸 -5- 하이드록시 -4-({[(5 R )-5-이소프로필-3-(1- 이소퀴놀리닐 )-4,5-다이하이드로-5-이소옥사졸릴]카보닐}아미노)-2-다이하이드로푸라논 ((4 S , 5 S )-5- fluoromethyl -5- hydroxy -4-({[(5 R )-5-isopropyl-3-(1- isoquinolinyl )-4,5-dihydro-5-isoxazolyl]carbonyl}amino)-dihydrofuran-2-one (1, R ¹ =1- 이소퀴놀 리닐, R ² = 이소프로필)

제조예 6에서 수득한 화합물 (14, R¹=1-이소퀴놀리닐 (isoquinolinyl), R² = 이소프로필 (isopropyl), R³ , R^'3 = 메틸 (methyl); 17.0 g, 36.9 mmol)과 아세트산 (6.6 mL, 110 mmol)을 6 N 염산 수용액 (123 mL, 738 mmol)에 녹이고 약 4 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물의 내부온도를 0 ℃로 조절하고, 에틸아세테이트 (150 mL)를 첨가하였다. 3 N 수산화나트륨 수용액 (220 mL, 660 mmol)을 서서히 첨가하여 pH를 약 3으로 조절한 후, 유기층을 층분리하고 분리된 물층을 에틸아세테이트 (150 mL x 2)로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 소금물 (100 mL)로 세척하고 감압증류한 후, 톨루엔 (50 mL)을 첨가하고 다시 감압증류하여 화학식 15와 화학식 16의 화합물 (R¹=1-이소퀴놀리닐, R² = 이소프로필)의 혼합물 (15.4 g, 정량적 수율, 화학순도: 87.0%)을 얻었다.

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d6): 8.99 (m, 1H), 8.65 (m, 1H), 8.19-7.78 (m, 4H), 5.15 (m, 1.5H), 4.77 (m, 1H), 4.42 (m, 0.5H), 3.91 (2d, J = 17.6 Hz, 1H), 3.74 (m, 1H), 2.99 (m, 0.2H), 2.82 (m, 1H), 2.63 (m, 0.8H), 2.33 (m, 1H), 0.97 (m, 6H)

화학식 15와 화학식 16의 화합물 (R¹=1-이소퀴놀리닐, R² = 이소프로필)의 혼합물 (14.6 g, 35.2 mmol, 화학순도: 87.0%)에 톨루엔 (146 mL)을 가하고 100 ℃까지 가열하여 완전히 녹인 후, 표제화합물의 시드 (seed; 1, R¹=1-이소퀴놀리닐, R² = 이소프로필; 14 mg)를 첨가한 후, 천천히 온도를 20℃로 낮추어 고체가 생성되도록 교반하였다. 디이소프로필아민 (0.25 mL, 1.8 mmol)을 첨가하고 약 20 ℃에서 약 2 주 동안 교반하고, HPLC로 화학식 15의 화합물과 화학식 16의 화합물 (R¹=1-이소퀴놀리닐, R² = 이소프로필)의 비율이 92.8:7.2가 된 것을 확인하였다. 감압증류하여 톨루엔을 제거하고 에틸아세테이트 (88 mL)를 넣고 65 ℃까지 가열하여 완전히 녹인 후, 노르말헥산 (88 mL)을 첨가하고 서서히 온도를 낮추고 2 일 동안 약 20 ℃에서 교반하였다. 생성된 고체를 여과하고 여과된 고체를 에틸아세테이트 (15 mL)와 노르말헥산 (15 ml)의 혼합용액으로 세척하였다. 질소로 건조한 후 화학식 2의 화합물로부터 54.7% (8.0 g, 화학순도 98.6%)의 수율로 흰색 고체인 표제화합물 (1, R¹=1-이소퀴놀리닐, R² = 이소프로필)을 얻었다.

결정형의 고체 NMR은 VACP MAS (variable amplitude cross polarization magic angle spinning) 방법을 이용하여 9 kH spinning rate에서 실험하여 얻었다.

¹H NMR (CDCl₃): 9.02 (bs, 1H), 8.54 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 7.85 (d, J = 7.95 Hz, 1H), 7.70 (m, 3H), 7.60 (bs, 1H), 4.86 (bs, 1H), 4.2-5.2 (bs, 2H), 4.05 (b, J = 19.0 Hz, 1H), 3.78 (b, J = 19.0 Hz, 1H), 2.7-3.1 (bm, 2H), 2.40 (m, 1H). 1.08 (dd, J = 6.7, 4.9 Hz, 6H). ¹³C NMR (CDCl₃) 173.8, 172.4, 160.2, 147.6, 141.7, 136.8, 130.7, 129.0, 127.4, 127.3, 126.8, 122.9, 92.3, 82.7 (d, J = 215 Hz), 48.9 (b), 44.6, 34.4, 33.9, 17.7, 16.3 ¹³C NMR (solid) 176.4, 171.8, 160.3, 150.2, 139.5, 137.5, 132.3 (2C), 127.7 (3C), 123.0, 104.3, 94.1, 86.4, 48.8, 42.9, 32.7 (2C), 19.6, 15.4 Mass (ESI): 416.14 (M+1).

(c=1.0, 아세토니트릴)

실험예 1

안정성 시험

도 2에 도시된 바와 같이 화합물의 안정성시험 결과 비결정형 (amotphous form)의 화합물은 가혹 조건 (60 ℃)에서 28일 후 50%가 파괴될 정도로 불안정 하 나, 결정형(crystalline form)의 화합물은 가혹 조건 (60 ℃)에서 28일 후에도 정량 값의 감소가 전혀 관찰되지 않았다. 이 결과로 결정형의 화합물이 저해제 혹은 치료제의 조성물로써 사용하기 적합한 충분한 안정성을 확보하고 있음을 알 수 있다.

실험예 2

마우스에서 LPS - 유발성 급성간염의 치료효과

단계 1: 혈액샘플의 제조

수컷 Balb/c 마우스(6주령, Charles River Laboratory, Osaka, Japan)를 22℃ 및 55%의 상대습도하에 12시간씩 밤/낮을 바꿔주면서 사육하였다. 이때, 사료와 물은 마음껏 공급하였다. 발열물질(pyrogen)이 제거된 식염수에 LPS (lipopolysaccaride)와 D-갈락토사민(galactosamine)을 각각 0.4 ㎎/㎖의 농도와 280 ㎎/㎖ 농도로 용해 시켜 1:1로 혼합한 용액을 5 ml/㎏의 양으로 주사하였다. 시험화합물이 용해되어 있는 비히클(PEG400 : ethanol : Tween80 = 15 : 7.5 : 2.5로 구성된 혼합물을 식염수로 1/5희석) 또는 비히클 단독을 LPS와 D-갈락토사민(galactosamine)을 주사한 직후에 실험동물로 투여하였다. 약물을 주사한 지 8시간 후 심장채혈을 통해 혈액 샘플을 얻었다.

단계 2: 혈장 아미노트랜스퍼라제 활성 에세이

단계 1에서 얻은 혈액샘플에 대해 혈장 ALT 활성을 제조자의 안내서에 따라 ALT 어세이 키트(assay kit: 아산제약)를 사용하여 측정하였다. 양실험에서 LPS와 D-갈락토사민(galactosamine)의 투여가 혈장내 ALT 활성을 급격히 상승시키며, 시험물질은 용량-의존적인 방식으로 상기 상승된 효소활성을 억제하는 것으로 확인되었다. 이들 결과를 바탕으로 각 시험물질에 대하여 프리즘(Prism) 소프트웨어(GraphPad사) 를 사용하여 ED 50 수치를 산출하였다..

실험예 3

마우스에서 Fas 항체 유발성 급성간염의 치료효과

수컷 Balb/c 마우스(6주령, Charles River Laboratory, Osaka, Japan)를 22℃ 및 55%의 상대습도하에 12시간씩 밤/낮을 바꿔주면서 사육하였다. 이때, 사료와 물은 마음껏 공급하였다. 발열물질(pyrogen)이 제거된 Fas항체를 각각 30 ug/㎖의 농도로 용해시켜 5 ml/㎏의 양으로 미정맥에 주사하였다. 시험화합물이 용해되어 있는 비히클(PEG400 : ethanol : Tween80 = 15 : 7.5 : 2.5로 구성된 혼합물을 식염수로 1/5희석) 또는 비히클 단독을 LPS와 D-갈락토사민(galactosamine)을 주사한 직후에 실험동물로 투여하였다. 약물을 주사한 지 8시간 후 심장채혈을 통해 혈액 샘플을 얻었다. 이때 얻은 혈액을 앞서 시험방법을 사용하여 ED50 수치를 산출하였다. 하기 표 1에 실시예 2에서 수득한 화합물 1의 투여경로에 따른 급성간염 모델에서의 약효시험 결과를 나타내었다.

모델l	투여경로	ED₅₀ (mg/kg)	95% 신뢰구간 (mg/kg)
LPS/D-Gln	정맥투여	0.015	0.002 ~ 0.111
LPS/D-Gln	경구투여	0.02	0.003 ~ 0.118
Fas 항체	정맥투여	0.003	0.001 ~ 0.006
Fas 항체	경구투여	0.018	0.013 ~ 0.026

본 발명에 따른 화학식 1의 고리화 카복시산 헤미케탈을 포함한 이소옥사졸린 유도체는 우수한 캐스파제 저해 활성을 가지며, 우수한 안정성을 가진다. 또한, 본 발명의 방법에 따르면 결정화-유도 동적 변환반응(Crystallization-induced dynamic transformation)을 사용하여 한가지 부분입체 이성질체만을 고순도로 만들 수 있다. 아울러, 본 발명의 키탈을 포함한 아민 유도체를 중간체로 사용하면 다른 정제 없이 보다 쉽게 본 발명의 고리화 카복시산 헤미케탈을 포함한 이소옥사졸린 유도체를 제조할 수 있다.

Claims

하기 화학식 1의 화합물:

[화학식 1]

상기 식에서,

R¹은 이소퀴놀리닐기, 퀴놀리닐기 또는 나프틸기를 나타내고,

R²는 C_1-8알킬기를 나타낸다.
제1항에 있어서,

R¹은 이소퀴놀리닐기, 퀴놀리닐기 또는 나프틸기를 나타내고,

R²는 메틸기, 에틸기, 프로필기 또는 부틸기를 나타내는 것을 특징으로 하는 화합물.
제2항에 있어서,

R¹은 이소퀴놀리닐기를 나타내고,

R²는 이소프로필기를 나타내는 것을 특징으로 하는 화합물.
(a) 하기 화학식 2의 화합물을 활성화시킨 다음 하기 화학식 4의 화합물과 반응시켜 하기 화학식 13의 화합물을 제조하는 단계;

(b) 하기 화학식 13의 화합물을 가수분해하여 하기 화학식 14의 화합물을 제조하는 단계;

(c) 하기 화학식 14의 화합물을 탈보호화하는 단계; 및

(d) 결정화-유도 동적 변환반응(Crystallization-induced dynamic transformation)을 수행하는 단계를 포함하는 하기 화학식 1의 화합물의 제조 방법.

[화학식 2]

[화학식 4]

[화학식 13]

[화학식 14]

[화학식 1]

상기식에서,

R¹은 이소퀴놀리닐기, 퀴놀리닐기 또는 나프틸기를 나타내고,

R²는 C_1-8알킬기를 나타내며,

R³과 R'³은 각각 C_1-8알킬기를 나타내거나, R³과 R'³은 이들이 부착된 산소원자와 함께 다이옥솔레인 또는 다이옥세인기를 형성하고,

R⁴는 C_1-8알킬기를 나타낸다.
제4항에 있어서,

R¹은 이소퀴놀리닐기, 퀴놀리닐기 또는 나프틸기를 나타내고,

R²는 메틸기, 에틸기, 프로필기 또는 부틸기를 나타내며,

R³ 및 R³'는 각각 메틸기, 에틸기 또는 프로필기를 나타내거나,

R³ 및 R³'는 이들이 부착된 산소원자와 함께 다이옥솔레인 또는 다이옥세인기를 형성하고,

R⁴는 메틸기, 에틸기, 프로필기 또는 부틸기를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
제4항 또는 제5항에 있어서, 단계 (a)에서 화학식 2의 화합물을 옥살릴클로 라이드, 트리메틸아세틸클로라이드, 포스포릴트리클로라이드 및 티오닐클로라이드로부터 선택된 활성화 시약으로 활성화하는 것을 특징으로 하는 방법.
제4항 또는 제5항에 있어서, 단계 (a)의 반응을 트리에틸아민, 트리(n-부틸)아민, 디이소프로필에틸아민, 피리딘, 4-디메틸아미노피리딘 및 4-(4-메틸-피페리딘-1-일)-피리딘으로부터 선택된 염기의 존재하에 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제4항 또는 제5항에 있어서, 단계 (b)의 가수분해를 수산화리튬, 수산화나트륨, 수산화칼륨 및 수산화칼슘으로부터 선택된 염기의 존재하에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제4항 또는 제5항에 있어서, 단계 (c)의 탈보호화를 염산, 황산 및 트리플루오로아세트산으로부터 선택된 산의 존재하에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제4항 또는 제5항에 있어서, 단계 (c)의 탈보호화를 디클로로메탄 및 클로로포름으로부터 선택된 용매의 존재 하에서 또는 용매의 부재하에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제4항 또는 제5항에 있어서, 단계 (d)의 결정화-유도 동적 변환반응을 화학 식 1의 화합물을 시드(seed)로서 첨가하여 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 단계 (d)의 결정화-유도 동적 변환반응을 시드 및 촉매량의 염기의 존재하에 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제12항에 있어서, 염기가 트리에틸아민, 트리(n-부틸)아민, 디이소프로필에틸아민, 디이소프로필아민, 피리딘, 4-디메틸아미노피리딘, 4-(4-메틸-피페리딘-1-일)-피리딘, 광학활성이 있는 1-페닐에틸아민 또는 광학활성이 있는 1-나프틸에틸아민인 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 아민을 화학식 14의 화합물에 대해 0.001 내지 1.0 당량의 양으로 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
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제1항에 따른 화학식 1의 화합물을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는, 소염, 치매, 뇌졸중, AIDS로 인한 뇌손상, 당뇨, 위궤양, 간염바이러스에 의한 뇌손상, 간염바이러스에 의한 간질환, 급성 간염, 인간 돌발성 간부전증, 간경화, 패혈증, 장기이식거부반응, 류마티스성 관절염 및 허혈성 심장질환에 의한 심장세포괴사로 이루어진 그룹 중에서 선택된 질환의 치료용 약학적 조성물.
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제3항에 있어서, 하기와 같은 X-선 회절 패턴을 나타내는 결정형인 화합물: