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KR100746658B1 - 소수성 담즙산이 접합된 엑센딘-4 유도체, 이의 제조방법및 이를 포함하는 약학 조성물 - Google Patents

소수성 담즙산이 접합된 엑센딘-4 유도체, 이의 제조방법및 이를 포함하는 약학 조성물 Download PDF

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KR100746658B1
KR100746658B1 KR1020070039445A KR20070039445A KR100746658B1 KR 100746658 B1 KR100746658 B1 KR 100746658B1 KR 1020070039445 A KR1020070039445 A KR 1020070039445A KR 20070039445 A KR20070039445 A KR 20070039445A KR 100746658 B1 KR100746658 B1 KR 100746658B1
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KR
South Korea
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exendin
acid
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lca
bile
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KR1020070039445A
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English (en)
Inventor
이강춘
채수영
신재희
Original Assignee
성균관대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

본 발명은 소수성 담즙산이 접합된 엑센딘-4 유도체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것으로, 상기 소수성 담즙산이 접합된 엑센딘-4 유도체는 엑센딘-4의 12번, 27번 또는 12번과 27번의 리신 잔기, 바람직하게는 27번 리신 잔기에 담즙산을 선택적으로 접합한 것을 특징으로 한다.

Description

소수성 담즙산이 접합된 엑센딘-4 유도체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약학 조성물{Exendin-4 derivative linked hydrophobic bile acid, method for the preparation thereof and pharmaceutical composition comprising the same}
도 1은 본 발명의 소수성 담즙산이 접합된 엑센딘-4 유도체의 제조 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 담즙산/엑센딘-4의 반응비에 따른 반응 정도의 변화를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 담즙산이 접합된 엑센딘-4 유도체의 최적 수율을 위한 최적화 반응비 도출을 위한 각 생성물들의 상대적인 비를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 최종 생성물들의 순도를 HPLC를 이용하여 확인한 HPLC 크로마토그램을 나타낸 도이다.
도 5는 MALDI-TOF 질량 분석기를 이용하여 미반응 엑센딘-4 및 3개의 이성체들(LCA-M1, LCA-M2, 및 LCA-DI)의 분자량 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 리신-C를 이용한 분해를 통하여 미반응 엑센딘-4 및 3개의 이성체들(LCA-M1, LCA-M2, 및 LCA-DI)에서의 담즙산 치환 위치를 확인한 MALDI-TOF 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 수용액 하에서 본 발명의 LCA-M1의 농도 변화에 따른 나노입자 형성 거동을 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 LCA-M1의 알부민 흡착 거동을 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 LCA-M1의 알부민 흡착을 정량화한 알부민 결합량을 나타낸 도이다.
도 10은 엑센딘-4 및 리소콜릭산이 접합된 엑센딘-4 유도체(LCA-M1, LCA-M2, 및 LCA-DI)의 췌장소도 자극을 통한 인슐린 분비 촉진 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 제 2형 당뇨동물에서 엑센딘-4 및 LCA-M1의 피하 투여에 따른 경구 내당력 거동의 변화를 나타낸 도이다.
도 12는 도 11의 경구 내당력 거동의 변화를 정량화하기 위하여 각각의 실험동물에 따른 혈중농도 곡선하 면적(포도당 AUC)을 도식화한 도이다.
도 13은 본 발명의 리소콜릭산이 접합된 엑센딘-4(LCA-M1)의 제 2형 당뇨동물 모델에서의 활성지속시간을 나타낸 도이다.
도 14는 도 13의 결과를 이용하여 곡선하 면적(포도당 AUC)을 나타낸 도이다.
도 15는 대조군, 엑센딘-4 및 LCA-M1(각각 10 nmole/kg 투여군)에서 실험동물의 시간에 따른 먹이 섭취량을 나타낸 도이다.
도 16은 엑센딘-4의 약물동력학적 거동을 나타낸 도이다.
도 17은 본 발명의 LCA-M1의 약물동력학적 거동을 나타낸 도이다.
도 18은 본 발명의 LCA-M1의 투여를 통한 실험기간 동안 실험동물의 혈당변화를 나타낸 도이다.
도 19는 본 발명의 LCA-M1의 투여를 통한 실험기간 동안 실험동물의 체중변화를 나타낸 도이다.
도 20은 본 발명의 LCA-M1의 투여를 통한 실험기간 동안 실험동물의 먹이 섭취량을 나타낸 도이다.
도 21은 본 발명의 LCA-M1의 투여 전의 실험동물의 경구 내당력 변화를 나타낸 도이다.
도 22는 본 발명의 LCA-M1의 투여 28일 후 실험동물의 경구 내당력 변화를 나타낸 도이다.
도 23은 도 22의 결과를 이용하여 곡선하 면적(포도당 AUC)을 나타낸 도이다.
본 발명은 소수성 담즙산이 접합된 엑센딘-4 유도체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
글루카곤-유사 펩티드-1(glucagon-like peptide-1, 이하 GLP-1)은 인슐린 분비 자극, 글루카곤 분비 억제, 위 공복 억제, 위 운동 또는 장 운동 억제, 글루코오스 사용 증진 및 체중 감량 유도와 같은 다양한 생물학적 효과를 유도한다. 또한, GLP-1은 제 2형 당뇨병인 인슐린 비-의존성 진성 당뇨병(Type Ⅱ diabetes, Non-insulin dependence diabetes mellitus, NIDDM)이 진행됨에 따라 유발되는 췌 장 β-세포 퇴화의 예방 및 신생 β-세포의 생성촉진에 의한 인슐린 분비능의 회복 등의 작용을 할 수 있는 것으로 알려져 있다. 특히, GLP-1의 현저한 특성은 인슐린 요법, 또는 인슐린 발현 증가에 의해 작용하는 경구 용법 및 몇몇 유형을 이용하는 경우에 나타나는 저혈당증 관련 위험을 수반하지 않고 인슐린 분비를 자극하는 능력에 있다. 뿐만 아니라, 혈당 강하제인 술폰 요소제(sulfonylurea) 등의 장기 복용에 따른 췌장 내 β-세포의 사멸 및 괴사 등의 부작용을 수반하지 않는 것으로 알려져 있다. 따라서 제 2형 당뇨병의 치료에 있어서 매우 유효한 물질로 생각된다.
그러나 GLP-1 자체의 활성이 불충분하고, 2가지의 절단된 자연 발생 펩티드인 GLP-1(7-37)OH 및 GLP-1(7-36)NH2가 생체 내에서 빠르게 제거되어 생체 내 반감기가 매우 짧다는 사실에 의해 GLP-1 펩티드가 관여하는 요법의 유용성이 제한되어 왔다. 특히, 내생적으로 생성된 디펩티딜 펩티다제 IV(dipeptidyl peptidase-Ⅳ, 이하 DPP-Ⅳ)는 N-말단 히스티딘(7번) 및 알라닌 잔기(8번)를 제거함으로써 GLP-1 펩티드를 불활성화시키며, 이것이 짧은 생체 내 반감기에 대한 주요 원인인 것으로 알려져 있다(O' Harte et al., 2000).
따라서, DPP-IV 저해제를 사용하여 GLP-1의 분해를 억제하거나(P93/01, NVP-LAF237, NVP-DPP728, 815541A, 823093, MK-0431 등) GLP-1 수용체 작용물질 또는 GLP-1 유도체를 이용하여 (엑센딘, 리라글루타이드, GLP-1/CJC-1131 등) 생물학적 활성을 유지하면서 GLP-1 펩티드의 소실 반감기를 연장시키거나 신체로부터 펩티드 제거율을 감소시키기 위한 다양한 접근법이 시도되고 있다.
혈당 농도를 저하시키는 다른 군의 폴리펩티드인 엑센딘은 John Eng에 의해 처음 제시되었으며(미국 등록특허 제 5,424,286호), 엑센딘-4는 하기와 같은 서열구조를 갖고 GLP-1(7-36)NH2와 일부 서열 유사성(53%)을 나타낸다(Goke et al., 1993).
His1-Gly-Glu-Gly-The-Phe-The-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys12-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys27-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
엑센딘은 독도마뱀 또는 구슬도마뱀의 독에서 발견되며, 엑센딘-3은 멕시코 구슬도마뱀인 헬로더마 호리덤(Heloderma horridum)의 독에 존재하고, 엑센딘-4는 아메리칸 독도마뱀인 헬로더마 서스펙텀(Heloderma suspectum)의 독에 존재한다. 엑센딘-4는 2번 및 3번 위치에서만 엑센딘-3과 상이하며, 포유동물류에서 DPP-IV에 의한 분해에 대해 저항성을 가지며 DPP-IV에 대해 2분 이하의 반감기를 갖는 GLP-1보다 더 긴 반감기를 갖고 있다(Kieffer TJ et al., 1995). 또한, in vivo 실험에서 2~4시간의 반감기를 나타내며, 1일 2~3회 복강투여로 충분한 혈중 농도에 도달할 수 있음이 밝혀진 바 있다(Fineman MS et al., 2003). 또한, 엑센딘-4는 위장관 운동성을 조절하고 음식섭취를 감소시켜주며 혈장 글루카곤을 억제한다고 알려져 있는데(미국 등록특허 제 6,858,576호, 제 6,956,026호, 제 6,872,700호), 엑센딘- 4의 혈당조절작용과 관련하여 엑센딘-4 단일요법 뿐만 아니라 설포닐우레아 및/또는 메트포민 등의 항당뇨병 치료제와의 병용요법 모두에서 28일간의 투여 후 1% 범위 내에서 HbAlc 수치를 낮추었다고 보고되고 있다(Egan JM et al., 2003). 최근에는 Byetta™라는 상표로 합성 엑센딘-4가 미국 식품의약품안전청(US Food and Drug Administration)으로부터 시판 허가되었다.
한편, 단백질 및 펩티드 약물 방출의 서방화 및 약물의 물리화학적 특성을 변화시켜 지속형 약물을 제조하려는 다양한 시도가 현재 지속적으로 이루어지고 있다. 약물에 화학적 접합을 가하지 않고 서방성을 도입하기 위하여 가장 활발히 이루어지고 있는 기술은 약물을 미립구, 하이드로젤 및 다양한 장치에 도입한 후 이러한 매질로부터 약물이 일정한 속도로 방출하게 하는 것들을 들 수 있다.
약물의 화학적 개질은 약물 고유의 특성, 특히 물리화학적 특성을 변화시키기 때문에 이러한 과정을 통하여 서방형 또는 지속형 약물을 제조하는 시도 또한 다양하게 이루어지고 있다. 이의 가장 대표적 예로는, 폴리에틸렌 글리콜을 단백질 또는 펩티드에 화학적으로 접합시키는 것을 들 수 있다(Harris JM. et al. Nature Reviews Drug Discovery 2003).
또 다른 접근방법으로서는 단백질 및 펩티드 약물에 화학적으로 지방산을 접합시키는 방법을 들 수 있다. 이러한 지방산 접합은 약물에 가역적 알부민 결합능을 부여하여 지속적인 약물 효능을 부여하는 것으로 알려져 있다. 이는 알부민의 고유한 특성을 이용하는 것으로서, 알부민은 혈액 중 가장 많은 부분을 차지하는 단백질로서 다양한 혈중물질과 가역적 결합을 하는 것으로 알려져 있으며, 대표적 인 물질이 지방산이다. 알부민 한 분자는 8개 이상의 지방산 결합 부위가 있는 것으로 알려져 있으며 이러한 결합 부위는 혈중 지방산의 양을 상회하기 때문에 항상 일정 부분은 지방산 결합이 없는 상태로 혈중에 존재한다. 또한 알부민의 경우 분자량이 크기 때문에 신장에서의 손실이 없이 장기간 혈중에서 순환하게 된다.
따라서, 상기의 특성을 이용하여 단백질 및 펩티드 약물의 지속형 특성을 부여한 다양한 시도가 보고되고 있다. Kurtzhals 등은 인슐린에 지방산을 접합시켜 지속형 인슐린을 개발한 바 있다(Kurtzhals P. et al. Biochem. J., 1995). 또한 유사한 시도로서 GLP-1 유사체의 곁가지에 지방산을 도입한 새로운 GLP-1 유도체의 개발을 통한 지속형 제제 또한 개발중인 것으로 알려져 있다(Rolin B. et al., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., 2002; 대한민국 등록특허 제 10-0539193호).
그러나, 지방산 뿐만 아니라 담즙산의 경우에도 알부민 결합능이 있는 것으로 알려져 있으며, 이러한 특성을 이용하여 지속형 특성을 부여한 단백질 약물에 대한 결과가 보고된 바 있다. Jonassen 등은 인슐린에 담즙산 유도체를 화학적으로 결합시켜 응집체 형성 및 알부민 결합에 의한 지속형 인슐린 유도체를 개발하였다 (Jonassen I. et al., Pharm. Res., 2006).
상기의 다양한 접근법들은 천연 엑센딘에 비해 반감기가 연장되거나 효능이 증대된 엑센딘 화합물을 수득하는데 사용될 수 있다. 반면에 둘 이상의 지방산 및 담즙산이 엑센딘에 공유결합되면 치료제로 사용하기 부적합할 정도로 심각하고 불리한 특성, 예컨대 분자에 대한 불안정성 및 생물학적 활성의 감소가 발생할 위험이 존재한다.
이에, 본 발명자들은 천연 엑센딘-4와 유사한 생물학적 활성도를 나타내면서 약물의 체내 반감기를 증가시켜 우수한 생물학적 안정성을 나타낼 수 있는 엑센딘-4 유도체에 대하여 연구하던 중, 엑센딘-4의 특정 위치에 소수성 담즙산을 선택적으로 접합시킴으로써, 여러 형태가 혼합된 담즙산이 접합된 엑센딘-4 유도체에 비해 순도가 높고, 나노입자를 형성하며, 매우 강한 알부민 흡착 거동을 나타내고, 생물학적 안정성, 생물학적 활성 및 당뇨동물에서의 혈당강화 효과가 우수하며, 약물의 체내 잔존 시간을 증가시켜 치료효과에 필요한 투여량이나 투여횟수를 줄일 수 있도록 향상된 약동학 프로파일을 갖는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 소수성 담즙산이 접합된 엑센딘-4 유도체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약학 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 소수성 담즙산이 접합된 엑센딘-4 유도체를 제공한다.
상기 소수성 담즙산이 접합된 엑센딘-4 유도체는, 엑센딘-4의 12번, 27번 또는 12번과 27번의 리신 잔기, 바람직하게는 27번 리신 잔기에 담즙산을 선택적으로 접합한 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 사용된 엑센딘-4는, 천연 또는 재조합 엑센딘-4 중 어느 것을 사용하여도 무방하다. 상기 엑센딘-4의 경우, 소수성 담즙산이 결합될 수 있는 자리가 3개 존재한다(N-말단의 히스티딘, 12번 및 27번의 리신 잔기). 그러나, 3개의 자리가 상기 담즙산으로 접합되면 약학적 용도로 사용하는데 부적합할 정도로 타겟 분자에 대한 불안정성 및 생물학적 활성이 감소되는 문제가 있다. 본 발명에서는 담즙산이 엑센딘-4의 12번, 27번 또는 12번과 27번의 리신 잔기에 선택적으로 접합함으로써 생물학적 안정성 및 생물학적 활성을 증가시킨다. 따라서, 상기 담즙산은 엑센딘-4의 12번, 27번 또는 12번과 27번의 리신 잔기에 접합되는 것이 바람직하며, 특히 엑센딘-4의 27번 리신 잔기에 접합되는 것이 가장 바람직하다.
본 발명에서 사용된 담즙산은 특별히 한정되지는 않지만, 바람직하게는 콜릭산, 데옥시콜릭산, 체노데옥시콜릭산, 리소콜릭산, 우르소콜릭산, 우르소데옥시콜릭산, 이소우르소데옥시콜릭산, 라고데옥시콜릭산, 글리코콜릭산, 타우로콜릭산, 글리코데옥시콜릭산, 글리코체노데옥시콜릭산, 디히드로콜릭산, 하이오콜릭산 및 아하이오데옥시콜릭산을 포함한 천연 또는 합성의 스테로이드, 콜라닉산의 유도체를 포함한다. 더욱 바람직하게는 리소콜릭산, 데옥시콜릭산, 콜릭산, 콜라닉산이다.
또한, 본 발명은
1) 담즙산과 N-히드록시숙신이미드(NHS)을 반응시켜 담즙산의 카복실산 그룹을 활성화시키는 단계,
2) 상기 1)단계에서 활성화된 담즙산-NHS와 엑센딘-4를 반응시키는 단계, 및
3) 상기 반응혼합물로부터 담즙산이 접합된 엑센딘-4를 분리하는 단계를 포함하여 이루어지는 담즙산이 접합된 엑센딘-4 유도체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 담즙산이 접합된 엑센딘-4 유도체의 제조방법을 단계별로 상 세히 설명하면 다음과 같다.
상기 1)단계에서, 담즙산의 카복실산 그룹과 엑센딘-4 내의 1차 아민과의 원활한 반응을 위하여 담즙산의 카복실산 그룹을 N-히드록시숙신이미드를 이용하여 활성화시킨 담즙산-NHS를 제조한다. 상기 제조된 담즙산-NHS의 경우 말단 카복실산 그룹의 99% 이상이 NHS-에스터 형태로 전환된 것을 1H-NMR 분석을 통하여 확인할 수 있다.
상기 2)단계에서, 담즙산의 반응 몰비는 엑센딘-4 1몰에 대해 담즙산의 종류에 따라 0.5 내지 2의 몰비 범위 내에서 적절하게 선택되는 것이 바람직하다. 예컨대, 담즙산이 리소콜릭산인 경우에는 리소콜릭산/엑센딘-4의 반응비는 1:1 ~ 1.5:1인 것이 바람직하다. 적절한 상기 반응 몰비의 선택은 접합되는 담즙산의 분자구조, 분자량뿐만 아니라 반응액의 pH, 반응온도, 반응시간 등을 고려하여 바람직하게 선택될 수 있다.
상기 3)단계에서, 반응혼합물로부터 담즙산이 접합된 엑센딘-4 유도체의 분리는 고성능 액체크로마토그래피 등을 사용하여 수행할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기와 같은 분리 단계의 수행에 의해, 엑센딘-4의 12번, 27번 또는 12번과 27번의 리신 잔기에 담즙산을 선택적으로 접합한 엑센딘-4 유도체를 98% 이상의 순도로 얻을 수 있다.
또한, 본 발명은 담즙산이 접합된 엑센딘-4 유도체를 포함하는 당뇨병, 특히 제 2형 당뇨병, 또는 비만과 같은 인슐린의 과다분비에 의해 유발되는 질환, 또는 과민성 장 증후군과 같은 혈장 글루코오스 저하, 위 또는 장 운동의 억제, 위 또는 장 공복의 억제 또는 음식 섭취 억제에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 담즙산이 접합된 엑센딘-4 유도체는 엑센딘-4의 12번, 27번 또는 12번과 27번의 리신 잔기, 바람직하게는 27번 리신 잔기에 담즙산을 선택적으로 접합함으로써, 나노입자를 형성하며, 매우 강한 알부민 흡착 거동을 나타내고, 천연 엑센딘-4와 동등 또는 유사한 생물학적 활성도를 나타내면서 약물의 체내 반감기를 증가시켜 생물학적 안정성이 매우 우수하다. 또한, 담즙산의 결합위치 및 결합수를 선택적으로 제한함으로써 이러한 요소들의 다양성으로부터 유발되는 부작용을 최소화시켜 장의 능동수송시스템을 이용한 소장 흡수율을 증가시킨다. 따라서, 본 발명의 담즙산이 접합된 엑센딘-4 유도체는 인슐린 과다분비, 또는 혈장 글루코오스 저하, 위 또는 장 운동 억제, 위 또는 장 공복 억제, 또는 음식 섭취 억제에 의해 유발될 수 있는 질환들의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있으며, 특히 당뇨병, 바람직하게는 제 2형 당뇨병, 비만 및 과민성 장 증후군에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 담즙산이 접합된 엑센딘-4 유도체를 포함하는 약학 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구 투여 형태로 제제화되어 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
제제화할 경우 통상적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해 제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양화될 수 있지만, 일반적으로 일일 1회 내지 수회 투여로도 유효 투여량의 투여가 가능하다. 본 발명의 담즙산이 접합된 엑센딘-4 유도체의 일일 투여량은 0.01 내지 50 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.1 내지 10 ㎎/㎏을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 리소콜릭산이 접합된 엑센딘 -4의 제조
1. 활성화된 리소콜릭산의 제조
담즙산의 카복실산 그룹과 엑센딘-4 내의 1차 아민과의 원활한 반응을 위하여 담즙산의 카복실산 그룹을 N-히드록시숙신이미드(NHS)를 이용하여 활성화시킨 담즙산-NHS를 제조하였다.
담즙산으로서 5g의 리소콜릭산을 3g의 N-히드록시숙신이미드(NHS) (담즙산에 대해 2.1 몰배 과량) 및 5.3g의 3-디시클로헥실 카르보디미드(DCC) (담즙산에 대해 2 몰배 과량)와 함께 무수 테트라히드로퓨란(THF) 100㎖에 녹였다. 상기 용액을 질소 기류 하에서 24시간 동안 충분히 교반시키며 반응시켰다. 반응 후 생성된 디시클로헥실우레아(dicyclohexylurea; DCU)는 종이필터를 이용하여 제거하고, 반응액을 감압 조건하에서 농축한 후 과량의 n-헥산(농축액의 10 부피배 이상)에 침전시켜 활성화된 담즙산인 리소콜릭산-NHS 및 기타 리소콜릭산-NHS를 얻었다. 얻어진 생성물의 순도 향상 및 불순물 제거를 위하여, 상기 생성물을 진공 건조한 후 벤젠에 녹여 n-헥산에 침전시키는 과정을 추가로 수행하였다. 최종 생성물은 진공상태에서 48시간 동안 건조하여 분말형태로 얻었고, 반응도 및 순도는 1H NMR을 이용하여 확인하였다.
상기 제조된 리소콜릭산-NHS의 경우 대략 85~90% 정도의 무게대비 순도를 보였으며, 최종 산물에 함유된 불순물은 미반응 NHS가 대부분을 차지하는 것을 확인할 수 있었다. 미반응 NHS가 활성화된 리소콜릭산-NHS와 엑센딘-4와의 반응에 영향 을 미치지 않기 때문에 더 이상의 정제 없이 최종 리소콜릭산-NHS를 얻었다. 리소콜릭산-NHS의 경우 말단 카복실산 그룹의 99% 이상이 NHS-에스터 형태로 전환된 것을 1H-NMR 분석을 통하여 확인할 수 있었다.
담즙산으로서 상기 사용한 리소콜릭산 이외에, 데옥시콜릭산, 콜릭산, 콜라닉산 등의 다양한 담즙산류를 사용할 수 있다.
2. 리소콜릭산이 접합된 엑센딘 -4의 제조
상기 1에서 제조한 리소콜릭산-NHS (디메틸설폭사이드(DMSO)에서 0.4446~1.778 ㎎/㎖) 0.1㎖를 0.1㎖의 엑센딘-4(DMSO에서 8 ㎎/㎖)에 첨가하고, 트리에틸아민(triethylamine)이 3% 함유된 DMSO 0.1㎖를 첨가하여 상온에서 45분간 적당히 교반하며 반응시켰다. 상기 반응액에 트리플루오로아세트산(TFA, trifluoracetic acid)이 1%(v/v) 포함된 증류수 0.3㎖를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 이때, 반응에 참여하는 엑센딘-4 : 리소콜릭산-NHS의 몰비를 1 : 0.5~2로 변화하여 반응시킨 후 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 이용한 분석을 통하여 최적화된 반응 조건을 확립하였다. HPLC 분석은 각각 0.1%(v/v)의 TFA가 포함된 물과 아세토니트릴을 이용하여 아세토니트릴 기준 30~100%의 선형증가 형태의 유동상 변화를 이용하였다.
리소콜릭산과 엑센딘-4의 생접합 반응의 개략도는 도 1에 나타내었으며, 담즙산/엑센딘-4의 반응비에 따른 반응 정도의 변화는 도 2에 나타내었고, 담즙산이 접합된 엑센딘-4 유도체의 최적 수율을 위한 최적화 반응비 도출을 위한 각 생성물들의 상대적인 비는 표 1 및 도 3에 나타내었다.
Figure 112007030646404-pat00001
도 2에 나타난 바와 같이, 엑센딘-4와 리소콜릭산의 비율에 따라 다양한 형태의 반응물이 생성되었다. 대표적인 4개의 분리물로는, 1) 미반응 엑센딘-4 (5.5분에 용출), 2) 27번 리신 잔기에 리소콜릭산이 접합된 엑센딘-4 (12.93분에 용출, 이하 'LCA-M1'라 한다), 3) 12번 리신 잔기에 리소콜릭산이 접합된 엑센딘-4 (14.25분에 용출, 이하 'LCA-M2'라 한다), 및 4) 12번과 27번의 리신 잔기에 리소콜릭산이 접합된 엑센딘-4 (22.75분에 용출, 이하 'LCA-DI'라 한다)이었다.
또한 표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 27번 리신 잔기에 리소콜릭산이 접합된 엑센딘-4 유도체(LCA-M1)의 경우, 엑센딘-4와 리소콜릭산의 초기 투입량에 따라 서로 상이한 결과를 나타내었다. 따라서 LCA-M1의 최적 수율을 위한 최대화 조건을 산출하기 위하여 LCA-M1/Native 및 LCA-M1/LCA-DI의 반응 수율비와 초기 투입비를 이용한 최적화 그래프를 도출하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, LCA-M1/Native의 비율은 반응 투여비(리소콜릭산/엑센딘-4)가 증가함에 따라서 급격한 증가를 보였고, 반면에 LCA-M1/LCA-DI의 비율은 투여비의 증가에 따라 점차적으로 감소하는 경향을 보였다. 이러한 상대비율을 이용하여 리소콜릭산/엑센딘-4의 초기 반응비가 1:1 ~ 1.5:1 정도의 반응조건에서 최대량의 LCA-M1을 제조할 수 있음을 알 수 있었다.
실험예 1 : 리소콜릭산이 접합된 엑센딘 -4의 분리 및 분석
상기 실시예 1의 2에서 제조된 리소콜릭산이 접합된 엑센딘-4(LCA-엑센딘-4)는 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 미반응 엑센딘-4, LCA-M1, LCA-M2 및 LCA-DI의 4가지 서로 다른 물질로 분리하였다. 분리된 각각의 미반응 엑센딘-4 및 3개의 이성체들은 MALDI-TOF 질량 분석기를 이용한 질량분석을 통하여 미반응물 및 치환도(1개 및 2개)를 확인하였다.
최종 생성물들의 순도를 HPLC를 이용하여 확인한 HPLC 크로마토그램은 도 4에 나타내었으며, MALDI-TOF 질량 분석기를 이용하여 미반응 엑센딘-4 및 3개의 이성체들의 분자량 측정 결과는 표 2 및 도 5에 나타내었다.
Figure 112007030646404-pat00002
도 4에 나타난 바와 같이, HPLC를 이용하여 분리한 각각의 미반응물 및 리소콜릭산이 접합된 엑센딘-4의 경우(LCA-M1, LCA-M2, 및 LCA-DI) 매우 우수한 순도를 나타내었으며, 대략 98% 이상의 순도를 갖는 리소콜릭산이 접합된 엑센딘-4를 얻었다.
또한 표 2 및 도 5에 나타난 바와 같이, 3개의 각 이성체들은 불순물이 포함되지 않는 순수한 물질임을 확인할 수 있었으며, 이론적 분자량과 유사한 질량을 나타내었다.
또한, 엑센딘-4의 특정 부위에의 치환을 확인하기 위하여 엔도프로테이네이즈인 Lys-C 다이제스션(digestion) 방법을 이용하였다. 실험은 정제된 각 미반응 엑센딘-4 및 3개의 이성체들(LCA-M1, LCA-M2, 및 LCA-DI)을 5㎕의 트리에틸아민-염산 완충액(50 mmol/L; pH 8.6)에 50㎍/㎖ 농도로 용해한 뒤 5㎕의 Lys-C 효소(10㎍/㎖)를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이러한 과정을 통한 Lys-C 효소의 특이적 반응인 리신 결합 부위 절단 및 리신 잔기에의 생접합(담즙산 접합)에 따른 특이성의 결여로 특정부위 리신 잔기의 접합을 확인할 수 있었다.
결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 미반응 엑센딘-4의 경우 아미노산 배열중 2개의 리신 잔기의 존재에 따라서 Lys-C의 효소분해 반응에 의해 3개의 분절로 분해되는 반면, LCA-M1 및 LCA-M2의 경우 한 개의 리신 잔기의 생접합 반응에 의한 변화로 인하여 각각 서로 다른 두 개의 분절로 분해되는 현상을 보였다. 또한 두 개의 리신 잔기가 모두 반응한 경우 Lys-C에 의한 분해가 일어나지 않고 본래의 분자량을 나타내는 한 개의 피크가 보이는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 분석을 통하여 HPLC를 이용하여 분리한 각각의 물질이 리신 잔기 27번에 리소콜릭산이 접합된 LCA-M1, 리신 12번에 접합된 LCA-M2, 및 리신 12번과 27번에 모두 접합된 LCA-DI 임을 확인할 수 있었다.
실험예 2 : 리소콜릭산이 접합된 엑센딘 -4( LCA - M1 )의 물리화학적 특성 분석
담즙산류, 특히 말단의 카복실산 그룹이 제거 및 반응에 참가한 경우 대부분 소수성 특징을 나타낸다. 따라서 담즙산이 접합된 엑센딘-4의 경우 접합에 참여한 담즙산의 소수성 및 이러한 소수성 담즙산간의 상호작용을 통하여 수용액 하에서 미셀(micelle) 또는 나노입자(nanoparticle)를 형성하게 된다. 또한 이러한 미셀 및 나노입자의 형성은 수용액 하의 농도에 의존하는 경향을 보인다. 이러한 나노입자의 형성을 관찰하기 위하여 서로 다른 농도에서의 LCA-M1의 나노입자의 크기를 동적광산란법(Dynamic Light Scattering)을 이용하여 관찰하였다.
수용액 하에서 LCA-M1의 농도 변화에 따른 나노입자 형성 거동은 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 본 발명의 리소콜릭산이 접합된 엑센딘-4(LCA-M1)의 저농도(0~30 ㎍/㎖) 하에서는 나노입자 형성 거동을 확인할 수 없는 반면, 50㎍/㎖ 이상의 농도에서 LCA-M1은 약 200㎚ 이상의 입자가 형성됨을 확인할 수 있었다.
실험예 3 : 리소콜릭산이 접합된 엑센딘 -4( LCA - M1 )의 알부민 흡착 거동 조사
본 발명의 리소콜릭산이 접합된 엑센딘-4(LCA-M1)의 알부민 흡착 거동을 확인하기 위하여, 알부민이 결합된 컬럼 충전물과 LCA-M1 사이의 상호작용을 관찰하였다.
NHS로 활성화 되어있는 세파로즈 레진(sepharose resin) 4㎖와 30㎎의 HSA (Human Serum Albumin, 사람의 혈장 알부민)를 10mM pH 7.4의 인산염완충용액에 녹여서 상온에서 2시간 이상 반응시켜 레진에 알부민을 접합시켰다. 또한, HSA를 넣지 않고 위와 동일한 방법으로 반응시켜 NHS를 제거한 대조군도 준비하였다. 이렇게 반응이 종결된 레진들은 10mM pH 7.4의 인산염완충용액으로 충분히 씻어주었다. 이렇게 준비된 레진을 각각 80㎕씩 튜브에 담고 10mM pH 7.4의 인산염완충용액을 155㎕씩 넣었다. 여기에 미반응 엑센딘-4와 리소콜릭산이 접합된 엑센딘-4(LCA-MA)를 50㎕(100㎍/㎖)씩 넣어 상온에서 2시간 동안 흔들어주면서 반응시켰다. 반응이 종결된 후 10,000g에서 15분간 원심분리하여 상등액을 취한 뒤 micro BCA 단백질 정량법을 사용하여 알부민에 흡착되지 않고 남아있는 시료의 농도를 측정하였다.
본 발명의 LCA-M1의 알부민 흡착 거동은 도 8에 나타내었으며, 알부민 흡착을 정량화한 알부민 결합량은 도 9에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, 본 발명의 LCA-M1은 매우 강한 알부민 흡착 거동을 보이기 때문에 알부민 결합 레진과 일반 레진과의 큰 농도차를 보이는 것을 알 수 있다. 반면에 엑센딘-4는 자체적으로 낮은 알부민 흡착 거동을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 이는 엑센딘-4에 접합된 리소콜릭산이 알부민 흡착에 매우 중요한 역할을 하는 것을 나타낸다.
또한 도 9에 나타난 바와 같이, 본 발명의 LCA-M1의 경우 83%의 알부민 흡착을 보였고, 엑센딘-4는 30%의 알부민 흡착 거동을 보였다. 따라서, 본 발명에 따라 제조된 LCA-M1의 경우 인체에 투여한 후 인체 내의 알부민과의 결합을 통하여, 보다 긴 생체 반감기 및 느린 소실속도를 나타낼 것으로 여겨진다.
실험예 4 : 리소콜릭산이 접합된 엑센딘 -4의 췌장소도 인슐린 분비 촉진 활성 측정
본 발명의 리소콜릭산이 접합된 엑센딘-4의 인슐린 분비 촉진 활성을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
실험동물로 Sprague Dawley 랫트를 사용하였으며, 콜라게네이즈 분해 및 Ficoll 밀도차 분리법을 이용하여 랫트의 췌장소도를 분리하였다. 분리한 췌장 소도에 엑센딘-4 및 리소콜릭산이 접합된 엑센딘-4 유도체(LCA-M1, LCA-M2, 및 LCA-DI)를 이용한 인슐린 분비 자극 실험을 통하여 관찰하였다. 실험은 평균 크기가 150㎛인 췌장소도 20개를 1㎖의 크랩스-링거 완충용액(Krebs-Ringer Buffer, KRB, 16.7 mM 포도당 함유)에 분산시킨 후, 각 엑센딘-4 및 리소콜릭산이 접합된 엑센딘-4 유도체를 0.1, 1, 10, 100 nM의 농도로 투여하고 2시간 동안 인슐린 분비량을 ELISA kit를 이용하여 측정하였다.
엑센딘-4 및 리소콜릭산이 접합된 엑센딘-4 유도체(LCA-M1, LCA-M2, 및 LCA-DI)의 췌장소도 자극을 통한 인슐린 분비 촉진 실험의 결과는 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이, 엑센딘-4 및 리소콜릭산이 접합된 엑센딘-4 유도체(LCA-M1, LCA-M2, 및 LCA-DI)는 농도 의존적으로 췌장소도의 인슐린 분비능을 향상시키는 것을 알 수 있었다. 비교적 저농도인 1 nM 이하에서는 특별한 인슐린 분비 효능을 보이지 않았으나, 농도가 10 nM 이상으로 증가함에 따라 급격한 인슐린 분비 향상을 촉진시키는 기능을 나타내었으며, 이러한 인슐린 분비 촉진 기능은 리소콜릭산의 접합수 및 접합 위치에 따라 서로 다른 경향을 보였다. 10 nM의 농도에서 가장 현격한 효능차이를 관찰할 수 있었다. 본 발명의 LCA-M1의 경우 천연 엑센딘-4에 비하여 약간의 활성감소를 보였으나 통계학적으로는 큰 차이를 보이지 않았고(Student t-test에 의한 p값 = 0.14), LCA-M2의 경우 통계적으로 유의한 활성 감소를 보였다(p=0.01). 또한 LCA-DI의 경우 상대적으로 매우 낮은 활성을 보였다. 따라서, 본 발명의 LCA-M1이 가장 우수한 생접합체임을 확인할 수 있었다.
실험예 5 : 본 발명의 리소콜릭산이 접합된 엑센딘 -4( LCA - M1 )의 동물모델에서의 생물학적 활성 측정
본 발명의 리소콜릭산이 접합된 엑센딘-4(LCA-M1)의 동물모델에서의 경구 내당력(oral glucose tolerance, OGTT)을 측정하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
6주령된 수컷 db/db 마우스(제 2형 당뇨 모델 동물, C57/BLKS/J-db/db, 한국생명공학연구원)에 글루코오스(200 ㎎/㎖) 200㎕ 및 약물(엑센딘-4 및 LCA-M1, 1 nmole/kg body, 투여부피 100㎖, 글루코오스 투여 30분 전에 주사)을 각각 경구 및 피하 투여의 방법으로 주입한 후 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180분에 꼬리 정맥에서 채취한 혈액 샘플에서 혈당 변화를 관찰하였다.
제 2형 당뇨동물에서 엑센딘-4 및 LCA-M1의 피하 투여에 따른 경구 내당력 거동의 변화는 도 11에 나타내었으며, 이러한 경구 내당력 거동의 변화를 정량화하기 위하여 각각의 실험동물에 따른 혈중농도 곡선하 면적(포도당 AUC)을 도식화 한 것은 도 12에 나타내었다.
도 11에 나타난 바와 같이, 대조군(생리식염수 주사)의 경우 포도당의 투여에 따라 급격한 혈당증가 경향 및 매우 느린 혈당 강하 거동을 나타낸 반면, 엑센딘-4 및 LCA-M1을 투여한 실험군에서는 포도당을 투여함에도 낮은 혈당증가 및 빠른 혈당 강하를 통한 혈당 정상화를 확인할 수 있었다.
또한 도 12에 나타난 바와 같이, 대조군의 경우 약 41000 ng.min/㎖의 포도당 AUC 값을 보인 반면, 엑센딘-4 및 LCA-M1의 경우 각각 13000과 12000 ng.min/㎖의 포도당 AUC 값을 보였다. 또한 엑센딘-4와 LCA-M1의 경우 Student t-test에 의한 p값이 0.47로서 통계학적 차이를 보이지 않는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 6 : 본 발명의 리소콜릭산이 접합된 엑센딘 -4( LCA - M1 )의 동물모델에서의 활성 지속시간 측정
본 발명의 리소콜릭산이 접합된 엑센딘-4(LCA-M1)의 동물모델에서의 활성지속시간을 측정하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
6주령된 수컷 db/db 마우스(C57/BLKS/J-db/db, 한국생명공학연구원)에 0.1㎖의 엑센딘-4(10 nmole/㎏)와 LCA-M1(5, 10, 15 nmole/㎏)을 마우스의 피하에 투여한 후 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24시간에 꼬리정맥에서 혈액 샘플을 이용하여 혈당을 측정하였다. 또한 정상적인 환경 하에서의 약효를 규명하기 위하여 물 및 먹이를 자유로이 섭취할 수 있도록 하였으며, 12시간 및 24시간 후의 먹이 섭취량을 측정하였다.
본 발명의 리소콜릭산이 접합된 엑센딘-4(LCA-M1)의 제 2형 당뇨동물 모델에서 활성지속시간 결과는 도 13에 나타내었고, 도 13의 결과를 이용하여 곡선하 면적(포도당 AUC)으로 도식화 한 것은 도 14에 나타내었으며, 대조군, 엑센딘-4 및 LCA-M1(각각 10 nmole/kg 투여군)에서 실험동물의 시간에 따른 먹이 섭취량은 도 15에 나타내었다.
도면 13에 나타난 바와 같이, 당뇨동물 모델에서 대조군(생리식염수 투여)의 혈당은 250mg/㎖ 이상의 수준에서 꾸준히 유지되었다. 반면에 엑센딘-4 투여군(10 nmole/kg)의 경우 투여 30분 이후에 뚜렷한 혈당 감소를 동반하고, 이러한 혈당 감소는 투여 4시간 후까지 유지되었으며, 그 이후에 점진적 혈당 증가를 수반하여 약 12시간 후에는 고혈당 수준(200㎎/㎖ 혈당)에 도달하였다. 본 발명의 LCA-M1 투여군의 경우 엑센딘-4와 유사한 혈당감소 경향을 보였으나 보다 장기간의 정상혈당 유지 시간을 나타내었으며, 정상혈당 유지시간의 경우 투여량에 비례하는 경향을 보였다. 본 발명의 LCA-M1을 5, 10 nmole/kg의 양으로 투여한 경우 정상혈당 유지시간은 각각 8시간과 12시간 정도로 측정되었으며, 15 nmole/kg의 양으로 투여한 경우 24시간 경과 후에도 평균혈당값이 108㎎/㎖로 정상치를 유지함을 알 수 있었다.
또한 도 14에 나타난 바와 같이, 엑센딘-4 및 LCA-M1을 투여한 실험동물은 Student t-test를 이용하여 분석한 결과 대조군에 비하여 현격한 포도당 AUC 값의 감소를 나타내었다. LCA-M1 투여군의 경우 엑센딘-4에 비하여 매우 낮은 포도당 AUC 값을 나타내었으며, 10 및 15 nmole/kg 투여군의 경우 통계학적으로 유의하게 낮은 포도당 AUC 값을 갖는 것을 알 수 있었다.
또한 도 15에 나타난 바와 같이, 12시간 동안의 먹이 섭취량에서는 엑센딘-4와 LCA-M1 투여군들에서 유의하게 감소된 경향을 보였고, 엑센딘-4와 LCA-M1 사이에는 통계적 차이를 보이지 않았다. 반면 24시간 동안의 먹이 섭취량에서는 LCA-M1 투여군이 유의하게 낮은 먹이 섭취량을 나타내었다.
이러한 실험을 통하여, 본 발명의 리소콜릭산이 접합된 엑센딘-4(LCA-M1)가 보다 장기간 동안 정상혈당을 유지시키는 지속형 약물의 성질을 보임을 알 수 있었으며, 또한 먹이 섭취에도 장기적 효과를 보임을 확인할 수 있었다.
실험예 7 : 본 발명의 리소콜릭산이 접합된 엑센딘 -4( LCA - M1 )의 동물모델에서의 약물동력학적 거동
본 발명의 리소콜릭산이 접합된 엑센딘-4(LCA-M1)의 동물모델에서의 약물 체내 동태를 고찰하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
6주령된 Sprague-Dawley 랫트로부터 혈액 샘플 채취를 용이하게 하기 위하여 동물의 우측 경정맥에 PE-10 튜브를 약 2.5㎝ 정도 삽관한 후 봉합하고 삽입된 튜브의 끝을 동물의 등 부위를 거쳐 외부의 채혈관과 연결하였다. 약 24시간의 안정화 및 회복기간 경과 후 엑센딘-4 및 LCA-M1을 각각 4.18 ㎍/rat과 50 ㎍/rat의 용량으로 피하에 주입한 후, 5분~24시간의 실험기간 동안 주기적으로 혈액을 채취하였다(0.2㎖, 각 시간 포인트 별). 혈액 샘플은 원심분리기를 이용하여 혈장만을 취한 후, 혈장 내 엑센딘-4 및 LCA-M1의 약물 체내 동태를 분석 kit(엑센딘-4 ELISA kit)를 이용하여 측정하였다.
엑센딘-4의 약물동력학적 거동은 도 16에 나타내었고, LCA-M1의 약물동력학적 거동은 도 17에 나타내었다.
도 16에 나타난 바와 같이, 엑센딘-4의 경우 약물투여 약 30분 후에 혈중최고농도에 도달하였고, 1시간 이후에는 급격한 혈중 농도 감소를 수반하며, 3시간 이후에는 대부분의 혈중 엑센딘-4가 사라짐을 알 수 있었다. 이러한 결과를 이용하여 도출한 엑센딘-4의 반감기는 1.6±0.4 시간이었다. 반면 LCA-M1의 경우, LCA-M1 투여 후 지속적 혈중농도 증가를 수반하여 약 6~8시간 이후에 혈중최고농도에 도달하였고, 이후 점차적으로 감소하는 경향을 나타내었다. 계산된 LCA-M1의 반감기는 9.7±1.4 시간이었으며, 이는 엑센딘-4에 비해 약 6배 증가한 긴 반감기이다.
실험예 8 : 본 발명의 리소콜릭산이 접합된 엑센딘 -4( LCA - M1 )의 장기 투여를 통한 당뇨병 치료효과
본 발명의 리소콜릭산이 접합된 엑센딘-4(LCA-M1)의 동물모델에서의 장기 투여를 통한 제 2형 당뇨병 치료효과를 고찰하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
제 2형 당뇨병 동물모델인 db/db 마우스에 4주간 LCA-M1을 15 nmole/kg의 투여량으로 하루 1회씩 투여하였으며, 혈당, 먹이 섭취량, 및 체중을 측정하는 방법을 사용하였다. 또한 투약 전 및 4주 투약 후의 경구 내당력 측정을 통하여 실험동물의 혈당 제거능력을 조사하였다. 새로운 약물 투여 직후에 나타나는 초기효과를 배재하기 위하여 혈당 측정은 약물투여 직전에 실시하였다.
본 발명의 LCA-M1의 투여를 통한 실험기간 동안 실험동물의 혈당변화는 도 18에 나타내었으며, 실험동물의 체중변화는 도 19에 나타내었고, 실험동물의 먹이 섭취량은 도 20에 나타내었다. 또한, 본 발명의 LCA-M1의 투여 전의 실험동물의 경구 내당력 변화는 도 21에 나타내었으며, 본 발명의 LCA-M1의 투여 28일 후 실험동물의 경구 내당력 변화는 도 22에 나타내었고, 도 22의 결과를 이용하여 곡선하 면적(포도당 AUC)으로 도식화 한 것은 도 23에 나타내었다.
도 18에 나타난 바와 같이, 식염수만을 투여한 대조군의 경우 초기 약 170 mg/㎖의 혈당 평균치가 점진적 증가를 통하여 4주 후에는 250 mg/㎖ 이상의 고혈당을 나타내었다. 반면 매일 LCA-M1을 투여한 실험군에서는 전 실험기간 동안 100~150 mg/㎖ 정도의 정상혈당치를 유지하였다. 또한 약물투여 28일 이후 약물투여의 중지에 따라서 혈당의 급격한 증가를 수반하고 대조군의 실험동물과 유사한 고혈당을 나타내었다. 따라서 본 발명의 LCA-M1의 하루 1회 투여는 당뇨동물의 혈당 정상화에 유효한 효능을 나타냄을 알 수 있었다.
또한 도 19에 나타난 바와 같이, 대조군 실험동물의 경우 지속적 체중증가를 수반하여 최종 40g 이상의 비만상태를 보였으나, 본 발명의 LCA-M1 투여군의 경우 약물 투여에 따른 체중 증가의 완화 경향을 보임을 알 수 있었다.
또한 도 20에 나타난 바와 같이, 본 발명의 LCA-M1 투여군에서는 초기 1~2주간 현격한 음식물 섭취 감소 경향을 보였으며, 2주 이후에는 대조군에 비하여 그리 큰 차이를 나타내지 않는 것을 알 수 있었다.
또한 도 21 및 도 22에 나타난 바와 같이, 초기에 동일한 경구 내당력을 보이는 실험동물을 이용하여 본 발명의 LCA-M1의 투여 전과 4주간 투여 후의 경구 내당력은 현격한 차이를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
또한 도 23에 나타난 바와 같이, 본 발명의 LCA-M1의 4주간 투여는 당뇨실험 동물의 경구 내당력의 증가에 현격한 영향을 보이는 것을 알 수 있었다.
하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.
제제예 : 약학적 제제
1. 산제의 제조
담즙산이 접합된 엑센딘-4 유도체 2g
유당 1g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
2. 정제의 제조
담즙산이 접합된 엑센딘-4 유도체 100㎎
옥수수전분 100㎎
유 당 100㎎
스테아린산 마그네슘 2㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
3. 캡슐제의 제조
담즙산이 접합된 엑센딘-4 유도체 100㎎
옥수수전분 100㎎
유 당 100㎎
스테아린산 마그네슘 2㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
4. 주사액제의 제조
담즙산이 접합된 엑센딘-4 유도체 10 ㎍/㎖
묽은 염산 BP pH 3.5로 될 때까지
주사용 염화나트륨 BP 최대 1㎖
적당한 용적의 주사용 염화나트륨 BP 중에 본 발명의 담즙산이 접합된 엑센딘-4 유도체를 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 사용하여 pH 3.5로 조절하고, 주사용 염화나트륨 BP를 사용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명유리로 된 5㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자 하에 봉입시키고, 120℃에서 15분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다.
본 발명의 담즙산이 접합된 엑센딘-4 유도체는 엑센딘-4의 12번, 27번 또는 12번과 27번의 리신 잔기, 바람직하게는 27번 리신 잔기에 담즙산을 선택적으로 접합함으로써, 나노입자를 형성하며, 매우 강한 알부민 흡착 거동을 나타내고, 천연 엑센딘-4와 동등 또는 유사한 생물학적 활성도를 나타내면서 약물의 체내 반감기를 증가시켜 생물학적 안정성이 매우 우수하다. 또한, 담즙산의 결합위치 및 결합수를 선택적으로 제한함으로써 이러한 요소들의 다양성으로부터 유발되는 부작용을 최소화시켜 장의 능동수송시스템을 이용한 소장 흡수율을 증가시킨다. 따라서, 본 발명의 담즙산이 접합된 엑센딘-4 유도체는 인슐린 과다분비, 또는 혈장 글루코오스 저하, 위 또는 장 운동 억제, 위 또는 장 공복 억제, 또는 음식 섭취 억제에 의해 유발될 수 있는 질환들의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있으며, 특히 당뇨병, 바람직하게는 제 2형 당뇨병, 비만 및 과민성 장 증후군에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (12)

  1. 소수성 담즙산이 접합된 엑센딘-4 유도체.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 엑센딘-4 유도체는 엑센딘-4의 12번, 27번 또는 12번과 27번의 리신 잔기에 담즙산을 선택적으로 접합한 것을 특징으로 하는 엑센딘-4 유도체.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 엑센딘-4 유도체는 엑센딘-4의 27번 리신 잔기에 담즙산을 선택적으로 접합한 것을 특징으로 하는 엑센딘-4 유도체.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 엑센딘-4는 천연 또는 재조합 엑센딘-4인 것을 특징으로 하는 엑센딘-4 유도체.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 담즙산은 콜릭산, 데옥시콜릭산, 체노데옥시콜릭산, 리소콜릭산, 우르소콜릭산, 우르소데옥시콜릭산, 이소우르소데옥시콜릭산, 라고데옥시콜릭산, 글리코콜릭산, 타우로콜릭산, 글리코데옥시콜릭산, 글리코체노데옥시콜릭산, 디히드로콜릭산, 하이오콜릭산 및 아하이오데옥시콜릭산을 포함한 천연 또는 합성의 스테로이드, 및 콜라닉산의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 엑센딘-4 유도체.
  6. 1) 담즙산과 N-히드록시숙신이미드(NHS)을 반응시켜 담즙산의 카복실산 그룹을 활성화시키는 단계,
    2) 상기 1)단계에서 활성화된 담즙산-NHS와 엑센딘-4를 반응시키는 단계, 및
    3) 상기 반응혼합물로부터 담즙산이 접합된 엑센딘-4를 분리하는 단계를 포함하여 이루어지는 청구항 1의 담즙산이 접합된 엑센딘-4 유도체의 제조방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 2)단계에서 담즙산의 반응 몰비는 엑센딘-4 1몰에 대해 0.5 내지 2의 몰비 범위 내인 것을 특징으로 하는 청구항 1의 담즙산이 접합된 엑센딘-4 유도체의 제조방법.
  8. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 담즙산이 접합된 엑센딘-4 유도체를 포함하는 인슐린의 과다분비에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 질환은 당뇨병 또는 비만인 것을 특징으로 하는 인슐린의 과다분비에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 당뇨병은 제 2형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 인슐린의 과다분비에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  11. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 담즙산이 접합된 엑센딘-4 유도체를 포함하는 혈장 글루코오스 저하, 위 또는 장 운동의 억제, 위 또는 장 공복의 억제 또는 음식 섭취 억제에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 질환은 과민성 장 증후군인 것을 특징으로 하는 혈장 글루코오스 저하, 위 또는 장 운동의 억제, 위 또는 장 공복의 억제 또는 음식 섭취 억제에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100864584B1 (ko) 2008-02-25 2008-10-24 성균관대학교산학협력단 비오틴으로 수식된 엑센딘 유도체, 이의 제조방법 및 이의용도
WO2021107519A1 (en) * 2019-11-27 2021-06-03 D&D Pharmatech Inc. Biotin moiety-conjugated polypeptide and pharmaceutical composition for oral administration comprising the same

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6767887B1 (en) 1996-06-05 2004-07-27 Roche Diagnostics Gmbh Exendin analogues, processes for their preparation and medicaments containing them
US20060178304A1 (en) 2003-06-03 2006-08-10 Novo Nordisk A/S Stabilized pharmaceutical peptide compositions

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6767887B1 (en) 1996-06-05 2004-07-27 Roche Diagnostics Gmbh Exendin analogues, processes for their preparation and medicaments containing them
US20060178304A1 (en) 2003-06-03 2006-08-10 Novo Nordisk A/S Stabilized pharmaceutical peptide compositions

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Pharmaceutical Research, Vol.23(1):49-55, (2006.01.)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100864584B1 (ko) 2008-02-25 2008-10-24 성균관대학교산학협력단 비오틴으로 수식된 엑센딘 유도체, 이의 제조방법 및 이의용도
WO2009107900A1 (en) * 2008-02-25 2009-09-03 Sungkyunkwan University Foundation For Corporate Collaboration Exendin derivative linked biotin, method for the preparation thereof and pharmaceutical composition comprising the same
US8466103B2 (en) 2008-02-25 2013-06-18 B&L Delipharm, Corp. Exendin polypeptide linked to biotin, method for the preparation thereof and pharmaceutical composition comprising the same
WO2021107519A1 (en) * 2019-11-27 2021-06-03 D&D Pharmatech Inc. Biotin moiety-conjugated polypeptide and pharmaceutical composition for oral administration comprising the same
CN114746437A (zh) * 2019-11-27 2022-07-12 D&D制药技术股份有限公司 生物素部分缀合的多肽和包括其的用于口服施用的药物组合物

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