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KR100746431B1 - 셀 소터 칩 - Google Patents

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KR100746431B1
KR100746431B1 KR1020060011579A KR20060011579A KR100746431B1 KR 100746431 B1 KR100746431 B1 KR 100746431B1 KR 1020060011579 A KR1020060011579 A KR 1020060011579A KR 20060011579 A KR20060011579 A KR 20060011579A KR 100746431 B1 KR100746431 B1 KR 100746431B1
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micro
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겐지 야스다
아끼히로 핫또리
가즈노리 오까노
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도꾸리쯔교세이호징 가가꾸 기쥬쯔 신꼬 기꼬
가부시끼가이샤 온칩 바이오테크놀리지스
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Abstract

기판 위에 형성하는 마이크로유로(流路)를 이용하는 세포 분리 또는 검출용으로, 확실하게 소정 세포의 검출 및 분리를 행할 수 있는 세포 분리 칩 및 세포 분리 기술을 확립하여, 염가로 시료마다 교체가 가능한 일회용 칩을 이용한 세포 분석 분리 장치를 제공한다. 이것을 위해 기판 위에 형성하는 마이크로유로를 이용해서, 제1단에서 개괄적인 분리를 행하고, 이어서 제2단에서 고정밀의 세포 분리를 행한다. 보다 구체적으로는, 제1단은 산란 광 내지 형광 강도로 세포를 대략적으로 분리한다. 이어서 제2단에서, 개괄적으로 된 세포를 화상 식별을 이용해서 고정밀의 세포 분리를 행한다.
겔 전극, 셀 소터 칩, 마이크로유로, 시료 완충액, 세포 분리 영역, 세포 검출 영역, 리저버, 필터

Description

셀 소터 칩{CELL SORTER CHIP}
도 1은 실시예의 2단계에서 세포 분리를 행하는 셀 소터 칩의 요소 기능의 구성과, 각 요소 기능에 부속하는 장치를 나타내는 세포 분리 시스템의 개념도.
도 2는 실시예의 셀 소터 칩의 구성의 일례를 모식적으로 도시하는 평면도.
도 3은 리저버(210) 영역의 구멍(201, 203 및 204)의 중심부를 통과하는 A-A 위치에서 화살표 방향으로 본 칩 기판(101)의 단면도.
도 4의 (a), 도 4의 (b) 및 도 4의 (c)는 시료 세포의 도입부에 있어서의 연구를 설명하기 위해, 리저버(210) 영역의 구멍(202, 201) 및 필터(230)에 주목한 칩 기판(101)의 부분적인 단면도.
도 5는 제1 세포 분리 영역(262) 근방의 상세 구조를 도시하는 도면.
도 6은 마이크로유로(221)를 유하(流下)하는 완충액이 마이크로유로(224, 224')를 유하하는 완충액에 의해서 중앙부로 밀어 붙여진 결과의 합류 후의 마이크로유로(221) 내의 세포 분포를 설명하는 도면.
도 7은 제2 세포 분리 영역(320) 근방의 상세 구조를 도시하는 도면.
도 8은 제1 세포 분리 영역(262)에서 세포를 분리하기 위한 정보를 얻는 제1 세포 검출 영역(261)이, 전방 산란이나 투과광의 감쇠에 의해서 세포의 정보를 얻는 경우의 산란 광 검출부를 설명하는 도면.
도 9는 제1 세포 분리 영역(262)에서 세포를 분리하기 위한 정보를 공급하는 제1 세포 검출 영역(261)이, 측방 산란 광에 의해 세포의 정보를 얻는 경우의 측방 산란 광 검출부를 설명하는 도면.
도 10은 제2 세포 분리 영역(320)에서 세포를 분리하기 위한 정보를 공급하는 제2 세포 검출 영역(310)이, 세포 정보를 화상 정보로서 얻는 화상 검출부의 구성의 일례를 설명하는 도면.
도 11은 제2 세포 분리 영역(320)에서 세포를 분리하기 위한 정보를 공급하는 제2 세포 검출 영역(310)이, 세포 정보를 세포의 형광상으로서 얻는 화상 검출부의 구성의 일례를 설명하는 도면.
도 12는 세포를 미리 형광 표식해 두고 형광 강도에 의해 세포 검출을 행하는 광학계의 구성의 일례를 설명하는 도면.
<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>
1 : 세포 현탁액 저류부
2 : 산란 광 검출부
3 : 제1 분리부
4 : 제1 폐기 리저버
5 : 화상 검출부
6 : 제2 분리부
7 : 제2 폐기 리저버
8 : 분리 리저버
10 : 퍼스널 컴퓨터
13, 14 : 전원
100 : 셀 소터 칩
[비특허 문헌 1] Kamarck, M.E., Methods Enzymol. Vol.151, p150-165(1987)
[비특허 문헌 2] Micro Total Analysis, 98, pp.77-80(Kluwer Academic Publishers, 1998)
[비특허 문헌 3] Analytical Chemistry, 70, pp.1909-1915(1998)
[특허 문헌 1] 일본 특허 공개 2003-107099호 공보
[특허 문헌 2] 일본 특허 공개 2004-85323호 공보
[특허 문헌 3] 국제공개 제2004/101731호 팜플렛
본 발명은 기판 위에 구성되는 세포 분리 장치(셀 소터)에 관한 것이다.
다세포생물에 있어서의 생체조직은 여러 가지 세포가 역할을 분담하여 전체적으로 조화를 이룬 기능을 유지하고 있다. 또는 세포의 일부가 암화(여기서는 종양도 포함해서 일괄하여 암이라고 부르기로 한다)하면, 주변 영역과 상이한 신생물이 되는데, 암 영역과 거기에서 멀리 떨어진 정상조직 부분은 어떤 경계를 가지고 반드시 구획할 수 있는 것이 아니라, 암 주변 영역도 얼마간의 영향을 받고 있다. 따라서 장기조직에 있어서의 기능을 해석하기 위해서는 좁은 영역에 존재하는 소수 의 세포를 분리할 필요가 있다.
또는 의료 분야에 있어서 정상조직 중의 암이 의심되는 영역을 조사하기 위해서는 바이옵시로 분리한 조직편으로부터 암이 의심되는 부분을 분리할 필요가 있다. 이러한 특정세포의 분리에는 세포를 고정하고, 여러 가지 세포염색을 실시하여 원하는 부분을 잘라내는 것이 일반적이고, 최근에는 레이저 마이크로 다이섹션이라고 불리는 레이저를 쏘인 영역만의 세포를 분리하는 방법이 고안되어 있다.
또는 재생 의료 분야에서는 조직 중에서 줄기세포를 분리하고, 이것을 배양하고 분화 유도하여 원하는 조직, 나아가서는 장기를 재생하려고 하는 시도가 이루어지고 있다.
세포를 식별하거나 분리하려고 하면 어떠한 지표에 따라 구별할 필요가 있다. 일반적으로 세포의 구별에는,
1) 눈으로 보는 것에 의한 형태학적인 세포 분류:예를 들면 뇨 중에 출현하는 이형세포 검사에 의한 방광암이나 요도암 등의 검사나 혈 중의 이형세포 분류, 조직 중에 있어서의 세포진에 의한 암 검사 등을 들 수 있다.
2) 형광항체법에 의한 세포 표면 항원(마커) 염색에 의한 세포 분류:일반적으로 CD 마커라고 불리는 세포 표면 항원을, 그것에 특이적인 형광 표식 항체로 염색하는 것으로, 셀 소터에 의한 세포 분리나 플로우 사이트 미터나 조직염색에 의한 암 검사 등에 이용되고 있다. 물론, 이것들은 의료 면뿐만 아니라 세포 생리 연구용이나 공업적인 세포 이용에 있어서도 다용되고 있다.
3) 세포 내에 받아들여지는 형태의 형광 색소를 리포터로 하는 줄기세포의 분리:줄기세포를 포함하는 세포를 대략적으로 분리하고, 다시 그 후에 실제로 배양을 함으로써 원하는 줄기세포를 분리한다. 이것은 줄기세포의 유효한 마커가 아직 확립되어 있지 않기 때문에, 실제로 배양하여 분화 유도한 것만을 이용함으로써 실질적으로 목적세포를 분리하고 있는 것이다.
이와 같이 배양액 중의 특정한 세포를 분리하여 회수하는 것은 생물학·의학적인 분석에 있어서는 중요한 기술이다.
세포의 비중 차이로 세포를 분리하는 경우에는 속도 침강법에 의해서 분리할 수 있다. 그러나 미감작의 세포와 감작한 세포를 분별하는 것 같은, 세포의 비중 차이가 거의 없는 경우에는 형광항체로 염색한 정보 또는 목시의 정보에 기초하여 세포를 하나하나 분리할 필요가 있다. 이 기술에 대해서는 예를 들면 셀 소터가 있다.
셀 소터는 형광염색 처리 후의 세포를 형광의 유무나 세포의 산란 광 정보를 얻은 후, 전하를 갖게 한 액적 중에 1세포 단위로 단리하여 대기 중에 적하하고, 이 액적 중의 세포를 액적이 낙하하는 과정에서, 낙하 방향에 대해서 법 평면 방향으로 고전계를 임의의 방향으로 인가함으로써, 액적의 낙하 방향을 제어하여 하부에 놓인 복수의 용기에 분획하여 회수하는 기술이다(비특허 문헌 1).
그러나 이 기술은 장치가 고가인 것, 장치가 대형인 것, 수천 볼트라는 고전계가 필요한 것, 시료가 다량으로 필요한 것, 액적을 작성하는 단계에서 세포에 손상을 줄 가능성이 있는 것, 직접 시료를 관찰할 수 없는 것 등의 문제가 있다.
이러한 문제들을 해결하기 위해서, 최근, 마이크로 가공 기술을 이용해서 미세한 유로를 작성하고, 유로 내의 층류 중을 흐르는 세포를 직접 현미경 관찰하면서 분리하는 셀 소터가 개발되어 있다(비특허 문헌 2 및 비특허 문헌 3).
그러나 이 마이크로 가공 기술을 이용해서 작성하는 셀 소터에서는 관찰 수단에 대한 시료 분리의 응답 속도가 느려, 실용화하기 위해서는 시료에 손상을 주지 않으면서도 응답이 보다 빠른 처리 방법이 필요했다.
본 발명자들은 이러한 문제점을 해소하기 위해서 마이크로 가공 기술을 활용하여, 시료의 미세 구조와 시료 중의 형광 분포에 기초하여 시료를 분획하고, 회수하는 시료에 손상을 주지 않고, 간편하게 세포 시료를 분석 분리할 수 있는 세포 분석 분리 장치를 출원하고 있다(특허 문헌 1-특허 문헌 3). 이것은 실험실 레벨에서는 충분히 실용적인 셀 소터이지만, 범용적으로 사용하기 위해서는 액 반송법이나 회수법, 시료조제에 대해서 새로운 기술개발이 필요하다.
본 발명은 기판 위에 형성하는 마이크로유로를 이용하는 세포 분리 또는 검출용으로, 확실하게 소정 세포의 검출 및 분리를 행할 수 있는 세포 분리 칩 및 세포 분리 기술을 확립하여, 염가로 시료마다 교체가 가능한 일회용 칩을 이용한 세포 분석 분리 장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.
기판 위에 마이크로유로를 작성해서 액을 흘리면, 일반적으로는 그 안을 흐르는 액은 층류가 된다. 기판 위에 형성하는 마이크로유로를 이용한 셀 소터 시스템에서도 시스 플로우 기술이 이용되어 세포를 정렬시키고, 화상 식별 기술을 이용해서 세포의 특징을 추출해서 소정의 세포를 분리한다. 이 방법은 고정밀도의 세포 분리 회수가 가능하지만, 기판을 이용하지 않고 액적을 형성시켜 그 안에 포함되는 세포를 산란 광이나 형광 강도로 식별 분리하는 통상의 셀 소터에 비해 처리 능력이 뒤떨어진다.
그래서 세포의 분리 처리 능력을 종래의 셀 소터와 동등 정도까지 높인 셀 소터 칩의 개발과 분리 알고리즘의 확립이 본 발명의 목적이다.
본 발명에서 상정하고 있는 세포는, 작은 것에서는 박테리아, 큰 것에서는 동물세포(암세포)와 같은 것이다. 따라서 세포 사이즈로서는 0.5㎛ 내지 30㎛φ 정도의 범위가 된다. 세포 분리를 기판 위에 조립한 마이크로유로를 이용해서 행하고자 하면, 우선 문제가 되는 것이 마이크로유로폭(단면 형상)이다. 또한 마이크로유로는 기판의 두께 방향으로 10 내지 100㎛ 내외의 스페이스에, 실질 2차원 평면 형상으로 작성하게 된다. 세포의 크기로부터 해서 마이크로유로는 박테리아용으로는 폭이 5 내지 10㎛, 높이가 20㎛ 정도, 동물세포용으로는 폭이 10 내지 50㎛, 높이가 50㎛ 정도가 적당한 사이즈가 된다.
마이크로유로 안을 흐르는 세포를 모두 화상 식별로 처리하려고 하면, 처리 능력은 화상의 식별 속도, 즉 화상을 받아들이는 카메라의 프레임 레이트와 받아들인 화상의 순차 화상 처리의 속도에 의존한다. 예를 들면 500프레임/초의 고속 카메라를 이용하면, 1/500초 이하에서 한 장의 프레임의 화상 처리를 행할 필요가 있다. 각 프레임에 수 세포 정도까지 세포의 상이 있더라도 각 세포를 프레임 사이에서 링크시키면서 형상 특징을 추출하는 기술은 만들려고 생각하면 만들 수 있고, 실제, 본원의 발명자들은 500프레임/초의 고속 카메라와 전용 화상 처리 칩을 개발 함으로써 2000세포/초 정도의 처리를 실현하고 있다.
이 수치는 종래의 셀 소터의 세포 분리 처리 속도 6 내지 8만 세포/초(실제로는 순도와 회수율을 확보하기 위해서 2000 내지 5000세포/초 정도의 범위가 가장 다용된다)와 실질적으로는 거의 동등한 처리가 가능하다. 또 다른 세포 처리 능력의 향상에는 화상 식별만으로 염가로 달성하는 것은 현상의 기술에서는 어렵다.
따라서, 본 발명에서는 세포 화상 식별 전에 산란 광 내지 형광 강도로 세포를 식별분별하는 단을 설정하기로 했다. 즉, 제1단에서 개괄적인 분리를 행하고, 이어서 제2단에서 고정밀의 세포 분리를 행한다. 보다 구체적으로는, 제1단은 산란 광 내지 형광 강도로 세포를 대략적으로 분리한다. 이 단계에서는 불필요한 세포를 제거할 수 없더라도, 수집해야 할 세포를 잃어버리는 일 없도록 개괄적으로 하는 것이다. 이어서 제2단에서 개괄적으로 된 세포를 화상 식별을 이용해서 고정밀의 세포 분리를 행한다. 이 2단계의 분리를 캐스케이드로 한 장의 칩 위에 작성한다.
(실시예)
도 1은 실시예의 2단계로 세포 분리를 행하는 셀 소터 칩의 요소 기능의 구성과, 각 요소 기능에 부속하는 장치를 나타내는 세포 분리 시스템의 개념도이다.
참조 부호 100은 셀 소터 칩이다. 참조 부호 1은 세포 현탁액 저류부이고, 분리 대상인 세포 현탁액을 저류한다. 세포 현탁액 저류부(1)로부터 유하하는 세포 현탁액에 포함되는 세포에, 산란 광 검출부(2)에서 레이저광원(15)에 의해 레이 저광을 조사한다. 세포에 의해서 산란되는 레이저광의 산란 광을 광 검출기(11)로 검출한다. 광 검출기(11)로 검출한 산란 광 정보를 퍼스널 컴퓨터(10)로 보내어 산란 광을 발하는 세포의 크기를 산출한다. 산란 광 검출부(2)를 통과한 세포 현탁액은 제1 분리부(3)에 도달한다. 제1 분리부(3)에서는 퍼스널 컴퓨터(10)의 산출 결과가, 전방 산란 광 베이스로 일정한 산란 광 강도 이하의 세포(예를 들면 세포의 사이즈로 해서 거의 5㎛이하인 것)가 유하할 때, 퍼스널 컴퓨터(10)의 명령에 의해 전원(13)이 조작되어, 그 세포를 제1 폐기군의 세포로서 폐기 리저버(4)로 옮긴다. 한편, 제1 분리부(3)에서는 산란 광 강도가 큰 세포(예를 들면 세포의 사이즈로 해서 거의 5㎛를 초과하는 것)는 제1 정제 세포군의 세포로서 그대로 유하시킨다. 제1 폐기군의 세포가 제거된 세포 현탁액, 즉, 제1 정제 세포군의 세포를 포함하는 세포 현탁액은 화상 검출부(5)에 도달한다. 화상 검출부(5)에서는 소정의 광원(16)으로 광을 조사하고, 촬상 소자(12)에 의해 세포를 화상 데이터로서 퍼스널 컴퓨터(10)로 보내어 퍼스널 컴퓨터(10)로 화상 파라미터를 평가한다. 화상 검출부(5)를 통과한 세포 현탁액은 제2 분리부(6)에 도달한다. 제2 분리부(6)에서는 퍼스널 컴퓨터(10)의 평가 결과가 소정 조건에 있는 세포(예를 들면 세포의 긴 직경, 짧은 직경이 소정값 이하인 것)가 유하할 때, 퍼스널 컴퓨터(10)의 명령에 의해 전원(14)이 조작되어, 제2 폐기군의 세포로서 폐기 리저버(7)로 옮긴다. 한편, 제2 분리부(6)에서는 소정 조건에 있는 세포(예를 들면 세포의 긴 직경, 짧은 직경이 소정값을 초과하는 것)는 제2 정제 세포군의 세포로서 그대로 유하시켜 분리 리저버(8)에 의해 회수한다.
여기서 퍼스널 컴퓨터(10)에 의해 평가하는 화상 파라미터에 대해서 보다 구체적으로 설명한다. 광 검출기(11)가 검출하는 산란 광 정보에 대해서 보면, 세포 사이즈에 의존하는 전방 산란에 의존하는 파라미터로 분리하는 세포를 결정하는 방법, 세포 내의 미소 과립의 산란에 의존하는 측방 산란의 파라미터로 분리하는 세포를 결정하는 방법, 또는 단순히 산란에 의한 투과광량의 감쇠를 이용할 수 있다. 촬상 소자(12)에서 얻어지는 세포의 화상 파라미터에 대해서 보면, 화상 파라미터로서는 세포의 긴 직경, 짧은 직경, 화상 상에서의 투영 면적, 형상, 투과도, 세포 내 투명도 분포를 적절하게 조합하여 이용할 수 있다.
도 2는 실시예의 셀 소터 칩의 구성의 일례를 모식적으로 도시하는 평면도이다. 셀 소터 칩(100)은 기판(101)에 의해 구성되어 있다. 기판(101)의 하면에 마이크로유로를, 상면에 이 마이크로유로에 연통하는 개구를 형성하고, 시료나 필요한 완충액의 공급구로 한다. 또한 충분한 완충액의 공급과 각 마이크로유로의 완충액의 유량 조정을 위해 리저버를 형성한다. 마이크로유로의 작성은 PMMA 등의 플라스틱을 금형에 유입시키는 이른바 사출 성형으로 작성할 수 있다. 칩 기판(101) 전체의 사이즈는 20×40×1㎜(t)이다.
칩 기판(101)의 하면에 새겨진 홈이나 기판의 관통구멍을 마이크로유로나 웰의 형상으로 하기 위해서 홈이 새겨진 하면측에 0.1㎜ 두께의 라미네이트 필름이 열압착되어 있다. 개구수 1.4, 배율 100배의 대물 렌즈를 이용하여, 0.1㎜의 라미네이트 필름을 통해서 마이크로유로 내를 흐르는 세포를 관찰할 수 있다. 물론 이것보다 저 배율의 렌즈에서는 문제없이 관찰할 수 있다.
칩 기판(101)의 상면에는 마이크로유로에 세포를 포함하는 시료 완충액을 도입하는 구멍(201), 세포를 포함하지 않는 완충액을 도입하는 구멍(202, 203, 204, 205, 205', 206 및 206')이 형성됨과 함께, 이들을 포괄하는 리저버(210)가 형성된다. 시료를 포함하는 완충액을 도입하는 구멍(201)의 주변에는 세포를 포함하는 시료 완충액의 확산을 방지하기 위한 벽(211)이 형성되어 있다. 벽(211)의 높이는 리저버(210)의 벽보다도 낮다. 이들의 구멍(201, 202, 203, 204, 205, 205', 206 및 206')에는 마이크로유로(221, 222, 223, 224, 224', 225, 225')가 연통하고 있다. 따라서 리저버(210)에 벽(211)보다 높은 위치까지 충분한 완충액을 공급하면 구멍(201, 202, 203, 204, 205, 205', 206 및 206')은 완충액으로 연결된다. 또한 이들 구멍에 연통하고 있는 마이크로유로(221, 222, 223, 224, 224', 225, 225')에 완충액이 유입된다.
구체적으로는 후술하겠지만, 구멍(201)에 도입된 세포를 포함하는 시료 완충액은 마이크로유로(221)를 유하하여, 제1 세포 검출 영역(261)에서 세포가 제1 파라미터로 평가되고, 이 결과에 따라서 제1 세포 분리 영역(262)에서 분리된다. 분리된 한 쪽은 마이크로유로(219)를 유하하여 회수구멍(271)으로 흐른다. 분리된 다른 쪽은 마이크로유로(218)를 유하하여 제2 세포 검출 영역(310)에서 세포가 제2 파라미터로 평가되고, 이 결과에 따라서 제2 세포 분리 영역(320)에서 분리된다. 분리된 한쪽은 마이크로유로(330)를 유하하여 회수구멍(272)으로 흐른다. 분리된 다른 쪽은 마이크로유로(331)를 유하하여 회수구멍(273)으로 흐른다. 각각의 회수구멍은 각각의 리저버(281, 282 및 283)로 둘러싸여, 회수된 세포를 포함하는 시료 완충액의 확산을 방지함과 함께, 또한 이들을 포괄하는 리저버(284)가 형성된다. 리저버(284)는 세포를 포함하는 시료 완충액의 확산을 방지하기 위한 벽(271)이나 후에 기술하는 벽(282)이나 벽(283)의 높이보다도 높고, 분리 조작 전에 완충액은 벽(281, 282, 283)보다 높은 위치까지 채워져 있는데, 이 높이는 리저버(210)에 채워져 있는 완충액의 위치보다는 낮은 것이 된다.
도 3은 리저버(210) 영역의 구멍(201, 203 및 204)의 중심부를 통과하는 A-A 위치에서 화살표 방향으로 본 칩 기판(101)의 단면도이다. 기판(101)의 하면에 새겨진 홈은 라미네이트 필름(410)으로 막히고, 기판(101)의 구멍(201, 203 및 204)은 기판(101)의 상면에 개구된 웰이 되고, 홈은 기판(101)의 하면에 형성된 마이크로유로(221, 222 및 223)가 된다. 구멍(201, 203 및 204)은 마이크로유로(221, 222 및 223)와 연통하고 있다. 구멍(221)은 기판(101)의 상면에서 리저버(211)에 둘러싸임과 함께, 절구 형상의 구멍이 되고, 상면에 멤브레인 필터(411)가 설치되어 있다. 이것은 세포를 포함하는 시료 완충액의 세포를 마이크로유로(221)에 확실하게 도입함과 함께, 큰 먼지가 마이크로유로(221)에 유입되는 것을 방지하기 위해서이다. 다른 구멍과 마이크로유로의 관계는 도시는 생략하지만 마찬가지이다.
도 3에서 알 수 있듯이, 리저버(210)에는 충분한 완충액(200)이 공급되므로, 이것에 의해 구멍(201, 202, 203, 204, 205, 205', 206 및 206')에 연속해 있는 마이크로유로(221, 222, 223, 224, 224', 225, 225')에는 모두 같은 액면 높이의 완충액이 공급된다. 따라서 마이크로유로에 세포를 포함하는 시료 완충액을 도입하는 구멍(201), 세포를 포함하지 않는 완충액을 도입하는 구멍(202, 203, 204, 205, 205', 206 및 206')의 입구에는 동일한 액압이 걸린다. 이 때문에 마이크로유로폭(마이크로유로 높이를 동일하다고 한다면), 또는 단면적, 또한 양 마이크로유로의 유로 길이를 실질적으로 동일하게 하면, 양 마이크로유로의 유량을 실질적으로 동량으로 할 수 있다. 예를 들면 구멍(205, 205')에 연속해 있는 마이크로유로(224, 224')에는 같은 액면 높이의 완충액이 공급되어, 마이크로유로(224, 224')를 흐르는 완충액의 유량을 동일하게 할 수 있다. 이하의 설명에서는 각 부의 사이즈의 구체예를 나타낸다.
도 4의 (a), 도 4의 (b) 및 도 4의 (c)는 시료 세포의 도입부에 있어서의 연구를 설명하기 위해서 리저버(210) 영역의 구멍(202, 201) 및 필터(230)에 주목한 칩 기판(101)의 부분적인 단면도이다. 도 4의 (a)에서 알 수 있듯이, 마이크로유로(221)(폭 20㎛, 깊이 15㎛)는 구멍(201)보다도 상류에 위치하는 구멍(202)까지 연신되어 있다. 따라서 도 4의 (b)에 도시한 바와 같이 구멍(201)에 도입된 시료 세포(501)를 포함하는 시료 완충액은 구멍(202)으로부터 공급되는 세포를 포함하지 않는 완충액을 타고 마이크로유로(221)를 유하한다. 구멍(201)으로부터 공급되는 세포 용액의 흐름과 구멍(202)으로부터 공급되는 완충액의 흐름은 마이크로유로(221)의 구멍(201)보다 하류의 부위에서는 층류 상태가 되어 있다. 따라서 구멍(202)으로부터 공급되는 완충액의 흐름 층 위에 구멍(201)으로부터 공급되는 세포 용액층이 형성되기 때문에 세포는 마이크로유로의 바닥에 접하지 않고, 마이크로유로(221) 내를 세포가 순조롭게 유하한다. 마이크로유로(221)의 구멍(201)보다 하류의 부위에는 마이크로유로(221)의 눈 막힘을 방지하기 위해서 칩 중에 직접 미세 구조로서 조립된 필터(230)가 배치되어 있다. 도 4의 (c)는 개구부(201)로부터 유로(221)로 유입되는 세포가 라미네이트 필름(410)에 접촉하고, 그것이 원인이 되는 체류를 일으키고 있는 모습을 모식적으로 도시하는 것이다. 세포 하나가 라미네이트 필름(410)에 접촉하여 거기에 멈추는 일이 생기면 그것에 다른 세포가 걸려 차례대로 세포가 쌓이게 되어 결국은 세포의 유하가 정지해 버리게 된다.
필터(230)를 통과한 세포를 포함하는 시료 완충액은 마이크로유로(221)를 유하하여, 마이크로유로(224, 224')(폭 12㎛, 깊이 15㎛)를 유하하는 구멍(205, 205')에 도입된 세포를 포함하지 않는 완충액과 합류한다. 참조 부호 240은 합류 후의 마이크로유로(폭 20㎛, 깊이 15㎛)이고, 그 일부가 제1 세포 검출 영역(261)이 된다. 제1 세포 검출 영역(261)을 마이크로유로(221)와 마이크로유로(224, 224')를 합류시킨 마이크로유로(240)에 설정하는 이유는 도 5를 참조하여 후술한다.
제1 세포 검출 영역(261)의 하류에서, 마이크로유로(240)와, 구멍(203)에 도입된 세포를 포함하지 않는 완충액이 유하하는 마이크로유로(222)(폭 20㎛, 깊이 15㎛)가 합류하는 구조가 된다. 참조 부호 241은 합류 후의 마이크로유로(폭 40㎛, 깊이 15㎛)이고, 이 영역이 제1 세포 분리 영역(262)이 된다. 제1 세포 분리 영역(262)의 출구에서, 합류한 마이크로유로(241)는 마이크로유로(218(폭 20㎛, 깊이 15㎛) 및 219(폭 20㎛, 깊이 15㎛))로 분류된다. 제1 세포 분리 영역(262)에서는 마이크로유로(241)를 유하하는 완충액에 겔 전극이 접촉하고 있어, 겔 전극에 전압이 인가되었을 때, 세포에 작용하는 전기영동적인 힘과 마이크로유로(241) 내 를 흐르는 완충액으로부터 받는 힘의 합성 벡터에 의해서 세포를 분리한다. 제1 세포 분리 영역(262)의 구성과 세포 분리의 힘에 대해서도 도 5를 참조하여 설명한다.
도 5는 제1 세포 분리 영역(262) 근방의 상세 구조를 도시하는 도면이다. 시료 완충액이 마이크로유로(221)를 유하하여 마이크로유로(224, 224')와 합류함으로써, 도 5의 상부에 도시한 바와 같이 마이크로유로(221) 안을 잡연하게 유하해 온 세포(501)는, 합류 후의 마이크로유로(240)에서는 중앙부에 모인 형태가 되고, 또한 정연하게 배열된 형태로 유하한다. 그 이유를 도 6을 참조하여 설명한다.
도 6은 마이크로유로(221)를 유하하는 완충액이 마이크로유로(224, 224')를 유하하는 완충액에 의해서 중앙부로 밀어 붙여진 결과의 합류 후의 마이크로유로(221) 내의 세포 분포를 설명하는 도면이다. 도면에 있어서 참조 부호 259는 유로의 측벽이다. 즉, 폭 20㎛의 마이크로유로(221)를 유하하는 세포를 포함하는 완충액의 흐름이, 폭 12㎛의 마이크로유로(224, 224')를 유하하는 완충액의 흐름에 의해서 폭 20㎛의 마이크로유로(221)의 중앙부로 밀어 붙여지는 상황을, 횡축에 마이크로유로(221)의 위치, 종축에 세포의 출현 빈도로 도시하는 도면이다. 곡선(301)은 마이크로유로(224, 224') 각각을 유하하는 완충액이, 마이크로유로(221)를 유하하는 세포를 포함하는 완충액의 거의 절반, 즉, 마이크로유로(224, 224')의 유로폭이 마이크로유로(221)의 거의 절반인 경우에, 세포가 마이크로유로(221)의 중앙부의 거의 10㎛의 폭에 분포하는 것을 나타내고 있다. 곡선(302)은 마이크로유로(224, 224')의 유로폭이 보다 작은 경우의 세포 분포, 곡선(303)은 마이크로유로 (224, 224')를 형성하지 않는 경우의 세포 분포를 각각 나타낸다. 곡선(301)에서 분명한 바와 같이, 마이크로유로(224, 224')의 유로폭을 적절하게 설정함으로써 실질적으로 세포를 유로벽으로부터 거리를 두고 흐르게 할 수 있어 세포가 벽에 접근하는 것을 방지할 수 있다.
다시 도 5로 되돌아가 설명한다. 제1 세포 검출 영역(261)의 위치에서는, 따라서, 마이크로유로(221)를 유하하는 세포는 정연하게 늘어서서 마이크로유로(221)의 중앙부를 통과하게 되기 때문에 개개의 세포를 검출할 수 있게 되고, 보다 정확하게 세포의 파라미터를 평가할 수 있다.
제1 세포 검출 영역(261)의 하류에서는 마이크로유로(221)에 마이크로유로(224, 224')를 합류시킨 마이크로유로(240)에, 마이크로유로(222)(폭 20㎛, 깊이 15㎛)를 합류시켜 마이크로유로(241)(폭 40㎛, 깊이 15㎛)로 한다. 마이크로유로(222)에는 세포를 포함하지 않는 완충액이 구멍(203)으로 유입되고 있다. 여기서 마이크로유로(240)와 마이크로유로(222)의 유로폭을 같게 하고, 마이크로유로(241)의 폭을 이들의 2배로 했기 때문에, 마이크로유로(241)에서는 합류한 마이크로유로(240)와 마이크로유로(222)를 유하하는 완충액은 각각의 흐름의 층을 실질적으로 유지하여 유하한다. 따라서 도 6에 도시한 세포의 분포곡선(301)이 마이크로유로(222)의 유입하는 쪽으로 약간 넓어지는 경향을 나타내지만, 그다지 큰 변화는 없다.
마이크로유로(240)와 마이크로유로(222)의 합류점과 합류 후의 마이크로유로(241)의 영역은 제1 세포 분리 영역(262)이 된다. 여기서는 마이크로유로와 마찬가지로, 기판(101)의 하면에 형성되고, 내부가 전해질을 포함하는 겔로 채워진 폭 15㎛(마이크로유로를 따른 길이), 깊이 15㎛, 길이 20㎛ 정도의 액락 구조의 연결부(255 및 256)가 마이크로유로(240) 및 마이크로유로(222)의 각각의 측벽으로부터 유로 내에 개구하여, 전해질을 포함하는 겔이 마이크로유로를 유하하는 완충액과 직접 접촉한다. 겔과 마이크로유로를 유하하는 완충액이 접촉하는 면적은 15㎛이다. 연결부(255 및 256)는 도 5에 도시한 바와 같이, 연결부(255) 쪽이 연결부(256)보다 하류측이 되도록 이루어진다. 연결부(255 및 256)의 타단은 마찬가지로, 기판(101)의 하면에 형성된 폭 200㎛×높이 15㎛의 마이크로 구조(253 및 254)의 굴곡부에 연결되어 있다. 각각의 마이크로 구조(253 및 254)의 양단부에는 기판(101)의 상면에 연통하는 구멍(251, 251') 및 구멍(252, 252')(2㎜φ)이 형성되어 있다. 구멍(251, 251' 및 252, 252')은 전해질을 포함하는 겔을 도입하는 구멍이다. 구멍(251 및 252)으로부터 겔을 넣고 구멍(251' 및 252')으로 겔이 나올 때까지 겔을 넣음으로써, 도입된 겔은 기판(101) 하면의 마이크로 구조(253, 254) 및 액락 구조의 연결부(255 및 256)는 전해질을 포함하는 겔로 채워진다.
겔을 도입하는 구멍(251 및 252)에는 검은 원으로 나타내는 전극(257, 258)이 삽입되고, 이들 전극은 도 1에서 설명한 전원(13)에 접속된다. 전극 사이에는 제1 세포 검출 영역(261)에서 검출된 세포가 연결부(255, 256) 사이를 유하하는 타이밍에서 퍼스널 컴퓨터(10)가 공급하는 신호에 의해 완충액에 전압이 인가된다.
제1 세포 분리 영역(262)에서 완충액에 겔이 접촉하는 연결부(255, 256)는 전술한 바와 같이 연결부(256) 쪽이 연결부(255)보다 상류에 위치하는 구조로 되어 있다. 구멍(252)의 전극(258)에 플러스, 구멍(251)의 전극(257)에 마이너스의 전압을 걸었을 때에, 마이크로유로(240)를 유하해 오는 세포를 마이크로유로(218)에 효율적으로 이동시킬 수 있다. 왜냐하면 전류를 흘렸을 때에 마이너스로 챠지(charge)하고 있는 세포는 전기영동적인 힘이 작용하여, 이 힘과 마이크로유로 내를 흐르는 완충액으로부터 받는 벡터와 전기영동적 힘의 벡터의 합성 벡터가 되기 때문이다. 이것에 의해 액락부(255와 256)를 마이크로유로의 흐름에 대해서 동 위치(흐름 선의 대상 위치)에 작성한 경우에 비해 효율이 좋은 전계 이용이 가능해져, 보다 저전압으로 세포의 마이크로유로(218) 또는 마이크로유로(219)로의 이동이 안정된 상태에서 가능하게 된다. 마이크로유로(219)의 하류부에는 제1 세포 분리 영역(262)에서 나누어진 세포의 회수구멍(271)이 뚫려 있다. 구멍(271)에는 회수된 세포를 포함하는 시료 완충액의 확산을 방지하기 위한 벽(281)이 형성된다.
도 2로 되돌아가 설명한다. 제1 세포 분리 영역(262)에서 마이크로유로(218)로 이동시켜진 세포는 제2 세포 검출 영역(310)으로 유하한다. 이 과정에서 마이크로유로(218)에는 앞서 설명한 마이크로유로(240)와 마찬가지로 리저버(210)에 형성된 구멍(206, 206')으로 유입되는 세포를 포함하지 않는 완충액을 공급하는 2개의 측로인 마이크로유로(225, 225')(폭 12㎛, 깊이 15㎛)와 합류한다. 그 결과, 합류 후의 마이크로유로(300)는 마이크로유로(240)와 마찬가지로 세포의 흐름이 보다 정연한 것으로 됨과 함께 제2 세포 검출 영역(310)으로서 이용된다. 또한 제2 세포 검출 영역(310)의 하류측에는 제2 세포 분리 영역(320)이 형성되는데, 여기서는 제1 세포 분리 영역(262)과 마찬가지로 마이크로유로(300)에는 리저버(210) 에 형성된 구멍(204)으로 유입되는 세포를 포함하지 않는 완충액을 공급하는 마이크로유로(223)(폭 20㎛, 깊이 15㎛)와 합류해서 마이크로유로(340)(폭 40㎛, 깊이 15㎛)가 된다.
제2 세포 분리 영역(320)은 제1 세포 분리 영역(262)과 마찬가지로 합류한 마이크로유로(340)의 출구에서, 마이크로유로(330(폭 20㎛, 깊이 15㎛) 및 331(폭 20㎛, 깊이 15㎛))로 분류되는데, 여기서도 마이크로유로와 마찬가지로 기판(101)의 하면에 형성되고, 내부가 전해질을 포함하는 겔로 채워진 폭 15㎛(마이크로유로를 따른 길이), 깊이 15㎛, 길이 20㎛ 정도의 액락 구조의 연결부(355 및 356)가 마이크로유로(300) 및 마이크로유로(223)의 각각의 측벽으로부터 유로 내에 개구하여 전해질을 포함하는 겔이 마이크로유로를 유하하는 완충액과 직접 접촉한다.
도 7은 제2 세포 분리 영역(320) 근방의 상세 구조를 도시하는 도면인데, 실질적으로 도 5에 도시한 제1 세포 분리 영역(262)의 구조와 같다. 즉, 구멍(351, 351' 및 352, 352')은 전해질을 포함하는 겔을 도입하는 구멍이다. 구멍(351 및 352)으로부터 겔을 넣고 구멍(351' 및 352')으로 겔이 나올 때까지 겔을 넣음으로써, 도입된 겔은 기판(101)의 하면의 마이크로 구조(353, 354) 및 액락 구조의 연결부(355 및 356)는 전해질을 포함하는 겔로 채워진다. 마이크로 구조(353, 354)의 굴곡부는 마이크로유로(300)와, 참조 부호 300과 참조 부호 223의 경계선 근방과의 사이에서 20㎛ 정도의 길이의 액락 구조의 연결부(355, 356)로 되어 있어, 세포 분리 영역(320)에 있어서, 마이크로유로(340)와 마이크로유로(223)의 합류한 마이크로유로(340) 근방을 흐르는 완충액에 겔이 직접 접촉할 수 있는 구조가 된다. 겔과 완충액이 접촉하는 면적은 15㎛(마이크로유로를 따른 길이)×15㎛(높이)이다. 겔을 도입하는 구멍(351 및 352)에는 검은 원으로 나타내는 전극(357, 358)이 삽입되고, 전극 사이에는 제2 세포 검출 영역(310)에서 검출된 세포가 연결부(355, 356) 사이를 유하하는 타이밍에서 퍼스널 컴퓨터(10)가 공급하는 신호에 의해 완충액에 전압이 인가된다.
제2 세포 분리 영역(320)에서 마이크로유로(340)를 흐르는 완충액에, 겔이 접촉하는 연결부(355와 356)는 제1 세포 분리 영역(262)과 마찬가지로 연결부(356) 쪽이 마이크로유로의 상류에 위치하는 구조로 되어 있다. 구멍(352)의 전극(358)에 플러스, 구멍(351)의 전극(357)에 마이너스의 전압을 걸었을 때에, 마이크로유로(300)를 흘러 오는 세포를 마이크로유로(331)로 효율적으로 이동시킬 수 있다. 즉 전류를 흘렸을 때에 마이너스로 챠지하고 있는 세포는 전기영동적인 힘이 작용하여, 이 힘과 마이크로유로 내를 흐르는 완충액으로부터 받는 벡터와 전기영동적 힘의 벡터의 합성 벡터가 되기 때문이다. 이것에 의해 액락부(355와 356)를 마이크로유로의 흐름에 대해서 동 위치(흐름 선의 대상 위치)에 작성한 경우에 비해 효율이 좋은 전계 이용이 가능해져, 보다 저전압으로 세포의 마이크로유로(330) 또는 마이크로유로(331)로의 이동이 안정된 상태에서 가능하게 된다.
제2 세포 분리 영역(320)에서는 제1 세포 분리 영역(262)에서 개괄적으로 한 시료 완충액 중의 세포가 제2 세포 검출 영역(310)에서, 제1 세포 검출 영역(261)과는 상이한 파라미터로 평가되어 분리된다. 따라서 마이크로유로(330, 331)를 유하하는 세포는 도 7에 도시한 바와 같이, 보다 엄밀하게 분리된 것이 된다.
마이크로유로(330, 331)의 하류부에는 도 2에서 설명한 바와 같이, 나누어진 세포의 회수구멍(272와 273)이 각각 뚫려 있다. 구멍(272 및 273)에는 회수된 세포를 포함하는 시료 완충액의 확산을 방지하기 위한 벽(282, 283)이 형성된다. 벽(282, 283)은 벽(281)과 함께, 또한 이들을 포괄하는 리저버(284)에 의해서 둘러싸인다. 리저버(284)는 세포를 포함하는 시료 완충액의 확산을 방지하기 위한 벽(271), 벽(282), 벽(283)의 높이보다도 높고, 분리 조작 전에 완충액은 벽(281, 282, 283)보다 높은 위치까지 채워져 있는데, 이 높이는 리저버(210)에 채워져 있는 완충액의 위치보다는 낮은 것이 된다.
여기서 각 마이크로유로를 흐르는 액의 구동력에 대해서 기술한다. 본 발명에서는 세포 분리 칩만으로 모든 마이크로유로의 송액을 행할 수 있도록 연구하고 있다. 본 발명에서는 리저버간의 액면의 높이의 차이에 의해 송액을 행하고 있다. 즉, 리저버(210)의 완충액의 액위는 리저버(284)의 그것보다도 높기 때문에, 이 낙차가 마이크로유로를 흐르는 완충액 이동의 구동력이 됨과 함께 맥동이 없는 안정된 흐름을 만들어 낸다. 리저버(210)의 완충액의 저장량을 충분히 큰 것으로 해 놓으면, 구멍(201)에 도입된 세포를 포함하는 시료 완충액을, 모두 마이크로유로(221)에 유입시킬 수 있다. 제1 세포 분리 영역(262)과 제2 세포 분리 영역(320)에 공급되는 액은, 모두 동일한 리저버(210)로부터 액이 공급되고, 송액의 구동력은 리저버(210)와 리저버(284)의 액면 높이의 차에 기인한다. 이 때문에 각 마이크로유로의 입구(201, 202, 203, 204, 205, 205', 206, 206')에 걸리는 압력은 같아지고 안정된 송액이 세포 분리 칩만으로 가능하게 된다.
실시예에서는 제1 세포 분리 영역(261)과 제2 세포 분리 영역(320)이 순차적으로 연결된 2단의 세포 분리를 행하는 칩에 대해서 설명했는데, 3단 이상의 다단으로 해도 액을 공급하는 쪽의 리저버를 공통으로 하고, 또한 액 회수측의 리저버도 공통으로 하고, 액 공급측과 회수측의 리저버의 액면의 차를 이용해서 모든 송액을 행하는 것으로 하면, 안정된 다단의 세포 분리용 칩을 실현할 수 있다.
도 8은 제1 세포 분리 영역(262)에서 세포를 분리하기 위한 정보를 얻는 제1 세포 검출 영역(261)이, 전방 산란이나 투과광의 감쇠에 의해서 세포의 정보를 얻는 경우의 산란 광 검출부를 설명하는 도면이다. 도 8에 있어서, 레이저원(510)으로부터 발해진 레이저는 광 파이버(511)를 통해서 콜리메이트 렌즈계(512)에서 레이저 빔(513)으로서 기판(101)의 상방으로부터 제1 세포 분리 영역(261)의 마이크로유로(240)에 조사된다. 기판(101)과 라미네이트 필름(410)은 파장 400㎚ 내지 700㎚ 사이의 이른바 가시광을 투과할 수 있기 때문에, 조사된 레이저 빔(513)이 마이크로유로(240)를 유하하는 세포에 의해서 산란된다. 직진하는 레이저 빔(513)은 스토퍼(514)로 차광되고, 세포에 의한 산란 광(515)이 집광 렌즈(516)로 집광되어, 핀홀(517)을 통과하여 배광이 제거된 후, 포토 다이오드 광 검출기(518)로 검출된다. 포토 다이오드 광 검출기는 산란 광 강도를 측정하는 것이나, 링 형상의 포토 다이오드 어레이 광 검출기로 산란 광의 각도를 측정하는 것의 어느 것이나 이용할 수 있다. 후자 쪽이 세포의 사이즈를 측정하는 데에 있어서 유리하지만, 제1단의 세포 분리가 대략적인 세포 분리를 목표로 하는 것이기 때문에, 단순히 산란 광 강도를 측정할 수 있는 염가의 포토 다이오드도 상관없다.
도 9는 제1 세포 분리 영역(262)에서 세포를 분리하기 위한 정보를 공급하는 제1 세포 검출 영역(261)이, 측방 산란 광에 의해 세포의 정보를 얻는 경우의 측방 산란 광 검출부를 설명하는 도면이다. 이 예에서는 레이저원(701)으로서, 파장 514㎚의 YAG 레이저나 파장 488㎚의 아르곤 레이저를 이용할 수 있어, 기판(101)의 측면으로부터 콜리메이트 렌즈(702)에서 빔 광으로서 조사한다. 빔 광은 기판(101) 안을 직진하고, 제1 세포 인식부(261)의 마이크로유로(240)를 유하하는 세포에 의해서 산란된다. 마이크로유로(240) 내에 세포가 흘러 오지 않을 때를 산란 광의 베이스로 한다. 세포가 레이저광을 가로지르면 광 산란이 일어나고, 산란 광(703)이 집광 렌즈계(704)에 의해 광전자 증배관(705)에 도달하여 산란 광 강도로서 측정된다.
이러한 측방 산란계에서는 보다 작은 사이즈의 입자 측정이 가능하기 때문에, 세포의 내부 구조의 차이에 의해 산란 광 강도가 변화한다. 이 때문에 전방 산란과는 차이가 나는 파라미터로 세포를 식별 분리할 수 있다.
도 10은 제2 세포 분리 영역(320)에서 세포를 분리하기 위한 정보를 공급하는 제2 세포 검출 영역(310)이, 세포 정보를 화상 정보로서 얻는 화상 검출부의 구성의 일례를 설명하는 도면이다. 제2 세포 검출 영역(310)의 마이크로유로(300)를 유하하는 세포는, 콜드 밀러가 부착된 할로겐 램프(520)로부터의 광을 위상차 링(521)과 콘덴서 렌즈(522)를 통해서 조사한다. 세포를 투과한 광은 위상차 대물 렌즈(523)를 이용해서 고속 카메라(524)의 촬상 소자에 결상한다. 고속 카메라(524)의 촬상 소자에 얻어진 화상 신호는 퍼스널 컴퓨터(10)로 보내진다.
도 11은 제2 세포 분리 영역(320)에서 세포를 분리하기 위한 정보를 공급하는 제2 세포 검출 영역(310)이, 세포 정보를 세포의 형광상으로서 얻는 화상 검출부의 구성의 일례를 설명하는 도면이다. 이 경우에는 수은 램프 광원(530)으로부터의 광을 다이클로익 미러(531)로 여기 광 파장 밴드로 하고, 집광 렌즈(523)를 이용해서 제2 세포 검출 영역(310)의 마이크로유로(300)를 유하하는 세포에 조사하여 형광 여기한다. 세포로부터 발해지는 형광상은 대물 렌즈(523)를 이용해서 집광하고, 필터(532)로 형광 성분으로만 해서 고속 카메라(524)로 촬상한다.
제2 세포 분리 영역(320)에서의 세포 분리에서는 세포의 형상을 파라미터로 분류를 행하기 때문에, 제2 세포 검출 영역(310)은 제1 세포 검출 영역(261)보다도 고정밀의 분류가 가능하도록 화상 인식을 이용하기 때문에, 너무 다량의 세포를 취급할 수 없다. 즉, 처리할 수 있는 세포수는 카메라의 프레임 레이트와 그 후의 실시간 화상 처리 디바이스의 성능에 의존한다. 그러나 예를 들면, 제2 세포 검출 영역(310)에서 사용하는 고속 카메라(524)는 매초 500프레임을 촬상할 수 있는 CCD 타입의 카메라를 이용해서, 실질적으로 매초 500프레임의 처리가 가능한 디바이스를 이용하는 것으로 하면, 1000세포/초 이상의 세포의 형상 판단은 가능하다. 그러나 이 숫자는 제1 세포 검출 영역(261)을 산란 광 베이스의 세포 인식으로서 분리하는 것과 비교하면 한자릿수 적다. 이것은 제1단째에서 대략적인 세포 분리를 실시하고, 제2단에서 보다 고정밀의 분리를 행하는 본 발명의 2단 구성의 셀 소터 칩 구성의 메리트가 큰 것을 의미한다.
또한 도 8에서 설명한 전방 산란 광 검출에 의한 세포 검출과, 도 9에서 설 명한 측방 산란 광 검출에 의한 세포 검출은, 어느 것이나 대량의 세포를 단시간으로 평가할 수 있기 때문에, 사이즈가 유사한 세포군의 분리에 대해서는 제1 세포 검출 영역(261), 제2 세포 검출 영역(310)의 각각에 전방 산란 광 검출에 의한 세포 검출, 측방 산란 광 검출을 적용함으로써, 다량의 세포군의 분리를 효율적이고, 또한 고정밀도로 처리할 수 있다.
또한 제1단째에서 대략적인 세포 분리를 행하는 방법으로서는 산란 광에 의한 방법뿐만 아니라, 형광 강도에 의한 것으로 하여도 된다. 형광 강도 측정에는 당연한 일이지만 세포를 미리 형광 표식해 둘 필요가 있다. 형광 표식에는 DAPI와 같은 색소에 의한 핵 염색이나 형광 표식 항체를 이용하는 세포 표면 항원의 형광 표식과 같은 기존의 방법을 들 수 있다. 검출에는 도 12에서 나타낸 광학계를 이용한다. 이 경우에는 레이저광원(830)으로부터의 광을 다이클로익 미러(831)로 반환시키고, 렌즈(823)를 이용해서 제2 세포 검출 영역(310)의 마이크로유로(300)를 유하하는 세포에 조사하여 형광 여기한다. 세포로부터 발해지는 형광은 렌즈(823)를 이용해서 집광하여, 다이클로익 미러(831)와 필터(832)로 형광 성분으로만 해서 슬릿(833)으로 미광을 커트하고, 광전자 증배관(834)을 이용해서 검출한다. 필요한 세포를 선별하여 제2단째의 분리를 행하는데, 이 경우에는 제2단째의 고정밀의 분리는 도 10에 도시한 세포 정보를 화상 정보로서 얻는 화상 검출하는 방법이나, 도 11에 도시한 세포의 형광상을 검출하는 방법에 의해 행하는 것이 좋다.
(분리예)
적혈구와 심근 세포의 혼합 현탁 시료를 본 발명에 의해서 분리하는 예에 대 해서 설명한다.
표 1은 적혈구와 심근 세포(배양세포)의 혼합물을 시료 세포 현탁액으로 하고, 각 처리 공정에서 얻어지는 세포의 내역을 나타내는 표이다.
Figure 112006008950800-pat00001
혼합 현탁 시료액은 적혈구가 1×105개/100㎕, 심근 세포가 1×103개/100㎕,그 밖의 세포(형상으로는 구별이 되지 않는 세포, 또는 먼지)가 2.1×103개/100㎕이고, 토탈 50㎕를 구멍(201)에 넣었다. 제1 세포 검출 영역(261)에 도 8에서 설명한 전방 산란 광 검출에 의한 세포 검출, 제2 세포 검출 영역(310)에 도 10 또는 도 11에서 설명한 화상 처리에 의한 세포 검출을 적용하여, 이 혼합 현탁 시료액의 세포 분리를 실행했다.
제1 분리부(3)에서는 편평한 형상으로 사이즈가 큰 적혈구 쪽이 산란 광이 크고, 구형의 배양 심근 세포는 그다지 산란하지 않는 것에 착안하여, 심근 세포를 거의 회수할 수 있도록, 제1 세포 검출 영역(261)의 산란 광 검출의 임계값을 설정함으로써 적혈구와 심근 세포로부터 심근 세포를 농축할 수 있다. 그 결과, 제1 분리부(3)에서는 적혈구에 대해서 제1 정제 세포군으로서 1.2×104개/100㎕, 제1 폐기군으로서 8.7×104개/100㎕의 분리, 심근 세포에 대해서 제1 정제 세포군으로서 0.93×103개/100㎕, 제1 폐기군으로서 0.07×103개/100㎕의 분리, 그 밖의 세포에 대해서 제1 정제 세포군으로서 0.3×103개/100㎕, 제1 폐기군으로서 2.7×103개/100㎕의 분리의 결과를 얻었다. 즉, 심근 세포 0.93×103/100㎕와 적혈구 1.2×104/100㎕, 그 밖의 세포 0.3×103/100㎕의 혼합현탁액을 얻을 수 있고, 심근 세포를 농축할 수 있었다.
제1 분리부(3)의 세포 분리에서는 세포를 대략적으로밖에 분리할 수 없기 때문에, 상기의 결과에는 적혈구도 다량으로 포함되어 있고, 그 밖의 세포도 남아 있다. 적혈구에 대한 심근 세포의 비는 약 8배로 농축되어 있지만, 아직 13배의 적혈구가 남아 있다.
제2 분리부(6)에서는 제1 분리부(3)로부터 얻어지는 혼합현탁액에 대해서 제2 세포 검출 영역(310)에 화상 처리에 의한 세포 검출을 적용하여 세포 분리를 행한다. 그 결과, 적혈구에 대해서 제2 정제 세포군으로서 0.01×103개/100㎕, 제2 폐기군으로서 1.1×104개/100㎕의 분리, 심근 세포에 대해서 제2 정제 세포군으로서 0.78×103개/100㎕, 제2 폐기군으로서 0.11×103개/100㎕의 분리, 그 밖의 세포에 대해서 제1 정제 세포군으로서 0개/100㎕, 제2 폐기군으로서 1.3×103개/100㎕의 분리의 결과를 얻었다. 즉, 적혈구의 콘터미네이션을 1% 정도까지 낮춘 심근 세포를 얻을 수 있다.
본 발명에 의해 다량의 세포를 효율적으로 고정밀도로 분리 처리할 수 있고, 1 내지 2만 세포/초의 처리를 실현하는 다량세포의 분리가 가능한 일회용형의 세포 분리 칩을 실현할 수 있다.

Claims (11)

  1. 평면 기판에 형성되는 마이크로유로로 이루어지는 셀 소터로서, 상기 마이크로유로를 유하하는 시료 완충액에 포함되는 세포군을 제1 파라미터에 기초하여 2개의 군으로 분리하는 제1 분리부와, 그 제1 분리부에서 분리한 세포군을 제2 파라미터로 분리하는 제2 분리부를 캐스케이드로 형성함과 함께, 상기 시료 완충액의 유하는 상기 마이크로유로의 양단부의 완충액의 액위차에 의한 것인 것을 특징으로 하는 셀 소터 칩.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 파라미터가 세포에 광을 조사해서 얻어지는 세포의 산란 광 내지 형광 정보에 의한 것이고, 상기 제2 파라미터가 세포의 화상에 의한 것인 것을 특징으로 하는 셀 소터 칩.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제1 파라미터가 세포에 광을 조사해서 얻어지는 세포의 전방 산란 광 검출 내지 측방 산란 검출 내지 형광 검출 중 어느 하나에 의한 것이고, 상기 제2 파라미터가 세포에 광을 조사해서 얻어지는 세포의 전방 산란 광 검출 내지 측방 산란 검출 내지 형광 검출 중 제1 파라미터로 사용하지 않은 것에 의한 것인 것을 특징으로 하는 셀 소터 칩.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 제1 파라미터가 세포에 광을 조사해서 얻어지는 세포의 형광 정보에 의한 것이고, 상기 제2 파라미터가 세포의 형광 화상에 의한 것인 것을 특징으로 하는 셀 소터 칩.
  5. 기판, 그 기판 위에 구성되는 세포를 포함하는 시료 완충액을 유하시키기 위한 제1 마이크로유로, 그 제1 마이크로유로를 사이에 두고 그 제1 마이크로유로의 양측으로부터 세포를 포함하지 않는 완충액을 유하시키는 제2 및 제3 마이크로유로, 상기 제1 마이크로유로의 완충액과 제2 및 제3 마이크로유로의 완충액이 합류해서 1개의 마이크로유로가 되어 완충액을 유하시키는 제4 마이크로유로, 그 제4 마이크로유로에 형성된 상기 완충액과 함께 유하하는 세포를 검출하는 제1 세포 검출 영역, 상기 제4 마이크로유로에 합류하는 완충액을 유하시키는 제5 마이크로유로, 상기 제4 마이크로유로와 상기 제5 마이크로유로가 합류해서 1개의 마이크로유로가 되어 완충액을 유하시키는 제6 마이크로유로, 상기 제4 마이크로유로와 상기 제5 마이크로유로가 합류해서 상기 제6 마이크로유로를 형성하는 부분에 형성된 제1 세포 분리 영역, 그 제1 세포 분리 영역에서 분리된 세포를 유하시키는 상기 제6 마이크로유로로부터 분기된 제7 및 제8 마이크로유로, 상기 제7 마이크로유로를 사이에 두고 상기 제7 마이크로유로의 양측으로부터 세포를 포함하지 않는 완충액을 유하시키는 제9 및 제10 마이크로유로, 상기 제7 마이크로유로의 완충액과 상기 제 9 및 상기 제10 마이크로유로의 완충액이 합류해서 1개의 마이크로유로가 되어 완충액을 유하시키는 제11 마이크로유로, 그 제11 마이크로유로에 형성된 상기 완충액과 함께 유하하는 세포를 검출하는 제2 세포 검출 영역, 상기 제11 마이크로유로에 합류하는 완충액을 유하시키는 제12 마이크로유로, 상기 제11 마이크로유로와 상기 제12 마이크로유로가 합류해서 1개의 마이크로유로가 되어 완충액을 유하시키는 제13 마이크로유로, 상기 제11 마이크로유로와 상기 제12 마이크로유로가 합류해서 상기 제13 마이크로유로를 형성하는 부분에 형성된 제2 세포 분리 영역, 해당 제2 세포 분리 영역에서 분리된 세포를 유하시키는 상기 제13 마이크로유로로부터 분기된 제14 및 제15 마이크로유로를 구비하고, 상기 제1 세포 검출 영역이 세포를 검출하는 파라미터와, 상기 제2 세포 검출 영역이 세포를 검출하는 파라미터가 상이한 것으로 됨과 함께, 상기 제1 세포 분리 영역은 상기 제1 세포 검출 영역이 제공하는 정보에 따라서 세포를 분리하고, 상기 제2 세포 분리 영역은 상기 제2 세포 검출 영역이 제공하는 정보에 따라서 세포를 분리하는 것이고, 상기 제1 마이크로유로로부터 상기 제15 마이크로유로를 유하하는 완충액이 공통의 액면 위치를 갖는 리저버로부터 공급되는 것을 특징으로 하는 셀 소터 칩.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 제1 세포 검출 영역이 세포를 검출하는 파라미터가 세포에 광을 조사해서 얻어지는 세포의 산란 광 내지 형광 정보에 의한 것이고, 상기 제2 세포 검출 영역이 세포를 검출하는 파라미터가 세포의 화상에 의한 것인 것을 특징으로 하는 셀 소터 칩.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 제1 세포 검출 영역이 세포를 검출하는 파라미터가 세포에 광을 조사해서 얻어지는 세포의 전방 산란 광 검출 내지 측방 산란 검출 내지 형광 검출 중 어느 하나에 의한 것이고, 상기 제2 세포 검출 영역이 세포를 검출하는 파라미터가 세포에 광을 조사해서 얻어지는 세포의 전방 산란 광 검출 내지 측방 산란 검출 내지 제1 파라미터로 사용하지 않은 것에 의한 것인 것을 특징으로 하는 셀 소터 칩.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 제1 세포 검출 영역이 세포를 검출하는 파라미터가 세포에 광을 조사해서 얻어지는 세포의 형광 정보에 의한 것이고, 상기 제2 세포 검출 영역이 세포를 검출하는 파라미터가 세포의 형광 화상에 의한 것인 것을 특징으로 하는 셀 소터 칩.
  9. 제5항에 있어서,
    상기 제8 마이크로유로, 상기 제14 마이크로유로 및 상기 제15 마이크로유로의 하류 단부에 각각 독립된 벽으로 둘러싸인 회수구멍이 형성되고, 이들 회수구멍을 둘러싸는 리저버가 형성됨과 함께, 그 리저버의 완충액위가, 상기 제1 마이크로유로로부터 상기 제15 마이크로유로를 유하하는 완충액의 공통의 액면 위치를 갖는 리저버의 공통의 액면 위치보다 저 위치에 있는 것을 특징으로 하는 셀 소터 칩.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 세포 분리 영역 및 제2 세포 분리 영역은 마이크로유로의 양측에 대향하고, 또한 완충액의 흐름에 대해서 위치를 어긋나게 하여 배치된 전해질을 포함하는 겔을 포함하는 두 개의 겔 전극의 개구부를 구비하고, 상기 두 개의 겔 전극 사이에 소정의 전류를 흘린 경우와 흘리지 않는 경우에 따라서 겔 전극 사이를 통과하는 세포가 상기 세포 분리 영역의 하류의 두 개의 마이크로유로로 분배되는 것을 특징으로 하는 셀 소터 칩.
  11. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 마이크로유로에는 시료 완충액에 포함되는 먼지의 유하를 저지하기 위한 필터가 구비되는 것을 특징으로 하는 셀 소터 칩.
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