KR100743640B1

KR100743640B1 - 신규한 사이토킨 ｚａｌｐｈａ 11 리간드

Info

Publication number: KR100743640B1
Application number: KR1020017011499A
Authority: KR
Inventors: 줄리아 이. 노박; 스콧 알. 프레스넬; 신디 에이. 스프레셔; 도날드 시. 포스터; 리차드 디. 홀리; 제인 에이. 그로스; 자넷 브이. 존스톤; 앤드류 제이. 넬슨; 스타세이 알. 딜론; 안젤라 케이. 하몬드
Original assignee: 지모제넥틱스, 인코포레이티드
Priority date: 1999-03-09
Filing date: 2000-03-09
Publication date: 2007-07-27
Anticipated expiration: 2020-03-09
Also published as: CN102406937A; EP2295577A3; IL145288A; IL207424A; WO2000053761A2; EP1881070A3; EP1881070B1; DE60036930T2; JP2002537839A; CN1927883B; CA2366921C; HUP0200418A2; MXPA01009074A; AU777842B2; CN100500846C; CN1827639A; EP1165791B1; IL145288A0; ZA017370B; DK1165791T3

Abstract

본 발명은 zalpha11 리간드 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 분자에 관한 것이다. zalpha11 리간드는 신규한 사이토킨이다. 폴리펩티드는 시험관내 및 생체내에서 조혈 세포의 증식 및/또는 발생을 자극하기 위한 방법내에서 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 단백질의 제조 방법, 그것의 사용 및 그것에 대한 항체를 포함한다.

사이토킨, 조혈 세포, 단백질, 항체

Description

신규한 사이토킨 ＺＡＬＰＨＡ 11 리간드{NOVEL CYTOKINE ZALPHA11 LIGAND}

다핵세포 유기체의 세포의 증식 및 분화는 호르몬 및 폴리펩티드 성장 인자들에 의하여 조절된다. 이들 확산성 분자들은 세포가 상호 소통하고 협력하여 세포, 조직 및 기관을 형성하고, 손상된 조직을 수복하는 것을 가능하게 한다. 그러한 호르몬 및 성장 인자들의 실예로는 스테로이드 호르몬 (예컨대 에스트로겐, 테스토스테론), 부갑상선 호르몬, 난포 자극 호르몬, 인터류킨, 혈소판 유도된 성장 인자 (PDGF), 표피 성장 인자 (EGF), 과립구-마크로파지 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 에리트로포이에틴 (EPO) 및 칼시토닌이 있다.

호르몬과 성장 인자들은 리셉터에 결합함으로써 세포 대사에 영향을 미친다. 리셉터는 세포내에 있는 신호화 경로에 결합된 통합 멤브레인단백질, 예컨대 2차 메신저 시스템일 수 있다. 다른 부류의 리셉터들은 가용성 분자, 예컨대 전사 인자들일 수 있다.

사이토킨은 일반적으로 조혈 계통의 세포의 증식 또는 분화를 자극하거나 또는 신체의 면역 및 염증 반응 메카니즘에 관여한다. 조혈작용에 영향을 미치는 사이토킨의 실예로는 적혈구의 발생을 자극하는 에리트로포이에틴 (EPO); 거대핵세포 계통의 세포의 발생을 자극하는 트롬보포이에틴 (TPO); 및 호중구의 발생을 자극하 는 과립구-콜로니 자극 인자 (G-CSF)가 있다. 이들 사이토킨은 빈혈, 혈소판 감소증, 및 뉴트로페니아에 걸려있는 환자들 또는 암 때문에 화학요법을 받고 있는 환자들에서 정상적인 혈구 수준을 회복시키는데 유용하다.

인터류킨은 염증을 포함하는 면역 반응을 중재하는 사이토킨의 한 패밀리이다. 인터류킨은 여러가지의 염증성 병리를 중재한다. 면역 반응에서의 중심은 많은 사이토킨 및 항원에 대한 적응 면역성을 생성하는 T 세포이다. T 세포에 의해 생성된 사이토킨은 제 1 부류 및 제 2 부류로 분류된다 (Kelso,A. Immun. Cell Biol. 76:300-317, 1998). 제 1 부류의 사이토킨으로는 IL-2, IFN-γ, LT-α가 있으며, 염증성 반응, 바이러스 면역성, 세포내 기생충 면역성 및 동종이식 거부반응에 연루된다. 제 2 부류의 사이토킨으로는 IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 및 IL-13가 있으며, 체액 반응, 윤충 면역성 및 알레르기성 반응에 연루된다. 제 1 부류와 제 2 부류가 공유하고 있는 사이토킨으로는 IL-3, GM-CSF 및 TNF-α가 있다. 제 1 부류 및 제 2 부류 생성 T 세포 집단이 상이한 종류의 염증 조직으로 차별적으로 이동한다는 것을 시사하는 어떤 증거가 있다.

성숙한 T 세포들은 항원 또는 다른 자극에 의해 활성화되어, 예를 들어 T 세포 집단의 운명에 더욱 영향을 미치는 사이토킨, 생화학적 신호화 분자 또는 리셉터를 생성할 수 있다.

B 세포들은 B 세포 리셉터 및 다른 부속 분자들을 포함하는 그것들의 세포 표면에서 리셉터에 의하여 활성화되어, 부세포 기능, 예컨대 사이토킨의 생성을 수행할 수 있다.

자연 살생 (NK) 세포들은 T 세포 및 B 세포와 공통적인 프로게니터 세포를 가지고 있으며 면역 감시에서 어떤 역할을 한다. 15%까지의 혈액 림프구로 이루어지는 NK 세포는 항원 리셉터를 발현시키지 않고, 따라서 표적 세포에 결합하기 위한 필요조건인 MHC 인식을 사용할 수 없다. NK 세포는 어떤 종양 세포 및 바이러스성 감염 세포의 인식 및 살생에 연루된다. 생체내에서 NK 세포는 활성화가 필요하다고 여겨지지만, 시험관내에서 NK 세포는 활성화 없이 어떤 종류의 종양 세포를 죽이는 것으로 알려져 있다.

사이토킨 패밀리의 증명된 생체내 활성은 다른 사이토킨, 사이토킨 아고니스트 및 사이토킨 길항제의 막대한 임상적 잠재성 및 필요성을 예시한다. 본 발명은 조혈 세포 계통의 세포를 자극하는 신규한 사이토킨뿐만 아니라, 관련 조성물 및 방법을 제공함으로써 이들 필요성을 다룬다.

본 발명은 본원에 교시한 바로부터 당업자에게 명백해야 하는 이들 및 다른 사용을 위한 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명을 상세하게 설명하기 전에, 다음의 용어들을 규정하는 것이 발명의 이해를 도와줄 것이다.

용어 "친화성 태그"는 본원에서 두 번째 폴리펩티드의 정제 또는 검출을 제공하기 위하여 또는 기질에 대한 두 번째 폴리펩티드의 부착 부위를 제공하기 위하여 두 번째 폴리펩티드에 부착될 수 있는 폴리펩티드 절편을 규정하기 위하여 사용된다. 원리적으로, 그것에 대한 항체 또는 다른 특이적인 결합제가 활용될 수 있는 모든 펩티드 또는 단백질이 친화성 태그로서 사용될 수 있다. 친화성 태그로는 예를 들면, 폴리히스티딘 트랙, 단백질 A (Nilsson et al., EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3, 1991), 글루타티온 S 트랜스페라제 (Smith and Johnso, Gene 67:31, 1988), Glu-Glu 친화성 태그 (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952-7954, 1985), 물질 P, Flag^TM 펩티드 (Hopp et al., Biotechnology 6:1204-1210, 1988), 스트렙트아비딘 결합 펩티드, 또는 다른 항원성 에피토프 또는 결합 도메인이 있다. (일반적인 참조: Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95-107, 1991). DNA 코드화 친화성 태그는 상업적인 공급자들 (예컨대 Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)로부터 이용할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "대립성 변이체"는 동일한 염색체상 유전자좌를 차지하고 있는 유전자의 둘 또는 그 이상의 교대 형태중 어느 하나를 나타낸다. 대립성 변이는 돌연변이를 통하여 자연적으로 발생하며, 그 결과 그 집단내에서 표현형적 다형태를 유발할 수 있다. 유전자 돌연변이는 사일런트성일 수 있거나 (코드화된 폴리펩티드에 변화가 없음) 또는 변경된 아미노산 서열을 가지고 있는 폴리펩티드를 코드화할 수도 있다. 용어 대립성 변이체는 또한 본원에서 유전자의 대립성 변이체에 의해 코드화된 단백질을 나타내기 위해서도 사용된다.

용어 "아미노-말단" 및 "카르복시-말단"은 본원에서 폴리펩티드내에 있는 단백질을 표시하기 위해 사용된다. 내용이 허용되는 한, 이들 용어는 근접성 또는 상 대적인 위치를 표시하기 위하여 폴리펩티드의 특정 서열 또는 부분과 관련하여 사용된다. 예를 들어, 폴리펩티드내에 있는 참조 서열에 대하여 카르복시-말단적으로 위치한 특정 서열은 참조 서열의 카르복시 말단에 근접하여 위치한 것이지만, 반드시 완전한 폴리펩티드의 카르복시 말단에 있는 것은 아니다.

용어 "보체/항-보체 쌍"은 적절한 조건하에서 비-공유적으로 결합된, 안정한 쌍을 형성하는 동일하지 않은 부분을 나타낸다. 예를 들어, 바이오틴과 아비딘 (또는 스트렙트아비딘)은 보체/항-보체 쌍의 원형적인 한 예이다. 다른 예시적인 보체/항-보체 쌍으로는 리셉터/리간드 쌍, 항체/항원 (또는 합텐 또는 에피토프) 쌍, 센스/안티센스 폴리뉴클레오티드 쌍 등이 있다. 다음 단계로 보체/항-보체 쌍이 계속해서 분해되는 것이 바람직한 경우에는, 보체/항-보체 쌍의 결합 친화성이 바람직하게는 10⁹M^-1 보다 작은 것이 좋다.

용어 "폴리뉴클레오티드 분자의 보체"는 참조 서열과 비교하여 상보하는 염기 서열과 역 방향을 가지고 있는 폴리뉴클레오티드 분자이다. 예를 들어, 서열 5' ATGCACGGG 3' 은 5' CCCGTGCAT 3'에 상보한다.

용어 "축퇴성 뉴클레오티드 서열"은 하나 또는 둘 이상의 축퇴성 코돈 (폴리펩티드를 코드화하는 참조 뉴클레오티드 분자에 비교하여)을 포함하는 뉴클레오티드의 서열을 표시한다. 축퇴성 코돈은 뉴클레오티드의 상이한 트리플렛을 함유하고는 있지만, 동일한 아미노산 잔기를 코드화한다 (즉, GAU 및 GAC 트리플렛은 Asp를 코드화한다).

용어 "발현 벡터"는 본원에서 그것의 전사를 제공하는 추가의 절편에 작동가능하게 연결된 관심의 폴리펩티드를 코드화하는 절편을 포함하는, 선형 또는 원형의 DNA 분자를 나타낸다. 그러한 추가의 절편들로는 프로모터와 터미네이터 서열이 있으며, 또한 하나 또는 둘 이상의 복제 기원, 하나 또는 둘 이상의 선택성 마아커, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 등을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도될 수 있으며, 또는 두가지의 요소를 모두 함유할 수 있다.

용어 "분리된"은, 폴리뉴클레오티드에 적용될 때는 폴리뉴클레오티드가 그것의 자연적인 유전적 환경으로부터 제거되었고 그로써 다른 외인성 또는 원하지 않는 코딩 서열이 없으며, 유전공학적으로 처리된 단백질 제조 시스템내에서 사용하기에 적당한 형태임을 나타낸다. 그러한 분리된 분자들은 그것의 천연 환경으로부터 분리되는 것들로 cDNA 및 게놈 클론을 포함한다. 본 발명의 분리된 DNA 분자들은 그것들이 통상적으로 결합되는 다른 유전자들은 없지만, 프로모터 및 터미네이터와 같은 자연적으로 발생하는 5' 및 3' 미번역 영역을 포함할 수 있다. 결합된 영역의 확인은 당업자에게는 명백한 일일 것이다 (Dynan and Tijan, Nature 316:774-778, 1985).

"분리된" 폴리펩티드 또는 단백질은 그것의 천연 환경 이외의 조건, 예컨대 혈액 및 동물 조직이외의 조건에서 발견되는 폴리펩티드 또는 단백질이다. 바람직한 형태의 분리된 폴리펩티드는 실질적으로는 다른 폴리펩티드, 특히 동물 기원의 다른 폴리펩티드가 없는 것이다. 고도로 정제된 형태, 즉 95 % 이상 순수한, 보다 바람직하게는 99 % 이상 순수한 폴리펩티드가 제공되는 것이 바람직하다. 본 명세서에서 사용될 때, 용어 "분리된"은 선택적인 물리적 형태의 동일한 폴리펩티드의 존재, 예컨대 이량체 또는 그렇지 않은 경우 글리코실화된 또는 유도체화된 형태를 배제하지 않는다.

용어 "이상형성성"은 세포에 관해 설명할 때, 특히 증식이 진행성이고 제어되지 않는 조직에서, 새롭고 비정상적인 증식을 겪음으로써, 그 결과 이상형성물을 가져오는 세포를 나타낸다. 이상형성성 세포는 침입성 및 전이성인 악성, 또는 양성일 수 있다.

용어 "작동가능하게 연결된"은, DNA 절편과 관련하여,절편들이 그것들의 의도된 목적과 일치하여 작용하도록, 예컨대 전사는 프로모터에서 개시되고 코딩 절편을 통하여 진행되어 터미네이터에 이르도록 배열된 것을 가리킨다.

용어 "오르토로그"는 상이한 종으로부터 얻어지는 폴리펩티드 또는 단백질의 기능적 대응물인 한 종으로부터 얻어지는 폴리펩티드 또는 단백질을 가리킨다. 오르토로그들중의 서열 차이는 종 분화의 결과이다.

"파라로그"는 한 유기체에 의해 만들어진 구별되지만 구조적으로 관련된 단백질이다. 파라로그는 유전자 복제를 통하여 발생하는 것으로 여겨진다. 예를 들어, α-글로빈, β-글로빈, 및 미오글로빈은 상호의 파라로그이다.

"폴리뉴클레오티드"는 5' 단부에서 3' 단부쪽으로 판독되는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 단일- 또는 이중-가닥 중합체이다. 폴리뉴클레오티드로는 RNA 및 DNA 가 있으며, 천연 공급원으로부터 분리될 수 있고, 시험관내 에서 합성될 수 있으며, 또는 천연 및 합성 분자의 조합으로부터 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 크기는 염기쌍 ("bp"로 약칭됨), 뉴클레오티드 ("nt"), 또는 킬로염기 ("kb")로 표시된다. 내용이 허용되는 한, 후자의 두 용어는 단일 가닥 또는 이중 가닥의 폴리뉴클레오티드를 나타낼 수 있다. 이 용어가 이중 가닥의 분자에 적용되는 경우에는 그것은 전 길이를 표시하기 위해 사용되고, 용어 "염기쌍"과 동등한 것으로 이해될 것이다. 당업자는 이중 가닥의 폴리뉴클레오티드의 두 가닥이 길이가 약간은 다르며, 그것의 단부가 효소적 절단의 결과로서 서로 엇갈릴 수 있고, 그로써 이중 가닥의 폴리뉴클레오티드 분자내에 있는 모든 뉴클레오티드들이 쌍을 이루지 않을 수도 있음을 인지할 것이다.

"폴리펩티드"는 그것이 자연적으로 생성된 것이든 또는 합성된 것이든 펩티드 결합에 의하여 결합된 아미노산 잔기들의 중합체이다. 약 10 아미노산 잔기 이하의 폴리펩티드는 통상 "펩티드"로도 언급된다.

용어 "프로모터"는 본원에서 RNA 중합효소의 결합 및 전사의 개시를 제공하는 DNA 서열을 함유하고 있는 유전자 부분을 표시하기 위해 기술분야에서 인지되는 의미로 사용된다. 프로모터 서열은 통상, 그러나 항상 그렇지는 않지만, 유전자의 5' 비-코딩 영역에서 발견된다.

"단백질"은 하나 또는 둘 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 거대분자이다. 단백질은 또한 비-펩티드 성분, 예컨대 탄수화물 기를 포함할 수도 있다. 탄수화물 및 다른 비-펩티드 치환체는 단백질이 생성되는 세포에 의해 단백질에 부가될 수 있으며, 세포의 유형에 따라 다를 것이다. 단백질은 본원에서 그것들의 아미노산 골격 구조의 견지에서 규정되며; 탄수화물 기와 같은 치환체는 일반적으로 특정되어 있지 않지만, 그럼에도 불구하고 존재할 것이다.

본원에서 용어 "리셉터"는 생체내에서 활성적인 분자 ("리간드")에 결합하여 세포에 미치는 리간드의 영향을 중재하는 세포-결합된 단백질을 표시한다. 멤브레인-결합된 리셉터는 전형적으로 신호 변환에 연루되는 세포외 리간드-결합 도메인 및 세포내 이펙터 도메인을 포함하는 다중-펩티드 구조를 특징으로 한다. 리셉터에 대한 리간드의 결합의 결과로서 리셉터의 형태의 변화가 일어나고, 그로써 세포의 이펙터 도메인과 다른 분자(들) 사이의 상호작용이 유발된다. 이런 상호작용은 계속해서 세포의 대사의 변경을 유도한다. 리셉터-리간드 상호작용에 연결된 대사 사건으로는 유전자 전사, 인산화, 탈인산화, 고리형 AMP 생성의 증가, 세포내 칼슘의 고정화, 막지질의 고정화, 세포 점착, 이노시톨 지질의 가수분해 및 인지질의 가수분해가 있다. 일반적으로, 리셉터는 막결합될 수 있고, 시토솔에 있거나 핵에 있을 수 있으며, 단량체 (예컨대 갑상선 자극 호르몬 리셉터, 베타-아드레날린성 리셉터)이거나 다량체 (예컨대 PDGF 리셉터, 성장 호르몬 리셉터, IL-3 리셉터, GM-CSF 리셉터, G-CSF 리셉터, 에리트로포이에틴 리셉터 및 IL-6 리셉터)일 수 있다.

"분비 신호 서열"은 보다 큰 폴리펩티드의 성분으로서, 그것이 합성되는 세포의 분비 경로를 통하여 보다 큰 폴리펩티드를 지정하는 폴리펩티드 ("분비 펩티드")를 코드화하는 DNA 서열이다. 보다 큰 펩티드는 통상적으로 분비 경로를 통한 전이중에 분비 펩티드를 제거하기 위하여 절단된다.

용어 "스플라이스 변이체"는 본원에서 유전자로부터 전사되는 RNA의 또 다른 형태를 나타낸다. 스플라이스 변이체는 전사된 RNA 분자내에 있는, 또는 흔하지는 않지만 별도로 전사된 RNA 분자들 사이에 있는 또 다른 스플라이싱 부위를 사용함으로써 자연적으로 발생하고, 그 결과 동일한 유전자로부터 전사된 여러개의 mRNA를 유발할 수 있다. 스플라이스 변이체는 변경된 아미노산 서열을 가지고 있는 폴리펩티드를 코드화한다. 용어 스플라이스 변이체는 또한 본원에서 유전자로부터 전사된 mRNA의 스플라이스 변이체에 의해 코드화된 단백질을 나타내기 위하여 사용된다.

부정확한 분석 방법 (예컨대 겔 전기영동)에 의해 측정된 중합체의 분자량 및 길이는 대략적인 값으로 인지될 것이다. 그러한 값이 "약" X 또는 "대략" Z로 표시되는 경우, 표시된 X의 값은 ±10 % 정도로 정확할 것으로 인정될 것이다.

본원에 인용된 모든 참고자료는 그것들 전체가 참고자료로서 포함된다.

본 발명은 4중-나선-번들 사이토킨의 구조를 가지고 있는 단백질을 코드화하는 신규한 DNA 서열의 발견에 일부 기초한다. 본원에 상세하게 설명된 클로닝, 증식 분석 및 결합 연구의 과정을 통해, 신규한 리간드 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 이전의 고아 리셉터 zalpha11에 대해 높은 특이성을 갖는 리간드인 것으로 확인되었다. zalpha11 리간드로 나타낸 이 폴리펩티드 리간드가, CD3를 위해 선택된 활성화된 사람 말초 혈액 세포 (hPBCs)로부터 생성된 cDNA 라이브러리로부터 분리되었다. CD3는 림프양 기관의 세포, 특히 T 세포에 특유한 세포 표면 마아커이다.

다음의 예에서, 다른 성장 인자의 부재하에 생존 및 성장을 위해 zalpha11 고아 리셉터-결합 경로에 의존하는 셀라인이 zalpha11 리간드를 코드화하는 cDNA의 공급원에 대한 스크리닝을 위해 사용되었다. zalpha11 리셉터의 트랜스펙션 및 발현에 사용되는 바람직한 성장 인자-의존성 셀라인은 BaF3 (Palacios and Steinmetz, Cell 41: 727-734, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6 : 4133-4135, 1986)였다. 그러나, 다른 성장 인자-의존성 셀라인, 예컨대 FDC-P1 (Hapel et al., Blood 64: 786-790, 1984) 및 MO7e (Kiss et al., Leukemia 7: 235-240, 1993)도 이 목적에 적합하다.

zalpha11 리셉터에 대한 아미노산 서열은 코드화된 리셉터가 IL-2, IL-4, IL-7, IL-15, EPO, TPO, GM-CSF 및 G-CSF에 대한 리셉터를 제한 없이 포함하는 Class I의 사이토킨 리셉터 하위패밀리에 속한다는 것을 나타냈다 (리뷰, Cosman, "The Hematopoietin Receptor Superfamily" in Cytokine 5(2): 95-106, 1993 참조). zalpha11 리셉터는 공동 소유인 PCT 특허 출원 제 US99/22149 호에 충분히 설명된다. zalpha11 리셉터의 mRNA의 조직 분포에 대한 분석은 림프절, 말초 혈액 백혈구(PBLs), 비장, 골수 및 흉선에서의 발현을 밝혔다. 더욱이, mRNA는 Burkitt's 림프종으로부터 유도된 Raji 셀라인(ATCC No. CCL-86)에 풍부했다. 리셉터의 조직 분포는 예측된 zalpha11 리간드의 표적이 조혈 계통 세포, 특히 림프계 프로게니터 세포 및 림프양 세포라는 것을 시사한다. 림프양 세포에서 작용하는 다른 공지된 4중-나선-번들 사이토킨으로는 IL-2, IL-4, IL-7 및 IL-15가 있다. 4중-나선-번들 사이토킨에 대한 리뷰, Nicola et al., Advances in Protein Chemistry 52: 1-65, 1999 및 Kelso, A., Immunol. Cell Biol. 76: 300-317, 1998 참조.

CD3+ 선택된 PMA/이오노마이신-자극 사람 말초 혈액 세포로부터의 콘디셔닝 배지 (CM)는 zalpha11 리셉터를 발현하고 다르게는 IL-3에 의존하는 BaF3 세포의 성장을 지원했다. 1) PMA/이오노마이신-자극되지 않거나; 또는 2) CD3+ 선택된되지 않은 (PMA/이오노마이신-자극이 있거나 또는 없이) 세포로부터의 콘디셔닝 배지는 BaF3/zalpha11 리셉터 세포의 성장을 지원하지 않았다. 대조 실험은 이 증식 활성이 다른 공지의 성장 인자에는 기인하지 않으며, zalpha11 리셉터-발현 세포의 증식을 자극하는 그러한 콘디셔닝 배지의 능력이 가용성 형태의 리셉터에 의해 중화될 수 있다는 것을 증명했다.

CD3+ 선택된 PMA/이오노마이신-자극된 사람 말초 혈액 세포로부터의 CM에 노출된 zalpha11 리셉터-발현 BaF3 세포의 증식이 배양물의 시각적 검사에 의해 및/또는 증식 분석에 의해 확인되었다. 많은 적합한 증식 분석법이 당업계에 공지되어 있으며, alamarBlue^TM (AccuMed International, Inc. Westlake, Ohio), 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드(Mosman, J. Immunol. Meth. 65: 55-63, 1983); 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5,3-카르복시메톡시페닐-2H-테트라졸륨; 2,3-비스(2-메톡시-4-니트로-5-술포페닐)-5-[(페닐아미노)카르보닐]-2H-테트라졸륨 히드록시드; 및 시아노디톨릴-테트라졸륨 클로라이드 (Polysciences, Inc., Warrington, PA로부터 상업적으로 입수가능)와 같은 염료의 환원에 대한 분석; 미토지네시스 분석, 예컨대 ³H-티미딘의 결합 측정; 예를 들어 나프탈렌 블랙 또는 트리판 블루를 사용한 염료 배제 분석; 디아세틸 플루오레세인을 사용한 염료 흡수 및 크롬 방출을 포함한다. 일반적으로 본원에 참고자료로 포함된 Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 3rd ed., Wiley-Liss, 1994 참조.

cDNA 라이브러리가 CD3+ 선택된 PMA- 및 이오노마이신-자극된 초기 사람 말초 혈액 세포로부터 제조되었다. CD3+ 선택된 PMA- 및 이오노마이신-자극된 사람 말초 혈액 세포 cDNA 라이브러리는 다수의 cDNA 분자를 함유하는 풀들로 나누어졌고, 숙주 셀라인, 예를 들어 BHK 570 (ATCC accession no. 10314)안에 트랜스펙트되었다. 트랜스펙트된 숙주 세포는 외인성 성장 인자를 함유하지 않는 배지에서 배양되었고, 콘디셔닝 배지가 수집되었다. 콘디셔닝 배지는 zalpha11 리셉터로 트랜스펙트된 BaF3 세포의 증식을 자극하는 능력에 대해 분석되었다. BaF3/zalpha11 리셉터 세포를 자극하는 콘디셔닝 배지를 생성하는 cDNA 풀이 확인되었다. 이 모여진 플라스미드 cDNA가 대장균안에 전기천공되었다. cDNA가 단일 콜로니로부터 분리되었고, BHK 570 세포안에 각각 트랜스펙트되었다. 양성 클론이 BaF3/zalpha11 리셉터 증식 분석에서의 양성 결과에 의해 확인되었고, 특이성이 가용성 zalpha11 리셉터를 사용한 증식의 중화에 의해 시험되었다.

양성 클론이 분리되었고, 서열 분석으로 플라스미드 DNA 내에 함유된 폴리뉴클레오티드 서열이 신규의 것임을 밝혔다. 분비 신호 서열은 아미노산 잔기 1 (Met)에서 31 (Gly)까지로 이루어지고, 성숙한 폴리펩티드는 아미노산 잔기 32 (Gln)에서 162 (Ser)까지로 이루어진다 (SEQ ID NO: 2에 나타낸 바).

일반적으로, 사이토킨은 리간드-리셉터 상호작용에서 가장 중요한 나선 A, C 및 D를 갖는 4중-α 나선 구조를 가진다고 예측되고, 패밀리의 구성원 중에서 더욱 고도로 보존된다. SEQ ID NO: 2에 도시된 사람 zalpha11 리간드 아미노산 서열에 관하여, 사람 zalpha11 리간드, 사람 IL-15, 사람 IL-4 및 사람 GM-CSF 아미노산 서열의 정렬은, zalpha11 리간드 나선 A가 SEQ ID NO: 2에 도시된 아미노산 잔기 41에서 56; 나선 B가 아미노산 잔기 69에서 84; 나선 C가 아미노산 잔기 92에서 105; 그리고 나선 D가 아미노산 잔기 135에서 148에 의해 정의되는 것으로 예측한다. 구조 분석은, A/B 루프는 길고 B/C 루프는 짧으며 C/D 루프는 평행으로 길다는 것을 시사한다. 이 루프 구조는 위-위-아래-아래 나선 구성을 가져온다. 시스테인 잔기는 도 1에 나타낸 바와 같이, zalpha11 리간드와 IL-15 사이에서 완전하게 보존된다. 시스테인 잔기는 IL-15와 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 71, 78, 122 및 125에 상응하는 zalpha11 리간드 사이에서 보존된다. 일부 시스테인 잔기의 보존이 또한 도 1에 나타낸 바와 같이, IL-2, IL-4, GM-CSF 및 SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 78 및 125에 상응하는 zalpha11 리간드에서 발견된다. 일관된 시스테인 배치는 4중-나선-번들 구조를 더욱 확신시킨다. 또한, IL-15, IL-2, IL-4, GM-CSF 및 zalpha11 리간드를 포함하는 패밀리에서 고도로 보존된 것은 도 1에 나타낸 바와 같이, SEQ ID NO:2에 도시된 잔기 136에서 138까지의 서열 Glu-Phe-Leu이다.

다중 정렬 (도 1에 나타낸 바와 같은)에 기초한 zalpha11 리간드에 대한 더 이상의 분석은 아미노산 잔기 44, 47 및 135 (SEQ ID NO: 2에 도시된)가 그것의 같은 기원의 리셉터에 결합하는 zalpha11 리간드에서 중요한 역할을 한다고 예측한다. 더욱이, 뮤린 zalpha11 리간드의 예측된 아미노산 서열은 예측된 사람 단백질 에 대해 57%의 동일성을 나타낸다. 사람과 뮤린 zalpha11 리간드의 서열 사이의 비교에 기초하여, 잘-보존된 잔기들이 α 나선 A 및 D를 코드화한다고 예측된 영역에서 발견되었다. zalpha11 리간드 폴리펩티드 영역, 도메인, 모티프, 잔기 및 본원에 나타낸 서열을 코드화하는 상응하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 1에 도시된바와 같다.

상세한 돌연변이 분석이 IL-4 및 IL-2에 대해 수행되었고, 이것 모두는 zalpha11 리간드와 고도로 연관된다. 뮤린 IL-2의 분석 (Zurawski et al., EMBO J. 12:5113-5119, 1993)은 나선 A 및 C에 있는 잔기가 IL-2Rβ와 결합하는데 중요하며; 결정적인 잔기가 Asp₃₄, Asn₉₉ 및 Asn₁₀₃이라는 것을 나타낸다. 뮤린 IL-2 루프 A/B 및 나선 B 내에 있는 다수의 잔기가 IL-2Rα결합에 중요한 반면, 나선 D에서는 하나의 잔기 Gln₁₄₁만이 IL-2Rα와의 결합에 필요하다. 유사하게, 나선 A 및 C는 IL-4와 IL-4Rα (IL-2Rα와 구조적으로 유사) 사이의 상호작용의 부위이며, 나선 D 내에 있는 잔기들이 IL-2Rα 상호작용에 필요하다 (Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1657-1662, 1997; Kruse et al., EMBO J. 11: 3237-3244, 1992). 특히, 사람 IL-4에 있는 돌연변이 Tyr24 내지 Asp는 길항제를 만들고, 이것은 IL-2Rα가 아닌 IL-4Rα와 결합하며, 따라서 신호를 보낼 수 없다 (Kruse et al. 상기 동일. 1992)

나선 A가 사람과 뮤린 zalpha11 리간드 사이에서 비교적 잘-보존되는 반면, 나선 C는 더욱 분기한다. 두 종 모두 이 영역에서 우세한 산성 아미노산을 가지고 있는 반면, 그 차이점은 zalpha11 리간드와 그것의 "β" 형 리셉터 zalpha11 사이의 상호작용에서 종 특이성을 설명할 수 있다. zalpha11 리간드의 루프 A/B 및 나선 B는 종들 사이에서 잘 보존되며; IL-2Rα에 상응하는 리셉터 하위단위는 아직 확인되지 않았지만, 이 영역을 통한 보존은 그것이 기능적으로 중요함을 시사한다. 사람의 및 뮤린 zalpha11 리간드의 D 나선이 또한 고도로 보존된다. zalpha11 리셉터 길항제는 zalpha11 리간드 나선 D 내에 있는 돌연변이를 통해 디자인될 수 있다. 이들은 잔기 Gln₁₄₅(SEQ ID NO: 2) 또는 Gln₁₄₅ 또는 Ile₁₄₈ (SEQ ID NO: 2의; 사람 IL-4의 Tyr₁₂₄에 상응)의 돌연변이에서 Ala 또는 Asp와 같은 잔기까지의 단백질의 절단을 포함할 수 있다. zalpha11 리간드 나선 구조를 붕괴시키는 어떤 돌연변이는 그것의 리셉터와의 결합을 폐지함으로써 신호화를 억제할 수 있다.

4중-나선-번들 사이토킨은 또한 그것들의 성분 나선의 길이에 의해 분류된다. "긴-나선"형 사이토킨은 일반적으로 24 내지 30 잔기 나선으로 구성되며, IL-6, 섬모성 뉴트로트로프 인자(CNTF), 백혈병 억제 인자(LIF) 및 사람 성장 호르몬(hGH)을 포함한다. "짧은-나선"형 사이토킨은 일반적으로 18 내지 21 잔기 나선으로 구성되며, IL-2, IL-4 및 GM-CSF를 포함한다. zalpha11 리간드는 짧은-나선형 사이토킨 군의 새로운 구성원이 될 것으로 여겨진다. CNTF 및 IL-6을 사용한 연구는 CNTF 나선이 IL-6에 있는 동등한 나선과 교환되어 키메라에 CTNF-결합성을 부여한다는 것을 증명했다. 따라서, 4중-나선 사이토킨의 기능성 도메인은 서열 동일성에 상관없이 구조적 상동성을 기초로 결정되며, 키메라에서 기능적 완전성을 유지할 수 있다(Kallen et al., J. Biol. Chem. 274: 11859-11867, 1999). 따라서, zalpha11 리간드의 나선 도메인은 특히 사이토킨으로부터의 다른 짧은-나선을 갖는 키메라성 융합 분자를 제조하여 리셉터 결합 특이성을 측정하고 변화시키는데 유용할 것이다. 그 중 특히 흥미로운 것은 나선 A 및/또는 나선 D로 처리된 융합 단백질 및 IL-2, IL-4, IL-15 및 GM-CSF와 같은 다른 짧은-형 사이토킨으로부터의 나선 및 루프 도메인을 결합시킨 융합 단백질이다. zalpha11 리간드에 대한 나선 A, B, C 및 D, 그리고 루프 A/B, B/C 및 C/D를 포함하는 아미노산 잔기, IL-2, IL-4, IL-15 및 GM-CSF를 표 1에 나타낸다.

본 발명은 DNA 와 RNA 분자를 포함하여, 본원에서 설명된 zalpha11 리간드 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다. 당업자는 유전자 코드의 축퇴성의 견지에서, 상당한 서열 변이가 이들 폴리뉴클레오티드 분자들간에 가능하다는 것을 인지할 것이다. SEQ ID NO:3은 SEQ ID NO:2의 zalpha11 리간드 폴리펩티드를 코드화하는 모든 DNA를 포함하는 축퇴성 DNA 서열이다. 당업자는 SEQ ID NO:3의 축퇴성 코돈이 또한 T 대신 U를 치환함으로써 SEQ ID NO:2를 코드화하는 모든 RNA 서열을 제공함을 인지할 것이다. 그러므로, SEQ ID NO:3의 뉴클레오티드 1 또는 97에서 뉴클레오티드 486을 포함하는 zalpha11 리간드 폴리펩티드-코드화 폴리뉴클레오티드 및 그것들의 RNA 동등물은 본 발명에 포함된다. 하기 표 2는 축퇴성 뉴클레오티드 위치를 표시하기 위하여 SEQ ID NO:3 내에서 사용된 한-문자 코드를 나타낸다. "레졸루션"은 코드 문자에 의해 표시된 뉴클레오티드이다. "보체"는 상보하는 뉴클레오티드(들)을 가리킨다. 예를 들어, 코드 Y는 C 또는 T를 나타내며, 그것의 보체 R은 A 또는 G를 나타내고, A는 T에 상보하며, G는 C에 상보한다.

SEQ ID NO:3에서 사용된 축퇴성 코돈은, 주어진 아미노산에 대한 모든 가능한 코돈을 포함하여 하기 표 3에서 설명된다.

당업자는 각각의 아미노산을 코드화하는 모든 가능한 코돈을 대표하는 축퇴성 코돈을 결정하는데 약간의 불명확함이 포함된다는 것을 인지할 것이다. 예를 들어, 세린에 대한 축퇴성 코돈 (WSN)은 어떤 경우에는 아르기닌 (AGR)을 코드화하고, 아르기닌에 대한 축퇴성 코돈 (MGN)은 어떤 경우에는 세린 (AGY)을 코드화한다. 유사한 관계가 페닐알라닌과 로이신을 코드화하는 코돈들 사이에도 존재한다. 그러므로, 축퇴성 서열에 의해 포함되는 일부의 폴리뉴클레오티드는 변이 아미노산 서열을 코드화할 수 있지만, 당업자는 그러한 변이체 서열을 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 참조하여 쉽게 확인할 수 있다. 변이 서열은 본원에서 설명되는 바와 같이 기능성에 대해 쉽게 시험될 수 있다.

당업자는 또한 상이한 종이 "우선적인 코돈 용도"를 나타낼 수 있음을 인지할 것이다 (일반적인 참조: Grantham, et al., Nuc. Acids Res. 8:1893-1912, 1980; Haas, et al., Curr. Biol. 6:315-324, 1996; Wain-Hobson, et al., Gene 13:355-364, 1981; GrosJean and Fiers, Gene 18:199-209, 1982; Holm, Nuc. Acids Res. 14:3075-3087, 1986; Ikemura, J. Mol. Biol. 158:573-597, 1982). 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "우선적인 코돈 용도" 또는 "우선적인 코돈"은 특정한 종의 세포에서 가장 흔하게 사용되는, 그로써 각각의 아미노산을 코드화하는 가능한 코돈을 대표하는 하나 또는 소수를 선호하게 되는 단백질 번역 코돈에 관한 분야의 용어이다 (표 3 참조). 예를 들어, 아미노산 트레오닌 (Thr)은 ACA, ACC, ACG, 또는 ACT에 의해 코드화될 수 있지만, 포유류 세포에서는 ACC가 가장 흔하게 사용되는 코돈이고; 다른 종, 예컨대 곤충 세포, 효모, 바이러스 또는 박테리아에서는 다른 Thr 코돈이 바람직할 수 있다. 특정 종에 대한 우선적인 코돈이 당업계에 공지되어 있는 다양한 방법에 의하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 도입될 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 안으로의 우선적인 코돈 서열의 도입은 단백질 번역을 특정한 세포 유형 또는 종내에서 보다 효과적으로 만듦으로써 단백질 생성을 증가시킬 수 있다. 그러므로, SEQ ID NO:3에 나타낸 축퇴성 코돈 서열은 당해 기술분 야에서 통상적으로 사용되고 본원에서 설명되는 다양한 세포 유형 및 종에서의 폴리뉴클레오티드의 발현을 최적화하기 위한 템플레이트로서 작용한다. 우선적인 코돈을 함유하고 있는 서열은 본원에서 설명되는 바와 같이 다양한 종에서의 발현을 위해 시험되고 최적화될 수 있으며, 기능성에 대해 시험될 수 있다.

상기에서 주지되는 바와 같이, 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드는 DNA와 RNA를 포함한다. DNA와 RNA를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로, RNA는 다량의 zalpha11 리간드 RNA를 생성하는 조직 또는 세포로부터 분리된다. 그러한 조직 및 세포는 노던 블롯팅(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5201, 1980), 또는 표적 세포 또는 조직에 대한 활성에 대해 여러 세포 타입으로부터의 콘디셔닝 배지를 스크리닝함에 의해 확인된다. 일단 활성 또는 RNA 생성 세포 또는 조직이 확인되고, 총 RNA가 구아니디움 이소시아네이트 추출을 사용하고, 이어서 CsCl 구배에서의 원심분리에 의한 분리에 의해 제조될 수 있다 (Chirgwin et al., Biochemistry 18:52-94, 1979). 폴리(A)⁺RNA는 총 RNA로부터 Aviv와 Leder 방법을 사용하여 제조된다 (Aviv and Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:1408-1412, 1972). 상보하는 DNA (cDNA)는 공지의 방법을 사용하여 폴리(A)⁺RNA로부터 제조된다. 또는 달리, 게놈 DNA가 분리될 수도 있다. zalpha11 리간드 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드가 그런 다음, 예컨대 혼성화 또는 PCR에 의하여 확인되며 분리된다.

zalpha11 리간드를 코드화하는 전-길이의 클론은 종래의 클로닝 과정에 의하여 얻어질 수 있다. 어떤 경우에는 (예컨대 트랜스제닉 동물에서의 발현) 게놈 클론을 사용하거나 또는 최소한 하나의 게놈 인트론을 포함하도록 cDNA 클론을 변형시키는 것이 바람직할 수도 있지만, 상보하는 DNA (cDNA) 클론이 바람직하다. cDNA와 게놈 클론을 제조하는 방법은 공지이며 당업자의 기술 수준내에 있고, 라이브러리를 프로빙하거나 또는 프라이밍하기 위하여 본원에서 개시되는 서열, 또는 그것의 일부를 사용하는 것을 포함한다. 발현 라이브러리는 zalpha11, 리셉터 단편, 또는 다른 특이적 결합 파트너에 대한 항체를 사용하여 프로브될 수 있다.

본원에 개시된 zalpha11 리간드 폴리뉴클레오티드 서열은 또한 zalpha11 리간드 유전자의 클론 5' 비-코딩 영역을 클로닝하기 위한 프로브 또는 프라이머로서 사용될 수 있다. zalpha11 리간드에 대해 관찰된 조직-특이적 발현의 관점에서, 이 유전자 영역은 조혈- 및 림프양-특이적 발현을 제공할 것으로 기대된다. 따라서, zalpha11 리간드 유전자로부터의 프로모터 요소는 예를 들어 트랜스제닉 동물 또는 유전자 요법으로 치료되는 환자에서 이형 유전자의 조직-특이적 발현을 지시하는데 사용될 수 있다. 5' 측면 서열의 클로닝이 또한 미국 특허 제 5,641,670 호에 개시된 바와 같은 "유전자 활성화"에 의해 zalpha11 리간드 단백질의 생성을 용이하게 한다. 간단히 말해서, 세포에서 내인성 zalpha11 리간드 유전자의 발현이 적어도 표적화 서열, 조절 서열, 엑손 및 쌍을 이루지 않은 스플라이스 도너 부위를 포함하는 DNA 구성물을 zalpha11 리간드 유전자좌안에 도입시킴에 의해 변경된다. 표적화 서열은 구성물과 내인성 zalpha11 리간드 유전자좌의 동종성 재조합을 허가함으로써 구성물내에 있는 서열을 내인성 zalpha11 리간드 코딩 서열과 작동가능하게 연결되도록 하는 zalpha11 리간드 5' 비-코딩 서열이다. 이런 방식으로, 내인성 zalpha11 리간드 프로모터는 다른 조절 서열로 대체되거나 보충되어 증강된 조직-특이성을 제공할 수 있거나, 다르게는 발현을 조절할 수 있다.

본 발명은 추가로 다른 종으로부터 얻어지는 대응하는 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 (오르토로그)를 제공한다. 이들 종으로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 포유류, 조류, 양서류, 파충류, 어류, 곤충 및 다른 척추동물 및 무척추동물 종이 있다. 특히 관심있는 것은 뮤린과, 돼지, 양, 소, 개, 고양이, 말, 및 다른 영장류 폴리펩티드를 포함한 다른 포유류 종으로부터 얻어지는 zalpha11 리간드 폴리펩티드이다. 사람 zalpha11 리간드 의 오르토로그는 본 발명에 의해 제공되는 정보 및 조성물을 종래의 클로닝 기법과 조합하여 사용함으로써 클론될 수 있다. 예를 들면, cDNA는 본원에서 설명되는 바와 같이 zalpha11 리간드를 발현하는 조직 또는 세포 유형으로부터 얻어진 mRNA를 사용하여 클론될 수 있다. mRNA의 적당한 공급원은 본원에 개시된 서열로부터 디자인된 프로브를 사용하여 노던 블롯을 프로빙함으로써 확인될 수 있다. 그런 다음 양성의 조직 또는 셀라인의 mRNA로부터 라이브러리가 제조된다. 그런 다음 zalpha11 리간드-코드화하는 cDNA가 다양한 방법, 예컨대 완전한 또는 부분적인 사람 cDNA 또는 개시된 서열을 토대로 한 하나 또는 둘 이상의 축퇴성 프로브 세트를 사용하여 프로빙함으로써 분리될 수 있다. cDNA는 또한 중합효소 사슬 반응, 또는 PCR (Mullis, 미국 특허 제 4,683,202 호)을 사용하여, 본원에 개시된 대표적인 사람 zalpha11 리간드 서열로부터 디자인된 프라이머를 사용하여 클론될 수 있다. 추가의 방법에서, cDNA 라이브러리는 숙주 세포를 형질전환시키기 위하여 사용될 수 있으며, 관심의 cDNA의 발현은 zalpha11 리간드 폴리펩티드, 결합 연구 또는 활성 분석에 대한 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 유사한 기법들이 게놈 클론의 분리에도 적용될 수 있다.

zalpha11 리간드의 마우스 오르토로그에 대한 폴리뉴클레오티드 서열을 확인하여 SEQ ID NO: 55로 나타내고, 상응하는 아미노산 서열은 SEQ ID NO:56으로 나타낸다. zalpha11 리간드의 SEQ ID NO:2의 잔기 30에서 153 및 zlapha11 리간드의 SEQ ID NO: 56의 잔기 23에서 146에 상응하는 124 아미노산 영역에 걸친 마우스와 사람 서열 사이에는 62%의 동일성이 있다. 마우스 zalpha11 리간드에 대한 성숙한 서열은 His₁₈(SEQ ID NO: 56에 나타낸 바)에서 추정적으로 시작되며, 이것은 사람 서열의 His₂₅(SEQ ID NO:2에 나타낸 바)에 상응한다. 사람 폴리펩티드의 절단된 형태가 활성이기 때문에, 마우스 zalpha11 리간드의 동등한 폴리펩티드(즉, SEQ ID NO: 56의 His₁₈에서 Pro₂₂가 없는)가 또한 활성이다. 조직 분석으로 마우스 zalpha11 리간드의 발현이 고환, 비장 및 흉선에서 발견되는 것으로 밝혀졌다.

당업자는 SEQ ID NO:1에 개시된 서열이 사람 zalpha11 리간드의 단일한 대립형질을 나타내며, 대립성 변이 및 또는 다르게는 스플라이싱이 일어날 것으로 예상됨을 인지할 것이다. 이 서열의 대립성 변이체는 표준 과정에 따라 상이한 개체로부터 얻어지는 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 프로브함으로써 클론될 수 있다. SEQ ID NO:1에 나타낸 DNA 서열의 대립성 변이체는, 사일런트 돌연변이를 함유하는 것들 및 돌연변이가 아미노산 서열 변화를 초래하는 것들을 포함하여, SEQ ID NO:2의 대립성 변이체인 단백질과 같이 본 발명의 범주내에 있다. 또는 달리 스플라이스된 mRNA 로부터 생성되고, zalpha11 리간드 폴리펩티드의 성질을 보유하고 있는 cDNA는 그러한 cDNA 및 mRNA에 의해 코드화된 폴리펩티드들이 그러한 것처럼 본 발명의 범주안에 포함된다. 이들 서열의 대립성 변이체 및 스플라이스 변이체들은 당업계에 공지되어 있는 표준 과정을 따라 상이한 개체 또는 조직으로부터 얻어지는 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 프로브함으로써 클론될 수 있다.

zalpha11 리간드 유전자는 IL-2 프레임워크 마아커 SHGC-12342에 지도화되어 zalpha11 리간드를 IL-2 마아커로부터 대략 180kb에 위치시킨다. 주변 마아커의 사용은 zalpha11 리간드 유전자를 통합된 LDB 염색체 4 지도 상의 4q27 영역에 위치시킨다 (Genetic Location Database, University of Southhampton). 본 발명은 또한 진단 적용시 사용될 시약을 제공한다. 예를 들면, zalpha11 리간드 유전자, zalpha11 리간드 DNA 또는 RNA 또는 그것의 하위서열을 포함하고 있는 프로브가, zalpha11 리간드 유전자가 사람 염색체, 예컨대 염색체 4 상에 있는지 또는 유전자 돌연변이가 일어났는지의 여부를 측정하기 위하여 사용될 수 있다. zalpha11 리간드 게놈 DNA (Genbank Accession No. AC007458)의 일부를 함유하고 있는 사람 게놈 DNA의 단편의 주석에 기초하면, zalpha11 리간드는 염색체 4의 4q27 영역에 위치한다. Zalpha11 리간드 유전자 유전자좌에 있는 검출가능한 염색체 변형으로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 이수체, 유전자 복사수 변화, 이질성의 손실 (LOH), 전위, 삽입, 결실, 제한 부위 변화 및 재배열이 있다. 그러한 변형은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 사용함으로써, 분자 유전학 기법, 예컨대 제한 단편 길이 다형태 (RFLP) 분석, PCR 기법을 사용한 짧은 탠덤 반복부 (STR) 분석, 및 다른 공지의 유전자 결합 분석 (Sambrook et al., 상기 동일; Ausubel et al., 상기 동일; Marian, Chest 108:255-65, 1995)을 사용하여 검출될 수 있다.

유전자 위치에 대한 정확한 지식은 많은 목적, 예를 들어 1) 서열이 기존의 콘티그의 일부인지를 측정하고 추가의 주변 유전자 서열을 다양한 형태, 예컨대 YAC, BAC 또는 cDNA 클론으로 얻기 위하여; 2) 동일한 염색체 영역에 대한 결합을 보이는 유전적 질병에 대한 가능한 후보 유전자를 제공하기 위하여; 및 3) 특정 유전자가 어떤 기능을 가질 것인지를 측정하는 것을 도와주는 교차-참조 모델 유기체, 예컨대 마우스에 대하여 유용할 수 있다.

이미 말한 바와 같이, 사람 zalpha11 리간드 유전자는 IL-2 유전자 가까이에 주거하며, 이것은 어떤 가족들에서 염증성 장질환 (IBD, 크론병 (CD) 및 궤양성 대장염을 포함)에 대한 민감성과 관련성을 가진다고 알려진 염색체 4q의 영역에 있다 (Hampe et al. Am. J. Hum. Genet. 64:808-816, 1999; Cho et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 95:7502-7507, 1998). 여기에 더하여, zalpha11 리간드 유전자는 CD에 대한 민감성과 관련된 다른 게놈 영역인 16p11에 지도화된다 (Hugot et al., Nature 379:821-823, 1996; Ohmen et al., Hum. Mol. Genet. 5:1679-1683, 1996).

CD는 빈번한 전신성 병발을 갖는 소화관의 만성 염증으로, 정확한 병인은 알려져 있지 않으나, 보통의 소화관 항원에 대한 내성의 장애를 수반하는 면역조절성 기능장애가 주 구성 요소이다 (리뷰로서 Braegger et al., Annals Allergy 72:135-141, 1994; Sartor, Am. J. Gastroenterol. 92:5S-11S, 1997 참조). 몇몇 연구는 CD 환자에서 비정상적인 NK 활성을 발견했고 (예를 들어, Egawa et al., J. Clin. Lab. Immunol. 20:187-192, 1986; Aparicio-Pages et al., J. Clin. Lab. Immunol. 29:119-124, 1989; van Tol et al., Scand. J. Gastroenterol. 27:999-1005, 1992 참조), 결함 기억 B 세포 형성이 또한 입증되었다 (Brogan et al., J. Clin. Lab. Immunol. 24:69-74, 1987). zalpha11 리간드가 면역 조절에서 어떤 역할을 하기 때문에, 그리고 리셉터 및 리간드 모두에 대한 유전자가 CD 민감성 영역내에 위치하기 때문에, 리셉터 및 리간드 모두는 크론병에 대한 유전적 소인의 후보 유전자이다.

IBD의 병리학에서 zalpha11 리셉터 및/또는 zalpha11 리간드의 병발의 측정은 몇가지 방법에 의해 달성될 수 있다. cDNAs의 서열화처럼, 게놈 DNA로부터 엑손의 서열화는 코딩 돌연변이 (과오, 난센스 및 틀이동 돌연변이 포함)를 밝힐 수 있다. 게놈 DNA로부터의 서열화의 추가적 이점은 스플라이스 접합부가 또한 서열화된 단편내에 함유되어, 예를 들어 잘못 스플라이스된 RNAs가 빠르게 퇴화되는 경우에는 cDNA 샘플에는 나타나지 않았던 스플라이싱 이상성을 밝힐 수 있다는 것이다. IBD 환자에서 zalpha11 리간드 및 리셉터를 분석하는 다른 방법으로는 (1) 환자 대 정상 대조군으로부터의 활성화된 T 세포로부터의 리간드 생성의 사전평가 (즉, 생물학적 분석); (2) 정상 대조군으로부터의 절단부와 비교하여, IBD 환자로부터의 염증이 생긴 장의 절단부에 zalpha11 리셉터 또는 zalpha11 리간드 RNA의 제자리 혼성화; (3) IBD 환자 대 정상 대조군으로부터의 절단부 상의 면역조직화학; 및 (4) 미토지네시스 분석에 의해 측정된 바 zalpha11 리간드에서 환자의 말초 B 세포 의 반응성의 사전평가가 있다.

진단법은 의사가 질환의 종류 및 적절한 관련 요법을 결정하는 것을 돕거나 또는 유전적 상담을 도울 수 있다. 그러한 것으로서, 본 발명의 항-zalpha11 리간드 항체, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 zalpha11 리간드 폴리펩티드, mRNA 또는 항-zalpha11 리간드 항체의 검출에 사용될 수 있으며, 이와 같이 마아커로 사용하여, 당업계에 공지되고 본원에 기술된 방법을 사용하여 본원에 기술된 바와 같이 유전적 질환 또는 암을 검출하는데 직접 사용될 수 있다. 더욱이, zalpha11 리간드 폴리펩티드 프로브는 본원에 기술된 바와 같은 염색체 4q27을 수반하는 이상성을 검출하는데 사용될 수 있다. 이들 이상성은 사람 질환들, 또는 종양형성, 자연유산 또는 다른 유전적 장애들과 관련될 수 있다. 그러므로 zalpha11 리간드 폴리펩티드 프로브는 이들 결함과 관련된 이상성 또는 유전자형을 검출하는데 사용될 수 있다.

상기 논의된 바와 같이, zalpha11 리간드 유전자 자체의 결함은 유전성 사람 질환 상태를 초래할 수 있다. 본 발명의 분자, 예컨대 본 발명의 폴리펩티드, 길항제, 아고니스트, 폴리뉴클레오티드 및 항체는 zalpha11 리간드 유적적 결함과 관련된 질환의 검출, 진단 예방 및 치료에 도움을 줄 것이다. 여기에 더하여, zalpha11 리간드 폴리뉴클레오티드 프로브는 zalpha11 리간드 염색체 유전자좌에서 질환에 걸린 또는 걸리지 않은 개체들 사이의 대립형질의 차이를 검출하는데 사용될 수 있다. 그러한 것으로서, zalpha11 리간드 서열은 법의학상의 DNA 프로파일링에 있어 진단법으로 사용될 수 있다.

일반적으로, 환자에서 유전적 이상성 또는 변형을 검출하기 위한, 유전적 관 련성 분석에 사용되는 진단 방법이 당업계에 공지되어 있다. 대부분의 진단 방법은 (i) 잠재적으로 질환에 걸릴 환자, 질환에 걸린 환자 또는 잠재적인 질환에 걸리지 않은 열성 질환 대립형질의 보유자로부터 유전적 샘플을 얻는 단계; (ii) RFLP 분석에서와 같이 zalpha11 리간드 폴리뉴클레오티드 프로브 (여기에서, 폴리뉴클레오티드는 상보하는 폴리뉴클레오티드에 혼성화할 것이다)와 함께 유전적 샘플을 인큐베이션함으로써, 또는 적절한 PCR 반응 조건하의 PCR 반응의 센스 및 안티센스 프라이머와 함께 유전적 샘플을 인큐베이션함으로써 제 1 반응 생성물을 생성하는 단계; (iii) zalpha11 리간드 폴리뉴클레오티드 프로브 (여기에서, 폴리뉴클레오티드는 제 1 반응의 상보하는 폴리뉴클레오티드에 혼성화할 것이다)로 제 1 반응 생성물을 시각화하는것 과 같이, 겔 전기영동 및/또는 다른 공지의 방법에 의해 제 1 반응 생성물을 시각화하는 단계; 및 (iv) 시각화된 제 1 반응 생성물을 정상 또는 대조 개체로부터의 유전적 샘플의 제 2 대조 반응 생성물과 비교하는 단계를 포함한다. 제 1 반응 생성물과 대조 반응 생성물 사이의 차이는 질환에 걸린 또는 잠재적으로 질환에 걸릴 환자에서 유전적 이상성, 또는 질환에 걸리지 않은 환자에 있어 이종접합 열성 보유자 표현형의 존재, 또는 질환에 걸린 환자로부터의 종양에서 유적적 결함의 존재, 또는 태아 또는 사전-착상 배에서 유전적 이상성의 존재를 표시한다. 예를 들어, 제한 단편 패턴, PCR 생성물의 길이, zalpha11 리간드 유전자 유전자좌에서 반복 서열의 길이 등의 차이는, 정상 대조군과 비교하여 유전적 이상성, 유전적 변형 또는 대립형질의 차이를 표시한다. 대조군은 샘플의 시험 및 활용성에 따라, 영향을 받지 않은 가족 구성원들 또는 관계가 없는 개체들로 형성될 수 있다. 본 발명내에서 사용되는 유전적 샘플로는 환자로부터의 어떤 조직 또는 다른 생물학적 샘플, 예컨대, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 혈액, 타액, 정액, 배세포, 양수 등으로부터 분리된 게놈 DNA, mRNA 및 cDNA가 있다. 폴리뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머는 RNA 또는 DNA일 수 있으며, SEQ ID NO:1의 부분, SEQ ID NO:1의 보체 또는 그것들의 동등한 RNA을 포함할 것이다. 사람 질환 표현형에서 유전적 관련성 분석을 나타내는 그러한 방법이 당업계에 잘 공지되어 있다. 진단법에서 PCR을 기초로 한 방법의 참고자료로서, 일반적으로 Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991), White (ed.), PCR Protocols: Current Methods and Applications (Humana Press, Inc. 1993), Cotter (ed.), Molecular Diagnosis of Cancer (Humana Press, Inc. 1996), Hanausek and Walaszek (eds.), Tumor Marker Protocols (Humana Press, Inc. 1998), Lo (ed.), Clinical Applications of PCR (Humana Press, Inc. 1998), 및 Meltzer (ed.), PCR in Bioanalysis (Humana Press, Inc. 1991) 참조.

zalpha11 리간드 유전자좌와 관련된 돌연변이는 직접적 돌연변이 분석을 위한 표준 방법, 예컨대 제한 단편 길이 다형태 분석, PCR 기법을 사용한 짧은 탠덤 반복부 분석, 증폭-불응성 돌연변이 분석 및 당업계에 공지된 다른 유전자 분석 기법을 사용함에 의해, 본 발명의 핵산 분자를 사용하여 검출될 수 있다 (예를 들어, Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991), Marian, Chest 108:255 (1995), Coleman and Tsongalis, Molecular Diagnostics (Humana Press, Inc. 1996), Elles (ed.) Molecular Diagnosis of Genetic Diseases (Humana Press, Inc. 1996), Landegren (ed.), Laboratory Protocols for Mutation Detection (Oxford University Press 1996), Birren et al. (eds.), Genome Analysis, Vol. 2: Detecting Genes (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1998), Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics (John Wiley & Sons 1998) 및 Richards and Ward, "Molecular Diagnostic Testing," in Principles of Molecular Medicine, pages 83-88 (Humana Press, Inc. 1998) 참조. 돌연변이에 대한 zalpha11 리간드 유전자의 직접적 분석은 피험자의 게놈 DNA를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어 말초 혈액 림프구로부터 얻어진 게놈 DNA를 증폭하는 방법이 당업자에게 잘 공지되어 있다 (예를 들어, Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, pages 7.1.6 에서 7.1.7 (John Wiley & Sons 1998) 참조)

zalpha11 리간드 유전자에 있는 인트론의 위치는 게놈 클론의 확인에 의해 측정되고, 이어서 인트론/엑손 접합부가 서열화된다. 제 1 인트론은 Seq ID No. 2의 아미노산 잔기 56 (Leu)와 잔기 57 (Val) 사이에 위치하며, 길이로 115 염기쌍이다. 제 2 인트론은 4.4킬로염기로 가장 크며, Seq ID No. 2의 아미노산 잔기 68 (Glu)와 잔기 69 (Thr) 사이에 위치한다. 제 3 인트론은 2.6킬로염기이며, Seq ID No. 2의 아미노산 잔기 120 (Leu)와 잔기 121 (Thr) 사이에 위치한다. 마지막 인트론은 89 염기쌍이며, Seq ID No. 2의 아미노산 잔기 146 (Lys)와 잔기 147 (Met) 사이에 위치한다. 완전한 유전자는 약 8kb에 걸쳐 있다.

zalpha11 리간드 유전자가 1개의 추가적 인트론 (인트론 4)을 함유하지만, zalpha11 리간드 유전자의 구조는 IL-2 유전자의 구조 (Fujita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80:7437-7441, 1983)와 유사하다. IL-2 유전자는 전체적으로 약간 더 작지만 (약 6kb), 짧은 제 1 인트론 및 긴 제 2 및 제 3 인트론의 패턴은 2개 유전자들 사이에서 보존된다. 한편, IL-15 유전자는 8 엑손으로 구성되고, 적어도 34kb에 걸쳐 있다 (Anderson et al., Genomics 25:702-706, 1995). 이와 같이, zalpha11 리간드 유전자는 IL-15 유전자에서보다 IL-2 유전자에서 구조가 유사하다.

본 발명의 구체예 내에서, 분리된 zalpha11 리간드-코드화 핵산 분자는 엄격한 조건하에서 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자, SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 47 내지 532의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자, 또는 SEQ ID NO:1에 상보하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자에 혼성화할 수 있다. 일반적으로, 엄격한 조건은 규정된 이온 강도 및 pH에서 특이한 서열에 대한 열용융점 (Tm)보다 약 5℃ 더 낮게 선택된다. Tm은 표적 서열의 50%가 완전히 매치되는 프로브에 혼성화하는 온도 (규정된 이온 강도 및 pH하에서)이다.

핵산 분자의 쌍, 예컨대 DNA-DNA, RNA-RNA 및 DNA-RNA은, 만약 뉴클레오티드 서열이 어떤 정도의 상보성을 가진다면 혼성화할 수 있다. 혼성체는 이중 나선에 있는 미스매치된 염기쌍을 허용할 수 있지만, 혼성체의 안정성은 미스매치의 정도에 의해 영향을 받는다. 미스매치된 혼성체의 Tm은 모든 1 내지 1.5% 염기쌍 미스매치에 대해 1℃까지 감소한다. 혼성화 조건의 엄격도를 변화시키는 것은 혼성체에 존재하게 될 미스매치의 정도에 관한 조절을 허가한다. 엄격도의 정도는 혼성화 온 도 증가 및 혼성화 완충액의 이온 강도의 감소에 따라 증가한다.

특정 폴리뉴클레오티드 혼성체와 함께 사용되는 이들 조건을 조정하는 것은 당업자의 능력내에서 충분하다. 특이한 표적 서열에 대한 Tm은 표적 서열의 50%가 완전히 매치되는 프로브 서열에 혼성화하는 온도 (규정된 조건하에서)이다. Tm에 영향을 미치는 이들 조건은 폴리뉴클레오 프로브의 크기 및 염기쌍 내용, 혼성화 용액의 이온 강도, 및 혼성화 용액에 있는 탈안정제의 존재를 포함한다. Tm을 계산하기 위한 많은 방정식이 당업계에 공지되어 있으며, DNA, RNA 및 DNA-RNA 혼성체 및 다양한 길이의 폴리뉴클레오티드 프로브 서열에 따라 특이하다 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Press 1989); Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, 1987); Berger and Kimmel (eds.), Guide to Molecular Cloning Techniques (Academic Press, Inc. 1987); Wetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227 (1990)). OLIGO 6.0 (LSR; Long Lake, MN) 및 프라이머 프레이머 4.0 (Premier Biosoft International; Palo Alto, CA)와 같은 서열 분석 소프트웨어 뿐만 아니라 인터넷상의 사이트들이, 사용자가 규정한 기준을 토대로 주어진 서열을 분석하고 Tm을 계산하기 위해 활용될 수 있는 도구들이다. 그러한 프로그램들은 또한 규정된 조건하에서 주어진 서열을 분석하고 적당한 프로브 서열을 확인할 수 있다. 전형적으로, 50 염기쌍 이상의 보다 긴 폴리뉴클레오티드 서열의 혼성화는 계산된 Tm보다 약 20 내지 25 ℃ 낮은 온도에서 수행된다. 50 염기쌍 미만의 보다 작은 프로브에 대해서는, 혼성화는 Tm에서 또는 그것보다 5 내지 10 ℃ 낮은 온도에서 수행되는 것이 전형적이다. 이런 조건이 DNA-DNA 및 DNA-RNA 혼성체에 대한 혼성화의 최대 속도를 가능하게 한다.

혼성화 후에, 핵산 분자는 혼성화되지 않은 핵산 분자를 제거하기 위해 엄격한 조건하에서 또는 고도로 엄격한 조건하에서 세척될 수 있다. 전형적인 엄격한 세척 조건은 55 내지 65℃에서 0.1% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS)를 갖는 0.5× 내지 2×SSC 용액에서 세척하는 것이다. 즉, 변이 zalpha11 리간드 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 분자는 엄격한 세척 조건하에서 SEQ ID NO:1 (또는 그것의 보체)의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자와 함께 혼성화하며, 여기에서 세척 엄격도는 55℃에서 0.1% SDS를 갖는 0.5×SSC 또는 65℃에서 0.1% SDS를 갖는 2×SSC를 포함하여, 55 내지 65℃에서 0.1% SDS를 갖는 0.5× 내지 2×SSC와 동등하다. 당업자는, 예를 들어 세척 용액에 있는 SSC를 SSPE로 치환함에 의한 것과 같이, 동등한 조건을 쉽게 고안할 수 있다.

전형적인 고도로 엄격한 세척 조건은 50 내지 65℃에서 0.1% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS)를 갖는 0.1× 내지 0.2×SSC 용액에서 세척하는 것이다. 다른 말로, 변이 zalpha11 리간드 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 분자는 고도로 엄격한 세척 조건하에서 SEQ ID NO:1 (또는 그것의 보체)의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자와 함께 혼성화하며, 여기에서 세척 엄격도는 50℃에서 0.1% SDS를 갖는 0.1×SSC 또는 65℃에서 0.1% SDS를 갖는 0.2×SSC를 포함하여, 50 내지 65℃에서 0.1% SDS를 갖는 0.1× 내지 0.2×SSC와 동등하다.

본 발명은 또한 SEQ ID NO:2의 폴리펩티드 또는 그것들의 오르토로그에 대해 실질적으로 더 작은 서열 동일성을 가지고 있는 분리된 zalpha11 리간드 폴리펩티드를 제공한다. 용어 "실질적으로 더 작은 서열 동일성"은 본원에서 SEQ ID NO:2에 도시된 서열 또는 그것들의 오르토로그에 대해 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 95% 이상의 서열 동일성을 포함하는 폴리펩티드를 표시하기 위해 사용된다. 본 발명은 또한 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 1 내지 162 또는 33 내지 162의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 95% 이상의 서열 동일성을 가지고 있는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명은 그러한 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 분자를 더 포함한다. 퍼센트 동일성을 측정하는 방법이 아래에 기술된다.

본 발명은 또한 두가지 기준: 코드화된 폴리펩티드와 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열 사이의 유사성의 측정, 및/또는 상술된 바와 같은 혼성화 분석을 사용하여 확인될 수 있는 변이체 zalpha11 리간드 핵산 분자를 고려한다. 그러한 zalpha11 리간드 변이체는 (1) 세척 엄격도가 55 내지 65℃에서 0.1% SDS를 갖는 0.5× 내지 2×SSC와 동등한, 엄격한 세척 조건하에서 SEQ ID NO:1 (또는 그것의 보체)의 뉴클레오티드 서열을 가지고 있는 핵산 분자와 함께 혼성화거나; 또는 (2) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 95% 이상의 서열 동일성을 가지고 있는 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 분자를 포함한다. 또는 달리, zalpha11 리간드 변이체는 (1) 세척 엄격도가 50 내지 65℃에서 0.1% SDS를 갖는 0.1× 내지 0.2×SSC와 동등한, 고도로 엄격한 세척 조건하에서 SEQ ID NO:1 (또는 그것의 보체)의 뉴클레오티드 서열을 가지고 있는 핵산 분자와 함께 혼성화거나; 또는 (2) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 95% 이상의 서열 동일성을 가지고 있는 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 분자를 특징으로 한다.

퍼센트 서열 동일성은 종래의 방법에 의해 측정된다. 예를 들어, Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48:603-616, (1986), 및 Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, (1992) 참조. 간단히 설명하면, 두 개의 아미노산 서열이 10의 갭 개방 페널티, 1 의 갭 확장 페널티, 및 표 4 에 나타낸 바와 같은 Henikoff and Henikoff (상기 동일)의 "BLOSUM62" 스코어링 매트릭스를 사용하여 배열 스코어를 최적화기키기 위하여 배열된다 (아미노산은 표준 한-문자 코드로 표시된다).

당업자는 두 개의 아미노산 서열을 배열하기 위하여 활용될 수 있는 많은 알고리듬이 수립되어 있음을 인지할 것이다. 피어슨과 리프만의 "FASTA" 유사성 조사 알고리듬은 본원에 개시된 아미노산 서열 및 잠재적인 변이체 zalpha11 리간드의 아미노산 서열에 의해 공유된 동일성 수준을 조사하기에 적당한 단백질 배열 방법이다. FASTA 알고리듬은 Pearson 및 Lipman의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), 및 Pearson의 Meth. Enzymol. 183:63 (1990)에 의해 설명되었다.

간단하게 설명하면, FASTA는 먼저 의문 서열 (예를 들어, SEQ ID NO:2)과 보존적인 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 고려함이 없이 가장 높은 밀도의 동일성을 가지거나 (ktup 변수가 1 인 경우) 또는 동일성 쌍을 가진 (ktup=2) 시험 서열에 의해 공유된 영역을 확인함으로써 서열 유사성을 특징짓는다. 그런 다음 10 개 의 가장 높은 밀도의 동일성을 가지는 영역이 모든 쌍을 이룬 아미노산의 유사성을 아미노산 치환 매트릭스를 사용하여 비교함으로써 기록되고, 영역의 끝은 단지 가장 높은 스코어에 기여하는 잔기들만을 포함하도록 "트리밍"된다. 만약 "컷오프" 값보다 더 큰 스코어를 가지는 영역이 여러개 있다면 (서열의 길이 및 ktup 값을 토대로 예정된 식에 의해 계산됨), 그 때에는 트리밍된 초기 영역이 조사되어 영역들이 갭을 가지는 대략적인 배열을 형성하기 위하여 결합될 수 있는 지의 여부가 측정된다. 마지막으로, 두 아미노산 서열중 가장 높은 스코어를 가지는 영역이, 아미노산 삽입 및 결실을 가능하게 하는 니들만-분쉬-셀러스 알고리듬을 변형 사용하여 배열된다 (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26:787 (1974)). FASTA 분석에 바람직한 중재변수는 다음과 같다: ktup=1, 갭 개방 페널티=10, 갭 확장 페널티=1, 및 치환 매트릭스=BLOSUM62. 이들 중재변수는 FASTA 프로그램에 스코어링 매트릭스 파일 ("SMATRIX")을 Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990)의 Appendix 2에 설명된 바와 같이 변형시킴으로써 도입될 수 있다

FASTA는 또한 상술된 바와 같은 비율을 사용하여 핵산 분자의 서열 동일성을 측정하는데 사용될 수 있다. 뉴클레오티드 서열 비교를 위해서는, ktup 값이 0에서 6 까지, 바람직하게는 3에서 6 까지 변할 수 있으며, 가장 바람직하게는 3이고, 다른 중재변수들은 초기값으로서 설정된다.

변이체 zalpha11 리간드 폴리펩티드 또는 실질적으로 유사한 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드는 하나 또는 둘 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 가지는 것을 특징으로 한다. 이들 변화는 바람직하게는 미미한 성질의 것, 즉 보존성 아미노산 치환 (표 5 참조) 및 폴리펩티드의 접힘 또는 활성에 유의할만한 영향을 주지 않는 다른 치환; 작은 결실, 전형적으로는 1 내지 약 30 아미노산의 결실; 및 아미노- 또는 카르복시-말단 연장, 예컨대 아미노-말단 메티오닌 잔기, 약 20 내지 25 잔기의 작은 링커 펩티드, 또는 친화성 태그이다. 본 발명은 그러므로 SEQ ID NO:2의 상응하는 영역에 대하여 최소한 70%, 바람직하게는 최소한 90%, 보다 바람직하게는 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 약 108 내지 약 216 개의 아미노산 잔기로 된 폴리펩티드를 포함한다. 친화성 태그를 포함하는 폴리펩티드는 zalpha11 리간드 폴리펩티드와 친화성 태그 사이에 단백질 단백분해성 절단 부위를 더 포함할 수 있다. 바람직한 그러한 부위로는 트롬빈 절단 부위 및 제 Xa 인자 절단 부위가 있다.

보존성 아미노산 치환

염기성:	알기닌 리신 히스티딘
산성:	글루탐산 아스파르트산
극성:	글루타민 아스파라긴
소수성:	로이신 이소로이신 발린
방향성:	페닐알라닌 트립토판 티로신
작은 크기:	글리신 알라닌 세린 트레오닌 메티오닌

구조적 통합성을 유지하는데 중요한 영역 또는 도메인을 포함하는 아미노산 잔기들의 측정이 이루어질 수 있다. 이들 영역내에서 당업자는 변화를 다소간에 허용할 특이한 잔기들을 측정할 수 있고 분자의 전체적인 3차 구조를 유지할 수 있다. 서열 구조를 분석하는 방법으로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 다중 서열을 높은 아미노산 또는 뉴클레오티드 동일성, 2차 구조 경향, 쌍성 (binary) 패턴, 상보성 팩킹 및 숨겨져 있는 극성 상호작용이 있다 (Barton, Current Opin. Struct. Biol. 5:372-376, 1995; Cordes et al., Current Opin. Struct.Biol. 6:3-10, 1996). 일반적으로, 분자에 대한 변형을 디자인할 때 또는 특이한 단편을 확인할 때, 변형된 분자의 활성을 평가함에 의해 구조의 측정이 수반될 것이다.

아미노산 서열 변화는 생물학적 활성에 필수적인 보다 더 질서정연한 구조의 파괴를 최소화하기 위하여 zalpha11 리간드 폴리펩티드에서 이루어진다. 예를 들어, zalpha11 리간드 폴리펩티드가 하나 또는 둘 이상의 나선을 포함할 때, 아미노산 잔기의 변화는 형태의 변화가 일부의 중요한 기능, 예컨대 분자의 그것의 결합 파트너, 예를 들어 A 및 D 나선, SEQ ID NO:2의 잔기 44, 47 및 135에 대한 결합을 완화시키는 분자의 다른 성분들 및 나선 기하학을 파괴하지 않도록 만들어질 것이다. 아미노산 서열 변화의 영향은 예를 들면 상술된 바와 같은 컴퓨터 모델링에 의해 예측될 수 있거나, 또는 결정 구조에 의해 측정될 수 있다 (예를 들어, Lapthorn et al., Nat. Struct. Biol. 2:266-268, 1995 참조). 당업계에 잘 알려져 있는 다른 기법들은 표준 분자 (예컨대 천연 단백질)에 대한 변이체 단백질의 접힘을 비교한다. 예를 들어, 변이체와 표준 분자들의 시스테인 패턴의 비교가 이루어질 수 있다. 질량 분광측광법, 및 환원 및 알킬화를 사용하는 화학적 변형은 이황 화 결합으로 결합되어 있거나 또는 그러한 결합이 없는 시스테인 잔기를 측정하는 방법을 제공한다 (Bean et al., Anal. Biochem. 201:216-226, 1992; Gray, Protein Sci. 2:1732-1748, 1993; Patterson et al., Anal. Chem. 66:3727-3732, 1994). 일반적으로 만약 변형된 분자가 표준 분자와 동일한 시스테인 패턴을 가지고 있지 않다면 접힘이 영향을 받았을 것으로 여겨진다. 다른 잘 알려져 있고 수용되고 있는 접힘 측정 방법은 원형 이색성 (CD)이다. 변형된 분자와 표준 분자에 의해 생성된 CD 스펙트럼을 측정하고 비교하는 것은 기본적인 일이다 (Johnson, Protein 7:205-214, 1990). 접힘 및 구조를 분석하기 위해 잘 알려져 있는 다른 방법은 결정학이다. 핵자기 공명 (NMR), 소화 펩티드 지도화 및 에피토프 지도화도 또한 단백질과 폴리펩티드 사이의 접힘 및 구조적 유사성을 분석하기 위한 공지된 방법들이다 (Schaanan et al., Science 257:961-964, 1992).

SEQ ID NO:2에 도시된 바와 같은 zalpha11 리간드 단백질 서열의 Hopp/Woods 친수성 프로필이 만들어질 수 있다 (Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3824-3828, 1981; Hopp, J. Immun. Meth. 88:1-18, 1986; Triquier et al., Protein Engineering 11:153-169, 1998). 이 프로필은 미끄러지는 6-잔기 윈도우를 토대로 한다. 감추어져 있는 G, S, 및 T 잔기와 노출되어 있는 H, Y 및 W 잔기는 무시되었다. 예를 들어, zalpha11 리간드에서, 친수성 영역은 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 114부터 119 까지, SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 101부터 105 까지, SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 126부터 131 까지, SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 113부터 118 까지, 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 158부터 162 까지를 포함한다.

당업자는 zalpha11 리간드 폴리펩티드의 아미노산 서열의 변형을 디자인할 때 전체적인 구조적 및 생물학적 프로필을 파괴하지 않기 위하여 친수성 또는 소수성이 고려될 것임을 인지할 것이다. 대체의 경우 특히 관심있는 것은 Val, Leu 및 Ile 로 이루어지는 군 또는 Met, Gly, Ser, Ala, Tyr 및 Trp로 이루어지는 군으로부터 선택되는 소수성 잔기이다. 예를 들어, 치환을 허용하는 잔기는 SEQ ID NO:2에 도시된 바와 같은 잔기 100 및 103을 포함한다. SEQ ID NO:2의 위치 71, 78, 122 및 125에서 시스테인 잔기는 상대적으로 치환되지 않을 수도 있다.

필수 아미노산의 동일성은 또한 IL-15, IL-2, IL-4 및 GM-CSF와 zalpha11 리간드 사이의 서열 유사성의 분석으로부터 추론될 수 있다. 전술한 "FASTA" 분석법과 같은 방법을 사용하여 유사성이 높은 영역들이 단백질 패밀리내에서 확인되고 보존된 영역에 대한 아미노산 서열을 분석하기 위하여 사용된다. 구조를 토대로 하여 변이 zalpha11 리간드 폴리뉴클레오티드를 확인하기 위한 또 다른 접근법은 추정되는 변이 zalpha11 리간드 유전자를 코드화하는 핵산 분자가 상기 논의된 바와 같이, SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 서열을 가지고 있는 핵산 분자에 혼성화할 수 있는 지의 여부를 측정하는 것이다.

본 발명의 폴리펩티드의 필수 아미노산을 확인하는 다른 방법들은 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들면 부위-특정 돌연변이 생성 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이 생성이 있다 (Cunningham and Wells, Science 244:1081 (1989), Bass et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4498 (1991), Coombs and Corey, "부위-특정 돌연변이 생성 및 단백질 공학", in Proteins:Analysis and Design, Angeletti Ied.O, pages 259-311 (Academic Press, Inc. 1998)). 후자의 기법에서 단일한 알라닌 돌연변이가 분자내에 있는 매 잔기마다 도입되고, 그 결과의 돌연변이 분자들은 하기에서 논의되는 바와 같이, 분자의 활성에 중요한 아미노산 잔기를 확인하기 위하여 생물학적 활성에 대하여 시험된다 (Hilton et al., J. Biol. Chem. 271:4699 (1996)).

본 발명은 또한 zalpha11 리간드 폴리펩티드의 기능성 단편 및 그러한 기능성 단편을 코드화하는 핵산 분자를 포함한다. 본원에서 규정된 바와 같은 "기능성" zalpha11 리간드 또는 그것의 단편은 그것의 증식 또는 분화 활성, 특수화된 세포 기능을 유도 또는 억제하는 능력, 또는 항-zalpha11 라간드 항체 또는 zalpha11 리셉터 (가용성 또는 고정화된)에 대한 특이한 결합 능력을 가지는 것을 특징으로 한다. 전술한 바와 같이, zalpha11 리간드는 SEQ ID NO:2에 도시한 바와 같은, 나선 A (아미노산 잔기 41 에서 56), 나선 B (아미노산 잔기 69 에서 84), 나선 C (아미노산 잔기 92 에서 105) 및 나선 D (아미노산 잔기 135 에서 148)을 포함하는 4-나선 번들 구조를 특징으로 한다. 그러므로, 본 발명은 추가로 (a) 상술된 나선의 하나 또는 둘 이상을 포함하는 폴리펩티드 분자, 및 (b) 이들 나선의 하나 또는 둘 이상을 포함하는 기능성 단편들을 포함하고 있는 융합 단백질을 제공한다. 융합 단백질의 다른 폴리펩티드 부분은 다른 4중-나선-번들 사이토킨, 예컨대 IL-15, IL-2, IL-4 및 GM-CSF, 또는 융합 단백질의 분비를 용이하게 해주는 비-천연 및/또는 관련이 없는 분비 신호 펩티드에 의해 제공될 수 있다.

따라서, 본 발명은 적어도 4개의 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공 하며, N-말단부터 C-말단까지 폴리펩티드의 순서는, (a) SEQ ID NO:111의 IL-2 나선 A 아미노산 잔기 36 에서 46; (b) SEQ ID NO:112의 IL-15 나선 A 아미노산 잔기 29 에서 43; (c) SEQ ID NO:113의 IL-4 나선 A 아미노산 잔기 45 에서 68; (d) SEQ ID NO: 114의 GMCSF 나선 A 아미노산 잔기 30 에서 44; 및 (e) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 41 에서 56으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산을 포함하는 제 1 폴리펩티드; 6 내지 27 아미노산의 제 1 스페이서; 그리고 (a) SEQ ID NO:111의 IL-2 나선 B 아미노산 잔기 53 에서 75; (b) SEQ ID NO:112의 IL-4 나선 B 아미노산 잔기 65 에서 83; (c) SEQ ID NO:113의 IL-15 나선 B 아미노산 잔기 84 에서 101; (d) SEQ ID NO: 114의 GMCSF 나선 B 아미노산 잔기 72 에서 81; 및 (e) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 69 에서 84로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기를 포함하는 제 2 폴리펩티드; 5 내지 11 아미노산 잔기의 제 2 스페이서; (a) SEQ ID NO:111의 IL-2 나선 C 아미노산 잔기 87 에서 99; (b) SEQ ID NO:112의 IL-4 나선 C 아미노산 잔기 95 에서 118; (c) SEQ ID NO:113의 IL-15 나선 C 아미노산 잔기 107 에서 119; (d) SEQ ID NO: 114의 GMCSF 나선 C 잔기 91 에서 102; 및 (e) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 92 에서 105로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기를 포함하는 제 3 폴리펩티드; 3 내지 29 아미노산 잔기의 제 3 스페이서; 그리고 (a) SEQ ID NO:111의 IL-2 나선 D 아미노산 잔기 103 에서 121; (b) SEQ ID NO:112의 IL-15 나선 D 아미노산 잔기 134 에서 157; (c) SEQ ID NO:113의 IL-4 나선 D 아미노산 잔기 134 에서 160; (d) SEQ ID NO: 114의 GMCSF 나선 D 아미노산 잔기 120 에서 131; 및 (e) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 135 에서 148로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기를 포함하는 제 4 폴리펩티드이고, 여기에서 4개 폴리펩티드 중 적어도 하나는 zalpha11 리간드로부터 유래한 것이다. 다른 구체예에서, 스페이서 펩티드는 표 1에 나타낸 바와 같은, zalpha11 리간드, IL-2, IL-4, IL-15 또는 GM-CSF의 A/B, B/C 및 C/D 루프로부터 선택될 것이다.

Zalpha11 리간드 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 분자의 기능성 단편들을 얻기 위하여 핵산 분자에 대한 기본적인 결실 분석이 수행될 수 있다. 간단히 예를 들면, SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 서열을 가지고 있는 DNA 분자 또는 그것의 단편들은 일련의 차곡차곡 포개어진 결실을 얻기 위하여 Bal31 뉴클레아제로 소화될 수 있다. 그런 다음 이들 DNA 단편들은 적절한 리딩 프레임으로 발현 벡터안에 삽입되고, 발현된 폴리펩티드들은 분리되어 zalpha11 리간드 활성에 대해서, 또는 항-zalpha11 리간드 항체 또는 zalpha11 리셉터에 결합하는 능력에 대하여 시험된다. 또 다른 엑소뉴클레아제 소화 한 가지는 올리고뉴클레오티드-특정 돌연변이생성을 사용하여 원하는 zalpha11 리간드 단편의 생성을 구체화하기 위하여 결실 또는 중지 코돈을 도입하는 것이다. 또는 달리, zalpha11 리간드 유전자의 특정 단편이 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 합성될 수 있다.

기능성 도메인을 확인하기 위한 표준 방법들은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 인터페론의 양 단부 중 하나 또는 양 단부에 대한 연구가 문헌에 요약되어 있다 (Horisberger and Di Narco, Pharmac. Ther. 66:507 (1995). 더욱이, 단백질의 기능적 분석에 대한 표준 기법은 문헌에 설명되어 있다 (Treuter et al., Molec. Gen. Genet. 240:113 (1993); Content et al., "사람 인터페론에 의해 유도된 42 kDa 2-5A 합성효소의 발현 및 예비 결실 분석", in Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (ed.), pages 65-72 (Nijhoff 1987); Herschman, "The EGF Receptor," in Control of Animal Cell Proliferation 1, Boynton et al., (eds.) pages 169-199 (Academic Press 1985); Coumailleau et al., J. Biol. Chem. 270:29270 (1995); Fukunaga et al., J. Biol. Chem. 270:25291 (1995); Yamaguchi et al., Biochem. Pharmacol. 50:1295 (1995); Meisel et al., Plant Molec. Biol. 30:1 (1996)).

다중 아미노산 치환은 공지되어 있는 돌연변이 생성 및 스크리닝 방법, 예를 들면 라이트하르-올슨 및 사우어에 의해 또는 보위와 사우어에 의해 설명된 것과 같은 방법들에 의해 이루어지고 시험될 수 있다 (Reidhaar-Olson and Sauer, Science 241:53-57, 1988; Bowie and Sauer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-2156, 1989). 간단하게 설명하면, 이들 저자는 폴리펩티드안의 둘 또는 그 이상의 위치를 동시에 무작위화하고, 기능성 폴리펩티드를 선택한 후, 각각의 위치에서 허용될 수 있는 치환의 스펙트럼을 결정하기 위하여 돌연변이된 폴리펩티드를 서열화하는 방법을 개시하였다. 사용될 수 있는 다른 방법으로는 파지 디스플레이 (Lowman et al., Biochem. 30:10832-10837, 1991; Ladner et al., 미국 특허 제 5,223,409 호; Huse, 국제 공보 WO 92/06204), 및 영역-특정 돌연변이 생성 (Derbyshire et al., Gene 46:1986; Ner et al., DNA 7:127, 1988)이 있다.

개시된 zalpha11 리간드 뉴클레오티드와 폴리펩티드 서열의 변이체들이 또한 문헌에 개시된 바와 같이 DNA 셔플링을 통하여 생성될 수 있다 (Stemmer, Nature 370:389, 1994; Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751, 1994; 국제 공보 WO 97/20078). 간단히 설명하면, 변이 DNA 분자는 모 DNA의 무작위 단편화와 이어지는 PCR을 사용한 어젬블리에 의하여 동종 재조합되고, 그 결과 무작위로 도입된 점 돌연변이가 일어남으로써 생성될 수 있다. 이 기법은 과정에 추가의 가변성을 도입시키기 위하여 모 DNA 분자의 패밀리, 예를 들면 대립성 변이체 또는 다른 종으로부터의 DNA 분자를 사용함으로써 변형될 수 있다. 원하는 활성에 대한 선택 또는 스크리닝과, 이어지는 돌연변이 생성 및 분석의 추가의 반복은, 바람직한 돌연변이를 선택하는 한편 동시에 불리한 변화에 대하여 선택함으로써 서열의 신속한 "진화"를 제공한다.

본원에서 개시되는 것과 같은 돌연변이 생성법은 고-출력의 자동화된 스크리닝 방법과 조합되어 숙주 세포에서의 클론되고 돌연변이된 폴리펩티드의 활성을 검출할 수 있다. 생물학적으로 활성인 폴리펩티드, 또는 항-zalpha11 리간드 항체 또는 가용성 zalpha11 리셉터와 결합하는 폴리펩티드를 코드화하는 돌연변이된 DNA 분자들은 현대적인 장비를 사용하여 숙주 세포로부터 회수되어 신속하게 서열화될 수 있다. 이들 방법은 관심의 폴리펩티드의 개별적인 아미노산 잔기의 중요성에 대한 신속한 측정을 가능하게 하며, 미지의 구조를 가지는 폴리펩티드에도 적용될 수 있다.

또한, 본 발명의 단백질 (또는 그것의 폴리펩티드 단편)은 다른 생체활성 분자, 특히 다른 사이토킨과 결합하여 다중-기능성 분자를 제공할 수 있다. 예를 들면, zalpha11 리간드로부터의 하나 또는 둘 이상의 나선이 그것들의 생물학적 성질 또는 생성 효율을 증강시키기 위하여 다른 사이토킨과 결합될 수 있다.

본 발명은 그러므로 zalpha11 리간드의 하나 또는 둘 이상의 나선을 포함하고 있는 절편이 다른 폴리펩티드에 융합되어 있는 일련의 신규한 혼성 분자를 제공한다. 융합은 바람직하게는 DNA 수준에서 재조합 제조 시스템에서의 키메릭 분자의 발현을 가능하게 하는 스플라이싱에 의해 이루어진다. 다음 단계로 그 결과 생성된 분자는 개선된 용해도, 개선된 안정성, 연장된 제거 반감기, 개선된 발현 및 분비 수준, 및 약력학과 같은 성질에 대해 분석된다. 그러한 혼성 분자는 추가로 성분 단백질들 또는 폴리펩티드들 사이에 추가의 아미노산 잔기 (예컨대 폴리펩티드 링커)를 포함할 수 있다.

비-자연 발생적인 아미노산 잔기들로는 트랜스-3-메틸프롤린, 2,4-메타노프롤린, 시스-4-히드록시프롤린, 트랜스-4-히드록시프롤린, N-메틸글리신, 알로-트레오닌, 메틸트레오닌, 히드록시에틸시스테인, 히드록시에틸호모시스테인, 니트로글루타민, 호모글루타민, 피페콜산, 티아졸리딘 카르복실산, 데히드로프롤린, 3- 및 4-메틸프롤린, 3,3-디메틸프롤린, tert-로이신, 노르발린, 2-아자페닐알라닌, 3-아자페닐알라닌, 4-아자페닐알라닌, 및 4-플루오로페닐알라닌이 있으며, 제한은 없다. 비-자연 발생적인 아미노산 잔기를 단백질안에 통합시키는 여러 가지 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 넌센스 돌연변이가 화학적으로 아미노아실화된 억제제 tRNA를 사용하여 억제되는 시험관내 시스템이 사용될 수 있다. 아미노산을 합성하는 방법 및 tRNA를 아미노아실화하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 넌센스 돌연변이를 함유하고 있는 플라스미드의 전사 및 번역은 대장균 S30 추출물 및 상업적으로 이용할 수 있는 효소 및 다른 시약을 포함하고 있는 세포-유리 시스템에서 수행된다. 단백질은 크로마토그래피에 의해 정제된다. (예컨대 ,Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991; Ellman et al., Methods enzymol. 202:301, 1991; Chung et al., Science 259:806-809, 1993; Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-10149, 1993 참조).

두 번째 방법으로, 번역은 돌연변이된 mRNA와 화학적으로 아미노아실화된 억제제 tRNA의 미세 주사에 의하여 제노푸스 난모세포에서 수행된다 (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271:19991-19998, 1996). 세 번째 방법으로, 대장균 세포가 있어야 할 천연 아미노산 (예컨대 페닐알라닌)의 부재 및 원하는 비-자연 발생적인 아미노산(들) (예컨대 2-아자페닐알라닌, 3-아자페닐알라닌, 4-아자페닐알라닌, 또는 4-플루오로페닐알라닌)의 존재하에 배양된다. 비-자연 발생적인 아미노산은 그것의 천연 대응물 대신에 단백질안에 통합된다 (Koide et al., Biochem. 33:7470-7476, 1994 참조). 자연 발생적인 아미노산 잔기들은 시험관내에서 화학적 변형에 의하여 비-자연 발생적인 종으로 전환될 수 있다. 화학적 변형은 치환의 범위를 더 확대시키기 위하여 부위-특정 돌연변이 생성과 조합될 수 있다 (Wynn and Richards, Protein Sci. 2:395-403, 1993). 분자의 반감기를 연장시키기 위해, 특히 활성 상태에서 대사 지속성을 연장시키기 위해 zalpha11 리간드를 안정화시키는 것이 유리할 수 있다. 연장된 반감기를 달성하기 위해, zalpha11 리간드 분자는 본원에 설명된 방법을 사용하여 화학적으로 변형될 수 있다. PEG화가 통상적으로 사용되는 한 방법이며, 이것은 플라스마 반감기를 증가시킨다고 증명되었고, 가용성 을 증가시키고 항원성 및 면역원성을 감소시킨다 (Nucci et al., Advanced Drug Delivery Reviews 6:133-155, 1991 및 Lu et al., Int. J. Peptide Protein Res. 43:127-138, 1994).

제한된 수의 비-보존성 아미노산, 유전자 코드에 의하여 코드화되지 않은 아미노산들, 비-자연 발생적인 아미노산들, 및 비천연 아미노산들이 zalpha11 리간드 아미노산 잔기대신 치환될 수 있다.

본 발명은 또한 본원에 설명된 zalpha11 리간드 폴리펩티드의 에피토프를 가진 부분을 포함하는 폴리펩티드 단편 또는 펩티드를 제공한다. 그러한 단편 또는 펩티드는, 전체 단백질이 면역원으로서 사용될 때 항체 반응을 유발하는 단백질의 부분인, "면역원성 에피토프"를 포함할 수 있다. 면역원성 에피토프를 가진 펩티드는 표준 방법 (예를 들어, Geysen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81:3998 (1983) 참조)을 사용하여 확인될 수 있다.

반대로, 폴리펩티드 단편 또는 펩티드는, 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 분자의 영역인, "항원성 에피토프"를 포함할 수 있다. 어떤 에피토프는 아미노산의 선형 또는 연속되는 스트레치로 구성되며, 그러한 에피토프의 항원성은 변성제에 의해 파괴되지 않는다. 단백질의 에피토프를 의태할 수 있는 비교적 짧은 합성 펩티드가 단백질에 대한 항체의 생성을 자극하기 위해 사용될 수 있다는 것이 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, Sutcliffe et al., Science 219:660 (1983) 참조). 따라서, 본 발명의 항원성 에피토프를 가진 펩티드 및 폴리펩티드는 본원에 설명된 폴리펩티드와 결합하는 항체를 발생시키는데 유용하다. Hopp/Woods 친수성 프로파일이 최대의 항원성 잠재성을 가지고 있는 영역을 측정하기 위해 사용될 수 있다 (Hopp et al., 1981 및 Hopp, 1986, 상기 동일). zalpha11 리간드에서 이들 영역은 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 114 에서 119, 101 에서 105, 126 에서 131, 113 에서 118, 및 158 에서 162를 포함한다.

항원성 에피토프를 가진 펩티드 및 폴리펩티드는 바람직하게는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:56의 적어도 4개 내지 10개의 아미노산, 적어도 10개 내지 14개의 아미노산, 또는 약 14개 내지 약 30개의 아미노산을 함유한다. 그러한 에피토프를 가진 펩티드 및 폴리펩티드는, 본원에 설명된 바와 같이, zalpha11 리간드 폴리펩티드를 단편화함에 의해, 또는 화학적 펩티드 합성에 의해 생성될 수 있다. 더욱이, 에피토프는 랜덤 펩티드 라이브러리들의 파지 디스플레이에 의해 선택될 수 있다 (예를 들어, Lane and Stephen, Curr. Opin. Immunol. 5:268 (1993); 및 Cortese et al., Curr. Opin. Biotechnol. 7:616 (1996) 참조). 에피토프를 포함하는 작은 펩티드들로부터 에피토프를 확인하고 항체를 생성하는 표준 방법이 문헌상에 설명되어 있다 (예를 들어, Mole, "Epitope Mapping." in Methods in Molecular Biology, Vol. 10, Manson (ed.), pages 105-116 (The Humana Press, Inc., 1992; Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter and Ladyman (eds.), pages 60-84 (Cambridge University Press 1995), and Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, pages 9.3.1-9.3.5 and pages 9.4.1-9.4.11 (John Wiley & Sons 1997)).

변이 zalpha11 리간드 폴리뉴클레오티드의 특정 뉴클레오티드 서열에 관계없이, 폴리뉴클레오티드는 증식 또는 분화 활성, 특수한 세포 기능을 유발 또는 억제하는 능력, 또는 항-zalpha11 리간드 항체 또는 zalpha11 리셉터에 특이적으로 결합하는 능력을 특징으로 하는 폴리펩티드를 코드화한다. 더욱 구체적으로, 변이 zalpha11 리간드 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:2에 도시된 바와 같은 폴리펩티드들 중 적어도 50%, 바람직하게는 70%, 80%, 또는 90% 이상의 활성을 나타내는 폴리펩티드들을 코드화할 것이다.

변이체 및 융합 단백질을 포함하여 어떠한 zalpha11 리간드 폴리펩티드에 대해서든지, 당업자는 상기 표 1 및 표 2에 나타낸 정보를 사용하여 그 변이체를 코드화하는 완전히 축퇴성인 폴리뉴클레오티드 서열을 쉽게 생성할 수 있다.

본 발명은 추가로 다양한 다른 폴리펩티드 융합 (및 하나 이상의 폴리펩티드 융합을 포함하는 관련된 다량체 단백질)을 제공한다. 예를 들어, zalpha11 리간드 폴리펩티드는 미국 특허 제 5,155,027 호 및 5,567,584 호에 개시되어 있는 바와 같이 이량체화하는 단백질에 대한 융합물로서 제조될 수 있다. 이런 견지에서 바람직한 이량체화 단백질은 면역글로불린 불변 영역 도메인을 포함한다. 면역글로불린-zalpha11 리간드 폴리펩티드 융합물은 유전공학적으로 처리된 세포에서 (다양한 다량체 zalpha11 리간드 유사체를 생성하도록) 발현될 수 있다. 보조 도메인이 zalpha11 리간드 폴리펩티드를 특정 세포, 조직, 또는 거대분자에 대하여 표적화하기 위하여 zalpha11 리간드 폴리펩티드에 융합될 수 있다. 예를 들어, zalpha11 리간드 폴리펩티드 또는 단백질은, zalpha11 리간드 폴리펩티드를 표적 세포의 표면상의 리셉터에 특이적으로 결합하는 리간드에 융합시킴으로써, 정해진 세포 유형에 표적화될 수 있다. 이런 방식으로, 폴리펩티드 또는 단백질은 치료 또는 진단의 목적을 위해 표적화될 수 있다. zalpha11 리간드 폴리펩티드는 둘 또는 그 이상의 부분, 예컨대 정제를 위한 친화성 태그 및 표적화 도메인에 융합될 수 있다. 폴리펩티드 융합물은 또한 하나 이상의 절단 부위, 특히 도메인 사이에 있는 그런 부위들을 포함할 수 있다 (Tuan et al., Connective Tissue Research 34:1-9, 1996).

본원에 논의된 방법을 사용하여, 당업자는 SEQ ID NO:2의 잔기 1 에서 162 또는 33 에서 162에 대해 실질적으로 유사한 서열 동일성을 가지고 있는 다양한 폴리펩티드, 또는 기능적 단편 및 그것들의 융합물을 확인 및/또는 제조할 수 있으며, 그러한 폴리펩티드 또는 단편 또는 융합물은 야생형 단백질의 성질, 예컨대 증식, 분화를 자극하고, 특수한 세포 기능을 유도하며, zalpha11 리셉터 또는 zalpha11 리간드 항체를 결합시키는 능력을 계속 유지한다.

본 발명의 zalpha11 리간드 폴리펩티드는 전-길이의 폴리펩티드, 기능적 단편, 및 융합 폴리펩티드를 포함하여, 종래의 기법에 따라 유전공학적으로 제조된 숙주 세포에서 생성될 수 있다. 적당한 숙주 세포는 외인성 DNA로 형질전환될 수 있고 배양중에 성장할 수 있는 그러한 세포 유형으로, 박테리아, 진균 세포, 및 배양된 고등 진핵 세포가 포함된다. 진핵 세포, 특히 다핵 유기체의 배양 세포가 바람직하다. 클론된 DNA 분자를 조작하고 외인성 DNA를 다양한 숙주 세포안에 도입시키는 방법들은 문헌에 개시되어 있다 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987).

일반적으로, zalpha11 리간드 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 서열은 발현 벡터내에서 그것의 발현을 위해 필요한 다른 유전적 요소, 일반적으로는 전사 프로모터 및 터미네이터에 작동가능하게 연결된다. 비록 당업자가 특정 시스템내에서 선택가능한 마아커가 별도의 벡터상에 제공되고, 외인성 DNA의 복제가 숙주 세포 게놈안으로의 통합에 의하여 제공될 수 있음을 인지하게 되더라도, 벡터는 또한 통상적으로 하나 또는 둘 이상의 선택가능한 마아커 및 하나 또는 둘 이상의 복제 기원을 함유할 것이다. 프로모터, 터미네이터, 선택가능한 마아커, 벡터 및 다른 요소들의 선택은 당업자의 기술 수준내에 있는 기본적인 디자인의 문제이다. 그러한 많은 요소들이 문헌에 설명되어 있으며, 상업적인 공급체들로부터 이용가능하다.

숙주 세포의 분비 경로안에 zalpha11 리간드 폴리펩티드를 지정하기 위해서, 분비 신호 서열 (또는 리더 서열, 프레프로 서열 또는 프레 서열로도 공지됨)이 발현 벡터안에 제공된다. 분비 신호 서열은 zalpha11 리간드의 것일 수도 있고, 또는 다른 분비된 단백질 (예컨대 t-PA)로부터 유도될 수도 있고 또는 새롭게 합성될 수도 있다. 분비 신호 서열은 zalpha11 리간드 DNA 서열에 작동가능하게 연결된다. 즉 두 서열은 정확한 리딩 프레임으로 결합되어 숙주 세포의 분비 경로 안으로 새롭게 합성된 폴리펩티드를 지정하도록 자리를 잡는다. 분비 신호 서열은 통상적으로 관심의 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 서열의 5'쪽에 위치하지만, 어떤 분비 신 호 서열은 관심의 DNA 서열의 그 밖의 어느 곳에든지 위치할 수 있다 (Welch et al., 미국 특허 제 5,037,743 호; Holland et al., 미국 특허 제 5,143,830 호).

또는 달리, 본 발명의 폴리펩티드에 함유된 분비 신호 서열은 분비 경로안에 다른 폴리펩티드를 지정하기 위하여 사용된다. 본 발명은 그러한 융합 폴리펩티드를 제공한다. 신호 융합 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 1 에서 31까지의 유도된 분비 신호 서열이 당업계에 공지되고 본원에 개시된 방법들을 사용하여 다른 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 서열에 작동가능하게 연결되도록 만들어질 수 있다. 본 발명의 융합 폴리펩티드에 함유된 분비 신호 서열은 바람직하게는 아미노-말단쪽으로 추가의 펩티드에 융합되어 추가의 펩티드를 분비 경로안에 지정한다. 그러한 구성물은 당업계에 공지된 많은 적용 분야를 갖는다. 예를 들어, 이들 새로운 분비 신호 서열 융합 구성물은 정상적으로 분비되지 않는 단백질의 활성 성분의 분비를 지정할 수 있다. 그러한 융합물은 분비 경로를 통하여 펩티드를 지정하기 위하여 생체내에서 또는 생체외에서 사용될 수 있다.

배양된 포유류 세포가 본 발명내에서 적당한 숙주이다. 외인성 DNA를 포유류 숙주 세포안에 도입시키기 위한 방법으로는 인산 칼슘-중재된 형질전환 (Wigler et al., Cell 14:725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981; Graham and Van der Eb, Virology 52:456, 1973), 전기천공(Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982), DEAE-덱스트란 중재 형질전환 (Ausubel et al., 상기 동일), 및 리포좀-중재 형질전환 (Hawley-Nelson et al., Focus 15:73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15:80, 1993), 및 바이러스 벡터 (Miller and Rosman, BioTechniques 7:980-990, 1989; Wang and Finer, Nature Med. 2:714-716, 1996)가 있다. 배양된 포유류 세포에서의 재조합 폴리펩티드의 생성은 문헌에 개시되어 있다 (Levinson et al., 미국 특허 제 4,713,339 호; Hagen et al., 미국 특허 제 4,784,950 호; Palmiter et al., 미국 특허 제 4,579,821 호; 및 Ringold, 미국 특허 제 4,656,134 호). 적당한 배양 포유류 세포로는 COS-1 (ATCC No. CRL 1650), COS-7 (ATCC No. CRL 1651), BHK (ATCC No. CRL 1632), BHK 570 (ATCC No. CRL 10314), 293 (ATCC No. CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977) 및 차이니즈 햄스터 난소 (예컨대 CHO-K1; ATCC No. CCL 61) 셀라인이 있다. 추가의 적당한 셀라인이 당업계에 공지되어 있으며, 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션 (Manasssa, VA)과 같은 공공 기탁기관으로부터 이용가능하다. 일반적으로, 강한 전사 프로모터, 예컨대 SV-40 또는 사이토메갈로바이러스로부터 유도된 프로모터들이 바람직하다 (미국 특허 제 4,956,288 호). 다른 적당한 프로모터로는 메탈로티오네인 유전자로부터 유도된 것들 (미국 특허 제 4,579,821 호 및 4,601,978 호)과 아데노바이러스 주요 후기 프로모터가 있다.

약물 선택은 일반적으로 외래 DNA가 삽입된 배양 포유류 세포를 선택하기 위하여 사용된다. 그러한 세포는 통상적으로 "형질전환체"로 언급된다. 선택제제의 존재하에 배양되고 유전자가 그것들의 자손으로 계대될 수 있는 세포들은 "안정한 형질전환체"로 언급된다. 바람직한 선택가능한 마아커는 항생물질 네오마이신에 대한 내성을 코드화하는 유전자이다. 선택은 네오마이신-유사 약물, 예컨대 G-418 등의 존재하에 수행된다. 선택 시스템은 또한 관심의 유전자의 발현 수준을 증가시키 기 위하여 사용될 수 있으며, 그 과정을 "증폭"으로 언급한다. 증폭은 형질전환체를 낮은 수준의 선택 제제의 존재하에 배양한 후, 도입된 유전자의 생성물을 높은 수준으로 생성하는 세포들에 대하여 선택하기 위하여 선택 제제의 양을 증가시킴으로써 수행된다. 바람직한 증폭성 선택가능한 마아커는 디하이드로폴레이트 환원효소이며, 이것은 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여한다. 다른 약물 내성 유전자 (예컨대 하이그로마이신 내성, 다중-약물 내성, 퓨로마이신 아세틸트랜스페라제)도 사용될 수 있다. 변경된 표현형을 도입시키는 또 다른 마아커, 예컨대 녹색 형광 단백질, 또는 세포 표면 단백질, 예컨대 CD4, CD8, 제 I 부류 MHC, 태반 알칼리성 포스파타제가 FACS 분류법 또는 자기 비드 분리 기법과 같은 수단에 의해 형질전환되지 않은 세포로부터 형질전환된 세포를 분류하기 위하여 사용될 수 있다.

식물 세포, 곤충 세포 및 조류 세포를 포함하여 다른 고등 진핵 세포들이 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 식물 세포에서의 유전자 발현을 위한 벡터로서 아그로박테리움 리조게네스를 사용하는 것에 대해서는 문헌에서 검토된 바 있다 (Sinker et al., J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58, 1987). 곤충 세포의 형질전환 및 그 안에서의 외래 폴리펩티드의 생성에 대해서도 문헌에 개시되어 있다 (Guarino et al., 미국 특허 제 5,162,222 호 및 WIPO 공보 WO 94/06463). 곤충 세포는 오토그라파 캘리포니카 뉴클레어폴리헤드로시스 바이러스 (AcNPV)로부터 통상적으로 유도된 재조합 배큘로바이러스로 감염될 수 있다 (King, L.A. and Possee, R.D., The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, London, Chapman & Hall; O'Reilly, D.R. et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York, Oxford University Press., 1994; Richardson, C.D., Ed., Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995). 재조합 zalpha11 배큘로바이러스를 만드는 두 번째 방법은 루코프에 의해 설명된 트랜스포존-기초 시스템을 활용한다 (Luckow, V.A. et al., J. Virol. 67:4566-4579, 1993). 이 시스템은 Bac-to-Bac^TM 키트로 시판된다 (Life Technologies, Rockville, MD). 이 시스템은 zalpha11 리간드 폴리펩티드를 코드화하는 DNA를 "백미드"로 불리는 큰 플라스미드로서 대장균안에 유지되는 배큘로바이러스 게놈안에 이동시키기 위하여 Tn7 트랜스포존을 함유하고 있는 수송 벡터, pFastBacl^TM (Life Technologies)을 활용한다. pFastBac1^TM 수송 벡터는 이 경우 zalpha11 리간드인 관심의 유전자의 발현을 추진하기 위해 AcNPV 폴리헤드린 프로모터를 활용한다 (Hill-Perkins, M.S. and Possee, R.D., J. Gen. Virol. 71:971-976, 1990; Bonning, B.C. et al., J. Gen. Virol. 75:1551-1556, 1994; Chazenbalk, G.D. and Rapoport, B., J Biol. Chem. 270:1543-1549, 1995 참조). 그러한 수송 벡터 구성물에서, 짧거나 또는 긴 버전의 염기 단백질 프로모터가 사용될 수 있다. 더욱이, 수송 벡터는 자생적 zalpha11 리간드 분비 신호 서열을 곤충 단백질로부터 유도된 분비 신호 서열로 대체한 것으로 구성될 수 있다. 예를 들어, Ecdysteroid Glucosyltransferase (EGT), 꿀벌 Melittin (Invitrogen, Carlsbad, CA), 또는 배큘로바이러스 gp67 (PharMingen, San Diego, CA)로부터의 분비 신호 서열이 자생적 zalpha11 리간드 분비 신호 서열을 대체하기 위한 구성물 에 사용될 수 있다. 여기에 더하여, 수송 벡터는 발현된 zalpha11 리간드 폴리펩티드의 C- 또는 N-말단에 있는 에피토프 태그, 예를 들면 Glu-Glu 에피토프 태그 (Grussenmeyer, T. et al,. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952-7954, 1985)를 코드화하는 DNA와의 프레임-내 융합물을 포함할 수 있다. 당해 기술분야에 공지되어 있는 기법을 사용하여, zalpha11 리간드를 함유하고 있는 수송 벡터는 대장균에 형질전환되고, 재조합 배큘로바이러스를 나타내는 차단된 lacZ 유전자를 함유하고 있는 백미드에 대해 스크리닝된다. 재조합 배큘로바이러스 게놈을 함유하고 있는 백미드 DNA는 통상적인 기법을 사용하여 분리되고, 스포돕테라 프루기페르다 세포, 예컨대 Sf9 세포를 형질전환시키기 위하여 사용된다. zalpha11 리간드를 발현하는 재조합 바이러스는 계속해서 제조된다. 재조합 바이러스 스톡은 당해 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법들에 의하여 만들어진다.

재조합 바이러스는 숙주 세포, 전형적으로 가을 유충, 스포돕테라 프루기페르다로부터 유도된 셀라인을 감염시키기 위하여 사용된다 (Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C., 1994). 다른 적당한 셀라인은 트리코플루시아 니 (Trichoplucia ni)로부터 유도된 High FiveO^TM 셀라인 (Invitrogen)이다 (미국 특허 제 5,300,435 호).

효모 세포를 포함하여, 진균 세포들이 또한 본 발명내에서 사용될 수 있다. 본원의 견지에서 특히 관심이 있는 효모 종은 사카로마이세스 세레비시아에, 피치 아 파스토리스, 및 피치아 메타놀리카이다. 사카로마이세스 세레비시아에 세포를 외래 DNA로 형질전환하고, 그것으로부터 재조합 폴리펩티드를 제조하는 방법들은 문헌에 개시되어 있다 (Kawasaki, 미국 특허 제 4,599,311 호; Kawasaki et al., 미국 특허 제 4,931,373 호; Brake, 미국 특허 제 4,870,008 호; Welch et al., 미국 특허 제 5,037,743 호; Murray et al., 미국 특허 제 4,845,075 호). 형질전환된 세포들은 선택가능한 마아커, 통상적으로는 약물 내성 또는 특정 영양분 (예컨대 로이신)이 없을 때 성장하는 능력에 의해 결정된 표현형에 의하여 선택된다. 사카로마이세스 세레비시아에에서 사용하기에 바람직한 벡터 시스템은 형질전환된 세포들이 글루코오스-함유 배지에서의 성장에 의해 선택되는 것을 가능하게 하는, 가와사키 등에 의해 개시된 (미국 특허 제 4,931, 373 호) POT1 벡터 시스템이다. 효모에서 사용하기에 적당한 프로모터 및 터미네이터로는 당분해 효소 유전자로부터 유도된 것들 (Kawasaki, 미국 특허 제 4,599,311 호; Kingsman et al., 미국 특허 제 4,615,974 호; Bitter, 미국 특허 제 4,977,092 호) 및 알코올 데히드로게나제 유전자로부터 유도된 것들이 있다 (미국 특허 제 4,990,446 호; 5,063,154 호; 5,139,936 호 및 4,661,454 호 참조). 다른 효모, 예컨대 Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii 및 Candida maltosa를 위한 형질전환 시스템들이 당업계에 알려져 있다 (Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459-3465, 1986 및 Cregg, 미국 특허 제 4,882,279 호) 아스페르길루스 세포들은 맥나이트 등의 방법에 따라 사용될 수 있다 (McKnight et al., 미국 특허 제 4,935,349 호). Acremonium chrysogenum을 형질전환시키는 방법은 스미노 등의 미국 특허 제 5,162,228 호 (Sumino et al.)에 설명되어 있다. Neurospora를 형질전환시키는 방법은 람보비츠의 미국 특허 제 4,486,533 호 (Lambowitz)에 개시되어 있다.

재조합 단백질의 제조를 위한 숙주로서의 피치아 메타놀리카의 사용은 WIPO 공보 WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/01536 및 WO 98/02565에 개시되어 있다. 피치아 메타놀리카를 형질전환하는데 사용하기 위한 DNA 분자는 통상적으로 이중-가닥의 원형 플라스미드로서 제조될 것이고, 바람직하게는 형질전환전에 선형화될 것이다. 피치아 메타놀리카에서의 폴리펩티드 제조를 위해서는, 플라스미드의 프로모터 및 터미네이터가 피치아 메타놀리카 유전자의 프로모터 및 터미네이터, 예컨대 피치아 메타놀리카 알코올 활용 유전자 (AUG1 또는 AUG2)의 프로모터 및 터미네이터인 것이 바람직하다. 다른 유용한 프로모터로는 디히드록시아세톤 합성효소 유전자의 프로모터 (DHAS), 포름산염 데히드로게나제 유전자의 프로모터(FMD), 및 카탈라제 유전자의 프로모터 (CAT)가 있다. 숙주 염색체안으로의 DNA의 통합을 촉진하기 위해서는, 숙주 DNA 서열의 양 단부 옆에 플라스미드의 전체 발현 절편이 있는 것이 바람직하다. 피치아 메타놀리카에서 사용하기에 바람직한 선택가능한 마아커는 피치아 메타놀리카 ADE2 유전자로, 이것은 포스포리보실-5-아미노이미다졸 카르복실라제 (AIRC; EC 4.1.1.21)를 코드화하며, ade2 숙주 세포가 아데닌 없이 성장하는 것을 가능하게 한다. 메탄올의 사용을 최소화하는 것이 바람직한 대규모의 산업적 과정을 위해서는, 두가지 메탄올 활용 유전자 (AUG1 및 AUG2)가 결실되어 있는 숙주 세포를 사용하는 것이 바람직하다. 분비된 단백질의 제조를 위해서는, 공포의 (vacuolar) 프로테아제 유전자 (PEP4 및 PRB1)가 없는 숙주 세포가 바람직하다. 피치아 메타놀리카 세포안에 관심의 폴리펩티드를 코드화하는 DNA를 함유하고 있는 플라스미드를 도입하는 것을 용이하게 하기 위하여 전기천공이 사용된다. 피치아 메타놀리카 세포를 2.5에서 4.5 kV/cm, 바람직하게는 약 3.75 kV/cm의 자기장 세기와, 1 내지 40 밀리초, 가장 바람직하게는 약 20 밀리초의 시간 상수 (Ω)를 가지는, 지수적으로 감쇠하는 맥동 전기장을 사용하여 전기천공에 의해 형질전환하는 것이 바람직하다.

박테리아 대장균, 바실루스 및 다른 속의 스트레인들을 포함하여 원핵 숙주 세포들이 또한 본 발명내에서 유용한 숙주 세포들이다. 이들 숙주를 형질전환시키고 그 안에 클론된 외래 DNA 서열을 발현시키는 기법들은 당해 기술분야에 공지이다 (Sambrook et al., 상기 동일). 대장균과 같은 박테리아에서 zalpha11 리간드 폴리펩티드가 발현될 때, 폴리펩티드는 원형질에, 전형적으로는 불용성 과립으로서 보유되거나, 또는 박테리아 분비 서열에 의해 말초 공간을 향해 지정될 수도 있다. 전자의 경우에, 세포는 용해되고, 과립이 회수되어, 예를 들면 구아니딘 이소티오시아네이트 또는 우레아를 사용하여 변성된다. 변성된 폴리펩티드는 그런 다음 다시 접혀지고, 예컨대 우레아 용액 및 환원되고 산화된 글루타티온의 조합에 대한 투석과, 계속해서 완충 식염 용액에 대한 투석에 의해서와 같은, 변성제의 희석에 의하여 이량체화된다. 후자의 경우에는, 폴리펩티드는 말초 공간의 내용물을 방출시키기 위하여 세포를 파괴하고 (예컨대 초음파처리 또는 삼투 쇼크에 의해), 단백 질을 회수함으로써 가용성이고 기능적인 형태로 말초 공간으로부터 회수될 수 있고, 그로써 변성 및 재접힘에 대한 요구가 제거된다.

형질전환된 세포들은 종래 과정에 따라 선택된 숙주 세포의 성장에 필요한 영양분 및 다른 성분들을 함유하고 있는 배양 배지에서 배양된다. 규정된 배지 및 복합 배지를 포함한 다양한 적당한 배지가 당업계에 공지되어 있으며, 일반적으로 탄소 공급원, 질소 공급원, 필수 아미노산, 비타민 및 미네랄을 포함항다. 배지는 또한 성장 인자 또는 혈청과 같은 성분들을 필요에 따라 함유할 수 있다. 성장 배지는 일반적으로 외래적으로 첨가된 DNA를 함유하고 있는 세포를, 예를 들면 약물 선택 또는 발현 벡터상에 운반된 또는 숙주 세포안에 함께 형질전환된 선택가능함 마아커에 의해 상쇄되는 필수 영양분의 결핍에 의해 선택한다. 피치아 메타놀리카 세포는 적당한 탄소, 질소 공급원 및 미량의 영양분을 포함하고 있는 배지에서 약 25 ℃ 내지 35 ℃의 온도에서 배양된다. 액체 배양액에는 종래 수단, 예컨대 작은 플라스크의 진동 또는 발효기의 스파아징에 의해 충분한 공기가 통풍된다. 피치아 메타놀리카에 대한 바람직한 배양 배지는 YEPD (2 %의 D-글루코오스, 2 %의 Bacto^TM 펩톤 (Difco Laboratories, Detroit, MI), 1 %의 Bacto^TM 효모 추출물 (Difco Laboratories), 0.004 %의 아데닌 및 0.006 %의 L-로이신)이다.

본 발명의 폴리펩티드는 거대분자 오염, 특히 다른 단백질 및 핵산과 관련하여, 및 감염성 및 발열성 제제가 없이 80 % 이상의 순도로, 보다 바람직하게는 90 % 이상의 순도로, 더욱 바람직하게는 95 % 이상의 순도로 정제되는 것이 바람직하 며, 특히 바람직하게는 약학적으로 순수한 상태로, 즉 99.9 % 이상의 순도로 정제되는 것이 바람직하다. 바람직하게도, 정제된 폴리펩티드는 실질적으로 다른 폴리펩티드, 특히 동물 기원의 다른 폴리펩티드가 없다.

발현된 재조합 zalpha11 리간드 폴리펩티드 (또는 키메릭 zalpha11 리간드 폴리펩티드)는 분획화 및/또는 종래의 정제 방법 및 배지를 사용하여 정제될 수 있다. 암모늄 술페이트 침전 및 산 또는 케이오트로프 추출인 샘플의 분획화를 위해 사용될 수 있다. 예시적인 정제 단계로는 히드록시아파타이트, 크기 축출, FPLC 및 역상 고성능 액체 크로마토그래피가 있다. 적당한 크로마토그래피 배지로는 유도된 덱스트란, 아가로스, 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 특수 실리카 등이 있다. PEI, DEAE, QAE 및 Q 유도체가 바람직하다. 예시적인 크로마토그래피 배지로는 페닐, 부틸, 또는 옥틸기, 예컨대 페닐-세파로스 FF (Pharmacia), Toyopearl 부틸 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), 옥틸-세파로스 (Pharmacia)등으로 유도되는 배지; 또는 폴리아크릴계 수지, 예컨대 암버크롬 CG71 (Toso Haas) 등으로 유도된 배지가 있다. 적당한 고체 지지체는 그것들이 사용되는 조건하에서 불용성인 유리 비드, 실리카-기초 비드, 셀룰로스 수지, 아가로스 비드, 교차-결합된 아가로스 비드, 폴리스티렌 비드, 교차-결합된 폴리아크릴아미드 수지 등이다. 이들 지지체는 아미노기, 카르복실기, 술프히드릴기, 히드록시기 및/또는 탄수화물 부분에 의해 단백질이 부착되는 것을 허용하는 반응성기로 변형될 수 있다. 커플링 화학의 실예로는 시아노겐 브로마이드 활성화, N-히드록시숙신이미드 활성화, 에폭시드 활성화, 술프히드릴 활성화, 히드라지드 활성화, 및 카르보디이미드 커플링 화학을 위 한 카르복실 및 아미노 유도체가 있다. 이들 및 다른 고체 배지는 잘 알려져 있으며 당업계에서 널리 사용되고 있고, 상업적 공급체들로부터 구할 수 있다. 리셉터 폴리펩티드를 지지체 배지에 결합시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 특정 방법의 선택은 기본적인 디자인 문제이고, 부분적으로는 선택된 지지체의 성질에 의해 결정된다 (Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988).

본 발명의 폴리펩티드는 그것들의 물리적 또는 생화학적 성질의 개발에 의해 분리될 수 있다. 예를 들어, 고정된 금속 이온 흡착 (IMAC) 크로마토그래피는 폴리히스티딘 태그를 포함하여, 히스티딘이 풍부한 단백질을 정제하기 위해 사용될 수 있다. 간단하게 설명하면, 겔이 먼저 2가의 금속 이온으로 하전되어 킬레이트가 형성된다 (Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1-7, 1985). 히스티딘이 풍부한 단백질은 사용된 금속 이온에 따라 친화력을 달리하면서 이 매트릭스에 흡착될 것이고, 경합 용출, pH 의 강하, 또는 강력한 킬레이트제의 사용에 의해 용출될 것이다. 다른 정제 방법으로는 렉틴 친화성 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피에 의한 글리코실화된 단백질의 정제 (Methods in Enzymol., Vol. 182, "단백질 정제에 대한 안내", M. Deutsher, (ed.), Acad. Press. San Diego, 1990, pp.529-539) 및 가용성 zalpha11 리셉터의 사용이 있다. 본 발명의 추가의 구체예에서, 관심의 폴리펩티드와 친화성 태그 (예컨대 말토오스-결합 단백질, 면역글로불린 도메인)와의 융합이 정제를 용이하게 하기 위하여 구성될 수 있다.

더욱이, 당업계에 공지된 방법들을 사용하여 폴리펩티드 융합, 또는 혼성체 zalpha11 리간드 단백질이, 본 발명의 zalpha11 리간드의 영역 또는 도메인을, 다른 사람 사이토킨 패밀리 단백질 (예를 들어, 인터류킨 또는 GM-CSF), 또는 이종 단백질의 영역 또는 도메인과 함께 사용함으로써 구성된다 (Sambrook et al., 상기 동일; Altschul et al., 상기 동일; Picard, Cur. Opin. Biology, 5:511-515, 1994, 및 기타 본원에 인용된 문헌). 이들 방법으로 관심의 폴리펩티드의 보다 큰 도메인 또는 영역의 생물학적 중요성에 대한 측정이 가능해진다. 그러한 혼성체는 반응 역학, 결합을 변경시킬 수 있고, 기질 특이성을 제한 또는 확대시킬 수 있으며, 또는 폴리펩티드의 조직 및 세포 정위를 변경시킬 수 있고, 미지의 구조를 가지는 폴리펩티드에도 적용될 수 있다.

융합 단백질은 당업자에 의해, 융합 단백질의 각각의 성분을 제조한 후 그것들을 화학적으로 결합시킴으로써 제조될 수 있다. 또는 달리, 적절한 리딩 프레임에 있는 융합 단백질의 양쪽 성분들을 코드화하는 폴리뉴클레오티드가 공지의 기법을 사용하여 생성될 수 있고, 본원에 기술된 방법에 의하여 발현될 수 있다. 예를 들면, 생물학적 기능을 부여하는 나선의 일부 또는 전부가 본 발명의 zalpha11 리간드와 다른 패밀리 구성원, 예컨대 IL-15, IL-2, IL-4 또는 GM-CSF로부터의 기능적으로 동등한 나선들 사이에서 교환될 수 있다. 그러한 성분으로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 분비 신호 서열; 4중-나선-번들 사이토킨의 나선 A, B, C, D; 루프 A/B, B/C, C/D가 있다. 그러한 융합 단백질은 구성된 융합물에 따라 본 발명의 폴리펩티드 또는 다른 공지의 4중-나선-번들 사이토킨 패밀리 단백질과 동일한 또는 유사한 생물학적 기능 프로필을 가질 것으로 예상될 수 있다. 더욱이, 그러한 융합 단백질은 본원에 설명된 바와 같은 다른 성질을 나타낼 수 있다.

zalpha11 리간드 폴리펩티드와 그것들이 융합하게 되는 폴리펩티드 사이에 동등한 도메인들을 교환하기 위하여 표준 분자 생물학 및 클로닝 기법들이 사용될 수 있다. 일반적으로, 관심의 도메인, 예컨대 본원에서 기술된 zalpha11 리간드 나선 A 에서 D, 또는 다른 도메인을 코드화하는 DNA 서열은 추가의 폴리펩티드를 코드화하는 최소한 하나의 다른 DNA 절편 (예를 들면 다른 사이토킨, 예컨대 IL-2 등으로부터의 도메인 또는 영역)에 프레임내에서 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 DNA 구성물은 폴리펩티드의 상응하는 영역을 코드화하는 여러 가지 DNA 절편들이 전체 융합 단백질, 또는 그것의 기능적인 부분을 코드화하는 단일한 구성물을 만들기 위하여 프레임내에서 작동가능하게 연결되도록 만들어진다. 예를 들어, DNA 구성물은 신호 폴리펩티드와 이어지는 나선 A를 함유하는 성숙한 4중-나선-번들 사이토킨 융합 단백질을 포함하고 있는 융합 단백질의 N-말단에서부터 C-말단까지, 이어서 나선 B, 이어서 나선 C, 이어서 나선 D를 코드화할 것이다. 그러한 융합 단백질은 본원에서 설명되는 바와 같이 발현되고, 분리되며, 활성에 대해 분석될 것이다.

zalpha11 리간드 폴리펩티드 또는 그것의 단편들은 또한 화학적 합성을 통하여 제조될 수 있다. zalpha11 리간드 폴리펩티드는 단량체이거나 다량체일 수 있고; 글리코실화되거나 글리코실화되지 않을 수 있으며; 페길화되거나 그렇지 않을 수 있고; 초기 메티오닌 아미노산 잔기를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 예를 들어 Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1963에 설 명된 바와 같은 고체상 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 분자의 활성은 zalpha11 리셉터를 발현하는 세포의 증식 및/또는 그러한 세포에 대한 결합을 측정하는 다양한 분석법을 사용하여 측정될 수 있다. 그 중 특히 관심있는 것은 zalpha11 리간드-의존성 세포로의 변화이다. zalpha11 리간드-의존성으로 제조되어질 적당한 셀라인으로는 IL-3-의존성 BaF3 셀라인 (Palacios and Steinmetz, Cell 41:727-734, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986), FDC-P1 (Hapel et al., Blood 64:786-790, 1984), 및 MO7e (Kiss et al., Leukemia 7:235-240, 1993)이 있다. 성장 인자-의존성 셀라인은 공표된 방법 (예를 들어, Greenberger et al., Leukemia Res. 8:363-375, 1984; Dester et al., in Baum et al. Eds., Experimental Hematology Today, 8th Ann. Mtg. Int. Soc. Exp. Hematol. 1979, 145-156, 1980)에 따라 성립될 수 있다.

본 발명의 단백질들은 조혈 작용 및 면역 기능의 항상성에 수반되는 세포의 증식, 활성화, 분화 및/또는 특수한 세포 기능의 유발 또는 억제를 자극하는데 유용하다. 특히, zalpha11 리간드 폴리펩티드는 T 세포, B 세포, NK 세포, 수상 세포, 단구, 마크로파지 및 상피 세포를 제한 없이 포함하는, 조혈 계통의 세포의 증식, 활성화, 분화, 특수한 세포 기능의 유발 또는 억제를 자극하는데 유용하다. 조혈 세포의 증식 및/또는 분화는 배양된 세포를 사용하여 시험관내에서, 또는 적절한 동물 모델에 청구된 발명의 분자를 투여함에 의해 생체내에서 측정될 수 있다. 세포 증식 또는 분화를 측정하는 분석법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 증식을 측정하는 분석법으로는 천연의 붉은색 염료에 대한 약제감수성 (Cavanaugy et al., Investigational New Drugs 8:347-354, 1990, 본원에 참고자료로 포함됨), 방사성표지된 뉴클레오티드의 결합 (Cook et al., Analytical Biochem. 179:1-7, 1989, 본원에 참고자료로 포함됨), 증식성 세포의 DNA에 5'-브로모-2'-데옥시우리딘 (BrdU)의 결합 (Porstmann et al., J. Immunol. Methods 82:169-179, 1985, 본원에 참고자료로 포함됨), 및 테트라졸륨염의 사용 (Mosmann, J. Immunol. Methods 65:55-63, 1983; Alley et al., Cancer Res. 48:589-601, 1988; Marshall et al., Growth Reg. 5:69-84, 1995; 및 Scudiero et al., Cancer Res. 48:4827-4833, 1988, 모두 본원에 참고자료로 포함됨)과 같은 분석법이 있다. 분화를 측정하는 분석법으로는 예를 들어 조직의 단계-특이적 발현, 효소성 활성, 기능적 활성 또는 형태적 변화와 관련된 세포-표면 마아커를 측정하는 것이 있다 (Watt, FASEB, 5:281-284, 1991; Francis, Differentiation 57:63-75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989; 모두 본원에 참고자료로 포함됨).

본 발명의 분자들은 바이러스성 전달 시스템을 사용하여 분석될 수 있다. 이 목적을 위한 바이러스들의 예로는 아데노바이러스, 포진바이러스, 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 및 아데노-관련 바이러스 (AAV)가 있다. 이중-나선 DNA 바이러스인 아데노바이러스가 현재 이종 핵산의 전달에 대해 가장 잘 연구된 유전자 수송 벡터이다 (리뷰로서 T.C. Becker et al., Meth. Cell Biol. 43:161-89, 1994; 및 J.T. Douglas and D.T. Curiel, Science & Medicine 4:44-53, 1997).

리간드로서, zalpha11 리간드 폴리펩티드의 활성은 리셉터 결합과 이어지는 생리적 세포 반응과 관련된 세포외 산성화 비율 또는 양성자 배출을 측정하는 실리콘-기제 바이오센서 마이크로피지오미터에 의해 측정될 수 있다. 장치의 한 예는 Molecular Devices, Sunnyvale, CA에 의해 제조된 Cytosensor^TM Microphsiometer이다. 다양한 세포 반응, 예컨대 세포 증식, 이온 운반, 에너지 생성, 면역성 반응, 조절성 및 리셉터 활성 등이 이 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, McConnell, H.M. et al., Science 257:1906-1912, 1992; Pitchford, S. et al., Meth. Enzymol. 228:84-108, 1997; Arimilli, S. et al., J. Immunol. Meth. 212:49-59, 1998; Van Liefde, I. et al., Eur. J. Pharmacol. 346:87-95, 1998 참조.

더욱이, zalpha11 리간드는 zalpha11 리간드-자극 경로에 반응하는 세포, 조직 또는 셀라인을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 상술된 마이크로피지오미터가 리간드-반응성 세포, 예컨대 본 발명의 zalpha11 리간드에 반응하는 세포를 빠르게 확인하기 위해 사용될 수 있다. 세포는 zalpha11 리간드 폴리펩티드의 존재 또는 부재하에 배양될 수 있다. zalpha11 리간드의 존재하에 세포외 산성화에서 측정가능한 변화를 유도하는 이들 세포가 zalpha11 리간드에 반응한다. 그러한 세포 또는 셀라인은 상술된 바와 같은 zalpha11 리간드 폴리펩티드의 길항제 및 아고니스트를 확인하기 위해 사용될 수 있다.

zalpha11 리셉터에 대해 관찰된 조직 분포의 관점에서, 아고니스트 (천연 zalpha11 리간드/기질/보조인자/등을 포함하여) 및/또는 길항제는 시험관내 및 생체내 적용에서 모두 많은 잠재력을 가지고 있다. zalpha11 리간드 아고니스트로서 확인된 화합물들은 조혈 작용 및 면역 기능의 항상성에 수반되는 세포의 확장, 증식, 활성화, 분화, 및/또는 특수한 세포 기능의 유발 및 억제에 대해 유용하다. 예를 들어, zalpha11 리간드 및 아고니스트 화합물들은 규정된 세포 배양 배지의 성분으로서 유용하며, 세포 배양시에 통상적으로 사용되는 혈청을 대신하기 위하여 단독으로 또는 다른 사이토킨 및 호르몬과 결합하여 사용될 수 있다. 그러므로 아고니스트는 배양중의 T-세포, B-세포, NK 세포, 사이토킨 림프구, 및 다른 림프 및 골수 계통의 세포들의 성장 및/또는 발생을 특이적으로 촉진하는데 유용하다.

길항제는 또한 리간드-리셉터 상호작용의 부위를 특성확인하기 위한 연구 시약으로서 유용하다. 길항제는 조혈 작용을 조절하는데 수반되는 세포의 확장, 증식, 활성화, 및/또는 분화를 억제하는데 유용하다. zalpha11 리간드 활성의 억제제 (zalpha11 리간드 길항제)로는 항-zalpha11 리간드 항체 및 가용성 zalpha11 리간드 리셉터, 및 다른 펩티드성 및 비-펩티드성 항원 (리보자임을 포함함)이 있다.

Zalpha11 리간드는 또한 그것의 활성의 억제제 (예컨대 길항제)를 확인하기 위해 사용될 수 있다. zalpha11 리간드의 활성을 억제하는 화합물들을 확인하기 위하여 본원에 개시된 분석법에 시험 화합물이 첨가된다. 본원에 개시된 분석법외에, 샘플은 리셉터 결합, zalpha11 리간드-의존성 세포 반응의 자극/억제 또는 zalpha11 리셉터-발현 세포를 측정하기 위해 디자인된 다양한 분석법내에서 zalpha11 리간드 활성의 억제에 대해 시험될 수 있다.

zalpha11 리간드 폴리펩티드는 두 개의 불변 영역 도메인을 함유하고 가변 영역이 없는 면역글로불린 중쇄 불변 영역, 전형적으로 Fc 단편과의 융합물로서 발현될 수 있다. 그러한 융합물을 제조하는 방법이 미국 특허 제 5,155,027 호 및 5,567,584 호에 개시되어 있다. 그러한 융합물을 전형적으로 Fc 부분이 서로 이황화 결합되어 있고 2개의 비-Ig 폴리펩티드가 서로 아주 근접하여 배열되어 있는 다량체 분자로서 분비된다. 이런 종류의 융합물은, 예를 들어 이량체화에, 안정성 및 생체내 반감기를 증가시키는데, 리간드를 친화성 정제하는데, 시험관내 분석 도구로서, 또는 길항제로서 사용될 수 있다. 분석에서의 사용에 있어, 키메라가 Fc 영역에 의하여 지지체에 결합되고, ELISA 포맷에 사용된다.

zalpha11 리간드-결합 폴리펩티드는 또한 리간드의 정제를 위해 사용될 수 있다. 폴리펩티드는 고체 지지체, 예컨대 아가로스 비드, 교차-결합된 아가로스 비드, 유리 비드, 셀룰로스 수지, 실리카-기초 수지, 폴리스티렌, 교차-결합된 폴리아크릴아미드, 또는 사용 조건하에서 안정한 유사 물질위에 고정된다. 폴리펩티드를 고체 지지체위에 결합시키는 방법은 당업계에 공지이며, 예를 들면 아민 화학, 시아노겐 브로마이드 활성화, N-히드록시숙신이미드 활성화, 에폭시드 활성화, 술프히드릴 활성화, 밑 히드라지드 활성화가 있다. 그 결과의 배지는 일반적으로 컬럼의 형태로 형성될 것이며, 리간드를 함유하고 있는 액은 1 회 또는 여러번 컬럼을 통과하여 리간드가 리셉터 폴리펩티드에 결합하는 것을 가능하게 할 것이다. 그런 다음 리간드는 리간드-리셉터 결합을 파괴하는 염 농도의 변화, 케이오트로픽 제제 (구아니딘 HCl), 또는 pH 를 사용하여 용출된다.

리간드-결합 리셉터 (또는 항체, 보체/항-보체 쌍의 한 구성원) 또는 그것의 결합 단편, 및 상업적으로 활용할 수 있는 바이오센서 기구 (BIAcore, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ)를 사용하는 분석 시스템이 유리하게 사용될 수 있다. 그러한 리셉터, 항체, 보체/항-보체 쌍의 구성원 또는 단편은 리셉터 칩의 표면위에 고정된다. 이 기구의 사용은 문헌에 설명되어 있다 (Karlsson, J. Immunol. Methods 145:229-240, 1991; Cunningham and Wells, J. Mol. Biol. 234:554-563, 1993). 리셉터, 항체, 구성원 또는 단편은 아민 또는 술프히드릴 화학을 사용하여 플로우 셀 내에 있는 골드 필름에 부착된 덱스트란 섬유에 공유방식으로 부착된다. 시험 샘플은 셀을 통과한다. 만약 리간드, 에피토프, 또는 보체/항-보체 쌍의 반대 구성원이 샘플중에 있다면, 그것은 각각 고정된 리셉터, 항체 또는 구성원에 결합할 것이며, 그 결과 배지의 굴절 지수에 변화가 발생하고, 그것은 골드 필름의 표면 플래즈몬 공명의 변화로서 검출된다. 이 시스템으로, 그것으로부터 결합 친화력이 계산될 수 있는 온- 및 오프-레이트 (on- and off-rate)의 측정, 및 결합의 입체화학의 평가가 가능해진다. 또는 달리, 리간드/리셉터 결합은 SEIDI (TM) 기법 (Ciphergen, Inc., Palo Alto, CA)를 사용하여 분석될 수 있다.

리간드-결합 리셉터 폴리펩티드는 또한 당업계에 공지되어 있는 다른 분석 시스템내에서 사용될 수 있다. 그러한 시스템으로는 결합 친화력의 측정을 위한 스캐쳐드 분석 (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660-72, 1949) 및 열량 측정 분석 (Cunningham et al., Science 253:545-548, 1991; Cunningham et al., Science 245:821-825, 1991)이 있다.

Zalpha11 리간드 폴리펩티드는 또한 zalpha11 리간드 에피토프, 펩티드 또는 폴리펩티드에 결합하는 항체를 제조하기 위하여 사용될 수 있다. zalpha11 리간드 폴리펩티드 또는 그것의 단편은 동물을 접종하고 면역 반응을 유도하기 위한 항원 (면역원)으로서 작용한다. 당업자는 항원성인 에피토프를 가진 폴리펩티드가 zalpha11 리간드 폴리펩티드 (예컨대, SEQ ID NO:2)의 적어도 6, 바람직하게는 적어도 9, 더욱 바람직하게는 적어도 15 내지 약 30의 연속되는 아미노산 잔기의 서열을 함유한다는 것을 인지할 것이다. zalpha11 리간드 폴리펩티드의 더 긴 부분, 즉 30 내지 100 잔기에서 아미노산 서열의 전 길이까지를 포함하는 폴리펩티드가 포함된다. 항원 또는 면역원성 에피토프는 또한 본원에 설명된 바와 같은, 부착 태그, 애주번트 및 담체를 포함할 수 있다. 적당한 항원이 SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 32부터 아미노산 번호 162, 또는 그것의 9부터 131까지의 연속되는 아미노산 단편에 의해 코드화된 zalpha11 리간드 폴리펩티드를 포함한다. 다른 적당한 항원으로는 본원에 설명된 바와 같은, 전-길이 및 성숙한 zalpha11 리간드, 나선 A 에서 D, 및 zalpha11 리간드 4중-나선-번들 구조의 개별적인 또는 다중 나선 A, B, C 및 D가 있다. 항원으로서 사용하기 위한 바람직한 펩티드는 친수성 펩티드, 예컨대 본원에 설명된 바와 같은 친수성 플롯으로부터 당업자에 의해 예측된 것들로서, 예를 들어 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 114 에서 119, 101 에서 105, 126 에서 131, 113 에서 118 및 158 에서 162이다.

이들 항원으로 동물을 접종함으로써 생성된 면역 반응으로부터의 항체가 본원에 설명된 바와 같이 분리 및 정제될 수 있다. 다클론성 및 단클론성 항체를 제 조하고 분리하는 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다 (Current Protocols in Immunology, Cooligan et al., (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Hurrell, J.G.R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982).

당업자에게 명백한 바와 같이, 다클론성 항체는 말, 소, 염소, 양, 개, 닭, 토끼, 마우스, 및 뮤린와 같은 다양한 온혈동물을 zalpha11 리간드 폴리펩티드 또는 그것의 단편으로 접종함으로써 생성될 수 있다. zalpha11 리간드 폴리펩티드의 면역원성은 보조제, 예컨대 알루미늄 (수산화 알루미늄) 또는 프로인트 완전 또는 불완전 보조제를 사용함으로써 증가될 수 있다. 면역화에 유용한 폴리펩티드로는 또한 융합 폴리펩티드, 예컨대 zalpha11 리간드 또는 그것의 일부와 면역글로불린 폴리펩티드와의 또는 말토오스 결합 단백질과의 융합물이 있다. 폴리펩티드 면역원은 전-길이의 분자 또는 그것의 일부일 수 있다. 만약 폴리펩티드 부분이 "합텐-유사"한 것이라면, 그러한 부분은 유익하게도 면역화를 위해 거대분자 담체 (예컨대 키호울 림페트 헤모시아닌 (KLH), 우혈청 알부민 (BSA) 또는 파상풍 독소)에 결합 또는 연결될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "항체"는 다클론성 항체, 친화성-정제된 다클론성 항체, 단클론성 항체, 및 항원-결합 단편, 예컨대 F(ab')₂ 및 Fab 단백질 분해성 단 편을 포함한다. 일반적으로 공학제조된 무상 항체 또는 단편, 예컨대 키메릭 항체, Fv 단편, 단일 사슬 항체등과, 합성 항원-결합 펩티드 및 폴리펩티드들이 또한 포함된다. 비-사람 항체는 비-사람 CDR을 사람 프레임워크 및 불변 영역위에 이식하거나, 또는 전체 비-사람 가변 도메인을 통합시킴으로써 (노출된 잔기의 대체에 의해 사람-유사 표면으로 그것들을 임의로 "클로킹"하고, 그 결과는 "겉치레" 항체임) 사람화될 수 있다. 어떤 경우에, 사람화된 항체는 적절한 결합 특성을 증강시키기 위하여 사람 가변 영역 프레임워크내에서 비-사람 잔기를 보유할 수도 있다. 항체의 사람화를 통해서 생물학적 반감기가 증가될 수 있고, 사람에게 투여했을 때 역면역 반응에 대한 가능성이 감소된다. 더욱이, 사람 항체는 WIPO 공보 WO 98/24893에 개시된 바와 같이, 트랜스제닉, 즉 사람 면역글로불린 유전자를 함유하도록 조작되어진 사람이 아닌 동물에서도 생성될 수 있다. 이들 동물에서 내인성 면역글로불린 유전자는 예컨대 이종 재조합에 의해 비활성화되거나 또는 제거되는 것이 바람직하다.

항체는 만약 1) 그것들이 결합 활성의 역치 수준을 나타내고, 2) 그것들이 관련된 폴리펩티드 분자와 유의할만하게 교차-반응을 하지 않는다면, 특이적으로 결합하는 것이라고 생각된다. 본원에서 결합의 역치 수준은, 항-zalpha11 리간드 항체가 대조 (비-zalpha11 리간드) 폴리펩티드에 대한 결합 친화성보다 적어도 10 배 이상의 친화성을 갖는 zalpha11 리간드 폴리펩티드, 펩티드 또는 에피토프에 결합하는 경우 측정된다. 항체는 10⁶M^-1 이상, 바람직하게는 10⁷M^-1 이상, 보다 바람직 하게는 10⁸M^-1 이상, 가장 바람직하게는 10⁹M^-1 이상의 결합 친화력 (K_a)을 나타내는 것이 바람직하다. 항체의 결합 친화력은 당업자에 의해, 예컨대 스캐쳐드 분석 (Scatchard, G., Ann. NY Acad. Sci. 51:660-672, 1949)에 의해 쉽게 측정될 수 있다.

항-zalpha11 리간드 항체가 관련된 폴리펩티드 분자와 유의할만하게 교차-반응하지 않는지의 여부는, 예를 들어 표준 웨스턴 블롯 분석 (Ausubel et al., 상기 동일)을 사용하여 zalpha11 리간드 폴리펩티드는 검출하지만 공지의 관련된 폴리펩티드는 검출하지 못하는 항체에 의해 나타내진다. 공지의 관련된 폴리펩티드의 예는 선행기술에서 개시된 것들, 예컨대 공지의 오르토로그, 및 파라로그, 및 단백질 패밀리의 유사한 공지의 구성원들이다. 또한, 스크리닝이 비-사람 zalpha11 리간드, 및 zalpha11 리간드 성숙 폴리펩티드를 사용하여 행해질 수 있다. 더욱이, zalpha11 리간드 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 집단을 분리하기 위하여 항체가 공지의 관련된 폴리펩티드에 "대하여 스크리닝"될 수 있다. 예를 들어, zalpha11 리간드에 대하여 발생된 항체들은 불용성 매트릭스에 고착된 관련 폴리펩티드에 대하여 흡착되고; zalpha11 리간드에 대하여 특이적인 항체들은 적절한 완충 조건하에서 매트릭스를 통과하여 흐를 것이다. 스크리닝은 공지의 밀접하게 관련된 폴리펩티드에 대하여 교차-반응하지 않는 다클론성 및 단클론성 항체를 분리하는 것을 가능하게 한다 (Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols in Immunolgy, Cooligan, et al. (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995). 특이한 항체의 스크리닝 및 분리는 당해 기술분야에 잘 알려져 있다 (Fundamental Immunology, Paul (des.), Raven Press, 1993; Getzoff et al., Adv. in Immunol. 43:1-98, 1988; Monoclonal Antibodies:Principles and Practice, Goding J.W.(eds.), Academic Press Ltd., 1996; Benjamin et al., Ann. Rev. Immunol. 2:67-101, 1984). 특이적으로 결합하는 항-zalpha11 리간드 항체가 아래에 개시된 당업계의 여러가지 방법에 의해 검출될 수 있다.

당업자에게 알려져 있는 다양한 분석법들이 zalpha11 리간드 단백질 또는 폴리펩티드에 결합하는 항체들을 검출하기 위하여 활용될 수 있다. 예시적인 분석법들은 문헌에 상세하게 설명되어 있다 (Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). 그러한 분석법의 대표적인 실예로는 다음과 같은 것들이 있다: 동시발생적인 면역 전기영동, 방사성 면역 분석, 방사성 면역 침전, 효소-결합된 면역 흡착 분석 (ELISA), 돗트 블롯 또는 웨스턴 블롯 분석, 억제 또는 경합 분석, 및 샌드위치 분석. 또한, 항체는 야생형 대 돌연변이 zalpha11 단백질 또는 폴리펩티드에 대한 결합에 대해 스크리닝될 수 있다.

zalpha11 리간드에 대한 항체는 zalpha11 리간드를 발현하는 세포에 태그를 붙이기 위하여; 친화성 정제에 의하여 zalpha11 리간드를 분리하기 위하여; zalpha11 리간드 폴리펩티드의 순환하는 수준을 측정하기 위한 진단용 분석을 위하여; 숨겨져 있는 병리학 또는 질병의 마아커로서의 가용성 zalpha11 리간드를 검출 또는 정량하기 위하여; FACS를 사용하는 분석 방법에서; 발현 라이브러리를 스크리닝하기 위하여; 항-이디오타입 항체를 생성하기 위하여; 그리고 중화 항체로서 또는 시험관내 및 생체내에서 zalpha11 리간드 활성을 차단하기 위한 길항제로서 사용될 수 있다. 적당한 직접 태그 또는 표지로는 방사성 핵종, 효소, 기질, 보조인자, 억제제, 형광 마아커, 화학발광 마아커, 자기 입자 등이 있으며; 간접 태그 또는 표지는 중간체로서 바이오틴-아비딘 또는 다른 보체/항-보체 쌍을 사용하는 것을 특징으로 한다. 본원에서의 항체는 또한 약물, 독소, 방사성 핵종 등에 직접적으로 또는 간접적으로 콘쥬게이트될 수 있으며, 이들 콘쥬게이트는 생체내 진단용으로 또는 치료 용도로 사용된다. 더욱이, zalpha11 리간드 또는 그것의 단편에 대한 항체는 시험관내에서 분석, 예컨대 웨스턴 블롯 또는 다른 당업계에 공지되어 있는 분석중의 변성된 zalpha11 리간드 또는 그것의 단편을 검출하기 위하여 사용될 수 있다.

적당한 검출가능한 분자는 폴리펩티드 또는 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 부착될 수 있으며, 방사성 핵종, 효소, 기질, 보조인자, 억제제, 형광 마아커, 화학발광 마아커, 자기 입자 등이 있다. 적당한 세포독성 분자는 폴리펩티드 또는 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 부착될 수 있으며, 예컨대 박테리아 또는 식물 독소 (예를 들면 디프테리아 독소, 슈도모나스 외독소, 리신, 아브린 등), 뿐만 아니라 치료용 방사성 핵종, 예를 들면 요오드-131, 레늄-188 또는 이트륨-90이 있다 (어느 것이든지 직접적으로 폴리펩티드 또는 항체에 부착되든지, 또는 예컨대 킬레이트화 부분의 수단을 통하여 간접적으로 부착된다). 폴리펩티드 또는 항체는 또한 세포독성 약물, 예컨대 아드리아마이신에 콘쥬게이트될 수 있다. 검출가능한 또는 세포독성 분자의 간접적인 부착을 위해서는, 검출가능한 또는 세포독성 분자는 보체/항-보체 쌍의 한 구성원과 콘쥬게이트될 수 있으며, 이때 다른 구성원은 결합 폴리펩티드 또는 항체 부분에 결합된다. 이 목적에 대해, 예시적인 보체/항-보체 쌍은 바이오틴/스트렙트아비딘이다.

결합 폴리펩티드는 또한 시험관내 및 생체내에서 zalpha11 리간드 결합 및 신호 변환을 차단하기 위한 zalpha11 리간드 "길항제"로서 작용할 수 있다. 이들 항-zalpha11 리간드 결합 폴리펩티드들은 zalpha11 리간드 활성 및 단백질-결합을 억제하는데 유용할 것이다.

폴리펩티드-독소 융합 단백질 또는 항체-독소 융합 단백질은 표적화된 세포 또는 조직 억제 또는 제거 (예컨대 암세포 또는 조직을 치료하기 위하여)에 사용될 수 있다. 또는 달리, 만약 폴리펩티드가 다중 기능 도메인 (즉 활성화 도메인 또는 리셉터 결합 도메인과, 표적화 도메인)을 가지고 있다면, 단지 표적화 도메인만을 포함하고 있는 융합 단백질이 검출가능한 분자, 세포독성 분자 또는 보체 분자를 관심의 세포 또는 조직 타입에 지정하는데 적당할 것이다. 도메인이 단 하나인 융합 단백질이 보체 분자를 포함하는 경우에, 항-보체 분자는 검출가능한 또는 세포독성 분자에 콘쥬게이트될 수 있다. 그러므로 그러한 도메인-보체 분자 융합 단백질은 일반적인 항-보체-검출가능한/세포독성 분자 콘쥬게이트의 세포/조직-특이적 전달을 위한 일반적인 표적화 부형제을 대표한다.

zalpha11 리간드 사이토킨 융합 단백질 또는 항체-사이토킨 융합 단백질은, 만약 zalpha11 리간드 폴리펩티드 또는 항-zalpha11 리간드 항체가 과증식성 혈액 또는 골수 세포를 표적으로 한다면, 표적 조직 (예컨대 혈액 및 골수 암)의 생체내 죽음을 증가시키는데 사용될 수 있다 (Hornick et al., Blood 89:4437-4447, 1997). 그들은 융합 단백질이 원하는 작용 부위로 사이토킨이 표적화하는 것을 가능하게 하며, 그로써 사이토킨의 상승된 국부적인 농도를 제공한다고 설명하였다. 적당한 zalpha11 리간드 폴리펩티드 또는 항-zalpha11 리간드 항체는 원하지 않는 세포 또는 조직 (즉 종양 또는 백혈병)을 표적으로 하며, 융합된 사이토킨은 이펙터 세포에 의한 개선된 표적 세포 용해를 중재한다. 이 목적에 적당한 사이토킨은 예를 들면 인터류킨 2 및 과립구-마크로파지 콜로니-자극 인자 (GM-CSF)이다.

분화는 다효능 간세포로 시작하여 말단적으로 분화된 세포로 끝나는 점진적이며 동적인 과정이다. 계통에의 특화 없이 재생할 수 있는 다효능 간세포는 세포 계통에의 특화가 만들어질 때 상실되는 한 벌의 분화 마아커를 발현한다. 프로게니터 세포는, 세포가 돌연변이를 향한 세포 계통 경로로 진행함에 따라, 계속 발현되거나 계속 발현될 수 없는 한 벌의 분화 마아커를 발현한다. 성숙한 세포에 의해 독점적으로 발현되는 분화 마이커는 보통 기능성 물질, 예컨대 세포 생성물, 세포 생성물을 생성하는 효소 및 리셉터이다. 세포 집단의 분화 단계는 세포 집단에 존재하는 마아커의 확인에 의해 모니터된다.

말단 분화 또는 탈분화를 향한 경로를 가는 특이적인 세포 종류를 자극하는 인자가 공통 프로게니터 세포 또는 간세포로부터 기원하는 전체 세포 집단에 영향을 미친다는 것을 시사하는 증거가 있다. 이와 같이, 본 발명은 림프양 세포, 조혈 세포 및 상피 세포의 증식을 자극하거나 또는 억제하는 것을 포함한다.

zalpha11 리간드는 중요한 면역학적 기능을 가진다고 공지된 조직으로부터 분리되었으며, 이것은 면역 시스템에서 어떤 역할을 하는 세포들을 함유한다. zalpha11 리간드는 CD3+ 선택된, 활성화된 말초 혈액 세포에서 발현되며, zalpha11 리간드 발현은 T 세포 활성화 후에 증가한다고 알려져 있다. 더욱이, 본원의 실시예 부분에서 설명된 실험의 결과는 본 발명의 폴리펩티드가 NK 세포 또는 NK 프로게니터의 성장/확장 및/또는 분화된 상태에 효과를 미친다는 것을 증명한다. 추가적인 증거는 zalpha11 리간드가 생체내에서 T 세포 및 B 세포의 증식 및/또는 분화에 영향을 미친다는 것을 증명한다. 조혈 프로게니터의 증식을 자극하고 성숙한 세포를 활성화하는 인자가 일반적으로 공지되어 있다. NK 세포는 IL-2에만 반응하지만, 증식 및 활성화는 일반적으로 추가의 성장 인자가 필요하다. 예를 들어, IL-7 및 Steel Factor (c-키드 리간드)가 NK 프로게니터의 콜로니 형성에 필요하다고 알려져 있다. IL-7 및 Steel Factor와 조합된 IL-15 + IL-2가 더욱 효과적이다 (Mrozek et al., Blood 87:2632-2640, 1996). 그러나, 미확인된 사이토킨이 NK 세포 및/또는 NK 프로게니터의 특이적인 하위세트의 증식에 필수적일 수도 있다 (Robertson et al., Blood 76:2451-2438, 1990). zalpha11 리간드 및 IL-15를 포함하는 조성물은 NK 프로게니터 및 NK 세포를 자극하며, 이 조성물이 이미 설명된 인자들 및 인자들의 조합보다 더욱 효력있다는 증거가 있다.

분화를 측정하는 분석법으로는 예를 들어 조직의 단계-특이적 발현, 효소성 활성, 기능적 활성 또는 형태적 변화와 관련된 세포 마아커를 측정하는 것이 있다 (Watt, FASEB, 5:281-284, 1991; Francis, Differentiation 57:63-75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989; 모두 본원에 참고자료로 포함됨). 또는 달리, zalpha11 리간드 폴리펩티드 자체는 조직의 단계-특이적 발현과 관련된 추가의 세포-표면 또는 선택된 마아커로서 사용할 수 있다. 그러한 것으로서, zalpha11 리간드 폴리펩티드의 직접적인 측정, 또는 그것이 분화함에 따르는 조직에서 그것의 발현 감소가 조직의 분화에 대한 마아커로서 사용될 수 있다.

유사하게, zalpha11 리간드 폴리펩티드의 직접적인 측정, 또는 조직에서 그것의 발현 감소가 조직 또는 세포에서 종양의 진행에 따라 측정될 수 있다. 정상 조직과 비교하여, 세포의 침입성 및 운동성의 증가, 또는 사전-암성 또는 암성 조건에서 zalpha11 리간드의 발현 증가 또는 감소는 종양 진행에서의 변형, 침입 및 전이에 대한 진단법으로서 사용될 수 있다. 그러한 것으로서, 종양의 진행 및 전이 단계에 대한 지식은, 주어진 개개의 암 환자에 대해, 가장 적합한 요법, 치료의 공격성을 선택하는데 있어 의사에게 도움을 줄 것이다. 발현 (mRNA 또는 단백질의)의 증가 및 감소를 측정하는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있고 본원에 설명되었으며, zalpha11 리간드 발현에 적용될 수 있다. 예를 들어, 세포 운동성을 조절하는 폴리펩티드의 출현 또는 소실이 전립선암의 진단 및 예후를 돕기 위해 사용될 수 있다 (Banyard, J. and Zetter, B. R., Cancer and Metast. Rev. 17:449-458, 1999). 세포 운동성의 이펙터로서, zalpha11 리간드 발현의 증가 또는 감소가 림프양, B-세포, 상피, 조혈 및 다른 암들에 대한 진단법으로서 사용될 수 있다.

더욱이, 종양 진행 및 전이에 대한 zalpha11 리간드의 활성 및 효과가 생체내에서 측정될 수 있다. 몇가지 공통유전자 마우스 모델이 종양 진행에 대한 폴리펩티드, 화합물 또는 다른 치료의 영향을 연구하기 위해 개발되었다. 이들 모델에서, 배양물에서 계대접종된 종양 세포가 종양 도너로서 동일한 계통의 마우스안에 이식되었다. 세포는 레시피언트 마우스에서 동일한 특성을 갖는 종양으로 발전할 것이고, 또한 돌연변이가 일부 모델에서 생길 것이다. 우리의 연구를 위한 적절한 종양 모델로는 특히 Lewis 폐암종 (ATCC No. CRL-1642) 및 B16 흑색종 (ATCC No. CRL-6323)이 있다. 이들은 모두 통상적으로 시험관내에서 쉽게 배양되고 처리되는, C57BL6/J 마우스에 대한 공통유전자인 종양계로 사용된다. 이들 세포중 어느 하나의 이식의 결과인 종양은 C57BL6/J 마우스의 폐로 전이할 수 있다. Lewis 폐암종 모델이 맥관형성의 억제제를 확인하기 위해 마우스에서 최근 사용되었다 (O'Reilly MS, et al. Cell 79:315-328, 1994). C57BL6/J 마우스는 재조합 단백질, 아고니스트 또는 길항제의 일간 주입 또는 재조합 아데노바이러스의 1회 주입을 통해 실험적인 제제로 치료된다. 이 치료 후 3일 째, 10⁵ 내지 10⁶ 세포가 등쪽 피부 아래에 이식된다. 또는 달리, 이식 전에 세포 자체가 재조합 아데노바이러스, 예컨대 zalpha11 리간드를 발현하는 것으로 감염될 수 있고, 이로써 단백질이 전신적으로보다는 오히려 종양 부위에서 또는 세포내적으로 합성될 수 있다. 마우스는 5일 내에 눈에 보이는 종양을 정상적으로 발생시킨다. 종양은 3주까지의 기간 동안 성장이 허용되고, 이 기간 동안 그것들은 대조 치료된 군에서 1500 내지 1800mm³의 크기 에 도달할 수 있다. 종양 크기 및 체중이 실험 내내 주의깊게 모니터된다. 희생의 때에, 종양이 제거되어 폐 및 간과 함께 중량이 재어진다. 폐 중량은 전이성 종양과 관련이 있음을 나타낸다. 추가적 측정으로서, 폐표면 전이가 세어진다. 절제된 종양, 폐 및 간이 당업계에 공지되고 본원에 설명된 방법을 사용한 조직병리학적 시험, 면역조직화학 및 제자리 혼성화를 위해 준비된다. 이와 같이, 맥관구조를 동원하고 전이를 겪기 위한 종양의 능력에 대한 본 발현된 폴리펩티드, 예컨대 zalpha11 리간드의 영향이 평가된다. 생체내에서 zalpha11 리간드 발현을 활성화하기 위한 안정한 zalpha11 리간드 형질전환체의 사용 및 유발성 프로모터의 사용이 당업계에 공지되어 있으며, 전이에 대한 zalpha11 리간드 유발을 평가하기 위해 이 시스템에서 사용될 수 있다. 더욱이, 정제된 zalpha11 리간드 또는 zalpha11 리간드 콘디셔닝 배지가 이 마우스 모델안에 직접 주사될 수 있고, 그러므로 이 시스템에서 사용될 수 있다. 일반적 참고자료로서 O'Reilly MS, et al. Cell 79:315-328, 1994; 및 Rusciano D, et al. Murine Models of Liver Metastasis. Invasion Metastasis 14:349-361, 1995 참조.

zalpha11 리간드는 종양형성을 치료하는데 유용하며, 따라서 암의 치료에 유용할 것이다. zalpha11 리간드는 항-IgM 자극된 정상 B-세포의 IL-4 자극된 증식을 억제하며, B 세포 종양계를 보다 덜 증식하는 상태로 유도하기 위해 zalpha11 리간드로 환자를 치료하는데 있어 치료상의 이익이 있을 수 있다는 것을 시사하는 유사한 효과가 B-세포 종양계에서 관찰된다. 리간드는 사용에 있어 이미 종래의 화학요법 제제 및 면역 조절제, 예컨대 인터페론 알파를 포함하는 다른 제제와 조합하여 투여되고 있다. 알파/베타 인터페론은 어떤 백혈병 및 동물 질환 모델을 치료하는데 효과적인 것으로 알려져 있으며, 인터페론-알파 및 zalpha11 리간드의 성장 억제 효과가 적어도 하나의 B-세포 종양-유도된 셀라인에 대해 부가된다.

본 발명은 이상형성성 B 또는 T 세포의 증식을 감소시키기에 충분한 양의 zalpha11 리간드의 조성물을 B 또는 T 세포 이상형성물을 갖는 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 이상형성성 B 또는 T 세포의 증식을 감소시키는 방법을 제공한다. 다른 구체예에서, 조성물을 IL-2, IL-15, IL-4, GM-CSF, Flt3 리간드 또는 간세포 인자로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 다른 사이토킨을 포함할 수 있다.

다른 측면으로서, 본 발명은 이상형성성 B 또는 T 세포의 증식을 감소시키기에 충분한 양의 zalpha11 리간드 길항제의 조성물을 B 또는 T 세포 이상형성물을 갖는 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 이상형성성 B 또는 T 세포의 증식을 감소시키는 방법을 제공한다. 다른 구체예에서, 조성물을 IL-2, IL-15, IL-4, GM-CSF, Flt3 리간드 또는 간세포 인자로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 다른 사이토킨을 포함할 수 있다. 더욱이, zalpha11 리간드 길항제는 리간드/독소 융합 단백질일 수 있다.

zalpha11 리간드-사포린 융합 독소가 유사한 세트의 백혈병 및 림프종에 대하여 사용될 수 있으며, zalpha11 리간드로 치료될 수 있는 백혈병의 범위를 확장시킨다. zalpha11 리셉터의 융합 독소 중재된 활성화는 표적 세포의 성장을 억제하기 위한 2개의 독립적인 수단을 제공하는데, 첫째는 리간드만에 의해 보여지는 효 과와 동일하고, 두번째는 리셉터 내면화를 통한 독소의 전달에 기인한다. zalpha11 리셉터의 림프양 제한된 발현 패턴은 리간드-사포린 콘쥬게이트가 환자에 의해 허용될 수 있다는 것을 시사한다.

악성종양에 대한 치료가 동종의 골수 또는 간세포 이식술을 포함할 때, zalpha11 리간드는 종양에 대한 이식조직의 효과의 증강에 매우 유익할 수 있다. zalpha11 리간드는 용해 골수 프로게니터로붜 NK 세포의 생성을 자극하고, 항원 리셉터의 활성화 후 T-세포의 증식을 자극한다. 따라서, 환자가 동종의 골수 이식을 받을 때, zalpha11 리간드는 도너 림프구의 주입으로 또는 주입 없이 항-종양 반응의 생성을 증강시킬 것이다.

주어진 사이토킨에 대한 리셉터의 조직 분포는 그 사이토킨의 잠재적 작용 부위에 대한 강한 표시를 제공한다. zalpha11 리셉터의 노던 분석은 사람 비장, 흉선, 림프절, 골수 및 말초 혈액 백혈구에서의 전사를 밝혔다. 특이적 세포 종류가 zalpha11 리셉터를 발현함으로써 확인되었고, 강한 신호가 혼합된 림프구 반응 (MLR) 및 Burkitt's 림프종 Raji에서 보여졌다. 2개의 단구성 셀라인 THP-1 (Tsuchiya et al., Int. J. Cancer 26:171-176, 1980) 및 U937 (Sundstrom et al., Int. J. Cancer 17:565-577, 1976)이 음성였다.

zalpha11 리셉터는 MLR에서 비교적 높은 수준으로 발현되는데, 이 반응에서는 두 개체로부터의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMNC)가 혼합되고, 그 결과 상호 활성화가 일어난다. MNR에서는 높은 수준의 전사가 검출되지만 휴지의 T 또는 B 세포 집단에서는 그렇지 않은 것은 zalpha11 리셉터 발현이 활성화 동안 하나 이상의 세 포 종류에서 유발될 수 있음을 시사한다. T 및 B 세포의 분리된 집단의 활성화는 PMA 및 이오노마이신을 사용하여 세포를 자극함으로써 인위적으로 달성될 수 있다. 분류된 세포들이 이들 활성화 조건에 있을 때, zalpha11 리셉터 전사의 수준은 면역 반응, 특히 활성화 동안 자가분비 및 측분비 T 및 B 세포 확장에서 이 리셉터 및 zalpha11 리간드의 역할을 지원하는 두 세포 종류 모두에서 증가했다. zalpha11 리간드는 또한 림프구생성에 수반되는 더욱 원시적인 프로게니터의 확장에 어떤 역할을 한다.

zalpha11 리셉터는 휴지의 T 및 B 세포에서는 낮은 수준으로 존재한다고 밝혀졌으며, 두 세포 종류 모두에서 활성화 동안 상향 조절되었다. 흥미롭게도, B 세포는 또한 T 세포보다 더욱 빠르게 그 메시지를 하향 조절하는데, 이는 신호의 크기 및 신호 소광의 타이밍이 B 세포 반응의 적절한 조절을 위해 중요하다는 것을 시사한다.

여기에 더하여, 고유판 세포의 많은 비율이 zalpha11 리셉터와의 양성 혼성화 신호를 나타낸다. 이 조직은 활성화된 CD4+ T 세포 및 활성화된 B 세포를 포함하여, 림프양 세포의 혼합된 집단으로 구성된다. 면역 기능장애, 특히 점막 면역 반응의 만성적 활성화가 크론병의 병인에서 중요한 역할을 하고; 사전-면역성 사이토킨에 대한 비정상적 반응 및/또는 이것의 생성이 또한 의심되는 인자이다 (Braegger et al., Annals Allergy 72:135-141, 1994; Sartor RB Am. J. Gastroenterol. 92:5S-11S, 1997). IL-15와 함께 zalpha11 리간드는 골수 프로게니터로부터 NK 세포를 확장하고, NK 세포 이펙터 기능을 증대시킨다. zalpha11 리간 드는 또한 항-CD40 항체로 자극된 성숙한 B 세포를 함께 자극하지만, IgM을 통한 신호에 대한 B 세포 증식을 억제한다. zalpha11 리간드는 T 세포 리셉터를 통한 신호와 함께 T 세포 증식을 증강시키고, 트랜스제닉 마우스에서의 과잉발현은 림프구감소증 및 단구 및 과립구의 확장을 가져온다. 이들 zalpha11 리간드의 이들 다향적인 효과는 그것이 전신성 홍반성 루프스 (SLE), 류마티스양 관절염 (RA), 다발성 경화증 (MS), 중증 근무력증 및 당뇨병을 (제한 없이) 포함하여, 면역 시스템의 결함에 기인하는 광범위한 질환에 대한 치료상의 효용을 제공할 수 있음을 시사한다. 이들 질환이 면역 기능장애의 복잡한 네트워크 (예를 들어, SLE는 T 및 B 세포 모두에 있는 결함의 증상이다)의 결과인 것, 그리고 면역 세포가 효력있는 면역 반응을 유도하기 위해 서로간의 상호작용에 의존한다는 것을 주목하는 것이 중요하다. 따라서, 한 종류 이상의 면역 세포를 처리하는데 사용될 수 있는 zalpha11 리간드 (또는 리간드의 길항제)가 질환의 다단계에서의 중재를 위한 매력있는 치료상의 후보이다.

본 발명의 폴리펩티드 또는 단백질은 또한 생체외, 예컨대 자기유래의 골수 배양물에서 사용될 수 있다. 간단히 설명하면, 골수가 화학요법 또는 기관 이식전에 환자로부터 제거되어 선택적으로 하나 이상의 다른 사이토킨과 조합된 zalpha11 리간드로 처리된다. 다음에, 처리된 골수는 골수의 회복을 신속하게 하기 위해 화학요법 후, 또는 숙주에 대한 이식조직 질환을 억제하기 위해 이식 후 환자에게 되돌려진다. 여기에 더하여, 본 발명의 단백질은 또한 골수 또는 말초 혈액 프로게니터 (PBPC) 세포의 생체외 확장에 사용될 수 있다. 치료 전에, 골수는 말초 순화에 서 초기에 프로게니터 세포를 방출하도록 간세포 인자 (SCF)로 자극될 수 있다. 이들 프로게니터는 말초 혈액으로부터 수집되고 농축된 후, 고밀도 림프양 배양물에서 분화 및 증식하도록, SCF, IL-2, IL-4, IL-7 또는 IL-15를 제한 없이 포함하는 하나 이상의 다른 사이토킨과 선택적으로 조합된 zalpha11 리간드로 배양물중에서 처리될 수 있고, 다음에 이것은 화학요법 및 이식 후의 환자에게 되돌려질 수 있다.

본 발명은 zalpha11 리간드의 부재하에 배양된 골수 또는 말초 혈액 세포와 비교하여, 골수 또는 말초 혈액 세포에 있는 림프양 세포의 수를 증가시키기에 충분한 양의 zalpha11 리간드를 포함하는 조성물과 함께 골수 또는 말초 혈액 세포를 배양하는 것을 포함하는, 조혈 세포 및 조혈 세포 프로게니터를 확장하는 방법을 제공한다. 다른 구체예에서, 조혈 세포 및 조혈 프로게니터 세포는 림프양 세포이다. 또 다른 구체예에서, 림프양 세포는 NK 세포 또는 세포독성 T 세포이다. 더욱이, 조성물은 또한 IL-2, IL-15, IL-4, GM-CSF, Flt3 리간드 및 간세포 인자로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 다른 사이토킨을 포함할 수 있다.

또는 달리, zalpha11 리간드는 감염성 질환에 대한 면역성의 증가, 면역손상 환자, 예컨대 HIV+ 환자의 치료, 또는 백신의 개선에 중요한 면역 시스템을 활성시킬 수 있다. 특히, NK 세포 또는 그것들의 프로게니터의 zalpha11 리간드 자극 또는 확장은 바이러스성 감염의 치료에서 치료상의 가치를 제공하고, 항-이상형성성 인자로서 제공된다. NK 세포는 전이성 종양 세포의 제거에 있어 주요한 역할을 한다고 생각되며, 전이되고 단단한 종양을 갖는 환자는 감소된 수준의 NK 세포 활성 을 가진다 (Whiteside et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 230:221-244, 1998). 유사하게, 바이러스 및 비바이러스 병원성 병인 (박테리아, 원생동물 및 진균 포함)에 대한 면역 반응의 zalpha11 리간드 자극은 그러한 감염 병인의 성장을 억제함으로써 그러한 감염의 치료에서 치료상의 가치를 제공한다. 신체에 존재하는 병원체 또는 항원, 예컨대 종양 세포의 수준을 직접 또는 간접적으로 측정하는 것은 당업계에 공지되고 본원에 설명된 다수의 방법에 의해 달성될 수 있다.

본 발명은 (1) 포유류에 존재하는 항원 또는 병원체의 수준을 직접 또는 간접적으로 측정하는 단계; (2) 허용되는 제약학적 부형제중에 zalpha11 리간드 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 투여하는 단계; (3) 상기 포유류에 있는 항원 또는 병원체의 수준을 직접 또는 간접적으로 측정하는 단계; 그리고 (4) 단계 (1)에서의 항원 또는 병원체 수준과 단계 (3)에서의 항원 또는 병원체 수준을 비교하는 단계를 포함하는, 항원 또는 병원체에 노출된 포유류에서 면역 반응을 자극하는 방법을 포함하며, 여기에서 수준의 변화는 면역 반응 자극의 표시이다. 또 다른 구체예에서, zalpha11 리간드 조성물이 재-투여된다. 다른 구체예에서, 항원은 B 세포 종양; 바이러스; 기생충 또는 박테리아이다.

다른 측면으로, 본 발명은 (1) 항원- 또는 병원체-특이적 항체의 수준을 측정하는 단계; (2) 허용되는 제약학적 부형제중에 zalpha11 리간드 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 투여하는 단계; (3) 항원- 또는 병원체-특이적 항체의 투여 후 수준을 측정하는 단계; 그리고 (4) 단계 (1)에서의 항체 수준과 단계 (3)에서의 항체 수준을 비교하는 단계를 포함하는, 항원 또는 병원체에 노출된 포유류에서 면역 반 응을 자극하는 방법을 제공하며, 여기에서 항체 수준의 증가는 면역 반응 자극의 표시이다.

zalpha11 리간드 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드가 zalpha11 리간드 활성을 증가 또는 억제하는 것이 바람직한 유전자 요법의 사용내에서 유용하다. 만약 포유류가 돌연변이된 zalpha11 리간드 유전자를 가지거나 또는 이것을 가지지 않는다면, zalpha11 리간드 유전자가 포유류의 세포안으로 도입될 수 있다. 한 구체예에서, zalpha11 리간드 폴리펩티드를 코드화하는 유전자가 바이러스성 벡터에 생체내에서 도입된다. 그러한 벡터로는 독성약화 또는 결함 DND 바이러스, 예컨대, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 단순성 포진 바이러스 (HSV), 파필로마바이러스, Epstein Barr 바이러스 (EBV), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 (AAV) 등이 있다. 전체적으로 또는 거의 전체적으로 바이러스성 유전자가 결핍된 결함 바이러스가 바람직하다. 결함 바이러스는 세포안에 도입된 후는 감염성이 아니다. 결함 바이러스 벡터의 사용은 벡터가 다른 세포를 감염시킬 수 있는 것에는 관계 없이, 특이적이고 국소적인 영역에서 세포에의 투여를 허용한다. 특정 벡터의 예는 결함 단순성 포진 바이러스 1 (HSV1) 벡터 (Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci. 2:320-30, 1991); 독성약화 아데노바이러스 벡터, 예컨대 Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90:626-30, 1992에 의해 설명된 벡터; 및 결함 아데노-관련 바이러스 벡터 (Samulski et al., J. Virol. 61:3096-101, 1987; Samulski et al., J. Virol. 63:3822-8, 1989)를 제한 없이 포함한다.

zalpha11 리간드 유전자는, 예를 들어 Anderson 등의 미국 특허 제 5,399,346 호; Mann et al., Cell 33:153, 1983; Temin 등의 미국 특허 제 4,650,764 호; Temin 등의 미국 특허 제 4,980,289 호; Markowitz et al., J. Virol. 62:1120, 1988; Temin 등의 미국 특허 제 5,124,236 호; Dougherty 등에 의해 1995, 3, 16자로 발행된 국제 특허 공보 제 WO 95/07358; 및 Kuo et al., Blood 82:845, 1993에 설명된 바와 같이, 레트로바이러스성 벡터에 도입될 수 있다. 또는 달리, 벡터는 리포좀을 사용한 생체내에서의 리포펙션에 의해 도입될 수 있다. 합성 양이온성 지질이 마아커를 코드화하는 유전자의 생체내 트랜스펙션을 위한 리포좀을 제조하기 위해 사용될 수 있다 (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7, 1987; Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8027-31, 1988). 생체내에서 특이 기관안에 외인성 유전자를 도입하기 위한 리포펙션의 사용은 어떤 실제적인 이점을 가진다. 특이적인 세포에 대한 리포좀의 분자 표적화는 이익의 한 영역을 나타낸다. 더욱 특히, 특정 세포에 대한 트랜스펙션을 검출하는 것이 이익의 한 영역을 나타낸다. 예를 들어, 특정 세포 종류에 대한 트랜스펙션을 검출하는 것은 세포 이질성을 갖는 조직, 예컨대, 면역 시스템, 췌장, 간, 신장 및 뇌에서 특히 유리하다. 지질은 표적화의 목적을 위해 다른 분자와 화학적으로 커플링될 수 있다. 표적화된 펩티드 (예를 들어, 호르몬 또는 신경전달물질), 항체와 같은 단백질, 또는 비-펩티드 분자가 리포좀에 화학적으로 커플링될 수 있다.

표적 세포를 신체로부터 제거하는 것; 벡터를 노출된 (naked) DNA 플라스미드로서 도입하는 것; 그런 다음 형질전환된 세포를 신체안에 재-이식하는 것이 가능하다. 유전자 치료를 위한 노출된 DNA 벡터는 당업계에 공지되어 있는 방법, 예 컨대 형질전환, 전기천공, 미소주입, 트랜스덕션, 세포 융합, DEAE 덱스트란, 인산 칼슘 침전화, 유전자 총의 사용 또는 DNA 벡터 트랜스포터의 사용에 의해 원하는 숙주 세포안에 도입될 수 있다 (Wu et al., J. Biol. Chem. 267:963-967, 1992; Wu et al., J. Biol. Chem. 263:14621-14624, 1988).

Zalpha11 리간드 유전자 전사를 억제하기 위하여, 예컨대 생체내에서 세포 증식을 억제하기 위하여 안티센스 방법론이 사용될 수 있다. Zalpha11 리간드-코드화 폴리펩티드의 한 절편에 상보하는 폴리뉴클레오티드 (예컨대 SEQ ID NO:4에 나타낸 폴리뉴클레오티드)가 zalpha11 리간드-코드화 mRNA에 결합하여 그러한 mRNA의 번역을 억제하기 위하여 디자인된다. 그러한 안티센스 폴리뉴클레오티드는 세포 배양중에 또는 환자에서 zalpha11 리간드 폴리펩티드-코드화하는 유전자의 발현을 억제하기 위하여 사용된다.

"트랜스제닉 마우스"로 언급되는, zalpha11 리간드 유전자를 발현하도록 공학처리된 마우스, 및 "녹아웃 마우스"로 언급되는, zalpha11 리간드 유전자 기능이 완전히 없는 마우스가 또한 생성될 수 있다 (Snouwaert et al., Science 257:1083, 1992; Lowell et al., Nature 366:740-742, 1993; Capecchi, M.R., Science 244:1288-1292, 1989; Palmiter, R.D. et al., Annu. Rev. Genet. 20:465-499, 1986). 예를 들어, zalpha11 리간드를 과잉-발현하는 트랜스제닉 마우스는 편재하게 또는 조직-특이적인 또는 조직-제한된 프로모터하에서, 과잉-발현이 표현형을 유발하는지를 알아보기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 야생형 zalpha11 리간드 폴리펩티드, 그것의 폴리펩티드 단편 또는 돌연변이체의 과잉-발현은 정상적인 세포 과정을 변경시킬 수 있고, 그 결과 zalpha11 리간드 발현이 기능적으로 관련되고 zalpha11 리간드, 그것의 아고니스트 또는 길항제에 대한 치료적 표적을 가리킬 수 있는 조직을 확인하는 표현형을 초래한다. 예를 들면, 엔지니어에게 바람직한 트랜스제닉 마우스는 zalpha11 리간드 (SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 32 에서 162)를 과잉-발현하는 마우스이다. 더욱이, 그러한 과잉-발현은 사람 질병과 유사성을 나타내는 표현형을 초래할 것이다. 마찬가지로, 녹아웃 zalpha11 리간드 마우스는 zalpha11 리간드가 생체내에서 절대적으로 필요한지를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 녹아웃 마우스의 표현형은 본원에서 설명된 것들과 같은, zalpha11 리간드 길항제가 가질 수도 있는 생체내 효과의 징조이다. 마우스 또는 사람 zalpha11 리간드 cDNA는 녹아웃 마우스를 생성하기 위하여 사용된다. 이들 마우스는 zalpha11 리간드 유전자 및 그로써 생체내 시스템에 코드화된 단백질을 연구하기 위하여 사용될 수 있고, 상응하는 사람 질병에 대한 생체 모델로서 사용될 수 있다. 더욱이, 본원에서 설명된, zalpha11 리간드 안티센스 폴리뉴클레오티드 또는 zalpha11 리간드에 대해 지정된 리보솜의 트랜스제닉 마우스 발현은 상술된 트랜스제닉 마우스와 유사하게 사용될 수 있다. 연구는 또한 정제된 zalpha11 리간드 단백질의 투여에 의해 수행될 수 있다.

약학적 사용을 위하여, 본 발명의 단백질은 비경구용으로, 특히 정맥내 또는 피하 투여를 위하여 종래 방법에 따라 제형된다. 본원에서 설명된 생물활성 또는 항체 콘쥬게이트는 정맥내, 동맥내 또는 관내 전달될 수 있거나, 또는 의도된 작용 부위에 국소적으로 도입될 수 있다. 정맥내 투여는 1 내지 여러 시간의 전형적인 기간에 걸친 거환 주사 또는 주입에 의해 이루어질 것이다. 일반적으로, 약학적 제형은 약학적으로 허용되는 부형제, 예컨대 식염수, 완충 식염수, 물중의 5 % 덱스트로오스 등과 함께 zalpha11 리간드 단백질을 포함할 것이다. 제형은 또한 하나 또는 둘 이상의 부형제, 보존제, 용해제, 완충제, 바이알 표면상에서의 단백질 손실을 방지하기 위한 알부민 등을 포함할 수 있다. 제형 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 문헌에 개시되어 있다 (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th ed., 1995). 치료적 용량은 일반적으로 환자 체중 kg 당 1일에 0.1 내지 100 ㎍, 바람직하게는 0.5 내지 20 mg/kg/일의 범위이며, 정확한 용량은 허용된 표준에 따라, 치료해야 할 질환의 성질 및 심각성, 환자 특징 등을 고려하여 임상의에 의해 결정된다. 용량의 결정은 당업자의 수준내에 있다. 단백질은 일주 또는 그 이하에 걸쳐, 주로 1일 내지 3일의 기간에 걸쳐 급성 치료를 위해 투여될수 있거나, 또는 몇달 또는 몇년에 걸쳐 만성 치료를 위해 사용될수 있다. 일반적으로, zalpha11 리간드의 치료적인 유효량은 조혈 또는 면역 기능에 있어 임상적으로 현저한 변화를 생성하기에 충분한 양이다.

본 발명은 다음의 비제한적인 실시예들에 의해 더 설명된다.

도 1은 사람 IL-2, 사람 IL-15, zalpha11 Ligand(SEQ ID NO: 2), 사람 IL-4, 마우스 IL-4, 사람 GM-CSF 및 마우스 GM-CSF의 다중 정렬의 도해이다.

(실시예1)

MPL-zalpha11 폴리펩티드 키메라의 제조: zalpha11 세포간 신호전달 도메인에 융합된 MPL 세포외 및 TM 도메인

뮤린의 MPL 리셉터의 세포외 및 트랜스멤브레인 도메인을 프라이머 ZC17,212(SEQ ID NO:5) 및 ZC19,914(SEQ ID NO:6)를 가지고 PCR 을 사용하여 뮤린의 MPL 리셉터를 포함하는 플라스미드로부터 분리했다. 반응 조건을 하기와 같이 했다: 1 분동안 95℃;1 분동안 95℃ 에서 35 사이클, 1 분동안 45 ℃, 2 분동안 72 ℃; 그 다음에 10 분동안 72 ℃; 그 다음 10 ℃ 침액. PCR 생성물을 1 % 낮은 녹는점 아가로스 (Boerhinger Mannheim, Indianapolis, IN) 상에 전개시켰고, 약 1.5 kb MPL 리셉터 단편을 제조자의 지시에 따라 Qiaquick^TM겔 추출 키트 (Qiagen)를 사용하여 분리했다.

사람의 zalpha11 의 세포간 도메인을 프라이머 ZC19,913 (SEQ ID NO:8) 및 ZC20,097(SEQ ID NO:9)를 가지고 PCR 을 사용하여 zalpha11 리셉터 cDNA 를 포함하는 플라스미드로부터 분리했다. zalpha11 리셉터 코드 서열에 해당하는 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:7 으로 제시되고, 해당 아미노산 서열은 SEQ ID NO:115 로 제시된다. 반응 조건을 상기와 같이 했다. PCR 생성물을 1 % 낮은 녹는점 아가로스 (Boerhinger Mannheim)상에 전개시켰고, 약 900 bp zalpha11 단편을 제조자의 지시에 따라 Qiaquick^TM겔 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 분리했다.

상기에 개시된 각각의 분리된 단편을 1 :1 부피비로 혼합했고 MPL-zalpha11 키메라를 제조하기 위해 ZC17,212(SEQ ID NO:5) 및 ZC20,097(SEQ ID NO:9)를 사용하는 PCR 반응에 사용했다. 반응 조건을 하기와 같이 했다. : 1 분동안 95℃; 1 분동안 95℃ 에서 35 사이클, 1 분동안 55 ℃, 2 분동안 72 ℃; 그 다음에 10 분동안 72 ℃; 그 다음 10 ℃ 침액. 전체 PCR 생성물을 1 % 낮은 녹는점 아가로스 (Boerhinger Mannheim)상에 행했고, 약 2.4 kb MPL zallphal1 키메라 단편을 제조자의 지시에 따라 Qiaquick^TM겔 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 분리했다. MPL-zalpha11 키메라 단편을 제조자의 지시에 따라서 EcoRI (BRL) 및 Xbal(Boerhinger Mannheim)로 절단했다. 전체 분해물을 1 % 낮은 녹는점 아가로스(Boerhinger Mannheim)상에 전개시켰고, 절단된 MPL-zallphal1 키메라 단편을 제조자의 지시에 따라 Qiaquick^TM겔 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 분리했다. 결과적인 절단된 MPL-zalpha11 키메라를 하기에 개시된대로 발현 벡터에 삽입했다.

가용성 발현 벡터 pZP-5N 을 제조자의 지시에 따라서 EcoRI(BRL) 및 HindIII(BRL)로 절단했고, 겔을 상기에 개시된 대로 정제했다. 벡터 단편을 리게이션반응으로 상기의 분리된 EcoRI 및 XlaI 절단 MPL-zalpha11 키메라 및 XbaI/HindIII 링커 단편과 결합시켰다. 리게이션은 하룻밤동안 15 ℃ 에서 T4 리가제(BRL) 를 사용하여 행했다. 리게이션 샘플을 DH10B ElectroMAX^TM 일렉트로컴피턴트 대장균 세포(25μF, 200Ω, 2.3V) 에 전기천공했다. 형질전환체를 LB+암피실린 평판에 플레이팅했고, 단일 콜로니를 상기에 개시된 PCR 조건을 사용하여 ZC17,212(SEQ ID NO:5) 및 ZC20,097(SEQ ID NO:9) 를 사용하여 MPL-zalpha11 키메 라에 대해 PCR 로 스크리닝했다.

MPL-zalphal 키메라 서열의 확인은 다음의 프라이머: ZC12,700(SEQ ID NO:10), ZC5,020(SEQ ID NO:11), ZC6,675(SEQ ID NO:12), ZC7,727(SEQ ID NO:13), ZC8,290(SEQ ID NO:14), ZC19,572(SEQ ID NO:15), ZC6,622(SEQ ID NO:16),ZC7,736(SEQ ID NO:17), 및 ZC9,273(SEQ ID NO:18)를 사용하여 서열 분석으로 행했다. 삽입체는 약 2.4 bp 이고, 전-길이였다.

(실시예 2)

Alamar Blue 를 사용하여 BAF3 분석법으로 MPL-zalpha11 키메라 기초 증식

A. MPL-zalpha11 키메라를 발현하는 BaF3 의 제조

뮤린 골수로부터 얻은 인터류킨-3(IL-3) 의존 예비-림프구 셀라인, BaF3 (Palacios and Steinmetz, Cell 41: 727-734, 1985; Mathey Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986)를 10 % 열-불활성 송아지 태아 혈청, 2ng/ml 뮤린 IL-3 (mIL-3) (R & D, Minneapolis, MN), 2mM L-glutaMax-1^TN (Gibco BRL), 1 mM 피루브산 나트륨 (Gibco BRL), 및 PSN 항생제 (GIBCO BRL))로 보충된 완전 배지(RPMI 배지(JRH Bioscience Inc., Lenexa, KS)에 유지시켰다. 전기천공전에, pZP-5N/MPL-zalpha11 플라스미드 DNA (실시예 1)를 제조자의 지시에 따라 Qiagen Maxi Prep 키트(Qiagen)를 사용하여 정제했다. 전기천공용 BaF3 세포를 RPMI 배지에서 한번 세척했고, 그 다음 10 ⁷ 세포/ml 의 세포 밀도로 RPMI 배지에서 재현탁했다. 1 ml 의 재현탁된 BaF3 세포를 30 μg 의 pZP-5N/MPL-zalpha11 플라스미드 DNA 와 혼합했고 별개의 일회용 전기천공 챔버(GIBCO BRL)에 옮겼다. 그 다음, 실온에서 15 분 인큐베이션에 이어서, 세포에 전기천공 장치(CELL-PORATOR^TM; GIBCO BRL)로 2 번의 일련의 쇽(800 1Fad/300 V.; 1180 1Fad/300 V.)을 가했다. 5 분동안 회수후에, 전기천공된 세포를 50 ml 의 완전 배지에 옮겼고 인큐베이터에 15-24 시간 (37 ℃, 5% C0₂)놓았다. 그 다음 세포를 회전시켰고, T-162 플라스크에서 Geneticin^TM (Gibco) 선택 (500 μg/ml G418)을 포함하는 50 ml 의 완전배지에서 재현탁하여 G418-내성 풀을 분리했다. 이하에서는 BaF3/MPL-zalpha11 세포로 명명하는 트랜스펙션된 BaF3 세포의 풀을 하기에 개시된 대로, 신호전달 가능성에 대해 분석했다.

B. Alamar Blue 증식 분석법을 사용하여 BaF3/MPL-zalpha11 세포의 신호전달 가능성 시험.

BaF3/MPL-zalpha11 세포를 상기에 개시된 대로, 회전시켰고 mIL-3 가 없는 완전배지(이하, "mIL-3 무배지"라고 함)에서 세척했다. 세포를 회전시켰고 mIL-3 의 제거를 확실히하기 위하여 3 번 세척했다. 그 다음 세포를 헤마사이토미터로 계수했다. 세포를 mIL-3 무배지를 사용하여 웰당 100 ㎕ 의 부피로 웰당 5000 세포로 96-웰 포맷에 플레이팅했다.

BaF3/MPL-zalpha11 세포의 증식을 mIL-3 무배지로 500 ng/ml, 250ng/ml, 125 ng/ml, 62 ng/ml, 30 ng/ml, 15 ng/ml, 7. 5 ng/ml. 3.75 ng/ml, 1.8 ng/ml, 0.9 ng/ml, 0.5 ng/ml 및 0.25 ng/ml 농도까지 희석된 뮤린 m트롬보포이에틴(mTPO) 을 사용하여 분석했다. 100 ㎕ 의 희석된 mTPO 를 BaF3/MPL-zalpha11 세포에 첨가했다. 총 분석 부피는 200 ㎕ 이다. 음성 대조군을 mPTO 의 첨가 없이, mIL-3 무배지만을 사용하여 평행하게 놓았다. 분석 평판을 Alamar Blue(Accumed, Chicago, IL) 가 20 ㎕/웰로 첨가된 후 3 일동안 37 ℃, 5 % CO₂에서 인큐베이션했다. Alamar Blue 는 세포의 대사 활성에 기초한 형광 해독을 가능케했고, 따라서 음성 대조군과 비교하여 세포 증식의 직접적인 측정을 가능케 했다. 평판을 다시 24 시간동안 37 ℃, 5 % CO₂에서 인큐베이션했다. 평판을 SoftMax^TM Pro 프로그램을 사용하여 파장 544 (소멸) 및 590 (등장)으로 Fmax^TM 평판 리더상(Molecular Devices Sunnyvale, CA)에서 해독했다.

결과는 트롬보포이에틴 유발 증식이 62 ng/ml 이상의 mTPO 농도에서 백그라운드보다 약 10 배 이상일때, zalpha11 리셉터의 세포내 부분의 신호전달 가능성을 확증했다.

실시예 3

전체-길이 zalpha11 을 발현하는 발현 벡터의 구성

전체 zalpha11 리셉터를 프라이머 ZC19,905(SEQ ID NO:19) 및 ZC19,906(SEQ ID NO:20)을 가지고 PCR 을 사용하여 zalpha11 리셉터 cDNA (SEQ ID NO:7) 을 포함하는 플라스미드로부터 분리했다. 반응 조건을 하기와 같이 했다: 1 분동안 95℃;1 분동안 95℃ 에서 35 사이클, 1 분동안 55 ℃, 2 분동안 72 ℃; 그 다음에 10 분 동안 72 ℃; 그 다음 10 ℃ 침액. PCR 생성물을 1 % 낮은 녹는점 아가로스(Boerhinger Mannheim)상에 전개시켰고, 약 1.5 kb zalpha11 cDNA 를 제조자의 지시에 따라 Qiaquick^TM겔 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 분리했다.

정제된 zalpha11 cDNA 를 제조자의 지시에 따라서 BamH1(Boerhinger Mannheim) 및 EcoRI (BRL)로 절단했다. 전체 분해를 1 % 낮은 녹는점 아가로스(Boerhinger Mannheim)상에 전개시켰고, 절단된 zalpha11 단편을 제조자의 지시에 따라 Qiaquick^TM겔 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 분리했다. 결과적인 절단된 zalpha11 단편을 하기에 개시된대로 발현 벡터에 삽입했다.

수용 발현 벡터 pZP-5N 을 제조자의 지시에 따라서 BamH1(Boerhinger Mannheim) 및 EcoRI (BRL)로 절단했고, 겔을 상기에 개시된 대로 정제했다. 벡터 단편을 T4 리가제(BRL) 를 사용하여 리게이션반응으로 상기의 분리된 BamH1 및 EcoR1 절단 zalpha11 단편과 결합시켰다. 리게이션은 하룻밤동안 15 ℃ 에서 인큐베이션했다. 리게이션 샘플을 DH10B electroMAX^TM 일렉트로컴피턴트 E. coli 세포 (25 F, 200Ω, 2.3V)에 전기천공했다. 형질전환체를 LB+암피실린 평판에 플레이팅했고,단일 콜로니를 상기에 개시된 PCR 조건을 사용하여 ZC19,905 (SEQ ID NO: 19) 및 ZC19, 906 (SEQ ID NO: 20) 을 사용하는 zalpha11 서열을 체크하기 위해 PCR 로 스크리닝했다.

zalpha11 서열의 확인을 다음의 프라이머 : ZC12, 700 (SEQ ID NO: 10), ZC5,020 (SEQ ID NO: 11), ZC20,114 (SEQ ID NO: 21), ZC19, 459 (SEQ ID NO: 22), ZC19, 954 (SEQ ID NO: 23), 및 ZC20,116 (SEQ ID NO: 24)를 사용하여 서열 분석에 의해 했다.

실시예 4

Alamar Blue 를 사용하여 BAF3 분석법으로 zalpha11 기초 증식

A. zalpha11 리셉터 발현 BaF3 세포의 구성

전 길이 zalpha11 리셉터를 발현하는 BaF3 세포를 상기 실시예 3 에 개시된 30 μg zalpha11 발현 벡터를 사용하여 상기의 실시예 2A 에 개시된 대로 제조했다. zalpha11 리셉터 mRNA 를 발현하는 BaF3 세포는 BaF3/zalpha11 으로 지정된다. 세포는 하기의 실시예 5 및 6 에 개시된 zalpha11 리간드를 스크리닝하기 위해 사용했다.

실시예 5

Alamar Blue 증식 분석법을 사용하여 BaF3/zalpha11 세포를 사용하는 zalpha11 리간드 스크리닝

A. zalpha11 리간드의 존재를 시험하기 위한 제 1 차 원숭이 비장세포의 활성

원숭이 비장세포를 시험관내에서 자극하여 하기에 개시된 대로 zalpha11 리간드 활성의 존재를 시험하기 위한 콘디셔닝 배지를 생산했다. 원숭이 비장은 8 년 된 암컷 M. nesestrian 원숭이로부터 얻었다. 비장을 부분적으로 떼어내어 단일 세포 현탁액을 생산했다. 단핵 세포를 Ficoll-Paque

PLUS (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) 밀도 구배로 분리했다. 단핵 세포를 10 % FBS 로 보충된 RPMI- 1640 배지에서 2 × 10 ⁶ 세포/ml 로 시딩했고, 48 시간동안 5 ng/ml Phorbol-12-미리스테이트-13-아세테이트(PMA) (Calbiochem, San Diego, CA), 및 0. 5mg/ml Ionomycin^TM (Calbiochem) 으로 활성화했다. 하기에 개시된 BaF3/zalpha11 세포의 증식을 분석하기 위하여 자극된 원숭이 비장 세포의 현탁액을 사용했다.

B. Alamar Blue 증식 분석법을 사용하여 BaF3/zalpha11 세포를 사용하는 zalphal I 리간드 스크리닝

BaF3/Zalphal I 세포를 회전시켰고, mIL-3 무배지에서 세척했다. mIL-3 의 제거를 확실히 하기 위해서 세포를 3 번 회전시켰고 세척했다. 그 다음 헤마사이토미터로 세포를 계수했다. 세포를 mIL-3 무배지를 사용하여 웰마다 100 ㎕ 부피로 웰당 5000 세포로 96 웰 포맷에 플레이팅했다.

BaF3/MPL-zalpha11 세포의 증식을 활성화된 원숭이 비장으로부터 콘디셔닝 배지를 사용하여 분석했다(실시예 5A 참조). 콘디셔닝 배지를 mIL-3 무배지로 50%, 25%, 12.5%, 6.25%, 3.125%, 1.5%, 0.75% 및 0.375% 농도까지 희석했다. 100 ㎕ 의 희석된 콘디셔닝 배지를 BaF3/MPL-zalpha11 세포에 첨가했다. 총 분석 부피는 200 ㎕ 이다. 분석 평판을 Alamar Blue(Accumed, Chicago, IL)가 20 ㎕/웰로 첨가된 후 3 일동안 37 ℃, 5 % CO₂에서 인큐베이션했다. 평판을 24 시간동안 37 ℃, 5 % CO₂에서 인큐베이션했다. 평판을 상기에 개시된 대로(실시예 2) Fmax^TM 평판 리더 (Molecular Devices) 상에서 해독했다.

결과는 활성화 원숭이 비장 콘디셔닝 배지에 존재하는 인자에 대한 BaF3/Zalpha11 세포의 증식 반응을 확증한다. 측정된 반응은 50 % 농도에서 백그라운드보다 약 4 배 이상이었다. 트랜스펙션되지 않은 BaF3 세포는 이 인자에 대한 반응에서 증식하지 않음으로써 이 인자가 zalpha11 리셉터에 특이적임을 나타냈다.

C. zalpha11 리간드 분리에 사용되는 사람의 일차 공급원

100 ml 혈액을 각 6 명의 공여자로부터 채혈했다. 혈액은 헤파린을 포함하는 10 x 10 ml 진공기 튜브를 사용하여 취했다. 혈액을 6 명의 공여자로부터 모았고(600 ml), PBS 에서 1:1 로 희석했고, Ficoll-Paque

PLUS(Pharmacia Biotech) 를 사용하여 분리했다. 피콜(ficoll) 구배에서 분리한 후에 분리된 제 1 차 사람의 세포 산출량은 1.2 x 10 ⁹세포였다.

세포를 9.6 ml MACS 완충액 (PBS, 0.5% EDTA, 2mM EDTA)에서 현탁했다. 1.6 ml 의 세포 현탁액을 제거했고 0.4 ml CD3 마이크로비드 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA)를 첨가했다. 혼합물을 4 ℃ 에서 15 분동안 인큐베이션했다. CD3 비드로 표지된 세포를 30 ml MACS 완충액으로 세척했고, 그 다음 2 ml MACS 완충액으로 재현탁했다.

VS+ 컬럼(Miltenyi)을 제조자의 지시에 따라서 제조했다. 그 다음, VS+ 컬럼을 VarioMACS^TM 자기장(Miltenyi)에 놓았다. 컬럼을 5 ml MACS 완충액으로 평형화했다. 그 다음, 분리된 제 1 차 사람 세포를 컬럼에 적용했다. CD3 음성 세포가 통과하도록 했다. 컬럼을 9 ml (3 X 3 ml) MACS 완충액으로 린스했다. 그 다음, 컬럼을 자석으로부터 제거했고 15 ml 팔콘 튜브에 놓았다. 5 ml MACS 완충액을 첨가함으로써 CD3+ 세포를 컬럼으로 용리시켰고 제조자에 의해 제공된 플런저를 사용하여 결합 세포를 수체교환했다. 상기 CD3 자석 비드로 세포의 인큐베이션, 세척, 및 VS + 컬럼 단계(인큐베이션부터 용리까지)를 5 번 반복했다. 6 개의 컬럼 분리물로부터 결과적인 CD3+ 분획을 모았다. CD3+ 선택된 사람 세포의 산출량은 3X10⁸ 총세포였다.

모여진 CD3+ 선택된 사람 세포의 샘플을 그것의 순도를 평가하기 위해서 염색 및 형광 항체 세포 분류기 (FACS)상에서 분류하기 위해 제거했다. 사람의 CD3+ 선택된 세포는 91 % CD3+ 세포였다.

사람의 CD3+ 선택된 세포를 37 ℃ 에서 13 시간동안 RPMI + 5% FBS + PMA 10 ng/ml 및 Ionomycin 0.5 g/ml (Calbiochem)에서 인큐베이션하여 활성화했다. 활성화된 CD3+ 선택된 사람 세포로부터 상층액을 하기에 개시된대로 zalpha11 리간드 활성에 대해 시험했다. 게다가, 활성화된 CD3+ 선택된 사람 세포를 하기의 실시예 6 에 개시된 대로 cDNA 라이브러리를 제조하기 위해 사용했다.

D. BaF3/Zalpha11 세포 및 Alamar Blue 증식 분석법을 사용하여 zalpha11 리간드에 대한 활성화 CD3+ 선택된 사람 세포의 상층액 시험

BaF3/Zalpha11 세포를 회전시켰고, mIL-3 무배지로 세척했다. 세포를 회전시켰고, mIL-3 의 제거를 확실히하기 위해서 3 번 세척했다. 그 다음 세포를 헤마토시토미터로 계수했다. 세포를 mIL-3 무배지를 사용하여 웰당 100 ㎕ 의 부피로 웰 당 5000 세포로 96-웰 포맷에 플레이팅했다.

BaF3/Zalpha11 세포의 증식을 mIL-3 무배지로 50%, 25%, 12.5%, 6.25%, 3.125%, 1.5%, 0.75% 및 0.375% 농도로 희석된 활성화 CD3+ 선택된 사람 세포(실시예 5C 참조)로부터 콘디셔닝 배지를 사용하여 평가했다. 100 ㎕ 의 희석 콘디셔닝 배지를 BaF3/zalpha11 세포에 첨가했다. 총 분석 부피는 200 ㎕ 였다. 분석 평판을 인큐베이션했고, 실시예 5B 에 개시된 대로 분석했다.

결과는 활성화 CD3+ 선택된 사람 세포 콘디셔닝 배지에 존재하는 인자에 대한 BaF3/Zalpha11 세포의 증식 반응을 확증한다. 측정된 반응은 50 % 농도에서 백그라운드보다 약 10 배 였다. 트랜스펙션되지 않은 BaF3 세포는 인자에 대한 반응에서 증식하지 않았고, 이것은 인자가 zalpha11 리셉터에 대해 특이적이라는 것을 보여준다. 더욱이, 가용성 alpha11 리셉터는 BaF3/Zalpha11 세포에서 증식 활성을 차단했다. (실시예 11 참조)

실시예 6

사람의 CD3+ 선택된 세포 라이브러리로부터 사람 zalpha11 리간드의 클로닝

제 1 차 사람의 활성 CD3+ 선택된 세포 cDNA 라이브러리의 스크리닝은 4-나선-번들 사이토킨 부류의 새로운 요소인 분리된 cDNA 를 밝혀냈다. cDNA 는 zalpha11 리간드를 코드화했다. cDNA 는 zalpha11 리셉터를 사용하여 zalpha11 의 활성을 스크리닝하여 확인했다.

A. CD3+ 선택된 라이브러리 제조를 위한 벡터

CD3+ 선택된 라이브러리 제조를 위한 벡터는 pZP7NX 였다. pZP7NX 벡터를 하 기와 같이 제조했다: 벡터 pZP7 내의 DHFR 선택 마아커의 코드 영역을 Nicol 및 PstI 제한 효소(Boehringer Mannheim)로 DNA 절단하여 제거했다. 절단된 DNA 를 1 % 아가로스 겔상에 전개시켰고, 잘랐고 제조자의 지시에 따라서 Qiagen 겔 추출 키트 (Qiagen)를 사용하여 정제했다. Zeocin 선택 마아커의 코드 영역을 나타내는 DNA 단편은 프라이머 ZCl3,946 (SEQ ID NO: 25) 및 ZC13,945 (SEQ ID NO: 26), 및 템플레이트로서 pZeoSV2(+)를 가지고 PCR 방법으로 증폭했다. 프라이머 ZC13,946 (SEQ ID NO: 25)에 추가적인 PstI 및 BelI 제한효소 부위가 있었고, 프라이머 ZC13,945 (SEQ ID NO:26)에 추가적인 NcoI 및 SfuI 부위가 있었다. PCR 단편을 PstI 및 NcoI 제한 효소로 잘랐고 같은 2 개의 효소로 절단되어 제조된 pZP7 벡터에 클론했고, 연이어 겔 정제했다 벡터를 pZP7Z 로 명명했다. 그 다음, Zeocin 코드 영역을 Bell 및 SfuI 제한 효소를 가진 벡터 pZP7Z 의 DNA 절단으로 제거했다. 절단된 DNA 를 1 % 아가로스 겔상에 전개시켰고, 잘랐고 겔 정제한 다음, 같은 제한효소를 가진(BcII 및 SfuI) pZem228 벡터(American Type Culture Collection (ATCC)에 기탁, Manassas, VA; ATCC 기탁번호. 69446)로부터 잘려진 네오마이신 코드 영역 DNA 단편과 리게이션했다.

새로운 벡터를 pZP7N 로 명명했고, DHFR 선택마아커에 대한 코드 영역을 벡터 pZem228 의 네오마이신 선택 마아커에 대한 코드 영역으로 대체했다. Xho1 부위를 포함하는 스터퍼 단편을 pZP7N 에 첨가하여 고효율의 특이적인 cDNA 클로닝에 적합한 벡터를 제조했다; 새로운 벡터를 pZP7NX 라 한다. cDNA 를 위한 벡터를 제조하기 위해서, 37 ℃ 에서 5 시간동안, 그 다음 68 ℃ 에서 15 분동안 20 μg 의 pZP7NX 를 20 유니트의 EcoR1 (Life Technologies Gaithersberg, MD) 및 20 유니트의 Xhol (Boehringer Mannheim Indianapolis, IN) 절단했다. 그 다음 절단물을 0.8 % 낮은 녹는점 아가로스 1XTAE 겔상에서 런하여 벡터로부터 스터퍼를 분리했다. 벡터 밴드를 절단했고 제조자의 추천에 따라서 "베타-아가로스"(New England Biolabs, Beverly, MA)로 분해했다. 에탄올 침전후에 분해된 벡터를 물에서 재현탁하여 하기에 개시된 대로 CD3+ 선택된 cDNA 라이브러리의 리게이션을 위한 제조상의 45 ng/ml 로 했다.

B. 제 1 차 사람 활성 CD3+ 선택된 세포 cDNA 라이브러리의 구성

이오노마이신/PMA 에서 자극된 약 1.5 X 10⁸ 제 1 차 사람의 CD3+ 선택된 세포를 13 시간동안 37 ℃ 에서 배양한 후에 원심분리에 의하여 분리했다. (실시예 5C). 총 RNA 를 Qiagen, Inc.(Valencia, CA) 로부터 "RNeasy Midi" 키트를 사용하여 세포 펠렛으로부터 분리했다. mRNA 를 CPF Inc.(Lincoln Park, NJ)로부터 "MPG mRNA 정제 키트" 를 사용하여 총 RNA 의 225 μg 으로부터 분리했다. 3.4 μg 의 mRNA 를 분리했고 다음의 절차를 사용하여 이중 가닥 cDNA 로 전환시켰다.

자극된 사람의 CD3+ 선택된 세포로부터 첫번째 가닥의 cDNA 를 하기와 같이 합성했다.Xhol 제한효소 부위를 포함하는 1μg/㎕ 첫번째 가닥 프라이머 ZC18,698(SEQ ID NO:27)의 0.34 μg/㎕ 및 1.0 ㎕ 농도에서 9 ㎕ 올리고 d(T)-선택 폴리(A) CD3+ RNA 를 혼합했고, 65 ℃ 에서 4 분동안 가열했고, 아이스상에서 냉각시켰다. 첫번째 가닥 cDNA 합성은 RNA-프라이머 혼합물에 9 ㎕ 의 첫번째 가닥 완충액(5x SUPERSCRIPT

완충액; (Life Technologies), 4 ㎕ 의 100 mM 디티오트레이톨 및 dATP, dGTP, dTTP 및 5-메틸-dCTP (Pharmacia Biotech Inc.)의 각 10 mM 을 포함하는 2 ㎕ 의 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 용액을 첨가함으로써 개시된다. 반응 혼합물을 45 ℃ 에서 4 분 인큐베이션한 다음 8 ㎕ 의 200 U/㎕ SuperscriptII

, RNase H-역전사효소(Life technologies)를 첨가했다. 반응을 45 ℃ 에서 45 분 인큐베이션한 다음, 반응을 10 분간 멈출 경우에 인큐베이션 램프가 매 2 분마다 1°로 올라서 50 °가 되게 한다. 어떤 제 2 차 구조를 변성시키고, cDNA 의 추가적인 확장을 허용하기 위해서 반응을 2 분동안 70 ℃ 까지 가열시킨 다음, 2 ㎕ 의 SuperscriptII

RT 가 첨가된 다음 4 분동안 55 ℃ 까지 낮추었고, 추가적으로 15 분 인큐베이션하여 램프가 1분/1°C 로 70 ℃ 가 되게 한다. 비결합 뉴클레오티드를 2μg 의 글리콘 담체, 2.0 M 암모늄 아세테이트 및 2.5 부피의 에탄올의 존재하에서 2 번 침전한 다음 70 % 에탄올로 100 ㎕ 세척하여 cDNA 로부터 제거했다. 두번째 가닥 합성을 위해서 98 ㎕ 물에서 cDNA를 재현탁했다.

두 번째 가닥 합성은 첫번째 가닥이 두번째 가닥 합성의 프라이밍을 촉진하여 DNA 헤어핀 형성을 초래하는 조건하에서 첫번째 가닥 cDNA 상에서 수행했다. 두번째 가닥 반응은 98 ㎕ 의 첫번째 가닥 cDNA, 30 ㎕ 의 5 x 폴리머라제 완충액, (100 mM Tris: HCl, pH 7. 5, 500 mM KCl, 25 mM MgCl₂, 50 mM (NH₄)₂SO ₄), 2 ㎕ 의 100 mM 디티오트레이톨, 10 mM 의 각 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트, 5 ㎕ 의 5 mM b-NAD, 1㎕ 의 3 U/㎕ 대장균 DNA 리가제 (New England Biolabs Inc.) 및 4 ㎕ 의 lO U/㎕ E. coli DNA 폴리머라제 I (New England Biolabs Inc.)을 포함하는 6 ㎕ 의 용액을 포함했다. 반응물을 실온에서 모았고, 실온에서 2 분동안 인큐베이션한 다음 4 ㎕의 3.8 U/㎕ RNaseH (Life Technologies)를 첨가하였다. 반응물을 15 ℃ 에서 2 시간동안 인큐베이션한 다음에 실온에서 15 분동안 인큐베이션했다. 10 ㎕ 의 1 M TRIS pH 7.4 를 반응물에 첨가했고, 페놀/클로로폼으로 2 번 그리고, 클로로폼으로 1 번 추출했고, 그 다음 유기상을 50 ㎕ 의 TE(lOmM TRIS pH 7.4, 1mM EDTA)로 다시 추출했고, 나머지 수성층을 모으고, 0.3 M 나트륨 아세테이트의 존재하에서 에탄올 침전했다. 펠렛을 100 ㎕ 70 % 에탄올로 세척했고, 공기중에서 건조했고, 40 ㎕ 물로 재현탁했다.

헤파린 구조의 단일-가닥 DNA 를 멍 빈(mung bean)뉴클레아제를 사용하여 절단했다. 반응 혼합물은 40 ㎕ 의 제 2 가닥 cDNA , 1X 멍빈 뉴클레아제 완충액에서 1U/㎕ 까지 희석된 5 ㎕ 의 10 x 멍빈 뉴클레아제 완충액, (Life technologies), 5 ㎕ 의 멍빈 뉴클레아제 (Pharmacia Biotech Corp.)를 포함했다. 반응물을 37 ℃ 에서 45 분동안 인큐베이션했다. 반응을 10 II 의 1 M Tris: HCl, pH 7.4 에 이어서, 상기에 개시된 대로 일련의 페놀/클로로폼 및 클로로폼 추출물을 첨가하여 종결했다. 추출 다음에, cDNA 는 0.3 M 나트륨 아세테이트의 존재하에서 에탄올 침전했다. 펠렛을 100 ㎕ 70 % 에탄올로 세척했고, 공기중에서 건조시켰고, 38 ㎕ 물에서 재현탁했다.

재현탁 cDNA 는 T4 DNA 폴리머라제를 가진 블런트-말단이었다. 38 ㎕ 물에서 재현탁된 cDNA 를 12㎕ 5xT4 DNA 폴리머라제 완충액(250 mM Tris: HCl, pH 8. 0, 250 mM KCl, 25 mM MgCl₂), 2 ㎕ 0.1 M 디티오트레이톨, 10 mM 의 각 디옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 및 2 ㎕ 의 1 U/㎕ T4 DNA 폴리머라제 (Boehringer Mannheim Corp.)를 포함하는 6 ㎕ 의 용액과 혼합했다. 15 ℃ 에서 45 분의 인큐베이션후에, 반응을 30 ㎕ TE 다음에 일련의 페놀/클로로폼 및 클로로폼 추출물의 첨가 및 상기에 개시된 대로 20 ㎕ TE 로 재추출하여 종결하였다. DNA 는 2 ㎕ Pellet Paint^TM(Novagen) 담체 및 0.3 M 나트륨 아세테이트의 존재하에서 에탄올 침전하였고, 11 ㎕의 물로 재현탁했다.

Eco RI 어댑터를 상기에 개시된 cDNA 의 5'말단에 리게이션하여 클로닝이 발현 벡터가 되게 하였다. 11 ㎕ 의 cDNA 및 4 ㎕ 의 65 pmole/㎕ 의 Eco RI 헤미포스포릴레이션된 어댑터(Pharmacia Biotech Corp)를 5 ㎕ 5x 리가제 완충액 (Life Technologies), 2 ㎕ 의 10 mM ATP 및 3 ㎕ 의 1 U/㎕ T4 DNA 리가제(Life Technologies), 1 ㎕ lOX 리게이션 완충액(Promega Corp), 9 ㎕ 물과 함께 혼합했다. 1X 완충액으로 나머지 희석은 펠렛 페인트가 침전하는 것을 방지하기 위한 것이다. 반응은 물 욕 온도 램프에서 10 ℃ 에서 22 ℃ 로 9 시간이상 다음에, 25 ℃ 에서 45 분 인큐베이션하였다.반응을 68 ℃ 에서 15 분동안 인큐베이션에 의해서 종결했다.

발현 벡터에 cDNA 의 특이적 클로닝을 촉진하기 위해서, cDNA 를 Xhol 로 절단했고, 결과적으로 5'Eco RI 상보 말단 및 3' XhoI 상보 말단을 가지는 cDNA 를 가진다. cDNA 의 3'말단에서 XhoI 제한효소 부위는 ZC18698 (SEQ ID NO: 27)프라이 머를 사용하여 미리 도입되었다. 제한 효소 절단을 상기에 개시된 35 ㎕ 의 리게이션 혼합물, 6 ㎕ 의 10 xH 완충액(Boehringer Mannheim Corp.), 1 ㎕ 의 2mg/ml BSA (Biolabs Corp.), 17 ㎕ 물 및 1.0 ㎕ 의 40 U/㎕ XhoI (Boehringer Mannheim)를 포함하는 반응 혼합물에서 수행했다. 절단을 37 ℃ 에서 1 시간동안 수행했다. 반응을 68 ℃ 에서 15 분동안 인큐베이션한 다음 에탄올 침전하고, 상기에 개시된 대로 세척 건조하고, 30 ㎕ 물에서 재현탁하여 종결했다.

재현탁된 cDNA 를 5 분동안 65 ℃ 까지 가열시켰고, 아이스상에서 냉각시켰고, 4 ㎕ 의 5X 겔 로딩 염료(Research Genetics Corp.)를 첨가했고, cDNA 를 0.8 % 낮은 녹는점 아가로스 1X TAE 겔(SEA PLAQUE GTGTM low melt agarose; FMC Corp.)상에 로딩했고, 전기영동했다. 염료 어댑터 및 길이면에서 0.6 Kb 이하의 cDNA 를 겔에서 절단했다. 전극을 바꾸었고, 녹은 아가로스를 웰을 채우기 위해 첨가했고, 완충액을 바꾸었고, cDNA 를 래인 시작 근처까지 농축될 때까지 전기천공했다. 농축된 cDNA 를 포함하는 겔 영역을 절단했고, 마이크로퓨즈 튜브에 놓았고, 아가로스를 65 ℃ 에서 15 분동안 가열시켜서 녹였다. 샘플을 45 ℃ 까지 평형화한 다음에, 2 ㎕ 의 1U/l 베타-아가로스 I (Biolabs, Inc.)을 첨가했고, 아가로스를 절단하기 위해서 혼합물을 45 ℃ 에서 90 분동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후에, 3 M Na 아세테이트의 1 1/10 부피를 샘플에 첨가했고, 혼합물을 15 분동안 아이스상에서 인큐베이션했다. 비분해 아가로스를 제거하기 위해서, 샘플을 실온에서 15 분동안 14,000 xg 으로 원심분리했다. cDNA 를 에탄올 침전했고, 70 % 에탄올로 세척했고, 공기-건조했고, 40 ㎕ 물에서 재현탁했다.

벡터에 대한 cDNA 의 최대 비율을 결정하기 위해서, 몇 개의 리게이션을 모았고, 전기천공했다. 요약하면, 2 ㎕ 의 5 X T4 리가제 완충액 (Life Technologies), 1 ㎕ 의 10mM ATP,EcoR1-Xho1으로 절단된 1㎕ pZP7NX, 0.25 u/㎕ (Life Technologies) 물로 희석된 1 ㎕ T4 DNA 리가제 및 10 ㎕ 및 0.5, 1.2 또는 3 ㎕ 의 cDNA 를 4 개의 분리된 리게이션로 혼합했고, 22 ℃ 에서 4 시간, 68 ℃ 에서 20 분동안 인큐베이션했고, 나트륨 아세테이트-에탄올 침전했고, 세척했고, 건조했고, 10 ㎕ 에서 재현탁했다. 각 리게이션의 1 ㎕ 를 0.1 cm 큐벳(Biorad) 및 Genepulser, pulse controller^TM (Biorad)셋을 사용하여 40 ㎕ DHlOb ElectroMax^TM 일렉트로컴피턴트 박테리아 (Life Technologies)에 2.5KV, 251F, 200 Ω 으로 전기천공했다. 이 세포를 즉시 1 ml. SOC 육즙 (Manniatis, et al. 상기 참조) 에 이어서, 보존제로서 500㎕ 의 50% 글리세롤-SOC 에서 재현탁했다. "글리세롤-스톡"을 -70 ℃ 에서 몇개의 알리쿼트로 동결시켰다. 각각의 알리쿼트를 녹였고, 100 μg/ml 의 암피실린으로 보충된 LB-한천상에서 연속적으로 플레이팅했다. 콜로니 수는 pZP7NX 벡터에 대한 CD3+cDNA 의 최대 비율이 1 ㎕ 내지 45 ng 라는 것을 나타냈고; 이러한 리게이션은 4.5 밀리언 제 1 차 클론을 산출한다.

BaF3-zalpha11 기초 증식 분석법(실시예 5)을 사용하여 라이브러리를 스크리닝하는 경우에, 상기로부터 글리세롤 스톡을 깊은 웰 마이크로티터 평판에서 풀당 100 또는 250 클론의 액체 배양물로 희석하였고, 진탕하여 37 ℃ 에서 24 시간동안 배양하였고, 플라스미드를 제조자의 지시에 따라서, Qiagen 키트를 사용하여 분리 했다. 연속적으로 이러한 DNA 를 BHK 세포에 트랜스펙션시켰고, 배지를 72 시간동안 조정하였고, 증식을 "Alamar blue" 형광 분석법(실시예 5B 및 실시예 2B) 을 사용하여 평가한 다음 72 시간동안 5K BaF3-zalpha11 세포상에서 거두었다.

분비 트랩 클로닝에 의한 라이브러리의 스크리닝 목적의 경우에, COS-7 세포를 트랜스펙션시키기 위해서 라이브러리의 복합, 증폭된 형태가 필요했다. 약 4.8 밀리언 클론을 100 μg/ml 암피실린, 10 μg/ml 메티실린으로 보충된 11015 cm LB-한천 평판에 플레이팅했다. 37 ℃ 에서 하룻밤동안 배양한 후에, 박테리아를 스크랩핑 및 펠렛에 의해 거두었다. 플라스미드 DNA를 제조자의 지시에 따라서, Nucleobond-giga^TM(Clonetech) 펠렛화 박테리아로부터 추출했다. 그 다음 플라스미드를 하기에 개시된 분비 트랩 기법(실시예 12)을 사용하여 COS-7 세포(ATCC No. CRL 1651)를 트랜스펙션시키는 데 사용했다.

실시예 7

사람의 zalpha11 리간드의 발현 클로닝

활성 사람 CD3+ 선택된 세포 라이브러리로부터 글리세롤 스톡(실시예 6)을 800 ㎕ 당 250 세포의 농도로 Super Broth II^TM (Becton Dickinson, Cockeysville, MD) + 0.1 mg/ml 암피실린(amp)에 첨가했다. E. coli 가 실온에서 24 시간동안 평형화되도록 했다. 접종시에, 400㎕ 를 LB + amp 평판에 플레이트하여 접종의 실제 적정량을 결정했다. 24 시간후에, 평판을 계수했고, 그 다음 최종농도가 1.2 ml 당 250 세포가 되도록 하기 위해서 SuperBrothII^TM + E. coli 의 최종 농도를 조정했 다. 2 l 를 3 번 접종하여 6 l 가 되게 하였다. 그 다음, 배지를 96-웰 깊은 웰 차단기(Qiagen)에 플레이팅했다. 평판은 8-채널 Q-Fill2^TM디스펜서(Genetix, Christchurch, Dorset, UK)로 했다. E. coli 를 Brunswick Scientific Innova 4900 멀티-타이어 환경 진탕기상에서 250 회전/분으로 진탕하면서, 37 ℃ 에서 하룻밤동안 배양했다. E. coli를 Beckman GS-6KR 원심분리기를 사용하여 3000 rpm 으로 용액중에서 회전시켰다. E. coli 펠렛을 -20 ℃ 까지 동결시켰고, 플라스미드 DNA 를 미니프렙하기 전에 신선하게 했다. 각 펠렛은 사람의 CD3+ 선택된 세포 라이브러리로부터 약 250 cDNA 클론을 포함한다.

그 다음, 풀의 250 cDNA 클론을 QlAprep^TM 96 Turbo 미니프렙 키트 (Qiagen)를 사용하여 미니-프렙했다. 플라스미드 DNA 를 125 ㎕ 의 TE(10 mM Tris pH 8,1 mM EDTA)를 사용하여 용리했다. 그 다음, 플라스미드 DNA 를 BHK 세포를 트랜스펙션하기 위해 사용했다.

BHK 트랜스펙션

BHK 세포를 웰당 100 ㎕ 의 부피로 웰당 12,000 세포의 밀도로 96-웰 조직 배양물 평판에 플레이팅했다. 배양물 배지는 DMEM(GibcoBRL), 5% 열-불활성 태아 소 혈청, 2 mM L-글루타민(GibcoBRL), 1X PSN (GibcoBRL), 1 mM 피루브산 나트륨(GibcoBRL)이었다.

다음날, BHK 세포를 100 ㎕ SFA 로 한 번 세척했다. SFA 는 DMEM/F 12 (Gibco/BRL), 2 mM GlutaMax^TM (Gibco/BRL), 1 mM 피루브산 나트륨, 10 Hg/ml 트랜 스페린, 5 μg/ml 인슐린, 10 g/ml 페투인, 2 Hg/ml 셀레니움, 25mM HEPES (Gibco/BRL), 100 μM 비필수 아미노산(Gibco/BRL)인 무혈청 배지이다.

DNA/Lipofectamine^TM 혼합물은 하기와 같이 제조한다: 실온에서 2.2 ㎕ Lipofectamine^TM 시약(Gibco/BRL)을 102.8 ㎕ SFA 와 결합한다; 그 다음, 약 5 ㎕ 의 플라스미드 DNA (200 ng/㎕)를 Lipofectamine^TM/SFA 에 첨가하여 DNA/Lipofectamine^TM 혼합물을 형성하고, 이것을 실온에서 30 분동안 인큐베이션한다. SFA 를 BHK 세포로부터 제거했고, 세포를 50 ㎕ 의 DNA/lipofectamine^TM 혼합물과 함께 5 % CO₂ 로 37℃ 에서 5 시간동안 인큐베이션했다. 50 ㎕ 의 DNA/Lipofectamine^TM 혼합물을 BHK 세포의 2 웰의 각각에 첨가하여 트랜스펙션이 2 개가 되게 하였다.

BHK 세포를 DNA/Lipofectamine^TM 혼합물과 5 시간동안 인큐베이션한 후에, DNA/Lipofectamine^TM 혼합물을 제거했고, 100 ㎕ 배지를 첨가했다. 세포를 하룻밤동안 인큐베이션했고, 배지를 제거했고, 100 ㎕ 배지로 교체했다. 72 시간 세포를 배양한 후에, 콘디셔닝 배지를 제거했고, 최소 20 분동안 -80 ℃ 까지 동결시켰고, 해동시켰고, 그 다음 50 ㎕ 를 실시예 2B 및 실시예 5 에 개시된 대로, zalpha11/BaF3 증식 분석법에서 분석하여, 리간드 활성을 가지는 250 클론의 풀을 확인했다.

35 개의 96-웰 평판을 단일 분석법으로 스크리닝했다. 이것을 약 250 cDNA/웰 또는 총 840,000 cDNA 를 나타냈다. 이들 중에서, 54 웰(웰 당 250 cDNA 를 나타냄)의 콘디셔닝 배지가 증식 분석법에서 양성을 나타냈다. 양성 풀로부터의 콘디셔닝 배지를 가용성 리셉터(예를 들어, 실시예 12)의 존재 및 부존재로 제 2의 분석(분비 트랩)으로 재-시험했다. Zalpha11CEE 수용서 리셉터(실시예 10A) 는 최종 농도 약 1 μg/ml 로 사용되었다. 모든 54 개의 양성 풀의 경우에, 풀이 zalpha11 리간드의 cDNA 를 포함한다는 것을 나타내면서 모든 활성은 가용성 zalpha11 리셉터의 첨가로 필수적으로 중성화되었다. 이러한 양성 풀 중 4 개를 선택하여 분해하였고, zalpha11 리간드를 코드화하는 단일 cDNA 를 분리했다. 이것은 45C5, 46G11, 및 60A1 이었다.

이러한 4 개의 풀의 각각의 경우에, 전기천공에 의해서 1 ㎕ 의 DNA 를 ElectroMax^TM DHIOB 세포(Gibco/BRL)를 형질전환시키는데 사용했다. 형질전환체를 LB + amp (100 μg/ml) + 메티실린(lOpg/ml) 평판에 플레이트하여 단일 콜로니를 생산했다. 각 전기천공된 풀의 경우에, 960 개의 각각의 콜로니를 웰 당 1.2 ml 의 SuperBrothII^TM를 포함하는 96-웰 평판에 골라서 투입했다. 이러한 평판을 각 분해 풀에 대하여(45C5, 46G11, 40H12, 및 60AI)#1-10 으로 넘버링했다. 하룻밤동안 배양했고, 플라스미드 DNA 를 상기와 같이 미니프렙했다. 분해 평판으로부터 46G11, 40H12, 및 60A1, 플라스미드 DNA 를 상기와 같이 BHK 세포에 트랜스펙션했다.

45 C5의 경우에,"빠른 트랙" 프로토콜은 zalpha11 리간드 cDNA 의 확인을 증가시키기 위해서 사용했다. BHK 세포를 상기와 같이 분해 평판으로부터 플라스미드 DNA 로 트랜스펙션시켰고, DNA/Lipofectamine^TM 혼합물을 5 시간 인큐베이션후에 제거했고, 배양물을 5 시간후에 제거했고, 배지를 첨가했다. 트랜스펙션을 2 번 행한 후에, 배지를 트랜스펙션된 BHK 평판 중 하나로부터 24 시간 후인 다음날 거두었고, 잔여 트랜스펙션된 평판으로부터 48 시간후인 다음날 거두었다. 24 시간 콘디셔닝 배지를 본원에 개시된 증식을 사용하여 zalpha11 리간드 활성에 대해 상기와 같이 분석했다.

플라스미드 DNA 를 45C5 분해 평판 #1-4 로부터 모았고, "분비-트랩"프로토콜(하기의 실시예 12 참조)에 의해 리간드에 zalpha11 가용성 리셉터의 결합에 대해 분석했다. 8 개의 양성 클론을 총 384 서열로부터 확인했다. 증식 분석법으로부터 결과는 zalpha11 리간드의 활성을 확증했고 분비 트랩 분석법의 결과와 관련되었다. (실시예 12 참조) 동시에, 45C5 풀 분해 평판 #1-4 로부터 미니프렙된 플라스미드 DNA 를 서열결정하여 각 384 의 DNA 서열을 결정했다.

증식 및 분비 트랩 분석법으로 양성적으로 확인된 몇 개의 클론을 또한 다음의 프라이머를 사용하여 서열결정했다 : ZC14, 063 (SEQ ID NO: 28), ZC7,764a (SEQ ID NO: 38), ZC7, 764b (SEQ ID NO: 39), ZC22, 034 (SEQ ID NO: 40), and ZC22,035 (SEQ ID NO: 41). Zalpha11 리간드는 전체-길이 (SEQ ID NO: 1)였고, 그것의 해당하는 아미노산 서열은 (SEQ ID NO: 2)로 제시된다.

실시예 8

zalpha11 가용성 리셉터를 발현하는 포유류 발현 벡터의 제조: zalpha11CEE, zalpha11CFLG, zalpha11 CHIS 및 zalpha11-Fc4

A. zalpha11CEE, zalpha11CFLG 및 zalpha11CHIS 를 포함하는 zalpha11 포유류 발현 벡터 구성물

발현 벡터를 zalpha11 폴리펩티드, pC4zalphalICEE 의 가용성, 세포외 도메인의 발현을 위해 준비했고, 여기에서 구성물은 미리지정된 개시 메티오닌을 포함하고, 미리예정된 트랜스멤브레인 도메인에 인접하여 절단되고, C-말단 Glu-Glu 태그(SEQ ID NO:29)를 가진 zalpha11 폴리펩티드를 발현하도록 설계된다.

700bp PCR 생성 zalpha11 DNA 단편을 Asp718 및 BamHI 을 첨가하기 위해서 PCR 프라이머로서 ZC19,931 (SEQ ID NO: 30) 및 ZC19,932 (SEQ ID NO: 31)을 사용하여 제조했다. zalpha11 리셉터 cDNA (SEQ ID NO: 7)을 포함하는 플라스미드를 템플레이트로 사용했다. zalpha11 단편의 PCR 증폭은 하기와 같이 행했다: 94℃에서 0.5 분동안 25 사이클; 94 ℃ 에서 10 초동안 5 사이클, 50 ℃ 에서 30 초동안, 68 ℃ 에서 45 초, 다음에 4 ℃ 에서 유지. 반응을 클로로포롬/페놀 추출물 및 이소프로판올 침전으로 정제했고, 제조자의 프로토콜에 따라서 Asp718 및 BamH1 (Gibco BRL) 로 분해했다. 예견되는 밴드 크기,700 bp 가 1 % 아가로스 겔 전기영동으로 가시화, 배제되었고, DNA 는 제조자의 지시에 따라서 QiaexII^TM 정제 시스템 (Qiagen)을 사용하여 정제되었다.

배제된 DNA 를 BamHI 및 As718 로 잘려진 플라스미드 pC4EE 에 서브클론했다. pC4zalpha11 CEE 발현 벡터는 천연 zalpha11 신호 펩티드를 사용하고 zalpha11 폴리펩티드-코드화 폴리뉴클레오티드 서열의 세포외 부분의 C-말단 부분에 Glu-Glu 태그 (SEQ ID NO: 29)를 부착한다. 플라스미드 pC4EE 은 마우스 메탈로티오나인-1 프로모터, 코드 서열, 스탑 코돈 및 사람의 성장 호르몬 터미네이터의 삽입을 위한 다중 제한 부위를 가지는 발현 카세트를 포함하는 포유류 발현 벡터이다. 플라스미드는 또한 E. coli 복제 기점, SV40 프로모터, 인핸서 및 복제기점, DHFR 유전자 및 SV40 터미네이터를 가지는 포유류 선택 마아커 발현 단위를 가진다.

약 30 ng 의 제한 분해 zalpha11 삽입체 및 약 12 ng 분해 벡터를 하룻밤동안 16 ℃ 에서 리게이션했다. 1 ㎕ 의 각 리게이션 반응을 제조자의 지시에 따라서, DH10B 컴피턴트 세포(GIBCO BRL,Gaithersburg, MD)에 독립적으로 전기천공했고, 50 mg/ml 암피실린을 포함하는 LB 평판에 플레이팅했고, 하룻밤동안 인큐베이션했다. 콜로니를 각 콜로니의 2 ml 액체 배양물로부터 준비된 DNA 의 제한 분석으로 스크리닝했다. 양성 클론의 삽입체 서열을 서열 분석에 의해 증명했다. 대량 플라스미드 준비를 제조자의 지시에 따라서, QIAGENO

Maxi prep 키트 (Qiagen)를 사용하여 행했다.

같은 과정을 일렬의 6 His 잔기 ; 및 C-말단 플래그(SEQ ID NO: 37)태그, zalpha11CFLAG 로 구성되는 C-말단 his 태그를 가진 zalpha11 가용성 리셉터를 준비하기 위해 사용했다. 구성물을 제조하기 위해서, 상기 언급된 벡터는 glu-glu 태그(SEQ ID NO: 29)대신에 HIS 또는 FLAG

표지를 가진다.

B. 가용성 zalpha11 리셉터 zalpha11-Fc4 의 포유류 발현 구성물

폴리뉴클레오티드 코드화 zalpha11 의 전체 또는 부분을 포함하는 발현 플라스미드를 동형재조합으로 제조했다. zalpha11 리셉터의 세포외 도메인을 Fc 리셉터에 더이상 결합하지 않도록 하기 위한 돌연변이를 포함하는 "Fc4" (SEQ ID N0 : 33)로 명명된 사람의 IgG 로부터 유도된 Fc 영역에 융합했다. zalpha11 cDNA 의 단편을 zalpha11 리셉터의 세포외 도메인으로부터 폴리뉴클레오티드를 포함하는 PCR 을 사용하여 분리했다. zalpha11 단편의 제조에 사용된 2 개의 프라이머는: (1)각각 5' 에서 3' 말단을 포함하는 PCR 용 프라이머: 벡터 양측말단에 위치한 서열의 40 bp40(삽입체의 5') 및 zalpha11 세포외 도메인(SEQ ID NO: 32)의 5'말단에 해당하는 17 bp; 및 (2) Fc4 폴리뉴클레오티드 서열(SEQ ID N0 : 33)의 5' 말단의 40 bp 및 zalpha11 세포외 도메인(SEQ ID NO: 34)의 3' 말단에 해당하는 17 bp 였다. zalpha11 을 가진 Fc-4 의 단편을 유사한 방식으로 PCR 로 제조했다. Fc4 단편의 생산에 사용된 2 개의 프라이머는 (1) zalpha11 세포외 도메인의 3' 말단으로부터 40 bp 서열 및 Fc4 (SEQ ID NO: 35)의 5' 말단의 17 bp 로 구성되는 5' 프라이머; 및 (2) 벡터 서열(삽입체의 3')의 40 bp 및 Fc4(SEQ ID NO:36)의 3'말단의 17bp 로 구성되는 3' 프라이머였다.

상기에 개시된 각 반응의 PCR 증폭을 하기와 같이 수행했다: 94℃에서 2 분동안 1 사이클; 94 ℃ 에서 30 초동안 25 사이클, 60 ℃ 에서 30 초동안, 72 ℃ 에서 1 분, 72 ℃ 에서 5 분동안 1 사이클, 다음에 4 ℃ 에서 유지. 100 ㎕ PCR 반응의 10 ㎕를 분석을 위해서 1 x TBE 완충액으로 0.8 % LMP 아가로스 겔 (Seaplaque GTG)상에 전개시켰다. PCR 반응의 잔여 90 ㎕ 를 5 ㎕ M NaCl 및 250 ㎕ 의 완전 에탄올의 첨가로 침전했다. 사용된 발현 벡터는 pZP9 (ATCC Deposit No. 98668)로부터 유도된 플라스미드 pCZR199 로부터 유도되었고, SmaI(BRL)으로 잘려졌다. 발현 벡터는 플라스미드 pCZR199 로부터 유도되었고, CMV 급성 초기 프로모터, 마우스 면역글루블린 중쇄 위치의 가변 영역의 공통 인트론, 코드 서열, 중지 코돈 및 사람의 성장 호르몬 터미네이터의 삽입을 위한 다중 제한 부위를 가지는 발현 카세트를 포함하는 포유류 발현 벡터이다. 발현벡터는 E. coli 복제기점, SV40 프로모터, 인핸서 및 복제 기점, DHFR 유전자 및 SV40 터미네이터를 가지는 포유류 선택 마아커 발현 단위를 가진다. 사용된 발현 벡터는 CMV 급성 초기 프로모터로 메탈로티오나인 프로모터의 대체에 의해서 pCZRl99 로부터 제조되었다.

100 ㎕ 의 컴피턴트 효모 세포 (S. cerevisiae)를 약 1μg 사람 zalpha11과 Fc4 삽입체 및 100 ng 의 SmaI (BRL)절단 발현 벡터를 함유하는 10 ㎕ 혼합물에 배합하였고, 0.2 cm 전기천공 큐벳에 옮겼다. 효모/DNA 혼합물을 0.75 kV (5 kV/cm), "무제한" Ω, 25 μF 에서 전기펄스를 가하였다. 각 큐벳에 600 ㎕ 의 1.2 M 솔비톨이 첨가되고, 효모를 2 개의 URA-D 평판에 2 개의 300 ㎕ 로 플레이팅했고, 30 ℃ 에서 인큐베이션했다.

약 48 시간 후에, 단일 평판으로부터 Ura+ 효모 형질전환체를 1 ml H₂O 에서 재현탁했고, 효모 세포를 펠렛하기 위해 단기간 회전시켰다. 세포 펠렛을 1 ml 의 용균 완충액에 재현탁했다. (2% Triton X-100.1% SDS. 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8.0,1 mM EDTA). 500 ㎕ 의 용균 혼합물을 300 ㎕ 산 세척 유리 비드 및 200 ㎕ 의 페놀-플로로폼을 포함하는 Eppendorf 튜브에 첨가했고, 1 분간격으로 2 번 또는 3 번 와동시킨 다음에 최대속도로 Eppendorf 원심분리기에서 5 분 회전했다. 300 ㎕ 의 수성상을 신선한 튜브에 옮겼고, DNA 를 600 ㎕ 에탄올(EtOH) 로 침전시켰고, 4 ℃ 에서 10 분동안 원심분리했다. DNA 펠렛을 100 ㎕ H₂O 에서 재현탁했다.

일렉트로컴피턴트 E. coli 세포의 형질전환체는(DH10B, GibcoBRL) 0.5-2 ml 효모 DNA 준비 및 40 ㎕ 의 DH1OB 세포로 행했다. 세포를 2.0 kV, 25 mF and 400 Ω 으로 전기펄스를 가하였다. 전기천공다음, 1 ml SOC (2% BactoT^TM Tryptone (Difco, Detroit, MI), 0.5% 효모 추출물(Difco), 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄, 20 mM 글루코스)를 4 개의 LB AMP 평판에 250 ㎕ 알리쿼트로 플레이팅했다(LB 육즙 (Lennox), 1.8% Bacto 한천 (Difco), 100 mg/L Ampicillin).

zalpha11-Fc4 에 대한 올바른 발현 구성물을 포함하는 각각의 클론을 zalpha11-Fc4 의 존재를 확인하고, 다양한 DNA 서열이 서로 올바르게 리게이션되었는지를 확증하기 위해서 제한 분해로 동정했다. 양성 클론의 삽입은 서열 분석에 놓이기 쉽다. 더 큰 플라스미드 DNA 는 제조자의 지시에 따라서, Qiagen Maxi 키트 (Qiagen)을 사용하여 분리한다.

실시예 9

zalpha11 가용성 리셉터 폴리펩티드의 트랜스펙션 및 발현

A. 가용성 zalpha11 리셉터 zalpha11CEE, zalpha11CFLG, and zalpha11CHIS 의 포유류 발현

BHK 570 세포 (ATCC No. CRL-10314), 패시지 27 을 800 ㎕ 의 무혈청 (SF) DMEM 배지 (DMEM, Gibco/BRL High Glucose) (Gibco BRL, Gaithersburg, MD)로 1.2 X10⁶ 세포/웰(6-웰 평판)에 놓았다. 세포를 상기에 개시된(실시예 8 참조)zalpha11CEE, zalpha11CFLG, 또는 zalpha11 CHIS 를 포함하는 발현 플라스미드로 무혈청(SF) DMEM 에서 Lipofectin^TM (Gibco BRL)으로 트랜스펙션시켰다. 3 μg 의 zalpha11CEE, zalpha11CFLG, 또는 zalpha11CHIS 각각을 개별적으로 1.5 ml 튜브로 희석하여 총 최종 부피 100㎕ SF DMEM 이 되게하였다. 개별적인 튜브에서, 15 ㎕ 의 Lipofectin^TM (Gibco BRL) 을 100 ㎕ 의 SF DMEM 과 혼합했다. Lipofectin^TM 혼합물을 30-45 분동안 실내 온도에서 인큐베이션했고, 그 다음 DNA 혼합물을 첨가했고, 실온에서 약 10-15 분 인큐베이션하도록 허용했다.

전체 DNA: Lipofectin^TM 혼합물을 플레이팅된 세포에 첨가했고, 그위에 고르게 분배했다. 세포를 약 5 시간동안 37 ℃ 에서 인큐베이션했고, 다음에 최종 부피 30 ml DMEM/5% 태아 소 혈청(FBS)(Hyclone, Logan, UT)으로 별도의 150 mm MAXI 평판에 옮겼다. 평판을 하룻밤동안 37 ℃, 5% CO₂에서 인큐베이션했고, DNA: Lipofectin^TM 혼합물을 다음날 선택 배지(5% FBS/DMEM with 1 pM 메토트렉세이트 (MTX)) 로 교체했다.

약 10-12 일 트랜스펙션한 후에, 평판을 10 ml SF DMEM 으로 세척했다. 세척 배지를 흡출했고, 7.25 ml 무혈청 DMEM 으로 세척했다. SF DMEM 에 예비-침액된 무균 Teflon 메쉬 (Spectrum Medical Industries, Los Angles,CA) 를 클론 세포 콜로니에 놓았다. 다음에, SF DMEM에 예비-침액된 무균 니트로셀룰로스 여과기를 메쉬에 놓았다. 니트로셀룰로스상의 방향 마아커는 배양물 디쉬에 옮겼다. 그 다음 평판을 37 ℃, 5% CO₂인큐베이터에서 5-6 시간동안 인큐베이션했다.

인큐베이션 후에, 여과기/메쉬를 제거했고, 배지를 흡출했고, IμM MTX 를 가진 5 % FBS/DMEM 으로 대체했다. 그 다음, 여과기를 진탕 쉐이커상에서 실온로 15 분동안 10% 비지방 건조 우유/웨스턴 A 완충액(Western A: 50mM Tris pH 7.4.5 mM EDTA, 0.05% NP-40,150 mM NaCl and 0.25% gelatin)으로 차단했다. 그 다음, 여과기를 진탕 쉐이커상에서 실온로 1 시간동안 2.5% 비지방 건조 우유/웨스턴 A 완충액으로 각각 항-Glu-Glu, 항-FLAG

, 또는 항-HIS 항체-HRP 결합체와 함께 인큐베이션했다. 그 다음 여과기를 실온에서 세척당 5-10 분동안 웨스턴 A 로 3 번 세척했다. 여과기를 제조자의 지시에 따라서, 울트라 ECL 시약(Amersham Corp., Arlington Heights, IL)으로 현상했고, Lumi-Imager (Roche Corp.)상에서 가시화했다.

양성 발현 클론 콜로니를 기계적으로 15μM MTX 를 가진 1 ml 의 5% FCS/DMEM 으로 12-웰 평판에 골라냈고, 그 다음 배양시켜서 합류하도록 했다. 그 다음 콘디셔닝 배지를 SDS-PAGE 에 및 웨스턴 분석에 의한 발현 수준에 대해 시험했다. 각 구성물의 3 개의 가장 놓은 발현 클론을 골라냈고; 3 개중 2 개를 백업을 위해 동결시켰고, 1 개를 미코플라스마 시험 및 대규모 팩토리 시딩으로 확장시켰다.

B. 가용성 zalpha11 리셉터 zalpha11-Fc4 의 포유류 발현

BHK 570 세포(ATCC NO: CRL-10314)를 10cm 조직 배양 디쉬에 플레이팅했고, DMEM/FBS 배지(DMEM, Gibco/BRL High Glucose, (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 태아 소 혈청(Hyclone, Logan, UT), 1mM L-글루타민 (JRH Biosciences, Lenexa, KS), 1mM 피루브산 나트륨(Gibco BRL))에서, 37 ℃, 5% CO₂ 로 하룻밤동안 50 내지 70 % 합류점으로 배양되도록 허용했다. 그 다음 세포를 무혈청(SF) 배지 조성물(DMEM, 10 mg/ml 트랜스페린, 5 mg/ml 인슐린, 2 mg/ml 페투인, 1% L-글루타민 및 1% 피루브산 나트륨)에서 Lipofectamine^TM (Gibco BRL)을 사용하여 zalpha11-Fc4 (실시예 8 참조)를 포함하는 플라스미드로 트랜스펙션시켰다. Zalphal I-Fc4 를 포함하는 플라스미드를 SF 배지로 총 부피 640 ml 가 되도록 15 ml 튜브에 희석시켰다. 35 ml 의 Lipofectamine^TM (Gibco BRL) 을 605 ML 의 SF 배지와 혼합했다. Lipofectamine^TM 혼합물을 DNA 혼합물에 첨가했고, 실온에서 약 30 분동안 인큐베이션했다. 5 ml 의 SF 배지를 DNA: Lipofectamine^TM 혼합물에 첨가했다. 세포를 5 ml 의 SF 배지로 한 번 린스했고, 흡출했고, DNA: Lipofectamine^TM 혼합물을 첨가했다. 세포를 5 시간동안 37 ℃ 에서 인큐베이션했고, 그 다음 6.4 ml 의 DMEM/10% FBS, 1% PSN 배지를 각 평판에 첨가했다. 평판을 37 ℃ 에서 하룻밤동안 인큐베이션했고, 다음날 DNA: Lipofectamine^TM 혼합물을 5% FBS/DMEM 배지로 교체했다. 트랜스펙션 후 2 일에, 세포를 1:10, 1:20 및 1:50 으로 150 mm 평판에서 선택배지로(DMEM/FBS media from above with the addition of l HM methotrexate (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.)) 쪼개었다. 세포상의 배지를 트랜스펙션 후 5 일에서 신선한 선택 배지로 교체했다. 트랜스펙션 후 약 10 일에서, 각 트랜스펙션으로부터 메토트렉세이트 내성 콜로니의 2 개의 150 mm 배양물 디쉬를 트립신처리하였고, 세포를 모았고, T-162 플라스크에 플레이팅했고, 대규모 배양물에 옮겼다.

실시예 10

BHK 570 세포로부터 zalpha11 가용성 리셉터의 정제

A. BHK 570 으로부터 zalpha11CEE 폴리펩티드의 정제

다른 언급이 없다면, 모든 작업은 4 ℃ 에서 수행했다. 다음의 과정은 C-말단 GluGlu(EE) 표지를 포함하는 zalpha11 폴리펩티드를 정제하기 위해서 사용했다. 30 l 의 세포 팩토리 콘디셔닝 배지는 ProFlux A30 상의 Amicon Slow3 나선형 카트리지로 1.6 l 로 농축시켰다. 프로테아제 억제 용액을 트랜스펙션된 BHK 570 세포로부터(실시예 9 참조) 농축된 1.6 l 의 세포 팩토리 콘디셔닝 배지에 첨가하여, 최종 농도 2.5 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA, Sigma Chemical Co. St. Louis, MO), 0.003 mM 루펩틴 (Boehringer-Mannheimt Indianapolis, IN), 0.001 mM 펩스타틴 (Boehringer-Mannheim) 및 0.4 mM Pefabloc (Boehringer-Mannheim)가 되게 하였다.분석을 위해 샘플을 제거했고, 정제 개시전에 벌크 부피를 -80 ℃ 까지 동결시켰다. 농축된 세포 팩토리 콘디셔닝 배지의 총 표적 단백질 농도는 항-EE HRP 결합 항체를 가지고 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석으로 결정했다.

항-EE G-세팔로스(하기에 개시된 대로 준비)의 100 ml 컬럼을 Waters AP-5,5 cm x 10 cm 글래스 컬럼에 부었다. 컬럼을 유동 팩했고, BioCad Sprint (PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) 상에서 포스페이트 완충 식염수(PBS) pH 7.4 로 평형화했다. 농축된 세포 팩토리 콘디셔닝 배지를 녹였고, 0.2 마이크론 무균 여과했고, pH 를 7.4 로 조정한 다음, 컬럼을 1 ml/분 유동율로 하룻밤동안 컬럼상에 로딩했다. 컬럼을 10 컬럼 부피(CV)의 포스페이트 완충 식염수(PBS, pH 7.4)로 세척했고, 5ml/분으로 0.5 mg/ml EE 펩티드 (Anaspec, San Jose, CA)를 포함하는 200 ml 의 PBS 로 플러그 추출했다. 사용된 EE 펩티드는 서열 EYMPME (SEQ ID NO: 29)를 가졌다.컬럼을 PBS 로 10 CV 에서 세척한 다음, 0.2 M 글리신, pH 3.0 의 5 CV 로 추출했다. 글리신-추출 컬럼의 pH 는 5 X PBS 의 2 CV 로 7.0 으로 조정했다. 5 ml 분획을 전 용리 크로마토그래피 과정에서 수집하여 280 및 215 nM 에서 흡광도를 모니터했다; 통과 및 세척 풀을 또한 저장했고 분석했다. EE-폴리펩티드 용리 피크 분획을 항-EE HRP 결합 항체를 가진 SDS-PAGE Silver 염색 및 웨스턴 블롯으로 표적 단백질에 대해 분석했다. 관심의 폴리펩티드 용리 분획을 모았고,제조자의 지시에 따라서, 10,000 달톤 분자량 컷오프 멤브레인 스핀 농축기(Millipore, Bedford, MA)를 사용하여 60 ml 내지 5.0 ml 까지 농축했다.

다른 공-정제 단백질로부터 zalpha11CEE 를 분리하기 위해서, 농축 폴리펩티드 용리 모인 분획을 pH 8.0 에서 POROS HQ-50 (strong anion exchange resin from PerSeptive BioSystems, Framingham, MA)에 놓았다. 1.0 x 6.0 cm 컬럼을 부었고, BioCad Sprint 상에서 유동 팩했다. 컬럼을 짝이온으로 하전되었고, 그 다음 20 mM TRIS pH 8.0 (Tris (Hydroxymethyl Aminomethane))으로 평형화했다. 샘플을 1:13 (PBS 의 이온강도 감소 목적)으로 희석시킨 다음 5 ml/분으로 Poros HQ 컬럼에 로딩했다. 컬럼을 20 mM TRIS pH 8.0 을 가진 10 CV 에서 세척한 다음 10 ml/분에서 40 CV 구배의 20 mM Tris/1 M 염화 나트륨 (NaCl)으로 추출했다. 1.5 ml 분획을 전 크로마토그래피 과정에서 수집하여 280 및 215 nM 에서 흡광도를 모니터했다. 용리 피크 분획을 SDS-PAGE Silver 염색법으로 분석했다. 관심의 분획을 모았고, 제조자의 지시에 따라서 10,000 달톤 분자량 컷오프 멤브레인 스핀 농축기(Millipore, Bedford, MA)를 사용하여 1.5 내지 2 ml 로 농축했다.

무EE 펩티드 및 다른 염색 공-정제 단백질로부터 zalpha11CEE 폴리펩티드를 분리하기 위해서, 모여진 농축 분획을 1.5 X 90 cm Sephadex S200 (Pharmacia, Piscataway, NJ)상에서 크로마토그래피에 놓았고, 컬럼을 평형화했고, BioCad Sprint 를 사용하여 1.0 ml/분의 유동율로 PBS 에 로딩했다. 1.5 ml 분획을 전 크로마토그래피 과정에서 수집하여 280 및 215 nM 에서 흡광도를 모니터했다. 피크 분획을 SDS-PAGE Silver 염색법으로 특이화했고, 가장 순수한 분획만을 모았다. 이 물질은 정제된 zalpha11 CEE 폴리펩티드를 나타냈다.

정제된 물질을 어떤 잔여 엔도톡신을 제거하기 위해서 최종적으로 4 ml ActiClean Etox (Sterogene) 컬럼에 놓았다. 샘플을 PBS 평형 중력 컬럼을 통해 4 번 통과시킨 다음 컬럼을 "클린"샘플로 모여진 단일 3ml 부피의 PBS 로 세척했다. 그 다음, 물질은 0.2 마이크론 여과되었고, 알리쿼트전까지 -80 ℃에서 저장되었다.

Coomassie Blue 및 Silver 염색된 SDS-PAGE 겔의 웨스턴 블롯에서, zalpha11CEE 폴리펩티드는 약 50,000 달톤의 거대 분자량의 주요한 밴드였다. 이 밴드의 유동성은 감소 및 비-감소 겔상에서와 같다.

정제된 물질의 단백질 농도는 표준 과정에 따라서, BCA 분석법(Pierce, Rockford, IL)에 의해 수행했고, 단백질을 알리쿼트했고, -80 ℃에서 저장했다. IEF(등전 포커싱)겔상에서 단백질을 4.5 미만의 PI 와 함께 런한다. zalpha11 CEE 폴리펩티드의 농도는 1.0 mg/ml 였다.

항-EE 세파로스를 제조하기 위해서, 단백질 G-세파로스(Pharmacia, Piscataway, NJ)의 100 ml 베드 부피를 500 ml Nalgene 0.45 마이크론 여과 단위를 사용하여 0.02 % 나트륨 아지드를 포함하는 100 ml 의 PBS 로 3 번 세척했다. 겔을 6.0 부피의 200 mM 트리에탄올아민, pH 8.2 (TEA, Sigma, St.Louis, MO)로 세척했고, 900 mg 의 항체를 포함하는 같은 부피의 EE 항체 용액을 첨가했다. 4 ℃ 에서 하룻밤동안 인큐베이션후에, 비결합 항체를 상기에 개시된 대로 5 부피의 200 mM TEA 를 가진 수지로 세척했다. 수지를 2 부피의 TEA 로 재현탁했고, 적당한 컨테이너에 옮겼고, TEA 에서 용해된 디메틸피밀리미데이트-2HCl(Pierce, Rockford, IL)을 최종 농도 36 mg/ml 의 단백질 G-세파로스 겔에 첨가했다. 겔을 45 분동안 실온에서 락했고, 액체를 상기에 개시된 대로 여과 단위를 사용하여 제거했다. 그 다음, 겔상의 비특이적 부위를 200 mM TEA 의 5 부피의 20 mM 에탄올아민으로 실온에 서 10 분동안 인큐베이션하여 차단했다. 그 다음, 겔을 0.02 % 나트륨 아지드를 포함하는 5 부피의 PBS 로 세척했고, 이 용액에 저장했다.

B. BHK 570 으로부터 zalpha11 CFLAG 폴리펩티드의 정제

다른 언급이 없다면, 모든 작업은 4 ℃ 에서 수행했다. 다음의 과정은 C-말단 FLAG

(FLG)(Sigma-Aldrich Co.) 표지를 포함하는 zalpha11 폴리펩티드를 정제하기 위해서 사용했다. 30 l 의 세포 팩토리 콘디셔닝 배지는 ProFlux A30 상의 Amicon Slow3 나선형 카트리지로 1.7 l 로 농축시켰다. 프로테아제 억제 용액을 트랜스펙션된 BHK 570 세포로부터(실시예 9 참조) 1.7 l 의 농축된 세포 팩토리 콘디셔닝 배지에 첨가하여, 최종 농도 2.5 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA, Sigma Chemical Co. St. Louis, MO), 0.003 mM 루펩틴 (Boehringer-Mannheimt Indianapolis, IN), 0.001 mM 펩스타틴 (Boehringer-Mannheim) 및 0.4 mM Pefabloc (Boehringer-Mannheim)가 되게 하였다. 분석을 위해 샘플을 제거했고, 정제 개시전에 벌크 부피를 -80 ℃ 까지 동결시켰다. 세포 팩토리 콘디셔닝 배지의 총 표적 단백질 농도는 항-FLAG

(Kodak)HRP 결합 항체를 가지고 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석으로 결정했다. 125 ml 컬럼의 항-FLAG

M2-아가로스 친화성 겔(Sigma-Aldrich Co.)를 Waters AP-5,5 cm x 10 cm 글래스 컬럼에 부었다. 컬럼을 유동 팩했고, BioCad Sprint (PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) 상에서 포스페이트 완충 식염수(PBS) pH 7.4 로 평형화했다. 농축된 세포 팩토리 콘디셔닝 배지를 녹였고, 0.2 마이크론 무균 여과했고, pH 를 7.4 로 조정한 다음, 컬럼을 1 ml/분 유 동율로 하룻밤동안 컬럼상에 로딩했다. 컬럼을 10 컬럼 부피(CV)의 포스페이트 완충 식염수(PBS, pH 7.4)로 세척했고, 5ml/분으로 0.5 mg/ml FLAG

(Sigma-Aldrich Co) 펩티드를 포함하는 250 ml 의 PBS 로 플러그 추출했다. 사용된 FLAG

펩티드는 서열 DYKDDDDK (SEQ ID NO: 37)를 가졌다.컬럼을 PBS 로 10 CV 에서 세척한 다음, 0.2 M 글리신, pH 3.0 의 5 CV 로 추출했다. 글리신-추출 컬럼의 pH 는 5 X PBS 의 2 CV 로 7.0 으로 조정한 다음, PBS(pH 7.4 )에서 평형화했다. 5 ml 분획을 전 용리 크로마토그래피 과정에서 수집하여 280 및 215 nM 에서 흡광도를 모니터했다; 통과 및 세척 풀을 또한 저장했고 분석했다. FLAG

-폴피펩티드 용리 피크 분획을 항-FLAG HRP 결합 항체를 가지고 SDS-PAGE Silver 염색법과 웨스턴 블롯으로 표적 단백질에 대해 분석했다. 관심의 폴리펩티드 용리 분획을 모았고, 제조자의 지시에 따라서 10,000 달톤 분자량 컷오프 멤브레인 스핀 농축기 (Millipore, Bedford, MA)를 사용하여 80 ml 내지 12 ml 로 농축했다.

다른 공-정제 단백질로부터 zalpha11CEE 폴리펩티드를 분리하기 위해서, 폴리펩티드 추출 모인 분획을 pH 8.0 에서, POROS HQ-50(PerSeptive BioSystems, Framingham, MA의 강한 음이온 교환 수지)에 놓았다. 1.0 X 6.0 cm 컬럼을 부었고, BioCad Sprint 상에서 유동 팩했다. 컬럼을 컬럼을 짝이온으로 하전되었고, 그 다음 20 mM TRIS pH 8.0 (트리스(히드록시메틸 아미노메탄))으로 평형화했다. 샘플을 1:13 (PBS 의 이온강도 감소 목적)으로 희석시킨 다음 5 ml/분으로 Poros HQ 컬럼에 로딩했다. 컬럼을 20 mM TRIS pH 8.0 을 가진 10 CV 에서 세척한 다음 10 ml/분 에서 40 CV 구배의 20 mM Tris/1 M 염화 나트륨 (NaCl)으로 추출했다. 1.5 ml 분획을 전 크로마토그래피 과정에서 수집하여 280 및 215 nM 에서 흡광도를 모니터했다. 용리 피크 분획을 SDS-PAGE Silver 염색법으로 분석했다. 관심의 분획을 모았고, 제조자의 지시에 따라서 10,000 달톤 분자량 컷오프 멤브레인 스핀 농축기(Millipore, Bedford, MA)를 사용하여 1.5 내지 2 ml 로 농축했다.

zalpha11 CFLG 폴리펩티드를 무 FLAG

펩티드 및 어떤 염색 공-정제 단백질로부터 분리하기 위해서, 모인 농축 분획을 1.5 X 90 cm Sephacryl S200 (Pharmacia, Piscataway, NJ)상에서 크로마토그래피에 놓았고, 컬럼을 평형화했고, BioCad Sprint 를 사용하여 1.0 ml/분의 유동율로 PBS 에 로딩했다. 1.5 ml 분획을 전 크로마토그래피 과정에서 수집하여 280 및 215 nM 에서 흡광도를 모니터했다. 피크 분획을 SDS-PAGE Silver 염색법으로 특이화했고, 가장 순수한 분획만을 모았다. 이 물질은 정제된 zalpha11 CEE 폴리펩티드를 나타냈다.

정제된 물질의 단백질 농도는 BCA 분석법(Pierce, Rockford, IL)에 의해 수행했고, 단백질을 알리쿼트했고, -80 ℃에서 저장했다. IEF(등전 포커싱)겔상에서 단백질을 4.5 미만의 PI 와 함께 런한다. zalpha11 CEE 폴리펩티드의 농도는 1.0 mg/ml 였다.

C. 트랜스펙션된 BHK 570 세포로부터 zalpha11-Fc4 폴리펩티드의 정제

다른 언급이 없다면, 모든 작업은 4 ℃ 에서 수행했다. 다음의 과정은 사람의 IgG/Fc (zalpha11-Fc4; 실시예 8 및 9)와 C-말단 융합을 포함하는 zalpha11 폴리펩티드 정제에 사용되었다. Zalpha11-Fc4 로 트랜스팩션된 BHK 570 세포로부터 12,000 ml 의 콘디셔닝 배지를 1.2 mm 무균 여과기를 통해 여과했고, 그 다음 프로테아제 억제제 용액으로 보충하여 최종 농도 0.001 mM 류펩틴(Boerhinger Mannheim, Indianapolis, IN), 0.001 mM 펩스타틴 (Boerhinger-Mannheim) 및 0.4 mM Pefabloc (Boerhinger-Mannheim)이 되게 하였다. 단백질 G 세파로스 (6 ml bed volume, Pharmacia Biotech)를 팩했고, 500 ml PBS (Gibco/BRL)로 세척했다. 보충 콘디셔닝 배지를 유동율 10 ml/분의 유동율로 컬럼상에서 통과시켰고, 그 다음 1000 ml PBS(BRL/Gibco) 로 세척하였다. zalpha11-Fc4 를 0.1M 글리신 pH 3.5 로 컬럼으로부터 추출했고, 2 ml 분획을 직접 0.2 ml 2M Tris pH 8.0 으로 수집하여 분획의 최종 pH 가 7.0 이 되게 조정했다.

용리 분획을 항-사람 Fc(Amersham) 항체와 함께 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯으로 특징화했다. 웨스턴 블롯 분석의 감소하는 SDS-PAGE 겔은 분획 2- 10 에서 약 80,000 KDa 의 면역반응 단백질을 나타낸다. Silver 염색 SDS-PAGE 겔은 또한 80,000 KDa zalpall: Fc 폴리펩티드를 밝혀냈다. 분획 2-10 을 모았다.

모여진 분획의 단백질 농도를 BCA 분석(Pierce, Rockford, IL)에 의해 수행되었고, 물질을 앨러쿼트했고, 표준 과정에 따라서 -80 ℃ 에서 저장했다. 모여진 분획의 농도는 0.26 mg/ml 였다.

실시예 11

경쟁적인 억제 분석법에서 zalpha11 가용성 리셉터 zalpha11CEE, zalpha11CFLG 및 zalpha11-Fc4 (돌연변이) 가용성 리셉터를 사용한 분석법

BaF3/zalpha11 세포를 회전시켰고, mIL-3 무배지에서 세척했다. 세포를 회전시켰고, mIL-3 의 제거를 확인하기 위해서 3 번 세척했다. 그 다음 세포를 헤마사이토미터로 계수했다. 세포를 mIL-3 무배지를 사용하여 웰 당 100 ㎕ 의 부피로 웰당 5000 세포로 96-웰 포맷에 플레이팅했다.

실시예 5 에 개시된 원숭이 비장 세포 활성 및 사람의 CD3+ 선택된 세포의 콘디셔닝 배지를 10 μg/ml 로 zalpha11 가용성 리셉터의 존재 또는 부재로 50%, 25%, 12.5%, 6.25%, 3.125%, 1.5%, 0.75% 및 0.375% 농도로 별도의 실험장치에 첨가했다. (CEE, C-flag, 및 Fc4 구성물; 실시예 9 및 10 참조) 총 분석 부피는 200 ㎕ 였다.

분석 평판을 Alamar Blue (Accumed)가 20 ㎕/웰로 첨가된 후 3 일 동안 37 ℃ , 5% CO₂에서 인큐베이션했다. 평판을 다시 37 ℃ , 5% CO₂에서 24 시간동안 인큐베이션했다. 평판을 실시예 2 개 개시된 대로 Fmax^TM 플레이트 리더 (Molecular Devices)상에서 해독했다. 결과는 10 μg/ml 에서 서로다른 zalpha11 가용성 리셉터 구성물 각각으로부터 세포 배양의 완전한 억제를 나타내어, 각 샘플의 인자는 zalpha11 리셉터에 특이적이라는 것을 확증했다.

가용성 리셉터를 희석한 적정 커브를 또한 상기 언급된 분석법을 사용하여 전개시켰다. Zalpha11CEE 및 zalpha11CFLG 가용성 zalpha11 리셉터 모두 20 ng/ml 와 같이 낮은 농도에서 성장을 완전하게 억제할 수 있었다. 돌연변이 zalpha11-Fc4 가용성 zalpha11 리셉터는 1.5 μg/ml 에서만 효과적이었다.

실시예 12

선택 트랩 분석법

선택 트랩 분석법을 zalpha11 리간드에 대해 cDNA 를 확인하기 위해 사용했다. 양성 DNA 풀을 실시예 7 에 개시된 발현 클로닝 결과로부터 얻었다.

DNA 풀의 250 클론을 96 웰 포맷으로 BHK 세포에 트랜스팩션했고, 콘디셔닝 배지를 실시예 4 및 실시예 5 에 개시된 BaF3/zalpha11 세포를 사용하여 증식 분석법을 실시하였다. 몇 개의 DNA 풀은 zalpha11 가용성 리셉터로 반복되었고 중성화된 양성 활성을 나타냈다 (실시예 11 참조).

하나의 양성 DNA 풀, 45C5 를 하기에 개시된 Lipofectamine^TM 방법을 사용하여 12 웰 포맷으로 COS 에 트랜스팩션했다. 그 다음, 풀 45C5 내의 zalpha11 리셉터와 zalph11 가용성 리셉터의 잠재성 리간드간의 직접적인 결합(하기 참조)을 시험하기 위해서 분비 트랩 분석법을 zalpha11 가용성 리셉터 (바이오틴화 존재 또는 부재로 표지된 C-말단 Glu-Glu; C-말단 Flag 표지;또는 Fc4 zalpha11 가용성 리셉터 융합) (실시예 9)를 사용하여 수행했다. 결과는 양성이었다. 그러므로, 풀 45C5 의 DNA 는 대장균 에 전기천공되고, 단일 콜로니를 10 96-웰 평판에 골라냈다. 평판을 37 ℃에서 24 시간동안 진탕한 다음, TomTech Quadra 9600 을 사용하여 DNA 미니프렙(QiaPrepTM 96 Turbo Miniprep Kit; Qiagen)을 96-웰 포맷에서 준비했다. 그 다음, 플라스미드 DNA 를 열 및 컬럼의 포맷으로 모았고, COS 세포에 트랜스펙션했고, 그 다음 양성 풀은 하기에 개시된 대로 분비 트랩으로 결정했다.

COS 세포 트랜스펙션

COS 세포 트랜스펙션은 하기와 같이 수행했다: 92 ul 무혈청 DMEM 배지(500 ml DMEM 에서 55mg 피루브산 나트륨, 146mg L-글루타민, 5mg 트랜스페린, 2.5mg 인슐린, lμg 셀레니움 및 5mg 페투인)에서 3 ul 풀 DNA 및 5 ul Lipofectaminc^TM 를 혼합하고, 실온에서 30 분동안 인큐베이션하고, 그 다음 400 ul 무혈청 DMEM 배지를 첨가한다. 12-웰 조직 평판상에 플레이트된 1.5x10⁵ COS 세포/웰상에 500ul 혼합물을 첨가하고 37 ℃ 에서 5 시간동안 인큐베이션한다. 500ul 20% FBS DMEM 배지(100 ml FBS, 500ml DMEM 에서 55 mg 피루브산 나트륨 및 146mg L-글루타민 )를 첨가하고 하룻밤동안 인큐베이션하라.

분비 트랩 분석법

분비 트랩을 하기와 같이 수행했다: 배지를 PBS 로 린스했고, 그 다음 FBS 에서 1.8% 포름알데히드로 15 분동안 고정했다. 그 다음, 세포를 TNT (O. 1M Tris- HCL, 0.15M NaCl, and 0.05% Tween-20 in H₂O)로 세척했고, 15 분동안 PBS 에서 0.1 % Triton-X 로 침투시켰고, 다시 TNT 로 세척했다. 세포를 1 시간동안 TNB (O. IM Tris-HCL, 0.15M NaCl and 0.5% Blocking Reagent (NEN Renaissance TSA-Direct Kit) in H₂0)로 차단했고, TNT 로 다시 세척했다. 바이오틴화 단백질을 사용한 경우에, 세포를 TNT 로의 세척사이에 아비딘 그다음 바이오틴 (Vector Labs)으로 15 분동안 인큐베이션으로 차단했다. 사용된 가용성 리셉터에 따라서, 세포를: (A) 1-3 μg/ml zalpha11 가용성 리셉터 zalpha11-Fc4 융합 단백질(실시예 10); (B) 3 μg/ml zalpha11 가용성 리셉터 C-말단 FLAG 표지, zalpha11CFLG (실시예 10); (C) 3μg/ml zalpha11 가용성 리셉터 C-말단 GluGlu 표지, zalpha11CEE (실시예 10); 또는 (D) TNB 의 3 μg/ml 바이오틴화 zalpha11 가용성 리셉터 zalpha11CEE로 1 시간동안 인큐베이션했다. 그 다음 세포를 TNT 로 세척했다. 사용된 가용성 리셉터에 따라서, 세포를 (A) 1: 200 희석된 염소-항-사람 Ig-HRP (Fc 특이적); (B) 1: 1000 희석 M2-HRP; (C) 1: 1000 희석 항 GluGlu 항체-HRP; 또는(D) TNB 에서 1:300 희석 스트렙타비딘-HRP (NEN kit)와 함께 1 시간동안 인큐베이션했다. 세포를 TNT 로 다시 세척했다.

양성 결합을 희석 완충액(NEN kit)에서 1:50으로 희석된 플루오레세인 티라미드 시약으로 검출했고, 4-6 분동안 인큐베이션했고, TNT 로 세척했다. 세포를 TNT 에서 1:5 로 희석된 Vectashield Mounting Media (Vector Labs Burlingame, CA)에 보존했다. 세포를 형광 현미경상에서 FITC 여과기를 사용하여 가시화했다.

실시예 13

Zalpha11 리간드 유전자의 염색체 지정 및 배치

Zalpha11 리간드 유전자를 상업적으로 이용가능한 버전 "Stanford G3 Radiation Hybrid Mapping Panel" (Research Genetics Inc., Huntsville, AL)을 사용하여 염색체 4 에 대해 맵핑했다. "Stanford G3 RH Panel" 은 사람의 전체 게놈 각각의 83 래디에이션 혼성체 클론의 DNA , 및 2 개의 조절 DNA (RM 공여자 및 A3 수용자)를 포함한다. 공개적으로 이용가능한 WWW 서버(http ://shgc-www. stanford. edu)로 마아커의 염색체 위치를 알수 있다.

"Stanford G3 RH Panel" 로 zalpha11 리간드의 맵핑의 경우에, 20 ㎕ 반응물을 96-웰 마이크로티터 평판(Stratagene, La Jolla,CA)에 셋업했고, "RoboCycler Gradient 96" 열 사이클러(Strataaene)에서 사용했다. 각각의 85 PCR 반응물은 총 부피 20 ㎕ 를 구성하는 2 ㎕ 10 X KlenTaq PCR 반은 완충액(CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA), 1.6 ㎕ dNTPs 혼합물 (2.5 mM each, PERKIN-ELMER, Foster City, CA), 1 ㎕ 센스 프라이머, ZC 22,050 (SEQ ID NO: 42), 1 ㎕ 안티센스 프라이머,ZC 22,051 (SEQ ID NO: 43), 2 ㎕ "RediLoad" (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL), 0.4 ㎕ 50X Avantage KlenTaq Polymerase Mix (Clontech Laboratories, Inc.), 각각의 혼성체 클론으로부터 25 ng 의 DNA 또는 대조표준 및 ddH₂O 로 구성되었다. 반응물을 동량의 미네랄 오일로 오버레이하였고, 봉입했다. PCR 사이클러 조건을 하기와 같이 했다: 94 ℃ 에서 5 분 최초의 1 사이 클 변성, 94℃ 에서 45 초 35 사이클, 60℃ 에서 45 초 어닐링 및 72 ℃ 에서 1 분 15 초 연장, 다음에 72 ℃에서 7 분 최종 1 사이클 연장. 반응을 2 % 아가로스 겔상에서 (Life Technologies, Gaithersburg, MD) 전기천공으로 분리했다.

결과는 zalpha11 리간드 유전자가 > 12 의 LOD 스코어 및 마아커로부터 6 cR-10000(약 180 kb)의 거리로 IL2 프레임워크 마아커 SHGC-12342 에 결합하는 것을 보여주었다. 주변 마아커의 사용은 zphal1 리간드 유자자를 통합된 LDB 염색체 4 맵상에서 4q27 영역에 위치시킨다 (The Genetic Location Database, University of Southhampton.WWW server: http://cedar. genetics. soton. ac. uk/public~html/).

실시예 14

뮤린 zalpha11 리간드의 동정 및 클로닝

전체-길이 뮤린 zalpha11 리간드를 얻기 위한 EST 서열의 사용

A. 마우스 zalpha11 리간드의 EST 서열

문제의 사람 zalpha11 리간드 cDNA 서열(SEQ ID NO: I), 마우스 EST (EST1483966)가 마우스 zalpha11 리간드에 대한 잠재적인 부분 서열로서 확인되었다. EST1483966 는 사람의 zalpha11 리간드의 펩티드 절편과 높은 서열 동일성을 공유하는 2 개의 잠재적인 엑손으로부터 유도된 펩티드 서열에 관한 마우스 게놈 단편을 나타낸다. (SEQ ID NO:2의 아미노산 13 (Ile)부터 아미노산 80 (Gln).

B. 마우스 마라톤 cDNA 패널의 PCR 스크린

11 마우스 마라톤 cDNA (Clontech)샘플을 하기에 개시된 PCR 로 스크리닝했 다. 마우스 마라톤 cDNA 샘플을 뇌, 췌장, 신장, 태반, 타액선, 피부, 고환, 자궁, 배아, 및 비장 조직으로부터 준비했다. 제조자의 지시에 따라서, Marathon^TM cDNA Amplification Kit (Clontech)를 사용하여 가정에서 가능했다. EST 서열에 기초하여, 2 개의 PCR 프라이머, ZC22,056 (SEQ ID NO: 44) 및 ZC22,057 (SEQ ID NO: 45) 를 사용하여 PCR 로 마우스 zalpha11 리간드원을 확인했다. PCR 반응 조건은 하기와 같았다. 94 ℃ 에서 2 분; 94 ℃ 에서 30 초동안 35 사이클; 68 ℃에서 2 분동안; 다음에, 68 ℃에서 4 분; 그다음 10 ℃ 침액. PCR 생성물을 1 % 아가로스 겔에 전개시켰다. 증폭된 cDNA 단편을 나타내는 진한 150 bp 밴드가 가시화되었다. 지시된 마우스 비장 마라톤 cDNA 는 마우스 zalph11 리간드 cDNA 클로닝의 원이다. 마우스 비장 마라톤 cDNA 는 마우스 zalpha11 리간드에 대한 부분적인 cDNA 로서 서열분석에 의해 연속적으로 확인된 양성 cDNA 를 포함했다.

C. 5'-및 3' RACE 에 의해 생성된 마우스 전체-길이 cDNA 에 대한 복합 서열

마우스 zalpha11 리간드 부분 cDNA 서열의 5' 및 3' 양쪽측면에 위치한 서열은 5' 및 3' RACE 증폭에 의해 얻었다. 2 번의 PCR 증폭을 추가적인 유전자-특이적 올리고 프라이머 ZC22,205 (SEQ ID NO: 46) 및 ZC22,206 (SEQ ID NO: 47), ZC22,056 (SEQ ID NO: 44) 및 ZC22,057 (SEQ ID NO: 45), 및 2 개의 어댑터 올리고 프라이머 ZC9,739 (SEQ ID NO: 48) 및 ZC9,719 (SEQ ID NO: 49)로 수행했다. PCR 반응을 하기와 같이 수행했다: 94 ℃ 에서 2 분; 94 ℃ 에서 30 초동안 35 사이클; 68 ℃에서 2 분동안; 다음에, 68 ℃에서 4 분; 그다음 10 ℃ 침액. PCR 생성물을 1 % 아가로스 겔상에 전개시켰고, 약 300 bp 5'RACE 산물 및 약 800 bp 3'RACE 산물을 확인했다. 이 단편을 Qiaquick^TM 겔 추출 키트 (Qiagen)를 사용하여 분리했다.

정제 PCR 생성물을 하기의 프라이머를 사용하여 서열결정했다 : ZC9,719 (SEQ ID NO: 49), ZC22,205 (SEQ ID NO: 46) 및 ZC22,206 (SEQ ID NO: 47). 제 1 의 복합 전 길이 마우스 zalpha11 리간드 서열을 5' 및 3' RACE 단편을 결합하여 확인했다. 전 길이 마우스 클론을 하기의 실시예 15 에 개시된대로 분리했다.

실시예 15

활성 마우스 비장 라이브러리로부터 마우스 zalpha11 cDNA 클론의 분리

A. 마우스 zalpha11 리간드 결합에 사용된 뮤린의 1 차 원

Balb/C 마우스로부터 마우스 비장을 수거하고 동결된 말단 슬라이드사이에 매쉬하여 세포 현탁액을 제조했다. 분리된 제 1 차 마우스 세포 산출량은 하기에 개시된 선택전에 6.4 X 10 ⁸ 세포였다.

비장 세포는 9.6 ml MACS 완충액 (PBS, 0.5% EDTA, 2mM EDTA)에서 현탁했다. 1.6 ml 의 세포 현탁액을 제거했고, 0.4 ml CD90 (Thyl. 2) 마이크로비드(Miltenyi Biotec)를 첨가했다. 혼합물을 4 ℃ 에서 15 분동안 인큐베이션했다. CD90 비드로 표지된 세포를 30 ml MACS 완충액으로 세척했고, 그 다음 2 ml MACS 완충액으로 재현탁했다.

VS+ 컬럼(Miltenyi)을 제조자의 지시에 따라서 준비했다. 그 다음, VS+ 컬럼을 VarioMACS^TM 자기장(Miltenyi)에 놓았다. 컬럼을 5 ml MACS 완충액으로 평형화했 다. 그 다음, 분리된 제 1 차 마우스 세포를 컬럼에 적용했다. CD3 음성 세포가 통과되도록 허용했다. 컬럼을 9 ml(3 X 3 ml) MACS 완충액으로 린스했다. 그 다음, 컬럼을 자석으로부터 제거했고, 15 ml 팔콘 튜브에 놓았다. CD90+ 세포를 컬럼에 5 ml MACS 완충액을 첨가함으로서 추출했고, 결합 세포를 제조자에 의하여 제공된 플러저를 사용하여 수체교환했다. 상기의 CD90 자기 비드와 함께 세포의 인큐베이션, 세척, 및 VS+ 컬럼 단계(인큐베이션부터 용리까지)를 한 번 더 반복했다. 2 컬럼 분리로부터 결과적인 CD90+ 분획을 모았다. CD90+ 선택된 마우스 비장 세포의 산출량 은 1X10⁸ 총세포였다.

모여진 CD90+ 선택된 마우스 세포의 샘플을 그것의 순도를 평가하기 위해서 형광 항체 세포 분류기(FACS)상에서 염색 및 분류를 위해 제거했다. PE-결합 햄스터 항-마우스 CD3ε 항체(PharMingen) 을 CD90+ 선택된 세포를 염색하고 분류하는 데 사용했다. 마우스 CD90+ 선택된 세포는 93% CD3+ 세포였고, 세포가 93% T-세포임을 제시했다.

뮤린의 CD90+ 선택된 세포를 37 ℃ 에서 하룻밤동안 RPMI + 5% FBS + PMA 10 ng/ml 및 이오노마이신 0.5 μg/ml (Calbiochem)에서 3 X 10⁶ 세포/ml 를 인큐베이션하여 활성화했다. 활성화 CD90+ 선택된 마우스 세포로부터의 상층액을 하기에 개시된 대로 zalph11 리간드 활성에 대해 시험했다. 더욱이, 활성 CD90+ 선택된 마우스 세포는 하기의 실시예 16 에 개시된 대로, cDNA 라이브러리를 준비하기 위해 사용했다.

실시예 16

마우스 CD90+ 선택된 세포 라이브러리로부터 마우스 zalpha11 리간드의 클로닝

제 1 차 마우스 활성 CD90+ 선택된 세포 cDNA 라이브러리의 스크리닝은 분리된 4-나선-번들 사이토킨 부류의 새로운 요소, cDNA 를 밝혀냈다. cDNA 는 사람의 zalpha11 리간드의 마우스 오르토로그를 코드화했다. cDNA는 혼성화 스크리닝에 의해 확인했다.

A. CD90+ 선택된 라이브러리 구성물용 벡터

벡터, pZP7N 을 CD3+ 선택된 라이브러리 구성물용으로 사용했다(실시예 6A 참조).

B. 제 1 차 마우스 활성 CD90+ 선택된 세포 cDNA 라이브러리의 제조

이오노마이신/PMA(실시예 15)에서 자극된 약 1.5 X 10⁸제 1 차 마우스 CD90+ 선택된 세포를 원심분리에 의하여 분리했다. 총 RNA 를 세포 펠렛으로부터 분리했고, 실시예 6B 에 개시된 대로 이중 가닥 cDNA 로 전환했다. 연이어서, 실시예 6B 에 개시된 대로, DNA 를 BHK 세포로 트랜스펙션시켰고, 증식을 "Alamar blue"형광 분석법(실시예 2B)을 사용하여 평가했다.

분비 트랩 클로닝에 의한 라이브러리의 스크리닝 목적으로, 복합,증폭 형태의 라이브러리로 COS-7 세포를 트랜스펙션할 필요가 있다. 4.8 밀리언 클론을 100 μg/ml 암피실린, 10μg/ml 메티실린으로 보충된 11015 cm LB-한천 평판에 플레이 팅했다. 37 ℃ 에서 하룻밤동안 평판을 배양한 다음에, 박테리아를 스크랩핑하고 펠렛하는 것에 의해서 거두었다. 플라스미드 DNA 를 제조자의 지시에 따라서, Nucleobond-giga^TM (Clonetech)을 사용하여 펠렛 박테리아로부터 추출했다. 그 다음, 플라스미드를 슬라이드상의 COS-7 세포를 트랜스펙션시키는 데 사용했고, 하기에 개시된 분비 트랩 기법을 사용하여 스크리닝하였다(실시예 17).

C. 활성화 마우스 cDNA 라이브러리의 스크리닝

약 5X10⁵클론을 10 LB/Amp Maxi 평판에 플레이팅했다. 콜로니를 표준 과정 (Sambrook, J. et al. supra.)을 사용하여 리프트하여, 변성, 중성화하고, 교차결합시켰다. 50 ng 의 300 bp 5' RACE PCR 단편(실시예 14)을 Prime-Itr RmT random primer labeling kit (Stratagene)를 사용하여 ³²P로 표지했다. 10 여과물을 65 ℃ 에서 하룻밤동안 ExpressHyb^Tm 혼성화 용액 (Clontech)을 사용하여 표지된 프로브와 혼성화했다. 그 다음, 여과물을 0.2xSSC (30 mM NaCl, 3 mM 나트륨 시트레이트, pH 7.0), 0.1% SDS 로 60 ℃에서 1 시간동안 연속적으로 3 번 세척했고; 그 다음 65 ℃ 에서 1 시간동안. 여과물을 -80 ℃ 에서 하룻밤동안 노출했고, X-레이 필름을 현상했다. 양성 콜로니를 함유하는 한천 플러그를 모았고, 클론을 10 cm LB/Amp 평판에 플레이팅했다. 그 다음, 콜로니를 여과-리프트했고, 상기에 개시된 같은 과정에 따라서 다시 혼성화했다.

M11L/pZP7 로 명명된 DNA클론을 다음의 프라이머를 사용하여 분리했고, 서열 결정했다:ZC14,063 (SEQ ID NO: 50), ZC5, 020 (SEQ ID NO: 51), ZC22,421 (SEQ ID NO: 52), ZC22,604 (SEQ ID NO: 53), 및 ZC22,641 (SEQ ID NO: 54). 클론의 폴리뉴클레오티드 서열은 전체-길이 마우스 zalpha11 리간드 (SEQ ID NO: 55)이고, 5' 및 3' RACE 산물로부터 얻어진 복합 서열과 일치한다. 마우스 zalpha11 리간드에 상응하는 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 56 으로 제시된다.

실시예 17

마우스 zalpha11 리간드는 분비 트랩 분석법에서 사람의 zalpha11 가용성 리셉터에 결합한다.

마우스 클론 M11L/pZP7 에 해당하는 DNA 를 COS 세포에 트랜스펙션시켰고, 트랜스펙션된 COS 세포와 사람의 zalpha11 가용성 리셉터 zalpha11-Fc4 (실시예 10C) 의 결합은 분비 트랩 분석법(실시예 12)으로 시험했다. 분석은 마우스 zalpha11 리간드가 사람의 zalpha11 가용성 리셉터에 결합한다는 것을 확증한다.

COS 세포 트랜스펙션은 3 ㎕ 에서 0.7 gM11L/pZP7 DNA (실시예 16)를 사용하여 실시예 12 와 같이 수행했다.

분비 트랩을 TNB, 및 TNB 에서 1:200 희석 염소-항-사람 Ig-HRP(Fc 특이적)에 검출가능한 항체용으로 1 μg/ml zalpha11 가용성 리셉터 Fc4 융합 단백질(실시예 1OC)을 사용하여 실시예 12 와 같이 수행했다.

준비된 고정 세포와 가용성 사람 zalpha11 리셉터의 양성 결합을 실시예 12 와 같이 형광 티라미드 시약으로 검출했다. 실시예 12 에 따라서, 세포를 보존했고 가시화했다.

양성 결과는 마우스 zalpha11 리간드가 사람의 zalpha11 가용성 리셉터에 결합한다는 것을 나타냈다.

실시예 18

포유류 세포에서 마우스 zalpha11 리간드의 발현

A. 발현 벡터 Ml 1L/pZP9 의 제조

발현 벡터를 포유류 세포에서 마우스 zalpha11 리간드의 발현을 위해 준비했다. 500 bp PCR 생성 zalpha11 리간드 DNA 단편을 마우스 zalpha11 리간드의 코드 영역을 증폭하고, Xhol 및 XbaI 제한효소 부위를 첨가하기 위하여 PCR 프라이머로서 ZC22,283 (SEQ ID NO: 57) 및 ZC22,284 (SEQ ID NO: 58)를 사용하여 제조하였다. 마우스 zalpha11 리간드 클론 M11L/pZP7 (실시예 16)을 템플레이트로 사용했다. PCR 조건은 하기와 같다. : 94℃ 에서 2 분, 94 ℃ 에서 30 초동안 25 사이클, 2 분동안 68 ℃; 그 다음에 4 분동안 68 ℃; 그 다음 10 ℃ 침액. 약 500 bp 의 예견된 크기의 밴드를 1 % 아가로스 겔 전기영동에 의해 가시화했고, 절단했고, 그 DNA를 제조자의 지시에 따라서, QiaexII^TM 정제 시스템(Qiagen)을 사용하여 정제했다. 정제 DNA 를 37 ℃ 에서 2 시간동안 XhoI 및 XbaI (Boehringer Mannheim)으로 분해했다. 그 다음, DNA 를 다음의 과정에 따라서 겔 분리하고 정제하였다.

절단된 DNA 를 XhoI 및 XbaI (Boehringer Mannheim)으로 잘려진 플라스미드 pZP9 에 서브클론했다. 플라스미드 pZP9 는 마우스 메탈로티오나인-1(MT-1)프로모터, 코드 서열 삽입을 위한 다중 제한 부위, 및 사람의 성장 호르몬 터미네이터를 가지는 발현 카세트를 포함하는 포유류 발현 벡터이다. 플라스미드는 또한 대장균 복제 기점, SV40 프로모터, 인핸서 및 복제 기점, DHFR 유전자, 및 SV40 터미네이터를 가지는 포유류 선택 마아커 발현 단위를 가진다.

약 30 ng 의 제한 분해된 마우스 zalpha11 리간드 단편 및 약 10 ng 의 분해된 pZP9 벡터를 실온에서 2 시간동안 리게이션했다. 2 μg 의 리게이션 반응물을 제조자의 지시에 따라서, INVaF' 컴피턴트 세포(Invitrogen)에 형질전환시켰고, 50 μg /ml 암피실린을 함유하는 LB 평판에 플레이팅했고, 하룻밤동안 37 ℃ 에서 인큐베이션했다. 콜로니를 각각의 콜로니의 액체 배양물로부터 준비된 DNA 의 XhoI 및 XbaI (Boerhinger Mannheim)을 사용하여 제한 분석법에 의해 스크리닝했다. 양성 클론의 삽입 서열을 마우스 zalpha11 리간드 서열인지를 서열 분석법에 의하여 확인했다. 대량의 플라스미드 제조를 제조자의 지시에 따라서, Qiagen

Maxi prep 키트 kit (Qiagen)에서 행했다. 마우스 zalpha11 리간드를 함유하는 발현 벡터를 M11L/pZP9 으로 명명했다.

B. 마우스 zalpha11 리간드의 포유류 발현

BHK 570 세포(ATCC No: CRL-10314)를 10 cm 조직 배양 디쉬에 플레이팅했고, DMEM/FBS 배지 (DMEM, Gibco/BRL 고글루코스 배지; Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 5% 태아 소 혈청(Hyclone, Logan, UT), l mM L-글루타민(JRH Biosciences, Lenexa, KS), 1 mM 피루브산 나트륨 (Gibco BRL))에서, 37 ℃, 5% CO₂ 로 하룻밤동안 약 20 % 합류점으로 배양되도록 했다. 그 다음, 세포를 제조자의 지시에 따라서, 포유류 의 안정한 CaPO₄ 트랜스펙션 키트(Stratagene)를 사용하여 플라스미드 MllL/pZP9 (실시예 18A)로 트랜스펙션시켰다.

트랜스펙션한 다음날, 세포를 1:10 및 1:20 으로 쪼개어 150 mm 플레이트로 선택 배지(1 μm 메토트렉세이트가 첨가된 DMEM/FBS (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO))에 넣었다. 세포상의 배지를 트랜스펙션 5 일 후 신선한 선택 배지로 교체했다. 트랜스펙션 후 약 10 일에, 메토트렉세이트 내성 콜로니를 트립신화하고 세포를 모으고, 대규모 배양 플라스크에 플레이팅했다. 세포가 약 90 % 합류점으로 배양된 후에, PBS 로 세번 린스하고, 무혈청 ESTEP2 배지(DMEM (Gibco BRL), 0.11 g/l 피루브산 나트륨, 3. 7g/l NaHCO₃, 2.5 mg/l 인슐린, 5 mg/l 트랜스페린, pH7.0)와 함께 배양했다. 콘디셔닝 배지를 3 일 후에 수거했고, 실시예 19 에 개시된대로, Alamar Blue 를 사용하여 BaF3 증식 분석을 수행했다.

실시예 19

마우스 zalpha11 리간드는 Alamar Blue 를 사용한 BaF3 분석에서 사람의 zalpha11 리셉터를 활성화시킨다.

BaF3/zalpha11 세포(실시예 4, 및 5B)를 마우스의 zalpha11 리간드(실시예 18)를 발현하는 BHK 세포로부터 무혈청 콘디셔닝 배지를 사용하여 평가했다.

BaF3/zalpha11 세포를 회전시켰고, 세척했고, 실시예 5B 에 개시된대로, mIL-3 무혈청 배지에 플레이팅했다.

BaF3/zalpha11 세포를 마우스의 zalpha11 리간드(실시예 18)를 발현하는 BHK 세포 로부터 무혈청 콘디셔닝 배지를 사용하여 평가했다. 콘디셔닝 배지를 mIF-3 무배지로: 50%, 25%, 12.5%, 6.25%, 3.125%, 1.5%, 0.75% 및 0.375% 농도까지 희석시켰다. 증식 분석을 실시예 5B 와 같이 수행했다.

마우스 zalpha11 리간드에서 BaF3/zalpha11 세포의 증식 반응 결과가 확인되었다. 측정된 바, 반응은 50% 농도에서 백그라운드에 대해 대락 5-배였다.

실시예 20

Zalpha11 리간드는 루시페라제 분석법에서 사람의 zalpha11 리셉터를 활성화시킨다.

A. BaF3/KZ134/zalpha11 셀라인의 구성

KZ134 플라스미드를 4 개의 유전자로부터 STAT 전사인자 결합 요소를 포함하는 상보적인 올리고뉴클레오티드 ZC12,749 (SEQ ID NO: 59) 및 ZC12, 748 (SEQ ID NO: 60)로 구성했다. 변형된 c-fos Sis 유발 요소(m67SIE, or hSIE) (Sadowski, H. et al.. Science 261: 1739-1744, 1993), p21 WAF1 유전자로부터 p21 SIE1 (Chin, Y. et ail.. Science 272: 719-722, 1996), β-카제인 유전자의 유선 반응 요소(Schmitt-Ney, M. et al., Mol. Cell. Biol. 11:3745-3755, 1991), 및 Fcg RI 유전자의 STAT 유발 요소 (Seidel, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 3041-3045,1995). 올리고뉴클레오티드는 Asp718-XhoI 양립가능한 말단을 포함하고, 표준 방법을 사용하여 같은 효소로 분해된 네오마이신 선택 마아커를 포함하는 c-fos 프로모터 (Poulsen, L. K. et al., J. Biol. Chem. 273: 6229-6232,1998)를 가진 가용성 개똥벌레 루시페라제 리셉터 벡터로 리게이션되었다. KZ134 플라스미드는 표 준 트랜스펙션 및 선택 방법을 사용하여, BaF3/KZ134 셀라인을 만들기 위해서 BaF3 세포에 안정하게 트랜스펙션되는 데 사용되었다.

전 길이 zalpha11 리셉터를 발현하는 안정한 BaF3/KZ134 지시 셀라인을 실시예 3 에 개시된 대로 30 μg 의 zalpha11 발현 벡터를 사용하여 실시예 2A 와 같이 제조하였다. 클론을 희석했고, 플레이팅했고, 표준 기법을 사용하여 선택했다. 클론을 유발자로서 사람의 zalpha11 리간드 콘디셔닝 배지를 사용하여 루시페라제 분석(예를 들어, 하기의 실시예 20B)으로 스크리닝했다. 가장 높은 루시페레제 반응(STAT 루시페라제에 의함)을 가진 클론 및 가장 낮은 기초 반응을 가진 클론을 선택했다. 안정한 트랜스펙션된 셀라인을 선택했다. 셀라인을 BaF3/KZ134/zalph11 이라 명명했다.

B. 사람 및 마우스 zalpha11 리간드는 BaF3/KZ134/Zalph11 루시페라제 분석에서 사람의 zalpha11 리셉터를 활성화시킨다.

BaF3/KZ134/zalpha11 세포를 회저시켰고, mIL-3 무배지로 세척했다. mIL-3 의 제거를 확실히하기 위해서 세포를 3 번 회전했고, 세척했다. 그 다음 세포를 헤마사이토미터로 계수했다. 세포를 mIL-3 무배지를 사용하여 웰단 100 ㎕ 의 부피로 웰당 약 30,000 세포로 96-웰 포맷에 플레이팅했다. 같은 과정을 연이은 분석에서 대조표준으로 사용하기 위한 비트랜스펙션 BaF3/KZ134 세포에 사용했다.

BaF3/KZ134/Zalpha11 의 STAT 활성을 (1) 사람의 zalpha11 리간드로 트랜스펙션된 BHK570 세포 (실시예 7) 또는 (2) 마우스의 zalpha11 리간드로 트랜스펙션된 BHK570 세포 (실시예 18), 또는 (4) 배지만의 조절 반응을 측정하기 위한 mIL-3 무배지로부터 콘디셔닝 배지를 사용하여 평가했다. 콘디셔닝 배지를 RPMI mIL-3 무배지로 50%, 25%, 12.5%, 6.25%, 3.125%, 1.5%, 0.75% 및 0.375% 농도까지 희석시켰다. 100 ㎕ 의 희석된 콘디셔닝 배지를 BaF3/KZ134/Zalpha11 세포에 첨가했다. 노정 배지를 사용한 분석을 대조표준으로서 비트랜스펙션된 BaF3/KZ134 세포와 비교로서 행했다. 총 분석 부피는 200 ㎕ 였다. 분석 평판을 세포를 10 분동안 2000 rpm 으로 원심분리하여 펠렛하고, 배지를 흡출하고, 25 ㎕ 의 용균 완충액(Promega) 을 첨가한 후 24 시간동안 37 ℃, 5% CO₂ 로 인큐베이션했다. 실온에서 10 분후에, 5 초 통합으로 40 ㎕ 의 루시페라제 분석 기질(Promega)이 첨가된 루미노미터(Labsystems Luminoskan, model RS)상에서 평판을 해독함으로써 STAT 리셉터 구성물의 활성을 측정했다.

결과는 사람의 zalpha11 리간드에 대한 BaF3/KZ134/zalpha11 세포의 STAT 리셉터 반응을 확증한다. 측정된 반응은 50 % 농도에서 배지만 조절된 것에 비하여 약 50 배였다. 사람의 zalpha11 리간드에 대한 반응에서 STAT 활성은 비트랜스펙션 BaF3/KZ134 조정 세포에서 부재했고, 이것은 반응은 zalpha11 리셉터를 통해 조절된다는 것을 보여준다.

결과는 또한 사람의 zalpha11 리간드에 대한 BaF3/KZ134/zalpha11 세포의 STAT 리셉터 반응을 확증한다. 측정된 반응은 50 % 농도에서 배지만 조절된 것에 비하여 약 40 배였다. 더욱이, 마우스 zalpha11 리간드에 대한 반응에서 STAT 활성은 비트랜스펙션 BaF3/KZ134 조정 세포에서 부재했고, 이것은 반응은 zalpha11 리 셉터를 통해 조절된다는 것을 제안한다.

실시예 21

마우스 zalpha11 리간드는 마우스 골수 분석에서 활성이 있다.

A. 비-흡착 저밀도 골수 세포의 분리:

신선한 마우스 대퇴골 흡출물(골수)을 6-10 주된 수컷 Balb/C 또는 C57BL/6 마우스로부터 얻었다. 그 다음, 골수를 전체 골수 세포 현탁액으로서 RPMI+10% FBS (JRH, Lenexa KS; Hyclone, Logan UT)로 세척했다. 그 다음, 하기와 같이 전체 골수 세포 현탁액을 밀도 구배(Nycoprep, 1.077, Animal : Gibco BRL)에 놓아 대부분 단핵인 저밀도 세포의 밀도를 높였다: 전제 골수 세포 현탁액(약 8 ml) 를 15 ml 원뿔형 튜브에서 약 5 ml 니코프렙 구배 용액의 상층에 주의깊게 피펫했고, 그 다음, 20 분동안 600X 로 원심분리했다. 저밀도 단핵 세포를 포함하는 계면층을 제거했고, 과량의 RPMI+10% FBS 로 세척했고, 5-10 분동안 400X 로 원심분리에 의하여 펠렛했다. 펠렛을 RPMI +10% FBS 에서 재현탁했고, T-75 플라스크에서 약 10⁶ 세포/ml로 플레이팅했고, 37 ℃ 5 % CO₂ 에서 약 2 시간동안 인큐베이션했다. 현탁액의 결과적인 세포가 비-흡착 저밀도(NALD) 골수 세포였다.

B. 96-웰 분석법

NA LD 마우스 골수 세포를 RPMI +10% FBS + lng/mL 마우스 스템 세포 인자(mSCF) (R & D Systems, Minneapolis, MN), 및 하기 중 하나의 5% 콘디셔닝 배지: (1) 마우스 zalpha11 리간드(실시예 18)를 발현하는 BHK 570 세포, (2) 사람의 zalpha11 리간드(실시예 7)를 발현하는 BHK 570 세포, 또는 (3) 벡터를 포함하고, 어떤 리간드도 발현하지 않는 조정 BHK 570 세포의 96 웰 조직 배양물 평판에서 25,000 내지 45,000 세포/웰로 플레이팅했다. 그 다음, 세포를 골수로부터 헤마토포이틱 세포의 확장 또는 분화를 시험하기 위하여 다양한 사이토킨 처리를 하였다. 시험을 위해서, 평판 NA LD 마우스 골수 세포를 사람의 인터류킨-15(hIL-15)(R & D 시스템), 또는 다른 사이토킨의 패널에 위치시켰다. hIl-15, 또는 다른 사이토킨의 일련의 희석을 약 50 ng/ml 이하로부터 약 6025 ng/ml 농도가지 2 배 일련의 희석으로 시험했다. 8 일 내지 12 일 후에 96-웰 분석을 실시예 5B 에 개시된 대로 Alamar blue 분석에 의해서 세포 증식에 대해 스코어했다.

C. 96-웰 NA LD 마우스 골수 분석법 결과

마우스 및 사람의 zalpha11 리간드 모두를 발현하는 BHK 세포로부터 콘디셔닝 배지는 NALD 마우스 골수에서 헤마토포이틱 세포군의 확장을 촉진하기 위해서 hIL-15 와 함께 상승효과로서 작용했다. 헤마토포이틱 세포의 확장은 BHK 콘디셔닝 배지와 IL-15 로 조절한 경우에는 관찰되지 않았다. hIL-15 를 가진 마우스 zalpha11 리간드로 확장된 헤마토포이틱 세포군, 및 hIL-15 를 가진 사람 zalpha11 리간드로 확장된 헤마토포이틱 세포군을 세포 배양에서 더욱 번식시켰다. 헤마토포이틱 세포를 항-Pan NK 세포 항체(Pharmingen)로 표지된 피코에리트린으로 염색했고, 유동 시토미트리 분석을 했고, 이것은 확장된 세포가 자연 살생(NK) 세포 마아커에 대해 양성적으로 염색되었다는 것을 증명했다.

Poietic Technologies, Gaithersburg, MD 로부터의 신선한 사람 골수 세포를 사용하여 같은 96-웰 분석을 행했다. 다시 IL15 와 결합한 경우, 마우스 및 사람 zalpha11 리간드는 상기에 개시된 항체를 사용한 NK 세포 마아커에 대해 양성적으로 염색된 헤마토포이틱 세포군을 확장했다.

실시예 22

사람의 zalpha11 리간드 트랜스제닉 마우스를 생산하는 구성물

A. 간-특이적 MT-1 프로모터로부터 사람의 zalpha11 리간드를 발현하는 구성물

올리고뉴클레오티드는 공통 코작(Kozak) 서열 및 사람의 zalpha11 리간드 코드 서열을 포함하는 PCR 단편을 발생시키도록 설계된다. 올리고뉴클레오티드는 5' 말단에서 Fsel 부위 및 3'말단에서 AscI 를 가져서 (a) 표준 트랜스제닉 벡터, 또는 (b) 림프양-특이적 트랜스제닉 벡터, pKFO51(실시예 22B)로 클로닝을 촉진시키도록 설계되었다.

PCR 반응을 200 ng 사람의 zalpha11 리간드 템프레이트 (실시예 7) 및 올리고뉴클레오티드 ZC22,143 (SEQ ID NO: 61) 및 ZC22,144 (SEQ ID NO: 62)로 수행했다. PCR 반응 조건을 하기와 같이 했다. 95 ℃ 에서 5 분, 여기에서, Advantage^TM cDNA 폴리머라제(Clontech)가 첨가된다; 95 ℃ 에서 60 초동안 15 사이클, 60 ℃ 에서 60 초, 및 72℃ 에서 7 분. PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동으로 분리했고, QiaQuick^TM (Qiagen) 겔 추출 키트를 사용하여 정제했다. 분리된, 488 bp, DNA 단편을 FseI 및 AscI (Boerhinger-Mannheim)로 분해했고, 에탄올 침전했고, FseI 및 AscI 로 미리 분해된 pMT12-8 에 리게이션되었다. 트랜스제닉 마우스에서 간 및 다른 조직에서 관심의 유전자를 발현하도록 설계된 pMT12-8 플라스미드는 10 kb 의 MT-1 5 DNA 및 7 kb 의 MT-13' 가 양측면에 위치한 발현 카세트를 포함한다. 발현 카세트는 MT-1 프로모터, 래트 인슐린 II 인트론, 원하는 클론의 삽입을 위한 폴리링커, 및 사람의 성장 호르몬(hGH) 폴리 A 서열을 포함한다.

약 1 ㎕ 의 각 리게이션 반응을 제조자의 지시에 따라서, DHIOB ElectroMaxT^TM 컴피턴트 세포(GIBCO BRL, Gaithersburg MD)로 전기천공하였고, 100 μg/ml 암피실린을 포함하는 LB 평판에 플레이팅했고, 하룻밤동안 인큐베이션했다. 콜로니를 골라서 100 μg/ml 암피실린을 포함하는 LB 배지에서 배양했다. 미니프렙 DNA 를 정선된 클론으로부터 제조했고, EcoRI 단독, 또는 FseI 및 AscI 조합으로 제한효소 분해, 및 연이은 아가로스 겔 전기영동에 의해서 사람의 zalpha11 리간드 삽입에 대해 스크리닝했다. 올바른 pMT-사람의 zalpha11 리간드의 미니프렙을 수행했다. 5' 및 3' 양쪽측면에 위치한 서열을 가지고, MT-1 프로모터, 래트 인슐린 II 인트론, 사람의 zalpha11 리간드 cDNA 및 hGH 폴리 A 서열을 포함하는 SalI 단편을 수정된 뮤린의 난모세포에 미세주사하는데 사용하기 위해 제조했다. 미세주사 및 트랜스제닉 마우스의 생산은 Hogan, B. et al. Manipulating the Mouse Embryo, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1994 에 개시된 대로 생산했다.

B. 림프양-특이적 E㎕CK 프로모터로부터 사람의 zalpha11 리간드를 발현하는 구성물

올리고뉴클레오티드는 공통 코작(Kozak) 서열 및 사람의 zalpha11 리간드 코드 영역을 포함하는 PCR 단편을 발생시키도록 설계된다. 올리고뉴클레오티드는 5' 말단에서 Fsel 부위 및 3'말단에서 AscI 를 가져서 pKFO51, 림프양-특이적 트랜스제닉 벡터로의 클로닝을 촉진시키도록 설계되었다.

PCR 반응을 200 ng 사람의 zalpha11 리간드 템플레이트 (실시예 7) 및 올리고뉴클레오티드 ZC22,143 (SEQ ID NO: 61) 및 ZC22,144 (SEQ ID NO: 62)로 수행했다. PCR 반응을 하기의 조건하에 Advantage^TM cDNA 폴리머라제(Clontech)를 사용하여 수행했다: 95 ℃ 에서 5 분; 95 ℃ 에서 60 초동안 15 사이클, 60 ℃ 에서 60 초, 및 72℃ 에서 90 초; 및 72 ℃ 에서 7 분. PCR 생성물을 상기와 같이 정제했다. 분리된, 488 bp, DNA 단편을 FseI 및 AscI (Boerhinger-Mannheim)로 분해했고, 에탄올 침전했고, FseI 및 AscI 로 미리 분해된 pMT12-8 에 리게이션되었다. pKFO51 트랜스제닉 벡터는 p1026X (Iritani, B. M., et al., EMBO J.16: 7019-31,1997)로부터 유도되고, T-세포 특이적 lck 근처의 프로모터, B/T 세포-특이적 면역글루블린 μ 중쇄 인핸서, 원하는 클론의 삽입을 위한 폴리링커, 및 불활성 성장 호르몬 단백질(3' 인트론 및 폴리아데닐화 신호 제공)을 코드화하는 돌연변이화 hGH 유전자를 포함한다.

약 1 ㎕ 의 각 리게이션 반응을 제조자의 지시에 따라서 전기천공하였고, 플레이팅했고, 상기에 개시된대로, 제한효소 분해에 의해서 사람의 zalpha11 리간드 삽입에 대해 스크리닝했다. pKFO51-zalpha11 리간드의 올바른 클론을 스크리닝에 의해 확증했고, 클론의 맥시프렙을 수행했다. lck 근처 프로모터 및 면역글루블린 μ 인핸서(E㎕CK), zalpha11 리간드 cDNA , 및 돌연변이 hCG 유전자를 포함하는 NotI 단편을 수정된 뮤린의 난모세포에 미세주사하는데 사용하기 위해 제조했다.

실시예 23

마우스 zalpha11 리간드 조직 분포

뮤린의 복합 조직 노던 블롯(Mouse, Mouse Embryo, Clontech; MB1010, MB1012 Origene)을 뮤린의 zalpha11 리간드 발현의 조직 분포를 결정하기 위해서 프로브했다. 약 484 bp PCR 유도 프로브는 템플레이트로서 플라스미드 M1 lL/pZP7 (실시예 16) 및 프라이머로서 올리고뉴클레오티드 ZC22283 (SEQ ID NO: 57) 및 ZC22284 (SEQ ID NO: 58)을 사용하여 증폭했다. PCR 증폭을 하기와 같이 수행했다: 94 ℃ 에서 1 분 1 사이클; 94 ℃ 에서 30 초동안 35 사이클, 50 ℃ 에서 30 초, 및 72℃ 에서 30 초; 다음에 72 ℃에서 10 분 1 사이클. PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동으로 가시화했고, 약 488 bp PCR 생성물을 제조자의 지시에 따라서 Gel 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 정제했다. 프로브를 제조자의 지시에 따라서 REDIPRIME^TM 표지 키트(Amersham)를 사용하여 방사성 표지했다. 프로브를 NUCTRAP^TM 푸쉬 컬럼(Stratagene)을 사용하여 정제했다. EXPRESSHYB^TM (Clontech)용액을 예비혼성화를 위해 사용했고, 노던 블롯에 대한 혼성화 용액과 같았다. 혼성화는 10⁶ cpm/ml 의 표지된 프로브를 사용하여 65 ℃ 에서 하룻밤동안 수행했다. 그 다음 블 롯을 실온에서 2X SSC 및 0.1% SDS 에서 3 번 세척했고, 다음에 55 ℃ 에서 O.1X SSC 및 0.1% SDS 에서 2 번 세척했다. 약 1.2 alc 3.5 kb 의 2 전사체가 고환에서 발견된다. 상층 전사체만이 흉선에서 발견되었다.

8 개의 하우스키핑 유전자로 규정된 다양한 조직의 RNA 를 포함한 뮤린의 RNA 마스터 도트 블롯(Clontech)이 프로브화되었고, 상기에 개시된 대로 혼성화되었다. 고환에서 발현을 관찰했다.

실시예 24

BHK 570 으로부터 비표지 사람 및 마우스 zalpha11 리간드의 정제

다른 언급이 없다면, 모든 작업을 4 ℃ 에서 수행했다. 다음의 과정을 사람의 zalpha11 리간드 (실시예 25) 또는 마우스 zalpha11 리간드(M11L/pZP9) (실시예 18)를 발현하는 구성물을 가지고 트랜스펙션된 BHK570 세포의 콘디셔닝 배지로부터 사람 및 마우스의 zalpha11 리간드를 정제하기 위해서 사용했다. 콘디셔닝 배지를 표준 기법으로 농축했다. 농축된 콘디셔닝 배지(CM)를 0.45 및 0.22 마이크로 여과기를 통해 무균 여과했다. 그 다음, 배지를 pH 7.0 에서 0.01 M HEPES (JRH Biosciences, Lenexa, KS)에서 낮은 이온 강도(≤2mS)까지 희석했다. 그 다음, BioCAD SPRINT (Perceptive BioSystems)를 사용하여 4 ml/분으로 하룻밤동안 낮은 이온 강도 희석 CM 을 10 X 66 mm(6ml) Poros HS 50 컬럼(PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) 상에 로딩했다. 컬럼을 0.01 M HEPES pH7.0 을 가지는 10-20 컬럼 부피(CV)로 세척했다. 그 다음 결합 단백질을 5 ml/분 에서 0.01 M HEPES pH 7.0 에서 1 M NaCl (Mallinckrodt, Paris, KY)로 단계 추출했고; 2 ml 분획을 전체 크 로마토그래피상에서 수거했고, 280 및 215 nM 에서 흡광도를 모니터했다. 피크 흡광 분획을 생물학적 분석법 및 SDS-PAGE Silver (Geno Technology, St. Louis, MO) 및 코마지 (Sigma, St. Louis, MO) 염색법으로 분석했다. 피크 분획을 모았고, 무균 여과했고, pH 7.2 로 포스페이트 완충 식염수(PBS, Gibco BRL)를 가지고 ≤ 19 mS 까지 희석했다.

그 다음 희석된 샘플을 BioCad SPRINT 를 사용하여 zalpha11CFLAG 가용성 리셉터(실시예 10B) 또는 수지(하기 참조)상에 고정된 zalpha11-Fc4 융합 가용성 리셉터(실시예 lOC) 를 가진 0.8 ml Poros AL 컬럼상에 로딩했다. 그 다음, 컬럼을 10 ml/분으로 적어도 20 CV 의 PBS 로 세척했다. 그 다음 컬럼을 BioCAD 700E 상에서 PBS 를 가지고 10 ml/분의 유동율로 pH 2.5 의 0.1M 글리신의 600㎕ 주입(Aminoacetic Acid ; Glycocol, Spectrum, Gardena, CA)으로 빠르게 추출했다. 1 ml 분획을 각 6 초동안 수거했고, pH 8.8, 2 M TRIS (Tris (Hydroxymethyl) Aminomethane, EM Science, Gibbstown, NJ)의 55 ㎕ 를 가지고 즉시 pH 중성화햇다. 280 및 215 nM 에서 흡광도를 전체 크로마토그래피상에서 모니터했다.

피크 분획을 생물학적 분석 및 SDS-PAGE Silver (Geno Technology) 및 코마지 (Sigma) 염색법에 의해 분석했다. 마우스 zalpha11 리간드의 경우에 약 24 kD 및 18 kD 에서 2 개의 밴드가 Silver 및 코마지 겔상에서 관찰된다. 사람의 zalpha11 리간드에 대해 약 18 kD 의 단일 밴드가 Silver 및 코마지 겔상에서 관찰된다.

POROS AL 배지에서 사람의 zalpha11 가용성 리셉터 폴리펩티드의 고정

고정화된 zalpha11CFLAG 가용성 리셉터(실시예 10B) 또는 zalpha11-Fc4 융합 가용성 리셉터(실시예 10C)를 가지는 Poros AL 컬럼을 제조했다. 약 3 mg 의 zalpha11CFLAG 가용성 리셉터 및 약 10 mg 의 zalpha11-Fc4 융합 가용성 리셉터를 사용했다. 모든 작동을 BioCAD 700E 상의 실내옹도에서 수행했다. POROS AL 배지를 가진 4.5 X 50 mm 컬럼을 제조자의 설명에 따라서 2 M NaCl 에 흐름 충전했다. 그 다음, 컬럼을 pH 7.2 1. 1 M Na2SO450 mM NaPhosphate 으로 평형화했다. 리셉터를 Millipore 30 MWKO 스핀 농축기를 사용하여 4 mg/ml 까지 농축시킨다음에 1. 1 M Na2SO4/50 mM NaPhosphate, pH 7.2 로 1:1 희석시켰다. 컬럼을 1.1 M Na2S04/50 mM NaPhosphate pH 7.2 로 2 ml/분으로 유동시켰고, 고정된 상태의 포화, 또는 성공에 이를때까지 9 CV 이상으로 희석된 리간드의 100 ㎕ 주입을 하였다. 그 다음, 62 CV 구배를 1.1 M Na2SO4/50 mM NaPhosphate pH 7.2.에서 550 mM Na2SO4/50 mM NaPhosphate pH 7.2/5 mg/ml 나트륨 시아노보로히드라이드까지 전개시켰다. 그 다음, 고정 화학을 완결하도록 컬럼을 약 2 시간동안 유지했다. 그 다음, 컬럼을 0.2 M TRIS pH 7.2/5 mg/ml 나트륨 시아노보로히드라이드로 평형화하였고, 컬럼을 캡하기 위해서 약 1 시간동안 방치하였다. 최종적으로 컬럼을 PBS/0.02% 나트륨 아지드로 평형화하였고, 필요할 때까지 4 ℃ 에서 저장하였다. 사용하기 전에, 비특이적 단백질은 제거되었고 컬럼은 고정화된 사람의 zalpha11 가용성 리셉터를 걸러내지 않는다는 것을 확실히 하기 위해서 0.1 M 글리신으로 예비-추출했다.

실시예 25

포유류 세포에서 사람의 zalpha11 리간드의 발현

A. 발현 벡터 PZMP 11/zalpha11 Lig 의 구성

사람의 zalpha11 리간드를 코드화하는 모든 또는 부분 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 플라스미드는 동형 재조합으로 제조했다. 사람의 zalpha11 리간드 cDNA (SEQ ID NO: 63)의 단편을 PCR 을 사용하여 분리했다. 2 개의 프라이머를 PCR 반응에서 사람의 zalpha11 리간드 단편을 제조하기 위해 사용했다:(1) 벡터 양측에 위치한 40 bp 의 서열 및 사람의 zalpha11 리간드의 아미노 말단에 상보적인 17 bp 를 포함하는 프라이머 ZC22,052 (SEQ ID NO: 64), 및 (2) 양측에 위치한 벡터 서열에 상보적인 40 bp 의 3' 말단 및 사람의 zalpha11 리간드의 카르복실 말단에 상보적인 17 bp 를 포함하는 프라이머 ZC22,053 (SEQ ID NO: 65). PCR 반응 조건을 하기와 같이 수행했다: 94 ℃ 에서 2 분동안 1 사이클; 94 ℃ 에서 30 초동안 25 사이클, 30 초동안 60 ℃, 및 72 ℃ 에서 30 초; 다음에 72 ℃ 에서 5 분동안 1 사이클; 4 ℃ 침액. 분석을 위하여 1XTBE 완충액과 함께 100 ㎕ PCR 반응물의 10 ㎕를 0.8 % LMP 아가로스 겔상(Seaplaque GTG)에 전개시켰고, 약 560 bp 단편의 관찰이 기대된다. PCR 반응물의 잔여 90 ㎕ 를 하기에 개시된 대로 가용성 벡터 pZMP11 상의 재조합에 사용될 5 ㎕ 1M NaCl 및 250 ㎕ 의 완전 에탄올의 첨가로 침전시켰다. 가용성 플라스키드 pZMP11 을 SmaI 으로 미리 잘랐다.

플라스미드 pZMPll 를 플라스미드 pCZR199 (본원에 개시, 예를 들어, 실시예 8)로부터 유도했다. 플라스미드 pCZR199 는 CMV 급성 초기 프로모터, 마우스 면역글로블린 중쇄 위치의 가변 영역으로부터 공통 인트론, 코드 서열의 삽입을 위한 다중 제한 부위, 정지 코돈 및 사람의 성장 호르몬 터미네이터를 가지는 발현 카세 트를 포함하는 포유류 발현 벡터이다. 플라스미드는 또한 대장균 복제 기점, SV40 프로모터, 인핸서 및 복제기점, DHFR 유전자 및 SV40 터미네이터를 가지는 포유류 선택 마아커 발현 단위를 가진다. 벡터 pZMP11 을 pCZR199 로부터 제조했고, 메탈로티오나인 프로모터를 CMV 급성 초기 프로모토, 및 개방 리딩 프레임의 5' 말단에서 코작 서열로의 대체를 포함한다.

컴피턴트 효모 세포(S. cerevisiae)의 100 ㎕ 를 약 1 μg 의 사람 zalpha11 리간드 삽입체, 및 100 ng 의 SmaI 분해 pZMP11 벡터를 포함하는 혼합물의 10 ㎕ 와 혼합하였고, 0.2 cm 전기천공 커벳에 옮겼다. 효모/DNA 혼합물을 0.75kV(5kV/cm), 무제한 Ω, 25 μF 로 전기펄스를 가하였다. 각 큐벳에, 600 ㎕ 의 1.2 M 솔비톨을 첨가했고, 그 다음 효모를 2 개의 URA-D 평판상에 2 개의 300 ㎕ 알리쿼트로 플레이팅했고, 30 ℃ 에서 인큐베이션했다.

48 시간 후에, 단일 평판으로부터 Ura+ 효모 형질전환체를 1ml H₂O 에서 재현탁했고, 효모 세포를 펠렛하기 위하여 간단하게 회전시켰다. 세포 펠렛을 1 ml 의 용균 완충액(2% Triton X-100,1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8.0,1 mM EDTA)에서 재현탁했다. 500 ㎕ 의 용균 혼합물을 300 ㎕ 산 세척 유리 비드 및 200 ㎕ 페놀-클로로폼을 포함하는 Eppendorf 튜브에 첨가했고, 1 분 간격으로 2 번 또는 3 번 와동했고, 다음에 최대 속도로 Eppendorf 원심분리기에서 5 분 회전시켰다. 300 ㎕ 의 수성상을 신선한 튜브에 옮겼고, DNA 를 600 ㎕ 에탄올(EtOH) 로 침전시켰고, 다음에, 4 ℃ 에서 10 분동안 원심분리했다. DNA 펠셋을 100 ㎕ H₂O 로 재현탁했다.

일렉트로컴피던트 대장균 세포의 형질전환을 (DH10B, GibcoBRL) 0.5-2 ml 효모 DNA 준비 및 40 ㎕ 의 DH10B 세포로 수행했다. 세포를 2.0 kV, 25 mF 및 400 Ω으로 전기펄스를 가하였다. 전기천공 후에, 1 ml SOC (2% BactoTm Tryptone (Difco, Detroit, MI). 0.5% 효모 추출물 (Difco), 10 mM NaCl, 2.5 mM KCI, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM glucose) 를 4 개의 LB AMP 평판(LB broth (Lennox), 1.8% Bacto^TM Agar (Difco), 100 mg/L Ampicillin)상의 250 ㎕ 플레이팅했다.

사람의 zalpha11 리간드용 올바른 발현 구성물을 포함하는 각각의 클론을 삽입체의 존재를 확인하고, DNA 서열이 서로 올바르게 리게이션되었는지를 확인하기 위해서 제한효소 분해로 확인했다. 양성 클론의 삽입체가 서열 분석에 놓였다. 대량 플라스미드 DNA 를 제조자의 지시에 따라서, Qiagen Maxi 키트 (Qiagen) 를 사용하여 분리했다.

B. 사람의 zalpha11 리간드의 포유류 발현

BHK 570 세포(ATCC NO: CRL-10314)를 10 cm 조직 배양 디쉬에 플레이팅했고,

DMEM/FBS 배지(DMEM, Gibco/BRL High Glucose, (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 5% 태아 소 혈청(Hyclone, Logan, UT), 1mM L-글루타민 (JRH Biosciences, Lenexa, KS), 1mM 피루브산 나트륨(Gibco BRL))에서, 37 ℃, 5% CO₂ 로 하룻밤동안 50 내지 70 % 합류점으로 배양되도록 허용했다. 그 다음 세포를 무혈청(SF) 배지 조성물 (DMEM, 10 mg/ml 트랜스페린, 5 mg/ml 인슐린, 2 mg/ml 페투인, 1% L-글루타민 및 1% 피루브산 나트륨)에서 Lipofectamine^TM (Gibco BRL)을 사용하여 플라스미드 PZMP11/zalpha11Lig (실시예 25A )로 트랜스펙션시켰다. Zalpha11-Fc4/pZMP6 ( 실시예 8B)를 SF 배지로 총 부피 640 ml 가 되도록 15 ml 튜브에 희석시켰다. 35 ml 의 Lipofectamine^TM (Gibco BRL) 을 605 ML 의 SF 배지와 혼합했다. Lipofectamine^TM 혼합물을 DNA 혼합물에 첨가했고, 실온에서 약 30 분동안 인큐베이션했다. 5 ml 의 SF 배지를 DNA: Lipofectamine^TM 혼합물에 첨가했다. 세포를 5 ml 의 SF 배지로 한 번 린스했고, 흡출했고, DNA: Lipofectamine^TM 혼합물을 첨가했다. 세포를 5 시간동안 37 ℃ 에서 인큐베이션했고, 그 다음 6.4 ml 의 DMEM/10% FBS, 1% PSN 배지를 각 평판에 첨가했다. 평판을 37 ℃ 에서 하룻밤동안 인큐베이션했고, 다음날 DNA: Lipofectamine^TM 혼합물을 5% FBS/DMEM 배지로 교체했다. 트랜스펙션 후 5 일에, 세포를 선택배지에서(DMEM/5% FBS, 1% L-GLU, 1% NaPyr) T-162 플라스크로 쪼개었다. 트랜스펙션 후 약 10 일에, 각 트랜스펙션의 2 개의 150 mm 배양물 디쉬의 메토트렉세이트 내성 콜로니를 트립신 처리했고, 세포를 모았고, T-162 플라스크에 플레이팅했고, 대량 배양에 옮겼다. 실시예 24 에 개시된대로 대규모 배양물로부터 콘디셔닝 배지를 사람의 zalpha11 리간드 폴리펩티드 정제에 사용하였다.

실시예 26

마우스 zalpha11 리간드 트랜스제닉 마우스를 생성시키는 구성물

A. 림프양-특이적 EμLCK 프로모터로부터 마우스 zalpha11 리간드를 발현하 는 구성물

올리고뉴클레오티드를 공통 Kozak 서열 및 마우스 zalpha11 리간드 코딩 영역을 함유하는 PCR 단편을 생성하도록 디자인했다. 이들 올리고뉴클레오티드를 5' 단부에서 FseI 부위 및 3' 단부에서 AscI로 디자인하여 (a) 림프양-특이적 트랜스제닉 벡터 pKO51, 또는 (b) 우리의 표준 트랜스제닉 벡터 pTG12-8로의 클로닝을 용이하게 했다.

PCR 반응을 200ng 마우스 zalpha11 리간드 템플레이트 (SEQ ID NO:55; 실시예 16) 및 올리고뉴클레오티드 ZC23,115 (SEQ ID NO:66) 및 ZC23,116 (SEQ ID NO:67)로 수행했다. PCR 반응을 실시예 22B에 설명된 PCR 조건하에서 Advantage^TM cDNA 폴리머라제 (Clontech)를 사용하여 수행했다. 실시예 22B에 설명된 바와 같이, 분리된 440bp DNA 단편을 분해히고, Fsel 및 AscI로 이미 분해된 pKFO51에 리게이션했다.

각각의 리게이션 반응물 약 1㎕를 전기천공하고, 플레이트하고, 클론을 취하여 실시예 22에 설명된 바와 같은 제한 분해에 의해 사람 zalpha11 리간드 삽입물에 대해 스크리닝했다. 정확한 pKFO51-zalpha11 리간드 클론을 서열화함으로써 입증하고, 이 클론의 맥시프렙을 수행했다. lck 근접 프로모터, 면역글로불린 μ 인핸서, zalpha11 리간드 cDNA, 및 돌연변이된 hGH 유전자를 함유하는 NotI 단편 제조하여, 수정된 뮤린 난모세포안에 미세주사하는데 사용했다.

B. 간-특이적 MT-1 프로모터로부터 마우스 zalpha11 리간드를 발현하는 구성

실시예 26A로부터 동일한 마우스 zalpha11 리간드 삽입물을 실시예 22A에 설명된 바와 같이, pTG12-8에 하위클론했다. 이 구성물에 대해, 약 10mg의 pKFO51-zalpha11 리간드 맥시프렙 DNA를 FseI 및 AscI 조합으로 분해하고, 에탄올 침전시키고, 마우스 zalpha11 리간드 단편을 실시예 22에 설명된 바와 같이 정제했다. 다음에, 이 단편을 실시예 22A에 설명된 바와 같이, FseI 및 AseI로 이미 분해된 pTG12-8에 리게이션했다. 전기천공, 클론의 스크리닝 및 맥시프렙을 실시예 22에 설명된 바와 같이 수행했다. 5' 및 3' 측면 서열, MT-1 프로모터, 래트 인슐린 II 인트론, 마우스 zalpha11 리간드 cDNA 및 hGH 폴리 A 서열을 함유하는 SalI 단편을 제조하여, 수정된 뮤린 난모세포에 미세주사하는데 사용했다.

실시예 27

마우스 zalpha11-리간드 다클론성 항체

다클론성 항체를 2마리의 암컷 뉴질랜드 흰토끼를 정제된 재조합 단백질 muzalpha11L/MBP-6H (실시예 32)로 면역시킴에 의해 제조했다. 토끼 각각에게 3주 마다 처음에 Complete Freund's Aduvant의 200mg의 정제된 단백질을 복강내 (ip) 주사하고, 이어서 부우스터로 Incompelte Freund's Adjuvant의 100mg 펩티드의 ip 주사했다. 두번째 부우스터 (총 3회 주사)의 투여 후 7 내지 10일에, 동물에서 채혈하고, 혈청을 수집했다. 다음에, 동물을 부우스터하고, 3주 마다 채혈했다.

muzalpha11L/MBP-6H 특이적 토끼 혈청을 CNBr-SEPHAROSE g 당 정제된 재조합 말토스 결합 단백질 (MBP) 10mg을 사용하여 제조된 CNBr-SEPHAROSE 4B 단백질 컬럼 (Pharmacia LKB)을 사용하여 항-MBP 항체에 대해 재-흡착시켰다. 재조합 MBP를 만 들고 당업계에 잘 공지된 방법을 사용하여, 하우스에서 아밀로스 칼럼상에 정제했다. muzalpha11-리간드-특이적 다클론성 항체를 특이적 항체 정제된 재조합 단백질 muzalpha11L/MBP-6H (실시예 32) 10mg을 사용하여 제조된 CNBr-SEPHAROSE 4B 단백질 컬럼 (Pharmacia LKB)을 사용하여 토끼 혈청으로부터 친화성 정제하고, 이어서 하룻밤 20× PBS 중에서 투석시켰다. muzalpha11-리간드-특이적 항체를 항체 표적으로서 정제된 재조합 단백질 muzalpha11L/MBP-6H (실시예 32) huzalpha11L-MBP/6H (실시예 32) 1ug/ml를 사용하여 ELISA에 의해 특성화했다. 토끼 항-muzalpha11L/MBP-6H 친화성 정제된 항체의 검출 한계 (LLD)는 그것의 특이적 정제된 재조합 항체 muzalpha11L/MBP-6H 상에서 100pg/ml이었고, 정제된 재조합 huzalpha11L-MBP/6H 상에서 500pg/ml였다.

실시예 28

포유류 발현 벡터 및 CHO DG44 세포에서 발현하는 대규모 사람 zalpha11 리간드의 구성

cDNA의 5' 단부의 SalI 부위 및 3' 단부의 PmeI 부위를 추가하도록 디자인된 사람 zalpha11 리간드 (SEQ ID NO:1)에 대한 포유류 발현 벡터를 올리고뉴크레오티드 프라이머 ZC22,054 (SEQ ID NO:70) 및 ZC22,055 (SEQ ID NO:71)을 사용한 사람 zalpha11 리간드 (실시예 7)을 함유하는 플라스미드로부터의 PCR에 의한 증폭에 의하여 구성했다. PCR 반응 조건은 다음과 같다. 94℃ 4분, 94℃ 45초 25 사이클, 50℃ 45초, 72℃ 3분, 72℃ 10분. PCR 생성물을 본원에 설명된 바와 같이 분리하고, 본원에 설명된 바와 같은 표준 방법을 사용하여, SalI 및 PmeI로 자른 다음 폴리링 커에 있는 적절한 제한 부위에서 이미 잘려진 플라스미드 pDC312에 리게이션했다. 플라스미드 pDC312는 Morris, A. et al., "Expression Augmenting Sequence Element (EASE) isolated from Chinese Hamster Ovary Cells" in Animal Cell Technology, Carrondo, MJT et al (eds.) (1997) Kluwer Academic Publisers, The Netherlands, p. 529-534에 설명되어 있다.

리게이션된 벡터는 제조자의 지시에 따라 LipofectaminePlusTM 시약 (Gibco/BRL)을 사용한 리포펙션에 의해 현탁-조정된 CHO DG44 (Novo Nordisk, Denmark)안에 트랜스펙트되었다. 형질전환체를 티아민, 하이포크산틴이 없는 PFCHO 배지 (JRH, Lenexa, Kansas) 상에서 선택하고, 이어서 200nM 메토트렉세이트 (Sigma, St. Louis, MO) 상에서 선택했다. 메토트렉세이트 내성 세포를 희석하여 클로닝하고, BaF3 활성 분석 (실시예 5B)에 의해 zalpha11 리간드의 생성에 대해 분석했다.

생성된 클론을 대규모화하고, 7 내지 20L 생물반응기 (Applikon Bioreactors, Schiedam, The Netherlands)에서 PFCHO 배지중에서 성장시켜, 정제용 물질을 생성했다 (실시예 29).

실시예 29

BHK 및 CHO 포유류 발현 세포주로부터 태그 미부착 사람 및 마우스 zalpha11 리간드의 대규모 정제

A. CHO 발현 사람 zalpha11 리간드

다르게 명시하지 않는 한, 조작은 4 ℃에서 수행되었다. 하기 방법은 적어도 30 리터의 CHO 컨디셔닝 배지로부터 사람 zalpha11 리간드를 정제하는데 사용되었다 (실시예 28 참조). 농축된 또는 농축되지 않은 컨디셔닝 배지 (CM)를 0.45 및 0.22 미크론 여과지로 멸균여과시켰다. 컨디셔닝 배지는 그 후 0.01 M MES (Fluka BioChemika, Switzerland)로 완충시키고 pH는 6.0으로 조정한 후 50 X 100 mm (196 ml) Poros 50HS 컬럼 (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA로부터의 강한 양이온 교환수지)에 BioCAD SPRINT (PerSeptive Biosystems)를 사용하여 4 내지 10 ml/분으로 밤새 로딩하였다. 컬럼을 0.01 M MES/0.130 M NaCl (Mallinckrodt, Paris, KY), pH6.0으로 10 내지 20 컬럼 부피 (CV)로 세척하였다. 결합된 단백질을 그 후 0.130 M 내지 1 M NaCl 10 CV 구배로 0.01 M Mes pH 6.0으로 30ml/분에서 용리하였다; 25 개의 분획을 전 크로마토그래피 과정에서 수집하여 280 및 215 nM에서 흡광도를 점검하였다. 정점 흡광도인 분획을 SDS-PAGE Silver (Geno Technology, St. Louis, MO), Coomassie (Sigma, St.Louis, MO) 염색 및 사람 zalpha11 리간드에 대하여 웨스턴 면역 블롯에 의하여 분석하였다 (실시예 33 및 실시예 34).

정점 분획을 합하여 그 다음 YM10막 (Millipore/Amicon, Bedford, MA) 상에서 교반 세포농축기에서 소량의 부피가 되도록 (1 내지 10 ml) 농축시켰다. 샘플을 그 후 PBS (Gibco BRL)로 평형화한 적당한 Sephacryl S-200 (Pharmacia, Uppsala, Sweden) 고분해 크기 배제 컬럼 (52 내지 600 ml)상에 1 내지 2 ml/분의 속도로 로딩시켰다; 1 내지 2 ml의 분획을 전체 크로마토그래피 과정을 걸쳐 수집하였고 280 및 215 nM에서 흡광도를 점검하였다. 정점 흡광도인 분획을 SDS-PAGE Silver (Geno Technology, St. Louis, MO), Coomassie (Sigma, St.Louis, MO) 염색에 의하여 분 석하였다.

관심의 분획을 합하여 Millpore 5 kD MWKO 원심분리 농축기로 최소 부피까지 농축시켰다. 최종 산물을 단백질 순도 및 농도에 대하여, SDS-PAGE Coomaxxie 염색(Sigma, St. Louis, MO), 웨스턴 면역 블롯, N-말단 서열결정, 아미노산 분석, 및 BCA (Pierce, Rockford, Illinois)에 의하여 분석하였다.

B. BHK 570 발현 마우스 zalpha11 리간드

다르게 명시하지 않는 한, 조작은 4 ℃에서 수행되었다. 하기 방법은 BHK 컨디셔닝 배지로부터 마우스 zalpha11 리간드를 정제하는데 사용되었다 (실시예 18 참조). 농축된 또는 농축되지 않은 컨디셔닝 배지 (CM)를 0.45 및 0.22 미크론 여과지로 멸균여과시켰다. 컨디셔닝 배지는 그 후 0.01 M MES (Fluka BioChemika, Switzerland)로 완충시키고 pH는 6.0으로 조정하였다. CM을 분석하고, 실시예 29A에 기술한 바와 같이 AS 컬럼 상에 로딩하고 용리시켰다.

관심의 분획을 그 후 실시예 29A에 상기한 바와 같이 원심분리 세포 농축기에서 20 내지 30 ml까지 농축시켰다. pH는 7.0으로 조정한 후 샘플은, 약 3 mg zalpha11-CFLAG 태그된 용해성 리셉터를 가지는 0.8 ml Poros AL 컬럼 (실시예 10B) 또는 BioCAD SPRINT 상에서 1 ml/분에서 수지에 고정화된 (하기 방법 참조) zalpha11-Fc4융합 리셉터 (실시예 10C) 10 mg에 로딩시켰다. 컬럼을 그 후 적어도 20 CV의 0.3 M NaCl/PBS (Gibco BRL)/0.01 M MES로 10 ml/분에서 세척하였다. 컬럼은 그 다음 0.1 M 글리신 (Aminoacetic Acid; Glycocol, Specrtum, Gardena, CA)pH 2.5를 600 ㎕ 주사하여 유속 10 ml/분에서 PBS로 BioCAD SPRINT 상에서 신속하게 용리시켰다. 각각 6 초 동안 1 ml 분획을 수집하였고 pH는 즉시 55 ㎕의 2M TRIS pH 8.8 (Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane, EM Science, Gibbstown, NJ)로 중화시켰다. 전체 크로마토그래피에 걸쳐 280 및 250 nM에서의 흡광도가 점검되었다. 정점 흡광도인 분획을 상기된 바와 같이 SDS-PAGE Silver (Geno Technology, St. Louis, MO), Coomassie (Sigma, St.Louis, MO) 염색 및 웨스턴 면역 블롯에 의하여 분석하였다.

정점 분획을 합한 후 실시예 29A와 같이 원심분리 세포 농축기에서 최소 부피 (1 내지 10 ml)로 농축시켰다. 샘플은 그 후 실시예 29A와 같이 적당한 Sephacryl S-200 (Pharmacia) 고분해능 크기 배지 컬럼 상에서 로딩시키고, 평형화하고, 분석되었다. 정점 분획은 SDS-PAGE Silver (Geno Technology, St. Louis, MO), Coomassie (Sigma, St.Louis, MO) 염색에 의하여 분석하였다. 관심의 분획을 합하여 농축시키고 실시예 29A와 같이 분석하였다.

C. POROS AL 배지 상에 단백질 고정화

모든 조작은 실온에서 2 M NaCl 내 POROS AL 배지가 채워진 4.5 X 40 mm 컬럼 BioCAD 700E. Flow 상에서 제조자의 명세에 따라 수행되었다. 컬럼은 그 후 1.1 M Na₂SO₄ 및 50 mM NaPhosphate pH 7.2로 평형화되었다. 리셉터는 Millipore 30 kD MWKO 원심분리 농축기를 사용하여 4 mg/ml로 농축시킨 후 1.1 M Na₂SO₄ 및 50 mM NaPhosphate pH 7.2로 1:1로 희석하였다. 컬럼은 1.1 M Na₂SO₄ 및 50 mM NaPhosphate pH 7.2로 2 ml/분에서 유동되었고 희석된 리간드 100 ㎕ 주사가 9 CV 로 포화 평형상태 또는 반전에 이르기까지 수행되었다. 5 mg/ml 나트륨 시아노보로히라이드와 함께 1.1 M Na₂SO₄ 및 50 mM NaPhosphate pH 7.2부터 550 mM Na₂SO ₄ 및 50 mM NaPhosphate pH 7.2 까지의 62 CV 구배를 그 후 작동시켰다. 컬럼을 2 시간동안 유지시켜 고정화 화학을 완성시켰다. 컬럼을 그 후 5 mg/ml 나트륨 시아노보로히라이드와 함께 0.2M TRIS pH 7.2로 평형화시키고 1 시간 동안 놓아두었다. 최종적으로, 컬럼을 0.02 M 나트륨아지드와 함께 PBS에서 평형화시킨 다음 사용할 때까지 4 ℃에서 저장하였다. 사용전에, 컬럼을 0.1 M 글리신으로 사전-용리시켜 비-특이적 단백질이 제거된 것과 컬럼이 고정화된 리셉터를 삼출하지 않는 것을 확인하였다.

실시예 30

발현 벡터 제조, 태그되지 않은 사람 및 마우스 zalpha11 리간드의 배큘로바이러스로부터의 발현 및 정제

A. 사람 zalpha11리간드의 배큘로바이러스에서의 발현용 구성물

곤충세포에서 사람 zalpha11 리간드 폴리펩티드를 발현하기 위하여 발현 벡터인 pzalpha11L을 제조하였다. 사람 zalpha11 리간드에 대한 서열을 함유하고 BamH1 및 XhoI 제한 부위를 각각 5' 및 3' 말단에서 코딩하는 517 bp 단편을, 사람 zalpha11 리간드 cDNA (실시예 7)를 함유하는 플라스미드로부터 프라이머 ZC23,444(SEQ ID NO:74) 및 ZC23,445 (SEQ ID NO:75)를 사용한 PCR 증폭에 의하여 제조하였다. PCR 반응 조건은 하기와 같았다: 4 분 동안 94 ℃ 1 사이클에 이어서, 45 초 동안 94 ℃, 45 초 동안 50 ℃, 및 2 분 동안 72 ℃의 25 사이클; 이어서 4 ℃에서 냉각. 단편은 겔 전기영동 (1 % Seaplaque/1 % NuSieve)에 의하여 가시화되었다. 밴드를 절단하고, 0.5 % 한천이 되도록 2 mM MgCl₂로 희석하고 65 ℃에서 융해시키고, BamH1 및 XhoI (Boerhinger Mannheim)로 가수분해시키고, BamH1/XhoI 가수분해된 배큘로바이러스 발현 벡터 pZBV3L와 리게이션시켰다. pZBV3L 벡터는 폴리헤드린 프로모터가 제거되고 후기 활성화 Basic Priotein Promoter로 교체된 pFastBacl^TM (Life Technologies) 발현 벡터의 변형체이다. 약 14 ng의 제한 절단된 zalpha11 리간드 삽입체와 약 40 ng의 대응하는 벡터를 밤새 16 ℃에서 리게이션 시켰다.

리게이션 혼합물을 TE (10 mM Tris-HCl, pH 7.5 및 1 mM EDTA)로 3배 희석시키고 약 4 fmol의 희석된 리게이션 혼합물을 DH5αLibrary Efficiency 컴피턴트 세포 (Life Technologies)에 제조자의 지시에 따라 42 ℃ 수욕에서 45 초간의 열 쇼크에 의하여 형질전환시켰다. 형질전환된 DNA 및 세포를 450 ㎕ SOC 배지 (2 % Bacto^TM 트립톤, 0.5 % Bacto Yeast Extract, 10 ml 1 M NaCl, 1.5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄ 및 20 mM 포도당)에 희석하여 100 ㎕/ml 암피실린을 함유하는 LB 평판에 플레이팅 하였다. 클론을 제한효소 절단으로 분석하고, 제조자의 지시에 따라서 상기 기술한 것과 같이 열적 충격법으로 1㎕의 양성 클론으로 DH10Bac Max Efficiency 컴피턴트 세포(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)를 형질전환하였다. 형질 전환된 세포를 980㎕의 SOC 배지(2% Bacto^TM 트립토판, 0.5%Bacto^TM 효모 추출액, 10㎖ 1M NaCl, 1.5mM KCl, 10mM MgCl₂, 10mM MgSO4 및 20mM 포도당)에 희석시키고, 37°C 교반 배양기에서 4시간동안 배양시키고 50㎍/㎖의 가나마이신, 7㎍/㎖의 겐타마이신(Life Technologies), 10㎍/㎖의 테트라싸이클린, IPTG(Pharmacia Biotech) 및 Bluo-Gal(Life Technologies)을 함유하는 Luria 한천 평판에 플레이팅하였다. 사람 zalpha11 리간드를 코딩하는 공여 삽입체가 플라스미드("bacmid"로 지칭)를 갖는 세포를 색 선별법을 이용하여 동정되었다. 백색의 이러한 콜로니를 분석용으로 선택하였다. 제조자의 지시에 따라서 QiaVac Miniprep8 system(Qiagen)을 이용하여 사람 zalpha11 리간드 Bacmid DNA를 분리하였다. 이동성 인자(transposable element)에 대한 프라이머 ZC447(SEQ ID NO:76) 및 ZC976(SEQ ID NO:77)을 이용한 PCR을 이용한 DNA증폭으로 적당한 삽입체를 갖는 클론을 스크리닝하였다. PCR 반응은 다음과 같이 수행되었다: 94°C에서 45초, 50°C에서 45초, 및 72°C에서 5분의 35 사이클; 72°C에서 10분의 1사이클; 4°C로의 냉각. PCR생성물을 1% 한천 겔상에서 삽입체 크기를 확인하기 위해 분리하였다. 올바른 삽입체를 갖는 클론을 Spodoptera frugiperda(Sf9) 세포를 트랜스펙션하는데 사용하였다.

B. 배큘로바이러스로부터 사람 zalpha11 리간드의 정제를 위한 물질의 발현 및 제조

Sf9세포를 5 x 10⁶세포/35㎜ 평판에 접종하고 27°C에서 1시간동안 부착하도록 하였다. 사람 zalpha11 리간드 bacmid DNA(상기) 5㎕를 100㎕의 Sf-900Ⅱ SFM(Life Techonologies)에 희석하였다. 6㎕의 CellFECTIN 반응액(Life Technologies)을 100㎕의 Sf-900Ⅱ SFM과 희석하였다. bacmid DNA 및 지질 용액을 부드럽게 혼합하고 실온에서 30 내지 45분간 배양하였다. 세포 평판중 하나의 배지를 흡입하고, 세포를 2㎖의 신선한 Sf-900Ⅱ SFM으로 1x 세척하였다. 세척 배지를 흡입하고 DNA-지질 혼합을 세포에 첨가하였다. 세포를 27°C에서 4-5시간 항온처리하였다. DNA-지질 혼합을 흡입하고 2㎖의 Sf-900Ⅱ 배지를 각 평판에 첨가하였다. 바이러스를 수집 후 27°C, 90% 습도에서 96시간동안 평판을 배양하였다.

일차 증폭을 위하여, Sf9세포는 125㎖ 진탕 플라스크에서 50㎖의 Sf-900Ⅱ SFM에서 약 0.41 내지 0.52 x 10⁵세포/㎖의 밀도까지 성장되었다. 그 후에 당업계에 공지된 표준 기술에 따라서 150㎕의 상기로부터의 바이러스 원액으로 이들을 감염시키고 바이러스를 27°C에서 3일간 배양한 후 수집하였다. 500㎕ 샘플를 BaF3 분석(실시예5)로 생물학적 활성이 있는가를 알아내기 위해 이용하였다.

2차 증폭을 위하여, Sf9세포를 2800㎖ 플라스크안에서 1ℓ의 Sf-900Ⅱ SFM에서 약 0.5 x 10⁵세포/㎖의 밀도까지 성장시켰다. 그 후에 당업계에 공지된 표준 기술에 따라서 500㎕의 상기로부터의 바이러스 원액으로 이들을 감염시키고 바이러스를 27°C에서 4일간 배양한 후 수집하였다. 바이러스의 역가를 결정하고 실시예30C 및 실시예30D(하기)와 같이 사람 zalpha11 리간드(huzalpha11-Bv)의 정제를 위하여 대량으로 배양하였다.

C. 배큘로바이러스에서 발현시킨 사람/마우스 zalpha11 리간드의 대규모 정 제

다르게 명시하지 않으면, 모든 과정은 4°C에서 수행되었다. BV 조절 배지(실시예30B)로부터 사람 zalpha11 리간드(huzalpha11-Bv)의 정제를 위하여 다음의 방법을 사용하였다. 조절된 배지(CM)을 0.45 및 0.22 ㎛ 여과지로 멸균 여과를 하고, 0.01M MES(Fluka BioChemika, Switzerland)로 완충화하고 pH를 6.0으로 조절하였다. 그 후에 실시예29A와 같이 CM을 POROS 50 HS 컬럼에 로딩, 진행, 분획 수집, 분석하였다.

상기 정점 분획을 수집하고, 실시예29A와 같이 농축하여 고해상 크기배제 컬럼을 수행하고 분석하였다.

크기배제컬럼으로부터의 관심의 분획을 수집하고, 5kD MWCO Millipore 원심분리 회전 농축기로 최소 부피로 농축하였다. 최종 제조물을 SDS-PAGE 쿠마시(Sigma, St.Louis, MO), 웨스턴 면역 블롯, N-말단 서열결정, 아미노산 분석 및 단백질 순도 및 농도를 위한 CB(Pierce, Rockford, Illinois) 실시예29A와 같이 수행하고, 대량 단백질을 -80°C에 보관하였다.

D. 배큘로바이러스-발현된 사람/마우스 zalpha11 리간드의 소규모(<2mg) 정제

다르게 명시하지 않으면, 모든 과정은 4°C에서 수행되었다. BV 조절된 배지(실시예30B)로부터 사람 또는 마우스 zalpha11 리간드(huzalpha11-Bv) <2mg의 정제를 위하여 다음의 절차를 사용하였다. 실시예30C와 같이 CM을 여과하고, 완충시키고, pH를 조절하였다. 실시예30과 같이 CM을 POROS 50 HS 크로마토그래피에 로 딩하고 용리시켰다.

분획을 합한 후, YM10 여과막(10kD MWCO)(Millipore/Amicon, Bedford, MA) 교반 세포 농축기로 원심여과시켜 소량의 부피(20 내지 30㎖)로 농축시켰다. pH를 7.0으로 조절하고, 샘플를 약 3mg의 zalpha11CFLAG 용해성 리셉터(실시예10B)를 갖는 0.8㎖ Poros AL 컬럼, 또는 BioCad SPRINT상 1㎖/분에서 약10mg의 zalpha11-Fc4 융합 용해성 리셉터(실시예10C)가 고정된 수지에 로딩하였다. 그 후에 컬럼을 20CV의 0.3M NaCl/PBS(Gibco BRL)/0.01M MES로 10㎖/분으로 세척하였다. 그리고 컬럼을 BioCAD SPRINT상에서 10㎖/분의 속도로 600㎕의 0.1M 글리신(Aminoacetic Acid; Glycocol, Spectrum, Gardena, CA)pH 2.5로 PBS와 함께 용리시켰다. 6초동안 1㎖씩 각각 수집하고 55㎕의 2M TRIS(Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane, EM Science, Gibbstown, NJ)pH8.8로 즉시 중화시켰다. 전체 크로마토그래피를 통하여 280 및 215nm에서의 흡광도를 관찰하였다. 분획을 상기와 같이 분석하였다.

정점 분획을 수집하고, YM10 여과막(10kD MWCO)(Millipore/Amicon, Bedford, MA) 교반 세포 농축기로 원심여과시켜 1 내지 2㎖로 농축시켰다. 그 후에 샘플을 최적의 유속에서 PBS(Gibco BRL)로 평형화된 적당한 Sephacryl S-200(Pharmacia, Uppsala. Sweden) 고해상 크기배제컬럼에 로딩하였다; 전제 크로마토그래피동안 분획을 수집하고 280 및 215nm의 흡광도를 관찰하였다. 분획은 상기와 같이 분석하였다.

관심의 분획을 수집하고, 5kD MWCO Millipore 원심회전 농축기로 정상 부피로 농축시켰다. 최종 제조물을 그 후 SDS-PAGE 쿠마시(Sigma, St.Louis, MO), 웨스 턴 면역 블롯, N-말단 서열결정, 아미노산 분석 및 단백질 순도 및 농도를 위한 CB(Pierce, Rockford, Illinois)를 수행하여 분석하였다. 대량 단백질을 상기와 같이 보관하였다.

E. 배큘로바이러스에서 마우스 zalpha11 리간드의 발현을 위한 구성물:pzalpha11lig.M

곤충세포에서 마우스 zalpha11 리간드 폴리펩티드의 발현을 위해 발현 벡터, pzalpha11LM을 제조하였다. 제조자의 지시에 따라서, Expand High Fidelity PCR System(Boerhinger Manheim)을 사용하여 프라이머 ZC25,970(SEQ ID NO:109) 및 프라이머 ZC25,969(SEQ ID NO:110)을 이용하여 마우스 zalpha11 리간드 cDNA(실시예16)을 함유하는 플라스미드로부터 마우스 zalpha11 리간드의 서열을 포함하고 5' 및 3'말단에 BspE1 및 XBA1 제한효소 인식 부위를 코딩하는 413bp를 제조하였다. PCR조건은 다음과 같다. 94°C에서 2분의 1 사이클, 뒤이어 94°C에서 15초, 50°C에서 30초, 및 72°C에서 2분의 35 사이클; 72°C에서 10분의 1 사이클; 뒤이은 4°C로의 냉각. PCR 생성물의 작은 부분을 겔 전기영동(1% NuSieve 한천)으로 가시화하였다. 제조자 지시에 따라서, 잔여 단편을 Qiagen PCR 정제 키트로 정제하고, 30㎕의 물로 용리시켰다. 그 후에, 단편을 Bspe1 및 Xba1(Boerhinger Manheim) 제한효소로 37°C에서 2시간 절단한 후, 상기와 같이 한천 겔에 전개시켰다. 밴드를 잘라내고, 제조자 지시에 따라서 Qiagen 겔 추출 키트를 이용하여 정제 및 용리시켰다. 정제된 단편을 Bspe1/Xba1으로 절단된 배큘로바이러스 발현 벡터, pZBV37L에 삽입하였다. pZBV37L는 pFastBac1^TM발현 벡터(Life Technologies)가 폴리헤드론 프로모터를 제거하고 늦은 활성화 기초 단백질 프로모터 및 뒤이은 Ecdysteroid UDP-Glucosyltransferase(EGT)로부터의 분비 신호로 대체시켜 변형된 것이다. 약 5㎕의 제한효소 절단된 마우스 zalpha11 리간드 삽입체 및 약 100ng의 대응하게 절단된 벡터가 20㎕에서 16°C로 밤새 리게이션시켰다. 2㎜의 큐벳에서 2kV, 25μF 및 400오옴 세팅으로 5㎕의 리게이션 혼합물을 50㎕의 Life Techonologies DH12S 전기적컴피턴트 박테리아 세포에 전기천공시켰다. 전기천공된 세포를 1㎖의 SOC 배지(2% Bacto^TM 트립톤, 0.5% Bacto Yeast Extract, 10㎖ 1M NaCl, 1.5mM KCl, 10mM MgCl₂, 10mM MgSO₄ 및 20mM 포도당(Gibco BRL)에서 37°C로 1시간 배양후, 100㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 LB 평판에 플레이팅하였다. 클론으로부터 DNA를 분리하고 양성 클론을 동정하기 위해 제한효소절단으로 분석하였다. 양성 클론으로부터 약 5ng DNA로 제조자 지시에 따라서 42°C 수욕에서 45초의 열 충격으로 20㎕ DH10Bac Max Efficiency 컴피턴트 세포(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)를 형질 전환시켰다. 실시예30A에서와 같이 형질전환된 세포를 희석하고 배양하였다. 실시예30A와 같이 마우스 zalpha11 리간드 삽입체를 함유하는 Bacmid를 동정하고 분리하였다. bacmid의 이동 인자(transposable element)에 대한 프라이머 ZC447(SEQ ID NO:76) 및 프라이머976(SEQ ID NO:77)을 사용하여 PCR로 DNA를 증폭시켜서 올바른 삽입체를 갖는 클론을 스크리닝하였다. PCR반응을 다음과 같이 수행하였다: 94°C에서 45초, 50°C에서 45초, 및 72°C에서 5분의 35사이클; 72°C에 서 10분의 1사이클; 뒤이은 4°C로의 냉각. PCR생성물을 1%한천 겔에서 분리하여 삽입체 크기를 확인하였다. 적당한 삽입체를 갖는 것들로 Spodoptera frugiperda(Sf9)세포를 형질전환시켰다.

F. 배큘로바이러스로부터 마우스 zalpha11 리간드의 정제를 위한 물질의 발현 및 생산

Sf9세포를 1,000,000세포/35㎜로 평판에 접종하고 27°C에서 1시간동안 부착하도록 하였다. 마우스 zalpha11 리간드 bacmid DNA로 실시예30B와 같이 트랜스펙션시키고, 바이러스를 수집하였다.

1차 증폭을 위하여, Sf9세포를 상기와 같이 접종하고, 트랜스펙션시킨후 72시간이 경과한 500㎕의 상층액을 첨가하고 96시간동안 배양이 진행되도록 하고, 그 후에 표준 방법에 따라서 바이러스를 수집하였다.

2차 증폭을 위하여, Sf9세포를 상기와 같이 접종하고, 200㎕의 1차 바이러스 원액을 첨가하였다. 배양을 72시간동안 27°C에서 배양하고, 그 후에 표준 방법에 따라서 바이러스를 수집하였다.

3차 증폭을 위하여, 250㎖ 부피의 진탕 플라스크에 50㎖의 SF900Ⅱ 배지에서 웰 당 500,000세포인 Sf9세포에 10㎕의 2차 증폭 바이러스 원액을 6일간 배양한 후 상기와 같이 바이러스를 수집하였다. 실시예30C 및 실시예30D에 기술된 바와 같이 바이러스의 역가를 결정하고, 배큘로바이러스-생산된 마우스 zalpha11 리간드 (muzalpha11L-Bv)의 정제를 위하여 대량배양하였다.

항-muzalpha11/MBP-6H 다클론 항체(실시예27)을 이용한 웨스턴 분석으로 예 상되는 분자량 단백질의 상층액에서의 존재를 확인하였다. BaF3 기초한 증식 분석(실시예5) 역시 분비된 리간드가 활성이 있음을 보였다.

실시예 31

E.콜라이( 대장균 ) 에서의 사람 및 마우스 zalpha11 리간드의 발현

A. 사람 zalpha11 리간드- MBP 융합 발현 벡터 PTAP98/zalpha11 리간드의 제작

말토스 결합 단백질(MBP)에 N-말단이 융합된 사람 zalpha11 리간드의 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 플라스미드가 상동성 재조합을 통하여 제조되었다. 사람 zalpha11 리간드 cDNA의 단편 (SEQ ID NO:1)이 PCR을 사용하여 분리되었다. 사람 zalpha11 리간드 단편의 PCR 반응 생산에 두개의 프라이머가 사용되었다: (1) 벡터의 양쪽 인접 서열 40 bp 및 사람 zalpha11 리간드의 아미노 말단에 대응하는 26 bp를 함유하는 프라이머 ZC22,128 (SEQ ID NO:78) (2) 벡터의 양쪽 인접 서열에 대응하는 3' 말단 40 bp 및 사람 zalpha11 리간드의 카르복실 말단에 대응하는 28 bp를 함유하는 프라이머 ZC22,127 (SEQ ID NO:79). PCR 반응 조건은 하기와 같았다: 30 초 동안 94 ℃, 30 초 동안 50 ℃, 및 1 분 동안 72 ℃의 25 사이클; 이어서 4 ℃에서 냉각, 반복하여 실행함. 100 ㎕ PCR 반응물의 2 ㎕를 분석 용으로 1.0 % 한천 겔 상에서 1 x TBE 완충액과 함께 전개시켰고, 약 472 bp의 예상되는 밴드를 확인하였다. 남은 90 ㎕의 PCR 반응물은, 하기된 바대로, SmaI으로 잘린 수용 벡터 pTAP98 내로 재조합되어 MBP-zalpha11 리간드 융합체를 코딩하는 구성물을 제조하는데 사용될 400 ㎕ 순수 알콜로 침전된 제 2의 PCR 시험관에 배합시켰다.

플라스미드 pTAP98는 플라스미드 pRS316 및 pMAL-c2로부터 유래하였다. 플라스미드 pRS316은 사카로마이세스 세레비시아 (Saccharomyces derevisiae) 셔틀 벡터이다 (Hieter P. 및 Sikorski, R., Genetics 122:19-27, 1989). pMAL-c2 (NEB)는 E.콜라이 (대장균) 발현 플라스미드이다. 그것은 His 태그, 트롬빈 절단 부위, 클로닝 자리, 및 rrnB 터미네이터로 이어지는, (MBP를 코딩하는 유전자인) MalE를 조종하는 tac 프로모터를 운반한다. 벡터 pTAP98은 효모 상동성 재조합을 사용하여 제조되었다. 100 ng의 EcoRI 절단 pMAL-c2가 1 ㎍의 PvuI 절단 pRS316, 1 ㎍ 링커 및 1 ㎍의 ScaI/EcoRI 절단 pRS316과 재조합되었다. 링커는 PCR 반응에서 올리고 ZC19,372 (SEQ ID NO:80)(100 pmol): ZC19,351 (SEQ ID NO:81)(1 pmol): ZC19,352 (SEQ ID NO:82)(1 pmol): ZC19,371 (SEQ ID NO:83)(100 pmol)로 배합되어 구성되었다. 조건은 다음: 30 초 동안 94 ℃, 30 초 동안 50 ℃, 및 30 초 동안 72 ℃의 10 사이클; 이어서 4 ℃에서 냉각과 같았다. PCR 생성물은 100 % 알콜 침전을 통하여 농축되었다.

100 ㎕의 효모 컴피턴트 세포 (S. cerevisiae)를 약 1 ㎍ 사람 zalpha11 리간드 PCR 생성물과 100 ng SmaI 절단 pTAP98 벡터를 함유하는 10 ㎕ 혼합물에 배합하였고 0.2 cm 전기천공 큐벳에 옮겼다. 효모/DNA 혼합물에 0.75 kV (5 kV/cm), 무한 오옴, 25 ㎌에서 전기펄스를 가하였다. 각 큐벳에 대하여 600 ㎕의 1.2 M 솔비톨을 첨가하였다. 효모는 그 후 두 개의 300 ㎕ 알리쿼트로 두 개의 URA D 평판에 프레이팅하고 30 ℃에서 항온처리하였다.

약 48 시간 이후, 단일 평판으로부터의 Ura+ 효모 형질전환체를 1 ml H₂O에 재현탁시키고 단기간 회전시켜 효모 세포를 펠렛화하였다. 세포 펠렛을 1 ml 용균 완충액 (2 % Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA)에 재현탁시켰다. 500 ㎕ 용균 혼합물을 300 ㎕ 산 세척 유리 비드 및 200 ㎕ 페놀-클로로포름을 함유하는 Eppendorf 시험관에 첨가하고, 1 분 간격을 두고 두세차례 와동시킨 다음 Eppendorf 원심분리기에서 최고속도로 5 분 회전시켰다. 300 ㎕ 수성 상을 신선한 시험관에 옮기고 DNA는 600 ㎕ 에탄올 (EtOH)로 침전시킨 다음 이어서 4 ℃에서 10 분 동안 원심분리시켰다. DNA 펠렛을 100 ㎕ H₂O에 재현탁시켰다.

일렉트로컴피턴트 대장균 세포 (MC1061, Casadaban et. al. J. Mol. Biol. 138, 179-207)의 형질전환이 1 ㎕ 효모 DNA 제조물 및 40 ㎕ MC1061 세포로 수행되었다. 세포에 2.0 kV, 25 ㎌ 및 400 오옴에서 전기펄스를 가하였다. 전기천공 후, 0.6 ml SOC (2 % Bacto^TM 트립톤 (Difco, Detroit, MI), 0.5 % 효모 추출물 (Difco), 10 mM NaCl, 2.5 mM KCL, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄, 20 mM 포도당)가 하나의 알리쿼트로 LB AMP 평판 (LB 육즙 (Lennox), 1.8 % Bacto^TM Agar(Difco), 100 mg/L 암피실린) 상에 플레이팅 되었다.

사람 zalpha11 리간드에 대한 올바른 발현 구성물을 포함하는 각 개별 클론은 발현에 의하여 확인되었다. 세포를 100 ㎍/ml 암피실린을 포함하는 Superbroth II (Becton Dickinson)에서 밤새 성장시켰다. 50 ㎕의 밤새동안의 배양물을 신선한 Superbroth II + 100 ㎍/ml 암피실린 2 ml로의 접종물로 사용하였다. 배양물은 37 ℃에서 2시간동안 진탕배양되었다. 1 ml 배양물은 1 mM IPTG로 유도하였다. 2 내지 4 시간 후에 250 ㎕의 각 배양물을 250 ㎕ 산세척 유리 비드 및 250 ㎕의 5 % βME와 염료(8M 요소, 100 mM Tris pH 7.0, 10 % 글리세롤, 2 mM EDTA, 5 % SDS)를 포함하는 Thorner 완충액과 혼합하였다. 샘플을 1 분간 와동시키고 5 내지 10 분 동안 65 ℃까지 가열하였다. 래인 당 20 ㎕ 를 4 % 내지 12 % PAGE 겔 (NOVEX) 상에 로딩하였다. 겔은 1XMES 완충액에서 전개하였다. 양성 클론은 pTAP126로 표시되고 서열 분석을 받았다. pTAP126 내의 MBP-사람 zalpha11 리간드 융합체의 폴리뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO:84에 나타나고 대응하는 폴리펩티드는 SEQ ID NO:85에 나타난다.

B. 사람 zalpha11 리간드의 박테리아 발현

서열 결정 DNA의 1 ㎕가 균주 W3110(ATCC)에 사용되었다. 세포에 2.0 kV, 25 ㎌ 및 400 오옴에서 전기펄스를 가하였다. 전기천공에 이어, 0.6 ml SOC (2 % Bacto^TM 트립톤 (Difco, Detroit, MI), 0.5 % 효모 추출물 (Difco), 10 mM NaCl, 2.5 mM KCL, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄, 20 mM 포도당)가 하나의 알리쿼트로 LB AMP 평판 (LB 육즙 (Lennox), 1.8 % Bacto^TM Agar(Difco), 100 mg/L 암피실린) 상에 플레이팅 되었다.

각 개체는 발현되었다. 세포를 100 ㎍/ml 암피실린을 포함하는 Superbroth II (Becton Dickinson)에서 밤새 성장시켰다. 50 ㎕의 밤새동안의 배양물을 신선한 Superbroth II + 100 ㎍/ml 암피실린 2 ml로의 접종물로 사용하였다. 배양물은 37 ℃에서 2시간동안 진탕배양되었다. 1 ml 배양물은 1 mM IPTG로 유도하였다. 2 내지 4 시간 후에 250 ㎕의 각 배양물을 250 ㎕ 산세척 유리 비드 및 250 ㎕의 5 % βME와 염료(8M 요소, 100 mM Tris pH 7.0, 10 % 글리세롤, 2 mM EDTA, 5 % SDS)를 포함하는 Thorner 완충액과 혼합하였다. 샘플을 1 분간 와동시키고 5 내지 10 분 동안 65 ℃까지 가열하였다. 래인 당 20 ㎕ 를 4 % 내지 12 % PAGE 겔 (NOVEX) 상에 로딩하였다. 겔은 1XMES 완충액에서 전개하였다. 양성 클론을 huzalpha11L/MBP-6H융합체 단백질의 단백질 정제용 배양에 사용하였다 (실시예 32, 하기).

C. 마우스 zalpha11 리간드-MBP 융합체 발현 벡터 pTAP98/마우스 zalpha11 리간드

말토스 결합 단백질(MBP)에 N-말단이 융합된 마우스 zalpha11 리간드의 일부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 플라스미드를, 실시예 31A에 기술된 바와 같이, 상동성 재조합을 통하여 제조하였다. 마우스 zalpha11 리간드 cDNA의 단편 (SEQ ID NO:55)이 PCR을 사용하여 분리되었다. 마우스 zalpha11 리간드 단편의 PCR 반응 생산에 두개의 프라이머가 사용되었다: (1) 벡터의 양쪽 인접 서열 40 bp 및 마우스 zalpha11 리간드의 아미노 말단에 대응하는 24 bp를 함유하는 프라이머 ZC22,849 (SEQ ID NO:86) (2) 벡터의 양쪽 인접 서열에 대응하는 3' 말단 40 bp 및 마우스 zalpha11 리간드의 카르복실 말단에 대응하는 21 bp를 함유하는 프라이머 ZC22,850 (SEQ ID NO:87). PCR 조건은 상기된 바와 같았다. 약 450 bp 단편이 상기된 대로 pTAP98 내로 클로닝되었다. 클론이 형질전환되고, 확인되고 그리고 상기된대로 배양되었다. 양성 클론은 pTAP134로 표시되었고 서열 분석을 받었다. pTAP134 내의 MBP-마우스 zalpha11 리간드 융합체의 폴리뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO:88에 나타나고 대응하는 폴리펩티드는 SEQ ID NO:89에 나타난다. 양성 클론은 상기된 바대로 muzalpha11L/MBP-6H 융합체 단백질의 단백질 정제용으로 대장균에서 배양되는데 사용되었다.

실시예 32

zalpha11-MBP 리간드 또는 zalpha11-MBP 리셉터의 정제

다르게 명시되지 않는 한, 모든 조작은 4 ℃에서 수행되었다. 하기 방법은 대장균로부터의 사람 zalpha11-MBP 리간드 (huzalpha11/MBP-6H) 또는 마우스의 zalpha11-MBP 리간드 (muzalpha11/MBP-6H)에 대한 zalpha11-MBP 리간드 융합체를 정제하는데 사용되었다. 사람 또는 마우스 zalpha11-MBP 리셉터 융합은 동일한 방법을 사용하여 수행되었다. 사전-회전시킨 동결 대장균 덩어리를 해동시키고 2 L의 완충액 B (0.02 M TRIS (EM Science); 0.2 M NaCl (Mallincrodt); 0.01 M 2-메르캅토-에탄올 (EM Science); pH 8.0; 5 mg/l 펩스타틴 A (Boerhinger Mannheim); 5 mg/l 아프로티닌 (Boerhinger Mannheim); 및 1 mg/l PMSF (Fluka)) + 소포제인 AF289 소포제 (Sigma)로 희석시켰다. 혼합물은 사전-냉각된 Fresh Press 세포 분쇄기 (Constant Systems LTD)에서 20 내지 30 kPSI로 처리되었다.

세포용해물은 그 후 18,000 x g로 45 분 동안 4 ℃에서 원심분리시켰고; 상층액을 보관하였다. 완충액 A (TRIS (EM Science); 0.2 M NaCl (Mallincrodt); 0.01 M 2-메르캅토에탄올 (EM Science); pH 8.0)로 사전-평형화된 아밀로스 수지 200 ml 슬러리 (New England BioLabs)를 세포용해물에 첨가하고 롤러 병 내에서 밤새 항온처리하여 MBP 융합 단백질의 최대 회분식 흡착을 허용하였다. 수지는 회분식 컬럼형으로 ≥5 컬럼 부피로 완충액 A로 세척한 후 완충액 C (완충액 A와 0.02 M 말토스 (Sigma))로 회분식으로 용리시켰다. 원 분획을 수집하여 흡광도 280 nm로 점검하였다.

용리된 단백질을 SDS NuPAGE (NOVEX) Coomassie (Sigma) 염색에 의하여 분석하였다. 샘플과 전체 단백질을 -80 ℃에서 저장하였다.

실시예 33

사람 zalpha11 리간드 다클론 항체

사람 zalpha11 리간드에 대한 다클론 항체가, 2 마리의 암컷 뉴질랜드 백색 토끼를 정제된 재조합 단백질 huzalpha11L/MBP-6H (실시예 32) 또는 정제된 CHO 재조합 단백질 huzalpha11L-CHO (실시예 29)로 면역화하여 제조되었다. 토끼를 각각 완전 Freund's 아주반트 내 200 mg 정제된 단백질로 최초 복강내(ip) 주사하고 이어서 3 주마다 불완전 Freund's 아주반트 내 100 mg 정제된 단백질로 추가 ip 주사하였다. 제 2 추가 주사 (총 3회 주사) 후 제 7 내지 10 일에 동물을 채혈하고 혈청을 수집하였다. 동물을 그 후 매 3 주마다 추가접종시키고 채혈하였다.

huzalpha11L/MBP-6H에 대하여 제조된 토끼 혈청을, CNBr-SEPHAROSE 4B (Pharmacia) 그람 당 10 mg의 정제된 재조합 MBP를 사용하여 준비된 CNBr-SEPHAROSE 4B 단백질 컬럼 (Pharmacia LKB)을 사용하여 항-MBP 항체로 사전-흡착시 켰다. 재조합 MBP는 당업계 주지의 방법을 사용하여 제체적으로 아밀로스 컬럼 상에서 제조되고 정제되었다. huzalpha11-리간드-특이적 다클론 항체를, CNBr-SEPHAROSE 그람 당 특이 항원 정제 재조합 단백질 huzalpha11L-MBP-6H 10 mg 또는 정제 재조합 단백질 huzalpha11L-CHO 10 mg을 사용하여 준비된 CNBr-SEPHAROSE 4B 단백질 컬럼 (Pharmacia LKB)을 사용하고, 이어서 PBS에서 20X 투석함에 의하여 토끼 혈청으로부터 친화성 정제하였다. huzalpha11-리간드-특이적 항체는, 1 ㎍/ml 정제 재조합 단백질 huzalpha11L-MBP-6H (실시예 32), 사람 zalpha11 리간드 (huzalpha11L-CHO), 또는 muzalpha11L-MBP-6H (실시예 32)를 항체 표적으로 사용한 ELISA에 의하여 성질 결정되었다.

토끼 항-huzalpha11L-MBP-6H 친화성 정제된 항체의 검출 하한계 (LLD)는 특이적으로 정제된 재조합 항원 huzalpha11L-MBP-6H에 대하여 10 ng/ml, 정제된 재조합체 huzalpha11L-CHO에 대하여 500 pg/ml, 및 정제된 재조합 muzalpha11L-MBP-6H (실시예 32)에 대하여 100 pg/ml이었다. 토끼 항-huzalpha11L-CHO 친화성 정제된 항체의 LLD는 특이적으로 정제된 재조합 항원 huzalpha11L-CHO에 대하여 20 pg/ml, 정제된 재조합체 huzalpha11L-MBP-6H 상에서 500 pg/ml, 및 정제된 재조합 muzalpha11L-MBP-6H에 대하여 50 ng/ml이었다.

실시예 34

사람 zalpha11 리간드 항-펩티드 항체

다클론 사람 zalpha11 리간드 항-펩티드 항체는 2 마리의 암컷 뉴질랜드 백색 토끼를 사람 zalpha11 리간드 펩티드인 huzalpha11L-1 (SEQ ID NO:72) 또는 huzalpha11L-3 (SEQ ID NO:73)으로 면역화하여 제조되었다. 펩티드는 Applied Biosystems Model 431A 펩티드 합성기 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 합성하였다. 펩티드는 그 후 말레이미드-활성화로 담체 단백질 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)에 융합시켰다. 토끼를 각각 완전 Freund's 아주반트 내 200 mg 정제된 단백질로 최초 복강내(ip) 주사하고 이어서 3 주마다 불완전 Freund's 아주반트 내 100 mg 정제된 단백질로 추가 ip 주사하였다. 제 2 추가 주사 (총 3회 주사) 후 제 7 내지 10 일에 동물을 채혈하고 혈청을 수집하였다. 동물을 그 후 매 3 주마다 추가접종시키고 채혈하였다.

사람 zalpha11 리간드 펩티드에 대하여 제조된 토끼 혈청은, 항체 표적으로 1 ㎍/ml의 항체를 제조하는데 사용된 각각의 펩티드 (SEQ ID NO:72 또는 SEQ ID NO:73)를 사용하여 ELISA 역가 점검에 의하여 성질 결정되었다. huzalpha11L-1에 대한 두 토끼 혈청은 그것의 특이적 펩티드에 대하여 1:5,000,000 (1:5E6) 희석의 역가를 가졌다. huzalpha11L-3에 대한 두 토끼 혈청은 그것의 특이적 펩티드에 대하여 1:5E6 희석의 역가를 가졌다.

사람 zalpha11 리간드-특이적 다클론 항체는 CNBr-SEPHAROSE 4B 그람당 각각 특이적 펩티드 (SEQ ID NO:72 또는 SEQ ID NO:73) 10 mg을 사용하여 준비된 CNBr-SEPHAROSE 4B 단백질 컬럼 (Pharmacia LKB)을 사용하고 이어서 PBS에서 20X 투석함에 의하여 토끼 혈청으로부터 친화성 정제되었다. huzalpha11-리간드-특이적 항체는, 항체 표적으로 적당한 정제된 펩티드 항원 또는 정제된 재조합 전장 단백질 1 ㎍/ml 을 사용하여 ELISA 역가 점검에 의하여 성질 결정되었다.

토끼 항-huzalpha11L-1 친화성 정제된 항체의 검출 하한계 (LLD)는 그것의 특이적 항원(huzalpha11L-1; SEQ ID NO:72)에 대하여 500 pg/ml, 정제된 재조합체 huzalpha11L-MBP-6H (실시예 32)에 대하여 500 pg/ml, 및 정제된 CHO 재조합 huzalpha11L-CHO (실시예 29)에 대하여 500 pg/ml이었다. 정제된 재조합 muzalpha11L-MBP-6H (실시예 32)에 대하여 교차반응성은 나타나지 않았다. 토끼 항-huzalpha11L-3 친화성 정제된 항체의 LLD는, 그것의 특이적 펩티드 항원(huzalpha11L-1; SEQ ID NO:73)에 대하여 50 pg/ml, 정제된 재조합체 huzalpha11L-MBP-6H에 대하여 50 pg/ml, 정제된 CHO 재조합 huzalpha11L-CHO (실시예 29)에 대하여 500 pg/ml, 및 정제된 배큘로바이러스 재조합 huzalpha11L-Bv (실시예 30)에 대하여 100 pg/ml이었다. LLD가 5 ng/ml인 정제된 재조합 muzalpha11L-MBP-6H (실시예 32)에 대하여 교차반응성을 나타내었다.

실시예 35

사람 zalpha11 리셉터 단일클론 항체

zalpha11 리셉터 단일클론 항체는 5 마리의 BalbC 마우스 (Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN)를 정제된 재조합 용해성 리셉터 단백질인 zalpha11CEE (huzalpha11-CEE-BHK)(실시예 10A)로 면역화하여 제조되었다. 마우스를 각각 완전 Freund's 아주반트 (Pierce, Rockford, IL) 내의 20 mg 정제된 단백질로 최초 복강내(ip) 주사하고 이어서 2 주마다 불완전 Freund's 아주반트 내 10 mg 정제된 단백질로 추가 ip 주사하였다. 제 3회 추가 주사 투여 후 제 7 내지 10 일에 동물을 채혈하고 혈청을 수집하였다.

huzalpha11-CEE-BHK에 대하여 제조된 마우스 혈청 샘플은, 항체 표적으로 정제된 재조합 CHO huzalpha11-Fc 단백질 (실시예 10C)을 사용하여 ELISA 역가 점검에 의하여 성질 결정되었다. 한 마우스 혈청 샘플은 그것의 특이적 항체 표적에 대하여 1:1,000,000 (1:1E6) 희석의 역가를 가졌다. 네 마우스 혈청 샘플은 그것의 특이적 항체 표적에 대하여 1:100,000 (1:1E5) 희석의 역가를 가졌다.

비장혈구를 4 마리의 고-역가 마우스로부터 수집하고, 4:1의 비장혈구 대 골수종 세포 융합비를 사용하여 두 가지 분리된 융합 공정에서 PEG 1500 (Boerhinger Mannheim, UK)를 사용하여 마우스의 SP2/0 골수종 세포와 융합시켰다 (Antibodies: A Laboratory Manual, E. Halow 및 D.Lane, Cold Spring Harbor Press). 융합 후 10 일 성장 후, 특이적 항체-제조 하이브리도마를, 정제된 재조합 BHK 사람 zalpha11-Fc4 단백질 (실시예 10C)을 항체 표적으로 사용하여 ELISA에 의하여, 및 huzalpha11 서열을 발현하는 Baf3 세포 (실시예 4, 및 실시예 2)를 항체 표적으로서 사용하여 FACS에 의하여 확인하였다. 두가지 방법에 의하여 양성인 결과적인 4 개의 하이브리도마를 제한적 희석에 의하여 세 차례 클로닝하였다. 항체를 249.28.2.1.2.2; 247.10.2.15.4.6; 249.19.2.2.3.5; 및 249.15.2.4.2.7로 표시하였다.

실시예 36

zalpha11 리간드 트랜스제닉 마우스

A. 사람 및 마우스 zalpha11 리간드를 발현하는 트랜스제닉 마우스의 제조

각각의 프로모터 (MT-1 간-특이적 프로모터(마우스 zalpha11 리간드(실시예 26B)) 또는 림프양 특이적 LCK 프로모터(마우스 및 사람 zalpha11 리간드(실시예 26A 및 22B)))의 5' 및 3' 양쪽 인접 서열, 래트 인슐린 인트론, zalpha11 리간드 cDNA 및 사람 성장 호르몬 폴리 A 서열을 함유하는 트랜스제닉 벡터 (실시예 22 및 실시예 26)로부터의 DNA 단편을 준비하여, 수정된 B6C3f1 (Taconic, Germantown, NY) 마우스의 난모세포 내로 표준 마이크로주사 프로토콜을 사용하여 마이크로주사하는데 사용하였다. Hogan, B. et al., Manipulating the Mouse Embryo. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994를 참조하시오.

림프계-특이적 EμLCK 프로모터로부터 사람 zalpha11 리간드를 발현하는 8 마리의 트랜스제닉 마우스를 44 마리의 자손 중에서 확인하였다. 이들 자손 중 4 마리는 사망하고 4 마리는 성체로 성장하였다. 발현 수준은 이들 동물에서 매우 낮았다. 림프계-특이적 EμLCK 프로모터로부터 마우스 zalpha11 리간드를 발현하는 20 마리 트랜스제닉 마우스를 77 마리의 자손 중에서 확인하였다. 20 마리 모두 성체로 성장하였다. 이들 동물에서 발현 수준은 매우 낮았다. 간-특이적 MT-1 프로모터로부터 마우스 zalpha11 리간드를 발현하는 3 마리의 트랜스제닉 마우스를 60 마리의 자손 중에서 확인하였다. 두 마리는 사망하였고 한 마리만 성체로 성장하였다. 이들 동물에서 발현 수준은 매우 낮았다. 하기와 같이 조직을 준비하고 조직학적으로 시험하였다.

B. 트랜스제닉 마우스로부터의 조직의 현미경적 평가

사람 및 마우스 zalpha11 리간드를 발현하는 트랜스제닉 동물 (실시예 36A)로부터 비장, 흉선, 및 장간막 림프절을 수집하고 조직학적 시험용으로 준비하였 다. 통상적으로 회수되는 다른 조직은 다음: 간, 심장, 허파, 신장, 피부, 유선, 췌장, 위, 소장과 대장, 뇌, 침샘, 기관, 식도, 부신, 뇌하수체, 생식기, 부속 남성 생식선, 말초신경을 포함하는 골격근, 및 골수가 있는 대퇴골을 포함한다. 하기된 대로, 조직은 돌연사한 신생 자손 및 몇몇 성체 트랜스제닉 마우스로부터 회수되었다. 샘플은 10 % 완충된 포르말린에 고정시키고, 일상적으로 처리하고, 파라핀에 박아넣고, 5 미크론에서 절단하고, 헤마톡실린과 에오신으로 염색시켰다. 처리에 대하여 모르는 관인 수의 병리학자에 의하여 이 슬라이드를 시험하고 조직 변화의 심한 정도를 스코어링 (0=없음, 1=온화함, 2=보통, 3=심함)하였다.

사람 zalpha11을 발현하는 새끼와 2 마리 암컷 성체 마우스, 및 마우스 zalpha11을 발현하는 6 마리의 숫컷 성체 마우스 중 3 마리는, 시험된 많은 조직에서 염증 침윤물을 나타냈다. 마우스에 따라 침범된 정도는 다양하였다. 염증 침윤물은 일차적으로 다양한 수와 비율의 호중구와 마크로파지로 구성되었고 일반적으로 온화함 및 보통 정도의 심하기를 보였다. 더우기, 이들 동물은 비장과 흉선에서 보통 내지 심한 림프구 감소증(사람 및 마우스 zalpha11 리간드 트랜스제닉); 및 심한 림프구 감소증(사람 zalpha11 리간드 트랜스제닉) 또는 림프절에 온화한 내지 심한 화농성 내지 화농육아종성 림프절염(마우스 zalpha11 리간드 트랜스제닉)을 포함하는 림프계 기관의 변화를 나타냈다. 또한, 증가된 골수외 조혈작용은 비장에서 명백하였다. 이들 변화는 나이가 같은 대조군 마우스에서 관찰되지 않았다.

C. zalpha11 리간드를 과잉발현하는 트랜스제닉 마우스로부터의 조직의 유동 세포주측 분석

사람 또는 마우스 zalpha11 리간드 (실시예 36A)를 과다발현 하는 트랜스제닉 동물을 말초혈, 흉선, 림프절, 골수, 및 비장의 유동 세포주측 분석용으로 희생시켰다.

빙냉 배양 배지 (500 ml RPMI 1640 배지 (JRH Biosciences. Lenexa, KS); 5 ml 100x L-글루타민 (Gibco BRL. Grand Island, NY); 5 ml 100x Na 피루베이트 (Gibco BRL); 5 ml 100X 페니실린, 스트랩토마이신, 네오마이신 (PSN) (Gibco BRL))에서 폴셉으로 기관을 베어낸 후 세포를 세포 신장기 (Falcon, VWR Seattle, WA)를 통하여 온화하게 압축시킴에 의하여 비장, 흉선 및 림프절로부터 세포 현탁물을 제조하였다. 말초혈 (200 ml)을 헤파린 처리된 시험관에 수집하고 10U 헤파린/ml을 함유하는 HBSS에 의하여 10 ml로 희석되었다. 적혈구를 저장 용해에 의한 비장 및 말초혈 제조물로부터 채취하였다. 골수 세포 현탁물은 골수를 빙냉 배양 배지로 대퇴골로부터 쏟아내어 제조되었다. 세포수를 세고 세포는 트립판 블루 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD)를 사용하여 생존률에 대하여 시험하였다. 세포를 ml 당 10,000,000 개의 농도로 빙냉 염색 배지 (HBSS, 1 % 태아소 혈청, 0.1 % 나트륨 아지드)에 재현탁시켰다. Fc 리셉터 및 세포에 대한 항체의 비특이적 결합의 차단은 10 % 정상 염소 혈청과 Fc Block (Pharmingen, La Jolla, CA)을 세포 현탁물에 첨가하여 성취되었다.

세포 현탁물을 동일 부피의 형광색소 표지 단일클론 항체(PharMingen)와 혼합시키고, 얼음 위에서 60 분간 항온처리시킨 후, 몇몇의 샘플에서 1 mg/ml 7-AAD(Molecular Probes, Eugene, OR)를 생존률 마아커로서 함유하는 400 ml 세척 완 충액에 재현탁시키기 전에 빙냉 세척 완충액 (PBS, 1 % 태아소 혈청, 0.1 % 나트륨 아지드)으로 두 차례 세척하였다. FACSCalibur 유동 세포주측기 (BD Immunocytometry Systems, San Jose, CA) 상에서 유동 데이터를 획득하였다.

사람 또는 마우스 zalpha11 리간드를 고수준으로 발현한 트랜스제닉 동물은 분석된 모든 림프계 기관에서 극적으로 변화된 세포 집단을 가졌다. 나타난 변화는 흉선 세포질 완전 손실, CD45R 양성 B세포의 완전 부재 및 비장의 크기와 세포질 증가를 포함하였다. 비장과 골수 둘 모두는, 단핵백혈구와 호중구의 증가가 원인이 된 증가된 수의 골수 크기화된 세포를 가졌다. pan NK 세포 마아커 (DX5)가 많은 집단에서 증가하였다. 보통의 발현 파운더는 고발현체에서 나타나는 표현형과 일치하는, 덜 극적이지만 유의한 변화를 나타냈다. 가장 낮은 수준의 발현을 나타내는 마우스는 골수 세포의 증가가 유의하지도 않고 B 세포 수가 감소하지도 않았다. 그들은 흉선세포 집단에서 CD4+CD8+ 이중 양성 세포 감소 및 CD4와 CD8 단일 양성 세포 둘 모두의 증가를 나타내는 유의한 변화를 나타냈다.

실시예 37

zalpha11 리간드 정제된 재조합 사람 단백질

정상 마우스에서 투여량-반응 연구

A. 개요

6 마리의 정상 늙은 암컷 C57Bl/6 (Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN) 마우스를 복강내 주사로 하루 한 번 4일간 또는 8일간 4분의 1 투여량 수준의 정제된 재조합 사람 zalpha11 리간드 (실시예 24) 0.1, 0.5, 5 또는 50 ㎍/마우스/ 일로 또는 대조군으로서 부형제로 처리하였다. 체중과 체온을 매일 점검하였다. 제 4일 또는 제 9일에, 각 단백질 처리군으로부터 8 마리 마우스 중 4 마리와 부형제 대조군 10 마리 마우스 중 5 마리를 희생시켰다. 혈, 골수 및 조직을 채취하고 분석하였다. 일반적 생리학적 및 독물학적 매개변수 뿐 아니라 림프계 조직의 잠재적 혼돈을 시험하였다.

시험된 어느 투여량에서도 사람 zalpha11 리간드 단백질의 독성의 증거는 없었다. 체중과 체온은 변화하지 않았다. 임상적 화학적 매개변수에 명백한 변화가 없었다. 그러나, 부형제 대조군과 비교하여 zalpha11 리간드의 최고 투여량으로 처리된 마우스의 골수, 비장 및 말초혈 내 골수계 세포의 백분율 증가와 관련되는 일치하는 발견이 있었다. 고-투여량 군의 비장 호모지네이트의 유동 세포주측 분석에 의하여 확인된 골수계 크기 세포의 통계적으로 유의한 증가가 있었다. 두 개의 최고 투여량 군의 비장은 통계적으로 유의하게 다른 군보다 비대하였다. 그러나, 조직병리학적 시험에서는 최고 투여량 군에서 단지 골수외 조혈작용의 미미한 증가만 나타났다. 다른 군과 비교하여 고 투여량 군에서 골수의 골수 대 적혈구 비율의 통계적으로 유의한 증가가 있었다. 최종적으로, 동일한 군의 말초혈에서 총 백혈구수 및 다핵백혈구 백분율 모두에 있어서 증가가 나타났다.

B. 투여 용액 준비

정제된 사람 zalpha11 리간드 (실시예 24)를 PBS 부형제 0.1 ml에 50, 5, 0.5 또는 0.1 ㎍ 단백질 농도가 되도록 멸균 포스페이트 완충 식염수 (Gibco BRL, Grand Island, NY)내에 희석시켰다. 최초 4일에 대한 투여분을 제 0일에 제조하여 사용전에 -20 ℃ 냉동고에서 동결시켰다. 제 5일 내지 8일 투여분은 제 5일에 제조하여 상기와 같이 동결시켰다. 동일한 PBS의 알리쿼트를 부형제 처리된 대조군용으로 유사하게 동결하였다. 투여일에 정당한 알리쿼트를 해동시켜 0.1 ml의 용액을 매일 4일 또는 8일 동안 마우스에 복강내 주사하였다.

C. 연구 설계

연구 개시시 마우스 나이는 6 주였다. 각 처리군은 대조군 10 마리를 제외하고는 8 마리로 구성되었다. 각 처리군 마우스의 절반은 처리 4 일 후에, 나머지 절반은 처리 8 일 후에 희생되었다.

매일 처리 전에, 각 마우스를 체중을 재고, 피하이식된 자동응답기 (IPTT-100, BMDS, Maywood, NJ)로부터의 식별 번호와 체온에 대하여 마우스를 스캐닝함으로써, Portable Programmable Notebook System (BMDS, Inc, Maywood, NJ)를 사용하여 마우스의 체온을 기록하였다.

희생시킬 때, 유동 세포주측 분석에 의하여 백혈구 집단을 평가하려고 회수된 조직은 골수, 흉선 및 비장을 포함한다. 림프계 기관 및 골수의 FACS 분석은 FACSCalibur (Becton Dickinson, Mansfield, MA)로 수행한다. 단백질의 독성 신호에 대한 조직학적 시험용으로 회수된 조직은: 비장, 흉선, 간, 신장, 부신, 심장 및 허파를 포함한다. 조직학용으로 고정된 모든 조직은 10 % 일반 완충 식염수 (NBF)(Surgipath, Richmond, IL)에서 4 ℃로 유지되었다. 다음날 NBF를 70 % 에탄올로 교체하였고 조직은 조직학으로 처리될 때까지 4 ℃로 유지되었다.

조직을 처리하고 헤마톡실린과 에오신으로 자체적으로 염색한 후 조직병리학 적 분석용으로 계약 병리학자에게 보내었다. 혈을 완전 혈구수 측정 (CBC) 및 혈청 화학 프로필용으로 수집하였다. CBC는 Cell Dyn 3500 Hematology Analyzer (Abbott Diagnostics Division, Abbott Park, IL)로 자체내 분석하였고 수동식 미분 백혈구 수 측정은 Phoenix Center Laboratory (Everett, WA)에서 분석하였다. 혈청은 완전 혈청 화학 패널에 대하여 Phoenix Center Laboratory에 제출할 때까지 -20 ℃로 동결 유지되었다. 골수 세포:적혈구 비를 평가하기 위하여 하나의 대퇴로부터의 골수를 CytoSpin 슬라이드 (CYTOSPIN 3 CYTOCENTRIFUGE 및 CYTOSLIDE, Shandon, Pittsburgh, PA)에 적용시켰고 Phoenix Center Laboratory로 분석을 위하여 보냈다.

D. 연구 결과

50 ㎍/일 이하의 투여량에서 사람 zalpha11 리간드의 생리학적 효과나 독성의 명백한 임상적 표시는 없었다. 치료기간 동안 체중과 체온은 정상으로 유지되었다. 혈청 화학 매개변수도 정상 범위에 있었다. 적혈구와 혈소판 수도 정상으로 나타났다. 50 ㎍/일로 8일간 투여된 마우스에서, 수동측정 미분 백혈구 수는 다핵 백혈구의 비율이 말초혈에서 증가하고 총 백혈구수의 명백한 증가를 나타내었다. 대퇴골로부터 채혈된 골수에서, 50 ㎍ 투여량군에서 골수세포 대 적혈구 비율은 증가하였고 8-일 투여량 세트로부터의 5 ㎍ 투여량군은 그 정도가 낮았다. InStat (InStat MAC; GraphPad Software, Inc., San Diego, CA)를 사용한 무-매개변수 다컬럼 비교에서, 차이는 통계적으로 유의하였다 (p=.0049). 최고 투여량군과 부형제 사이의 차이 또한 유의하였다 (p=.0286). 말초혈 내 증가된 백혈구 및 골수 내 골 수세포 전구체의 유의한 증가는 따라서 관련이 있을 것이다.

하기 조직: 흉선, 간, 신장, 부신, 십이지장, 췌장, 공장, 맹장, 결장, 장간막 림프절, 자궁, 난소, 침샘, 심장, 기관, 허파, 및 뇌의 조직학적 평가는 세포학적 또는 구조적 변화, 세포분열 또는 사멸의 명백한 증거를 보이지 않았다. 처리된 군 간에 흉선, 신장, 간 및 뇌의 중량의 명백한 차이는 나타나지 않았다. 시험된 모든 조직중에서, 오직 비장 중량만이 유의하게 영향을 받았다.

각 마우스 비장 중량은 그것의 뇌중량에 대하여 표준화되었다. 50 ㎍/일 처리군은 부형제, 0.1 ㎍ 및 0.5 ㎍ 처리군과 비교하여 다른 세 군의 평균 비장 중량보다 비장 중량이 처리 4일 후에는 거의 50 %, 8일 후에는 거의 100 % 더 컸다. 4-일 세트에서, 5 ㎍/일 군 또한 대조군과 저투여량 군보다 더 큰 비장을 가지는 경향이 있었다. 처리군에 의하여 조합된 4-일 및 8-일 세트로부터의 데이터의 비장/뇌 중량의 차이는, InStat 프로그램 (GraphPad Software)을 사용한 Kruskall-Wallace non-parametic ANOVA, 다컬럼 비교 시험에 의하여 통계적으로 유의하였다 (p=.0072).

골수외 조혈작용, 특히 적골수에서의 미미한 증가는 최고 투여량 군으로부터의 마우스의 비장에서, 4 일 동안 처리된 마우스에서 조차 나타났다. 유동 세포주측 분석은, 최고 투여량 군에서 골수세포 크기의 세포 비율의 유의한 증가를 나타냈고(p=0.01) 단핵 백혈구 및 호중구 둘 모두의 증가를 나타냈다. 이 효과는, 상기된 골수에서의 골수세포 전구체의 명백한 증가 뿐 아니라 말초혈 단핵 세포 백분율의 증가와 관련된다. 더우기, 사람 zalpha11 유전자의 삽입으로부터 유래한 트랜스 제닉 마우스는 비-트랜스제닉 한배 자매에 비교하여 비장 골수외 조혈작용의 증가를 나타냈다.

대조군과 비교하여 50 ㎍/일 투여량 군에서 zalpha11 리간드가 골수세포주의 세포 생산이나 발생에 관련됨을 함축하는 몇몇 변화가 관찰되었다. 종합할 때, 관찰된 변화는 zalpha11이 암 및 여기에 기술된 면역학적 장애와 같은 의학적 특이점에 있어 치료 단백질로서 유용함을 시사한다.

실시예 38

정제된 재조합 사람 zalpha11 리간드 단백질의 사전 배제 및 조직 분포 연구

A. 개요

정제된 zalpha11 리간드의 조직분포와 배제 패턴을 밝히기 위하여, 사전 약물 생체 반응학 연구를 착수하였다. 9 주령의 숫컷 C57Bl/6 마우스에게, ¹¹¹Indium (¹¹¹In)(NEN, Boston, MA)으로 표지된, 정제된 재조합 사람 zalpha11 리간드 단백질을 세가지 수단 중 한 가지 수단으로 부여하였다. 각 마우스에게 단일 볼루스을 정맥내(IV), 복강내 (IP), 또는 피하 (SC) 주사하였다. 피하 또는 복강내 수단으로 주사된 마우스를 주사 후 한 시간 또는 세 시간 후에 희생시켰다. 정맥 내 로 주사된 마우스는 주사 10분 또는 1 시간 후에 희생시켰다. 혈, 혈장 및 선택된 조직을 다양한 시점에서 수집하여 감마 카운터에 의하여 측정하여 대략적인 반감기와 외인성 표지된 단백질의 조직분포를 추산하였다. 희생 간격 뿐 아니라 측정용으로 회수된 조직은, 방사성 핵종으로 표지된 다른 사이토킨의 분포의 보고를 기준으로 하여 선택하였다.

희생시, 방사능의 측정용으로 회수된 조직은 흉선, 비장, 신장, 한쪽 간엽, 한 쪽 폐엽, 방광을 포함한다. 복강내 주사를 받은 군에서, 소화관 또한 측정하여 소화관 내로의 주사의 영향을 평가하였고, 피하 투여된 마우스에서는 주사된 부위 밑의 조직을 포함한 피부를 측정하였다. 전체 간 및 허파에 대한 cpm을 측정된 절편 및 그 절편이 속하는 전체 기관의 백분율로부터 계산하였다.

수집된 조직의 연구 종결 후, 전혈과 혈장을 COBRA II AUTO-GAMMA 감마 측정기 (Packard Instrument Company, Meriden, CT)상에서 측정하였다. 원래의 표지된 투여 용액의 한 알리쿼트 또한 조직 연구의 종결 시 측정하였다. 이는 각 마우스에 대하여 총 주사된 방사능 및 방사성 붕괴에 대한 모든 카운트의 동시 보정 백분율의 계산을 가능케하였다. 잔여 혈 부피와 기관 중량의 추산은 조직에 투여된 카운트의 대부분이 각 수단에 의하여 표지된 zalpha11 리간드 투여에 따른 카운트 분포의 합리적 지표임을 가리켰다.

B. zalpha11 리간드의 ¹¹¹ Indium 표지

정제된 재조합 사람 zalpha11 리간드 (실시예 29)를 실온에서 PBS에 30 분간 항온처리하여 10배 몰 과량의 DTPA (Peirce, Rockford, Il)로 융합하였다. 반응하지 않은 DTPA및 가수분해물을 Biomax-5k NMWL (Ultrafree-15, Millipore, Bedford, MA) 상에서 완충액 교체로 제거하였다. 공 부피 단백질 정점을 5 mg/ml로 농축시키고 바이오센서 (마우스의 B-세포의 항-CD40 자극(실시예 44)) 시험용으로 알리쿼트 를 취하였다. DTPA-융합체가 온전한 생체활성을 가졌음을 확인한 후, 융합체를 1 M 아세트산 나트륨 pH 6.0으로 0.5 mg/ml로 희석하였다. 2 mCi의 ¹¹¹Indium를 0.5 ml 1 M 아세트산나트륨 pH 6.0에 넣고 DTPA-사람 zalpha11 리간드에 실온에서 30분간 혼합하였다. 포함되지 않은 ¹¹¹Indium을 PD-10컬럼 (Pharmacia, Piscataway, NJ) 상에서 PBS로의 완충액 교체 동안 제거하였다. 방사성-표지된 물질을 표지되지 않은 사람 zalpha11 리간드로 특이활성 100 mCi/mg이 되도록 희석하고, 멸균여과하고, 4 ℃에서 밤새 저장하였다. 표지된 단백질의 100 %를 Biomax-5k NMWL 막 (Millipore)상에 유지시켰다. 표지된 ¹¹¹In-사람 zalpha11 리간드를 배제 및 약물 생체 반응학 연구에서 마우스에 투여하였다. 0.1 ml PBS 부형제에서 5 μCi의 표지된 사람 zalpha11 리간드로 표지된 사람 zalpha11 리간드 단백질 50 ㎍을 각 동물에게 투여하였다.

C. 사전 분포 연구의 결과

모든 세 가지 수단에 의한 투여 1 시간 또는 3 시간 후, 이들 조직에서 최대 cpm을 나타냄에 의하여 입증되는 바와 같이, ¹¹¹In-사람 zalpha11 리간드의 최대 농도는 신장에서, 제 2 최대 농도는 소변 및 방광에서 발견되었다. 신장에서 재생한 평균 카운트는 간 전체 카운트보다 주사 경로 및 희생 시점에 따라 3 내지 8 배 높았다. 예를 들어, IV주사 60 분 후에 평균 신장 cpm은 동일 군으로부터의 간 전체에 대하여 계산된 평균 카운트보다 4.5 배 컸다. 정맥내 투여 10 분 후에 희생된 군에서, 최대 cpm은 역시 신장에서, 제 2 최대 축적은 간, 방광 및 자궁에서 동일하였다.

D. 사전 약물 생체 반응학 연구

혈 및 혈장 수집은 세 가지 경로에 의한 주사 후 10, 30 및 60 분 후에 수행되었다. IV 경로에 의한 주사에 이어, 분리된 세트의 마우스에서 제 2, 5 및 10 분에 혈 및 혈장을 취하였다. IP 또는 SC 경로에 의한 주사를 받은 다른 세트의 마우스에서는 제 1, 2 및 3 시간에 혈 샘플을 취하였다. 처리군에 대하여는 표 6을 참조하시오. 짧은 수집 시간은 정맥내 주사에 이은 IL-2의 보고된 반감기를 일괄하여 표시하였다. 보고된 T1/2는 2.5 내지 5.1 분이었다. IL-2에 대한 생체내 투여에 대한 기준에 대하여는 Donohue JH 및 Rosenberg SA J Immunol, 130: 2203, 1983을 참조하시오. 긴 시점은 선택되어 참여된 배제기를 개괄하였다.

주사경로	채혈 시점(분)	희생 시점
정맥내 군 1	2, 5, 10	10분
정맥내 군 2	10, 30, 60	60분
복강내 군 1	10, 30, 60	60분
복강내 군 2	60, 120, 180	180분
피하 군 1	10, 30, 60	60분
피하 군 2	60, 120, 180	180분

비-표지 IL-2는 IV 주사 후 마우스에서 약 3 분의 반감기를 가지고 혈청으로부터 배제되는 것으로 나타났다. 참고로서는 상기 Donahue, JH 및 Rosenburg 를 참조하시오. 유사한 양의 IL-2의 IP 및 SC 주사에 이어, 혈청 내 IL-2 활성의 지속 시간은 IV 주사 후 30 분 미만 동안 2 단위/ml부터, IP 주사후 2 시간 동안 및 SC 주사 후 6 시간동안 2 단위/ml까지 지속되었다. IL-2 제거의 주요 경로는 신장인 것으로 보인다. 여기에 논한 것과 같이, zalpha11 리간드는 구조적으로 IL-2와 유사한 것으로 나타났다. 본 연구에서 cpm의 축적이 신장에 이어 방광과 자궁에서 우세한 것으로 보아, zalpha11 리간드의 배제의 사전 평가는 IL-2의 신장에 의한 명백한 제거와 일치하는 것으로 나타난다.

PK 분석 프로그램 WinNonLin 버젼 1.1 (Scientific Consulting Inc., Cary, NC) 을 사용하여 혈장으로부터 얻어진 cpm 데이터의 비-분리 분석에 기초하여, 약물 생체 반응학 매개변수의 추산이 이루어졌다. 50 ㎍ 투여량의 정맥내, 피하, 및 복강내 투여에 대한 예상 최종 배제 속도 상수를 사용하여 zalpha11 리간드의 혈장 반감기를 추산하였다. 약물 생체 반응학 결과는, 혈장 농도 대 시간 프로필의 최종 배제 영역의 제한된 데이터 수치에 기인한 추산이었다. 더우기, SC 및 IP 투여에 대한 최종 배제기의 적합화는, ¹¹¹In-사람 zalpha11 리간드의 흡수가 명백히 일어나고 있는 시점으로부터의 데이터의 사용을 필요로 한다. 그러나, 정맥내, 피하 및 복강내 투여 후 반감기의 추산값은 각각 13.6 분, 18.8 분 및 34.3 분이었다. 투여량 범위는 평가되지 않았으나 포화 가능하거나 활성 배제 (Michaelis Menten 동역학)가 일어나는지는 명백하지 않다.

표지된 단백질의 생체이용도의 추산은, 정맥내 투여에 비교한 피하 또는 복강내 투여 후 곡선(AUC) 하의 영역에 기초하여 이루어졌다. 피하 및 복강내 주사에 이은 추산 생체이용도는 가각 35.8 % 및 63.9 %이다. 하나의 단백질 투여량만이 연구되었기 때문에, 생체이용도는 투여량의 함수로서 평가되지 않았다. (정맥내 주사 로부터 기초하여) 추산되는 제거 및 분포 부피는 각각 0.48 ml/분 및 6.1 ml이다.

비록 데이터는 잠정적이지만, IV로 투여된 zalpha11 리간드의 운명은, 4-나선-번들 사이토킨 (상기 Donahue, JH 및 Rosenburg, SA)인 IL-2에 대하여 보고된 것과 유사하였다. IL-2와 마찬가지로, IV-투여 zalpha11 리간드는 신장에서 주로 제거되는 겨우 1 분의 혈장 반감기를 가졌다. 주사 3 시간 후, 신장으로부터 추출된 표지된 물질의 대부분은 아직 Biomax 5K NMLW 막 (Millipore)에서 유지되었다. 인듐은 리소좀에서 가수분해되는 동안 조차도 단백질과 결합 유지된다는 것이 이전에 보고된 바 있으므로 (Staud,F. et al., J. Pharm. Sciences 88: 577-585, 1999), zalpha11 리간드는 신장에서 축적되고 분해될 것이다. IL-2를 포함하는 다수의 다른 단백질에서 관찰되는 바와 같이 (상기 Donahue, JH 및 Rosenburg, SA), 최근의 연구는 또한 IP 및 SC 투여가 zalpha11 리간드의 혈장 내 수준을 유의하게 지속시킴을 나타내었다.

실시예 39

NK 활성의 평가를 위한 zalpha11 리간드를 사용한 사람 골수 MNC CD34+ 분획의 분리와 확장

A. 사람 골수로부터 CD34+ 세포의 선택과 분리

신선한 사람 골수 단핵세포 (MNC)를 NK 세포 활성을 가지는 세포의 집적을 위하여 준비하였다. 신선한 사람 MNC를 Poeitic Technologies (Gaithersburg, MD)로부터 얻었다. 10 % HIA FBS (hyclone, Logan, UT)와 항생제 1 % PSN (Gibco BRL, Grand Island, NY)을 함유하는 10 ml 알파 MEM (JRH, lenexa, KS)를 세포 현탁물에 첨가하였고 세포를 100 ㎛ 체에 통과시켰다. 그 후 세포를 수를 세고, 펠렛화하고, 2 % FBS를 함유하는 10 ml PBS로 세척하고 다시 펠렛화한 다음 2 % FBS를 함유하는 1 ml PBS에 재현탁하였다. CD34+ 세포 표면마아커를 가지는 세포 (CD34+ 세포)를 Detachable kit with Dynabeads M-450 CD34 (Dynal, Oslo, Norway)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 자기적으로 분리하였다. CD34+ 및 CD34- 세포 모두의 분획을 하기에서 더 분석하였다.

B. zalpha11 리간드를 사용한 CD34+ 세포 확장

CD34+ 세포 분획을 24-웰 평판의 4 개 웰에 플레이팅 하였다. 50,000 양성으로 선택된 세포를 10 % HIA FBS (Hyclone) 및 1 % PSN (Gibco BRL)을 함유하는 1 ml 알파 MEM (JRH)에 현탁시키고 다양한 하기된 사이토킨을 각각의 4 개의 웰 (1 내지 4)에 플레이팅 하였다. CD34+ 선택된 골수 MNC의 zalpha11 리간드-유도 확장에 대한 시험에 다양한 시약이 사용되었다: 시약은 사람 flt3 (R&D, Minneapolis, MN); 정제된 사람 zalpha11 리간드 (실시예 30C 및 실시예 30D); 사람 IL-15 (R&D)를 포함한다. 시약은 하기와 같이 제 0 일에 배합되었다: 웰#1에, 2 ng/ml 사람 flt3을 첨가하였다. 웰#2에, 2 ng/ml 사람 flt3 및 15 ng/ml 정제된 사람 zalpha11 리간드를 첨가하였다. 웰#3에, 2 ng/ml 사람 flt3 및 20 ng/ml 사람 IL-15를 첨가하였다. 웰#4에, 2 ng/ml 사람 flt3, 15 ng/ml 정제된 사람 zalpha11 리간드 및 20 ng/ml 사람 IL-15를 첨가하였다. 18 일간 항온처리 후, 각 웰로부터 현탁된 세포를 펠렛화한 후 10 % HIA FBS (Hyclone) 및 1 % PSN (Gibco BRL)을 함유하는 0.5 ml 알파 MEM (JRH)에 재현탁하였고 CD34+ 세포 분획의 증식을 평가하기 위하여 측정하 였다. 낮은 수준의 증식이 flt3 단독 (웰#1)에서 나타났지만 flt3에 추가하여 IL-15나 zalpha11가 존재하는 것 (웰#2 및 #3)에서는 확장에 유의한 효과가 없었다. 그러나, flt3에 추가하여 IL-15 및 zalpha11를 함유하는 웰#4에서는 flt3 대조군 이상의 확장이 확연하였다. 이 결과는 zalpha11 및 IL-15가 사람 CD34+ 세포 집단을 확장시키는데 상승적으로 작용을 함을 시사한다. 더우기, 이 실험의 결과는 마우스 BM 분석 (실시예 21)에서 마우스 zalpha11 리간드로 실험한 결과를 뒷받침한다.

하기와 같이, 모든 세포 집단이 그 후 NK 활성에 대하여 시험되었고 유도 세포 계측 분석을 받았다 (실시예 41).

C. IL-15의 지연 첨가와 함께 zalpha11 리간드를 사용한 CD34+ 또는 CD34- 세포 확장

CD34 양성 및 음성 (CD34-) 분획 둘 모두를 따로 6 개의 12웰 평판 (1 내지 6)에 플레이팅하였다. 각 6 웰은, 상기와 같이 10 % HIA FBS 및 1 % PSN을 함유하는 2 ml 알파 MEM에 100,000 개씩의 양성 또는 음성으로 선택된 세포를 함유하였다. 사용된 시약은 상기와 같았다. 웰#1에, 2 ng/ml 사람 flt3을 제 0일에 첨가하였다. 웰#2에, 2 ng/ml 사람 flt3을 제 0 일에 첨가하였고 5일의 항온처리후 20 ng/ml 사람 IL-15를 첨가하였다. 웰#3에, 2 ng/ml 사람 flt3 및 15 ng/ml 정제된 사람 zalpha11 리간드를 제 0일에 첨가하였다. 웰#4에, 2 ng/ml 사람 flt3 및 15 ng/ml 정제된 사람 zalpha11 리간드를 제 0 일에 첨가하였고 5일의 항온처리 후 20 ng/ml 사람 IL-15를 첨가하였다. 웰#5에, 2 ng/ml 사람 flt3 및 20 ng/ml 사람 IL- 15을 제 0 일에 첨가하였다. 웰#6에, 2 ng/ml 사람 flt3, 15 ng/ml 정제된 사람 zalpha11 리간드 및 20 ng/ml 사람 IL-15을 제 0일에 첨가하였다. 실험의 개시부터 총 15 일의 항온처리 후, 각 웰로부터 세포를 수집하고 측정하였다.

낮은 수준의 증식이 flt3 단독 (웰#1)에서 나타났지만 flt3에 추가하여 제 0 일에 첨가된 IL-15 또는 zalpha11가 존재하는 것 (웰#3 및 #5)에서는 확장에 유의한 효과가 없었다. 5일 후 IL-15의 첨가는 flt3 대조군 (웰#1에 비교한 웰#2) 및 zalpha11의 존재에 의한 증식 효과 (웰#3에 비교한 웰#4)에 비교하여 다소간의 증식 효과를 나타냈다. 그러나, 가장 큰 확장은, 제 0 일에 flt3에 추가하여 IL-15 및 zalpha11을 함유하는 웰#6에서 가장 확연하였다.

CD34- 집단에서는, flt3 단독으로 존재 시 (대조군 웰#1) 증식이 나타나지 않았고, 실제로 세포 집단의 감소가 확연하였다. flt3에 추가하여 제 0일에 첨가된 zalpha11이 존재하는 것 (웰#3)은 flt3 대조군과 유사하였다. 제 5 일에 첨가된 IL-15의 존재는 zalpha11 리간드 존재(웰#4) 또는 부재(웰#2)에서 세포의 증식 효과를 증가시켰다. 다시, 가장 큰 확장은, 제 0 일에 flt3에 추가하여 IL-15 및 zalpha11를 함유하는 웰#6에서 가장 확연하였다.

모든 세포 집단이 그 후 NK 활성에 대하여 시험되었고 유도 세포 계측 분석을 받았다 (실시예 41).

실시예 40

NK 활성과 NK 세포 마아커의 평가를 위한 사람과 마우스 zalpha11 리간드를 사용한 신선한 마우스 세포의 분리와 확장

A. 사람 및 마우스 zalpha11 리간드를 사용한 신선한 마우스 저밀도 골수 세포의 선택과 분리

마우스의 대퇴골의 양쪽을 절단하고 2 내지 3 ml의 성장 배지 (하기)를 수집 시험관내로 뼈의 안쪽을 통하여 쏟아부어, 신선한 마우스 골수 세포를 분리하였다.

성장배지는 500 ml RPMI 1640 배지 (JRH Biosciences. Lenexa, KS); 5 ml 100x L-글루타민 (Gibco BRL. Grand Island, NY); 5 ml 100x Na 피루베이트 (Gibco BRL); 5 ml 100X 페니실린, 스트랩토마이신, 네오마이신 (PSN) (Gibco BRL); 및 50 ml 열-불활성 태아소 혈청 (FBS)(Hyclone Laboratories, Logan, UT)이었다. 골수 세포는 그 후 배지를 수 차례 상하로 피펫팅함에 의하여 부수었다. 그 후 세포를 펠렛화하고 한 차례 성장 배지로 세척시키고, 70-미크론 체에 통과시켰다. 그 후 골수세포를 밀도 구배에 적용시켜 저밀도 단핵세포를 분리시켰다. 5 내지 8 ml 성장 배지의 골수 세포를 원심분리 시험관에서 5 내지 8 ml의 NycoPrep 1.077 Animal (Nycomed. Oslo, Norway)상단에 주의 깊게 피펫으로 놓았다. 그 다음 이 구배를 600 X g에서 20 분간 원심분리하였다. 저밀도 단핵세포를 NycoPrep과 배지 사이의 층간으로부터 회수하였다. 이들 세포를 그 후 배양 배지로 약 20 ml되도록 희석하고 펠렛화하고 세척하였다. 그 후 세포를 ml 성장 배지 당 약 0.5 내지 1.5x10⁶세포가 되도록 표준 조직 배양 플라스크에 플레이팅하고 37 ℃, 5 % CO₂에서 두시간 항온처리하였다.

그 후 비-점착성, 저밀도 (NA LD) 골수 세포를 회수한 후, ml 당 0.5 내지 2.0x10⁵세포수로, 배지 + 2.5 ng/ml 마우스 flt3 (R and D systems, Minneapolis, MN) + 25 내지 50 ng/ml 사람 인터류킨 15 (IL-15) (R and D systems)에 50 내지 150 ng/ml 사람 zalpha11 리간드 존재 또는 부재; 또는 0.12 내지 10 ng/ml 마우스 zalpha11 리간드 존재 또는 부재에서 플레이팅 한다.

사람 또는 마우스 zalpha11 리간드의 첨가 없이는 어떤 유의한 확장도 없었다. 비-점착성 세포는 마우스 zalpha11 리간드를 0.12 ng/ml까지 낮은 농도로 함유하는 배양물 및 사람 zalpha11 리간드를 22 ng/ml까지 낮은 농도로 함유하는 배양물에서 확장되었다. 사람 및 마우스 zalpha11 리간드 둘 모두를 함유하는 배양물에서, 비-점착성 세포 확장은, 마우스 리간드는 5 내지 10 ng/ml에서 포화 반응을 나타내고, 사람의 것은 최고 투여량인 200 ng/ml에서도 포화 반응을 나타내지 않으면서, zalpha11 리간드 투여가 증가함에 따라 증가하였다. 사람 zalpha11 리간드는 마우스 zalpha11 리간드에 비하여 마우스 세포에 대하여 약 20 내지 100 배 덜 강력한 것으로 나타났다. 약 5 내지 10 일 후 zalpha11 리간드 확장 마우스 세포를 회수하고 유동 세포주측에 의하여 분석하여, PanNK 세포 마아커 DX5(Pharmigen)에 대하여 46 %가 양성일 때, 그것 중 몇 %가 NK 세포 항체에 대하여 양성인지 결정하였다.

B. 신선한 계통 감소 마우스 골수세포의 분리와 확장

일차적으로 하기 항체: TER 119, Gr-1, B220, MAC-1, CD3e 및 I-Ab (Pharmingen, San Diego, CA)로 세포를 항온처리하여 신선한 마우스 골수세포로부 터 신선한 계통 감소 (lin^-) 마우스 골수세포를 분리하였다. 그 후 lin+ 세포를 Dynabeads M-450 양 항-래트 IgG (Dynal, Lake Success, NY)로 제조자의 지시에 따라 분리하였다.

그 후 음성으로 선택된 lin-골수 세포는 상기와 같이 성장 배지 + 2.5 ng/ml 마우스 flt3 (R & D systems) 및 25 ng/ml IL-15 (R & D systems); 또는 flt3, IL-15 및 마우스 zalpha11 리간드, 2 내지 5 % BHK 마우스 zalpha11 리간드 함유 컨디셔닝 배지에 플레이팅된다. 성장 6일 후, 배양물을 화수하고, 수를 측정하고 NY 세포 활성 분석 (실시예 41)에 제출하였다. 마우스 zalpha11 리간드 존재하에서 성장한 세포는 zalpha11 리간드가 없이 성장한 세포보다 약 2 내지 3 배 더 효과적으로 NK 세포 표적 세포 (YAC-1 세포)를 용해시킨다.

C. CD4-CD8-(이중 음성 또는 DN) 흉선세포의 분리와 확장

3 내지 8 주 나이의 마우스로부터 흉선을 절단하고 체로 내려 신선한 마우스 흉선세포를 분리하였다. CD4-CD8-(DN) 세포는 그 후 흉선세포를 항-CD4 및 항-CD8 항체 (PharMingen)로 항온처리하여 음성적으로 선택하고 CD4+ CD8+ 세포를 Dynabeads M-450 양 항-래트 IgG (Dynal)로 제조자의 지시에 따라 제거하였다.

DN 마우스 흉선세포를 그 다음 성장배지 + 2.5 ng/ml의 flt3 (R & D systems), 25 ng/ml의 IL-15 (R & D systems) 및 10 ng/ml IL-7 (R & D systems)에 마우스 zalpha11 리간드의 존재 또는 부재인 상태에서 상기와 같이 성장시켰다. 상기된 바대로, 6 일 후 세포를 회수하고, 수를 측정하고, 유동 세포주측으로 분석하 고, 또한 NK 세포 활성 분석 (실시예 41)에 제출하였다.

마우스 zalpha11 리간드 존재 하에서 성장한 배양물은 약 480,000 세포를 산출한 반면, zalpha11 리간드 없이 성장한 배양물은 약 160,000 세포를 산출하였다. 마우스 zalpha11 리간드 존재 하에서 성장한 배양물은 NK 세포 항원 Pan NK, DX5 (PharMingen)에 대하여 약 16.2 % 양성인 것으로 나타났다. zalpha11 리간드 존재하에서 성장한 세포는 zalpha11 리간드 없이 성장한 세포보다 NK 세포 표적 세포인 YAC-1을 약 2 배 더 잘 용해하였다. 확장된 세포는 음성 대조군 표적 세포주인 EL4를 유의하게 용해시키지 않았다. 이들 결과는 zalpha11 리간드가 선택적으로 용균 NK세포를 확장시킴을 시사하였다.

실시예 41

NK 세포 세포독성 분석에서 사람 및 마우스 zalpha11 리간드 확장 세포 및 성숙 마우스 NK 세포의 활성

A. NK 세포 분석

NK 세포-매개 표적 세포 용해는 표준 ⁵¹Cr-방출 분석에 의하여 시험되었다. 표적 세포 (사람 분석에서는 K562 세포 (ATCC No. CCL-243), 마우스 분석에서는 YAC-1 세포 (ATCC No. TIB-160))는 주요 조직적합 복합체 (MHC) 분자의 발현이 결여되어 NK 세포-매개 용해를 받기 쉽게된다. 마우스 분석에서 음성 대조군 표적 세포주는 MHC⁺ 흉선종 EL4 (ATCC No. TIB-39)이다. K562, EL4 및 YAC-1 세포를 10 % FBS (hyclone, Logan, UT), 4 mM 글루타민 (Gibco BRL), 100 I.U./ml 페니실린+100 MCG/ml 스트렙토마이신 (Gibco BRL), 50 μM β-메르캅토에탄올 (Gibco BRL) 및 10 mM HEPES 완충액 (Gibco BRL)로 보충된 RP10 배지 (표준 RPMI 1640 (Gibco BRL, Grand island, NY))에서 배양하였다. 분석 수행일에, 1 내지 2 x 10⁶ 표적 세포를 회수하고 2.5 내지 5 x 10⁶ 세포/ml로 RP10에서 재현탁하였다. 50 내지 100 ㎕의 5 mCi/ml ⁵¹Cr-나트륨 크로메이트 (NEN, Boston, MA)를 직접 세포에 첨가하고 1 시간동안 37 ℃에서 항온처리한 후 두차례 12 ml PBS로 세척하고 2 ml RP10에 재현탁시켰다. 헤마사이토미터에서 세포수 측정 후, 표적 세포를 0.5 내지 1 x 10⁵ 세포/ml로 희석시키고 100 ㎕ ( 0.5 내지 1 x 10⁴ 세포)를 하기된 바와 같이 효과세포와 혼합하였다.

사람 분석에서, 효과세포는 수집하고 세척하고 수측정하고 다양한 농도로 ⁵¹Cr-표지 표적 세포와 96-웰 둥근바닥 평판에서 혼합되고 37 ℃에서 4시간 동안 항온처리한, 선택되고 확장된 사람 CD34+ BM 세포 (실시예 39B)로부터 준비되었다. 효과세포와 표지된 표적세포의 공동-항온처리 후, 각 웰의 상층액의 절반을 수집하여 감마 측정기로 1분/샘플 동안 측정하였다. 비 ⁵¹Cr 방출의 백분율이 식 100 x (X-Y)/(Z-Y)로부터 계산되는데 X는 효과세포 존재 하의 ⁵¹Cr 방출, Y는 효과세포 부재시 자발 방출이고 Z는 0.5 % Triton X-100과 항온처리된 표적세포로부터의 총 ⁵¹Cr 방출이다. 데이터는 각 웰에서의 % 고유 용해 대 효과세포-표적세포 비율로서 도표화하였다.

B. 사람 zalpha11 리간드 확장 세포의 활성

flt3+/- zalpah11 리간드 및 flt3+IL-15+/- zalpha11 리간드과 함께 배양된 분리된 CD34+ 사람 HPC 세포 (실시예 39)를 제 15일에 회수하여 상기한 바와 같이 표준 ⁵¹Cr-방출 분석에서 그것의 MHC^- K562 세포를 용해시키는 능력에 대하여 평가하고 유동세포주측에 의하여 그것의 표면 표현형을 분석하였다. 선행 보고로부터 기대되는 바와 같이(Mrozek, E et al., Blood 87:2632-2640, 1996; 및 Yu,H et al., Blood 92: 3647-3657, 1998), IL-15와 flt3L의 자극적 첨가는 CD56^- 세포 소집단의 부산물을 유도하였다. 흥미롭게도, zalpha11 리간드와 flt3과 동시에 배양된 BM 세포는 유의하게 확장되지 않았지만, flt3L, zlapha11 리간드 및 IL-15의 조합을 함유하는 배양물에서는 총 세포수의 유의한 증가가 있었다 (실시예 39 참조).

이들 사람 BM 배양물의 표면 표현형의 평가를 위하여, 세포의 작은 알리쿼트를 3-색 유동 세포주측 분석용으로서 항-CD3-FITC, 항-CD56-PE 및 항-CD16-CyChrome mAbs (모두 PharMingen, San Diego, CA 유래)로 염색하고 CellQuest 소프트웨어 (Becton Dickinson, Mountain View, CA)를 사용하여 FACSCalibur 상에서 분석하였다. 이 유동 세포주측 분석은, 모두 크고 과립이 있고 CD56 및 CD16 둘 모두를 발현하고 CD3^-이므로 (Lanier, LL Annu. Rev. Immunol. 16:359-393, 1998), 이 배양물로부터 성장한 세포는 NK세포를 증식시킴을 확인하였다. 더우기, 이들 세포는 IL-15 및 flt3과 함께 성장한 세포보다 유의하게 높은 효과 세포 기능을 나타내었다. 더 구체적으로, 세가지 사이토킨 모두에서 성장한 세포는 효과세포-대-표적세포 비 (E:T) 1.5에서 40 %를 넘는 K562 표적세포를 용해시킨 반면, IL-15+flt3L에서 상장한 세포는 E:T 2에서 5 % 미만의 표적세포를 용해시켰다. 이들 데이터는 IL-15와 조합하여 zalpha11 리간드는 CD34⁺ BM 세포로부터 NK 세포의 증식을 촉진하는 것을 나타낸다.

C. 마우스 zalpha11 리간드 확장 세포의 활성

zalpha11 리간드의 마우스 조혈 원시 세포에의 효과를 시험하기 위하여, C57Bl/6 마우스로부터의 정제된 계통-음성 (Lin-) 골수세포를 실시예 40B에 기술된 바와 같이, flt3+IL-15+/zalpha11 리간드에서 확장시켰다. 배양 제 6 일에서, 세포 ("효과세포")를 회수하고 수측정한 후 0.4 ml의 RP10 배지에 재현탁하였다 (실시예 41A). zalpha11 리간드 존재 또는 부재하에서 확장된 (실시예 41A) 각 샘플의 2 개의 알리쿼트 (각각 0.15 ml)를 96-웰 둥근바닥 평판에서 두 개씩 순서대로 3배 희석시켜 각 100 ㎕씩 총 6 웰이 되었다. 남은 100 ㎕의 세포를 NK 세포 표면 마아커에 대하여, FITC-항-2B4 및 PE-항-DX5 mAb (PharMingen)로 염색하고, 유동 세포주측에 의하여 분석하였다. zalpha11 리간드의 존재 또는 부재 하에 flt3+IL-15에 노출된 세포 각 군은, NK 마아커에 대하여 65 내지 75 % 양성 범위의 유사한 비율의 2B4+DX5+ 세포를 가졌다.

NK 용해 분석용으로, 표적세포 (YAC-1 및 EL4)는 상기된 바와 같이 ⁵¹Cr로 표지되었다. 헤마사이토미터 상에서 표적 세포 수를 측정한 후, 표적 세포를 0.5 내지 1 x 10⁵ 세포/ml로 희석시키고 100 ㎕ YAC-1 또는 EL4 (0.5 내지 1 x 10⁴ 세포)를 100 ㎕의 효과세포와 혼합하고 4 시간동안 37 ℃에서 항온처리하였다. 비용해는 상기한 바와 같이 각 웰에 대하여 측정되었다.

flt3+IL-15+zalpha11 리간드의 존재 하에서 성장한 세포는 YAC-1 표적 세포에 대하여 증가된 용해 활성 (약 2 배)을 나타내는 것을 발견하였다 (그러나 MHC⁺ 대조군 세포주 EL4를 죽이지는 않았다). 효과세포-대-표적세포 비 (E:T) 5에서, 3 가지 사이토킨(flt3+IL-15+zalpha11 리간드)의 존재 하에서 생성된 NK 세포는 12 %의 YAC-1 세포를 용해한 반면, flt3+IL-15와 함께 확장된 NK 세포는 6 %의 YAC-1 표적을 용해하였다. 이어지는 실험은 이 경향을 확인하였다.

zalpha11 리간드의 생체 활성을 결정하는 제 2의 접근방법에서, 실시예 40C에 기술된 바와 같이 비성숙 CD4-CD8- ("이중 음성", DN) 마우스 흉선세포를 분리하였고 zalpha11 존재 또는 부재하에서 IL-15+flt3+IL-7 또는 IL-15+flt3+IL-2와 함께 배양하였다. 배양 제 6 일에, 세포를 회수하고, 상기한 바와 같이 YAC-1 및 EL4 세포에 대한 NK 용해 활성에 대하여 분석하였다. zalpha11 리간드의 존재에서 배양된 세포는, 다른 사이토킨의 존재 하에서 이들 세포에 대하여 증가된 용해활성을 나타내면서, 이 분석에서 가장 큰 용해 활성을 가짐을 발견하였다. 구체적으로, IL-15+flt3+IL7과 함께 성장한 DN 흉선세포는 E:T 24에서 YAC-1 세포의 18 %를 죽 인 반면, IL-15+flt3+IL7에 zalpha11 리간드를 더한 것과 함께 성장한 DN 흉선세포는 동일한 E:T 에서 YAC-1 표적세포의 48 %를 죽였다. IL-15+flt3+IL-2에서 성장한 DN 흉선세포는 E:T 6에서 YAC-1 표적의 15 %를 죽인 반면, 3 가지 사이토킨에 zalpha11 리간드를 더한 것과 함께 성장한 DN 흉선세포는 E:T 9에서 YAC-1 세포의 35 %를 죽였다. NK 용해 분석 하루 전에 배양된 세포에 대하여 유동 세포주측을 수행하였다. 골수 배양에서도 사실인 것과 같이, zalpha11 리간드의 증식 효과 (zalpha11 리간드가 첨가되었을 때 약 2 배 세포수가 증가함)에도 불구하고, 그것은 DX5⁺ 세포의 비율을 유의하게 증가시키지 않았다 (IL-17과 함께 배양에서 총 세포의 17 내지 20 %, IL-2와 함께 배양에서 총 세포의 35 내지 46 %). 이 데이터는 zalpha11 리간드는, IL-15 및 flt3과 조합하여, 마우스 골수 또는 흉선으로부터 생산된 NK 세포의 용해활성을 증가시킴을 의미한다.

D. 마우스 zalpha11 리간드의 성숙 마우스 NK 세포에 대한 활성

마우스 zalpha11 리간드의서 성숙 NK 세포에 대한 효과를 시험하기 위하여, 4 마리의 5-주령의 C57Bl/6 마우스 (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)로부터 비장을 분리하고 결빙-말단 유리 슬라이드와 함께 짓이겨 세포 현탁물을 제조하였다. 적혈구를 하기와 같이: 세포를 펠렛화하고 상층액을 흡입에 의하여 제거하고 저장 용해에 의하여 제거하였다. 펠렛을 온화한 와동에 의하여 부순 후, 900 ㎕ 멸균수를 첨가하여 진탕에 이어 신속하게(5 초 이내로) 100 ㎕의 10 X HBSS (Gibco/BRL)을 첨가하였다. 세포를 그 후 10 ml 1 X HBSS에서 재현탁시켜 세포를 나일론 그물형 세포 여과기 (Falcon) 위로 통과시킴에 의하여 잔해를 제거하였다. 이들 RBC-감소 비장세포를 그 후 펠렛화하고 MACS 완충액 (PBS+1 % BSA + 2 mM EDTA)에서 재현탁시키고 측정하였다. 300 x 10⁶ 세포를 항-DX5-코팅 자기 비드 (Miltenyi Biotec)로 염색하고, 제조자의 지시에 따라 MACS VS+ 분리 컬럼으로 DX5⁺ NK 세포를 양성적으로 선택하였고, 8.4 x 10⁶ DX5⁺ 세포와 251 x 10⁶ DX5 ^- 세포를 수집하게 되었다. 각 군의 세포는 24-웰 평판에서 (0.67 x 10⁶ 세포/웰, 처리 조건 당 2개 웰) RP10배지 (실시예 41A) 단독으로 또는 1) 30 ng/ml 마우스 zalpha11 리간드, 2) 30 ng/ml 재조합 IL-2 (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN), 3) 30 ng/ml 재조합 사람 IL-15 (R&D), 4) 각각 30 ng/ml 마우스 zalpha11 리간드 및 hIL-15 또는 5) 각각 30 ng/ml mIL-2 및 hIL-15와 함께 배양하였다. 세포를 21 시간 이후에 수집하고, 세척하고, RP10 배지에 재현탁하였고 수를 측정하였다. 세포를 그 후 실시예 41A에 기술한 바와 같이, ⁵¹Cr-표지 YAC-1 또는 EL4 표적 세포를 용해하는 능력에 대하여 분석하였다.

일반적으로 DX5^- (비-NK 세포)군으로부터의 NK 활성은 거의 없었지만, zalpha11리간드 및 hIL-15와 함께 배양된 DX5^- 세포는 E:T 82에서 25 %의 YAC-1 표적세포를 용해시켰다. 이에 비하여, hIL-15 단독과 함께 배양된 DX5^- 세포는 E:T 110에서 YAC-1 표적을 14 % 용해시켰다. 이는 이 세포 제조물에서 잔여 NK1.1⁺ NK 세포에 대하여 zalpha11 리간드와 IL-15가 함께 작용함을 시사한다. DX5⁺ 세포 제조물에 대하여는, 마우스 zalpha11 리간드 단독으로 처리하는 것은 효과세포의 작용을 유의하게 증가시키지 않았다 (YAC-1 세포의 용해는 미처리군과 유사하였다). 예상되는 바와 같이, IL-2와 IL-15 둘 모두 NK 활성을 유의하게 개선시켰다. 그러나, 용해의 가장 높은 수준은 zalpha11 리간드 및 hIL-15로 처리된 군에서 검출되었다 (hIL-15 단독처리군의 E:T 4에서 45 % 용해에 비하여, E:T 3.3에서 YAC-1의 65 % 용해). 모두를 종합하면, 이들 결과는 zalpha11 리간드 단독은 NK 세포 용해 활성을 증가시키지 않지만 IL-15와 함께 투여되면 성숙 NK 세포의 NK 용해 활성을 증가시킴을 시사한다.

실시예 42

T-세포 증식 분석에서 사람 및 마우스 T-세포의 zalpha11 리간드 증식

A. 마우스 T-세포의 마우스 zalpha11 리간드 증식

C57Bl/6 마우스 (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)로부터의 T 세포를, 합하여진 비장세포 및 겨드랑이, 상박, 서혜부, 경부, 및 장간막 림프절 (LN)로부터의 림프구로부터 분리하였다. 비장을 분리하고 결빙-말단 유리 슬라이드와 함께 짓이겨 세포 현탁물을 제조하였다. LN을 폴셉으로 절단하여 세포 여과기를 통과시켜 잔해를 제거하였다. 합하여진 비장세포 및 LN 세포를 두 단계로 이어진 MACS 자기 분리 컬럼을 사용하여 제조자의 지시에 따라 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) CD8⁺ 및 CD4⁺ 서브세트로 분리하였다. 전체 흉선 세포를 동일한 마우스로부터 수집하였다.

다양한 농도의 항-CD3 mAb 2C11 (PharMingen)로 4 ℃에서 밤새 사전-코팅한 평바닥 평판 96-웰 평판에서, 증가하는 농도의 (0 내지 30 ng/ml)(실시예 24 및 실시예 29) 정제된 마우스 zalpha11 리간드와 함께, 세포를 3 x 10⁵ 세포/웰 (흉선세포) 또는 10⁵ 세포/웰 (성숙 T-세포)로 37 ℃에서 3일간 배양하였다. 항-CD3 항체가 T-세포 리셉터를 통하여 마우스의 T-세포를 활성화하는 역할을 하였다. 각 웰은 제 2 일에 1μCi ³H-티미딘으로 펄스를 가하고 16 시간 후 평판을 수집하여 측정하여 증식을 평가하였다.

T-세포 증식 분석에서 zalpha11 리간드를 시험할 때, 그것이 항-CD3-활성화 마우스 흉선세포를 공동-자극하여서 CD8⁺CD4^- 세포 (항-CD3+zalpha11 리간드와 함께 배양된 흉선세포의 대부분은 배양 제 3 일까지 CD8⁺CD4^-인 반면, 항-CD3 단독과 함께 배양된 세포는 이 표현형을 제 5 일까지 유의하게 나타내지 않았다)의 성장을 가속화하게 되는 것을 발견하였다. 항-CD3의 부재 하에는 zalpha11 리간드에 대한 유의한 수준의 흉선세포 증식이 관찰되지 않았다.

흥미롭게도, 성숙 말단 마우스 T 세포를 zalpha11 리간드+항-CD3에 대한 그것의 반응에 대하여 분석하였을 때, 오직 CD8⁺만이 zalpha11 리간드에 대한 투여량- 의존 방식으로 반응하며 CD4⁺ 서브세트는 반응하지 않음을 발견하였다. 또한, zalpha11 리간드 단독에 반응한 CD8⁺ 세포의 약하지만 재현성 있는 증식 (CD4⁺ 세포에서는 나타나지 않음)을 관찰하였다. 흥미롭게도, 이것은 사람 T-세포에 대하여는 관찰되지 않았다 (하기 실시예 42B 참조).

B. 사람 T-세포의 사람 zalpha11 리간드 증식

(하기) 실시예 43에 기술된 바와 같이 사람 CD8+ 및 CD4+ 세포를 PBMC로부터 분리하였다. 다양한 농도의 항-사람 CD3 mAb UCHT1 (PharMingen)로 4 ℃에서 밤새 사전-코팅한 평바닥 평판 96-웰 평판에서, 증가하는 농도의 (0 내지 50 ng/ml) (실시예 24) 정제된 사람 zalpha11 리간드와 함께, 세포를 약 10⁵ 세포/웰로 37 ℃에서 3일간 배양하였다. 각 웰은 제 2 일에 1μCi ³H-티미딘으로 펄스를 가하고 16 시간 후 평판을 회수하여 측정하여 증식을 평가하였다. 마우스 T-세포의 결과와는 달리, 이 예비적 데이터는 사람 zalpha11 리간드는 CD4+ 사람 T 세포를 투여량-의존 방식으로 공동-자극하지만 CD8+ 사람 T-세포는 그렇게 하지 않음을 시사한다.

실시예 43

실시간 PCR이 사람 CD4+ 세포에서의 zalpha11 리간드 발현을 나타냄

A. 사람 zalpha11 리간드 발현을 평가하는데 사용되는 1 차적 공급원으로서의 정제된 사람 T-세포

전혈 (150 ml)을 건강한 사람 기증자로부터 채혈하여 50 ml 코니칼 시험관에 서 PBS와 1:1로 혼합하였다. 30 ml 희석 혈액을 그 후 15 ml Ficoll Paque Plus (Amersham Pharmacia Biotech. Uppsala, Sweden) 위에 층지게 놓았다. 이 구배를 30 분 간 500 g에서 원심분리하여 제동 없이 서도록 허용하였다. 경계면(PBMC)에서 RBC-감소 세포를 수집하고 PBS로 세 차례 세척하였다. 분리된 사람 PBMC 수율은 하기된 선택 이전에 200 x 10⁶이었다.

PBMC를 1.5 ml MACS 완충액 (PBS, 0.5 % EDTA, 2mM EDTA)에서 현탁하고 3 x 10⁶ 세포를 대조군 RNA 및 유동 세포주측 분석용으로 남겨두었다. 그 다음 0.25ml 항-사람 CD8 마이크로비드 (Miltenyi Biotec)를 첨가하고 혼합물은 4 ℃에서 15 분간 항온처리하였다. 이들 세포를 CD8 비드로 표지하였고 30ml MACS 완충액으로 세척한 후 2 ml MACS 완충액에 재현탁하였다.

VS+ 컬럼 (Miltenyi)를 제조자의 지시에 따라 준비하였다. VS+ 컬럼을 그 다음 VarioMACS 자기장 (Miltenyi)에 놓았다. 컬럼은 5 ml MACS 완충액으로 평형화시켰다. 그 다음 분리된 1차 마우스 세포를 컬럼에 적용하였다. CD8 음성 세포를 통과하도록 허용하였다. 컬럼을 9 ml (3 x 3 ml) MACS 완충액으로 헹구었다. 그 후 컬럼을 자기장에서 분리하여 15 ml 펠콘 시험관에 옮겼다. 컬럼에 MACS 완충액을 첨가하여 CD8+ 세포를 용리시키고 결합한 세포를 제조자가 공급한 플런저를 사용하여 쏟아부었다. 사람 말초 T 세포로부터 선택된 CD8+의 수율은 약 51 X 10⁶ 총 세포였다. CD8-음성 유동 통과 세포를 수집하고, 수 측정하고, 항-사람 CD4 코팅된 비드로 염색한 다음 항온처리하고 상기한 농도와 동일한 농도에서 새로운 VS+ 컬럼을 통과시켰다. CD4+ 선택된 사람 말초 T-세포의 수율은 42 X 10⁶ 총 세포였다.

CD8+ 및 CD4+ 선택 사람 T 세포의 각각 샘플을 형광 활성화 세포 분리기 (FACS) 상에서의 염색 및 분리용으로 분리하였다. PE-융합 항-사람 CD4 항체, 항-사람 CD8-FITC Ab, 및 항-사람 CD19-CyChrome Ab (모두 PharMingen 유래)를 CD8+ 및 CD4+ 선택 세포를 염색하는 용으로 사용하였다. 이 제 1의 실험에서 CD8-선택 세포는 80 % CD8+이었고, CD4-선택 세포는 85 % CD4+였다. 2 개의 연속된 실험에서 (실시예 43B), 각각 CD8+ 정제 세포는 84 % 및 81 % 순수하였고 CD4+ 세포는 85 % 및 97 % 순수하였다. 한 실험에서, 비-결합 (유동 통과) 세포를 CD19-코팅된 비드로 염색하였고 제 3의 자기 비드를 통과시켜 CD19+ B 세포를 분리하였다(92 % 순수).

사람 CD8+, CD4+, 및 CD19+ 선택 세포를 0.5 x 10⁶ 세포/ml로 RPMI+5 % 사람 초혈청 (Gemini Bioproducts, Calabasas, CA) + PMA 10 ng/ml 및 이오노마이신 0.5 ㎍/ml (Calbiochem) 에서 4, 16 또는 24 시간동안 37 ℃에서 활성화시켰다. T-세포 (2.5 x 10⁶/웰)를, 0.5 ㎍/ml 평판-결합 항-CD3 mAb UCHT1 (PharMingen)로 사전-코팅된 24-웰 평판에서, 용해성 항-CD28 mAb (PharMingen) 5 ㎍/ml 존재 또는 부재하에서 선택적으로 자극하였다. 각 시점에서, 세포를 수집하고, 펠렛화하고, PBS로 한 차례 세척하고, 다시 펠렛화하였다. 상층액을 제거하고 펠렛을 드라이아이스/에탄올 욕에서 급속-동결시키고 나중의 RNA 제조용으로 -80 ℃에서 저장하였다.

사람 zalpha11 리간드와 리셉터 발현을 평가하기 위하여, 이들 사람 CD8+, CD4+ 및 CD19+ 선택 세포 상에 실시간-PCR이 하기 실시예 43B 및 실시예 43C에 기술된 바와 같이 수행되었다.

B. 사람 zalpha11 리간드 발현에 대한 정량적 RT-PCR용 프라이머와 프로브

ABI PRISM 7700 서열 결정 시스템 (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)을 사용한 실시간 정량 RT-PCR이 이전에 기술되었다 (Heid, CA et al., Genome Research 6: 986-994, 1996; Gibson, UEM et al., Genome Research 6: 995-1001, 1996; 및 Sundaresan, S et al., Endocrinology 139: 4756-4764, 1998). 이 방법은 리포터와 억제(quencher)염료 모두를 포함하는 유전자 특이적 프로브의 사용을 포함한다. 프로브가 온전한 경우 리포터 염료 방출은 억제 염료의 근접 때문에 감소된다. 추가적 유전자-특이적 순방향 및 역방향 프라이머를 사용하는 PCR 연장 동안, 프로브는 Taq 중합효소의 5' 뉴클라제 활성에 의하여 절단되어 이는 리포터 염료를 해리시켜 형광 방출을 증가시킨다.

실시간 정량 RT-PCR 분석에 사용되는 프라이머와 프로브는 프라이머 고안 소프트웨어인 Primer ExpressTM (PE Applied Biosystems)를 사용하여 고안하였다. 사람 zalpha11 리간드에 대한 프라이머는 인트론-엑손 리게이션을 포괄하여 게놈 DNA를 제거하도록 하여 고안되었다. 순방향 프라이머 ZC22,281 (SEQ ID NO:90)와 역방향 프라이머 ZC22,279 (SEQ ID NO:91) 둘 모두를 300 nM 농도로 사용하여 80 bp 산물을 제조하였다. 대응하는 zalpha11 리간드 TaqMan 프로브, ZG23 (SEQ ID NO:92)를 PE Applied Biosystems에 의하여 합성하였다. 프로브는 5' 말단에 리포터 형광 염료 (6-카르복실-형광)(FAM)(PE Applied Biosystems) 및 3' 말단에 억제 형광 염 료 (6-카르복실-테트라메틸-로다민)(TAMRA)(PE Applied Biosystems)로 표지하였다. 모든 RNA 샘플의 완전성 및 품질을 시험하기 위하여, PE Applied Biosystems로부터 주문한 프라이머와 프로브 세트 (cat No. 4304483)를 사용하여 rRNA에 대하여 스크리닝하였다. 이 프로브에 대한 리포터 형광염료는 VIC (PE Applied Biosystems)이다. rRNA 결과는 zalpha11 리간드 결과의 표준화를 허용할 것이다.

제조자의 지시에 따라 RNeasy Miniprep^TM Kit(Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 실시예 43A에서 제공된 펠렛으로부터 RNA를 준비하였다. 사람 zalpha11 리간드를 발현하는 약 천만 BHK 세포로부터 대조군 RNA를 준비하였다.

C. 사람 zalpha11 리셉터 발현에 대한 정량적 RT-PCR용 프라이머와 프로브

실시예 43A에 상세히 기술된 조건에서 준비된 세포와 zalpha11 리셉터에 특이적인 프로브를 사용하여 실시예 43B 및 실시예 43D에 따라 실시간 PCR이 수행되어 zalpha11 리셉터의 발현을 평가하였다. 순방향 프라이머 ZC22,277 (SEQ ID NO:93)와 역방향 프라이머 ZC22,276 (SEQ ID NO:94)을 PCR반응 (상기)에서 300 nM 농도로 사용하여, 143 bp 산물을 합성하였다. ZC31(SEQ ID NO:95)로 표시되는, 대응하는 zalpha11 TaqMan

프로브를 PE Applied Biosystems에 의하여 합성하고 표지하였다. 사람 zalpha11 리셉터를 발현하는 BaF3 세포로부터 RNA를 사용하여, 하기 실시예 43D에 기술된 실시간 PCR에 대한 표준 곡선용으로 적당한 대조군을 제조하였다.

D. 실시간 정량 RT-PCR

한단계 RT-PCR 방법 (PE Applied Biosystems)을 사용하여 총 RNA 샘플의 분석에 의하여 zalpha11 리간드 RNA의 상대적인 수준이 측정되었다. 사람 zalpha11 리간드를 발현하는 BHK 세포로부터의 RNA를 사용하여 표준 곡선을 제작하였다. 곡선은 중복된 세 벌로 분석되는 각 포인트에서 rRNA 스크리닝에 대하여 2.5 내지 2.5x 10^-4 ng, zalpha11 리간드 스크리닝에 대하여 25 내지 0.0025 ng의 순차적 희석으로 구성되었다. 총 RNA 샘플은 또한 내재적 대조군으로서 사람 zalpha11 리간드 전사체 수준 및 rRNA 수준에 대하여 중복된 세 벌로 분석되었다. 각 한단계 RT-PCR 반응은 총 부피 25 ㎕에 완충액 A (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, 및 내부적 표준 염료인 ROX (PE Applied Biosystems)) 내의 25 ng 총 RNA, 적당한 프라이머 (rRNA 샘플용으로 50 nM, zalpha11 리간드 샘플용으로 300 nM) 및 프로브 (rRNA용으로 50 nM, zalpha11 리간드용으로 300 nM), 5.5mM MgCl₂, 각 300 μM의 d-CTP, d-ATP 및 d-GTP와 600 μM의 d-UTP, 역전사효소 (0.25 U/㎕), AmpliTaq DNA 중합효소 (0.025 U/㎕) 및 RNase 저해제 (0.4 U/㎕)로 구성된다. 열 순환 조건은 48 ℃에서 30분 동안의 최초 RT 단계, 95 ℃에서 10 분 동안의 AmpliTaq Gold 활성화 단계, 이어서 95 ℃에서 15 초 동안 및 60 ℃에서 1분 동안의 40 사이클의 증폭으로 구성되었다. rRNA 계산을 사용하여 zalpha11 리간드 수준을 표준화하여, User Bulletin No.2 (PE Biosystems; User Bulletin #2: ABI Prism 7700 Sequence Detection System, Relative Quantitation of Gene Expression, December 11, 1997)에 기술된 표준 곡선 방법에 의하여 상대적 zalpha11 리간드 RNA 수준을 결정하였다. 각 실험 에서 샘플을 보정 인자에 상대적으로 비교하였다. 보정 인자는 양질의 RNA와 다른 샘플이 유의하게 비교될 수 있는 발현 수준을 기준으로 임의로 선택되었다. 자극되거나 자극되지 않은 세포에서의 zalpha11 리간드 및 zalpha11 리셉터의 발현 (실시예 43A)을 분석하는 실험의 결과는 하기 실시예 43E에 기술된 것과 같다.

E. CD4+, CD8+ 및 CD19+ 세포에서 사람 zalpha11 리셉터 및 리간드의 발현

제 1의 실험은 상기된 RT-PCR을 사용하여, 자극되지 않은 및 항-CD3 자극된 CD4+ 및 CD8+ 샘플에서, 자극 후 시점 0h (자극되지 않은("휴지") 세포), 및 4h, 15.5h 및 24h에서의 zalpha11 리셉터 발현을 평가하였다. 휴지 CD4+ 샘플은 보정 인자로서 임의로 선택되어 값 1.00로 주어졌다. 4h 내지 24h 동안의 배양물로부터 비자극 CD4+ 세포에서 리셉터 발현이 약 4 배 증가되었고, 동일한 기간동안 항-CD3 자극 CD4+ 세포에서는 약 8 배 증가되었다. CD8+ 세포는 제 4h에서 정점을 이루고 시간에 따라 감소되는 zalpha11 리셉터 발현이 7 배 증가됨을 나타냈다. 항-CD3 자극이 있으면, CD8+ 세포는 리셉터 발현에서 일정한 8 배 증가를 나타냈다.

제 1의 실험은 또한 상기된 RT-PCR을 사용하여, 자극되지 않은 및 항-CD3 자극된 CD4+ 및 CD8+ 샘플에서의 zalpha11 리셉터 발현을 평가하였다. 4시간 항-CD3 자극된 CD8+ 샘플은 보정 인자로서 임의로 선택되어 값 1.00이 주어졌다. 결과는 자극되지 않은 CD4+ 및 CD8+ 세포는 zalpha11 리간드를 발현하지 않음을 나타내었다. 제 4h에서 항-CD3 자극된 CD4+ 세포에서 유의한 발현 증가가 관찰되었고 15.5h에서 약 300 배 증가를 나타내었다. 항-CD3 자극에 대하여 CD8+ 세포는 소량의 리간드를 발현하였지만, 이는 아마도 소량의 CD4+ 로 CD8+ 집단이 오염되었기 때문일 것이다.

제 2의 실험은 상기된 RT-PCR을 사용하여, 항-CD3 자극된, PMA+이오노마이신-자극된 및 자극되지 않은 CD4+ 및 CD8+ 샘플에서, 활성화 후 시점 0h, 및 3.5h, 16h 및 24h에서의 zalpha11 리셉터 발현을 평가하였다. 휴지 CD8+ 샘플은 보정 인자로서 임의로 선택되어 값 1.00로 주어졌다. 휴지 CD4+ 및 CD8+ 세포는 유의한 양의 리셉터 발현을 가지지 않았다. PMA+이오노마이신-자극 CD4+ 샘플에서 자극 후 3.5h, 16h 및 24h에서 발현이 약 3 배 더 높았다. 항-CD3 활성화 CD4+ 세포의 발현은 자극 후 3.5h에서 백그라운드보다 10배 높은 정점을 나타내었고 그 후 자극 후 16h에서 백그라운드의 4 배 수준으로 떨어졌다. PMA+이오노마이신-자극 3.5h 후 CD8+ 세포는 4 배의 발현 증가를 나타내었고 그 후의 시점에는 발현은 감소되었다. 제 1의 실험에서와 같이 항-CD3 자극 CD8+ 세포는 리셉터 발현의 백그라운드 유도보다 일정한 8 배 증가를 나타냈다.

제 2의 실험으로부터의 이들 샘플 또한 zalpha11 리간드 발현을 평가하는데 사용되었다. 24 시간 PMA+이오노마이신 자극된 CD4+ 샘플은 보정 인자로서 임의로 선택되어 값 1.00을 부여받았다. 결과는 다시, 자극되지 않은 어떤 세포도 zalpha11 리간드를 발현하지 않는 것을 나타내었다. 선행 실험에서 나타난 바와 같이(4h) 항-CD3 자극된 CD4+ 세포에서 3.5 h에서 리간드 발현의 약 30 배의 유도가 있었다. 그러나, PMA+이오노마이신 자극으로는 3.5h에서 단지 약 5 배의 유도만이 있었고 이어지는 시점에서는 감소되었다. 다시, CD8+ 세포는 소량의 리간드를 발현하였는데 이는 CD4+ 세포의 오염때문일 것이다.

최종 실험은 상기된 RT-PCR을 사용하여, 항-CD3 및 항-CD3/항-CD28- 자극된 및 자극되지 않은 CD4+ 및 CD8+ 샘플에서, 활성화 후 시점 0h, 및 2h, 4h 및 16h에서의 zalpha11 리셉터 발현을 평가하였다. PMA+이오노마이신으로 활성화된 CD19+ 세포 또한 동일한 시간 간격으로 리셉터 발현에 대하여 스크리닝 되었다. 휴지 CD4+ 샘플은 보정 인자로서 임의로 선택되어 값 1.00로 주어졌다. 2시간 항-CD3 자극 CD4+ 세포는, 선행 실험의 3.5 h에서의 10 배 유도에 비교하여, 단지 4 배의 리셉터 유도를 나타내었다. 항-CD3과 항-CD28의 조합은 zalpha11 리셉터 발현을 백그라운드보다 8 배까지 증가시켰다. 16 시간 항-CD3/항-CD28- 자극 CD8+ 세포는, 선행 실험 (상기)에서의 CD8+ 세포에서 나타난 것과 같이, 매우 낮은 zalpha11 리셉터 발현 수준을 가졌다. PMA+이오노마이신으로 활성화된 CD19+ 세포는 2시간에 19 배 증가로서 가장 유의한 zalpha11 리셉터 발현을 가졌으나 발현 수준은 16h에 다시 휴지세포 수준으로 감소하였다.

최종 실험으로부터의 이들 샘플 또한 RT-PCR에 의하여 zalpha11 리간드 발현을 평가하는데 사용되었다. 16 시간 항-CD3/항-CD28 자극된 CD8+ 샘플은 보정 인자로서 임의로 선택되어 값 1.00을 부여받았다. 결과는 항-CD3자극이 있으면 제 2h에서 CD4+세포가 zalpha11의 약 2 배의 유도를 나타내고, 항-CD3+항-CD28 자극이 있으면 약 5 배의 유도를 나타내는 것을 나타내었다. 이들 자극 조건은 리간드 발현을 시간에 따라 리간드 발현을 유도하였는데 16 h에 CD4+ 세포는 백그라운드 수준의 70 배 리간드 발현을 나타내었다. CD8+ 및 CD19+ 세포는 zalpha11리간드 발현을 보이지 않았다.

수집혈 사이 (즉, 상이한 시간에서 동일한 환자로부터의 및 상이한 환자로부터의 다 샘플)에 일정량의 편차가 예상되었다. 그러므로, 총체적 결론을 위하여 데이터 경향은 각 연구에서 또는 단일 혈액 샘플로부터 분석되거나 상기 세가지 실험이 비교되었다. 상기된 실시간 PCR 실험으로부터의 경향은 시험된 모든 세포형 중에서 PMA+이오노마이신으로 활성화된 CD19+ B 세포가 가장 높은 수준의 zalpha11 리셉터 RNA를 발현하는 것이다. CD4+ 및 CD8+ 세포는 또한 리셉터를 발현하도록 자극될 수 있지만, B 세포에서 보다는 낮은 수준에서이다. zalpha11 리간드는 거의 유일하게 자극된 CD4+ T 세포에서 발현된다(CD8+ T 세포나 CD19+ B 세포에 의하여는 발현되지 않음). PMA+이오노마이신 자극이 양호한 zalpha11 리간드 신호를 유도하였지만, 생체내에서 항원이 만나게 되는 조건에 더 유사한, 항-CD3 mAb 또는 항-CD3과 항-CD28 mAb의 조합으로 자극된 CD4+ T 세포로부터 유의하게 높은 신호가 얻어졌다.

실시예44

항-CD40 또는 항-IgM 자극된 B 세포 세포의 zalpha11 리간드-의존성 증식

A. 사람 B 세포의 정제

1 x 10⁸의 성분분리된 사람 말초혈 단핵세포(PBMCs)를 함유하는 바이알을 37°C 수욕에서 급속히 해동하였고, 50ml 시험관에 25ml의 B세포 배지(RPMI 배지 1640(JRH Bioscience. Lenenxa, KS), 10% 가열 불활성화된 태반 보 혈액, 5% L-글루타민, 5% Pen/Strep)(Gibco BRL)에 재현탁하였다. 세포들은 트립판 블루(Gibco BRL)를 이용하여 세포의 생존능력을 시험하였다. 10㎖의 Ficoll/Hypaque Plus(Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ)를 세포 아래에 층지게 하고 30분간 1800rpm으로 회전시킨 후 제동 없이 정지하도록 하였다. 그 후 경계면을 분리하여 신선한 50 ml Falcon 시험관으로 옮겨 PBS로 최종 부피 40 ml를 만들고 1200 rpm에서 10 분간 제동과 함께 회전시켰다. 분리된 세포의 생존능력을 트립판 블루를 사용하여 다시 시험하였다. 선택적으로 신선하게 채취된 사람 혈액을 PBS(Gibco BRL)과 1:1로 희석시키고 Ficoll/Hypaque Plus(Pharmacia) 위에 층지게 올려 놓고, 회전시키고 상기와 같이 세척하였다. 신선한 공급원 또는 동결 공급원으로부터 분리된 세포는 대등한 결과를 보였다.

제조자의 지시에 따라 항-CD19 자기 비드(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)로 정상 사람 공여자의 피콜 부양된 말초혈 세포로부터 B-세포룰 정제하였다. 만들어진 제조물의 순도는 항-CD22 FITC 항체(Pharmingen, San Diego, CA)로 유동 세포주측 분석를 이용하여 관찰되었다. B-세포 제조물은 전형적으로 >90% 순도이다.

B. 마우스 B 세포의 정제

B 세포 배지에서 성체 C57Bl/6 마우스(Charles River Laboratories. Wilmington, MA)의 비장을 굽은 주사바늘로 가늘게 찢어서 마우스 비장세포의 현탁액을 준비하였다. 적혈구는 저장액 용해로 제거되었다. CD43 양성 세포를 제조자의 지시에 따라서 CD43 자기 비드로 분리하였었다. 준비된 제조물의 순도를 항-CD45 FITC 항체(Pharmingen)로 유동 세포주측 분석를 이용하여 관찰하였다. B-세포 제조물은 전형적으로 >90% 순도이다.

C. 사람 또는 마우스 zalpha11 리간드의 존재하에서의 항-CD40-자극된 B-세포의 증식

B-세포 배지에서 최종 농도 1 x 10⁶세포/㎖로 사람 또는 마우스 공급원으로부터의 B 세포를 현탁하였고, 다양한 자극 조건을 최종농도 200㎕/웰의 부피로 함유하는 96웰 U 바닥 평판(Falcon, VWR)에 100㎕/웰로 플레이팅하였다. 항-CD-40 자극을 위하여 1㎍/㎖의 항-사람 CD40(Genzyme, Cambridge, MA)를 사람 배양액에, 1㎍/㎖의 항-마우스 CD40(Serotec,UK)를 마우스 배양액에 공급하였다. 사람 또는 마우스 zalpha11 리간드가 1pg/㎖ - 1ng/㎖ 의 희석 범위로 첨가되었다. 25㎎/㎖의 용해성 사람 zalpha11CEE(실시예 10A)로 zalpha11 리간드 저해로써 zalpha11 효과의 특이성을 확인하였다. 모든 처리는 중복한 세 벌로 수행되었다. 그 후에 세포를 37°C의 습식 배양기에서 120시간(사람) 또는 72시간(마우스) 배양하였다. 수집하기 16시간전 1μCi ³H-티미딘(Amersham, Piscataway, NJ)을 B-세포가 증식되었는가를 평가하기 위하여 웰에 첨가하였다. 제조자의 지시에 따라서 세포 수집기(Packard)를 이용하여 세포를 96웰 여과지 평판(UniFilter GF/C, Packard, Meriden, CT)에 수집되었다. 평판은 55°C에서 20-30분간 건조되었고 웰의 바닥은 불투명한 평판 봉입기로 봉입되었다. 각각의 웰에 0.25㎖의 신틸레이션 용액(MIcroscint-O, Packard)을 첨가하고, 평판을 TopCount Microscint Scintillation Counter(Packard)를 이용하여 판독하였다.

3ng/㎖ 또는 그 이상 농도의 zalpha11과 배양은 용해성 항-CD40으로 유도된 증식을 마우스 및 사람 B-세포에서 양 의존적 방식으로 많게는 30배까지 향상시켰다. 마우스 및 사람 B-세포는 동일하게 그들의 각각 zalpha11 리간드에 반응하였다. 두 종 모두에 있어서, 자극은 zalpha11 리간드에 특이하며, 배양에 용해성 zalpha11 리셉터의 존재로 환원할 수 있었다.

D. 사람 및 마우스의 zalpha11 리간드의 존재하 항-IgM-자극된 B-세포의 증식

상기와 같은 사람 또는 마우스 공급원으로부터의 B-세포(실시예 44A 및 실시예 44B)를 상기와 같이 플레이팅하였다(실시예 44C). 사람 세포의 항-IgM 자극을 위하여 평판을 10㎎/㎖ F(ab')2 항-사람 IgM 항체(Southern Biotech Associates, Birmingham, Alabama)로 밤새 사전-코팅하였고 사용 직전에 멸균 배지로 세척하였다.배양에 0-10ng/㎖ 사람 rIL-4(R&D Systems, Minneapolis, MN)을 보충하였다. 마우스 세포의 항-IgM 자극을 위하여, 용해성 항-IgM(Biosource, Camarillo, CA)를 배양에 10mg/㎖로 첨가하였다. 선행 항-IgM/IL-4 조건 각각에 사람 또는 마우스의 zalpha11 리간드를 1pg/㎖ - 100ng/㎖의 희석 범위로 첨가하였다. zalpha11 리간드 효과의 특이성은 용해성 사람 zalpha11 리셉터에 의한 저해로 상기와 같이 확인되었다(실시예 44C). 모든 처리는 중복한 세 벌로 수행되었다. 실시예44C에 기술한 바와 같이 세포를 ³H-티미딘과 함께 배양하여 표지하고, 수집하고, 분석하였다.

농도 0.3ng/㎖ 또는 그 이상의 zalpha11 리간드와의 배양은 불용성 항-IgM(마우스) 또는 항-IgM 및 IL-4(사람)에 의한 증식을 투여량-의존적 방식으로 저해하 였다. 이러한 저해는 zalpha11 리간드 특이성이 나타내며, 배양내 zalpha11 리셉터의 존재로 환원된다.

실시예45

사람 zalpha11 용해성 리셉터의 대장균 에서의 발현

A. huzalpha11/MBP-6H 융합 단백질을 발현하는 발현 벡터 pCZR225의 제작

말토스 결합 단백질(MBP)과 C-말단에서 융합된 사람 zalpha11 용해성 리셉터를 함유하는 발현 플라스미드를 동종 재조합(homologous recombination)을 통하여 제작하였다. 사람 zalpha11 cDNA(SEQ ID NO:7)의 단편은 PCR을 사용하여 분리하였다. MBP-zalpha11 용해성 리셉터 융합 단백질의 폴리뉴클레오티드의 서열은 SEQ ID NO:96에서 나타난다. PCR 반응에서 사람 zalpha11 단편을 제조하기 위하여 2개의 프라이머를 사용하였다:(1) 벡터의 양쪽 인접서열 40bp 및 사람 zalpha11 아미노 말단에 대응하는 25bp를 함유하는 프라이머 ZC20,187(SEQ ID NO:98), 및 양쪽 인접 벡터 서열에 대응하는 3' 말단의 40bp 및 사람 zalpha11의 카르복실 말단에 대응하는 25bp를 함유하는 프라이머 ZC20,185(SEQ ID NO:99). PCR은 다음과 같이 수행되었다: 94°에서 30초, 50°C에서 30초, 및 72°C에서 1분의 25 사이클; 뒤이은 4°C에의 침액이 중복되어 수행되었다. 100㎕ PCR 반응중 2㎕를 1.0% 한천 겔상에서 1 x TBE 완충액에서 분석 용도로 전개하고, 예상되는 약 660bp의 단편을 관찰하였다. 나머지 90㎕의 PCR 반응은 두 번째 PCR 시험관에서 400㎕의 순수 에탄올로 침전시켰다. 침전된 DNA는 MBP-zalpha11 융합을 코딩하는 구성물을 제조하기 위해 SmaI으로 절단된 리셉터 벡터 pTAP98(실시예)에 재조합되었다. 클론들은 실시예31 에 기술된 바와 같이 형질전환시키고, 동정하고 성장시켰다. 양성 클론은 pCZR225로 명명되고 서열결정 분석하였다. MBP-zalpha11 용해성 리셉터 융합 폴리펩티드의 폴리뉴클레오티드의 서열은 SEQ ID NO:96에 보여지고, 대응하는 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO:97에 나타난다. 양성 클론은 huzalpha11/MBP-6H 융합 단백질의 단백질 정제용으로 실시예31에서와 같이 대장균에서 배양하는데 사용되었다(실시예46, 하기).

실시예46

대장균 발효로부터 huzalpha11/MBP-6H 용해성 리셉터의 정제

다르게 명시되지 않으면, 모든 조작은 4°C에서 수행되었다. huzalpha11/MBP-6H 용해성 리셉터 폴리펩티드를 정제하기 위해 다음의 과정이 사용되었다. pCZR225 구성물을 함유하고 huzalpha11/MBP-6H 용해성 리셉터(실시예45)를 발현하는 대장균이 SuperBrothⅡ(12g/L 카세인, 24g/L 효모 추출물, 11.4g/L 디-포타슘 포스페이트, 1.7g/L 모노-포타슘 포스페이트;Becton Dickenson, Cockeysville.MD)에서 성장시키고 0.5% 글리세롤에서 동결시켰다. SuperBrothⅡ + 글리세롤에서 동결된 세포 20 그람을 단백질 정제를 위해 사용하였다. 동결 세포를 해동하고 단백질 분해효소 저해제 용액(추출 완충액)에 1:10으로 희석하고, 세포를 용해시켜서, huzalpha11/MBP-6H 용해성 리셉터 단백질을 배출하였다. 희석된 세포는 최종농도로 20mM 트리스(JT Baker, Philipsburg, NJ), 100mM 염화 나트륨 (NaCl, Mallinkrodt, Paris, KY), 0.5mM 페닐메틸술포닐 플로리드(PMSF, Sigma Chemical Co., St.Louis, MO), 2㎍/㎖ 류펩틴(Fluka, Switzerland), 및 2㎍/㎖ 아 프로티닌(Sigma)를 함유한다. -7 내지 -10°C 및 30K PSI하 French Press 세포 분쇄 시스템(Constant Systems Ltd., Warwick, UK)을 이용하여 세포를 용해시켰다. 희석된 세포들의 분쇄는 French Press 수행 전 후의 A₆₀₀판독으로 확인하였다. 용해된 세포는 18,000G에서 45분간 원심분리하여 분해된 세포 잔해을 제거시키고, 상층액을 단백질 정제에 사용하였다. 상층액의 전체 표적 단백질 농도는 제조자의 지시에 따라서 BCA 단백질 분석(Pierce, Rockford, IL)을 이용하여 결정되었다.

25㎖ 컬럼의 Talon Metal Affinity 수지(Clontech, Palo Alto, CA)(하기와 같이 준비된)를 Bio-Rad, 2.5㎝ D x 10㎝ H 유리 컬럼에 부었다. 컬럼을 중력에 의하여 채우고 컬럼의 10배 부피의 Talon 평형 완충액(20mM 트리스, 100mM NaCl, pH 8.0)으로 평형화시켰다. 상층액은 밤새 Talon Metal Affinity 수지와 함께 진탕하여 회분 로딩하였다. 수지를 컬럼에 다시 붓고 중력으로 10CV의 Talon 평형 완충액으로 세척하였고, 그 이후 중력으로 140㎖의 용리 완충액(Talon 평형 완충액+200mM 이미다졸-Fluka Chemical)으로 용리시켰다. Talon 컬럼은 5CV의 20mM-2-(N-모르포리노) 에탄술폰산 pH 5.0(MES, Sigma), 5CV의 증류수로 세척하고, 20%에탄올/0.1% 나트륨 아지드에 보관하였다. 전체 크로마토그래피 용리중 14㎖의 분획을 수집하였고 분획은 280 및 320nm에서 흡광도를 판독하였고 BCA 단백질 분석을 하였다; 통과 및 세척 부분도 역시 모아서 보관하고 분석하였다. 관심의단백질 용리 분획을 수집하고 아밀로스 수지(New England Biolabs, Beverly, MA)에 바로 로딩하였다.

더 순수한 huzalpha11/MBP-6H 폴리펩티드를 얻기 위해서, Talon 친화성 분획 의 모아진 용리액을 아밀로스 수지(22㎖)에 pH 7.4 로딩하였다. 2.5㎝ D x 10㎝ H Bio-Rad 컬럼에 붓고, 채우고, 10CV의 아밀로스 평형 완충액-20mM 트리스(JT Baker), 100mM NaCl(Mallinkrodt), 1mM PMSF(Sigma), 10mM 베타-머캅토에탄올(BME, ICN Biomedicals Inc., Aurora, OH), pH 7.4로 평형화하였다. 샘플은 0.5㎖/분의 속도로 중력으로 로딩하였다. 컬럼을 10CV의 아밀로스 평형 완충액으로 세척한 후, 약 2CV의 아밀로스 평형 완충액+10mM 말토스(Fluka Biochemical, Switzerland)로써 중력으로 용리시켰다. 전체 크로마토그래피중 5㎖의 분획을 수집하였고, 280 및 320nm에서의 흡광도를 판독하였다. 아밀로스 컬럼은 1CV의 증류수, 5CV의 0.1%(w/v)SDS(Sigma), 5CV의 증류수 및 5CV의 아밀로스 평형 완충액으로 재생시켰다.

관심의 분획을 수집하고, Slide-A-Lyser(Pierce)에 넣어 4 x 4L PBS pH 7.4(Sigma)에서 투석하여 저분자 오염물질을 제거하고 완충액의 교환 및 염의 제거하였다. PBS로 교환한 후, 수집된 물질이 정제된 huzalpha11/MBP-6H 폴리펩티드이다. 정제된 huzalpha11/MBP-6H 폴리펩티드는 SDS-PAGE 쿠마시 염색법 및 항-토끼 HRP 접합 항체(Rockland, Gilbertsville, PA)를 이용한 웨스턴 블롯으로 분석하였다. huzalpha11/MBP-6H 폴리펩티드의 농도는 BCA분석에 의하여 1.92mg/㎖로 결정되었다.

정제된 huzalpha11/MBP-6H 폴리펩티드는 토끼 주사용으로 준비되었고, R & R Research and Development(Stanwood, WA)에 항체 생산을 위하여 보냈다. 항-huzalpha11/MBP-6H 혈청을 생산하기 위하여 토끼에 주사하였다.

실시예47

zalpha11 리셉터 다클론 항체

두 마리의 암컷 뉴질랜드 백색 토끼를 정제된 huzalpha11/MBP-6H 폴리펩티드(실시예46), 또는 정제된 재조합 zalpha11CEE 용해성 리셉터(실시예10A)로 면역화시켜서 다클론 항체를 제조하였다. 대응하는 다클론 항체는 토끼 항-huzalpha11/MBP-6H 및 토끼 항-huzalpha11-CEE-BHK로 각각 명명하였다. 토끼에 Complete Freud's Adjuvant(Pirece, Rockford, IL)상 200mg의 정제된 단백질을 초기 IP 주사하고, 이 후 Incomplete Freud's Adjuvant상 100mg의 정제된 단백질을 매 3주마다 추가로 주사하였다. 3차 추가 주사후 7일 내지 10일 경과후 동물의 혈청을 채취하였다. 그 후 토끼는 3주마다 추가 주사하고 혈액 채취하였다.

zalpha11-특이적 다클론 항체는 토끼 혈청으로부터 CNBr-SEPHAROSE 4B 단백질 컬럼(Pharmacia LKB)를 이용하여 친화 정제하였으며, CNBr-SEPHAROSE 4B 단백질 컬럼은 CNBr-SEPHAROSE당 10mg의 정제된 huzalpha11/MBP-6H 폴리펩티드를 이용하여 준비하고, PBS에서 밤새 20X 투석하였다. zalpha11-특이성 항체는 1mg/㎖의 적당한 단백질 항원을 항체의 표적으로 이용한 ELISA 역가 분석으로 특성화되었다. huzalpha11/MBP-6H 친화성 정제된 항체의 검출의 하한(LLD)은 500pg/㎖의 희석이다. 토끼 항-huzalpha11-CEE-BHK 친화성 정제된 항체의 LLD는 50pg/㎖의 희석이다.

실시예48

zalpha11 리셉터 분포

다양한 세포 타입에서 zalpha11 리셉터의 분포를 측정하기 위해서, 사람 리 셉터(실시예35 및 실시예47)에 대한 토끼 다클론 및 마우스 단일클론 항체(mAbs)를 준비하였고 유동 세포주측에서의 사용을 위하여 바이오틴에 접합시켰다. 초기에 상대적으로 낮은 친화성을 갖는 다클론 항체를 세포주 패널:IL-3 의존성 마우스 전-B 세포주 야생형 BaF3 세포(Palacios and Steinmetz, ibid.;Mathey-Prevot et al.,ibid.); 사람 zalpha11으로 형질전환된 BaF3 세포(실시예4); 사람 Burkitt's 림프종 세포주 Raji(ATCC No.CCL-86), Ramos(ATCC No.CRL-1596), RPMI 8226(ATCC No. CCL-155) 및 Daudi(ATCC No. CCL-213); 사람 T세포 백혈병 세포주 Jurkat(ATCC No. TIB-152); 사람 골수 단핵 세포 백혈병 세포주 Thp-1(ATCC No. CCL-240); 마우스 B세포 림프종 세포주 A20(ATCC No. TIB-208); 및 마우스 흉선종 세포주 EL4(ATCC No. TIB-39)의 염색에 이용하였다.

세포들을 수집하고, 혈청(WBS)이 있는 FACS 세척 완충액으로 한 차례 세척하였다. WBS는 Hank's 균형 염액(Gibco/BRL) + 10mM HEPES(Gico/BRL) + 1% BSA(Sigma) + 10% 정상 염소 혈청(Gemini Bioproducrs, Woodland, CA) + 10% 정상 토끼 혈액(Sigma)로 구성된다. 세척 완충액 (WB)은 혈청이 존재하지 않는 것만을 제외하고 WBS와 동일하다. 세척 후, 세포들을 10㎍/㎖의 토끼 항-zalpha11 다클론 항체(실시예47)을 함유하는 100㎕의 WB에 재현탁시켰다. 세포들은 항체와 함께 얼음상에서 20분간 반응시킨후, WB로 세척시키고, 염소 항-토끼-FITC(BioSource, Dickenson)으로 분석하였다. 대조군 샘플은 2차 염소 항-토끼-FITC 항체로만 염색하였다. 양성 염색은 이차항체로만 염색시킨 것보다 위로 이동된 것으로 정의된다. 다클론 항체는 낮은 친화도를 갖지만, BaF3/zalpha11 형질전환체, 모든 제가지 Burkitt's 림프종(Raji, Ramos, Daudi, 및 RPMI 8226), 및 Jurkat T 세포상에서 zalpha11 발현을 확실하게 검출하였다. 휴지(미분화)HL-60 세포는 항-zalpha11 항체와 결합하지 않았지만, HL-60 세포를 단핵 백혈구-유사 세포로 분화를 유도하는 PMA(Calibiochem, La Jolla, CA)로 24시간 활성화된 HL-60상에서는 양성 신호를 검출할 수 있었다. 역시 UT937 및 Thp-1세포상에서도 비-특이적 결합에 의한 신호일 수 있지만, 양성 신호를 검출하였다. 다클론 항체는 마우스 B 세포주 A20에 약하게 교차-반응성을 갖지만 EL4 마우스 흉선종은 염색되지 않았다.

네 가지 항-zalpha11 단일클론 항체(실시예35)를 바이오틴에 접하시켰고, 상기 기술된 세포의 서브세트를 zalpha11 리셉터 발현을 검색하기 위하여 사용하였다(BaF3, BaF3/zalpha11, Raji, Jurkat, 및 휴지 HL-60). 세포를 수집하고, 세척하고, 15㎕/ml의 4개 바이오틴화된 mAbs중 각각 하나를 함유하는 100㎕의 WB에 재현탁하였다. 세포들은 얼음상에서 20분간 mAb와 함께 항온처리시키고, 1.5㎖의 WB로 세척하고, 원심분리하여 펠렛으로 만들었다. 상층액은 흡입에 의해 제거되고, 펠렛을 100㎕의 CyChrome-접합된 스트렙타비딘(CyC-SA;PharMingen)에 재현탁시키고, 얼음 상에서 20분간 다시 항온처리하고, 세척 및 펠렛화하였다. 대조군 시험관은 단지 CyC-SA로 염색된 세포를 함유한다. 펠렛을 400㎕ WB에 재현탁시키고, 상기와 같이 유동 세포주측을 수행하였다. 양성 염색은 CyC-SA의 기저 수준보다 초과하는 신호로 정의된다. 대조군으로 BaF3/zalpha11 형질전환체를 사용하여, 항체 친화성 및/또는 mAbs의 바이오틴화된 정도를 나타내는 형광세기(MFI)에 따른 4개의 mAbs의 각각의 순서를 정하였다. mAbs의 순서는 높은 것부터 낮은 것까지 다음과 같다: 249.28.2.1.2.2, 247.10.2.15.4.6, 249.19.2.2.3.5, 및 249.15.2.4.2.7. Raji 세포는 zalpha11 단일클론 항체와 반응하여 양성 염색된다. Jurkat 세포는 B 세포(Raji)정도로 강하지 않지만, zalpha11 단일클론 항체와 반응하여 양성 염색된다. 따라서, zalpha11 리셉터는 이들 B 및 T 세포에서 발현된다. 비-활성화 HL-60 세포상 염색 양상은 모든 mAbs에 대하여 동일하였고, 신호는 매우 약했다. 이러한 신호는 HL-60 세포에 의한 zalpha11의 실제 발현에 의한 것이 아니고, 마우스 mAbs의 사람 세포에 대한 아마도 Fc-리셉터를 통한 비-특이적 결합 때문이라고 믿는다.

실시예49

사람 zalpha11 리간드의 B-세포에 대한 효과 및 zalpha11 리간드의 독성 사포린 융합

사람 zalpha11 리간드의 다음의 사람 B-세포: 및 사람 Burkitt's 림프종 세포주 Raji(ATCC No. CCL-86), 및 Ramos(ATCC No. CRL-1596); 사람 EBV B-세포 림프종 세포주 RPMI1788(ATCC No. CRL-156); 사람 골수종/형질세포종 세포주 RPMI1788(ATCC No. CRL-159); 및 사람 EBV 형질전환 B-세포주 DAIKIKI(ATCC No. TIB-206) 및 HS Sultan 세포(ATCC No. CRL-1484)에 대한 효과를 시험하였다. zalpha11 리간드로 처리후 약 2 내지 5일 후, IM-9, Raji, Ramos, 및 RPMI1788세포주에서 표면 마아커의 발현에 변화가 있었고, 이는 이러한 세포들이 zalpha11 리간드에 반응할 수 있음을 나타낸다. 세포 배양 접시에 재-플레이팅되었을 때, zalpha11 리간드로 처리된 B-세포는 처리되지 않은 세포보다 훨씬 느리게 성장하였다. 이러한 세포들은 FAS 리간드의 발현이 증가되었음을 유동 세포주측(실시예49D 및 실시예49E) 평가에 의하여 알 수 있으며, 활성화 FAS 항체(실시예49A)에 중간 정도의 증가된 감도를 보인다. 이러한 결과는 zalpha11 리간드가 어떤 타입의 B-세포 종양을 보다 약한 증식성 및/또는 FAS 리간드에 감수성 상태로 분화하게 하여 B-세포 종양을 조절할 수 있음을 나타낸다. 더우기, zalpha11 리셉터는 이러한 세포주(실시예48 참조)의 몇몇 표면에서 발현된다. 따라서, zalpha11 리간드 및 사람 zalpha11 리간드-사포린 면역독성 접합체(실시예49B, 하기), 또는 다른 zalpha11 리간드-독성 융합이 B-세포 백혈병 및 림프종에 치료적으로 사용될 수 있을 것이다.

A. 사람 zalpha11 리간드의 B-세포에 대한 효과

㎖당 약 50,000세포로 +/- 50㎍/㎖의 정제된 사람 zalpha11 리간드(실시예29) 조건에서 IM-9 세포가 접종되었다. 3일간 배양후, 세포를 수집하였으며, 세척되고, 숫자를 측정한 후, 약 2,500 세포/㎖의 농도로 0, 0.033, 0.1 또는 0.33㎍/㎖의 항-FAS 항체(R&D Systems, Minneapolis)이 존재하는 96웰 평판에 재-플레이팅하였다. 2일후에 Alamar 블루 형광 분석(실시예2B)을 수행하여 세포의 증식을 평가하였다.

항-FAS 항체의 부존재하에서 zalpha11 리간드-처리된 IM-9 세포는 처리된 세포의 농도의 단지 27%까지만 성장하였다. 0.33㎍/㎖의 항-FAS 항체 존재하에서, 처리되지 않은 세포는 단지 30%만 저해받았으나, zalpha11 리간드-처리된 세포는 추가적 52%로 저해되었다. zalpha11 리간드 및 0.33㎍/㎖의 항-FAS 항체 모두의 처리된 경우 세포 성장의 전체 저해는 86%이다.

IM-9 세포를 zalpha11 리간드 존재하 또는 부존재 조건에서 3일간 전처리하고, 웰당 100세포를 재-플레이팅하고 항-FAS 항체의 존재 또는 부존재 조건에서 5일간 배양하면, Alamar 블루 분석(실시예2B)으로 평가된 처리되지 않은 세포의 항-FAS 항체에 의한 저해는 단지 25%인 반면, zalpha11 리간드 처리된 세포는 0 항-FAS 항체의 조건에서 처리되지 않는 세포의 성장에 상대적으로 95% 저해되었다.

B. 사람 zalpha11 리간드-사포린 면역독소의 B-세포에 대한 영향

사람 zalpha11 리간드-사포린 면역독소 접합체(zalpha11L-sap) 구성 및 정제는 실시예50에 기술되어 있다. 사람 zalpha11L-sap는 사포린 단독으로 작용할 때 보다 세포 성장을 저해함에 있어 훨씬 강력하다. 3일 또는 4일 처리 후에 처리된 세포는 재-플레이팅되었고, zalpha11L-sap 처리된 세포는 매우 불량하게 성장하였다.

IM-9, Ramos 및 K562(ATCC No. CCL-243) 세포를 약 2,500세포/웰의 농도로 0 내지 250ng/㎖의 사람 zalpha11L-sap 접합체 또는 대조군으로 0 내지 250ng/㎖의 사포린(Stripe et al., Biotechnology 10; 405-412. 1992)만이 존재하는 96웰 평판에 접종하였다. 평판을 4일간 배양하고, Alamar 블루 증식 분석(실시예5B)을 수행하였다. 사람 zalpha11-sap 접합체의 최대 농도에서, IM-9 세포 및 RAMOS 세포의 성장은 각각 79% 및 65% 저해되었다. 유동 세포주측에 의하여 zalpha11 리셉터를 낮게/음성 발현하는 K562 세포는 zalpha11-sap에 의해 영향받지 않았으며, 따라서 접합체 효과의 특이성을 나타낸다.

IM-9 세포를 0 내지 50 ng/㎖의 사람 zalpha11L-sap 접합체가 존재하는 6웰 평판에 50,000 세포/ml로 접종하였다. 3일 후에 세포를 수집하였고, 숫자를 세어 2배 연속희석에 의해 웰당 100 내지 0.8 세포, 및 세포 희석 당 12웰에 사람 zalpha11리간드-사포린 면역독소 없이 재-플레이팅하였다. 6일후 Alamar Blue 증식 분석(실시예2B) 결과에 따라 각 세포 희석이 성장한 웰의 숫자를 점수화하였다.

Alamar 블루 분석(실시예2B)에 의한 세포 숫자를 평가하였을 때, 웰 당 약 12.5 및 6.25 세포로 접종된 성장 대조군 세포의 6일후 성장이 각각 100 및 50세포/웰로 접종된 zalpha11-sap 처리된 세포의 성장에 대응하였다. 따라서, 생존한 처리된 IM-9의 성장은 zalpha11-sap 면역독성의 제거, 재-플레이팅후에도 상당히 손상되었다.

사람 zalpha11 리셉터(실시예48)의 조직 제한된 분포 및 zalpha11-sap의 리셉터-발현 세포주에 대한 특이적 작용은 이러한 접합체가 생체내에서 용인될 수 있음을 제시한다.

C. 사람 zalpha11리간드-사포린 면역독소의 B-세포주 생존능력에 대한 영향

HS Sultan 세포(ATCC No/CRL-1484)가 ㎖당 약 40,000세포의 농도로 12웰 평판에 접종되고 사이토킨 또는 40ng/㎖ 정제된 사람 zalpha11 리간드(실시예29) 또는 25ng/㎖ 사람 zalpha11L-sap 접합체(실시예50, 하기)의 첨가 또는 미첨가와 또는 20ng/㎖의 IFN-알파(RDI) 또는 zalpha11 리간드 및 IFN-알파와 함께 5일간 배양하였다. zalpha11 리간드는 Hs Sultan 세포의 성장을 63% 저해하였다. IFN-알파는 성장을 38% 저해하였다. zalpha11 리간드와 함께 IFN-알파는 성장을 78% 저해하였으며, 사람 zalpha11 및 IFN-알파의 성장저해 효과가 누적적임을 나타낸다. 사람 zalpha11L-sap은 HS Sultans의 성장을 92% 저해하였다.

상기 결과는 zalpha11 리간드 또는 사람 zalpha11L-sap이 zalpha11 리셉터를 발현하는, 특히 B-세포로부터 유래한 악성 종양 또는 다른 질병의 치료에 사용가능성을 뒷받침한다. HS Sultan세포의 저해효과의 누적적 효과는 특히 zalpha11 리간드와 IFN-알파의 조합을 구체적으로 시사한다. 활성화된 T-세포가 역시 리셉터 mRNA를 발현하는 것과 같이, 다른 타입의 림프 악성 종양 및 질병 역시 zalpha11 리셉터를 발현할 수 있으며 (실시예 48), 이러한 질병의 몇몇은 또한 zalpha11 리간드 독성 융합 치료의 zalpha11리간드에 반응성일 수 있다.

D. 사람 zalpha1 리간드 자극에 의해 증가된 사람 B-세포주 상 FAS(CD95) 발현

사람 B-세포주 HS Sultan(ATCC No.CRL-1484), IM-9(ATCC No.CRL159), RPMI 8226(ATCC No. CCL-155), RAMOS (ATCC No. CRL-1596), DAKIKI(ATCC No. TIB-206), 및 RPMI 1788(ATCC No. CRL-156) 모두가 정제된 10 내지 50ng/㎖의 사람 zalpha11 리간드(실시예29)의 존재 또는 부존재로 2 내지 8일간 처리되었다. 그 후 세포를 제조자 지시에 따라서 항-CD95PE-접합된 항체(PharMingen, San Diego, CA)로 염색하고, FACScalibur(Becton Dickinson, San Jose, CA)로 분석하였다. 사람 zalpha11 리간드 처리로, 모든 세포주에서 항-CD95(FAS 또는 APO1) 염색이 증가하였고, 몇몇 경우에는 두 배 이상 증가하였다.

E. 사람 zalpha1 리간드 자극에 의해 증가된 일차 마우스 비장 B-세포상 FAS(CD95) 발현

8주 내지 12주령의 C57/BL6 마우스로부터의 비장을 잘라서 일차 마우스 비장세포를 얻었다. 적혈구는 5초간 물로 처리하여 용해시켰으며, 70마이크론 체를 통과시켰다. 상기 기술된 바와 같이, 잔여 비장세포를 세척하고 RPMI(JRH Bioscience)와 10% HIA-FBS(Hyclone, Lofan, UT)+사람 zalpha11 리간드의 존재 또는 부존재하에서 인터류킨2(IL-2)(R and D Systems)에 플레이팅하였다. 37°C, 5% CO₂의 조건에서 5일간 배양하였다. 비장세포를 수집하고, 제조자의 지시에 따라서 항-CD95 PE 접합 항체(PharMingen) 및 항-CD19 FITC 접합 항체(PharMingen)로 염색하였다. FACScalibur(Becton Dickinson) 유동 세포주측으로 세포를 분석하였다. CD19+ 마우스B-세포가 게이팅할 때, IL-2와 사람 zalpha11리간드로 처리한 B-세포가 IL-2만으로 처리한 세포에 비하여 항-CD95 염색이 증가하였음을 발견하였다. 항-CD95 염색결과는 IL-2 단독으로 처리한 B-세포의 경우 37 상대형광단위(RFU)이고, IL-2 및 사람 zalpha11 리간드로 처리한 B-세포의 경우 55 상대형광단위(RFU)이다.

실시예50

zalpha11 리간드 독소 융합체의 구성 및 정제

공급 계약하에, 10mg의 사람 zalpha11 리간드(실시예29)를 식물 독소 사포린(Stripe et al., Biotechnology 10,;405-412, 1992)과의 접합을 위하여 Advanced Targeting Systems(ATS, San Diego, CA)로 보냈다. 20nM 나트륨 포스페이트, 300nM 나트륨 클로리드, pH 7.2에 1.14mg/㎖ 농도의 사람 zalpha11 리간드 1 분자당 1.1개의 사포린 분자로 구성된 단백질 접합체 1.3mg을 Zymogenetics가 ATS로부터 받았다.

실시예51

생체내에서의 zalpha11 리간드 독소 융합체

A. 마우스에서의 zalpha11-saporin 접합체의 시험

zalpha11리간드-사포린 접합체(실시예49)가 C57BL6 마우스(암컷, 12주령, Taconic으로부터 구입)에 두 가지 상이한 투약량: 0.5 및 0.05mg/kg으로 주사하였다. 0.1% BSA(ICN, Costa Mesa, CA)로 구성된 매체로 i.v.로 주사하였다. 일주동안 3차례(0일, 2일 및 7일째) 주사하였다. 마우스로부터 혈액 시료을 0일째(주사-전), 2일째 및 8일째(주사-후)에 각각 채취하였다. 혈액을 헤파린화된 시험관(Becton Dickenson, Franklin Lakes, NJ)에 수집하고, 자동화된 혈구 분석기(Abbot Cell-Dyn model No. CD-3500CD, Abbott Park, IL)로 세포 숫자를 결정하였다. 8일째 혈액 수집에서 동물을 안락사시키고 해부하였다. 비장, 흉선, 간, 신장 및 골수를 조직병리학용으로 수집하였다. 비장 및 흉선의 무게를 측정하고, 혈액 분리 시험과에 추가의 혈액 샘플을 수집하였다. 표준화된 화학 패널 시험을 위해혈액을 Phoenix Central Labs, Everett, WA으로 보냈다. 여기에 기술된 바와 같이 유동 세포주측 분석을 위해 샘플을 수집하였다.

zalpha11 접합체로 처리한 마우스와 대응하는 양의 접합되지 않은 독소(사포린)로 처리한 마우스의 순환 혈액 세포 숙자 및 혈액 화학 측정치는 크게 다르지 않았다. zalpha11 접합체로 처리한 마우스와 대응하는 양의 접합되지 않은 독소로 처리한 마우스의 조직의 조직학적 분석 결과도 크게 다르지 않았다. 이러한 결과는 사포린 접합체가 생체내에서 독성이 아님을 보이는 것이다.

B. 생체내에서 B-세포 유래한 종양에 zalpha11 리간드 독소 접합체의 시험

여기에 기술된 종양 이종이식된 마우스를 이용하여 생체내에서 사람 종양 세포에 대한 zalpha11 리간드 및 사람 zalpha11 리간드 독소 사포린 융합체(실시예50)의 효과를 시험하였다. 실시예49에 기술된 것과 같이, 시험관내 실험 결과에 기초하여 선택된 세포주를 이용하여 이종 이식된 모델을 초기 시험하였다. 이러한 세포주는 다음: 사람 Burkitt's 림프종 세포주 Raji(ATCC No. CCL-86), 및 Ramos(ATCC No. CRL-1596); 사람 세포주 RPMI 1788(ATCC No. CRL-156); 사람 골수종/형질세포종 세포주 IM-9(ATCC No. CRL-159); 사람 세포주 DAKIKI(ATCC No. TIB-206), 및 HS Sultan 세포(ATCC No. CRL-1484)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 이러한 타입의 모델에 사람 종양으로부터 직접 유래한 세포를 사용할 수 있다. 이러한 방식으로, zalpha11 리간드 또는 zalpha11 리간드 독소 사포린 융합체 처리에 대한 환자 샘플의 감수성의 스크리닝을 항-종양 치료에서 zalpha11의 사용의 적합성을 선택하는 데 사용할 수 있다.

상기와 같이, 적당한 이종 이식된 생체 모델을 선택한 후, zalpha11 리간드-유도된 NK 세포의 활성 및/또는 zalpha11 리간드의 B-세포 유래 종양에 대한 효과를 생체 내에서 평가하였다. 여기에 기술된 종양 이종 이식된 마우스를 사용하여 B-세포 유래 종양에 대한 사람 zalpha11 리간드의 세포질독성 효과 세포(예를 들어, NK 세포)의 활성을 생성할 수 있는 능력을 시험하였다. 더우기, 사람 zapha11 리간드의 종양에 대한 직접 효과를 평가할 수 있었다. 수행할 이종 이식 모델은 상기와 같이 선택하였다. zalpha11 리간드 자극된 사람 세포를 이용한 절차를 개발하고, 세포주 또는 일차 종양이 주입된 마우스에서 종양을 제거하고 생존률을 증가시키는 효율을 시험하였다.

실시예52

게놈 사람 zalpha11 리간드 DNA를 함유하는 P1 인공 염색체의 동정

벡터에 기초한 프라이머를 이용하여 PCR로써 사람 zalpha11 리간드 cDNA 인서트를 증폭하였다. PCR 생성물을 ³²P로 표지하고 PAC(P1 인공 염색체) 고-농도 여과지에 혼성화 시켰다. 여과지 및 동결된 라이브러리 스톡은 Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, New York으로부터 얻었다; 표지로부터 4배 깊이 포괄의, 라이브러리 단편은 RPCI6이다. 제조자 제안에 따라서 ExpressHyb(Clontech)에서 65°C에서 밤새 혼성화시키고, 세척하였다. 양성 신호를 해석하여 23H17, 34A9, 105G9 및 236H14로 표시된 네 개의 PAC 클론을 동정하였다. 코딩 부분의 5'말단에 특이적인 ZC22,452(SEQ ID NO:100) 및 ZC 22,451(SEQ ID NO:101), 및 3' 말단에 특이적인 ZC22,450(SEQ ID NO:102) 및 ZC 22,449(SEQ ID NO:103)을 이용하여 PCR 분석한 결과 PACs 34A9 및 105G9가 양 말단을 함유하는 반면, PACs 23H17 및 236H14는 단지 5'말단만을 함유함을 확인하였다. PAC 23H17을 EcoRI 및 NotI으로 절단하여, zalpha11 리간드 cDNA 프로브에 혼성화하는 9kb 단편을 동정하였다. 여기에 기술된 방법을 이용하여, 이 단편을 분리하고, 미리 EcoRI 및 NotI으로 절단된 pBluescript II SK(+)(Stratagene)에 서브클로닝하였다. 서열분석하여 이 단편이 약 380 bp의 프로모터 부분, 엑손 1,2 및 3, 모든 인트론 1 및 2을 함유하고, 인트론 3 내에서 종료됨을 확인하였다.

PAC 34A9로부터의 DNA를 템플레이트로 사용하고, 프라이머 ZC23,771(SEQ ID NO:104) 및 ZC22,449(SEQ ID NO:103)을 이용한 PCR로써 사람 zalpha11 리간드 유전자의 3'말단을 얻었다. Taq 중합효소와 이와 함께 제공된 완충액에 4% DMSO를 첨가하여 이용하였다. 반응은 다음과 같이 진행되었다: 94°C에서 5분; 이어서, 94°C에서 30초, 52°C에서 1분, 72°C에서 3분의 35 사이클; 및 72°C에서 7분. 이 결과 엑손 3의 부분, 모든 인트론 3 및 4, 모든 엑손 4, 및 엑손 5의 코딩 부분을 함유하는 2.9kb 단편을 얻었다.

사람 zalpha11 리간드 유전자의 게놈 구조는 5'으로부터 3'으로 다음과 같다: 240bp의 프로모터를 함유하는 SEQ ID NO:105, 엑손 1(SEQ ID NO:105의 뉴클레오티드 번호 240-455), 엑손 2(SEQ ID NO:105의 뉴클레오티드 번호 563-598), 및 5' 748bp(SEQ ID NO:105의 뉴클레오티드 번호 563-598)를 함유하는 인트론2의 부분; 약3kb의 갭; 인트론 2의 3' 718bp, 엑손3(SEQ ID NO:106의 뉴클레오티드 번호 719-874), 및 인트론 3의 5'말단의 부분(SEQ ID NO:106의 뉴클레오티드 번호 875-1656)을 함유하는 SEQ ID NO:106; 약 800bp이하의 갭; 인트론 3의 644bp를 함유하는 SEQ ID NO:107; 약 800bp이하의 갭; 인트론 3의 3' 435bp, 엑손 4(SEQ ID NO:108의 뉴클레오티드 번호 436-513), 인트론 4(SEQ ID NO:108의 뉴클레오티드 번호 514-603), 및 엑손 5의 5'말단의 부분(SEQ ID NO:108의 뉴클레오티드 번호 604- 645)을 함유하는 SEQ ID NO:108.

실시예53

세포주에서 ¹²⁵ I-표지된 사람 zalpha11 리간드 결합 연구

제조자의 지시에 따라서, 2mCi ¹²⁵I 요오드비드(Pierce, Rockford Illinois)를 사용하여 25㎍의 정제된 사람 zalpha11 리간드(실시예29)를 표지하였다. 야생형 마우스 BaF3 세포, 및 zalpha11 리셉터로 트랜스펙션된 BaF3(BaF3/hzalpha11 세포)에의 결합을 대조군으로 사용하여, 표지된 단백질을 사용하여 사람 zalpha11 리간드의 사람 Raji 세포(ATCC No. CCL-86)에 대한 결합을 평가하였다. 증식 분석 결과에 기초하여(실시예5), zalpha11 리간드의 BaF3/hzalpha11 세포에의 결합이 예상되고(양성 대조군), 반면 야생형 BaF3 세포에는 결합하지 않을 것이 예상되었다(음성 대조군). 96웰 플레이트에 약 5 x 10⁵ Raji세포/웰, 1 x 10⁶ BaF/hzalpha11 및 1 x 10⁶ BaF3세포/웰로 각각 플레이팅하였다. 10ng/㎖의 표지된 사람 zalpha11 리간드를 웰에 1:4 희석으로, 250배 몰 초과로부터 0.061배 몰 초과까지 표지되지 않은 사람 zalpha11 리간드 경쟁체의 일련의 희석을 중복하게 첨가하였다. 각각의 포인트는 중복하게 실험하였다. 사람 zalaph11 리간드를 웰에 첨가한 후, 리간드가 세포에 결합하도록 4°C에서 2시간동안 배양하였다. 그 후 세포를 3 차례 결합 완충액(1% BSA(Sigma))이 첨가된 RPMI-1710(JRH Bioscience))로 세척하고, COBRA Ⅱ AUTO-GAMMA 감마 카운터(Packard Instrument Company, Meriden, CT)상에서 측정하였다.

Raji 및 BaF3/hzalpha11세포에서는 세포에 대한, 표지된 zalpha11 리간드의 결합은 명백하였다. 또한, Raji 세포에서 250배 몰 초과의 표지되지 않은 zalpha11 리간드는 비-특이적 경쟁체(R&D Systems, Minneapolis, MN로부터의 Interferon Gamma)는 결합을 3배 감소시키고, 경쟁체가 없는 것에 상대적으로 3.7배 감소시킨다. 특이적 표지되지 않은 경쟁체, 사람 zalpha11 리간드에 투여량 의존적인 경쟁을 관찰하였다. 따라서, Raji 세포에의 zalpha11 리간드의 결합은 특이적이다. 유사하게, 양성 대조군인 BaF/hzalpha11 세포에서, 250배 몰 초과 표지되지 않은 zalpha11 리간드가 비-특이적 경쟁체에 상대적으로 2배, 비 경쟁체에 대하여 3.06배 결합을 감소시켰다. 따라서, zalpha11 리간드의 Baf/zalpha11세포에의 결합 역시 특이적인 것이다. 따라서, zalpha11 리간드가 Raji세포 및 BaF3/hzalpha11에 특이적으로 결합하지만, 음성 대조군인 BaF3세포에는 특이적으로 결합하지 않음을 보여준다.

실시예54

사람 혈액 세포상 zalpha11 리셉터 발현

A. 사람 말초 혈액 세포 배양의 제조

신선하게 채혈된 사람 혈액을 PBS(Gibco BRL)와 1:1로 희석하고, Ficoll/Hypaque Plus(Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ)위에 층지게 놓고 1800rpm으로 30분간 회전시키고, 제동 없이 정지하도록 하였다. 경계면을 분리하고, 새로운 50㎖ Falcon 시험관(Falcon, VWR, Seattle, WA)에 옮기고, 최종 부피가 40㎖이 되게 PBS를 첨가하고 1200rpm에서 10분간 회전시키고 제동을 작 동하였다. 분리된 세포의 생존능력을 트리판 블루(Gibco BRL)을 이용하여 시험하고, 세포를 세포 배지(RPMI 배지 1640, 10% 가열 불활성회된 소 태아 혈청, 5% L-글루타민, 5% Pen/Strep)(Gibco BRL)에 1 x 10⁶세포/㎖의 농도로 재현탁하였다.

세포를 6웰 플레이트(Falcon, VWR)에서 하기의 다양한 다른 조건과 함께 0, 4, 또는 24시간 배양하였다. 항-IgM, 항-CD40 및 항-CD3 자극을 실시예44 및 실시예42와 같이 수행하였다. 포볼 미리스테이트 아세테이트(PMA) 및 이오노마이신 (Sigma, St.Louis,MO) (실시예5C)을 적당한 웰에 각각 10ng/㎖ 및 0.5mg/㎖ 첨가하였다. 다양한 시간동안 세포를 37°C 습식 배양기에서 배양하였다.

B. 항체 염색 및 분석

세포를 웰로부터 수집하여, 세척하고, 차가운 염색 배지(HBSS, 1% 소 태반 혈액, 0.1% 나트륨 아지드)에 약 천만 세포/㎖의 농도로 재현탁하였다. 10% 정상 염소 혈액(Gemini Bioproducts, Woodland, CA) 및 10% 정상 사람 혈액(Ultraserum, Gemini)를 세포 현탁액에 첨가하여 Fc 리셉터 및 항체의 비-특이적 결합을 차단하였다. 세포 현탁액의 알리쿼트를 계통 마아커인 CD3, CD19 또는 CD14중 하나에 대한, FITC 표지된 단일클론 항체(PharMingen, La Jolla, CA) 및 사람 zalpha11 리셉터(hu-zalpha11)(실시예35)에 대한 바이오틴화된 단일클론 항체와 혼합하였다. 10배의 과질량으로 zalpha11CEE 용해성 리셉터(실시예10A)를 사용하여 경쟁적으로 염색 특이성을 결정하였다. 얼음에서 60분간의 항온처리 후, 차가운 염색 배지로 세포를 세척하고 스트렙타비딘-PE(Caltag, Burlingame, CA)를 함유하는 50㎖의 염색 배지에 재현탁하였다. 얼음에서 30분간 항온처리 후, 세포를 차가운 세척 완충액(PBS. 1%소태반혈청, 0.1% 나트륨 아지드)으로 2 차례 세척하고 생존 마아커로서 1mg/㎖의 7-AAD(Molecular Probes, Eugene, OR)을 함유하는 세척 완충액에 재현탁하였다. FACScalibur 유동 세포주측(BD Immunocytometry Systems, San Jose, CA)를 사용하여 생존 세포의 플로우 데이터를 얻었다. 수집 및 분석 둘 모두 CellQuest 소프트웨어 (BD Immunocytometry Systems)를 이용하였다.

항-zalpha11 항체에 의한 염색 결과는 사람 zalpha11 리셉터가 CD3, CD19 또는 CD14를 발현하는 사람 말초혈 세포 상에서 발현된다는 것을 보여준다. CD3 및 CD9 세포상 염색은 특이적이며 이는 zalpha11 용해성 리셉터로 완전 경쟁으로써 증명되었다. CD14세포상 염색은 리간드에 대하여 어느 정도의 특이적이며 이는 용해성 리셉터로 부분 경쟁으로써 증명되었다. 항-CD3로의 T-세포 또는 항-CD40로의 B-세포의 활성화는 24시간에 세포 표면 zalpha11의 증가된 수준을 결과하였다. 어떤 세포 집단에 어떤 자극으로도 4시간에는 zalpha11의 발현 수준이 증가하지 않았다. zalpha11 리간드로 세포의 처리는 4 및 24시간 모두에서 CD14 양성 세포를 제외한 CD3 양성 및 CD19 양성 세포상 zalpha11 염색을 감소시켰다.

실시예55

사람 zalpha11 리간드의 수성 안정성의 예비 평가

생물학적 처리, 제제화, 및 생체내 주입을 위한 사람 zalpha11 리간드의 수성 안정 특성을 평가하기 위해 예비 연구를 하였다. 목적은 : 1)Alzet 미니펌프 및 일반적 보관 및 취급에서의 수율 및 안정성 확인, 2) 양이온 교환 HPLC(CX-HPLC), 역상 HPLC(RP-HPLC), 크기 배제 HPLC(SEC_HPLC) 및 생체 분석법 (BaF3/zalpha11R 증식)(예, 실시예 2 및 실시예 4)을 포함하는 수 가지의 분석 방법으로 안정성-지표성을 결정, 및 3) 안정성-제한 분해 경로 및 이들의 동력학 의존성을 결정하는 것이다.

정제된 사람 zalpha11 리간드(실시예29)의 알리쿼트를 PBS(pH7.4)에서 2mg/㎖가 되도록제조하고, 저농도 폴리에틸렌(LDPE) 세포바이알(Nalgene, 1.8㎖)에서 -80°C(대조군), 5°C, 30°C 및 37°C에 보관하였다. 샘플들을 29일에 걸쳐 때때로 CX-, RP-, SEC-HPLC, 및 생체분석으로 분석하였다. 알리쿼트를 역시 -80°C에 보관하고, 동결-해동(f/t)(-80°C/RT; 5 x f/t, 10 x f/t) 순환시켰다. 사람 zalpha11 리간드의 수율을 모든 분석에서 -80°C 대조군(1 f/t)에 상대적으로 결정하였다.

-80°C 대조군 샘플로부터 잔여 사람 zalpha11 리간드 용액은 분석 후 -80°C에 재동결시켰다. 이 알리쿼트(2 f/t)를 이용하여 사람 zalpha11 리간드의 열적 및 구조적 안정성을 순환 이색성(CD)으로 pH에 대한 함수로 평가하였다. pH 3.3 내지 8.8의 PBS 완충액 에 100㎍/㎖가 되도록 2mg/㎖를 희석하였다. far-UV CD 스펙트럼을 5°C 간격으로(n=3/pH) 5 내지 90°C범위에서 관찰하였다. 사용된 CD 스펙트로폴라리메터는 Jasco 715(Jasco, Easton, MD)이다. 열적 펼쳐짐은 222nm에서 타원율의 변화를 시간함수로 관찰하였다. 2-상태 펼쳐짐 모델을 가정하여 Tm의 추정치가 추산되었다. 이러한 데이터는 Window v4.1을 위한 SlideWrite Plus(Advanced Graphics Software; Encinitas, CA)를 이용하여 적정화되었다.

Alzet 미니펌프(Model No. 1007D; ALZA Corporation, Mountain View, CA)로 부터의 회수율 및 안정성을 2mg/㎖ 사람 zalpha11 리간드 용액 100㎕로 펌프를 채우고, 1㎖의 PBS(pH 7.4)를 함유하는 1.8㎖ LDPE로 위치하게 하고, 37°C에서 보관하였다. 미니펌프로부터의 사람 zalpha11 리간드의 방출/회수는 CX-, RP-, 및 SEC-HPLC로 2, 4, 및 7일에 평가하였다. 7일에 생분석으로 활성을 평가하였다. 연구는 샘플링 시간당 3 개의 펌프로부터의 방출을 평가하도록 고안되었다.

크로마토그래피 데이터는 CX- 및 SEC-HPLC 방법은 안정성을 나타내는 반면, RP-HPLC는 그렇지 않음을 암시한다. CX-HPLC에 의해, 적어도 3개의 추가적인 정점은 명백한 분해 산물을 나타낸다. SEC-HPLC 방법은 사람 zalpha11 리간드에 앞서서 용리되며, 이는 명백한 사람 zalpha11 리간드 합체를 나타낸다. 그러나, 사람 zalpha11 리간드 정점이후로는 상당한 추가적인 정점이 관찰되지 않았다. 이는 CX-HPLC로 관찰된 분해 산물이 아마도 가수분해/잔백질분해 과정에 따른 절단된 변형체가 아닌 디아민화와 같은 아미노산 변형에 따른 결과임을 암시한다. SEC- 및 CX-HPLC에서 상당한 분해를 보인 샘플에서 RP-HPLC로 관찰된 결과 작은 정도(대조군에 상대적으로)의 앞/뒤 용리가 관찰되었다. 그러나, 명백한 분해 산물은 RP-HPLC에 의해 분석되지 않았다. CX-HPLC로 관찰된 분해는 시간-온도함수에 따라서 증가하였으고, 명백하게 일차-동력학을 따랐다. 29일후 37°C, 30°C 및 5°C에서 CX-HPLC에 의해 회수된 사람 zalpha11 리간드의 %는 각각 39%, 63% 및 98%이다. 합체도 역시 시간-온동 의존 양상으로 증가하였다. 29일후 37°C, 30°C 및 5°C에서 저장되 제조물에서 발견되는 합체물(aggregate) %는 각각 7.4, 3.4 및 검출하한(BDL)밖의 값이다. 어떠한 샘플에서도 생체분석으로 관찰된 상당히 다른 점이 없었으며, 이는 분해 결과물과 온전한 사람 zalpha11 리간드의 활성은 대응함을 암시한다. 10 f/t 순환된 샘플에서 어떤 분석에 의해서도 분해가 관찰되지 않았다.

Alzet 미니펌프로부터의 사람 zalpha11 리간드의 방출은 이론적으로 기대되는 방출 부피와 일치하였다. 이는 상당한 표면 흡착이 사람 zalpha11 리간드의 2mg/㎖ 충전 농도로 Alzet 미니펌프를 이용한 전달이 방해되지 않음을 나타낸다. 앞서 언급된 것과 일치하는 분해가 관찰되었다. CX-HPLC로 결정된 2, 4, 및 7일후 방출된 사람 zalpha11 리간드의 순도 %는 각각 96%, 90% 및 79%이다. 사람 zalpha11 리간드가 방출 배지로 방출되거나 희석된 후에도 역시 분해되고 있음을 명심하여야 한다. 따라서, 미니펌프내에서의 % 순도는 방출 배지에서 결정된 것과 어느 정도 다를 수 있다. 미니펌프로부터 방출된 사람 zalpha11 리간드의 기대되는 양과 각 샘플의 활성은 일치하였다.

사람 zalpha11 리간드 far-UV CD 스펙트럼은 기대한 바와 같이 , IL-3(J. Biochem.,23:352-360,1991), IL-4(Biochemistry, 30:1259-1264, 1991), 및 IL-6 돌연변이체(Biochemistry, 35:11503-11511, 1996)과 같은 인터류킨과 일치하였다. pH에 대한 함수로서 far-UV CD 스펙트럼의 총체적 변화는 관찰되지 않았다. 결과는 열적/구조적 안정성의 최대 pH는 약 pH7.4임을 보인다. 펼쳐짐 곡선의 분석은 2-상태 펼쳐짐에 기초하여 pH/조성물의 함수에 대한 열적/구조적 안정성을 비교할 수 있게 한다. 그러나, 펼쳐짐 곡선의 얕음에 기초하여, 협력성이 상대적으로 낮으므로, 하나 또는 그 이상의 중간체가 펼쳐짐 과정에 존재할 수 있다. 연구가 사람 zalpha11 리간드가 90°C에서의 열적 펼쳐짐후에 다시 접히는지를 알아보려고 고안 된 것은 아니지만, 예비 데이터는 샘플의 온도가 20°C로 냉각되면 적어도 부분적으로 재접힘을 암시한다.

사람 zalpha11 리간드의 안정성 및 순도를 평가하기 위한 이러한 연구는 분석 영역을 허용한다. 예를 들어, SEC-HPLC는 수용액상 합체의 정도 및 속도를 특성화할 수 있다. 마찬가지로, CX-HPLC는 사람 zalpha11 리간드의 합체가 아닌 다른 기작에 의한 분해의 정도 및 속도를 특성화하는데 사용될 수 있다. 생체분석으로 사람 zalpha11 리간드 및 그 수성 분해 결과물의 활성을 확인할 수 있다. 예를 들어, 수성으로 생성되고 CX-HPLC로 분리된 사람 zalpha11 리간드 변형체가 동등한 생활성을 가지므로 치료제로서 유용할 수 있다. 역시, 여러 다른 과정(합체, 아미노산 변형)에 의한 사람 zalpha11 리간드 분해물이 용액 생성물의 장기 보관에 필요한 각 분해과정의 속도를 최소화하는 바람직하거나 유일한 제재임을 암시한다.

수성 분해 생성물의 성질 및 이들의 동력학 의존성(pH, 농도, 첨가제 (excipient))을 조사중이다. 혈액/플라즈마에서의 사람 zalpha11 리간드 안정성을 생체 연구의 고안 및 해석을 위해 결정하였다.

발명의 구체적인 구체예가 여기에 예증의 용도로 기술되었으나 선행하는 것으로부터 본 발명의 사상과 범위를 벗어나지 않고 다양한 변형이 만들어 질 수 있음을 인식할 것이다. 마찬가지로, 본 발명은 첨부된 청구항에 의하여만 제한될 뿐이다.

SEQUENCE LISTING <110> ZymoGenetics, Inc. <120> NOVEL CYTOKINE ZALPHA11 LIGAND <130> 99-16PC <150> US 09/264,908 <151> 1999-03-09 <150> US 09/265,992 <151> 1999-03-11 <150> US 60/142,013 <151> 1999-07-01 <160> 115 <170> FastSEQ for Windows Version 3.0 <210> 1 <211> 642 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (47)...(532) <400> 1 gctgaagtga aaacgagacc aaggtctagc tctactgttg gtactt atg aga tcc 55 Met Arg Ser 1 agt cct ggc aac atg gag agg att gtc atc tgt ctg atg gtc atc ttc 103 Ser Pro Gly Asn Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu Met Val Ile Phe 5 10 15 ttg ggg aca ctg gtc cac aaa tca agc tcc caa ggt caa gat cgc cac 151 Leu Gly Thr Leu Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln Asp Arg His 20 25 30 35 atg att aga atg cgt caa ctt ata gat att gtt gat cag ctg aaa aat 199 Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln Leu Lys Asn 40 45 50 tat gtg aat gac ttg gtc cct gaa ttt ctg cca gct cca gaa gat gta 247 Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val 55 60 65 gag aca aac tgt gag tgg tca gct ttt tcc tgt ttt cag aag gcc caa 295 Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln 70 75 80 cta aag tca gca aat aca gga aac aat gaa agg ata atc aat gta tca 343 Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile Asn Val Ser 85 90 95 att aaa aag ctg aag agg aaa cca cct tcc aca aat gca ggg aga aga 391 Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala Gly Arg Arg 100 105 110 115 cag aaa cac aga cta aca tgc cct tca tgt gat tct tat gag aaa aaa 439 Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys 120 125 130 cca ccc aaa gaa ttc cta gaa aga ttc aaa tca ctt ctc caa aag atg 487 Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met 135 140 145 att cat cag cat ctg tcc tct aga aca cac gga agt gaa gat tcc 532 Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu Asp Ser 150 155 160 tgaggatcta acttgcagtt ggacactatg ttacatactc taatatagta gtgaaagtca 592 tttctttgta ttccaagtgg aggagcccta ttaaattata taaagaaata 642 <210> 2 <211> 162 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Arg Ser Ser Pro Gly Asn Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu Met 1 5 10 15 Val Ile Phe Leu Gly Thr Leu Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln 20 25 30 Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln 35 40 45 Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro 50 55 60 Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln 65 70 75 80 Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile 85 90 95 Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala 100 105 110 Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr 115 120 125 Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu 130 135 140 Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu 145 150 155 160 Asp Ser <210> 3 <211> 486 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Degenerate polynucleotide sequence for human zalpha11 ligand <221> misc_feature <222> (1)...(486) <223> n = A,T,C or G <400> 3 atgmgnwsnw snccnggnaa yatggarmgn athgtnatht gyytnatggt nathttyytn 60 ggnacnytng tncayaarws nwsnwsncar ggncargaym gncayatgat hmgnatgmgn 120 carytnathg ayathgtnga ycarytnaar aaytaygtna aygayytngt nccngartty 180 ytnccngcnc cngargaygt ngaracnaay tgygartggw sngcnttyws ntgyttycar 240 aargcncary tnaarwsngc naayacnggn aayaaygarm gnathathaa ygtnwsnath 300 aaraarytna armgnaarcc nccnwsnacn aaygcnggnm gnmgncaraa rcaymgnytn 360 acntgyccnw sntgygayws ntaygaraar aarccnccna argarttyyt ngarmgntty 420 aarwsnytny tncaraarat gathcaycar cayytnwsnw snmgnacnca yggnwsngar 480 gaywsn 486 <210> 4 <211> 535 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> source <222> (0)...(0) <223> EST1483966 ; GenBank Acc #AA764063 <400> 4 taaacatgta tcatataagg atatgtcata ataaggatta atattatata attataaata 60 atttataata cttataatat cattgtttgg ttcactaata aatctatgga tacatggtca 120 aaatggaaat gaatattttg ccaattatta atccccaaag tcattgaaaa taagcataac 180 cattctactg acttgttaga ctctaaacta acataaaata cattttcaga aataaattca 240 accgatctta cctttacatc ttgtggagct gatagaagtt caggatccta agaaaattaa 300 ccaaagagta ttagttctga gttggtgata caagtcaaaa ggctcctttt gcattaatta 360 aaaaaatatt atttaaattg cattgtgaca aacatggcct taccaagtca ttttcataga 420 ttttcagctg ttcaacaatg tcaataaggt gacgaagtct aatcaggagg cgatctggcc 480 cttgggggct tgatttatgg gccactgtcc ccaagaagat gactaccaga cagac 535 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC17212 <400> 5 ggggaattcg aagccatgcc ctcttgggcc ctc 33 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC19914 <400> 6 caatggatgg gtctttagca gcagtaggcc 30 <210> 7 <211> 1614 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 atgccgcgtg gctgggccgc ccccttgctc ctgctgctgc tccagggagg ctggggctgc 60 cccgacctcg tctgctacac cgattacctc cagacggtca tctgcatcct ggaaatgtgg 120 aacctccacc ccagcacgct cacccttacc tggcaagacc agtatgaaga gctgaaggac 180 gaggccacct cctgcagcct ccacaggtcg gcccacaatg ccacgcatgc cacctacacc 240 tgccacatgg atgtattcca cttcatggcc gacgacattt tcagtgtcaa catcacagac 300 cagtctggca actactccca ggagtgtggc agctttctcc tggctgagag catcaagccg 360 gctccccctt tcaacgtgac tgtgaccttc tcaggacagt ataatatctc ctggcgctca 420 gattacgaag accctgcctt ctacatgctg aagggcaagc ttcagtatga gctgcagtac 480 aggaaccggg gagacccctg ggctgtgagt ccgaggagaa agctgatctc agtggactca 540 agaagtgtct ccctcctccc cctggagttc cgcaaagact cgagctatga gctgcaggtg 600 cgggcagggc ccatgcctgg ctcctcctac caggggacct ggagtgaatg gagtgacccg 660 gtcatctttc agacccagtc agaggagtta aaggaaggct ggaaccctca cctgctgctt 720 ctcctcctgc ttgtcatagt cttcattcct gccttctgga gcctgaagac ccatccattg 780 tggaggctat ggaagaagat atgggccgtc cccagccctg agcggttctt catgcccctg 840 tacaagggct gcagcggaga cttcaagaaa tgggtgggtg cacccttcac tggctccagc 900 ctggagctgg gaccctggag cccagaggtg ccctccaccc tggaggtgta cagctgccac 960 ccaccacgga gcccggccaa gaggctgcag ctcacggagc tacaagaacc agcagagctg 1020 gtggagtctg acggtgtgcc caagcccagc ttctggccga cagcccagaa ctcggggggc 1080 tcagcttaca gtgaggagag ggatcggcca tacggcctgg tgtccattga cacagtgact 1140 gtgctagatg cagaggggcc atgcacctgg ccctgcagct gtgaggatga cggctaccca 1200 gccctggacc tggatgctgg cctggagccc agcccaggcc tagaggaccc actcttggat 1260 gcagggacca cagtcctgtc ctgtggctgt gtctcagctg gcagccctgg gctaggaggg 1320 cccctgggaa gcctcctgga cagactaaag ccaccccttg cagatgggga ggactgggct 1380 gggggactgc cctggggtgg ccggtcacct ggaggggtct cagagagtga ggcgggctca 1440 cccctggccg gcctggatat ggacacgttt gacagtggct ttgtgggctc tgactgcagc 1500 agccctgtgg agtgtgactt caccagcccc ggggacgaag gacccccccg gagctacctc 1560 cgccagtggg tggtcattcc tccgccactt tcgagccctg gaccccaggc cagc 1614 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC19913 <400> 8 ggcctactgc tgctaaagac ccatccattg 30 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC20097 <400> 9 acatctagat tagctggcct ggggtccagg cgt 33 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC12700 <400> 10 ggaggtctat ataagcagag c 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC5020 <400> 11 cactggagtg gcaacttcca g 21 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC6675 <400> 12 gtggatgccg aacccagtcc 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC7727 <400> 13 tgttcacagc tacctgggct c 21 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC8290 <400> 14 ccaccgagac tgcttggatc accttg 26 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC19572 <400> 15 gtcctgtggc tgtgtctcag 20 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC6622 <400> 16 ctgggctgga aactggcaca c 21 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC7736 <400> 17 cactgtcaga aatggagc 18 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC9273 <400> 18 ggtccctccc cgggcaccga gaga 24 <210> 19 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC19905 <400> 19 acaggatccg tcagcatgcc gcgtggctgg gccgcc 36 <210> 20 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC19906 <400> 20 acagaattct tagctggcct ggggtccagg cgt 33 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC20114 <400> 21 cctgccttct acatgctgaa gg 22 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC19459 <400> 22 ctcctcctgc ttgtcatagt c 21 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC19954 <400> 23 actgggctgg gggactgc 18 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC20116 <400> 24 agcacagtca ctgtgtcaat gg 22 <210> 25 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC13946 <400> 25 ccctgcagtg atcaacatgg ccaagttgac 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region and the 5' end of the zalpha11 extracellular domain <400> 32 tccactttgc ctttctctcc acaggtgtcc agggaattca tcgataatgc cgcgtggctg 60 ggccgc 66 <210> 33 <211> 699 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 gagcccagat cttcagacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgag 60 ggggcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc catcctccat cgagaaaacc 360 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 420 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 480 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 540 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 600 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 660 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaataa 699 <210> 34 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> First Oligonucleotide primer spanning 3' end of the zalpha11 extracellular domain and the 5' end of Fc4 <400> 34 gcacggtggg catgtgtgag ttttgtctga agatctgggc tcgtgagggt tccagccttc 60 ct 62 <210> 35 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Second Oligonucleotide primer spanning 3' end of the zalpha11 extracellular domain and the 5' end of Fc4 <400> 35 agacccagtc agaggagtta aaggaaggct ggaaccctca cgagcccaga tcttcagaca 60 a 61 <210> 36 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer spanning the 3' end of Fc4 and the vector flanking region <400> 36 gtgggcctct ggggtgggta caaccccaga gctgttttaa tctagattat ttacccggag 60 acaggga 67 <210> 37 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal FLAG amino acid sequence <400> 37 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 38 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC7764a <400> 38 tttttttttt tttttttttt ttttta 26 <210> 39 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC7764b <400> 39 tttttttttt tttttttttt tttttc 26 <210> 40 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC22034 <400> 40 ttcaaatcac ttctccaaa 19 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC22035 <400> 41 ttttggagaa gtgatttgaa 20 <210> 42 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC22050 <400> 42 gaatgcgtca acttat 16 <210> 43 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC22051 <400> 43 ggaccaagtc attcac 16 <210> 44 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC22056 <400> 44 gtctgtctgg tagtcatctt cttgg 25 <210> 45 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC22057 <400> 45 cttgtggagc tgatagaagt tcagg 25 <210> 46 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC22205 <400> 46 agctgttcaa caatgtcaat aaggtg 26 <210> 47 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC22206 <400> 47 cctcctgatt agacttcgtc acct 24 <210> 48 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC9739 <400> 48 ccatcctaat acgactcact atagggc 27 <210> 49 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC9719 <400> 49 actcactata gggctcgagc ggc 23 <210> 50 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC14063 <400> 50 caccagacat aatagctgac agact 25 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC5020 <400> 51 cactggagtg gcaacttcca g 21 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC22421 <400> 52 ctaaaatggc tccttcaaaa 20 <210> 53 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC22604 <400> 53 cacacaggcc ggccaccatg ggcttccagc ctccggccgc 40 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC22641 <400> 54 atgcgttggt tctgattgtg 20 <210> 55 <211> 3072 <212> DNA <213> mus musculus <220> <221> CDS <222> (54)...(491) <400> 55 gagaaccaga ccaaggccct gtcatcagct cctggagact cagttctggt ggc atg 56 Met 1 gag agg acc ctt gtc tgt ctg gta gtc atc ttc ttg ggg aca gtg gcc 104 Glu Arg Thr Leu Val Cys Leu Val Val Ile Phe Leu Gly Thr Val Ala 5 10 15 cat aaa tca agc ccc caa ggg cca gat cgc ctc ctg att aga ctt cgt 152 His Lys Ser Ser Pro Gln Gly Pro Asp Arg Leu Leu Ile Arg Leu Arg 20 25 30 cac ctt att gac att gtt gaa cag ctg aaa atc tat gaa aat gac ttg 200 His Leu Ile Asp Ile Val Glu Gln Leu Lys Ile Tyr Glu Asn Asp Leu 35 40 45 gat cct gaa ctt cta tca gct cca caa gat gta aag ggg cac tgt gag 248 Asp Pro Glu Leu Leu Ser Ala Pro Gln Asp Val Lys Gly His Cys Glu 50 55 60 65 cat gca gct ttt gcc tgt ttt cag aag gcc aaa ctc aag cca tca aac 296 His Ala Ala Phe Ala Cys Phe Gln Lys Ala Lys Leu Lys Pro Ser Asn 70 75 80 cct gga aac aat aag aca ttc atc att gac ctc gtg gcc cag ctc agg 344 Pro Gly Asn Asn Lys Thr Phe Ile Ile Asp Leu Val Ala Gln Leu Arg 85 90 95 agg agg ctg cct gcc agg agg gga gga aag aaa cag aag cac ata gct 392 Arg Arg Leu Pro Ala Arg Arg Gly Gly Lys Lys Gln Lys His Ile Ala 100 105 110 aaa tgc cct tcc tgt gat tcg tat gag aaa agg aca ccc aaa gaa ttc 440 Lys Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Arg Thr Pro Lys Glu Phe 115 120 125 cta gaa aga cta aaa tgg ctc ctt caa aag atg att cat cag cat ctc 488 Leu Glu Arg Leu Lys Trp Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu 130 135 140 145 tcc tagaacacat aggacccgaa gattcctgag gatccgagaa gattcccgag 541 Ser gactgaggag acgccggaca ctatagacgc tcacgaatgc aggagtacat cttgcctctt 601 gggattgcaa gtggagaagt acgatacgtt atgataagaa caactcagaa aagctatagg 661 ttaagatcct ttcgcccatt aactaagcag acattgtggt tccctgcaca gactccatgc 721 tgtcaacatg gaaaatctca actcaacaag agcccagctt cccgtgtcag ggatttctgg 781 tgcttctcaa gctgtggctt catcttattg cccaactgtg acattctttg attggaaggg 841 gaaaactaaa gcttttagca aaaatacagc tagggaattt gtcgatctgc gagagtaaga 901 cctcttatga tcctaacgga atgatgtaag ctggaaataa taagcataag atgaaattga 961 aaattgaagt ctttattctt taagaaaaac tttgtacttg aaagcatgtc tgaagagttt 1021 actcattacc acaaacatct agcatattga taactaacat ctttatactc tacaagagag 1081 gctttccaga taggtacagt ttttcttctc tattaggtct atcaaaattt aacctattat 1141 gagggtcacc cctggctttc actgtttttc taaagaggca agggtgtagt aagaagcagg 1201 cttaagttgc cttcctccca atgtcaagtt cctttataag ctaatagttt aatcttgtga 1261 agatggcaat gaaagcctgt ggaagtgcaa acctcactat cttctggagc caagtagaat 1321 tttcaagttt gtagctctca cctcaagtgg ttatgggtgt cctgtgatga atctgctagc 1381 tccagcctca gtctcctctc ccacatcctt tcctttcttt cctctttgaa acttctaaga 1441 aaaagcaatc caaacaagtt cagcacttaa gacacattgc atgcacactt ttgataagtt 1501 aaatccaacc atctatttaa aatcaaaatc aggagatgag ccaagagacc agaggttctg 1561 ttccagtttt aaacagactt ttactgaaca tcccaatctt ttaaccacag aggctaaatt 1621 gagcaaatag ttttgccatt tgatataatt tccaacagta tgtttcaatg tcaagttaaa 1681 aagtctacaa agctattttc cctggagtgg tatcatcgct ttgagaattt cttatggtta 1741 aaatggatct gagatccaag catggcctgg gggatggttt tgatctaagg aaaaaggtgt 1801 ctgtacctca cagtgccttt aaaacaagca gagatcccgt gtaccgccct aagatagcac 1861 agactagtgt taactgattc ccagaaaagt gtcacaatca gaaccaacgc attctcttaa 1921 actttaaaaa tatgtattgc aaagaacttg tgtaactgta aatgtgtgac tgttgatgac 1981 attatacaca catagcccac gtaagtgtcc aatggtgcta gcattggttg ctgagtttgc 2041 tgctcgaaag ctgaagcaga gatgcagtcc ttcacaaagc aatgatggac agagagggga 2101 gtctccatgt tttattcttt tgttgtttct ggctgtgtaa ctgttgactt cttgacattg 2161 tgatttttat atttaagaca atgtatttat tttggtgtgt ttattgttct agccttttaa 2221 atcactgaca atttctaatc aagaagtaca aataattcaa tgcagcacag gctaagagct 2281 tgtatcgttt ggaaaagcca gtgaaggctt ctccactagc catgggaaag ctacgcttta 2341 gagtaaacta gacaaaattg cacagcagtc ttgaacctct ctgtgctcaa gactcagcca 2401 gtcctttgac attattgttc actgtgggtg ggaacacatt ggacctgaca cactgttgtg 2461 tgtccatgaa ggttgccact ggtgtaagct ttttttggtt ttcattctct tatctgtaga 2521 acaagaatgt ggggctttcc taagtctatt ctgtatttta ttctgaactt cgtatgtctg 2581 agttttaatg ttttgagtac tcttacagga acacctgacc acacttttga gttaaatttt 2641 atcccaagtg tgatatttag ttgttcaaaa agggaaggga tatacataca tacatacata 2701 catacataca tatatatata tatatataca tatatatata tatatatatg tatatatata 2761 tatatataga gagagagaga gagagagaga gagaaagaga gagaggttgt tgtaggtcat 2821 aggagttcag aggaaatcag ttatggccgt taatactgta gctgaaagtg ttttctttgt 2881 gaataaattc atagcattat tgatctatgt tattgctctg ttttatttac agtcacacct 2941 gagaatttag ttttaatatg aatgatgtac tttataactt aatgattatt tattatgtat 3001 ttggttttga atgtttgtgt tcatggcttc ttatttaaga cctgatcata ttaaatgcta 3061 cccagtccgg a 3072 <210> 56 <211> 146 <212> PRT <213> mus musculus <400> 56 Met Glu Arg Thr Leu Val Cys Leu Val Val Ile Phe Leu Gly Thr Val 1 5 10 15 Ala His Lys Ser Ser Pro Gln Gly Pro Asp Arg Leu Leu Ile Arg Leu 20 25 30 Arg His Leu Ile Asp Ile Val Glu Gln Leu Lys Ile Tyr Glu Asn Asp 35 40 45 Leu Asp Pro Glu Leu Leu Ser Ala Pro Gln Asp Val Lys Gly His Cys 50 55 60 Glu His Ala Ala Phe Ala Cys Phe Gln Lys Ala Lys Leu Lys Pro Ser 65 70 75 80 Asn Pro Gly Asn Asn Lys Thr Phe Ile Ile Asp Leu Val Ala Gln Leu 85 90 95 Arg Arg Arg Leu Pro Ala Arg Arg Gly Gly Lys Lys Gln Lys His Ile 100 105 110 Ala Lys Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Arg Thr Pro Lys Glu 115 120 125 Phe Leu Glu Arg Leu Lys Trp Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His 130 135 140 Leu Ser 145 <210> 57 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC22283 <400> 57 cgctcgagac catggagagg acccttgtct gtct 34 <210> 58 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC22284 <400> 58 gctctagaat cttctcggat cctcaggaat c 31 <210> 59 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide ZC12749 <400> 59 gtaccttccc gtaaatccct ccccttcccg gaattacaca cgcgtatttc ccagaaaagg 60 aactgtagat ttctaggaat tcaatccttg gccacgcgtc 100 <210> 60 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide ZC12748 <400> 60 tcgagacgcg tggccaagga ttgaattcct agaaatctac agttcctttt ctgggaaata 60 cgcgtgtgta attccgggaa ggggagggat ttacgggaag 100 <210> 61 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC22143 <400> 61 cgtatcggcc ggccaccatg agatccagtc ct 32 <210> 62 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC22144 <400> 62 cgtacgggcg cgcctcagga atcttcactt cc 32 <210> 63 <211> 483 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 63 tccagtcctg gcaacatgga gaggattgtc atctgtctga tggtcatctt cttggggaca 60 ctggtccaca aatcaagctc ccaaggtcaa gatcgccaca tgattagaat gcgtcaactt 120 atagatattg ttgatcagct gaaaaattat gtgaatgact tggtccctga atttctgcca 180 gctccagaag atgtagagac aaactgtgag tggtcagctt tttcctgttt tcagaaggcc 240 caactaaagt cagcaaatac aggaaacaat gaaaggataa tcaatgtatc aattaaaaag 300 ctgaagagga aaccaccttc cacaaatgca gggagaagac agaaacacag actaacatgc 360 ccttcatgtg attcttatga gaaaaaacca cccaaagaat tcctagaaag attcaaatca 420 cttctccaaa agatgattca tcagcatctg tcctctagaa cacacggaag tgaagattcc 480 tga 483 <210> 64 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC22052 <400> 64 tcatataggc cggccatatg cccgggcgcc accatggatt ccagtcctgg caacatg 57 <210> 65 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC22053 <400> 65 gtacaacccc agagctgttt taaggcgcgc ctctagatca ggaatcttca cttccgt 57 <210> 66 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC23115 <400> 66 gtatacggcc ggccaccatg gagaggaccc tt 32 <210> 67 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC23116 <400> 67 cgtatcggcg cgccctagga gagatgctga tg 32 <210> 68 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC20892 <400> 68 gtatacgttt aaacgccacc atgccgcgtg gctgg 35 <210> 69 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC20893 <400> 69 cgtatcggcg cgccttacaa tggatgggtc tt 32 <210> 70 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC22054 <400> 70 cccggggtcg acaccatgga ttccagtcct ggcaacatg 39 <210> 71 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC22055 <400> 71 tgcagtttaa actcaggaat cttcacttcc gt 32 <210> 72 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Huzalpha11L-1 peptide <400> 72 Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp 1 5 10 15 Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala 20 25 30 Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys 35 40 <210> 73 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Huzalpha11L-3 peptide <400> 73 Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu 1 5 10 15 Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser 20 25 30 <210> 74 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC23444 <400> 74 gcccgggcgg atccatggat tccagtcct 29 <210> 75 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC23445 <400> 75 cgcgccctcg agtcaggaat cttcacttcc gt 32 <210> 76 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC447 <400> 76 taacaatttc acacagg 17 <210> 77 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC976 <400> 77 cgttgtaaaa cgacggcc 18 <210> 78 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC22128 <400> 78 tcaccacgcg aattcggtac cgctggttcc gcgtggatcc caagatcgcc acatgattag 60 aatgcg 66 <210> 79 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC22127 <400> 79 tctgtatcag gctgaaaatc ttatctcatc cgccaaaaca tcaggaatct tcacttccgt 60 gtgttcta 68 <210> 80 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC19372 <400> 80 tgtcgatgaa gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc 40 <210> 81 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC19351 <400> 81 acgcgcagac taattcgagc tcccaccatc accatcacca cgcgaattcg gtaccgctgg 60 <210> 82 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC19352 <400> 82 actcactata gggcgaattg cccgggggat ccacgcggaa ccagcggtac cgaattcgcg 60 <210> 83 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC19371 <400> 83 acggccagtg aattgtaata cgactcacta tagggcgaat tg 42 <210> 84 <211> 1560 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> CDS <222> (1)...(1560) <223> MBP-human zalpha11 Ligand fusion polynucleotide <400> 84 atg aaa act gaa gaa ggt aaa ctg gta atc tgg att aac ggc gat aaa 48 Met Lys Thr Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys 1 5 10 15 ggc tat aac ggt ctc gct gaa gtc ggt aag aaa ttc gag aaa gat acc 96 Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr 20 25 30 gga att aaa gtc acc gtt gag cat ccg gat aaa ctg gaa gag aaa ttc 144 Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe 35 40 45 cca cag gtt gcg gca act ggc gat ggc cct gac att atc ttc tgg gca 192 Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala 50 55 60 cac gac cgc ttt ggt ggc tac gct caa tct ggc ctg ttg gct gaa atc 240 His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile 65 70 75 80 acc ccg gac aaa gcg ttc cag gac aag ctg tat ccg ttt acc tgg gat 288 Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp 85 90 95 gcc gta cgt tac aac ggc aag ctg att gct tac ccg atc gct gtt gaa 336 Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu 100 105 110 gcg tta tcg ctg att tat aac aaa gat ctg ctg ccg aac ccg cca aaa 384 Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys 115 120 125 acc tgg gaa gag atc ccg gcg ctg gat aaa gaa ctg aaa gcg aaa ggt 432 Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly 130 135 140 aag agc gcg ctg atg ttc aac ctg caa gaa ccg tac ttc acc tgg ccg 480 Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro 145 150 155 160 ctg att gct gct gac ggg ggt tat gcg ttc aag tat gaa aac ggc aag 528 Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys 165 170 175 tac gac att aaa gac gtg ggc gtg gat aac gct ggc gcg aaa gcg ggt 576 Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly 180 185 190 ctg acc ttc ctg gtt gac ctg att aaa aac aaa cac atg aat gca gac 624 Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp 195 200 205 acc gat tac tcc atc gca gaa gct gcc ttt aat aaa ggc gaa aca gcg 672 Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala 210 215 220 atg acc atc aac ggc ccg tgg gca tgg tcc aac atc gac acc agc aaa 720 Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys 225 230 235 240 gtg aat tat ggt gta acg gta ctg ccg acc ttc aag ggt caa cca tcc 768 Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser 245 250 255 aaa ccg ttc gtt ggc gtg ctg agc gca ggt att aac gcc gcc agt ccg 816 Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala 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270 aac aaa gag ctg gca aaa gag ttc ctc gaa aac tat ctg ctg act gat 864 Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp 275 280 285 gaa ggt ctg gaa gcg gtt aat aaa gac aaa ccg ctg ggt gcc gta gcg 912 Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala 290 295 300 ctg aag tct tac gag gaa gag ttg gcg aaa gat cca cgt att gcc gcc 960 Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala 305 310 315 320 acc atg gaa aac gcc cag aaa ggt gaa atc atg ccg aac atc ccg cag 1008 Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln 325 330 335 atg tcc gct ttc tgg tat gcc gtg cgt act gcg gtg atc aac gcc gcc 1056 Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala 340 345 350 agc ggt cgt cag act gtc gat gaa gcc ctg aaa gac gcg cag act aat 1104 Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn 355 360 365 tcg agc tcc cac cat cac cat cac cac gcg aat tcg gta ccg ctg gtt 1152 Ser Ser Ser His His His His His His Ala Asn Ser Val Pro Leu Val 370 375 380 ccg cgt gga tcc tgc ccc gac ctc gtc tgc tac acc gat tac ctc cag 1200 Pro Arg Gly Ser Cys Pro Asp Leu Val Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Gln 385 390 395 400 acg gtc atc tgc atc ctg gaa atg tgg aac ctc cac ccc agc acg ctc 1248 Thr Val Ile Cys Ile Leu Glu Met Trp Asn Leu His Pro Ser Thr Leu 405 410 415 acc ctt acc tgg caa gac cag tat gaa gag ctg aag gac gag gcc acc 1296 Thr Leu Thr Trp Gln Asp Gln Tyr Glu Glu Leu Lys Asp Glu Ala Thr 420 425 430 tcc tgc agc ctc cac agg tcg gcc cac aat gcc acg cat gcc acc tac 1344 Ser Cys Ser Leu His Arg Ser Ala His Asn Ala Thr His Ala Thr Tyr 435 440 445 acc tgc cac atg gat gta ttc cac ttc atg gcc gac gac att ttc agt 1392 Thr Cys His Met Asp Val Phe His Phe Met Ala Asp Asp Ile Phe Ser 450 455 460 gtc aac atc aca gac cag tct ggc aac tac tcc cag gag tgt ggc agc 1440 Val Asn Ile Thr Asp Gln Ser Gly Asn Tyr Ser Gln Glu Cys Gly Ser 465 470 475 480 ttt ctc ctg gct gag agc atc aag ccg gct ccc cct ttc aac gtg act 1488 Phe Leu Leu Ala Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro Phe Asn Val Thr 485 490 495 gtg acc ttc tca gga cag tat aat atc tcc tgg cgc tca gat tac gaa 1536 Val Thr Phe Ser Gly Gln Tyr Asn Ile Ser Trp Arg Ser Asp Tyr Glu 500 505 510 gac cct gcc ttc tac atg ctg aag ggc aag ctt cag tat gag ctg cag 1584 Asp Pro Ala Phe Tyr Met Leu Lys Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln 515 520 525 tac agg aac cgg gga gac ccc tgg gct gtg agt ccg agg aga aag ctg 1632 Tyr Arg Asn Arg Gly Asp Pro Trp Ala Val Ser Pro Arg Arg Lys Leu 530 535 540 atc tca gtg gac tca aga agt gtc tcc ctc ctc ccc ctg gag ttc cgc 1680 Ile Ser Val Asp Ser Arg Ser Val Ser Leu Leu Pro Leu Glu Phe Arg 545 550 555 560 aaa gac tcg agc tat gag ctg cag gtg cgg gca ggg ccc atg cct ggc 1728 Lys Asp Ser Ser Tyr Glu Leu Gln Val Arg Ala Gly Pro Met Pro Gly 565 570 575 tcc tcc tac cag ggg acc tgg agt gaa tgg agt gac ccg gtc atc ttt 1776 Ser Ser Tyr Gln Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe 580 585 590 cag acc cag tca gag gag tta aag gaa ggc tgg aac cct cac tag 1821 Gln Thr Gln Ser Glu Glu Leu Lys Glu Gly Trp Asn Pro His * 595 600 605 <210> 97 <211> 606 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MBP-zalpha11 soluble receptor polypeptide sequence <400> 97 Met Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys 1 5 10 15 Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr 20 25 30 Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe 35 40 45 Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala 50 55 60 His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile 65 70 75 80 Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp 85 90 95 Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu 100 105 110 Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys 115 120 125 Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly 130 135 140 Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro 145 150 155 160 Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys 165 170 175 Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly 180 185 190 Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp 195 200 205 Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala 210 215 220 Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys 225 230 235 240 Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser 245 250 255 Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro 260 265 270 Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp 275 280 285 Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala 290 295 300 Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala 305 310 315 320 Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln 325 330 335 Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala 340 345 350 Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn 355 360 365 Ser Ser Ser His His His His His His Ala Asn Ser Val Pro Leu Val 370 375 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18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC23771 <400> 104 accaccttcc acaaatgc 18 <210> 105 <211> 1347 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 105 gaattcaccc attctctctt tttcctgtca aagatgcaga tggggcacat ttcgttgact 60 ccatcaatcc ctgcccccac acattagcac atgcacacgt atacctagcc agtggaaaag 120 aaaaaagagt tactcacatt catccatttt acaaagattt ccaggctgca atgggagggc 180 tttacctctc cctgaaggat gaataaatag gtagcttaac tgacaacctg ttctcagtca 240 agctgaagtg aaaacgagac caaggtctag ctctactgtt ggtacttatg agatccagtc 300 ctggcaacat ggagaggatt gtcatctgtc tgatggtcat cttcttgggg acactggtcc 360 acaaatcaag ctcccaaggt caagatcgcc acatgattag aatgcgtcaa cttatagata 420 ttgttgatca gctgaaaaat tatgtgaatg acttggtaag actatatttg tcacaacaaa 480 atctaaatca tacttttcaa ttaatataaa aggagggttt ggcttataaa aataactcag 540 aacaaatttt cttttgctct aggtccctga atttctgcca gctccagaag atgtagaggt 600 aagaccagtt gaatttattt ctgaaaatac attggacata agtttttaaa tccaataaga 660 aagacattag catgattata taggagtata ctgaatttta atgaacttag cggtctaata 720 attgatgaaa tatttattta tattttggtt aaattcattg atttaccaaa aaccaactaa 780 aaaatgctat attatattcc tcataaacta tgtttatctt caagaatctc taagagtact 840 cctaagtagt attgctgaga cagaataaca aaactagaaa cgaaatctat actctgatca 900 gtttctgaac aatgcacagc tagttactct ttaagagccc ttgggcatga aagcttttga 960 gccttctttg ttatcctacc gaagaaacat agatacatac agtaggaagc agaattaacc 1020 ttttaataac aaacttaaaa aagaaagaaa gaaagaatta gattacaggg acagcatgga 1080 gaaatggtgg tgtggaaatc aaagctgtcc tttagaatat aattcacata taccttggcc 1140 tcagtgagtc ttgtctttgg ccttccgtga ggtcttttga aagaaccatt ttcaacaatt 1200 catcccgtct cttaagccat ttaaatccat tagagttcca ggaagaagag gcctggcatg 1260 agttcagagt gctgtcccgc tgatcttttt ctcagtaact tctacgatct gatcttctgg 1320 tctggtaccc tgaggtataa atgcaat 1347 <210> 106 <211> 1656 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 106 cctcaactgc ttgattcagg cagaatccta accctaaact gagctgggag tatgaaaagg 60 gttttagaaa agtcatggtg tgatctatgg caagtatatt gattcttaga tgtaaaatat 120 gctatcagag ggaggtaccc acttcctttc tccaaaggag gggctttaat tcattttctt 180 catctgttaa ctttacaaat atatgttgat cattaactgg caagacacta tgcctggcgc 240 tgtacagaat aaaatgctgc tcaagacatg tcatgataga tacattaaca gaaaccacaa 300 acaaatgaaa aatgttcttc atcagactat aacataattt acccaaagct gccactagtc 360 acagtgtaag ttttagagcc tcataactca gcaaatgtgt cctaaaccga actaactctc 420 ctttataaaa cacaaaggtc ttgtccacca cccagacatc aaaatggtcc tctgtgtagc 480 atcaggaata aagcattgtg aagaagtgag gctcctttct ctcttatctg cgaagcaggg 540 gattgtccct ttttcccatc ccaaagatta agtaggaggt gaaatcatac ctcactcatc 600 tgttgaaacg atgtaatgca cgacattgca gaagagatag aaatagagga ttgggaaagc 660 tatcttttac tttctgaata atgtttgtta acatatatac aaattgttta tctttcagac 720 aaactgtgag tggtcagctt tttcctgttt tcagaaggcc caactaaagt cagcaaatac 780 aggaaacaat gaaaggataa taaatgtatc aattaaaaag ctgaagagga aaccaccttc 840 cacaaatgca gggagaagac agaaacacag actagtaaga ttgtcatttg tcatctctct 900 tatttgtact tataaactat atatcttgca ttacataaac atacacacac acctgtagcc 960 agggctgctg gtgtcttcct tacctatagt tatgccttat tatacatggt gctttttttt 1020 tttaagacag agtctcactc tgtcacccag gctggagtgc agtggcgtga tctctgctca 1080 ccgcaagatc cacctcccgg tttcacgcca ttctcctcct acctcagcct cctgagtacc 1140 tgggactaca ggtgcccgcc accatgcccg gctaattttg tttttgtatt tttagtaaag 1200 acagggtttc accatgttag ccaggatggt ctcgatctcc tgaccccgtg atccgcccgc 1260 cttggcctcc caaagtgtgg ggattacagg catgagccac cgcacccggc ctatacgtgg 1320 tgcattttaa gaagtagggt cactctttta agcccacaga cttgaaagta ttcaaaaacc 1380 caattataat ttcctagtag tccttggcag ctggaatatg ttaatatagc ttctcaaggt 1440 gaggaagtca ttaggcagag aatccaactg tgattttgga gttaagaact atttcctctc 1500 atatggtcac agataacttg tattcttatt aacaggagct agatcctagc tttctaacaa 1560 gaaaagagcc tacaagaaga ctagggcaaa tcttaaactt tgcctcctct ctaaatcata 1620 ttactatctg tacatcagca gagtcagtat tgaatt 1656 <210> 107 <211> 644 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 107 agctaaactt agaactctcc agttaagcat gttcatctta tagatgagga aaagtgagat 60 ctacaaagga gttaagtcac tagccccaag ttccataaat agtgtcagaa tgagaattag 120 aacgtatatc tactatcttt tagtgaaatg ctctcactac aacatcacac tggcattgag 180 atgctaacta ccaagcaatg gcttggtgtt tggatctaaa tagggataaa gacaaagagc 240 ataaactaag aaagcttttt aaaaatctaa gtgagcaatc catatatgaa aaactgttca 300 atctccctag taatcacata aatgcgagtt aaaacaagga aatcctgttt tttccaatta 360 aacattttaa acaataccct ataataataa gaatgctcca agtgaaaaga ggtaaaaccc 420 tttataatgt atatcaaagc cttaaaattt ttatcccttt aatttagtaa ttctacttct 480 aggaatatat caaataagca aagatatata tgaaaaatta tttacagaga tgttctttgg 540 agtaatgtag acaaaaataa aaagttagat acagctgggt gtggtggctc atgcctgtat 600 tcccagcact ttgggaggcc gaggcaggcg gatcacctga gatc 644 <210> 108 <211> 645 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)...(645) <223> n = A,T,C or G <400> 108 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gttagatgca ccnttgggtc caaaaatagt aagagtgcat 60 cctatgtgga aacagaccaa ccactacatg tcatattttt gaagattatt taacacttag 120 gaaatcctgt gatatgttaa gtgtgaaaaa aaaaaagcaa atcaccaact ggtataaata 180 atgtaaatgc acaataataa ttaaaaatac ccaaaacaca gagagaatat acattaaaac 240 attgcagtgg gattcctatc tctgggaatg ggattacaag gactttttcc attgttactt 300 tccaaacagt tttatgtact tctcgaatgt ttttcagtga acataattta tgtttttaat 360 gaaaaaaaat tttaagaaac attttattac gaaaaaaatt ttaaagaaga ctgttacttt 420 ttcattgatt tctagacatg cccttcatgt gattcttatg agaaaaaacc acccaaagaa 480 ttcctagaaa gattcaaatc acttctccaa aaggtatcta ccttaagttt catttgattt 540 tctgctttat ctttacctat ccagatttgc ttcttagtta ctcacggtat actatttcca 600 cagatgattc atcagcatct gtcctctaga acacacggaa gtgaa 645 <210> 109 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC25970 <400> 109 atgcattcta gactaggaga gatgctgatg aatcat 36 <210> 110 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC25969 <400> 110 atgcattccg gacataaatc aagcccccaa gggcca 36 <210> 111 <211> 153 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 111 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 20 25 30 Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe 50 55 60 Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 65 70 75 80 Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys 85 90 95 Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 100 105 110 Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 115 120 125 Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe 130 135 140 Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 145 150 <210> 112 <211> 153 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 112 Met Gly Leu Thr Ser Gln Leu Leu Pro Pro Leu Phe Phe Leu Leu Ala 1 5 10 15 Cys Ala Gly Asn Phe Val His Gly His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln 20 25 30 Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys 35 40 45 Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr 50 55 60 Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr 65 70 75 80 Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln 85 90 95 Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg 100 105 110 Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala 115 120 125 Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met 130 135 140 Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser 145 150 <210> 113 <211> 162 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 113 Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr 1 5 10 15 Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His 20 25 30 Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala 35 40 45 Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 50 55 60 Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 65 70 75 80 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 85 90 95 Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu 100 105 110 Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val 115 120 125 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile 130 135 140 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn 145 150 155 160 Thr Ser <210> 114 <211> 144 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 114 Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile 1 5 10 15 Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His 20 25 30 Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp 35 40 45 Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe 50 55 60 Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys 65 70 75 80 Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met 85 90 95 Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser 100 105 110 Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys 115 120 125 Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu 130 135 140 <210> 115 <211> 538 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 115 Met Pro Arg Gly Trp Ala Ala Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gln Gly 1 5 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Pro Gly Leu Gly Gly Pro Leu Gly Ser Leu Leu Asp Arg 435 440 445 Leu Lys Pro Pro Leu Ala Asp Gly Glu Asp Trp Ala Gly Gly Leu Pro 450 455 460 Trp Gly Gly Arg Ser Pro Gly Gly Val Ser Glu Ser Glu Ala Gly Ser 465 470 475 480 Pro Leu Ala Gly Leu Asp Met Asp Thr Phe Asp Ser Gly Phe Val Gly 485 490 495 Ser Asp Cys Ser Ser Pro Val Glu Cys Asp Phe Thr Ser Pro Gly Asp 500 505 510 Glu Gly Pro Pro Arg Ser Tyr Leu Arg Gln Trp Val Val Ile Pro Pro 515 520 525 Pro Leu Ser Ser Pro Gly Pro Gln Ala Ser 530 535

Claims

삭제
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SEQ ID NO:2의 잔기 41(Gln)에서 148(Ile)까지의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드로서, SEQ ID NO:115에 도시된 아미노산 서열에 결합하는 분리된 폴리펩티드.
삭제
SEQ ID NO:2에 도시된 잔기 32(Gln)에서 잔기 162(Ser)까지, 또는 SEQ ID NO:56(마우스)에 도시된 잔기 23(Gln)에서 잔기 146(Ser)까지의 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
제 6 항에 있어서, SEQ ID NO:2에 도시된 아미노산 잔기의 서열이 잔기 1(Met)에서 잔기 162(Ser)까지이거나, 또는 SEQ ID NO:56(마우스)에 도시된 아미노산 잔기의 서열이 잔기 1(Met)에서 잔기 146(Ser)까지인 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
하기의 군에서 선택되는, 적어도 14개의 연속하는 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기를 포함하는 분리된 폴리펩티드.

(a) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 41 에서 56;

(b) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 69 에서 84;

(c) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 92 에서 105; 및

(d) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 135 에서 148
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적어도 4개의 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질로서, 여기에서 N-말단에서부터 C-말단까지 폴리펩티드의 순서가

SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 41에서 56까지의 서열을 포함하는 제 1 폴리펩 티드;

6 내지 27 아미노산 잔기의 제 1 스페이서;

(a) SEQ ID NO:111의 IL-2 나선 B 잔기 53 에서 75;

(b) SEQ ID NO:112의 IL-4 나선 B 잔기 65 에서 83;

(c) SEQ ID NO:113의 IL-15 나선 B 잔기 84 에서 101;

(d) SEQ ID NO: 114의 GMCSF 나선 B 잔기 72 에서 81; 및

(e) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 69 에서 84

로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드;

5 내지 11 아미노산 잔기의 제 2 스페이서;

(a) SEQ ID NO:111의 IL-2 나선 C 잔기 87 에서 99;

(b) SEQ ID NO:112의 IL-4 나선 C 잔기 95 에서 118;

(c) SEQ ID NO:113의 IL-15 나선 C 잔기 107 에서 119;

(d) SEQ ID NO: 114의 GMCSF 나선 C 잔기 91 에서 102; 및

(e) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 92 에서 105

로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 제 3 폴리펩티드;

3 내지 29 아미노산 잔기의 제 3 스페이서; 그리고

(a) SEQ ID NO:111의 IL-2 나선 D 잔기 103 에서 121;

(b) SEQ ID NO:112의 IL-15 나선 D 잔기 134 에서 157;

(c) SEQ ID NO:113의 IL-4 나선 D 잔기 134 에서 160;

(d) SEQ ID NO: 114의 GMCSF 나선 D 잔기 120 에서 131; 및

(e) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 135 에서 148

로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 제 4 폴리펩티드

인 융합 단백질.
적어도 4개의 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질로서, 여기에서 N-말단에서부터 C-말단까지 폴리펩티드의 순서가

(a) SEQ ID NO:111의 IL-2 나선 A 잔기 36 에서 46;

(b) SEQ ID NO:112의 IL-4 나선 A 잔기 29 에서 43;

(c) SEQ ID NO:113의 IL-15 나선 A 잔기 45 에서 68;

(d) SEQ ID NO: 114의 GMCSF 나선 A 잔기 30 에서 44; 및

(e) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 41 에서 56

으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드;

6 내지 27 아미노산 잔기의 제 1 스페이서;

(a) SEQ ID NO:111의 IL-2 나선 B 잔기 53 에서 75;

(b) SEQ ID NO:112의 IL-4 나선 B 잔기 65 에서 83;

(c) SEQ ID NO:113의 IL-15 나선 B 잔기 84 에서 101;

(d) SEQ ID NO: 114의 GMCSF 나선 B 잔기 72 에서 81; 및

(e) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 69 에서 84

로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드;

5 내지 11 아미노산 잔기의 제 2 스페이서;

(a) SEQ ID NO:111의 IL-2 나선 C 잔기 87 에서 99;

(b) SEQ ID NO:112의 IL-4 나선 C 잔기 95 에서 118;

(c) SEQ ID NO:113의 IL-15 나선 C 잔기 107 에서 119;

(d) SEQ ID NO: 114의 GMCSF 나선 C 잔기 91 에서 102; 및

(e) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 92 에서 105

로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 제 3 폴리펩티드;

3 내지 29 아미노산 잔기의 제 3 스페이서; 그리고

SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 135에서 148까지의 서열을 포함하는 제 4 폴리펩티드

인 융합 단백질.
제 10 항에 있어서, 제 4 폴리펩티드가 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 135에서 148까지를 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
제 4 항의 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드 분자.
제 13 항에 있어서, 뉴클레오티드가 SEQ ID NO:1에 도시된 뉴클레오티드 167에서 뉴클레오티드 490까지이거나, 또는 SEQ ID NO:3에 도시된 뉴클레오티드 121에서 뉴클레오티드 444까지인 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드 분자.
제 8 항의 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드 분자.
SEQ ID NO:2에 도시된 잔기 32에서 잔기 162까지, 또는 SEQ ID NO:56에 도시된 잔기 23에서 146까지의 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드 분자.
제 16 항에 있어서, 뉴클레오티드가 SEQ ID NO:1에 도시된 뉴클레오티드 140에서 뉴클레오티드 532까지이거나, 또는 SEQ ID NO:3에 도시된 뉴클레오티드 94에서 뉴클레오티드 486까지인 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드 분자.
SEQ ID NO:2에 도시된 잔기 1에서 잔기 162까지, 또는 SEQ ID NO:56에 도시된 잔기 1에서 146까지의 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드의 서열을 포함하 는 분리된 폴리뉴클레오티드 분자.
제 18 항에 있어서, 뉴클레오티드가 SEQ ID NO:1에 도시된 뉴클레오티드 47에서 뉴클레오티드 532까지, 또는 SEQ ID NO:3에 도시된 뉴클레오티드 1에서 뉴클레오티드 486까지인 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드 분자.
다음의 작동가능하게 연결된 요소

(a) 전사 프로모터;

(b) (a) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 41 에서 56;

(b) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 69 에서 84;

(c) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 92 에서 105; 및

(d) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 135 에서 148

로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 절편; 그리고

(c) 전사 터미네이터

를 포함하는 발현 벡터.
다음의 작동가능하게 연결된 요소

(a) 전사 프로모터;

(b) SEQ ID NO:2에 도시된 잔기 41(Gln)에서 148(Ile)까지에 아미노산 잔기의 서열을 포함하고, 여기에서 위치 44의 잔기가 Asp이고, 위치 47의 잔기가 Asp이고, 위치 135의 잔기가 Glu인 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 절편; 그리고

(c) 전사 터미네이터

를 포함하는 발현 벡터.
다음의 작동가능하게 연결된 요소

(a) 전사 프로모터;

(b) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 32(Gln)에서 162(Ser)까지를 포함하는 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 절편; 그리고

(c) 전사 터미네이터

를 포함하는 발현 벡터.
제 20 항, 제 21 항, 제 22 항 중 어느 한 항에 따르는 발현 벡터를 포함하는 배양 세포.
DNA 절편이 발현되는 조건하에서 제 23 항에 따르는 세포를 배양하는 단계; 및

DNA 절편에 의해 코드화된 단백질을 회수하는 단계

를 포함하는 단백질의 제조 방법.
(a) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 32(Gln)에서 아미노산 번호 162(Ser)까지의 아미노산 잔기의 연속하는 서열과 동일한, 9 내지 131개의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드;

(b) 제 4 항에 따르는 폴리펩티드;

(c) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 41(Gln)에서 아미노산 번호 148(Ile)까지의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;

(d) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 41(Gln)에서 아미노산 번호 56(Val)까지의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;

(e) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 69(Thr)에서 아미노산 번호 84(Leu)까지의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;

(f) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 92(Asn)에서 아미노산 번호 105(Arg)까지의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;

(g) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 135(Glu)에서 아미노산 번호 148(Ile)까지의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;

(h) SEQ ID NO:72의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;

(i) SEQ ID NO:73의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;

(j) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 32(Gln)에서 아미노산 번호 162(Ser)까지의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;

(k) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 1(Met)에서 아미노산 번호 162(Ser)까지의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;

(l) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 114에서 아미노산 번호 119까지의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;

(m) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 101에서 아미노산 번호 105까지의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;

(n) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 126에서 아미노산 번호 131까지의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;

(o) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 113에서 아미노산 번호 118까지의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;

(p) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 158에서 아미노산 번호 162까지의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드

로 구성되는 군으로부터 선택된 폴리펩티드로 동물을 접종하여 폴리펩티드가 동물에서 면역 반응을 유도하여 항체를 생성하도록 하는 단계; 그리고

동물로부터 항체를 분리하는 단계

를 포함하는, SEQ ID NO:2의 잔기 1 내지 162 또는 32 내지 162로 구성되는 폴리펩티드에 대한 항체의 제조 방법.
SEQ ID NO:2의 잔기 1 내지 162 또는 32 내지 162로 구성되는 아미노산 서열을 갖는 항원에 대한 단일클론 항체.
제 4 항의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체.
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SEQ ID NO:2의 잔기 1 내지 162 또는 32 내지 162로 구성되는 폴리펩티드의 부재하에 배양된 골수 또는 말초 혈액 세포와 비교하여, 골수 또는 말초 혈액 세포에 있는 림프양 세포의 수를 증가시키기에 충분한 양의 SEQ ID NO:2의 잔기 1 내지 162 또는 32 내지 162로 구성되는 폴리펩티드를 포함하는 조성물과 함께 골수 또는 말초 혈액 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 조혈 세포 및 조혈 세포 프로게니터의 확장 방법.
제 31 항에 있어서, 조혈 세포 및 조혈 프로게니터 세포가 림프양 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 32 항에 있어서, 림프양 세포가 NK 세포 또는 세포독성 T 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 31 항에 있어서, 조성물이 또한 IL-2, IL-15, IL-4, GM-CSF, Flt3 리간드 및 간세포 인자로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 다른 사이토킨을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
SEQ ID NO:2에 도시된 잔기 32 내지 162까지의 폴리펩티드를 포함하는 이상형성성 B 또는 T 세포의 증식을 감소시키는 백혈병 및 림프종 치료제.
제 35 항에 있어서, 약제는 IL-2, IL-15, IL-4, GM-CSF, Flt3 리간드 및 간세포 인자를 포함하는 것을 특징으로 하는 백혈병 및 림프종 치료제.
SEQ ID NO:2에 도시된 잔기 1 내지 162 또는 32 내지 162까지의 아미노산 서열에 결합하는 단일클론 항체를 포함하는 이상형성성 B 또는 T 세포의 증식을 감소시키는 전신성 홍반성 루프스 (SLE), 류마티스양 관절염 (RA), 다발성 경화증 (MS), 중증 근무력증 및 당뇨병의 치료제.
제 37 항에 있어서, 약제는 IL-2, IL-15, IL-4, GM-CSF, Flt3 리간드 및 간세포 인자를 포함하는 것을 특징으로 하는 전신성 홍반성 루프스 (SLE), 류마티스양 관절염 (RA), 다발성 경화증 (MS), 중증 근무력증 및 당뇨병의 치료제.
제37항에 있어서, 단일클론 항체는 리간드/독소 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 전신성 홍반성 루프스 (SLE), 류마티스양 관절염 (RA), 다발성 경화증 (MS), 중증 근무력증 및 당뇨병의 치료제.
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