KR100729938B1 - 셀루로즈, 자이란, 린첸안 및 만난을 동시에 분해하는페니바실러스 폴리믹사 ＧＳ０１ 균주의 다기능성 단일효소ｃｅｌ４４Ｃ 유전자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 단일효소로서 셀루로즈, 자이란, 린첸안 및 만난을 동시에 분해하는 cel44C 유전자에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) GS01 균주로부터 분리한 셀루로즈, 자이란, 린첸안안 및 만난을 동시에 분해하는 다기능 단일효소 유전자 및 그 유전자의 필수 활성 아미노산 잔기를 제공하는 매우 뛰어난 효과가 있다.

페니바실러스 폴리믹사, 식물세포벽 분해효소, 다기능 단일효소

Description

셀루로즈, 자이란, 린첸안 및 만난을 동시에 분해하는 페니바실러스 폴리믹사 ＧＳ０１ 균주의 다기능성 단일효소 ｃｅｌ４４Ｃ 유전자{Novel multi-glycosyl hydrolase gene cel44C from Paenibacillus polymyxa GS01 strain}

도 1A는 23 내지 49kb DNA 사이즈 확인을 위하여 1㎖의 주사기를 이용하여 DNA를 부분적으로 마쇄한 후 전기 영동한 결과이며 도 1B는 5 내지 40%의 슈크로오즈 밀도 구배 초원심분리법을 이용하여 원심분리한 후 정액펌프를 이용하여 500㎕씩 1.5㎖ 마이크로 듀브에 분취하고 전기 영동한 결과이다.

도 2는 균주 GS01 게놈 라이브러리로부터 클론을 무작위로 선택하고 플라스미드 정제 후 제한효소 BamHI으로 자른 후 전기 영동한 결과이다.

도 3A는 균주 GS01 게놈 라이로부터 셀루라아제(cellulase) 활성 클론을 스크리닝한 결과이며 도 3B는 자이란아제(xylanase) 활성 클론을 스크리닝한 결과이다.

도 4A는 셀루로즈 배지에 서브클로닝한 클론을 배양하여 셀루라아제 활성 클론을 스크리닝한 결과이며 도 4B는 활성 클론의 플라스미드를 분리한 후 여러 제한효소로 처리하여 전기 영동한 결과이다.

도 5는 다기능 단일효소인 cel44C 유전자의 DNA 염기서열, 프로모터 지역, 개방 해독 판톡틀(open reading frame, ORF)의 아미노산 서열을 나타낸 결과이다.

도 6은 다기능 단일효소인 cel44C 유전자의 구조와 셀루라아제, 자이란아제, 린첸안아제 및 만난아제 활성을 나타낸 결과이다.

도 7은 다기능 단일효소인 cel44C 유전자의 구조 분석을 통하여 서브클로닝한 클론의 한천확산법을 통하여 효소 활성을 나타낸 것으로 A는 셀루라아제(cellulase), B는 자이란아제(xylanase), C는 리첸아제(lichenase) D는 만난아제(mannanase) 효소 활성 결과이다.

도 8은 다기능 단일효소인 cel44C 유전자산물을 단백질 전기영동 후 활성염색법으로 단백질 분자량을 측정한 것으로 A는 셀루라아제(cellulase), B는 자이란아제(xylanase), C는 리첸아제(lichenase) 및 D는 만난아제(mannanase) 유전자산물을 확인한 결과이다.

도 9A는 다기능 단일효소인 cel44C 유전자산물의 pH 변화에 따른 결과이며 도 9B는 다기능 단일효소인 cel44C 유전자산물의 온도의 변화에 따른 결과이다.

도 10은 부위 직접돌연변이법(site direct mutagenesis)를 위해 다기능 단일효소인 cel44C의 아미노산 서열과 기존에 알려진 8 가지의 글루코실 하이도라제 패밀리 44(glycosyl hydrolase family 44, GH44)의 효소의 아미노산 서열의 결과이다.

본 발명은 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) GS01 균주가 생성하는 단일효소로서 셀루로즈(cellulose), 자이란(xylan), 린첸안(lichenan) 및 만난(mannan)을 동시에 분해하는 유전자에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 5년근 인삼뿌리 내부로부터 내생균을 분리하고 식물 세포벽 분해력이 우수한 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) GS01 균주를 선발하여 상기 균주로부터 생성되는 cel44c 다기능성 단일효소 유전자 및 부위 직접 돌연변이법(site direct mutagenesis)을 이용하여 셀루로즈(cellulose), 자이란(xylan), 린첸안(lichenan), 및 만난(mannan)을 동시에 분해하는 본 발명 유전자의 필수 활성 아미노산 잔기에 관한 것이다.

식물의 세포벽은 많은 다른 다당류, 단백질, 방향족 화합물로 구성이 되어있다. 셀루로즈(cellulose)는 일차 식물 세포벽 건조중량의 약 15-30%와 이차 식물 세포벽 대부분을 차지하고 있으며, 글루코우스(glucose)가 베타 1→4 결합을 하고 있는 다당류이다. 자이란(xylan)은 헤미셀루로즈의 일종으로 식물 세포벽의 주요 성분이며, 자일로즈(xylose)가 베타 1→4 결합을 하고 있는 다당류이다.

만난(mannan) 역시 헤미셀루로즈이며, 만노오즈(mannose)가 베타 1→4 결합을 하고 있는 다당류이다. 린첸안(lichenan)은 식물의 내배유 조직과 곡류에 존재하는 식물 다당류로 글루코스(glucose)가 베타 1→3과 1→4 결합을 하고 있는 다당류이다.

많은 세균, 곰팡이, 및 동물에서 식물 세포벽을 분해하는 효소들을 암호화하 는 유전자들이 보고 되어있다. 셀루로즈(cellulose)를 분해하는 셀루라아제(cellulase)는 글루코실 하이도라제 패밀리(glycosyl hydrolase family) 5, 8, 9, 44, 45, 48, 및 61 등이 해당되며, 자이란(xylan)을 분해하는 자이란아제(xylanase)는 글루코실 하이도라제 패밀리 10, 11, 및 43 등이 해당되며, 만난의 분해효소인 만난아제는 글루코실 하이도라제 패밀리(glycosyl hydrolase family) 5 및 26 등이 있었으며, 린첸안(lichenan)의 분해효소인 린첸안아제(lichenanase)는 글루코실 하이도라제 패밀리(glycosyl hydrolase family) 16이 대표적이다.

식물 세포벽을 분해하는 효소를 암호화하는 유전자에는 탄수화물 분해를 촉매하는 도메인(catalytic domain, CD), 탄수화물에 결합하는 도메인(carboxylhydrolate binding domain, CBD), 섬유소 기질에 결합하는 도메인(fibronectin, Fn) 등으로 구성되어 있다.

이들 중에서 글루코실 하이도라제 패밀리 44는 지금까지 많이 보고가 되지 않은 식물 세포벽 분해효소이다.

본 발명은 상기와 같은 점들을 감안하여 안출한 것으로, 본 발명의 목적은 식물 뿌리 내부에 존재하는 균주를 분리, 그 균주의 게놈 라이브러리 제작을 통하여 셀루로즈, 자이란, 린첸안, 및 만난을 동시에 분해하는 단일 유전자를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 셀루로즈, 자이란, 린첸안, 및 만난을 동시에 분해하는 단일 유전자의 필수 아미노산 잔기를 제공하는데 있다.

인삼 뿌리 내부로부터 식물 세포벽 분해력이 뛰어난 균주을 선발한 후 단일효소로서 여러 가지 식물 세포벽을 분해하는 신규한 유전자를 분리하고 상기 유전자를 대장균에 이종 발현시킨 후 유전자의 염기 서열과 아미노산 서열을 결정하고 유전자 산물의 확인 및 효소적 특징 분석과 셀루로즈, 자이란, 린첸안 및 만난을 동시에 분해하는 유전자의 필수 활성 아미노산 잔기를 확인함으로써 본 발명을 달성하였다.

본 발명은 인삼뿌리 내부를 완충액을 넣고 분쇄한 후 한천배지에 도말하여 배양한 후 내생균을 분리하는 단계; 식물 세포벽 분해효소 활성을 조사하는 단계; 상기 분리된 균주를 형질도입하여 다기능 단일 유전자 스크리닝 단계; 중합효소연쇄반응을 이용하여 다기능 단일 유전자의 구조 분석 단계; 효소의 클로닝 및 형질전화하여 얻은 클론을 배양하여 그 상등액을 조효소로 사용하여 다기능 단일 유전자 산물을 확인하는 단계; 디니트로살리시릭산(dinitrosalicylic acid)을 이용한 환원당 정량법으로 다기능 단일효소의 생화학적 특징 검사 단계 및 부위 직접 돌연변이법으로 유전자의 필수 활성 아미노산 잔기를 확인하는 단계로 구성된다.

본 발명에서 분리된 균주를 대장균(E. coli) EP1300TM에 형질도입하였고 유 전자 스크리닝은 대장균(E. coli) DH5α에 형질전환하여 단일 유전자를 스크리닝하였다.

본 발명에서 단일 유전자의 DNA 염기서열 분석은 PRISM Ready reaction dye terminator/primer cycle sequencing kit(Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT, USA)를 이용한 사슬종결법으로 DNA 염기서열 분석하였다.

본 발명에서 단일 유전자의 DNA 염기서열의 연결 및 아미노산의 개방 해독 판독틀(open reading frame, ORF) 분석을 DNAMAN 분석 시스템(Lynnon Biosoft, Quebec, Canada)를 이용하여 분석하였다.

본 발명에서 단일 유전자의 DNA와 아미노산의 상동성 조사는 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)의 블라스트(BLAST) 네트워크 서비스와 DNAMAN 분석 시스템(Lynnon Biosoft, Quebec, Canada)를 이용하여 조사하였으며 다기능 단일효소를 생성하는 신규한 유전자(cel44C)는 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)에 등록 번호 DQ367923으로 등록되었다.

본 발명에서 단일 유전자의 필수 활성 아미노산 잔기는 부위 직접 돌연변이법으로 Site directed mutagenesis kit(Stratagene, La Jolla, CA, USA)를 사용하였고 중합효소연쇄반응을 실시한 후 대장균(E. coli) DH5α에 형질전환하여 DNA 염기서열을 분석한 후 효소들 간의 활성을 조사하였다.

이하 본 발명의 구성을 하기 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하지만 본 발명 의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예1 : 균주 분리 및 분해효소 활성 조사

5년근 인삼뿌리를 세척한 후 물기를 제거하고 1% 염소로 10분 동안 침지하여 인삼뿌리 표면을 소독한다. 그 후에 인삼뿌리의 표면으로부터 약 0.5cm를 제거하고 남은 인삼뿌리 내부를 살균된 막자사발에 넣은 후 살균 10mM 포스페이트 완충액(pH 7.2)을 넣고 완전히 마쇄한 후 트리피틱 소이 한천배지(TSA, Difco, USA)에 도말하여 28℃에서 48시간 동안 배양한 후 내생 균주를 분리하였다. 상기 분리된 내생균주를 한천 확산법으로 셀루라아제, 자이란아제, 펙틴아제 및 프로테아제의 식물 세포벽 분해효소 활성을 조사한 결과 상기 내생균주 중 GS01 균주가 식물세포벽 분해효소 활성이 가장 우수하였다(표 1; -: 활성 없음, +: 약간 활성, ++: 중간 활성, +++: 강한 활성). GS01 균주는 16S rRNA 염기서열을 통해서 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa)로 동정되었고 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) GS01로 명명하였다.

<표 1> 인삼뿌리 내부로부터 분리한 내생균들의 식물세포벽 분해 활성

균 주	셀루라아제	자이란아제	펙틴아제	프로테아제
GS01	+++	+++	+++	+++
GS02	-	-	-	-
GS03	+	-	-	-
GS04	-	-	-	-
GS05	-	-	-	-
GS06	++	++	++	++
GS07	-	-	-	+
GS08	-	-	-	+
GS09	-	-	-	-
GS10	-	-	-	+
GS11	+	-	-	+
GS12	-	-	-	-

실시예2 . 균주 GS01 게놈 라이브러리 구축

균주 GS01의 토탈 게놈 DNA를 분리한 후 DNA 농도 측정하여 100 ㎍/㎖되게 희석을 한다. 상기 희석된 DNA를 1㎖씩 1.5㎖ 마이크로 듀브에 담은 후 1㎖의 주사기를 이용하여 DNA를 부분적으로 마쇄한 후 전기 영동하여 23 내지 49kb의 사이를 확인한 후 이차 사이즈 선발을 위하여 5 내지 40%의 슈크로오즈 밀도 구배 초원심분리법을 이용하여 원심분리한 후 정액펌프를 이용하여 500㎕씩 1.5 ㎖ 마이크로 듀브에 분취하고 전기 영동하여 23 내지 49kb의 사이즈를 확인하였다. 사이즈 확인된 라인을 모아서 DNA를 정제하고 DNA 끝을 수선(End-repair)한 후 코스미드 pCC1FOSTM 운반체에 연결하고 람다 DNA 페키징 키드에 포장하여 대장균(E. coli) EP1300TM 에 형질 도입하여(Epicentre, WI, USA), 약 4,000,000 클론의 코스미드 라이브러리 풀(pool)을 확보하였다. 이 코스미드 라이브러리를 384 격자에 넣어 배양한 후 한천 확산법으로 식물세포벽 분해 활성 클론을 스크린하였다(도 1 내지 3).

실시예3 . 다기능 단일 유전자의 DNA 서열 및 아미노산 서열

DNA와 아미노산의 상동성 조사는 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)의 블라스트(BLAST) 네트워크 서비스와 DNAMAN 분석 시스템(Lynnon Biosoft, Quebec, Canada)를 이용하여 조사하였다. 셀루라아제 분해활성이 있는 코스미드 클론(cel44F)을 퀴아젠 중간 플라스미 드(Qiagen midi plasmid kit, USA)를 이용하여 코스미드 플라스미드를 분리한 후 숏트간(shunt gun) 방법으로 서브클로닝하여 카복실메칠셀루로즈가 들어있는 배지에서 접종하여 활성이 있는 클론 선발하고 플라스미드를 분리하여 여러 제한효소를 처리하여 DNA 지도를 작성하는 동시에 다기능 단일효소를 코딩하는 유전자 서열 및 아미노산 서열이 서열번호 1 내지 2와 같았다.

개방 해독 판독틀(open reading frame, ORF)을 코딩하는 유전자는 4,056 bp이며 아미노산은 1,352로 구성되어져 있었다. ATG가 시작 코돈이고 오처(ochre) 코돈인 TAA가 종결 코돈이며, 프로모터 영역에 -35 지역, -10 지역, 및 라이보좀 결합 서열(ribosome binding sequence, RBS)인 GGAGG로 구성이 되어 있었다(도 4 내지 5).

실시예4 . 다기능 단일유전자의 유전자 구조 분석

본 발명 유전자의 구조 분석은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 기초로 하였다. 중합효소연쇄반응을 실시하기 위해 제작한 정방향 프라이머에는 BamHI의 제한효소를 만들고 역방향 프라이머에는 새로운 종결코든과 SalI의 제한 효소를 만들어 중합효소연쇄반응을 한 후 증폭산물과 운반체인 pBluescript II SK+를 BamHI과 SalI의 제한효소로 처리한 후 정제하여 연결하고 대장균(E. coli) DH5α에 형질전환하여 그 특성을 분석하였다. 본 발명 다기능 단일효소인 cel44C 유전자는 pBluescript II SK+ 운반체에 안에 약 5.1 kb 정도 클로닝 되었으며, 유전자의 구조 분석을 위하여 여러 프라이머를 제작하여 pBluescript II SK+ 운반체에 다시 서브클로닝 하였다.

다기능 단일효소인 cel44C 유전자 시그날 펩타이드(signal peptide, SP), 글루코실 하이도라제 패밀리 44(glycosyl hydrolase family 44, GH44) 도메인, 피브로넥틴 타입 3(fibronectin type 3, Fn3) 도메인, 글루코실 하이도라제 패밀리 26(glycosyl hydrolase family 44, GH26) 도메인 및 셀루로즈 결합 타입3 모둘레스(cellulose-binding modules type 3, CBM3)로 구성되어 있다. 글루코실 하이도라제 패밀리 26(glycosyl hydrolase family 44, GH26) 도메인은 오로지 만난아제 활성만이 관여하는 도메인인 것으로 나타났으며, 글루코실 하이도라제 패밀리 44(glycosyl hydrolase family 44, GH44) 도메인은 셀루라아제, 자이란아제, 및 린첸안아제을 동시에 분해하는 다기능 도메인인 것으로 나타났다.

피브로넥틴 타입 3(fibronectin type 3, Fn3) 도메인과 셀루로즈 결합 모둘레스 타입3 (cellulose-binding modules type 3, CBM3)는 효소활성에 영향을 미치지 않은 것으로 나타났다(표 2 및 도 6 내지 7).

표 2. 다기능 단일효소인 cel44C 유전자 구조 분석을 위한 프라이머

실시예5 . 다기능 단일효소의 도메인별 상동성 비교

본 발명 다기능 단일효소인 cel44 유전자의 4가지 도메인과 기존에 밝혀진 도메인과 상동성을 비교한 결과 글루코실 하이도라제 패밀리 44(glycosyl hydrolase family 44, GH44) 도메인과 가장 높은 상동성은 페니바실러스 란투스(Paenibacillus latus)의 celA와 63.3%, 피브로넥틴 타입 3(fibronectin type 3, Fn3) 도메인은 페니바실러스 종(Paenibacillus sp.) BP-23의 cel48C와 47.8%, 글루코실 하이도라제 패밀리 26(glycosyl hydrolase family 44, GH26) 도메인은 딕툐그로무스 써모필윰(Dictyoglomus thermophilum) Rt46B.1의 manA와 59.1% 있었으며, 셀루로즈 결합 타입3 모둘레스(cellulose-binding modules type 3, CBM3)는 칼디바실러스 셀루로보란스(Caldibacillus cellulovorans)의 xylA와 60.7%로 가장 상동성이 높았다. 모든 도메인 기존에 알려진 것과 상동성이 높지 않은 것으로 보아 본 발명 다기능 단일효소인 cel44C는 신규한 효소이며 이를 코딩하는 유전자 역시 신규한 유전자인 것으로 확인이 되었다(표 3).

표 3. 본 발명 다기능 단일효소 cel44C와 기존에 알려진 도메인별 상동성 비교

실시예6 : 다기능 단일효소의 유전자산물 확인 및 특징

본 발명 다기능 단일효소 cel44C의 유전자 산물은 단백질 전기영동 후 활성 염색을 통하여 확인하였다. 셀루로즈, 자일이란, 리첸, 및 만난 기질에 대하여 각각 확인한 결과 모두 약 145,000Da으로 확인되었다. 또한 생물정보학 켬퓨터 등전점과 분자량을 측정한 결과 145,294Da로 동일한 결과를 보였다 (http://kr.expasy.org/tools/pi_tool.html).

본 발명 다기능 단일효소 cel44C의 pH에 대한 영향을 살펴본 결과 셀루로즈와 리첸을 분해하는 셀루라아제와 리첸아제는 pH 7.0에서 최적 활성을 나타냈었으며, 자이란과 만난를 분해하는 자이란아제와 만난아제는 pH 5.0에서 최적 활성을 나타냈었다. 다기능 단일효소 cel44C의 온도에 대한 영향을 살펴본 결과 셀루로즈, 자일이란, 리첸, 및 만난의 모든 기질에 대해서 50℃에서 최적 활성을 나타내었다(도 8 내지 9).

실시예7 : 다기능 단일효소의 필수 아미노산 잔기 확인

본 발명 다기능 단일효소 cel44C 유전자의 활성 부위 조사는 부위 직접 돌연변이법으로 수행하였다(Site directed mutagenesis kit, Stratagene, La Jolla, CA, USA). 본 발명 cel44C 유전자가 코딩하는 아미노산 서열과 기존에 알려진 8개의 아미노산 서열을 정렬하여 글루타믹산(glutamic aicd, Glu, E)과 아스파틱산(aspartic acid, Asp, D)이 일치하는 14개의 지역을 선정한 후 글루타믹산과 아스파틱산 모두를 알라닌(Alanie, Ala, A)으로 대처한 프라이머를 제작한 후 pET-29(+)/P558 플라스미드를 주형으로 하여 중합효소연쇄반응을 실시한 후 DpnI의 제 한효소로 처리한 후 대장균(E. coli) DH5α에 형질전환하여 얻은 클론에서 플라스미드를 정제하여 DNA 염기서열 분석하여 변화된 것을 확인 한 후 본 발명 다기능 단일효소 cel44C 유전자의 기존 효소와 무탄트(mutant)된 효소들 간의 활성을 조사하였다(표 4).

표 4. 본 발명 다기능 단일효소 cel44C의 부위 직접 돌연변이법을 위한 프라이머

본 발명 다기능 단일효소 cel44C의 구십 한 번째 글루타믹산(E91A)과 이백 이십 두 번째 글루타믹산(E222A)을 알라닌(Alanie)으로 변화시킨 결과 셀루로즈, 자이란, 및 린첸안을 분해할 수 있는 효소 활성이 소실한 것으로 보아 셀루로즈, 자이란, 및 린첸안을 분해하는데 이 두 아미노산이 필수 아미노산 잔기인 것으로 확인되었다. 그 외 다른 무탄트 단백질들은 활성이 기존 단백질과 비슷하거나 2 내지 4배 정도로 활성이 작아졌다(표 5 및 도 10).

표 5. 본 발명 다기능 단일효소 cel44C와 이들 무탄드 단백질의 셀루로즈, 자이란, 및 린첸안 분해를 위한 효소의 특정적 활성과 상대적 활성

단백질	특이적 활성(U/mg)/상대적 활성(%)
	셀루라아제	자이란아제	린첸안아제
P558	765/100	378/100	754/100
E91A	ND	ND	ND
D100A	312/41	132/35	273/36
D106A	282/37	112/30	258/34
D195A	312/41	134/35	274/36
E196A	336/44	161/43	296/39
D220A	253/33	107/28	240/32
E222A	ND	ND	ND
E242A	279/37	106/28	245/32
D258A	310/41	125/33	266/35
E262A	312/41	128/34	271/36
D314A	758/99	371/98	748/99
D317A	244/32	99/26	234/31
D323A	281/37	116/31	241/32
[주] ND; 활성 없음

상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) GS01 균주로부터 분리한 본 발명 cel44 유전자는 단일효소로서 셀로루즈, 자이란, 린첸안, 및 만난를 동시에 분해하는 매우 뛰어난 효과가 있으므로 제지공업 및 유기농 생산을 위한 환경산업 및 농업산업에 있어 매우 유용한 발명인 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (3)

1. 서열번호 1의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드로써 셀루로즈(cellulose), 자이란(xylane), 린첸안안(lichene) 및 만난(mannane)을 동시에 분해하는 다기능 단일효소 cel44c 유전자(미국 국립생물정보센터 : NCBI 등록번호 DQ367923).
2. 상기 제1항 유전자 서열로부터 코딩된 서열번호 2의 아미노산 서열.
3. 상기 제1항 유전자의 구조 분석을 위한 서열번호 3 내지 8의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드.

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