KR100560375B1 - 만난아제를 코딩하는 유전자와 그 형질전환체를 이용하여생산된 재조합 만난아제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) WL-12 균주의 만난아제(mannanase)를 코드하는 신규한 만난아제 유전자, 그 유전자를 포함한 재조합 플라스미드, 그 재조합 플라스미드를 포함하는 대장균 형질전환체에 관한 것으로, 동물의 장내와 가까운 환경인 중성 pH와 중온에서 반응성이 높을뿐만 아니라 갈락토만난을 만노즈, 만노바이오즈와 만노트리오즈로 분해하는 만난아제를 제공하는 뛰어난 효과가 있다.
바실러스 리체니포미스 WL-12 균주, 만난아제, 만난아제 유전자, 갈락토만난 가수분해 산물
Description
도 1은 본 발명 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) WL-12 균주의 만난아제를 코드하는 유전자를 포함한 재조합 플라스미드 pMWL13의 제한효소 지도이다.
도 2는 본 발명 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) WL-12 균주의 만난아제를 코드하는 유전자를 포함한 재조합 플라스미드 pMWL13의 개열 지도이다.
도 3은 본 발명 재조합 플라스미드 pMWL13를 함유한 대장균 형질전환체가 생산하는 만난아제의 반응온도와 반응 pH에 따른 활성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명 재조합 플라스미드 pMWL13를 함유한 대장균 형질전환체가 생산하는 만난아제에 의한 아카시아 열매수지 유래 갈락토만난의 최종 분해 산물의 박층크로마토그래피 사진도이다.
도 5는 본 발명 재조합 플라스미드 pMWL13를 함유한 대장균 형질전환주가 생산하는 만난아제에 의한 만노바이오즈, 만노트리오즈, 만노테트라오즈, 만노펜토즈, 만노헥소즈의 최종 분해 산물의 박층크로마토그래피 사진도이다.
본 발명은 만난아제 생합성 유전자와 그 효소 생산에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 된장으로부터 갈락토만난 분해능이 우수한 것으로 분리된 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) WL-12 균주 유래의 만난아제(mannanase)를 코드하는 유전자의 염기서열과 아미노산 서열에 관한 것이다.
만난아제는 헤미셀룰로즈를 구성하는 주요성분인 만난 함유물질을 분해하는 효소로 그 용도가 증대되고 있다. 헤미셀룰로즈는 식물 세포벽의 구성성분이며 셀룰로즈와 리그닌과 결합하여 존재하는데 자연계에 셀룰로즈 다음으로 풍부한 다당류이다.
헤미셀룰로즈에는 콩과식물의 씨에 존재하는 갈락토만난, 아라비노갈락탄, 침엽수의 글루코만난, 갈락토글로코만난 등의 만난물질이 포함된다. 자일라나제 및 글루카나제와 함께 헤미셀룰라제에 속하는 만난아제의 이용 가능성 중 가장 중요한 것은 지구상의 재생가능한 식물자원인 헤미셀룰로즈를 당화하여 생물체가 이용가능한 탄소원으로 전환시키는 것이나, 아직까지 현실화되지는 않은 상태이다.
현재 헤미셀룰라제가 실용화되는 것들로 커피, 초코렛, 코코아, 차, 시리얼등의 식품 및 펄프 등이 있다.
식품과 사료에 사용되는 헤미셀룰로즈를 함유한 곡물을 헤미셀룰라제로 가공하면 식·사료용에 알맞은 형태로 전환되어 에너지 수율이 증진되고 점질도가 저하 된다. 그런데, 식품과 가축사료의 이용 가능한 에너지 함량이 높아진다면, 특히 사료에 있어서는 가축의 생산가를 낮출 수 있는 이점이 있다.
대두 단백질은 개, 고양이, 돼지, 물고기, 닭 등의 가축 사료로 사용된다. 주된 에너지원 성분은 아니지만 대두박은 필수아미노산을 갖는 우수한 단백질원이다. 대두박 성분 중 에너지원 성분인 탄수화물의 약 10% 정도는 갈락탄과 펜토산으로 구성된다. 이러한 탄수화물은 단위 동물에 의해 상당량이 소화되지 않고 배설되는데 만난아제는 대두박의 에너지원이 되는 탄수화물 중 갈락탄을 저분자의 올리고당이나 단당으로 분해하여 단위동물이 쉽게 대사할 수 있도록 한다.
만난아제는 고초균과 애로모나스(Aeromonas), 엔테로코커스(Enterococcus), 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속에 속하는 세균을 비롯하여 곰팡이, 효모 등의 미생물에 의해 생산된다. 그리고, 고등식물과 동물도 만난아제를 생산하는 것이 있다.
그러나, 실제 만난아제 효소의 생산에 사용되고 있는 미생물은 주로 트리코더마 (Trichoderma), 아스퍼질러스 (Aspergillus) 속 곰팡이 균주들이며, 곰팡이 유래의 만난아제는 산성 조건에서 최대 활성을 나타낸다.
한편, 돼지나 닭의 소화기관의 생리적 조건은 부위별로 다르지만 만난아제가 작용하여야 할 소장 이후의 pH 조건은 6.5 부근이다. 따라서 pH 3.6 ∼ 5.5 부근에서 활성이 높은 곰팡이 유래의 만난아제보다는 중성 부근의 산도 조건에서 활성이 높은 만난아제가 사료첨가용 효소로 요구되고 있다.
헤미셀룰로즈의 주요성분인 만난을 완전하게 분해하여 당화하기 위해서는 일 반적으로 세가지 종류의 효소, 즉 엔도만난아제 (endo-β-mannanase), 엑소만난아제 (exo-β-mannanase) 및 만노시다제 (β-mannosidase)가 함께 작용해야 한다. 이들 중 엔도만난아제는 만노즈 중합도가 4개인 만노테트라오즈 이상의 중합도를 갖는 만난 다당류의 β-D-1,4-만노피라노실(mannopyranosyl) 결합을 무작위로 가수분해하는 반응을 촉매하며, 만난물질을 가수분해하는데 주된 역할을 한다.
본 발명에서는 이들 효소중 첫 번째 엔도만난아제에 중점을 두었으며 이후 이 효소를 편의상 만난아제로 칭한다.
본 발명자들은 상기와 같은 사실을 감안하여 중성의 산도에서 활성이 높은 만난아제를 생산하는 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) WL-12 균주를 전통식품인 된장으로부터 분리하여 이를 동정하였고, 이 균주로부터 만난아제를 코드하는 유전자를 크로닝하고 그 염기서열을 결정하였다. 또한, 만난아제 유전자를 함유한 재조합 플라스미드에 의해 형질전환된 대장균 형질전환체에서 생산된 만난아제의 반응특성을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 산도가 중성에서 활성이 높은 만난아제를 생산하는 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) WL-12 균주로부터 만난아제를 코드하는 유전자를 크로닝하여 그 염기서열을 결정하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 만난아제 유전자를 함유한 재조합 플라스미드에 의해 형질전환된 대장균 형질전환체를 발현시켜 만난아제를 생산하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 생산된 만난아제를 함유하는 사료를 제공하는데 있다.
본 발명의 상기 목적은 된장에서 분리된 갈락토만난 분해능이 우수한 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) WL-12로부터 추출한 염색체 DNA를 이용하여 제조한 유전자 라이브러리를 도입한 대장균의 콜로니가 자란 고체 한천배지에 아카시아 열매수지 갈락토만난을 함유한 한천배지를 중층하여 갈락토만난 분해환을 관찰함으로써 만난아제 유전자를 함유한 대장균 형질전환주를 얻고, 이러한 형질전환주가 지니고 있는 재조합 플라스미드를 분리하여 만난아제를 코드하는 유전자의 염기서열을 밝히고 제한효소 지도를 작성 한 후, 대장균 형질전환주가 생산하는 만난아제를 부분 정제하여 반응온도와 반응 pH가 만난아제의 활성에 미치는 영향을 분석한 다음, 만난아제에 의한 아카시아 열매수지 갈락토만을 비롯한 만노바이오즈, 만노트리오즈, 만노테트라오즈, 만노펜토즈, 만토헥소즈 각각의 분해산물을 비교 분석하여 식·사료첨가용으로서의 유용성을 확인함으로써 달성하였다.
본 발명은 자연계에서 갈락토만난 분해능이 우수한 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) WL-12 균주를 분리·동정하는 단계; 분리된 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) WL-12 균주의 총 염색체 DNA를 추출하고 제한효소로 처리하여 플라스미드와 연결한 후 이를 대장균에 도입하여 유전자 라이브러리를 제조하는 단계; 상기 제조된 유전자 라이브러리의 대장균 형질전환체를 고체 한천배지에 도말하여 콜로니가 형성된 후 아카시아 열매수지 갈락토만난을 함유한 한천배지를 중층하여 갈락토만난 분해환을 관찰함으로써 만난아제 유전자를 함유한 형질전환체를 선별하는 단계; 만난아제 유전자를 함유한 대장균 형질전환체로부터 재조합 플라스미드를 추출하여 만난아제 염기서열을 밝히는 단계; 본 발명 만난아제 유전자를 함유한 대장균 형질전환체를 발현시켜 만난아제 생산 ·부분정제한 다음, 본 발명 만난아제의 반응 온도와 반응 pH에 따른 활성을 분석하고 만난 종류에 따른 가수분해 활성을 비교하는 단계; 본 발명 만난아제에 의한 아카시아 열매수지 갈락토만난 분해산물과 만노바이오즈, 만노트리오즈, 만노테트라오즈, 만노펜토즈, 만노헥소즈의 분해산물을 박층 크로마토그래피로 조사하는 단계로 구성된다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
상기 단계에서 대장균 형질전환체 중에서 갈락토만난 분해능을 보이는 형질전환체를 선별하는 중층배지로 아카시아 열매수지 갈락토만난 2 g/L, 효모 추출물 5 g/L, 트립톤 10 g/L, NaCl 5 g/L, 앰피실린 50 mg/L, 한천 8 g/L로 구성되고, pH를 7.0으로 조절한 LB-갈락토만난 한천 배지를 사용한다.
대장균 형질전환체 배양용 배지로는 효모 추출물 5 g/L, 트립톤 10 g/L, NaCl 5 g/L로 구성되고, LB 복합 액체배지에 앰피실린 (50 mg/L)을 첨가하여 사용한다.
만난아제를 생산하는 미생물 분리를 위해 된장 시료 현탁액을 영양평판배지에서 배양하고, 평판배지 상에 형성된 콜로니 주위의 갈락토만난 분해환을 관찰하여 만난아제 생산균을 분리한다.
분리 균주의 동정은 형태적, 생화학적 특성 및 16S rRNA 유전자의 염기서열 을 조사함으로써 실시한다. 분리균을 동정하기 위해 특성을 조사한 결과, 호기성이고 그람 양성균이며, 포자를 형성하고 카탈라아제 활성을 지닌 단간균으로 확인되어 바실러스 속에 속하는 것으로 판단된다.
백 카드(BAC 카드)를 사용하여 비텍 (VITEK) 판독기로 바실러스 속 분리균의 생화학적 특성을 분석한 결과, 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)와 97%의 유사도 값을 보이며, 16S rRNA 유전자의 염기서열을 조사한 결과 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)의 유전자 염기서열과 상동성이 99%로 나타나 유사도가 가장 높은 것으로 판단된다.
상기 분리 ·동정된 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) WL-12의 만난아제 유전자 클로닝을 위하여 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) WL-12의 유전자 라이브러리를 제조하고, 만난아제 유전자를 함유하는 대장균 형질전환체를 선별한다.
바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) WL-12 균주를 대수증식기까지 증식시키고 원심분리하여 회수한 균체에서 염색체 DNA를 추출한 후, 이를 제한효소 Sau3AI로 절단하고 전기영동하여 1∼10kb 크기의 DNA단편을 회수한다.
이 단편들을 BamHI로 절단한 플라스미드 pUC19에 삽입시켜 유전자 라이브러리를 제조한다. 상기 제조된 재조합 플라스미드를 대장균에 형질전환시키고, 만난아제 유전자를 함유한 형질전환체의 획득을 위해 LB 한천배지에 도말한다. 상기 재조합 플라스미드를 도입하는 대장균으로서는 당해 재조합 플라스미드를 도입, 발현 및 유지할 수 있는 것이면 어떠한 것도 사용할 수 있다. 예를 들면, XL-1, C600, Y1088, Y1090, NM522, K802 및 JM105 등이 사용된다. 이어 대장균 형질전환주 콜로니가 형성된 후 LB-갈락토만난 중층배지를 중층하여 5시간 배양한 후 갈락토만난 분해환을 보이는 형질전환체를 선발한다.
만난아제를 코드하는 유전자의 염기배열을 결정하기 위해 상기 대장균 형질전환체를 앰피실린을 첨가한 LB 액체 배지에서 배양한다. 이어, 배양하여 얻은 균체를 알칼리 분해방법으로 플라스미드를 분리한다.
여기에 여러 가지 제한효소를 처리하여 조사한 결과 재조합 플라스미드는 약 1.3kb 크기의 클론된 DNA 단편을 함유하고 있으며, 이 재조합 플라스미드를 pMWL13으로 명명하였다. 플라스미드 pMWL13에 있는 클론된 1.3kb DNA 단편의 염기서열을 결정하기 위해 여러가지 제한 효소를 이용하여 단편을 작은 조각으로 나누어 pUC19에 삽입시켜 디데옥시뉴클레이티드 시퀀싱 (dideoxynucleotide sequencing) 방법으로 총 1,300 bp의 염기서열을 결정한다.
이 염기서열에는 만난아제의 구조유전자에 해당하는 총 1,083 bp의 오픈리딩프레임(open reading frame)이 존재하며(서열번호 1), 이 구조유전자의 염기배열로부터 추론된 만난아제 효소의 아미노산 서열은 서열번호 2에 나타낸 것으로 총 361개 아미노산으로 이루어진 단백질이다.
이렇게 밝혀진 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) WL-12의 만난아제 유전자의 염기배열로부터 유추된 만난아제의 아미노산 배열을 기존에 밝혀진 바실러스 속 균주의 만난아제의 아미노산 배열의 유사성이 높은 것을 조사한 결과, 가장 상동성이 높은 것이 80% 정도의 상동성을 보이는 것으로 확인되어 바실러 스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)의 만난아제 유전자는 신규한 유전자임을 알 수 있다.
본 발명 재조합 플라스미드 pMWL13을 함유한 대장균 형질전환체를 발현시켜 생산된 재조합 만난아제의 온도와 pH에 따른 활성을 조사하기 위해, 앰피실린을 첨가한 LB 액체배지에서 pMWL13으로 형질전환된 대장균 형질전환체를 배양하고 배양된 균체를 파쇄 ·농축하여 효소를 부분정제한다. 이 효소에 대해 반응온도와 pH를 달리하여 만난아제 활성을 측정한다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 65℃와 pH 6.0에서 최고의 효소 활성을 보이며 pH 5.5∼6.5 범위에서는 90% 이상의 활성을 보인다. 특히 동물 장내의 생리적 조건인 pH 6.5에서 최고활성의 93% 이상에 해당하는 활성을 보인다. 부분정제된 만난아제를 이용하여 만난의 종류에 따른 효소 활성을 측정하기 위해 아카시아 열매수지 갈락토만난, 구아 수지 글루코만난, 곤냑의 가수분해 상대 활성도를 비교한 결과 표 1에 나타난 바와 같이 갈락토만난에 대한 가수분해력이 가장 높음을 알 수 있다.
본 발명 만난아제 유전자를 함유하는 대장균 형질전환체의 발현에 의해 생산되는 만난아제의 만난 가수분해 물질을 분석하기 위해, 아카시아 열매수지 갈락토만난을 기질로 하여 최적 반응조건하에서 가수분해 반응을 실시하고 그 최종 산물을 박층 크로마토그래피(TLC)로 분석한다. 그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 최종산물로 만노즈, 만노바이오즈와 만노트리오즈 등이 생성된다. 또한, 만노바이오즈, 만노트리오즈, 만노테트라오즈, 만노펜토즈, 만노헥소즈를 기질로 하여 본 발명 만나아제를 각각 반응시킨 후 가수분해 산물을 박층 크로마토그래피를 수행하여 조사한 결과 도 5에 나타낸 바와 같이 만노바이오즈를 분해하지 않으며, 만노트리오즈, 만노테트라오즈, 만노펜토즈와 만노헥소즈를 만노즈, 만노바이오즈와 만노트리오즈로 분해하는 것이 확인된다.
따라서, 본 발명 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) WL-12 균주의 만난아제 유전자에 의해 생산되는 만난아제는 만난 물질을 분해하여 소당류를 생성하는 것을 알 수 있다.
이하, 본 발명의 구체적인 구성을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 바실러스(
Bacillus
) 속 WL-12의 분리와 동정
만난아제를 생산하는 미생물 분리를 위해 된장 시료 1 g을 0.85% NaCl 용액 10 mL에 현탁하고 현탁액의 적당량을 취하여 0.5%의 아카시아 열매수지 갈락토만난 (locust bean gum)을 첨가한 영양(nutrient) 평판배지(beef extract, 3 g; bacto-peptone, 5 g; water, 1 liter)에 도말한 후 37℃에서 배양하였다. 평판배지 상에서 형성된 콜로니 주위의 갈락토만난 분해환을 관찰하여 만난아제 생산균들을 선별하고 60℃에서 성장하는 균을 최종적으로 1주 분리하였다. 분리균을 WL-12로 명명하고 갈락토만난 이외의 다른 고분자 물질을 분해할 수 있는지 분석하기 위해 스킴 밀크(1%), 스타치(0.2%), 트리부틸린(tributylin)(1%)과 카복시메틸 셀룰로오즈(carboxymethyl cellulose)(0.5%)를 각각 첨가한 평판배지에서 배양하여 분해환을 조사였는데, 그 결과 이들을 모두 분해하였다.
분리 균주의 동정은 형태적, 생화학적 특성 및 16S rRNA 유전자의 염기서열을 조사함으로써 실시하였다. 분리균의 형태적 관찰을 위해서는 그람염색과 포자염색을 실시하였고, 생화학적 특성을 조사하기 위해서는 VITEK(bioMerieux Inc. France)을 사용하였다. 분리균 WL-12를 동정하기 위해 특성을 조사한 결과 호기성이며 그람 양성균으로 나타났으며, 포자를 형성하고 카탈라아제 활성을 지닌 단간균으로 확인되어 바실러스 속에 속하는 것으로 판단되었다.
또한, WL-12의 탄수화물 이용능을 BAC CARD를 사용하여 조사한 결과 수크로즈(sucrose), 글루코스(glucose), 이노시톨(inositol), 아라비노즈(arabinose), 만노즈(mannose), 살리신(salicin), 아미그달린(amygdalin), 말토즈(maltose), 트레할로즈(trehalose), 팔라티노즈(palatinose)는 이용하였으나, 다른 탄수화물은 이용하지 못하는 것으로 확인되었다.
이러한 WL-12의 형태적 특성과 생화학적 특성으로 볼 때 바실러스 속 균주 중 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)와 유사성이 가장 높았으며 97%의 유사도 값을 보였다.
추가적으로 WL-12 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 다른 균주와 비교하기 위해 세균의 16S rRNA 유전자 염기서열 중 보존 염기서열을 프라이머로 사용하고 분리균의 총염색체 DNA를 템플레이트로 하여 PCR을 수행함으로써 증폭된 DNA 단편의 염기서열을 다른 균주의 것과 비교하였는데, 그 결과 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 유전자의 염기서열과 상동성이 가장 높은 것으로 나타났 다. 상기 여러 특성으로 보아 분리균은 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)로 판단되었다.
실시예 2 : 바실러스 리체니포미스(
Bacillus licheniformis
) WL-12 균주의 만난아제 유전자의 크로닝
(1) 단계1 : 바실러스 리체니포미스( Bacillus licheniformis ) WL-12의 유전자 라이브러리 제조
실시예 1에서 분리·동정된 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) WL-12 균주를 LB 액체배지 200 mL에 접종하여 37℃에서 대수 증식기까지 진탕 배양하고, 균체 배양액을 원심분리하여 회수한 균체를 TEN 완충용액 (10 mM Tris-HCl, pH 7.6, 1 mM EDTA, 10 mM NaCl)으로 세척한 후 라이소자임을 첨가한 SET 완충액 (20% 수크로즈, 50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 50 mM EDTA) 20 mL에 현탁하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 여기에 10% 소디움 도데실설페이트(SDS)를 2 mL 첨가하여 균체를 용해시키고, 프로테아제 K를 적당량 처리하여 37℃에서 1 시간 동안 방치하였다.
페놀을 첨가하고 원심분리한 후 상등액을 모아 두배 부피의 차가운 에탄올을 첨가하여 엉기는 염색체 DNA를 유리봉으로 감아올려 70%, 80%, 90% 에탄올에서 순차적으로 세척한 후, 적정부피의 TE 완충용액 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)에 녹였다.
분리된 염색체 DNA 50㎍을 제한효소 Sau3AI으로 부분 절단한 후 아가로즈 겔 전기영동하여 크기가 1∼10kb 크기의 DNA 단편을 회수하였다. 제한효소 BamHI으로 완전히 절단한 플라스미드 pUC19와 염색체 절단체를 동량 섞고 T4 DNA 리가제를 첨가하여 14℃에서 15시간 반응시켜 연결반응을 실시하여 바실러스 WL-12의 유전자 라이브러리를 제조하였다.
(2) 단계2 : 만난아제 유전자를 갖는 대장균 형질전환체의 선별
단계1 에서 얻은 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) WL-12의 유전자 라이브러리를 이용하여 대장균 XL-1을 형질전환시키고 LB 한천배지에 도말하여 약 10,000개의 형질전환체를 얻었다. 이 때 대장균은 대장균 XL-1 대신 C600, Y1088, Y1090, NM522, K802 및 JM105 중에서 어느 하나를 선택하여 사용하여도 된다. 이들 형질전환주 위에 LB-칼락토만난 배지를 중층하여 콜로니 주변에 갈락토만난 분해환을 보이는 형질전환체를 1주 선발함으로써 만난아제 유전자를 포함하는 대장균 형질전환체를 획득하였다.
실시예 3 : 본 발명 만난아제를 코드하는 유전자 염기배열의 결정
실시예 2의 단계2 에서 얻은 형질전환체를 앰피실린 (50 mg/L)을 첨가한 LB 액체배지에서 키워 얻은 균체로부터 알칼리 분해방법 (Birnboim, H. C. and J. Doly, Nucleic Acid Res. 7, 1513-1523 (1979))으로 플라스미드를 분리하고 여러 가지 제한효소를 처리하여 조사한 결과 재조합 플라스미드는 약 1.3kb 크기의 클론된 DNA 단편을 함유하고 있었으며, 이 재조합 플라스미드를 pMWL13으로 명명하였 다. pMWL13의 제한효소 지도를 도 1에 표시하였다.
도 1에서 Man은 본 발명의 만난아제 유전자를 포함하는 DNA 단편이다.
플라스미드 pMWL13에 있는 클론된 1.3 kb DNA 단편의 염기서열을 결정하기 위해 여러 가지 제한 효소를 이용하여 단편을 작은 조각으로 나누어 pUC19에 삽입시켜 디데옥시뉴클레이티드 시퀀싱(dideoxynucleotide sequencing) 방법으로 총 1,300 bp의 염기서열을 결정하였다. 이 염기서열에는 만난아제의 구조유전자에 해당하는 총 1,083 bp의 오픈리딩프레임 (open reading frame)이 존재하였다 (서열번호 1). 이러한 구조유전자의 염기배열로부터 추론된 만난아제 효소의 아미노산 서열은 서열번호 2에 나타낸 것으로 총 361개 아미노산으로 이루어진 단백질이다.
이렇게 밝혀진 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) WL-12의 만난아제 유전자의 염기배열로부터 유추된 만난아제의 아미노산 배열을 기존에 밝혀진 바실러스 속 균주의 만난아제의 아미노산 배열의 유사성이 높은 것을 조사한 결과 가장 상동성이 높은 것이 80% 정도의 상동성을 보이는 것으로 확인되어 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)의 만난아제 유전자는 신규한 유전자였다.
실시예 4 : 본 발명 형질전환된 대장균의 발현에 의해 생산되는 만난아제 활성의 조사
상기 실시예 3에서 제조된 재조합 플라스미드 pMWL13을 함유한 대장균 형질전환체를 발현시켜 생산되는 만난아제의 반응온도와 pH에 따른 가수분해 활성을 조 사하기 위하여, 앰피실린 (50 mg/L)을 첨가한 LB 액체배지에 pMWL13으로 형질전환된 대장균 형질전환주를 접종하여 37℃에서 16시간 동안 진탕 배양하고 배양된 균체를 초음파 파쇄한 후 파쇄액을 황산 암모니움염 분획, 이온 크로마토그래피를 통해 효소를 부분정제한 다음, 이 부분정제된 효소를 반응온도와 pH를 달리하여 아카시아 열매수지 갈락토만난에 반응시킴으로써 만난아제 활성을 측정하였다.
실험결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 65℃와 pH 6.5에서 최고의 효소 활성을 보였으며 pH 5.5∼6.5 범위에서는 90% 이상의 활성을 보였다. 특히 동물 장내의 생리적 조건인 pH 6.5에서 최고활성의 93% 이상에 해당하는 활성을 보였다.
또한, 부분정제된 만난아제를 이용하여 만난의 종류에 따른 효소 활성을 측정하기 위해 아카시아 열매수지 갈락토만난, 구아 수지 글루코만난, 곤냑의 가수분해 상대 활성도를 비교하였다. 이때 반응 조건은 pH 6.0과 50℃로 하여 반응을 수행하였다. 실험결과, 표 1에 나타난 바와 같이 갈락토만난, 곤냑, 글루코만난 순서로 이들에 대한 가수분해력이 높은 것을 알 수 있었다.
이와 같은 결과를 살펴볼 때 본 발명 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) WL-12 균주의 만난아제 유전자를 함유하는 대장균 형질전환체에 의해 생산되는 만난아제는 사료 첨가에 적합함을 알 수 있었다.
| 기질의 종류 | 상대 활성치 (%) |
| 아카시아 열매수지 갈락토만난 | 100.0 |
| 곤냑 | 91.6 |
| 구아 수지 글루코만난 | 12.2 |
실시예 5 : 본 발명 형질전환된 대장균의 발현에 의해 생산되는 만난아제의 만난 가수분해 산물 조사
실시예 4에서 얻어진 부분정제된 만난아제에 의한 만난 최종반응 산물을 분석하기 위해 아카시아 열매수지 갈락토만난을 기질로 하여 최적 반응조건하에서 가수분해 반응을 실시하고 최종 가수분해 산물을 박층 크로마토그래피(TLC)를 하였다.
그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이 최종산물로 만노즈, 만노바이오즈와 만노트리오즈 등이 생성되었다.
또한, 만노바이오즈, 만노트리오즈, 만노테트라오즈, 만노펜토즈, 만노헥소즈를 기질로 하여 본 발명 만난아제를 각각 반응시킨 후 가수분해 산물을 박층 크로마토그래피를 수행하여 조사한 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 만노바이오즈를 분해하지 않았으며, 만노트리오즈, 만노테트라오즈, 만노펜토즈와 만노헥소즈를 만노즈, 만노바이오즈와 만노트리오즈로 분해하는 것이 확인되었다.
따라서, 본 발명의 만난아제는 만난 물질을 분해하여 만난 소당류를 생성하는 것으로 나타났다.
상기에서 설명한 바와 같이 본 발명 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) WL-12 균주의 만난아제 유전자를 도입하여 형질전환된 대장균의 발현에 의해 생산된 만난아제는 아카시아 열매수지, 곤냑, 구아 수지 유래 만난의 가수분해에 뛰어난 효과가 있을 뿐만아니라, 그 가수분해 산물은 동물의 장내 유용세균의 성장인자로 작용하는 만노즈, 만노바이오즈와 만노트리오즈를 포함한 만노즈 소량류이므로 식사료 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
<110> CTC BIO, INC.
<120> Gene coding mannanase and recombinant mannanase expressed from
transformant thereof
<130> 2959
<150> KR1020030042182
<151> 2003-06-26
<160> 2
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 1083
<212> DNA
<213> Bacillus licheniformis WL-12
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1083)
<400> 1
tta gtg aaa aaa aac atc gtt tgt tca atc ttc gcg ctg ctc ctt gct 48
Leu Val Lys Lys Asn Ile Val Cys Ser Ile Phe Ala Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
ttt gcc gtt tcg cag ccg agc tat gca cac acc gtt tct ccg gtg aac 96
Phe Ala Val Ser Gln Pro Ser Tyr Ala His Thr Val Ser Pro Val Asn
20 25 30
ccg aat gcc cag ccg acg acg aaa gcg gtg atg aac tgg ctc gcc cac 144
Pro Asn Ala Gln Pro Thr Thr Lys Ala Val Met Asn Trp Leu Ala His
35 40 45
ctg ccc aat cgg acg gaa agc cgg gtg atg tcc ggg gcg ttc gga gga 192
Leu Pro Asn Arg Thr Glu Ser Arg Val Met Ser Gly Ala Phe Gly Gly
50 55 60
tac agc ctc gac aca ttt tca acg gct gaa gcc gac cgg atc aaa cag 240
Tyr Ser Leu Asp Thr Phe Ser Thr Ala Glu Ala Asp Arg Ile Lys Gln
65 70 75 80
gca aca gga cag ctg ccg gcc ata tac ggc tgc gat tat gca aga gga 288
Ala Thr Gly Gln Leu Pro Ala Ile Tyr Gly Cys Asp Tyr Ala Arg Gly
85 90 95
tgg ctg gag ccg gaa aag atc gcc gat acg att gac tac agc tgc aac 336
Trp Leu Glu Pro Glu Lys Ile Ala Asp Thr Ile Asp Tyr Ser Cys Asn
100 105 110
cgt gat ttg atc gca tac tgg aaa agc gga ggc att ccg caa atc agc 384
Arg Asp Leu Ile Ala Tyr Trp Lys Ser Gly Gly Ile Pro Gln Ile Ser
115 120 125
atg cac ctc gca aac ccc gcg ttt act tcg ggt cat tat aaa act cag 432
Met His Leu Ala Asn Pro Ala Phe Thr Ser Gly His Tyr Lys Thr Gln
130 135 140
att tca aac agc cag tat gag aga att tta gat tct tcc act cct gaa 480
Ile Ser Asn Ser Gln Tyr Glu Arg Ile Leu Asp Ser Ser Thr Pro Glu
145 150 155 160
gga aag cgg ctt gag gcg atg ctg agc aaa atc gcg gac ggc ctc cag 528
Gly Lys Arg Leu Glu Ala Met Leu Ser Lys Ile Ala Asp Gly Leu Gln
165 170 175
gag ctt gaa aat gaa ggc gtg ccc gtt cta ttc aga ccc ctt cac gaa 576
Glu Leu Glu Asn Glu Gly Val Pro Val Leu Phe Arg Pro Leu His Glu
180 185 190
atg aac ggc gaa tgg ttc tgg tgg ggg ctg acg caa tat aat caa aaa 624
Met Asn Gly Glu Trp Phe Trp Trp Gly Leu Thr Gln Tyr Asn Gln Lys
195 200 205
gac agc gaa aga atc tcc ttg tac aaa cag ctc tat gtg aaa atc tat 672
Asp Ser Glu Arg Ile Ser Leu Tyr Lys Gln Leu Tyr Val Lys Ile Tyr
210 215 220
gac tat atg aca aaa aca aga ggc ctg gat cat ctc ttg tgg gtg tat 720
Asp Tyr Met Thr Lys Thr Arg Gly Leu Asp His Leu Leu Trp Val Tyr
225 230 235 240
gcg ccg gac gcc aac aga gac ttt aaa acg gac ttt tat ccg ggc gca 768
Ala Pro Asp Ala Asn Arg Asp Phe Lys Thr Asp Phe Tyr Pro Gly Ala
245 250 255
tca tat gtg gac att gtc ggg ctt gac gct tat ttt gat gac ccg tac 816
Ser Tyr Val Asp Ile Val Gly Leu Asp Ala Tyr Phe Asp Asp Pro Tyr
260 265 270
gcc att gat ggc tac gaa gag ctc aca tcg ctg aac aag ccg ttt gcc 864
Ala Ile Asp Gly Tyr Glu Glu Leu Thr Ser Leu Asn Lys Pro Phe Ala
275 280 285
ttt aca gaa gtc gga ccg cag acg aca aac ggc ggg ctg gat tac gcg 912
Phe Thr Glu Val Gly Pro Gln Thr Thr Asn Gly Gly Leu Asp Tyr Ala
290 295 300
cgg ttt atc cat gcc atc aaa gaa aaa tac ccg aaa acg acg tac ttc 960
Arg Phe Ile His Ala Ile Lys Glu Lys Tyr Pro Lys Thr Thr Tyr Phe
305 310 315 320
ctg gcg tgg aac gat gag tgg agc ccg gct gtg aat aag gga gcg gac 1008
Leu Ala Trp Asn Asp Glu Trp Ser Pro Ala Val Asn Lys Gly Ala Asp
325 330 335
acc ctc tat ctt cat cca tgg acg ctg aat aaa gga gag ata tgg gac 1056
Thr Leu Tyr Leu His Pro Trp Thr Leu Asn Lys Gly Glu Ile Trp Asp
340 345 350
ggc gat tct ttg acg cct gtc gtg gaa 1083
Gly Asp Ser Leu Thr Pro Val Val Glu
355 360
<210> 2
<211> 361
<212> PRT
<213> Bacillus licheniformis WL-12
<400> 2
Leu Val Lys Lys Asn Ile Val Cys Ser Ile Phe Ala Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Phe Ala Val Ser Gln Pro Ser Tyr Ala His Thr Val Ser Pro Val Asn
20 25 30
Pro Asn Ala Gln Pro Thr Thr Lys Ala Val Met Asn Trp Leu Ala His
35 40 45
Leu Pro Asn Arg Thr Glu Ser Arg Val Met Ser Gly Ala Phe Gly Gly
50 55 60
Tyr Ser Leu Asp Thr Phe Ser Thr Ala Glu Ala Asp Arg Ile Lys Gln
65 70 75 80
Ala Thr Gly Gln Leu Pro Ala Ile Tyr Gly Cys Asp Tyr Ala Arg Gly
85 90 95
Trp Leu Glu Pro Glu Lys Ile Ala Asp Thr Ile Asp Tyr Ser Cys Asn
100 105 110
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Thr Leu Tyr Leu His Pro Trp Thr Leu Asn Lys Gly Glu Ile Trp Asp
340 345 350
Gly Asp Ser Leu Thr Pro Val Val Glu
355 360
Claims (6)
- 서열목록 서열 1의 염기서열로 나타내어지는 만난아제를 코딩하는 뉴클레오티드.
- 제1항 기재의 염기서열을 포함하는 개열 지도 도 2에 기재된 재조합 벡터.
- 제2항 기재의 재조합 벡터에 의해 형질전환된 대장균.
- 서열목록 서열 2의 아미노산 서열로 나타내어지는 만난아제 단백질.
- 제3항에 기재된 대장균의 배양물로부터 얻음을 특징으로 하는 만난아제의 제조방법.
- 제4항 기재의 재조합 만난아제가 첨가된 가축사료.
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