KR100680765B1

KR100680765B1 - 3'-아미노-2',3'-디데옥시구아노신의 제조 방법

Info

Publication number: KR100680765B1
Application number: KR1020050035689A
Authority: KR
Inventors: 성동호; 한세종; 송성원; 함병재; 이수영; 강재성
Original assignee: 주식회사 삼천리제약
Priority date: 2005-04-28
Filing date: 2005-04-28
Publication date: 2007-02-09
Anticipated expiration: 2025-04-28
Also published as: KR20060112944A; US20060263859A1

Abstract

본 발명은 3'-아미노-2',3'-디데옥시구아노신의 제조 방법에 관한 것으로서, 3'-아미노-3'-데옥시티미딘을 출발물질로 효소작용으로 3-아미노-2,3-디데옥시리보스를 2,6-디아미노퓨린에 전이하여 3'-아미노-2',3'-디데옥시리보실2,6-디아미노퓨린을 높은 수율로 만든 후 아데노신 디아미나아제의 작용으로 탈아민화하여 3'-아미노-2',3'-디데옥시구아노신을 효율적으로 제조하는 방법이다.

3'-아미노-2',3'-디데옥시구아노신, 뉴클레오시드 포스포릴라아제, 아데노신 디아미나아제

Description

3'-아미노-2',3'-디데옥시구아노신의 제조 방법{Methods of preparation of 3'-amino-2',3'-dideoxyguanosine}

도 1은 본 발명에 따른 3'-아미노-2',3'-디데옥시구아노신 제조과정을 보인다.

본 발명은 아데노신 디아미나아제를 사용한 하기 화학식 1의 3'-아미노-2',3'-디데옥시구아노신의 제조 방법에 관한 것이다.

(화학식 1)

N3' → O5' 포스포라미데이트(phosphoramidates)는 이중나선 및 삼중나선에서도 안정성이 있으며, 보통의 DNA나 RNA에 비하여 뉴클리아제에 대한 저항성이 높다. 이들은 DNA 교잡 프로브 및 낮은 카피수를 가지고 있는 RNA 서열에 대하여 높은 선택성이 있는 PCR 증폭을 위한 프라이머에 사용되어질 수 있다. 그러나 이러한 화합물을 이용하는데 있어서 큰 장애는 아미노뉴클레오시드를 얻기가 어렵다는 것이다.

아미노뉴클레오시드 중 3'-아미노-2',3'-디데옥시구아노신은 화학적인 제조방법으로 3'-아지도-3'-데옥시티미딘을 원료로 3'-아지도-3'-데옥시-5'-O-아세틸티미딘을 만든 후 N²-팔미토일구아닌과 치환하는 방법이 알려지고 있으나(JOC, 43(15),3044) 아노머의 생성으로 분리정제가 어려울 뿐만 아니라 제조 수율이 28%로 낮아 효율성 높은 제조 방법의 개발이 요구 되어지고 있으며, 케모엔지마틱 방법으로 3'-아지도-3'-데옥시티미딘을 화학적으로 환원하여 3'-아미노-3'-데옥시티미딘을 만든 후 효소반응으로 3'-아미노-2',3'-디데옥시구아노신을 제조하는 방법(Nucleosides & Nucleotides, 13(1-3),819)이 알려지고 있으나 치환효율이 좋지 않아 정제 후 수율 20.5%로 역시 낮아 공업적 생산을 위하여 제조 효율이 좋은 방법이 요구되어져 왔다.

본 발명은 보다 효율적으로 3'-아미노-2',3'-디데옥시 구아노신을 제조하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 3'-아미노-3'-데옥시티미딘(하기 화학식 2) 및 2,6-디아미노퓨린(하기 화학식 3)을 뉴클레오시드 포스포릴라아제로 당전이시켜 3'-아미노-2',3'-디데옥시리보실 2,6-디아미노퓨린(하기 화학식 4)를 제조하고, 상기 3'-아미노-2',3'-디데옥시리보실 2,6-디아미노퓨린를 아데노신 디아미나아제를 이용하여 효소적으로 전환시켜 3'-아미노-2',3'-디데옥시구아노신(화학식 1)로 제조하는 것을 특징으로 하는 3'-아미노-2',3'-디데옥시구아노신(화학식 1)의 제조방법을 제공한다(도 1 참조).

(화학식 1)

(화학식 2)

(화학식 3)

(화학식 4)

상기 뉴클레오시드 포스포릴라아제는 분리 정제된 형태의 효소, 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성을 가진 미생물균체, 유전자 조작에 의해 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성을 가지는 미생물균체 또는 상기 미생물 균체의 처리물로 이루어진 그룹에서 선택되어질 수 있다.

뉴클레오시드 포스포릴라아제는 인산 존재하에 뉴클레오시드의 N-글리코시드 결합을 가인산 분해하는 효소의 총칭으로, 리보뉴클레오시드를 예로 들면 다음 식으로 표시되는 반응을 촉매한다.

리보뉴클레오시드 + 인산(염) → 핵산 염기 + 리보스1-인산

푸린뉴클레오시드 포스포릴라아제와 피리미딘뉴클레오시드 포스포릴라아제로 대별되는 이 효소는 널리 생물계에 분포하며 포유류, 조류, 어류 등의 조직, 효모, 세균에 존재한다. 이 효소 반응은 가역적이며, 역반응을 이용한 각종 뉴클레오시드 화합물의 합성이 이전부터 알려져 있다.

본 발명에서의 뉴클레오시드 포스포릴라아제란 인산 존재하에 뉴클레오시드 화합물의 N-글리코시드 결합을 분해하는 효소의 총칭을 말하며, 본 발명에서는 역반응을 이용할 수가 있다. 반응에 사용하는 효소는 3'-아미노-3'-데옥시티미딘와 2,6-디아미노퓨린에서 3'-아미노-2',3'-디데옥시리보실2,6-디아미노퓨린을 생성할 수 있는 활성을 가지고 있으면 어떠한 종류 및 기원의 것이어도 상관없다. 이 효소는 푸린형과 피리미딘형으로 대별되는데, 공지된 것으로서는, 예를 들면 푸린형으로서 푸린뉴클레오시드 포스포릴라아제(EC2.4.2.1), 구아노신포스포릴라아제(EC2.4.2.15), 피리미딘형으로서 피리미딘뉴클레오시드 포스포릴라아제(EC2.4.2.2), 우리딘포스포릴라아제(EC2.4.2.3), 티미딘포스포릴라아제(EC2.4.2.4), 데옥시우리딘포스포릴라아제(EC2.4.2.23) 등을 들 수 있다.

본 발명에서의 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성을 갖는 미생물이란 푸린뉴클레오시드 포스포릴라아제(EC2.4.2.1), 구아노신포스포릴라아제(EC2.4.2.15), 피리미딘뉴클레오시드 포스포릴라아제(EC2.4.2.2), 우리딘 포스포릴라아제(EC2.4.2.3), 티미딘포스포릴라아제(EC2.4.2.4), 데옥시우리딘포스포릴라아제(EC2.4.2.23)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 일종 이상의 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 발현하고 있는 미생물이면 특별히 한정되지 않는다.

이러한 미생물의 구체예로서는 노카르디아(Nocardia)속, 미크로박테리움(Microbacterium)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 브레비박테리움속(Brevibacterium)속, 셀룰로모나스(Cellulomonas)속, 플라보박테리움(Flabobacterium)속, 클루이베라(Kluyvere)속, 미코박테리움(Micobacterium)속, 헤모필라스(Haemophilus)속, 미코플라나(Micoplana)속, 프로타미노박터(Protaminobacter)속, 칸디다(Candida)속, 사카로마이세스(Saccharomyces)속, 바실루스(Bacillus)속, 호열성의 바실루스 속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 미크로코카스(Micrococcus)속, 하프니아(Hafnia)속, 프로테우스(Proteus)속, 비브리오(Vibrio)속, 스타피로코카스(Staphyrococcus)속, 프로피오니박테리움(Propionibacterium)속, 사르티나(Sartina)속, 플라노코카스(Planococcus)속, 에세리시아(Escherichia)속, 쿠르티아(Kurthia)속, 로도코카스(Rhodococcus)속, 아시네토박터(Adinetobacter)속, 잔토박터(Xanthobacter)속, 스트렙토마이세스(Streptomyces)속, 리조븀(Rhizobium)속, 살모넬라(Salmonella)속, 클레브시엘라(Klebsiella)속, 엔테로박터(Enterobacter)속, 에르위니아(Erwinia)속, 에로모나스(Aeromonas)속, 시트로박터(Citrobacter)속, 아크로모박터(Achromobacter)속, 아그로박테리움(Agrobacterium)속, 아스로박터(Arthrobacter)속 또는 슈도노카르디아(Pseudonocardia)속에 포함되는 미생물주를 적합한 예로서 들 수 있다.

최근의 분자 생물학 및 유전자 공학의 진보에 의해 상술한 미생물주의 뉴클레오시드 포스포릴라아제의 분자 생물학적인 성질 또는 아미노산 서열 등을 해석함으로써 상기 단백질의 유전자를 상기 미생물주로부터 취득하여 상기 유전자 및 발현에 필요한 제어 영역이 삽입된 재조합 플라스미드를 구축하고, 이것을 임의의 숙주에 도입하여 상기 단백질을 발현시킨 유전자 재조합균을 만들어 내는 것이 가능해지고, 또한 비교적 용이해지기도 하였다. 이러한 기술 수준에 비추어 이러한 뉴클레오시드 포스포릴라아제 유전자를 임의의 숙주에 도입한 유전자 재조합균도 본 발명의 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 발현하고 있는 미생물에 포함되는 것으로 한다.

여기에서 말하는 발현에 필요한 제어 영역이란 프로모터 서열(전사를 제어하는 오퍼레이터 서열을 포함한다), 리보좀 결합 서열(SD 서열), 전사 종결 서열 등을 나타내고 있다. 프로모터 서열의 구체예로서는 대장균 유래의 트립토판오페론의 trp 프로모터, 락토스오페론의 lac 프로모터, 람다 파지 유래의 프로모터 또는 고초균 유래의 글루콘산 합성 효소 프로모터(gnt), 알칼리 프로테아제 프로모터(apr) ·중성 프로테아제 프로모터(npr) α-아밀라제 프로모터(amy) 등을 들 수 있다. 또, tac 프로모터와 같이 독자적으로 개변·설계된 서열도 이용할 수 있다. 리보좀 결합 서열로서는 대장균 유래 또는 고초균 유래의 서열을 들 수 있지만 대장균이나 고초균 등의 목적으로 하는 숙주내에서 기능하는 서열이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면 16S 리보좀 RNA의 3' 말단 영역에 상보적인 서열이 4염기 이상 연속된 콘센서스 서열을 DNA 합성에 의해 제조하여 이것을 이용하여도 좋다. 전사종결 서열은 반드시 필요한 것은 아니지만 ρ 인자 비의존성인 것, 예를 들면 리포프로테인 터미네이터, trp 오페론 터미네이터 등을 이용할 수 있다. 이들 제어 영역의 재조합 플라스미드상에서의 서열 순서는 5' 말단측 상류부터 프로모터 서열, 리보좀 결합 서열, 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 코드하는 유전자, 전사 종결 서열의 순으로 배열하는 것이 바람직하다.

여기에서 말하는 플라스미드의 구체예로서는 대장균 중에서의 자율 복제 가능한 영역을 가지고 있는 pBR322, pUC18, Bluescript II SK(+), pKK223-3, pSC101 또는 고초균 중에서의 자율 복제 가능한 영역을 가지고 있는 pUB110, pTZ4, pC194, ρ11, φ1ㅡ φ105 등을 벡터로서 이용할 수가 있다. 또한, 2종류 이상의 숙주내에서의 자율 복제가 가능한 플라스미드의 예로서 pHV14, TRp7, YEp7 및 pBS7을 벡터로서 이용할 수가 있다.

여기에서 말하는 임의의 숙주로는 후술하는 실시예와 같이 대장균(Escherichia coli)을 대표예로서 들 수 있지만 특별히 대장균으로 한정되는 것은 아니며, 고초균(Bacillus subtilis) 등의 바실루스속균, 효모나 방선균 등의 다른 미생물 균주도 포함된다.

본 발명에서의 뉴클레오시드 포스포릴라아제 또는 이 효소 활성을 갖는 미생물로서는 시판 중인 효소, 이 효소 활성을 갖는 미생물 균체 및 균체 처리물 또는 이들의 고정화물 등을 사용할 수 있다. 균체 처리물이란, 예를 들면 아세톤 건조균체나 기계적 파괴, 초음파 파쇄, 동결 융해 처리, 가압 감압 처리, 침투압 처리, 자기 소화, 세포벽 분해 처리, 계면 활성제 처리 등에 의해 제조한 균체 파쇄물 등이고, 또한 필요에 따라 황산암모늄 침전 또는 아세톤 침전, 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제를 거듭한 것을 이용할 수도 있다.

상기 아데노신 디아미나아제는 분리 정제된 형태의 효소, 아데노신 디아미나아제 활성을 가진 미생물균체, 유전자 조작에 의해 아데노신 디아미나아제 활성을 가진 미생물균체 또는 상기 미생물 균체의 처리물로 이루어진 그룹에서 선택되어질 수 있다.

아데노신 디아미나아제(EC 3.5.4.4)는 3'-아미노-2',3'-디데옥시리보실2,6-디아미노퓨린을 탈아민화하여 3'-아미노-2',3'-디데옥시구아노신를 만들 수 있으면 어떠한 종류 및 기원의 것이어도 상관없다. 효소는 분리 정제된 형태의 효소를 사용할 수도 있으며, 미생물균체 또는 미생물 균체처리물을 이용할 수 있다. 본 발명에서 아데노신 디아미나아제 활성을 갖는 미생물는 아데노신 디아미나아제를 발현하고 있는 미생물이면 특별히 한정되지 않는다. 최근의 분자 생물학 및 유전자 공학의 진보에 의해 상술한 미생물주의 아데노신 디아미나아제의 분자 생물학적인 성질 또는 아미노산 서열 등을 해석함으로써 상기 단백질의 유전자를 상기 미생물주로부터 취득하여 상기 유전자 및 발현에 필요한 제어 영역이 삽입된 재조합 플라스미드를 구축하고, 이것을 임의의 숙주에 도입하여 상기 단백질을 발현시킨 유전자 재조합균을 만들어 내는 것이 가능해지고, 또한 비교적 용이해지기도 하였다. 이러한 기술 수준에 비추어 이러한 아데노신 디아미나아제 유전자를 임의의 숙주에 도입한 유전자 재조합균도 본 발명의 아데노신 디아미나아제를 발현하고 있는 미생물에 포함되는 것으로 한다.

이하에 실시예 및 참고예를 들어 본 발명을 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예들에 의해 전혀 제한되지 않는다.

[참고예]

[3'-아미노-3'-데옥시티미딘의 제조]

4Kg의 3'-아지도티미딘을 6L 아세토니트릴과 함께 교반하며 4.7Kg의 트리페닐포스핀을 가한 후 실온에서 3시간 교반한 다음 4L의 증류수를 가하고 실온에서 4시간 교반 후 감압 하에서 농축한 다음 12L의 메탄올을 가하여 실온에서 8시간 교반 후 여과하여 결정을 모아 건조하여 2.7Kg의 3'-아미노-3'-데옥시티미딘을 수득하였다.

[E. coli 우리딘 포스포릴라아제 발현 균주 제조]

당전이(transglycosylation)에 사용할 대장균 유래 우리딘 포스포릴라아제(uridine phosphoryolase)를 과발현하는 유전자 재조합 대장균은 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

Eschericha coli(E.coli) JM109 균주(Promega inc.)를 50ml LB배지에 접종하고, 37^oC에서 하룻밤 배양한 후 원심분리 하여 세포를 수확하였다. 수확한 대장균으로부터 DNeasy Tissue Kit(Qiagen Inc.)을 이용하여 게놈 DNA를 분리하고 이를 PCR 주형으로 이용하였다.

PCR용 프라이머는 E.coli 기지의 udp 유전자의 염기서열(Genebank Accession 번호 제 X15689 호, 코딩영역 염기번호 163에서 924)에 의거하여 설계한 하기의 서열번호 1 및 2의 올리고 뉴클레오티드를 위탁제조사인 바이오닉스로사에서 제조하여 사용하였다.

서열번호 1 : 5'-CATATGTCCAAGTCTGATGTTTTTCATCTCGGC-3'

서열번호 2 : 5'-AAGCTTTTACAGCAGACGACGCGCCGCTTCCACC-3'

상기 대장균 게놈 DNA를 주형으로 하여, 200 μM의 dNTP, 20 pmol의 프라이머, 1× Taq DNA 중합효소 완충액 및 2.5 U의 Taq DNA 중합효소가 존재하는 조건에서, 94 ℃에서 1분, 55 ℃에서 1분, 72 ℃에서 2분의 조건을 30회 반복하여 반응시켰다. 그 결과 증폭된 775 bp의 PCR 산물을 아가로스 젤 전기영동법(agarose gel electorphoresis)으로 확인하고, 이를 젤 추출 키트(gel extraction kit, Qiagen 사)를 이용하여 정제하였다. pGEM-T easy vector system I (Promega Inc.)을 이용하여 정제한 DNA 절편을 pGEM-T easy vector에 라이게이션한 후 JM109 대장균 세포를 형질전환시켜 얻은 대장균 집락 중, 원하는 플라스미드를 함유하는 클론을 선별하여 이를 pGEM-EUDP로 명명하였다.

이어 당사에서 제조한 대장균용 발현 벡터 pFRPT(대한민국 특허 제 0449639호)에 E.coli 우리딘 포스포릴라아제(EUDP) 유전자를 삽입하기 위해, 10 ㎍의 pFRPT를 10 U의 NdeI과 10 U의 HindIII가 함유된 반응액 20㎕에서 절단하고 절단된 플라스미드를 아가로즈 젤 전기영동법으로 분석하여, 6.5 kbp의 절편을 젤 추출 키트를 이용하여 정제하였다. 한편, pGEM-EUDP 10 ㎍을 10 U의 NdeI과 10 U의 HindIII가 함유된 반응액 20㎕에서 절단하고 상기와 같이 아가로스 전기영동법으로 분석하여 775bp의 EUDP DNA 절편을 젤 추출 키트를 이용하여 정제하였다. 상기 방법을 통해 얻은 두 DNA 절편을 3 U의 리가아제와 1X 리가아제 완충액이 함유된 반응액에 첨가하여 16 ℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 상기 반응액으로 JM109 대장균 세포를 형질전환시킨 후 이를 배양하여 얻은 대장균 집락으로부터 플라스미드를 추출하고, 목적의 DNA 절편이 삽입된 플라스미드를 pFRPT-EUDP라 명명하고 이와 같이 해서 얻어진 형질전환 균주를 pFRPT-EUDP/JM109라 명명하였다.

[E. coli 아데노신 디아미나아제 발현 균주 제조]

탈아미노화(deamination) 반응에 사용할 대장균 유래 아데노신 디아미나아제를 과발현하는 유전자 재조합 대장균은 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

E.coli 기지의 유전자의 염기서열(Genebank Accession 번호 제 M59033 호, 코딩영역은 염기번호 109 에서 1107)에 의거하여 설계한 PCR용 프라이머는 하기의 서열번호 3 및 4와 같고 이는 올리고 뉴클레오시드를 위탁제조사인 바이오닉스로사에서 제조하여 사용하였다.

서열번호 3 : 5'-ACGGATCCATGATTGATACCACCCTGCCAT-3'

서열번호 4 : 5'-GGGGTACCTTACTTCGCGGCGACTTTTTCT-3'

전술한 바대로 제조한 대장균 게놈 DNA를 주형으로 하여, 200 μM의 dNTP, 20 pmol의 프라이머, 1× vent DNA 중합효소 완충액 및 2.5 U의 Vent DNA 중합효소가 존재하는 조건에서, 94 ℃에서 30초, 55 ℃에서 1분, 72 ℃에서 1분의 조건을 30회 반복하여 반응시켰다. 그 결과 증폭된 1kbp의 PCR 산물을 아가로스 젤 전기영동법(agarose gel electorphoresis)으로 확인하고, 이를 젤 추출 키트(gel extraction kit, Qiagen 사)를 이용하여 정제하였다. 정제한 DNA 절편을 BamHI과 KpnI으로 절단하고 이를 BamHI과 KpnI으로 절단된 플라스미드 발현 벡터 pQE31(Qiagen Inc.)에 라이게이션 하고 JM109 대장균 세포를 형질전환시킨 후, 목적의 DNA 절편이 삽입된 플라스미드를 pQE31-EADD라 명명하였다.

이어 당사에서 제조한 대장균용 발현 벡터 pFRPT(대한민국 특허 제 0449639호)에 E.coli 아데노신 디아미나아제(EADD) 유전자를 삽입하기 위해, 10 ㎍의 pFRPT를 10 U의 Bgl II와 10 U의 KpnI이 함유된 반응액 20㎕에서 절단하고 절단된 플라스미드를 아가로즈 젤 전기영동법으로 분석하여, 6.45 kbp의 절편을 젤 추출 키트를 이용하여 정제하였다. 한편, pQE31-EADD 10 ㎍을 10 U의 BamHI과 10 U의 KpnI 함유된 반응액 20㎕에서 절단하고 상기와 같이 아가로스 전기영동법으로 분석하여 999bp의 EADD DNA 절편을 젤 추출 키트를 이용하여 정제하였다. 상기 방법을 통해 얻은 두 DNA 절편을 3 U의 리가아제와 1X 리가아제 완충액이 함유된 반응액에 첨가하여 16 ℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 상기 반응액으로 JM109 대장균 세포를 형질전환시킨 후 이를 배양하여 얻은 대장균 집락으로부터 플라스미드를 추출하고, 목적의 DNA 절편이 삽입된 플라스미드를 pFRPT-EADD라 명명하고 이와 같이 해서 얻어진 형질전환 균주를 pFRPT-EADD/JM109라 명명하였다.

[Lactococcus lactis subsp. Lactis 아데노신 디아미나아제 유전자 발현 균주 제조]

탈아미노화 반응에 사용할 락토코코스(Lactococcus)유래 아데노신 디아미나아제(LADD)를 과발현하는 유전자 재조합 대장균은 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

Lactococcus lactis subsp. Lactis 균주 (한국종균협회로부터 분양 받아 사용, KCCM 40104)를 50ml TSB배지에 접종하고, 30 ^oC에서 하룻밤 배양한 후 원심분리 하여 세포를 수확하였다. 수확한 균으로부터 DNeasy Tissue kit(Qiagen Inc.)을 이용하여 게놈 DNA를 분리하고 이를 PCR 주형으로 이용하였다.

PCR용 프라이머는 Lactococcus lactis subsp. Lactis 기지의 아데노신 디아미나아제 유전자의 염기서열(Genebank Accession 번호 제 NC_002662 호, 코딩영역은 염기번호 287447에서 288505)에 의거하여 설계한 하기의 서열번호 5 및 6의 올리고 뉴클레오시드를 위탁제조사인 바이오닉스로사에서 제조하여 사용하였다.

서열번호 5 : 5'-GGATCCAATGAAAAGAAAAGGGAGAAACTC-3'

서열번호 6 : 5'-AAGCTTCTCTGATTATTCAGAGATTTTTTTG-3'

상기의 Lactococcus lactis subsp. Lactis 게놈 DNA를 주형으로 하여, 200 μM의 dNTP, 30 pmol의 프라이머, 1× Taq DNA 중합효소 완충액 및 2.5 U의 Taq DNA 중합효소가 존재하는 조건에서, 94 ℃에서 1분, 50 ℃에서 1분, 72 ℃에서 1분 30초의 조건을 30회 반복하여 반응시켰다. 그 결과 증폭된 1078bp의 PCR 산물을 아가로스 젤 전기영동법(agarose gel electorphoresis)으로 확인하고, 이를 젤 추출 키트(gel extraction kit, Qiagen 사)를 이용하여 정제하였다. pGEM-T easy vector system I (Promega Inc.)을 이용하여 정제한 DNA 절편을 pGEM-T easy vector에 라이게이션 후 JM109 대장균 세포를 형질전환시켜 얻은 대장균 집락 중, 원하는 플라스미드를 함유하는 클론을 선별하여 이를 pGEM-LADD로 명명하였다.

효소 단백질의 과발현을 위해 pGEM-LADD를 BamHI과 Hind III로 절단하고 이를 BamHI과 Hind III로 절단된 플라스미드 발현 벡터 pQE31(Qiagen Inc.)에 라이게이션 하고 JM109 대장균 세포를 형질전환시킨 후, 목적의 DNA 절편이 삽입된 플라스미드를 pQE31-LADD라 명명하고 이와 같이 해서 얻어진 형질전환 균주를 pQE31-LADD/JM109라 명명하였다.

[E. coli 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 발현 균주 제조]

당전이(transglycosylation) 반응에 사용할 대장균 유래 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 과발현하는 유전자 재조합 대장균은 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

E.coli 기지의 유전자의 염기서열(Genebank Accession 번호 제 M60917 호, 코딩영역은 염기번호 123 에서 842)에 의거하여 설계한 PCR용 프라이머는 하기의 서열번호 7 및 8과 같고 이는 올리고 뉴클레오시드를 위탁제조사인 바이오닉스로사에서 제조하여 사용하였다.

서열번호 7 : 5'-GGATCCCATGGCTACCCCACACATTAATGCA-3'

서열번호 8 : 5'-AAGCTTTTACTCTTTATCGCCCAGCAGAAC-3'

전술한 바대로 제조한 대장균 게놈 DNA를 주형으로 하여, 200 μM의 dNTP, 20 pmol의 프라이머, 1× Taq DNA 중합효소 완충액 및 2.5 U의 Taq DNA 중합효소가 존재하는 조건에서, 94 ℃에서 30초, 50 ℃에서 1분, 72 ℃에서 1분의 조건을 30회 반복하여 반응시켰다. 그 결과 증폭된 720bp의 PCR 산물을 아가로스 젤 전기영동법(agarose gel electorphoresis)으로 확인하고, 이를 젤 추출 키트(gel extraction kit, Qiagen 사)를 이용하여 정제하였다. pGEM-T easy vector system I (Promega Inc.)을 이용하여 정제한 DNA 절편을 pGEM-T easy vector에 라이게이션 후 JM109 대장균 세포를 형질전환시켜 얻은 대장균 집락 중, 원하는 플라스미드를 함유하는 클론을 선별하여 이를 pGEM-EPUNP로 명명하였다

이어 당사에서 제조한 대장균용 발현 벡터 pFRPT(대한민국 특허 제 0449639호)에 E.coli 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제(EPUNP) 유전자를 삽입하기 위해, 10 ㎍의 pFRPT를 10 U의 BglII와 10 U의 HindIII이 함유된 반응액 20㎕에서 절단하고 절단된 플라스미드를 아가로즈 젤 전기영동법으로 분석하여, 6.45 kbp의 절편을 젤 추출 키트를 이용하여 정제하였다. 한편, pGEM-EPUNP 10 ㎍을 10 U의 BamHI과 10 U의 Hind III가 함유된 반응액 20㎕에서 절단하고 상기와 같이 아가로스 전기영동법으로 분석하여 720bp의 EPUNP DNA 절편을 젤 추출 키트를 이용하여 정제하였다. 상기 방법을 통해 얻은 두 DNA 절편을 3 U의 리가아제와 1X 리가아제 완충액이 함유된 반응액에 첨가하여 16 ℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 상기 반응액으로 JM109 대장균 세포를 형질전환시킨 후 이를 배양하여 얻은 대장균 집락으로부터 플라스미드를 추출하고, 목적의 DNA 절편이 삽입된 플라스미드를 pFRPT-EPUNP라 명명하고 이와 같이 해서 얻어진 형질전환 균주를 pFRPT-EPUNP/JM109라 명명하였다.

[E. coli 티미딘 포스포릴라아제 발현 균주 제조]

당전이(transglycosylation) 반응에 사용할 대장균 유래 티미딘 포스포릴라아제(thymidine phosphorylase)를 과발현하는 유전자 재조합 대장균은 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

E.coli 기지의 유전자의 염기서열(Genebank Accession 번호 제 U14003 호, 코딩영역은 염기번호 1 에서 1323)에 의거하여 설계한 PCR용 프라이머는 하기의 서열번호 9 및 10과 같고 이는 올리고 뉴클레오시드를 위탁제조사인 바이오닉스로사에서 제조하여 사용하였다.

서열번호 9 : 5'- CCATGGTTGTTTCTCGCACAAGAACT-3'

서열번호 10 : 5'-GATATCTTATTCGCTGATACGGCGATAG -3'

전술한 바대로 제조한 대장균 게놈 DNA를 주형으로 하여, 200 μM의 dNTP, 20 pmol의 프라이머, 1× Taq DNA 중합효소 완충액 및 2.5 U의 Taq DNA 중합효소가 존재하는 조건에서, 94 ℃에서 1분 , 55 ℃에서 1분, 72 ℃에서 2분의 조건을 30회 반복하여 반응시켰다. 그 결과 증폭된 1.3kbp의 PCR 산물을 아가로스 젤 전기영동법(agarose gel electorphoresis)으로 확인하고, 이를 젤 추출 키트(gel extraction kit, Qiagen 사)를 이용하여 정제하였다. pGEM-T easy vector system I (Promega Inc.)을 이용하여 정제한 DNA 절편을 pGEM-T easy vector에 라이게이션한 후 JM109 대장균 세포를 형질전환시켜 얻은 대장균 집락 중, 원하는 플라스미드를 함유하는 클론을 선별하여 이를 pGEM-TMDP로 명명하였다

이어 당사에서 제조한 대장균용 발현 벡터 pFRPT(대한민국 특허 제 0449639호)에 E.coli 티미딘 포스포릴라아제(TMDP) 유전자를 삽입하기 위해, 10 ㎍의 pFRPT를 10 U의 NcoI과 10 U의 EcoRV가 함유된 반응액 20㎕에서 절단하고 절단된 플라스미드를 아가로즈 젤 전기영동법으로 분석하여, 6.45 kbp의 절편을 젤 추출 키트를 이용하여 정제하였다. 한편, pGEM-TMDP 10 ㎍을 10 U의 10 U의 NcoI과 10 U의 EcoRV가 함유된 반응액 20㎕에서 부분 절단(partial digestion)하고 상기와 같이 아가로스 전기영동법으로 분석하여 1.3kbp의 TMDP DNA 절편을 젤 추출 키트를 이용하여 정제하였다. 상기 방법을 통해 얻은 두 DNA 절편을 3 U의 리가아제와 1X 리가아제 완충액이 함유된 반응액에 첨가하여 16 ℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 상기 반응액으로 JM109 대장균 세포를 형질전환시킨 후 이를 배양하여 얻은 대장균 집락으로부터 플라스미드를 추출하고, 목적의 DNA 절편이 삽입된 플라스미드를 pFRPT-TMDP라 명명하고 이와 같이 해서 얻어진 형질전환 균주를 pFRPT-TMDP/JM109라 명명하였다.

실시예1) E.coli pFRPT-EUDP/JM109 습균체 제조

면전을 장착한 250ml 엘렌마이어 플라스크에 30μg/ml의 카나마이신이 함유된 이스트 엑기스(Difco사 제) 0.5%, 비프 엑기스(Difco사 제)0.7%, 펩톤(Difco사 제)1.0%, 식염 0.3%를 포함하는 살균된 배지 25ml에 E.coli pFRPT-EUDP/JM109를 1백금이 접종하고 37 ℃ 에서 240rpm으로 하룻밤 동안 진탕 배양한 배양액 2ml를 1L 엘렌마이어 플라스크에 담긴 상기와 동일한 배지 200ml에 무균적으로 접종 후 37 ℃에서 240rpm으로 진탕 배양하였다. 흡광도가 0.8이 되었을 때, 1mM의 농도가 되게 IPTG를 첨가하였다. 3시간 동안 추가로 진탕 배양하여 얻어진 배양액을 8000rpm에서 10분간 원심분리하고 이를 20ml의 10mM 인산 완충액으로 세척하여 E.coli 유래의 우리딘 포스포릴라아제(uridine phosphorylase)의 효소원으로 사용하였다.

실시예2) E.coli pFRPT-EADD/JM109 습균체 제조

면전으로 장착한 250ml 엘렌마이어 플라스크에 30μg/ml의 카나마이신이 함유된 이스트 엑기스(Difco사 제) 0.5%, 비프 엑기스(Difco사 제)0.7%, 펩톤(Difco사 제)1.0%, 식염 0.3%를 포함하는 살균된 배지 25ml에 E.coli pFRPT-EADD/JM109를 1백금이 접종하고 37 ℃ 에서 240rpm으로 하룻밤 동안 진탕 배양한 배양액 2ml를 1L 엘렌마이어 플라스크에 담긴 상기와 동일한 배지 200ml에 무균적으로 접종 후 37 ℃에서 240rpm으로 진탕 배양하였다. 흡광도가 0.8이 되었을 때, 1mM의 농도가 되게 IPTG를 첨가하였다. 3시간 동안 추가로 진탕 배양하여 얻어진 배양액을 8000rpm에서 10분간 원심분리하고 이를 20ml의 10mM 인산 완충액으로 세척하여 E. coli 유래 아데노신 디아미나아제의 효소원으로 사용하였다.

실시예3) E. coli pQE31-LADD/JM109습균체 제조

면전으로 장착한 250ml 엘렌마이어 플라스크에 50μg/ml의 앰피실린이 함유된 이스트 엑기스(Difco사 제) 0.5%, 비프 엑기스(Difco사 제)0.7%, 펩톤(Difco사 제)1.0%, 식염 0.3%를 포함하는 살균된 배지 25ml에 E.coli pQE31-LADD/JM109를 1백금이 접종하고 37 ℃ 에서 240rpm으로 하룻밤 동안 진탕 배양한 배양액 2ml를1L 엘렌마이어 플라스크에 담긴 상기와 동일한 배지 200ml에 무균적으로 접종 후 37 ℃에서 240rpm으로 진탕 배양하였다. 흡광도가 0.8이 되었을 때, 1mM의 농도가 되게 IPTG를 첨가하였다. 3시간 동안 추가로 진탕 배양하여 얻어진 배양액을 8000rpm에서 10분간 원심분리하고 이를 20ml의 10mM 인산 완충액으로 세척하여 Lactococcus 유래 아데노신 디아미나아제의 효소원으로 사용하였다.

실시예4) E.coli pFRPT-EPUNP/JM109 습균체 제조

면전으로 장착한 250ml 엘렌마이어 플라스크에 30μg/ml의 카나마이신이 함유된 이스트 엑기스(Difco사 제) 0.5%, 비프 엑기스(Difco사 제)0.7%, 펩톤(Difco사 제)1.0%, 식염 0.3%를 포함하는 살균된 배지 25ml에 E.coli pFRPT-EPUNP/JM109를 1백금이 접종하고 37 ℃ 에서 240rpm으로 하룻밤 동안 진탕 배양한 배양액 2ml를 1L 엘렌마이어 플라스크에 담긴 상기와 동일한 배지 200ml에 무균적으로 접종 후 37 ℃에서 240rpm으로 진탕 배양하였다. 흡광도가 0.8이 되었을 때, 1mM의 농도가 되게 IPTG를 첨가하였다. 3시간 동안 추가로 진탕 배양하여 얻어진 배양액을 8000rpm에서 10분간 원심분리하고 이를 20ml의 10mM 인산 완충액으로 세척하여 E.coli 유래 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제의 효소원으로 사용하였다.

실시예5) E.coli pFRPT-TMDP/JM109 습균체 제조

면전으로 장착한 250ml 엘렌마이어 플라스크에 30μg/ml의 카나마이신이 함유된 이스트 엑기스(Difco사 제) 0.5%, 비프 엑기스(Difco사 제)0.7%, 펩톤(Difco사 제)1.0%, 식염 0.3%를 포함하는 살균된 배지 25ml에 E.coli pFRPT-TMDP/JM109를 1백금이 접종하고 37 ℃ 에서 240rpm으로 하룻밤 동안 진탕 배양한 배양액 2ml를 1L 엘렌마이어 플라스크에 담긴 상기와 동일한 배지 200ml에 무균적으로 접종 후 37 ℃에서 240rpm으로 진탕 배양하였다. 흡광도가 0.8이 되었을 때, 1mM의 농도가 되게 IPTG를 첨가하였다. 3시간 동안 추가로 진탕 배양하여 얻어진 배양액을 8000rpm에서 10분간 원심분리하고 이를 20ml의 10mM 인산 완충액으로 세척하여 E. coli 유래 티미딘 포스포릴라아제의 효소원으로 사용하였다.

실시예 6)

0.15g의 2,6-디아미노퓨린(DAP), 0.22g의 3'-아미노-3'-데옥시티미딘(ATMD), 3ml 증류수 및 0.5ml 1N-인산나트륨 완충액(pH 7.5)을 함유하는 기질용액에 0.2g E.coli pFRPT-EPUNP/JM109 습균체 0.2g의 E.coli pFRPT-EUDP/JM109 습균체를 혼합 후 50℃ 진탕교반 조건 하에서 2일간 반응하였다. 반응액을 HPLC로 분석한 결과 이때 3'-아미노-2',3'-디데옥시리보실 2,6-디아미노퓨린(ADDAP)의 생성률은 50.45% 이었다.

반응 후의 분석은 고속액체크로마토그래피 컬럼 ; 이너실 ODS-3(5마이크로메타, 직경 4.6미리미터, 길이 150 미리미터, 지엘사이언스사제), 이동상 ; 4% 메탄올함유 10mM 인산나트륨 완충액(pH8.0), 검출 ; 자외선 254nm 흡광을 사용하여 측정하였다.

실시예 7)

0.15g의 2,6-디아미노퓨린(DAP), 0.22g의 3'-아미노-3'-데옥시티미딘(ATMD), 3ml 증류수 및 0.5ml 1N-인산나트륨 완충액(pH 7.5)을 함유하는 기질용액에 0.2g E.coli pFRPT-EPUNP/JM109 습균체 0.2g의 E.coli pFRPT-TMDP/JM109 습균체를 혼합 후 50℃ 진탕교반 조건하에서 2일간 반응하였다. 반응액을 HPLC로 분석한 결과 이때 3'-아미노-2',3'-디데옥시리보실 2,6-디아미노퓨린의 생성률은 77.18% 이었다.

실시예 8)

7.5g의 2,6-디아미노퓨린(DAP), 18.1g의 3'-아미노-3'-데옥시티미딘(ATMD), 30ml 증류수 및 3g 인산이수소나트륨을 함유하는 기질용액에 5g E.coli pFRPT-EPUNP/JM109 습균체, 5g의 E.coli pFRPT-TMDP/JM109 습균체를 혼합 후 50℃ 진탕교반 조건 하에서 40시간 반응하였다. 반응액을 HPLC로 분석한 결과 이때 3'-아미노-2',3'-디데옥시리보실 2,6-디아미노퓨린의 생성률은 96.28% 이었다.

실시예 9)

실시예8)의 반응액에 3.5g 가성소다를 넣어 용해 후 원심분리한 다음 상등액을 1/2로 분할하여 초산으로 중성화한 다음 E.coli pFRPT-EADD/JM109 습균체 3g을 넣고 40℃에서 pH7.5를 유지하며 29시간 교반하였다. 이때 반응율은 88.5% 이었다.

반응율은 다음과 같이 계산하였다.

(반응종료 시 3'-아미노-2',3'-디데옥시 구아노신 몰수 ÷ 반응 시작 시 3'-아미노-2',3'-디데옥시리보실 2,6-디아미노퓨린 몰수) Х 100

실시예 10)

실시예8)의 반응액에 3.5g 가성소다를 넣어 용해 후 원심분리 후 상등액을 1/2로 분할 후 초산으로 중성화한 다음 E. coli pQE31-LADD/JM109습균체 3g을 넣고 40℃에서 pH7.5를 유지하며 29시간 교반 하였다. 이때 반응율은 98.97% 이었다.

실시예 11)

1mmole 3'-아미노-3'-데옥시티미딘(ATMD), 1mmole 염기공여체 및 5ml의 0.1M-인산나트륨완충액을 함유하는 기질용액(pH 7.5)에 0.3g의 E.coli pFRPT-EPUNP/JM109 습균체, 0.3g 의 E.coli pFRPT-TMDP/JM109 습균체를 혼합 후 50℃ 교반 조건 하에서 42시간 반응 하였다.

뉴클레오시드의 생성율은 아래식에 의하여 구하였다.

그 결과는 표와 같다

염기공여체	생성물	생성율(%)
구아닌	3'-아미노-2',3'-디데옥시 구아노신	비검출
구아노신	3'-아미노-2',3'-디데옥시 구아노신	5.3%
2,6-디아미노퓨린	3'-아미노-2',3'-디데옥시리보실 2,6-디아미노퓨린	73.7%

실시예 12 )

252g의 2,6-디아미노퓨린(DAP), 362g의 3'-아미노-3'-데옥시티미딘(ATMD) 및 90g인산이수소나트륨을 함유하는 기질용액(pH 7.5) 3L에 150g E.coli pFRPT-EPUNP/JM109 습균체, 150g 의 E.coli pFRPT-TMDP/JM109 습균체를 혼합 후 5L 발효기(BIOFLO 3000, NBS사 제)에서 100rpm으로 교반하며 50℃에서 36시간 반응 하였다. 이때 3'-아미노-2',3'-디데옥시리보실 2,6-디아미노퓨린(ADDAP)의 생성율은 79% 이었다.

반응액에 90g의 가성소다를 넣어 용해 후 원심분리하여 상등액을 모은 후 침전물을 1L의 증류수를 사용하여 세척하고 상등액과 세척액을 합한 용액에 85g의 초산을 혼합 후 100g E. coli pQE31-LADD/JM109습균체를 넣은 후 40℃에서 초산을 사용하여 수소이온 농도를 7.5를 유지하며 5시간 반응을 하였다.

350 ml 10N-가성소다를 가하여 실온에서 3시간 교반 후 원심분리하여 상등액을 모은 후 침전물을 0.5L의 정제수로 세척한 다음 상등액과 세척액을 합한 용액을 염산으로 중성화한 후 얼음 냉각하여 3시간 교반 후 원심분리하여 조3'-아미노-2',3'-디데옥시 구아노신 을 모은 후 다시 0.5L 증류수를 가하여 교반 한 다음 원심분리하여 침전물을 모은 후 건조하여 3'-아미노-2',3'-디데옥시 구아노신(ADG) 268g을 수득하였다.

3'-아미노-2',3'-디데옥시 구아노신(ADG)를 제조함에 있어서, 3'-아미노-3'-데옥시티미딘(ATMD) 및 2,6-디아미노퓨린(DAP)를 뉴클레오시드 포스포릴라아제로 당전이시켜서 3'-아미노-2',3'-디데옥시리보실 2,6-디아미노퓨린(ADDAP)를 제조하고, 아데노신 디아미나아제를 이용하여 효소적으로 상기 3'-아미노-2',3'-디데옥시리보실 2,6-디아미노퓨린(ADDAP)를 아미노-2',3'-디데옥시 구아노신(ADG)로 제조하는 방법은, 기존의 수율이 떨어지는 화학적인 제조방법이나 3'-아미노-3'-데옥시티미딘과 구아닌에 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 처리하여 3'-아미노-2',3'-디데옥시 구아노신를 직접 제조하는 케모엔지마틱 방법에 비하여 높은 수율로로 3'-아미노-2',3'-디데옥시 구아노신를 제조할 수 있다.

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Claims

3'-아미노-3'-데옥시티미딘 및 2,6-디아미노퓨린을 뉴클레오시드 포스포릴라아제로 당전이시켜 3'-아미노-2',3'-디데옥시리보실 2,6-디아미노퓨린을 제조하고, 상기 3'-아미노-2',3'-디데옥시리보실 2,6-디아미노퓨린을 아데노신 디아미나아제를 이용하여 효소적으로 전환시켜 3'-아미노-2',3'-디데옥시 구아노신을 제조하는 것을 특징으로 하는 하기 화학식 1의 3'-아미노-2',3'-디데옥시 구아노신의 제조 방법.

화학식 1
제 1 항에 있어서, 상기 뉴클레오시드 포스포릴라아제는 분리 정제된 형태의 효소, 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성을 가진 미생물균체, 유전자 조작에 의해 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성을 가지는 미생물균체 또는 상기 미생물 균체의 처리물로 이루어진 그룹에서 선택되어지는 것을 특징으로 하는 3'-아미노-2',3'-디데옥시 구아노신의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 아데노신 디아미나아제는 분리 정제된 형태의 효소, 아데노신 디아미나아제 활성을 가진 미생물균체, 유전자 조작에 의해 아데노신 디아미나아제 활성을 가진 미생물균체 또는 상기 미생물 균체의 처리물로 이루어진 그룹에서 선택되어지는 것을 특징으로 하는 3'-아미노-2',3'-디데옥시 구아노신의 제조방법.