JP3822006B2 - シチジン５’−ジリン酸コリンの製造法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、シチジン５’−ジリン酸コリン（ＣＤＰ−コリン）の効率的な製造法およびそれに使用する酵素タンパク質をコードするＤＮＡ断片に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＣＤＰ−コリンは医薬品として頭部外傷、脳手術に伴う意識障害、脳卒中などの改善治療に用いられている有用な化合物である。
ＣＤＰ−コリンの製造方法としては、化学合成法、酵母などの微生物を用いる方法などが古くから知られている。しかし、これらいずれの方法もシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）１モルに対するＣＤＰ−コリンの合成収率は低く、低コストでＣＤＰ−コリンを製造できる効率的な方法とはいえなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
最近、丸山らはオロット酸より酵素処理によりＣＤＰ−コリンを製造する方法を開発した（特開平５−２７６９７４）。しかしながら、該方法ではオロット酸からウリジン５’−トリリン酸（ＵＴＰ）を製造するための微生物を培養する工程とＵＴＰからのＣＤＰ−コリンの合成に関与する３種類の酵素〔ＣＴＰシンセターゼ、コリンホスフェートシチジルトランスフェラーぜ（ＣＣＴ）およびコリンキナーゼ（ＣＫＩ）〕を生産する組換え大腸菌を培養する工程があり、微生物培養の手間と培養設備の観点から必ずしも簡便な方法とは言えない。また、オロット酸１モルに対するＣＤＰ−コリンの合成収率も必ずしも高くなく、満足し得る方法ではない。
【０００４】
また、山下らはＣＣＴ遺伝子を含む組換えＤＮＡで形質転換された酵母菌体を用い、ＣＭＰとホスホコリンからＣＭＰ１モルに対し９０％前後の合成収率でＣＤＰ−コリンを製造する方法を開発した（特許第２７２４８２５号）。該方法は、セルフクローニングによりＣＤＰ−コリンの合成に関与するＣＣＴの生産を増強した酵母を用いることで、高収率でＣＤＰ−コリンを合成できるものの、用いる組換え酵母菌体はＣＭＰからのＣＤＰ−コリン合成に関与する一連の酵素の供給を担うこととなり、しかもＣＣＴ以外のＣＤＰ−コリン合成関連酵素の生産性は必ずしも高くないため、合成反応には多量の酵母菌体を使用する必要があった。このため、組換え酵母の培養量が膨大となり、結果的には必ずしも実用的な方法とは言えず、実際には実施されるに至っていない。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、酵母菌体がヌクレオシド５’−モノリン酸を効率的にヌクレオシド５’−トリリン酸に転換する活性を有することに着目し、ＣＭＰからのＣＤＰ−コリンの効率的な合成法を確立すべく、ＣＭＰとコリン（あるいはホスホリルコリン）を基質とする酵母添加反応液に酵母由来のＣＣＴ及びＣＫＩを生産する組換え大腸菌、その処理物あるいは酵素抽出液を添加して反応することで、またはＣＭＰとホスホコリンを基質とする酵母添加反応液にＣＣＴを生産する組換え大腸菌、その処理物あるいは酵素抽出液を添加して反応することでＣＤＰ−コリンが合成できるかどうか検討した結果、コリンを用いた場合には意外なことに目的とするＣＤＰ−コリンはまったく合成されないか、合成されても極くわずかな量しか生成されないこと、およびホスホコリンを用いた場合であっても満足しうる量のＣＤＰ−コリンを合成することができないことを確認した。
【０００６】
この原因を究明する過程において、ＣＤＰ−コリンの低収率は、酵母由来のＣＣＴ並びにＣＫＩは大腸菌において安定に高生産されないことに起因していることを突き止めた。
そこで本発明者らは、大腸菌における当該酵素の発現経過を検討した結果、完全には解明されなかったものの、発現後のＣＣＴおよびＣＫＩを不安定化する要因の１つにプロテアーゼによる加水分解が関与しているものと推測された。そこで、使用する酵素にプロテアーゼ抵抗性を付与し、安定に高発現させるための方策に関し種々検討を重ねた結果、Ｎ末端またはＣ末端のアミノ酸を複数個欠失させて得られるタンパク質は目的とする酵素活性を維持し、発現量が増大するとともに、プロテアーゼに対しても抵抗性を示し、大腸菌においても安定に高生産される系を構築できることを見いだし、このような高生産系で得られた酵素タンパク質を使用することで効率的にＣＤＰ−コリンを合成することを確認し、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）に記載のいずれかのＤＮＡ断片の塩基配列によりコードされるコリンホスフェートシチジルトランシフェラーゼ（ＣＣＴ）活性を有する酵素タンパク質、および（ｄ）〜（ｆ）に記載のいずれかのＤＮＡ断片の塩基配列によりコードされるコリンキナーゼ（ＣＫＩ）活性を有する酵素タンパク質の２種類の酵素タンパク質の存在下、酵母菌体、シチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）及びコリンを反応させてシチジン５’−ジリン酸コリン（ＣＤＰ-コリン）を製造することを特徴とする、ＣＤＰ-コリンの製造法に関するものである。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｂ）配列番号１で示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｃ）上記（ａ）に記載のＤＮＡ断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片、
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｅ）配列番号２で示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｆ）上記（ｄ）に記載のＤＮＡ断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片
【０００８】
また、本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）に記載のいずれかのＤＮＡ断片の塩基配列によりコードされるＣＣＴ活性を有する酵素タンパク質の存在下、酵母菌体、ＣＭＰ及びホスホリルコリンを反応させてＣＤＰ-コリンを製造することを特徴とする、ＣＤＰ-コリンの製造法に関するものである。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｂ）配列番号１で示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｃ）上記（ａ）に記載のＤＮＡ断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片
【０００９】
さらに、本発明は、（１）配列番号１で示される塩基配列からなり、ＣＣＴ活性を有する酵素タンパク質をコードするＤＮＡ断片、（２）配列番号１で示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなり、ＣＣＴ活性を有する酵素タンパク質をコードするＤＮＡ断片、または（３）上記（１）のＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ＣＣＴ活性を有する酵素タンパク質をコードするＤＮＡ断片に関するものである。
【００１０】
さらにまた、本発明は、（１）配列番号２で示される塩基配列からなり、ＣＫＩ活性を有する酵素タンパク質をコードするＤＮＡ断片、（２）配列番号２で示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなり、ＣＫＩ活性を有する酵素タンパク質をコードするＤＮＡ断片、または（３）上記（１）のＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ＣＫＩ活性を有する酵素タンパク質をコードするＤＮＡ断片に関するものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
上述したように、本発明の特徴は、反応系に添加するＣＣＴとして、以下の（ａ）〜（ｃ）に記載のいずれかのＤＮＡ断片の塩基配列によりコードされるＣＣＴ活性を有する酵素タンパク質、および必要によりＣＫＩとして以下の（ｄ）〜（ｆ）に記載のいずれかのＤＮＡ断片の塩基配列によりコードされるＣＫＩ活性を有する酵素タンパク質を使用することにある。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｂ）配列番号１で示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｃ）上記（ａ）に記載のＤＮＡ断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片、
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｅ）配列番号２で示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｆ）上記（ｄ）に記載のＤＮＡ断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片
【００１２】
上記（ａ）記載のＤＮＡ断片は、酵母ＣＣＴをコードする遺伝子からＣ末端２２アミノ酸残基相当分を欠失させたＤＮＡ断片である。具体的には、図１に示す塩基配列中、塩基番号１〜１２０８番目で示される配列が酵母のＣＣＴ構造遺伝子に相当し、このＣＣＴ遺伝子からＣ末端２２アミノ酸残基相当分（６６塩基）を欠失させたものが配列番号１で示される塩基配列である。
上記（ａ）のＤＮＡ断片と同等の機能、すなわちＣＣＴ活性を維持し、プロテアーゼに対する抵抗性を示す限り、配列番号１で示される塩基配列において１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されたＤＮＡ断片、またはこれらのＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片も本発明で使用可能である。
【００１３】
また、上記（ｄ）記載のＤＮＡ断片は、酵母ＣＫＩをコードする遺伝子からＮ末端２９アミノ酸残基相当分を欠失させたＤＮＡ断片である。具体的には、図１に示す塩基配列中、塩基番号１２２３〜２８８１番目で示される配列がＣＫＩの構造遺伝子に相当し、このＣＫＩ遺伝子からＮ末端２９アミノ酸残基相当分（８７塩基）を欠失させたものが配列番号２で示される塩基配列である。
上記（ｄ）のＤＮＡ断片と同等の機能、すなわちＣＫＩ活性を維持し、プロテアーゼに対する抵抗性を示す限り、配列番号２で示される塩基配列において１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されたＤＮＡ断片、またはこれらのＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片も本発明で使用可能である。
なお、本発明でいうストリンジェントな条件下での反応とは、５ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣは塩化ナトリウム８．７６ｇ、クエン酸ナトリウム４．４１ｇを１リットルの水に溶解させたもの）、０．１％（ｗ／ｖ）Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．５％（ｗ／ｖ）ブロッキング試薬を含む溶液を用い、６０℃で２０時間程度のハイブリダイゼーション反応を行うことを意味する。
【００１４】
このような特定のＤＮＡ断片を使用するとき、酵素タンパク質の発現量を最大にすることができ、生産された後の安定性も向上することが本発明者らの実験で初めて確認された。
ＤＮＡ断片の調製は、既にクローン化され、その全塩基配列が決定されており、酵母のＣＣＴ遺伝子（Eur. J. Biochem., 169, 477-486, 1987）およびＣＫＩ遺伝子（J. Biol. Chem., 264, 2053-2059, 1989）を参考に公知の組換えＤＮＡ手法（例えば「Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition」Cold Spring Harbor Laboratory (1989)）をクローン化後、ヌクレアーゼ等の酵素を用いて消化させることにより容易に実施することができる。
また、調製したＤＮＡ断片を用い発現ベクターの調製、発現ベクターを用いたＣＣＴおよびＣＫＩ活性を有する酵素タンパク質の調製なども分子生物学の分野に属する技術者にとっては周知の技術であり、例えば（「Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition」Cold Spring Harbor Laboratory (1989)）に従って行うことができる。
【００１５】
すなわち、宿主微生物としては、ＣＣＴ活性またはＣＫＩ活性を有する酵素タンパク質が発現でき、ＣＤＰ−コリンの製造に適用できるものであればいずれも使用可能であり、培養及び酵素調製の簡便さから大腸菌が適当である。具体的には、組換えＤＮＡ実験に使用されるＫ１２株、Ｃ６００菌、ＪＭ１０５菌、ＪＭ１０９菌(Gene, 33, 103-119(1985))などが使用可能であり、特にプロテアーゼ欠損株が好ましい。また、発現用ベクターとしては大腸菌内で複製可能であれば特に限定されないが、ｐＢＲ３２２（Gene, 2, 95-113, 1977）あるいはｐＵＣ１８（Gene, 33, 103-119, 1985）など、あるいはそれら誘導体が使用できる。このようなベクターと上記ＤＮＡ断片を用いて、大腸菌の菌体中で自発現可能となるように発現制御シグナル（転写開始及び翻訳開始シグナル）をその上流に連結した組換え発現ベクターを作製する。
【００１６】
このような発現制御シグナルとしては、人為的制御が可能で、酵素タンパク質の発現量を飛躍的に上昇させるような強力な転写開始並びに翻訳開始シグナルを用いることが望ましい。具体的には、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター（Proc．Natl．Acad．Sci．USA.,80，21(1983）、Gene，20，231(1982））、ｔｒｃプロモーター(J．Biol．Chem．，260，3539(1985））などを例示することができる。
作製した組換えべクターを用いて大腸菌を形質転換する。大腸菌を形質転換する方法はすでに多くの方法が報告されており、たとえば、低温下、塩化カルシウム処理して菌体内にプラスミドを導入する方法（J．Mol．Biol．，53，159（1970））により大腸菌を形質転換することができる。
【００１７】
得られた形質転換体は当該形質転換体が増殖可能な培地中で増殖させ、さらにクローン化したＣＣＴ活性ならびにＣＫＩ活性を有する酵素タンパク質の発現を誘導して菌体内に当該酵素タンパク質が大量に蓄積するまで培養を行う。
培地としてはブイヨン培地、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストエキストラクト、１％食塩）または２×ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％イーストエキストラクト、０．５％食塩）などを使用することができる。また、ベクターとしてプラスミドを用いた場合には、培養中におけるプラスミドの脱落を防ぐために適当な抗生物質（プラスミドの薬剤耐性マーカーに応じ、アンピシリン、カナマイシンなど）の薬剤を適当量培養液に加えて培養する。
【００１８】
形質転換体の培養は、低温で培養することで上記酵素タンパク質を安定に生産させることができるので、当該培地に種菌を接種後、２０〜３０℃で、好ましくは２０〜２８℃で１０〜５０時間程度必要により通気撹拌しながら培養する。
また、酵素タンパク質の産生を誘導する必要がある場合には、用いたプロモーターで常用されている方法で該遺伝子の発現を誘導する。例えば、ｌａｃプロモーターやｔａｃプロモーターを使用した場合には、培養中期に発現誘導剤であるイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴＧと略称する）を適当量添加する。また、使用するプロモーターが構成的に転写活性を有する場合には、特に発現誘導剤を添加する必要はない。
【００１９】
反応液に添加する酵素タンパク質としては、上記の方法で得られる培養液から遠心分離、膜分離などの固液分離手段で回収した微生物の菌体を利用することも可能であるが、該微生物の処理物、該処理物から得られる酵素調製物を利用することもできる。
微生物の処理物としては、上記回収した微生物菌体を、機械的破壊（ワーリングブレンダー、フレンチプレス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、自己消化、乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処理（リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理（酸、アルカリ処理などによる）などの一般的な処理法に従って処理して得られる菌体処理物または菌体の細胞壁もしくは細胞膜の変性物を例示することができる。
酵素調製物としては、上記菌体処理物から当該酵素活性を有する画分を通常の酵素の精製手段（塩析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、透析処理、各種クロマトグラフィー処理など）を施して得られる粗酵素または精製酵素を例示することができる。
【００２０】
また、反応系に添加する酵母菌体としては、ＣＭＰをシチジン５’−トリリン酸（ＣＴＰ）に変換できる酵母であればよく、なかでも市販のパン酵母、あるいはワイン酵母を用いることで酵母菌体製造の過程が省略でき、極めて有利である。また、酵母乾燥菌体、酵母生菌体いずれの形態も利用可能である。酵母菌体の使用濃度としては、乾燥重量として１〜５％（ｗ／ｖ）の範囲から適宜設定することができる。
基質として使用するＣＭＰ、コリンまたはホスホリルコリンは市販品を使用することができる。各基質の使用濃度としては１〜２００ｍＭ、好ましくは５０〜１５０ｍＭの範囲から適宜設定できる。
【００２１】
ＣＤＰ−コリンの合成反応は、例えば水溶液、好ましくはリン酸緩衝液（ｐＨ６．０〜８．０）中、酵母菌体、ＣＭＰ、コリン（またはホスホリルコリン）を添加し、さらにＣＣＴ活性を有する酵素タンパク質、ＣＫＩ活性を有する酵素タンパク質（ホスホリルコリンを使用した場合には不要）をそれぞれ０．０１ユニット／ｍｌ以上、好ましくは０．０４〜１．０ユニット／ｍｌ添加し、５〜３０℃、好ましくは２０〜３０℃で１０〜７２時間程度、必要により撹拌しながら反応させることにより実施できる。
【００２２】
なお、上記酵素反応は、無機リン酸及びエネルギー源を反応系に添加して行うのが望ましい。使用する無機リン酸としては、リン酸カリウムなどのリン酸塩をそのまま使用してもよく、リン酸緩衝液の形態で使用してもかまわない。無機リン酸の使用濃度は、１０〜５００ｍＭ、好ましくは１００〜３００ｍＭの範囲から適宜選定することができる。また、エネルギー源としてはグルコース、フラクトースなどの糖類または酢酸、クエン酸などの有機酸を使用することができ、それぞれ１０〜５００ｍＭ、好ましくは２０〜４００ｍＭの範囲から適宜選定することができる。
このようにして得られたＣＤＰ−コリンは、通常の単離精製手段（イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、塩析など）により単離精製することができる。
【００２３】
【実施例】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないことは明らかである。なお、実施例におけるＤＮＡの調製、制限酵素による切断、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ連結、並びに大腸菌の形質転換法は全て「Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition」（Sambrookら編、Cold spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989)）に従って行った。また、制限酵素、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼは宝酒造（株）より入手した。
また、実施例において、反応液中のＣＤＰ−コリンの定量にはＨＰＬＣ法により行った。具体的には、分離には日立社製の３０１３−Ｎカラムを用い、溶出液としてはＡ液；０．１２ｍＭ ＮＨ4Ｃｌ、０．２ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、０．２ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、Ｂ液；５００ｍＭ ＮＨ4Ｃｌ、８３ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、８３ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4、５％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを用い、０〜５０％Ｂ液（０−２０分リニアーグラジエント）、１００％Ｂ液（２０−２５分）の条件で分析を行った。
【００２４】
実施例１
（１）発現用プラスミドｐＴｒｃ１２−６の作製
プラスミドベクター πＡＧ１（プラスミドベクター πＡＧ１を保持した大腸菌 Ｋ−１２株 ＴＮＣ１１１菌の寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６９０１号：平成１１年９月３０日生命工学工業技術研究所寄託）を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡ末端を平滑化し、さらにＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてｐＢｇｌＩＩリンカーを付与した。該ＤＮＡを制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩで切断し、カナマイシン耐性遺伝子を含む１．８ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を調製した。
次にｐＴｒｃ９９ＡＤＮＡを制限酵素ＰｖｕＩで切断後、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼによる部分消化を行い、β―ラクタマーゼ遺伝子を欠失させ、さらにｐＢｇｌＩＩリンカーをＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いてＤＮＡ末端に付与し、さらに制限酵素ＢｇｌＩＩで切断した。該ＤＮＡと先に調製したカナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９菌を形質転換した。
得られたカナマイシン耐性形質転換体より、プラスミドｐＴｒｃ１２−６を得た。ｐＴｒｃ１２−６は、ｐＴｒｃ９９Ａのβ―ラクタマーゼ遺伝子が完全に欠失し（position ５６７―１８１６ｂｐが欠失）、その欠失部位にＴｎ９０３由来のカナマイシン耐性遺伝子が挿入されたものである。
【００２５】
（２）ＣＣＴ遺伝子のクローニング
酵母 Saccharomyces cerevisiae DBY746（ＡＴＣＣ ４４７７３）の染色体ＤＮＡを公知の方法（Biochim. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)）で調製した。このＤＮＡをテンペレートとして、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法により酵母ＣＣＴ遺伝子を増幅した。
プライマー（Ａ）：5'-TACCATGGCAAACCCAACAAGGGA-3'
プライマー（Ｂ）：5'-TATCTAGAGGGGCTCAGTTCGCTGATT-3'
ＰＣＲによるＣＴＴ遺伝子の増幅は、反応液１００μｌ中（５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、テンペレートＤＮＡ ０．５μｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）（Ｂ）各々０．２μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ２．５ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製 ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーション（７２℃、１．５分）のステップを２５回繰り返すことにより行った。
【００２６】
遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍容のエタノールを添加し、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．８ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｂａＩで切断し、同じく制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｂａＨＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ１２−６とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９菌を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ１２−ＣＣＴを単離した。
ｐＴｒｃ１２−ＣＣＴは、ｐＴｒｃ１２−６のｔｒｃプロモーター下流のＮｃｏＩ−ＸｂａＨＩ切断部位に酵母ＣＣＴ遺伝子を含有するＮｃｏＩ−ＸｂａＩ ＤＮＡ断片が挿入されたものである。
【００２７】
（３）ＣＫＩ遺伝子のクローニング
酵母 Saccharomyces cerevisiae DBY746（ＡＴＣＣ ４４７７３）の染色体ＤＮＡをテンペレートとして、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法により酵母ＣＫＩ遺伝子を増幅した。
プライマー（Ｃ）：5'-ATTCTAGAGGAGCAAAAGATGGTACAAGAATCA-3'
プライマー（Ｄ）：5'-ATCTGCAGGAATTCGTATACGTATTACA-3'
ＰＣＲによるＣＫＩ遺伝子の増幅は、反応液１００μｌ中（５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、テンペレートＤＮＡ ０．５μｇ、プライマーＤＮＡ（Ｃ）（Ｄ）各々０．２μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ２．５ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製 ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーション（７２℃、１．５分）のステップを２５回繰り返すことにより行った。
【００２８】
遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍容のエタノールを添加し、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、２．０ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩ及びＰｓｔＩで切断し、同じく制限酵素ＸｂａＩ及びＰｓｔＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ１２−６とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９菌を形質転換し、得られたカナマイシン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ１２−ＣＫＩを単離した。
ｐＴｒｃ１２−ＣＫＩは、ｐＴｒｃ１２−６のｔｒｃプロモーター下流のＸｂａＩ−ＰｓｔＩ切断部位に酵母ＣＫＩ遺伝子を含有するＸｂａＩ−ＰｓｔＩ ＤＮＡ断片が挿入されたものである。
【００２９】
（４）ＣＣＴ及びＣＫＩの調製
プラスミドｐＴｒｃ１２−ＣＣＴを制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｂａＩで消化し、ＣＣＴ遺伝子を含むＮｃｏＩ−ＸｂａＩ断片を分離精製した。該断片とＮｃｏＩ及びＸｂａＩで切断したプラスミドｐＴｒｃ１２−ＣＫＩ ＤＮＡとＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、連結反応液を用いた大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。得られたカナマイシン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ−ＣＣＫ８を単離した。ｐＴｒｃ−ＣＣＫ８は、ｐＴｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモーター下流に酵母ＣＣＴ及びＣＫＩ遺伝子が連結されて挿入されたものである。
プラスミドｐＴｒｃ−ＣＣＫ８を用いて大腸菌Ｋ−１２株 ＭＥ８４１７（ＦＥＲＭ ＢＰ−６８４７号：平成１１年８月１８日 生命工学工業技術研究所寄託）を形質転換し、得られた形質転換体を、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する２ｘＹＴ培地 ３００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養した。４ｘ１０8菌／ｍｌに達した時点で、培養液に終濃度０．２５ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに２８℃で２０時間振とう培養を続けた。
【００３０】
培養終了後、遠心分離（９，０００ｘｇ，１０分）により菌体を回収し、３０ｍｌの緩衝液〔５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ〕に懸濁した後、超音波処理を行い、菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，０００ｘｇ、１０分）により菌体残渣を除去した。このように得られた上清画分を酵素液とした。酵素液におけるＣＣＴ活性は０．８４ユニット／ｍｇ蛋白、ＣＫＩ活性は０．０６ユニット／ｍｇ蛋白であった。
さらに、酵素生産の過程をタイムコースを追って調べた結果、ＩＰＴＧ誘導後、ＣＣＴ、ＣＫＩとも生産されるものの、その量は必ずしも高くなく、しかも生産された酵素の活性が徐々に失われてゆき、その原因の１つとしてプロテアーゼによる加水分解が推定された。
【００３１】
なお、本発明における各種酵素の単位（ユニット）は、以下に示す方法で測定、算出したものである。
（ＣＣＴ活性の測定と単位の算出法）
５ｍＭ ＣＴＰ、５ｍＭ ホスホコリン、２５ｍＭ 塩化マグネシウムを含有する１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に酵素標品を添加し、２８℃で反応させる。反応終了後１００℃で１分間の熱処理を行い、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で反応液中のＣＤＰ−コリン量を分析する。２８℃で１分間に１μｍｏｌｅのＣＤＰ−コリンを生成する活性を１単位（ユニット）とする。
（ＣＫＩ活性の測定と単位の算出法）
５ｍＭ ＣＴＰ、５ｍＭ 塩化コリン、５ｍＭ ＡＴＰ、２５ｍＭ 塩化マグネシウム、１ユニット／ｍｌ ＣＣＴを含有する１００ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に酵素標品を添加し、２８℃で反応を行い、１００℃で１分間の熱処理により反応を停止させる。反応液中のＣＤＰ−コリン量をＨＰＬＣ法により定量する。２８℃で１分間に１μｍｏｌｅのＣＤＰ−コリンの生成する活性を１単位（ユニット）とする。
【００３２】
（５）酵母ＣＣＴをコードする遺伝子からＣ末端２２アミノ酸残基相当分を欠失させたＤＮＡ断片（ＣＴＲ−１）の調製
上記（４）で構築、単離したｐＴｒｃ−ＣＣＫ８プラスミドをテンペレートとして、前述のプライマーＤＮＡ（Ａ）と下に示すプライマーＤＮＡ（Ｅ）を常法に従って合成し、ＰＣＲ法によりＣＴＲ−１を増幅した。
プライマー（Ｅ）：5'-TACCATGGCAAACCCAACAACAGGGA-3'
ＰＣＲによるＣＴＲ−１の増幅は、反応液１００μｌ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、テンペレートＤＮＡ ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）（Ｅ）各々 ０．２μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ２．５ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製 ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーション（７２℃、３分）のステップを２５回繰り返すことにより行った。
【００３３】
遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍容のエタノールを添加し、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．２ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで切断し、同じく制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ１２−６とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌Ｋ−１２株 ＭＥ８４１７（ＦＥＲＭ ＢＰ−６８４７）を形質転換し、得られたカナマイシン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ−ＣＴＲ１を単離した。
ｐＴｒｃ−ＣＴＲ１は、ｐＴｒｃ１２−６のｔｒｃプロモーター下流のＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ切断部位に３’末端６６ｂｐを欠失した酵母ＣＣＴ構造遺伝子を含有するＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩＤＮＡ断片が挿入されたものである。
【００３４】
（６）酵母ＣＫＩをコードする遺伝子からＮ末端２９アミノ酸残基相当分を欠失させたＤＮＡ断片（ＣＫＦ−Ａ）の調製
上記（４）で構築、単離したｐＴｒｃ−ＣＣＫ８プラスミドをテンペレートとして、先に示したプライマーＤＮＡ（Ｄ）と以下に示すプライマーＤＮＡ（Ｆ）を常法に従って合成し、ＰＣＲによりＣＫＦ−Ａを増幅した。
プライマー（Ｆ）：5'-TGTCTAGATGGTAACACGCCAACGTTCCTC-3'
ＰＣＲによるＣＫＦ−Ａの増幅は、反応液１００μｌ中（５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、テンペレートＤＮＡ ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ｄ）（Ｆ）各々 ０．２μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ２．５ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製 ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーション（７２℃、３分）のステップを２５回繰り返すことにより行った。
【００３５】
遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍容のエタノールを添加し、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．７ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩ及びＰｓｔＩで切断し、同じく制限酵素ＸｂａＩ及びＰｓｔＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ１２−６とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９菌を形質転換し、得られたカナマイシン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃＣＫＦ−Ａを単離した。
ｐＴｒｃＣＫＦ−Ａは、ｐＴｒｃ１２−６のｔｒｃプロモーター下流のＸｂａＩ−ＰｓｔＩ 切断部位に酵母ＣＫＩ遺伝子の５’末端８７ｂｐを欠失した構造遺伝子を含有するＸｂａＩ−ＰｓｔＩＤＮＡ断片が挿入されたものである。なお、ＣＫＦ−Ａタンパク質のＮ末端１、２番目のアミノ酸基はメチオニン、バリンである（天然のＣＫＩではセリン、ロイシンに相当）。
【００３６】
（７）ＣＴＲ−１およびＣＫＦ−Ａを用いてのＣＣＴ活性を有する酵素タンパク質とＣＫＩ活性を有する酵素タンパク質の生産
ｐＴｒｃＣＫＦ−Ａプラスミドを制限酵素ＰｓｔＩで切断した後、切断断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑化した。続いて平滑化処理した該プラスミドを制限酵素ＸｂａＩで切断し、得られたＣＫＦ−Ａ遺伝子を含む１．５ｋｂのＤＮＡ断片を文献（Molecular Cloning、前述）の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離、回収した。次にｐＴｒｃ−ＣＴＲ１プラスミドを制限酵素ＳａｌＩで切断した後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて切断断片を平滑化した。続いて制限酵素ＸｂａＩで切断し、該ＤＮＡ断片と実施例で調製したＣＫＦ−Ａ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌Ｋ−１２株 ＭＥ８４１７（ＦＥＲＭ ＢＰ−６８４７）を形質転換し、得られたカナマイシン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ−ＦＡを単離した。
得られた形質転換体を、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する改変ＬＢ培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム、１％グルコース）３００ｍｌに植菌し、２４℃で振とう培養した。培養液ｍｌあたりの菌体数が５ｘ１０8に達した時点で終濃度が０．１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに２４℃で２０時間培養を続けた。
【００３７】
培養終了後、遠心分離（９，０００ｘｇ，１０分）により菌体を回収し、３０ｍｌの緩衝液〔５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ塩化マグネシウム〕にけん濁した後、超音波処理を行い、菌体を破砕し、遠心分離（２０，０００ｘｇ、１０分）により菌体残渣を除去した。このようにして得られた上清画分を酵素標品とした。
このようにして調製した酵素標品における両酵素活性と従来のＣ末またはＮ末欠失前の遺伝子を用いて調製した上記（４）で得られた酵素液の酵素活性との比較を表１に示す。表１から明らかなように、大腸菌における生産性は、上述したＣ末またはＮ末を欠失させた特定のＤＮＡ断片を使用することにより、生来の酵母ＣＣＴに比べて約１．４倍、ＣＫＩは生来の酵母ＣＫＩに比べて約２０倍の生産性の向上が確認され、発現量の増大とともに、プロテアーゼ抵抗性の付与が生産された酵素タンパク質の活性を高レベルに維持できる要因と推測された。
【００３８】
【表１】
【００３９】
（８）ＣＤＰ−コリンの合成（その１）
２００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．０）、７５ｍＭ ＣＭＰ、２５ｍＭ塩化マグネシウム、７５ｍＭ塩化コリン、０．２Ｍグルコース、２％（ｗ／ｖ）乾燥パン酵母（オリエンタル酵母社）を含有する反応液４．９ｍｌに、上記（７）で調製した酵素液を０．１ｍｌ添加して（ＣＣＴ活性：０．３８ユニット／ｍｌ、ＣＫＩ活性：０．４０ユニット／ｍｌ）、試験管中で通気撹拌し、２８℃で４６時間保温した。反応開始７、２３、３２時間後に終濃度０．２Ｍとなるようにグルコースを添加した。反応４６時間後に６８ｍＭのＣＤＰ−コリンが合成された（対ＣＭＰモル収率：９０．７％）。
比較として、前記（４）で調製した酵素液を０．１ｍｌ添加する他は同じ条件で反応を行ったが、ＣＤＰ−コリンの合成はわずかであった。
【００４０】
実施例２ ＣＤＰ−コリンの合成（その２）
２００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．０）、１２５ｍＭ ＣＭＰ、２５ｍＭ塩化マグネシウム、１１０ｍＭホスホリルコリン、０．２Ｍグルコース、３．０％（ｗ／ｖ）乾燥パン酵母（オリエンタル酵母社）を含有する反応液４．９ｍｌに、実施例１の（７）で調製した酵素液を０．１ｍｌ添加し（ＣＣＴ活性：０．３８ユニット／ｍｌ）、試験管中で通気撹拌し、２５℃で４８時間保温した。反応開始７、２３、３２時間後に終濃度０．２Ｍとなるようにグルコースを添加した。反応４８時間後に、１０２ｍＭのＣＤＰ−コリンが合成された（対ＣＭＰモル収率：８１．６％）。
【００４１】
実施例３ ＣＤＰ−コリンの合成（その３）
実施例１の（７）と同様の方法で、調製した組換え大腸菌の培養液２０ｍｌを遠心分離（９，０００ｘｇ，１０分）により菌体を回収し、−５℃で１晩保存した後、２．３ｍｌの緩衝液〔５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ 塩化マグネシウム〕にけん濁し、菌体けん濁液とした。
次に、２００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．０）、１２５ｍＭ ＣＭＰ、２５ｍＭ塩化マグネシウム、１３０ｍＭホスホリルコリン、０．４Ｍグルコース、３．０％（ｗ／ｖ）乾燥パン酵母（オリエンタル酵母社）を含有する反応液４．８７５ｍｌに、調製した菌体けん濁液を０．１２５ｍｌ添加し、さらにキシレンを０．０２５ｍｌ添加し、試験管中で通気撹拌し、２４℃で４０時間保温した。反応開始１６と２４時間後に終濃度０．２Ｍとなるようにグルコースを添加した。反応４０時間後に、１０７ｍＭのＣＤＰ−コリンが合成された（対ＣＭＰモル収率：８５．６％）。
【００４２】
実施例４ ＣＤＰ−コリンの合成（その４）
２００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．０）、７５ｍＭ ＣＭＰ、２５ｍＭ塩化マグネシウム、８０ｍＭホスホリルコリン、０．２Ｍグルコース、２％（ｗ／ｖ）乾燥パン酵母（オリエンタル酵母社）を含有する反応液１５００ｍｌに、実施例１の（７）で調製した酵素液を１２．５ｍｌ添加し（ＣＣＴ活性：０．３８ユニット／ｍｌ）、３Ｌ卓上型ジャーファメンターで通気撹拌し（０．５Ｌ／ｍｉｎ、３００ｒｐｍ）、２４℃で４８時間保温した。反応開始７時間後に終濃度０．２Ｍとなるようにグルコース、並びに酵素液を１２．５ｍｌを添加した。さらに反応２４及び３２時間後に終濃度０．２Ｍとなるようにグルコースを添加した。
反応４８時間後に、６７．５ｍＭのＣＤＰ−コリンが合成された（対ＣＭＰモル収率９０．０％）
【００４３】
【発明の効果】
本発明の方法は、Ｎ末端またはＣ末端のアミノ酸を複数個欠失させた特定のＤＮＡ断片を使用することで、目的とする酵素タンパク質を安定に高生産させることができ、このような高生産系で得られた酵素タンパク質を使用することでＣＤＰ−コリンを短時間に効率的に合成できる極めて実用性の高い方法である。
具体的には、本発明の特定のＤＮＡ断片を使用することで、大腸菌における酵素タンパク質の生産性は、ＣＣＴは約１．４倍以上、ＣＫＩは約２０倍以上向上し、もってＣＤＰ−コリンの合成も飛躍的に向上させることが可能である。
【００４４】
【配列表】
【００４５】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、酵母由来のＣＣＴおよびＣＫＩの構造遺伝子を含有する塩基配列を示したものである。図中、塩基番号１〜１２０８番目で示される配列がＣＣＴの構造遺伝子であり、１２２３〜２８８１番目で示される配列がＣＫＩの構造遺伝子である。
【００４６】
【受託証】
【発明の属する技術分野】
本発明は、シチジン５’−ジリン酸コリン（ＣＤＰ−コリン）の効率的な製造法およびそれに使用する酵素タンパク質をコードするＤＮＡ断片に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＣＤＰ−コリンは医薬品として頭部外傷、脳手術に伴う意識障害、脳卒中などの改善治療に用いられている有用な化合物である。
ＣＤＰ−コリンの製造方法としては、化学合成法、酵母などの微生物を用いる方法などが古くから知られている。しかし、これらいずれの方法もシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）１モルに対するＣＤＰ−コリンの合成収率は低く、低コストでＣＤＰ−コリンを製造できる効率的な方法とはいえなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
最近、丸山らはオロット酸より酵素処理によりＣＤＰ−コリンを製造する方法を開発した（特開平５−２７６９７４）。しかしながら、該方法ではオロット酸からウリジン５’−トリリン酸（ＵＴＰ）を製造するための微生物を培養する工程とＵＴＰからのＣＤＰ−コリンの合成に関与する３種類の酵素〔ＣＴＰシンセターゼ、コリンホスフェートシチジルトランスフェラーぜ（ＣＣＴ）およびコリンキナーゼ（ＣＫＩ）〕を生産する組換え大腸菌を培養する工程があり、微生物培養の手間と培養設備の観点から必ずしも簡便な方法とは言えない。また、オロット酸１モルに対するＣＤＰ−コリンの合成収率も必ずしも高くなく、満足し得る方法ではない。
【０００４】
また、山下らはＣＣＴ遺伝子を含む組換えＤＮＡで形質転換された酵母菌体を用い、ＣＭＰとホスホコリンからＣＭＰ１モルに対し９０％前後の合成収率でＣＤＰ−コリンを製造する方法を開発した（特許第２７２４８２５号）。該方法は、セルフクローニングによりＣＤＰ−コリンの合成に関与するＣＣＴの生産を増強した酵母を用いることで、高収率でＣＤＰ−コリンを合成できるものの、用いる組換え酵母菌体はＣＭＰからのＣＤＰ−コリン合成に関与する一連の酵素の供給を担うこととなり、しかもＣＣＴ以外のＣＤＰ−コリン合成関連酵素の生産性は必ずしも高くないため、合成反応には多量の酵母菌体を使用する必要があった。このため、組換え酵母の培養量が膨大となり、結果的には必ずしも実用的な方法とは言えず、実際には実施されるに至っていない。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、酵母菌体がヌクレオシド５’−モノリン酸を効率的にヌクレオシド５’−トリリン酸に転換する活性を有することに着目し、ＣＭＰからのＣＤＰ−コリンの効率的な合成法を確立すべく、ＣＭＰとコリン（あるいはホスホリルコリン）を基質とする酵母添加反応液に酵母由来のＣＣＴ及びＣＫＩを生産する組換え大腸菌、その処理物あるいは酵素抽出液を添加して反応することで、またはＣＭＰとホスホコリンを基質とする酵母添加反応液にＣＣＴを生産する組換え大腸菌、その処理物あるいは酵素抽出液を添加して反応することでＣＤＰ−コリンが合成できるかどうか検討した結果、コリンを用いた場合には意外なことに目的とするＣＤＰ−コリンはまったく合成されないか、合成されても極くわずかな量しか生成されないこと、およびホスホコリンを用いた場合であっても満足しうる量のＣＤＰ−コリンを合成することができないことを確認した。
【０００６】
この原因を究明する過程において、ＣＤＰ−コリンの低収率は、酵母由来のＣＣＴ並びにＣＫＩは大腸菌において安定に高生産されないことに起因していることを突き止めた。
そこで本発明者らは、大腸菌における当該酵素の発現経過を検討した結果、完全には解明されなかったものの、発現後のＣＣＴおよびＣＫＩを不安定化する要因の１つにプロテアーゼによる加水分解が関与しているものと推測された。そこで、使用する酵素にプロテアーゼ抵抗性を付与し、安定に高発現させるための方策に関し種々検討を重ねた結果、Ｎ末端またはＣ末端のアミノ酸を複数個欠失させて得られるタンパク質は目的とする酵素活性を維持し、発現量が増大するとともに、プロテアーゼに対しても抵抗性を示し、大腸菌においても安定に高生産される系を構築できることを見いだし、このような高生産系で得られた酵素タンパク質を使用することで効率的にＣＤＰ−コリンを合成することを確認し、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）に記載のいずれかのＤＮＡ断片の塩基配列によりコードされるコリンホスフェートシチジルトランシフェラーゼ（ＣＣＴ）活性を有する酵素タンパク質、および（ｄ）〜（ｆ）に記載のいずれかのＤＮＡ断片の塩基配列によりコードされるコリンキナーゼ（ＣＫＩ）活性を有する酵素タンパク質の２種類の酵素タンパク質の存在下、酵母菌体、シチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）及びコリンを反応させてシチジン５’−ジリン酸コリン（ＣＤＰ-コリン）を製造することを特徴とする、ＣＤＰ-コリンの製造法に関するものである。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｂ）配列番号１で示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｃ）上記（ａ）に記載のＤＮＡ断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片、
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｅ）配列番号２で示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｆ）上記（ｄ）に記載のＤＮＡ断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片
【０００８】
また、本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）に記載のいずれかのＤＮＡ断片の塩基配列によりコードされるＣＣＴ活性を有する酵素タンパク質の存在下、酵母菌体、ＣＭＰ及びホスホリルコリンを反応させてＣＤＰ-コリンを製造することを特徴とする、ＣＤＰ-コリンの製造法に関するものである。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｂ）配列番号１で示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｃ）上記（ａ）に記載のＤＮＡ断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片
【０００９】
さらに、本発明は、（１）配列番号１で示される塩基配列からなり、ＣＣＴ活性を有する酵素タンパク質をコードするＤＮＡ断片、（２）配列番号１で示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなり、ＣＣＴ活性を有する酵素タンパク質をコードするＤＮＡ断片、または（３）上記（１）のＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ＣＣＴ活性を有する酵素タンパク質をコードするＤＮＡ断片に関するものである。
【００１０】
さらにまた、本発明は、（１）配列番号２で示される塩基配列からなり、ＣＫＩ活性を有する酵素タンパク質をコードするＤＮＡ断片、（２）配列番号２で示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなり、ＣＫＩ活性を有する酵素タンパク質をコードするＤＮＡ断片、または（３）上記（１）のＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ＣＫＩ活性を有する酵素タンパク質をコードするＤＮＡ断片に関するものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
上述したように、本発明の特徴は、反応系に添加するＣＣＴとして、以下の（ａ）〜（ｃ）に記載のいずれかのＤＮＡ断片の塩基配列によりコードされるＣＣＴ活性を有する酵素タンパク質、および必要によりＣＫＩとして以下の（ｄ）〜（ｆ）に記載のいずれかのＤＮＡ断片の塩基配列によりコードされるＣＫＩ活性を有する酵素タンパク質を使用することにある。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｂ）配列番号１で示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｃ）上記（ａ）に記載のＤＮＡ断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片、
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｅ）配列番号２で示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｆ）上記（ｄ）に記載のＤＮＡ断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片
【００１２】
上記（ａ）記載のＤＮＡ断片は、酵母ＣＣＴをコードする遺伝子からＣ末端２２アミノ酸残基相当分を欠失させたＤＮＡ断片である。具体的には、図１に示す塩基配列中、塩基番号１〜１２０８番目で示される配列が酵母のＣＣＴ構造遺伝子に相当し、このＣＣＴ遺伝子からＣ末端２２アミノ酸残基相当分（６６塩基）を欠失させたものが配列番号１で示される塩基配列である。
上記（ａ）のＤＮＡ断片と同等の機能、すなわちＣＣＴ活性を維持し、プロテアーゼに対する抵抗性を示す限り、配列番号１で示される塩基配列において１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されたＤＮＡ断片、またはこれらのＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片も本発明で使用可能である。
【００１３】
また、上記（ｄ）記載のＤＮＡ断片は、酵母ＣＫＩをコードする遺伝子からＮ末端２９アミノ酸残基相当分を欠失させたＤＮＡ断片である。具体的には、図１に示す塩基配列中、塩基番号１２２３〜２８８１番目で示される配列がＣＫＩの構造遺伝子に相当し、このＣＫＩ遺伝子からＮ末端２９アミノ酸残基相当分（８７塩基）を欠失させたものが配列番号２で示される塩基配列である。
上記（ｄ）のＤＮＡ断片と同等の機能、すなわちＣＫＩ活性を維持し、プロテアーゼに対する抵抗性を示す限り、配列番号２で示される塩基配列において１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されたＤＮＡ断片、またはこれらのＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片も本発明で使用可能である。
なお、本発明でいうストリンジェントな条件下での反応とは、５ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣは塩化ナトリウム８．７６ｇ、クエン酸ナトリウム４．４１ｇを１リットルの水に溶解させたもの）、０．１％（ｗ／ｖ）Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．５％（ｗ／ｖ）ブロッキング試薬を含む溶液を用い、６０℃で２０時間程度のハイブリダイゼーション反応を行うことを意味する。
【００１４】
このような特定のＤＮＡ断片を使用するとき、酵素タンパク質の発現量を最大にすることができ、生産された後の安定性も向上することが本発明者らの実験で初めて確認された。
ＤＮＡ断片の調製は、既にクローン化され、その全塩基配列が決定されており、酵母のＣＣＴ遺伝子（Eur. J. Biochem., 169, 477-486, 1987）およびＣＫＩ遺伝子（J. Biol. Chem., 264, 2053-2059, 1989）を参考に公知の組換えＤＮＡ手法（例えば「Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition」Cold Spring Harbor Laboratory (1989)）をクローン化後、ヌクレアーゼ等の酵素を用いて消化させることにより容易に実施することができる。
また、調製したＤＮＡ断片を用い発現ベクターの調製、発現ベクターを用いたＣＣＴおよびＣＫＩ活性を有する酵素タンパク質の調製なども分子生物学の分野に属する技術者にとっては周知の技術であり、例えば（「Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition」Cold Spring Harbor Laboratory (1989)）に従って行うことができる。
【００１５】
すなわち、宿主微生物としては、ＣＣＴ活性またはＣＫＩ活性を有する酵素タンパク質が発現でき、ＣＤＰ−コリンの製造に適用できるものであればいずれも使用可能であり、培養及び酵素調製の簡便さから大腸菌が適当である。具体的には、組換えＤＮＡ実験に使用されるＫ１２株、Ｃ６００菌、ＪＭ１０５菌、ＪＭ１０９菌(Gene, 33, 103-119(1985))などが使用可能であり、特にプロテアーゼ欠損株が好ましい。また、発現用ベクターとしては大腸菌内で複製可能であれば特に限定されないが、ｐＢＲ３２２（Gene, 2, 95-113, 1977）あるいはｐＵＣ１８（Gene, 33, 103-119, 1985）など、あるいはそれら誘導体が使用できる。このようなベクターと上記ＤＮＡ断片を用いて、大腸菌の菌体中で自発現可能となるように発現制御シグナル（転写開始及び翻訳開始シグナル）をその上流に連結した組換え発現ベクターを作製する。
【００１６】
このような発現制御シグナルとしては、人為的制御が可能で、酵素タンパク質の発現量を飛躍的に上昇させるような強力な転写開始並びに翻訳開始シグナルを用いることが望ましい。具体的には、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター（Proc．Natl．Acad．Sci．USA.,80，21(1983）、Gene，20，231(1982））、ｔｒｃプロモーター(J．Biol．Chem．，260，3539(1985））などを例示することができる。
作製した組換えべクターを用いて大腸菌を形質転換する。大腸菌を形質転換する方法はすでに多くの方法が報告されており、たとえば、低温下、塩化カルシウム処理して菌体内にプラスミドを導入する方法（J．Mol．Biol．，53，159（1970））により大腸菌を形質転換することができる。
【００１７】
得られた形質転換体は当該形質転換体が増殖可能な培地中で増殖させ、さらにクローン化したＣＣＴ活性ならびにＣＫＩ活性を有する酵素タンパク質の発現を誘導して菌体内に当該酵素タンパク質が大量に蓄積するまで培養を行う。
培地としてはブイヨン培地、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストエキストラクト、１％食塩）または２×ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％イーストエキストラクト、０．５％食塩）などを使用することができる。また、ベクターとしてプラスミドを用いた場合には、培養中におけるプラスミドの脱落を防ぐために適当な抗生物質（プラスミドの薬剤耐性マーカーに応じ、アンピシリン、カナマイシンなど）の薬剤を適当量培養液に加えて培養する。
【００１８】
形質転換体の培養は、低温で培養することで上記酵素タンパク質を安定に生産させることができるので、当該培地に種菌を接種後、２０〜３０℃で、好ましくは２０〜２８℃で１０〜５０時間程度必要により通気撹拌しながら培養する。
また、酵素タンパク質の産生を誘導する必要がある場合には、用いたプロモーターで常用されている方法で該遺伝子の発現を誘導する。例えば、ｌａｃプロモーターやｔａｃプロモーターを使用した場合には、培養中期に発現誘導剤であるイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴＧと略称する）を適当量添加する。また、使用するプロモーターが構成的に転写活性を有する場合には、特に発現誘導剤を添加する必要はない。
【００１９】
反応液に添加する酵素タンパク質としては、上記の方法で得られる培養液から遠心分離、膜分離などの固液分離手段で回収した微生物の菌体を利用することも可能であるが、該微生物の処理物、該処理物から得られる酵素調製物を利用することもできる。
微生物の処理物としては、上記回収した微生物菌体を、機械的破壊（ワーリングブレンダー、フレンチプレス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、自己消化、乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処理（リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理（酸、アルカリ処理などによる）などの一般的な処理法に従って処理して得られる菌体処理物または菌体の細胞壁もしくは細胞膜の変性物を例示することができる。
酵素調製物としては、上記菌体処理物から当該酵素活性を有する画分を通常の酵素の精製手段（塩析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、透析処理、各種クロマトグラフィー処理など）を施して得られる粗酵素または精製酵素を例示することができる。
【００２０】
また、反応系に添加する酵母菌体としては、ＣＭＰをシチジン５’−トリリン酸（ＣＴＰ）に変換できる酵母であればよく、なかでも市販のパン酵母、あるいはワイン酵母を用いることで酵母菌体製造の過程が省略でき、極めて有利である。また、酵母乾燥菌体、酵母生菌体いずれの形態も利用可能である。酵母菌体の使用濃度としては、乾燥重量として１〜５％（ｗ／ｖ）の範囲から適宜設定することができる。
基質として使用するＣＭＰ、コリンまたはホスホリルコリンは市販品を使用することができる。各基質の使用濃度としては１〜２００ｍＭ、好ましくは５０〜１５０ｍＭの範囲から適宜設定できる。
【００２１】
ＣＤＰ−コリンの合成反応は、例えば水溶液、好ましくはリン酸緩衝液（ｐＨ６．０〜８．０）中、酵母菌体、ＣＭＰ、コリン（またはホスホリルコリン）を添加し、さらにＣＣＴ活性を有する酵素タンパク質、ＣＫＩ活性を有する酵素タンパク質（ホスホリルコリンを使用した場合には不要）をそれぞれ０．０１ユニット／ｍｌ以上、好ましくは０．０４〜１．０ユニット／ｍｌ添加し、５〜３０℃、好ましくは２０〜３０℃で１０〜７２時間程度、必要により撹拌しながら反応させることにより実施できる。
【００２２】
なお、上記酵素反応は、無機リン酸及びエネルギー源を反応系に添加して行うのが望ましい。使用する無機リン酸としては、リン酸カリウムなどのリン酸塩をそのまま使用してもよく、リン酸緩衝液の形態で使用してもかまわない。無機リン酸の使用濃度は、１０〜５００ｍＭ、好ましくは１００〜３００ｍＭの範囲から適宜選定することができる。また、エネルギー源としてはグルコース、フラクトースなどの糖類または酢酸、クエン酸などの有機酸を使用することができ、それぞれ１０〜５００ｍＭ、好ましくは２０〜４００ｍＭの範囲から適宜選定することができる。
このようにして得られたＣＤＰ−コリンは、通常の単離精製手段（イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、塩析など）により単離精製することができる。
【００２３】
【実施例】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないことは明らかである。なお、実施例におけるＤＮＡの調製、制限酵素による切断、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ連結、並びに大腸菌の形質転換法は全て「Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition」（Sambrookら編、Cold spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989)）に従って行った。また、制限酵素、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼは宝酒造（株）より入手した。
また、実施例において、反応液中のＣＤＰ−コリンの定量にはＨＰＬＣ法により行った。具体的には、分離には日立社製の３０１３−Ｎカラムを用い、溶出液としてはＡ液；０．１２ｍＭ ＮＨ4Ｃｌ、０．２ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、０．２ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、Ｂ液；５００ｍＭ ＮＨ4Ｃｌ、８３ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、８３ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4、５％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを用い、０〜５０％Ｂ液（０−２０分リニアーグラジエント）、１００％Ｂ液（２０−２５分）の条件で分析を行った。
【００２４】
実施例１
（１）発現用プラスミドｐＴｒｃ１２−６の作製
プラスミドベクター πＡＧ１（プラスミドベクター πＡＧ１を保持した大腸菌 Ｋ−１２株 ＴＮＣ１１１菌の寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６９０１号：平成１１年９月３０日生命工学工業技術研究所寄託）を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡ末端を平滑化し、さらにＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてｐＢｇｌＩＩリンカーを付与した。該ＤＮＡを制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩで切断し、カナマイシン耐性遺伝子を含む１．８ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を調製した。
次にｐＴｒｃ９９ＡＤＮＡを制限酵素ＰｖｕＩで切断後、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼによる部分消化を行い、β―ラクタマーゼ遺伝子を欠失させ、さらにｐＢｇｌＩＩリンカーをＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いてＤＮＡ末端に付与し、さらに制限酵素ＢｇｌＩＩで切断した。該ＤＮＡと先に調製したカナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９菌を形質転換した。
得られたカナマイシン耐性形質転換体より、プラスミドｐＴｒｃ１２−６を得た。ｐＴｒｃ１２−６は、ｐＴｒｃ９９Ａのβ―ラクタマーゼ遺伝子が完全に欠失し（position ５６７―１８１６ｂｐが欠失）、その欠失部位にＴｎ９０３由来のカナマイシン耐性遺伝子が挿入されたものである。
【００２５】
（２）ＣＣＴ遺伝子のクローニング
酵母 Saccharomyces cerevisiae DBY746（ＡＴＣＣ ４４７７３）の染色体ＤＮＡを公知の方法（Biochim. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)）で調製した。このＤＮＡをテンペレートとして、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法により酵母ＣＣＴ遺伝子を増幅した。
プライマー（Ａ）：5'-TACCATGGCAAACCCAACAAGGGA-3'
プライマー（Ｂ）：5'-TATCTAGAGGGGCTCAGTTCGCTGATT-3'
ＰＣＲによるＣＴＴ遺伝子の増幅は、反応液１００μｌ中（５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、テンペレートＤＮＡ ０．５μｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）（Ｂ）各々０．２μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ２．５ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製 ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーション（７２℃、１．５分）のステップを２５回繰り返すことにより行った。
【００２６】
遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍容のエタノールを添加し、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．８ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｂａＩで切断し、同じく制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｂａＨＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ１２−６とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９菌を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ１２−ＣＣＴを単離した。
ｐＴｒｃ１２−ＣＣＴは、ｐＴｒｃ１２−６のｔｒｃプロモーター下流のＮｃｏＩ−ＸｂａＨＩ切断部位に酵母ＣＣＴ遺伝子を含有するＮｃｏＩ−ＸｂａＩ ＤＮＡ断片が挿入されたものである。
【００２７】
（３）ＣＫＩ遺伝子のクローニング
酵母 Saccharomyces cerevisiae DBY746（ＡＴＣＣ ４４７７３）の染色体ＤＮＡをテンペレートとして、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法により酵母ＣＫＩ遺伝子を増幅した。
プライマー（Ｃ）：5'-ATTCTAGAGGAGCAAAAGATGGTACAAGAATCA-3'
プライマー（Ｄ）：5'-ATCTGCAGGAATTCGTATACGTATTACA-3'
ＰＣＲによるＣＫＩ遺伝子の増幅は、反応液１００μｌ中（５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、テンペレートＤＮＡ ０．５μｇ、プライマーＤＮＡ（Ｃ）（Ｄ）各々０．２μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ２．５ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製 ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーション（７２℃、１．５分）のステップを２５回繰り返すことにより行った。
【００２８】
遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍容のエタノールを添加し、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、２．０ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩ及びＰｓｔＩで切断し、同じく制限酵素ＸｂａＩ及びＰｓｔＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ１２−６とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９菌を形質転換し、得られたカナマイシン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ１２−ＣＫＩを単離した。
ｐＴｒｃ１２−ＣＫＩは、ｐＴｒｃ１２−６のｔｒｃプロモーター下流のＸｂａＩ−ＰｓｔＩ切断部位に酵母ＣＫＩ遺伝子を含有するＸｂａＩ−ＰｓｔＩ ＤＮＡ断片が挿入されたものである。
【００２９】
（４）ＣＣＴ及びＣＫＩの調製
プラスミドｐＴｒｃ１２−ＣＣＴを制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｂａＩで消化し、ＣＣＴ遺伝子を含むＮｃｏＩ−ＸｂａＩ断片を分離精製した。該断片とＮｃｏＩ及びＸｂａＩで切断したプラスミドｐＴｒｃ１２−ＣＫＩ ＤＮＡとＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、連結反応液を用いた大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。得られたカナマイシン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ−ＣＣＫ８を単離した。ｐＴｒｃ−ＣＣＫ８は、ｐＴｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモーター下流に酵母ＣＣＴ及びＣＫＩ遺伝子が連結されて挿入されたものである。
プラスミドｐＴｒｃ−ＣＣＫ８を用いて大腸菌Ｋ−１２株 ＭＥ８４１７（ＦＥＲＭ ＢＰ−６８４７号：平成１１年８月１８日 生命工学工業技術研究所寄託）を形質転換し、得られた形質転換体を、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する２ｘＹＴ培地 ３００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養した。４ｘ１０8菌／ｍｌに達した時点で、培養液に終濃度０．２５ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに２８℃で２０時間振とう培養を続けた。
【００３０】
培養終了後、遠心分離（９，０００ｘｇ，１０分）により菌体を回収し、３０ｍｌの緩衝液〔５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ〕に懸濁した後、超音波処理を行い、菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，０００ｘｇ、１０分）により菌体残渣を除去した。このように得られた上清画分を酵素液とした。酵素液におけるＣＣＴ活性は０．８４ユニット／ｍｇ蛋白、ＣＫＩ活性は０．０６ユニット／ｍｇ蛋白であった。
さらに、酵素生産の過程をタイムコースを追って調べた結果、ＩＰＴＧ誘導後、ＣＣＴ、ＣＫＩとも生産されるものの、その量は必ずしも高くなく、しかも生産された酵素の活性が徐々に失われてゆき、その原因の１つとしてプロテアーゼによる加水分解が推定された。
【００３１】
なお、本発明における各種酵素の単位（ユニット）は、以下に示す方法で測定、算出したものである。
（ＣＣＴ活性の測定と単位の算出法）
５ｍＭ ＣＴＰ、５ｍＭ ホスホコリン、２５ｍＭ 塩化マグネシウムを含有する１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に酵素標品を添加し、２８℃で反応させる。反応終了後１００℃で１分間の熱処理を行い、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で反応液中のＣＤＰ−コリン量を分析する。２８℃で１分間に１μｍｏｌｅのＣＤＰ−コリンを生成する活性を１単位（ユニット）とする。
（ＣＫＩ活性の測定と単位の算出法）
５ｍＭ ＣＴＰ、５ｍＭ 塩化コリン、５ｍＭ ＡＴＰ、２５ｍＭ 塩化マグネシウム、１ユニット／ｍｌ ＣＣＴを含有する１００ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に酵素標品を添加し、２８℃で反応を行い、１００℃で１分間の熱処理により反応を停止させる。反応液中のＣＤＰ−コリン量をＨＰＬＣ法により定量する。２８℃で１分間に１μｍｏｌｅのＣＤＰ−コリンの生成する活性を１単位（ユニット）とする。
【００３２】
（５）酵母ＣＣＴをコードする遺伝子からＣ末端２２アミノ酸残基相当分を欠失させたＤＮＡ断片（ＣＴＲ−１）の調製
上記（４）で構築、単離したｐＴｒｃ−ＣＣＫ８プラスミドをテンペレートとして、前述のプライマーＤＮＡ（Ａ）と下に示すプライマーＤＮＡ（Ｅ）を常法に従って合成し、ＰＣＲ法によりＣＴＲ−１を増幅した。
プライマー（Ｅ）：5'-TACCATGGCAAACCCAACAACAGGGA-3'
ＰＣＲによるＣＴＲ−１の増幅は、反応液１００μｌ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、テンペレートＤＮＡ ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）（Ｅ）各々 ０．２μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ２．５ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製 ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーション（７２℃、３分）のステップを２５回繰り返すことにより行った。
【００３３】
遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍容のエタノールを添加し、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．２ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで切断し、同じく制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ１２−６とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌Ｋ−１２株 ＭＥ８４１７（ＦＥＲＭ ＢＰ−６８４７）を形質転換し、得られたカナマイシン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ−ＣＴＲ１を単離した。
ｐＴｒｃ−ＣＴＲ１は、ｐＴｒｃ１２−６のｔｒｃプロモーター下流のＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ切断部位に３’末端６６ｂｐを欠失した酵母ＣＣＴ構造遺伝子を含有するＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩＤＮＡ断片が挿入されたものである。
【００３４】
（６）酵母ＣＫＩをコードする遺伝子からＮ末端２９アミノ酸残基相当分を欠失させたＤＮＡ断片（ＣＫＦ−Ａ）の調製
上記（４）で構築、単離したｐＴｒｃ−ＣＣＫ８プラスミドをテンペレートとして、先に示したプライマーＤＮＡ（Ｄ）と以下に示すプライマーＤＮＡ（Ｆ）を常法に従って合成し、ＰＣＲによりＣＫＦ−Ａを増幅した。
プライマー（Ｆ）：5'-TGTCTAGATGGTAACACGCCAACGTTCCTC-3'
ＰＣＲによるＣＫＦ−Ａの増幅は、反応液１００μｌ中（５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、テンペレートＤＮＡ ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ｄ）（Ｆ）各々 ０．２μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ２．５ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製 ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーション（７２℃、３分）のステップを２５回繰り返すことにより行った。
【００３５】
遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍容のエタノールを添加し、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．７ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩ及びＰｓｔＩで切断し、同じく制限酵素ＸｂａＩ及びＰｓｔＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ１２−６とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９菌を形質転換し、得られたカナマイシン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃＣＫＦ−Ａを単離した。
ｐＴｒｃＣＫＦ−Ａは、ｐＴｒｃ１２−６のｔｒｃプロモーター下流のＸｂａＩ−ＰｓｔＩ 切断部位に酵母ＣＫＩ遺伝子の５’末端８７ｂｐを欠失した構造遺伝子を含有するＸｂａＩ−ＰｓｔＩＤＮＡ断片が挿入されたものである。なお、ＣＫＦ−Ａタンパク質のＮ末端１、２番目のアミノ酸基はメチオニン、バリンである（天然のＣＫＩではセリン、ロイシンに相当）。
【００３６】
（７）ＣＴＲ−１およびＣＫＦ−Ａを用いてのＣＣＴ活性を有する酵素タンパク質とＣＫＩ活性を有する酵素タンパク質の生産
ｐＴｒｃＣＫＦ−Ａプラスミドを制限酵素ＰｓｔＩで切断した後、切断断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑化した。続いて平滑化処理した該プラスミドを制限酵素ＸｂａＩで切断し、得られたＣＫＦ−Ａ遺伝子を含む１．５ｋｂのＤＮＡ断片を文献（Molecular Cloning、前述）の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離、回収した。次にｐＴｒｃ−ＣＴＲ１プラスミドを制限酵素ＳａｌＩで切断した後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて切断断片を平滑化した。続いて制限酵素ＸｂａＩで切断し、該ＤＮＡ断片と実施例で調製したＣＫＦ−Ａ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌Ｋ−１２株 ＭＥ８４１７（ＦＥＲＭ ＢＰ−６８４７）を形質転換し、得られたカナマイシン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ−ＦＡを単離した。
得られた形質転換体を、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する改変ＬＢ培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム、１％グルコース）３００ｍｌに植菌し、２４℃で振とう培養した。培養液ｍｌあたりの菌体数が５ｘ１０8に達した時点で終濃度が０．１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに２４℃で２０時間培養を続けた。
【００３７】
培養終了後、遠心分離（９，０００ｘｇ，１０分）により菌体を回収し、３０ｍｌの緩衝液〔５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ塩化マグネシウム〕にけん濁した後、超音波処理を行い、菌体を破砕し、遠心分離（２０，０００ｘｇ、１０分）により菌体残渣を除去した。このようにして得られた上清画分を酵素標品とした。
このようにして調製した酵素標品における両酵素活性と従来のＣ末またはＮ末欠失前の遺伝子を用いて調製した上記（４）で得られた酵素液の酵素活性との比較を表１に示す。表１から明らかなように、大腸菌における生産性は、上述したＣ末またはＮ末を欠失させた特定のＤＮＡ断片を使用することにより、生来の酵母ＣＣＴに比べて約１．４倍、ＣＫＩは生来の酵母ＣＫＩに比べて約２０倍の生産性の向上が確認され、発現量の増大とともに、プロテアーゼ抵抗性の付与が生産された酵素タンパク質の活性を高レベルに維持できる要因と推測された。
【００３８】
【表１】
（８）ＣＤＰ−コリンの合成（その１）
２００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．０）、７５ｍＭ ＣＭＰ、２５ｍＭ塩化マグネシウム、７５ｍＭ塩化コリン、０．２Ｍグルコース、２％（ｗ／ｖ）乾燥パン酵母（オリエンタル酵母社）を含有する反応液４．９ｍｌに、上記（７）で調製した酵素液を０．１ｍｌ添加して（ＣＣＴ活性：０．３８ユニット／ｍｌ、ＣＫＩ活性：０．４０ユニット／ｍｌ）、試験管中で通気撹拌し、２８℃で４６時間保温した。反応開始７、２３、３２時間後に終濃度０．２Ｍとなるようにグルコースを添加した。反応４６時間後に６８ｍＭのＣＤＰ−コリンが合成された（対ＣＭＰモル収率：９０．７％）。
比較として、前記（４）で調製した酵素液を０．１ｍｌ添加する他は同じ条件で反応を行ったが、ＣＤＰ−コリンの合成はわずかであった。
【００４０】
実施例２ ＣＤＰ−コリンの合成（その２）
２００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．０）、１２５ｍＭ ＣＭＰ、２５ｍＭ塩化マグネシウム、１１０ｍＭホスホリルコリン、０．２Ｍグルコース、３．０％（ｗ／ｖ）乾燥パン酵母（オリエンタル酵母社）を含有する反応液４．９ｍｌに、実施例１の（７）で調製した酵素液を０．１ｍｌ添加し（ＣＣＴ活性：０．３８ユニット／ｍｌ）、試験管中で通気撹拌し、２５℃で４８時間保温した。反応開始７、２３、３２時間後に終濃度０．２Ｍとなるようにグルコースを添加した。反応４８時間後に、１０２ｍＭのＣＤＰ−コリンが合成された（対ＣＭＰモル収率：８１．６％）。
【００４１】
実施例３ ＣＤＰ−コリンの合成（その３）
実施例１の（７）と同様の方法で、調製した組換え大腸菌の培養液２０ｍｌを遠心分離（９，０００ｘｇ，１０分）により菌体を回収し、−５℃で１晩保存した後、２．３ｍｌの緩衝液〔５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ 塩化マグネシウム〕にけん濁し、菌体けん濁液とした。
次に、２００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．０）、１２５ｍＭ ＣＭＰ、２５ｍＭ塩化マグネシウム、１３０ｍＭホスホリルコリン、０．４Ｍグルコース、３．０％（ｗ／ｖ）乾燥パン酵母（オリエンタル酵母社）を含有する反応液４．８７５ｍｌに、調製した菌体けん濁液を０．１２５ｍｌ添加し、さらにキシレンを０．０２５ｍｌ添加し、試験管中で通気撹拌し、２４℃で４０時間保温した。反応開始１６と２４時間後に終濃度０．２Ｍとなるようにグルコースを添加した。反応４０時間後に、１０７ｍＭのＣＤＰ−コリンが合成された（対ＣＭＰモル収率：８５．６％）。
【００４２】
実施例４ ＣＤＰ−コリンの合成（その４）
２００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．０）、７５ｍＭ ＣＭＰ、２５ｍＭ塩化マグネシウム、８０ｍＭホスホリルコリン、０．２Ｍグルコース、２％（ｗ／ｖ）乾燥パン酵母（オリエンタル酵母社）を含有する反応液１５００ｍｌに、実施例１の（７）で調製した酵素液を１２．５ｍｌ添加し（ＣＣＴ活性：０．３８ユニット／ｍｌ）、３Ｌ卓上型ジャーファメンターで通気撹拌し（０．５Ｌ／ｍｉｎ、３００ｒｐｍ）、２４℃で４８時間保温した。反応開始７時間後に終濃度０．２Ｍとなるようにグルコース、並びに酵素液を１２．５ｍｌを添加した。さらに反応２４及び３２時間後に終濃度０．２Ｍとなるようにグルコースを添加した。
反応４８時間後に、６７．５ｍＭのＣＤＰ−コリンが合成された（対ＣＭＰモル収率９０．０％）
【００４３】
【発明の効果】
本発明の方法は、Ｎ末端またはＣ末端のアミノ酸を複数個欠失させた特定のＤＮＡ断片を使用することで、目的とする酵素タンパク質を安定に高生産させることができ、このような高生産系で得られた酵素タンパク質を使用することでＣＤＰ−コリンを短時間に効率的に合成できる極めて実用性の高い方法である。
具体的には、本発明の特定のＤＮＡ断片を使用することで、大腸菌における酵素タンパク質の生産性は、ＣＣＴは約１．４倍以上、ＣＫＩは約２０倍以上向上し、もってＣＤＰ−コリンの合成も飛躍的に向上させることが可能である。
【００４４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、酵母由来のＣＣＴおよびＣＫＩの構造遺伝子を含有する塩基配列を示したものである。図中、塩基番号１〜１２０８番目で示される配列がＣＣＴの構造遺伝子であり、１２２３〜２８８１番目で示される配列がＣＫＩの構造遺伝子である。
【００４６】
【受託証】
Claims (8)
- 以下の（ａ）〜（ｃ）に記載のいずれかのＤＮＡ断片の塩基配列によりコードされるコリンホスフェートシチジルトランシフェラーゼ（ＣＣＴ）活性を有する酵素タンパク質、および（ｄ）〜（ｆ）に記載のいずれかのＤＮＡ断片の塩基配列によりコードされるコリンキナーゼ（ＣＫＩ）活性を有する酵素タンパク質の２種類の酵素タンパク質の存在下、酵母菌体、シチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）及びコリンを反応させてシチジン５’−ジリン酸コリン（ＣＤＰ-コリン）を製造することを特徴とする、ＣＤＰ-コリンの製造法。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｂ）配列番号１で示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｃ）上記（ａ）に記載のＤＮＡ断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片、
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｅ）配列番号２で示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｆ）上記（ｄ）に記載のＤＮＡ断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片 - 以下の（ａ）〜（ｃ）に記載のいずれかのＤＮＡ断片の塩基配列によりコードされるＣＣＴ活性を有する酵素タンパク質の存在下、酵母菌体、ＣＭＰ及びホスホリルコリンを反応させてＣＤＰ-コリンを製造することを特徴とする、ＣＤＰ-コリンの製造法。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｂ）配列番号１で示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｃ）上記（ａ）に記載のＤＮＡ断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片 - 配列番号１で示される塩基配列からなり、ＣＣＴ活性を有する酵素タンパク質をコードするＤＮＡ断片。
- 配列番号１で示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなり、ＣＣＴ活性を有する酵素タンパク質をコードするＤＮＡ断片。
- 請求項３記載のＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ＣＣＴ活性を有する酵素タンパク質をコードするＤＮＡ断片。
- 配列番号２で示される塩基配列からなり、ＣＫＩ活性を有する酵素タンパク質をコードするＤＮＡ断片。
- 配列番号２で示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなり、ＣＫＩ活性を有する酵素タンパク質をコードするＤＮＡ断片。
- 請求項６記載のＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ＣＫＩ活性を有する酵素タンパク質をコードするＤＮＡ断片。
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