KR100679112B1 - 동물세포 배양방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 재조합 단백질을 생산하는 동물 세포의 배양 방법으로서, 대두(soybean) 또는 효모(yeast) 추출 단백질을 산 또는 효소로 가수분해 처리하여 생성된 가수분해 산물을 준비하는 단계; 50% 이상의 산소 농도 및 7.2의 pH를 유지하면서 무혈청 배지에서 세포를 배양하는 단계; 및 세포 농도가 1.5×106 세포주/㎖에 도달시 3 g/L 내지 20 g/L의 양의 상기 가수분해 산물을 첨가한 후 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 재조합 단백질을 생산하는 동물 세포의 배양 방법은 대두(soybean) 또는 효모(yeast) 추출 단백질을 산 또는 효소로 가수분해 처리하여 생성된 가수분해 산물이 3 g/L 내지 20 g/L 포함된 무혈청 배지에서 세포를 연속 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 의해, 세포의 사멸을 완화하면서 단백질의 분해속도를 최소 5배 이상 증가시켜, 재조합 단백질을 대량으로 제조할 수 있다.
동물 세포, 세포 배양, 재조합 단백질, 무혈청 배지
Description
도 1은 단백질 가수분해 물질이 첨가된 배지의 세포 성장도와 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 2는 단백질 가수분해 물질이 첨가된 배지의 단백질의 생산농도를 나타낸 그래프이다.
도 3은 단백질 가수분해 물질이 첨가된 배지를 이용한 회분식 배양시 세포 성장도와 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 4는 단백질 가수분해 물질이 첨가된 배지를 이용한 회분식 배양시 단백질 생산농도를 나타낸 그래프이다.
도 5는 단백질 가수분해 물질이 첨가된 배지를 이용한 연속배양시 세포 성장도와 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 6은 단백질 가수분해 물질이 첨가된 배지를 이용한 연속배양시 단백질 생산농도를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 재조합 단백질을 생산하는 동물 세포의 배양 방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 세포 성장용 배지로 무혈청 배지를 사용하여 세포를 충분히 성장시킨 후, 단백질 가수분해 물질[대두(soybean) 또는 효모(yeast) 추출 단백질을 산 또는 효소로 가수분해 처리하여 생성된 가수분해 산물]을 첨가하여 배양하여 세포의 사멸현상을 완화시키면서도, 단백질의 분비속도를 최소 5배 이상 증가시킬 수 있다.
지금까지 동물 세포를 배양하여 단백질 생산량을 높이기 위하여 많은 방법들이 사용되어 왔고, 그 방법은 크게 두 가지 범주로 나뉠 수 있다. 첫째는 생산성이 우수한 동물 세포주를 만드는 것이다. 동물세포와 같은 진핵세포를 숙주 세포로 사용하는 경우에는 재조합 대장균이나 재조합 효모를 숙주 세포로 사용할 때에 비하여 재조합 단백질의 발현량이 적은 단점이 있다. 이러한 단점을 극복하기 위하여 디하이드로폴레이트 환원효소(Dihydrofolate Reductase, dhfr), 글루타민 합성효소(Glutamine Synthetase, GS), 아데닌 탈아민효소(Adenine deaminase)와 같은 선별 마커(selection marker) 유전자를 이용한 유전자 증폭 방법이 사용되었다. 유전자 증폭은 세포 안의 유전자 수(copy number)를 크게 늘려 재조합 단백질의 발현 수준을 증가시키지만, 유전자 증폭이 지나칠 경우 발현은 되지만 세포 외부로 분비되는 속도가 떨어지며 완전한 전사 후 과정(post translational modification)이 이루어지지 않는 단점이 있었다(Martin Scholer et. al. Biotechnology and Bioengineering, 547-559, Vo. 53, No. 6, 1997).
두 번째 방법은 배양 조건의 최적화 방법이며, 이를 위해서 여러 가지 배양 변수들에 대한 연구가 진행되어 왔다. 배양 조건의 최적화에 대한 일차적인 목표는 가능한 고농도의 세포농도를 달성하는 것이고, 고농도의 세포 배양을 이루는데 가장 문제가 되는 것은 세포 성장에 필요한 영양분의 고갈이며 이는 무혈청 배지를 사용한 배양의 경우 더욱 민감하게 작용한다. 세포성장에 필요한 영양분을 공급하고 고농도 배양을 이루는 방법 중 가장 좋은 방법은 연속식 배양 방법이며, 이 때 연속 배양을 위한 세포 유지 장치로 스핀-필터(spin-filter)를 사용할 경우 2X107 세포수/ml 이상의 고농도 배양이 가능하다고 알려져 있다(Reuveny et. al. Journal of Immunological Methods, 86:61-69, 1985).
세포를 최대한 고농도로 배양한 후에는, 세포의 단백질 생산 속도를 증가시키기 위해 배양 변수를 조정한다. 일반적으로 배양 온도, pH, 용존 산소 및 삼투압을 조절하는 방법이 사용되고, 이와 함께 배양 배지에 새로운 첨가물을 더해주는 방법이 사용된다. 위의 방법들은 세포를 세포 주기상 G1 상태에 존재하는 세포의 비율을 증가시켜서 세포 성장을 둔화시키는 반면 단백질의 분비속도를 증가시키는 현상을 이용한 방법이다(Kaufmann H et. al. Biotechnology and Bioengineering, 63:573-582, (1999), Marc Cherlet et. al. Cytotechnology 29:71-84, (1999)). 배양 배지에 사용하는 첨가물로 현재까지 동물 세포 배양시 단백질의 발현 및 분비를 증가시키는데 가장 많이 사용된 것은 소디움 부티레이트(Sodium butyrate)이다. 소디움 부티레이트는 세포 핵 내부로 흡수되어 DNA와 히스톤 단백질의 결합을 약하게 하기 때문에, 히스톤 단백질의 아세틸화(acetylation)를 증가시키고 인산화(phospholylation)를 감소시켜서 세포가 G1 상태에 머물러 있도록 유도하여, 그 결과 세포의 재조합 단백질 생산 속도를 증가시킨다고 알려져 있다(Marc Cherlet et. al. Cytotechnology 32:17-29, (2000)).
그러나, 배양시 소디움 부티레이트를 첨가하면 재조합 단백질의 발현과 분비를 증가시킬 수는 있으나, 소디움 부티레이트의 첨가로 인하여 세포의 성장이 멈추고, 세포의 사멸이 유도되는 현상이 나타난다(Palermo. D.P. et. al, J.of Biotechnology, 19 35-48(1991), Chotigeat W., et. al., Cytotechnology, 15, 217-221(1994)). 세포 사멸 현상이 나타남에 따라 세포의 생존율이 급격히 저하되어 생산 배양 시간이 단축되며, 그 결과 연속 배양시 재조합 단백질의 총 생산량이 감소하는 단점이 있다.
단백질 가수분해 물질은 대두나 밀 혹은 효모 추출 단백질을 산을 이용하거나 효소적으로 가수분해한 물질로서, 식품 제조시(대한민국 특허출원 제1999-0031026호) 사용되거나 미생물 발효시(대한민국 특허출원 제1994-0011070호)에 중요한 질소원으로 사용되어 왔다. 동물 세포를 이용한 재조합 단백질 생산시에는 소태아 유래 혈청을 대체하기 위하여 인슐린 등 기타 성장인자 등과 함께 사용되어 왔으며(WO 96/26266), 더 나아가서는 무혈청 배지에서 동물유래 성분을 제거한 경우에도 중요 영양 성분으로 사용되어 왔다(WO 2004/005493). 그러나, 종래의 연구는 주로 세포의 성장에 중점을 두었으며, 재조합 단백질 생산에 사용되었다 하더라도 그 생산 속도가 혈청 사용시와 유사하거나 동등한 수준에 그쳤다(Xuejun Gu et. al. Biotechnology and Bioengineering, 56:353-360, (1997)).
이에 본 발명자들은 세포의 사멸을 최대한 억제하면서 재조합 단백질의 생산 시간을 연장시켜, 세포의 재조합 단백질 생산 속도를 증가시킬 수 있는 동물 세포 배양방법의 개발을 위하여 노력한 결과, 본 발명의 재조합 단백질을 생산하는 동물 세포의 배양 방법을 개발하게 되었다.
본 발명은 무혈청 배지에서 세포를 성장시키는 단계; 및 상기 무혈청 배지에 단백질 가수분해 물질[대두(soybean) 또는 효모(yeast) 추출 단백질을 산 또는 효소로 가수분해 처리하여 생성된 가수분해 산물]을 첨가하는 단계로 이루어지는 재조합 단백질을 생산하는 동물 세포의 배양 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 무혈청 배지에서 세포를 성장시키는 단계; 및 상기 무혈청 배지를 단백질 가수분해 물질[대두(soybean) 또는 효모(yeast) 추출 단백질을 산 또는 효소로 가수분해 처리하여 생성된 가수분해 산물]이 포함된 생산용 무혈청 배지로 교환하는 단계로 이루어지는 재조합 단백질을 생산하는 동물 세포의 배양 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 재조합 단백질을 생산하는 동물 세포의 배양 방법에 관한 것이다.
하나의 양태로서 본 발명은 세포 성장용 배지로 무혈청 배지를 사용하여 세포를 충분히 성장시킨 후, 단백질 가수분해 물질[대두(soybean) 또는 효모(yeast) 추출 단백질을 산 또는 효소로 가수분해 처리하여 생성된 가수분해 산물]을 배지에 첨가하는 연속교반식 생물반응기(Continuous stirred tank reactor)의 회분식 배양(batch culture)방법이다. 구체적으로, 본 발명은 재조합 단백질을 생산하는 동물 세포의 배양 방법으로서, 대두(soybean) 또는 효모(yeast) 추출 단백질을 산 또는 효소로 가수분해 처리하여 생성된 가수분해 산물을 준비하는 단계; 50% 이상의 산소 농도 및 7.2의 pH를 유지하면서 무혈청 배지에서 세포를 배양하는 단계; 및 세포 농도가 1.5×106 세포주/㎖에 도달시 3 g/L 내지 20 g/L의 양의 상기 가수분해 산물을 첨가한 후 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 대두(soybean) 또는 효모(yeast) 추출 단백질을 산 또는 효소로 가수분해 처리하여 생성된 가수분해 산물이 3 g/L 내지 20 g/L 포함된 무혈청 배지에서 세포를 연속 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 양태로서 본 발명은 세포 성장용 배지로 무혈청 배지를 사용하여 세포를 충분히 성장시킨 후, 단백질 가수분해 물질[대두(soybean) 또는 효모(yeast) 추출 단백질을 산 또는 효소로 가수분해 처리하여 생성된 가수분해 산물]이 포함된 생산용 무혈청 배지로 교환하는 연속교반식 생물반응기(Continuous stirred tank reactor)의 연속식 배양(Perfusion Culture)방법이다.
본 발명의 동물세포는 외래 단백질 생산을 위하여 유전자 조작이 가능한 동물세포로 이용될 수 있는 모든 동물 세포를 포함하는데, 본 발명의 동물세포 배양방법에서 사용되는 동물세포로는 차이니즈 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, 이하 ‘CHO'라 약칭함)가 바람직하다.
본 발명의 재조합 단백질은 인간의 치료 및 진단용 의약품에 이용될 수 있는 모든 단백질이며, 바람직하게는 당쇄를 가지고 분비되는 단백질이 사용될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 인터페론-베타(interferon-β), 에리스로포이에틴(erithropoietin, EPO), 또는 혈액응고 제8인자(antihemophilic factor, Factor Ⅷ)등이 바람직하게 사용될 수 있다.
본 발명의 무혈청 생산배지는 CHO-SFM-SGM1(대한민국 특허출원번호 10-2003-0099633)을 포함하여, 시그마(Sigma, 미국)사의 CHO PF 배지나 하이클론(Hyclone, 미국)사의 SFM4CHO 배지 등 이미 상업적으로 공지된 무혈청 배지는 어떠한 것이라도 사용될 수 있다.
이하 하기의 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명의 범위가 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 내지 3 및 비교예 1 내지 3. 세포농도, 생존율, 재조합 단백질의 분비 측정
인터페론 베타를 생산하도록 형질전환된 CHO세포를 α-MEM(Gibco사) 배지에 10%의 소태아 혈청(FBS, Hyclone사)이 포함된 배지를 사용하여 175mm2 T-flask에 접종, 37℃, 5% CO2 배양기에서 약 2일간 배양하였다. 세포가 충분히 자라 약 2X107 세포수에 이르렀을 때 배양액을 제거하고 PBS용액으로 세척한 후 0.1% 트립신 용액으로 플라스크에 부착된 세포를 떼어낸 후 CHO-SFM-SGM1 배지가 든 삼각 플라스크에 접종하여 무혈청 부유배양을 실시하였다. 약 5X105 세포주/ml 접종하여 2일간 배양하였다. 2일간 배양 후 세포 농도가 1.5X106 세포주/ml 이상에 도달 한 후 배양액에 단백질 가수분해 물질이 5g/L 농도가 되도록 첨가하여 2일간 추가 배양하였고(실시예 1), 아무것도 첨가하지 않거나(비교예 1-1) 소디움 부티레이트(sodium uate) 1mM을 첨가(비교예 1-2)하는 것 이외에는 동일하게 수행하였다.
에리스로포이에틴 및 혈액응고 제8인자를 생산하도록 형질전환된 CHO세포도 상기와 동일한 방법으로 배양하였다(실시예 2 및 3 비교예 2-1,2-2 및 3-1,3-2).
단백질 가수분해 물질[대두(soybean) 또는 효모(yeast) 추출 단백질을 산 또는 효소로 가수분해 처리하여 생성된 가수분해 산물]이 첨가된 배양액(실시예 1)에서는 아무것도 첨가하지 않은 경우(비교예1-1)과 유사하게 세포가 자라는 것을 볼 수 있었으며, 배양 종료 시점까지 세포 생존율이 유지된 반면, 소디움 부티레이트를 첨가한 경우(비교예 1-2)에는 세포 성장이 저하되고 생존율이 점차 하락하였다(도 1).
인터페론 베타를 생산하는 세포주를 사용한 경우 아무것도 첨가하지 않은 경우에 비하여 단백질 분비 속도는 약 6배 증가하였고, 소디움 부틸레이트를 첨가한 경우와 비교할 경우에도 약 2배 증가하였다(표 1 및 도 2). 에리스포포이에틴을 생산하는 세포주를 사용한 경우 아무것도 첨가하지 않은 경우에 비하여 단백질 생산량에서 약 6배 증가하였고, 소디움 부티레이트를 첨가한 경우와 비교할 경우에도 약 3배 증가하였다. 또한, 혈액응고 제8인자를 생산하는 세포주를 사용한 아무것도 첨가하지 않은 경우에 비하여 단백질 생산량에서 약 5배 증가하였고, 소디움 부티레이트를 첨가한 경우에 비하여 약 2.5배 증가하였다 (표 1).
| 세포농도(106/ml) | 단백질 농도 | |
| 실시예 1 | 3.05 | 14.9(ug/ml) |
| 실시예 2 | 3.20 | 76.5(ug/ml) |
| 실시예 3 | 3.11 | 12.8(IU/ml) |
| 비교예 1-1 | 2.96 | 2.3(ug/ml) |
| 비교예 1-2 | 1.65 | 7.2(ug/ml) |
| 비교예 2-1 | 2.75 | 12.7(ug/ml) |
| 비교예 2-2 | 1.89 | 26.1(ug/ml) |
| 비교예 3-1 | 2.89 | 2.4(IU/ml) |
| 비교예 3-2 | 1.91 | 5.2(IU/ml) |
실시예 4. 배양기 이용한 회분식 배양
7.5리터 배양기(Celligen plus, NBS사)에서 회분식 배양을 실시하였다. 인터페론 베타를 생산하도록 형질전환된 CHO세포를 α-MEM(Gibco사) 배지에 10%의 소태아 혈청(FBS, Hyclone사)이 포함된 배지를 사용하여 T-flask에 접종, 37℃, 5% CO2 배양기에서 약 2일간 배양하였다. 세포가 충분히 자라 약 2X107세포수. T-175에 이르렀을 때 배양액을 제거하고 PBS용액으로 세척한 후 0.1% 트립신 용액으로 플라스크에 부착된 세포를 떼어내어 CHO-SFM-SGM1(-) 배지 100ml이 든 250ml 스피너 플라스크(spinner flask)에 접종하여 무혈청 부유배양을 실시하였다.
약 5X105세포주/ml 접종하여 2일간 배양한 후 약 1.5X106 세포주/ml 농도에서 CHO-SFM-SGM1 배지 400ml이 든 1리터 스피너 플라스크로 전량 이송 배양하였다. 1리터 플라스크 2개를 3일간 배양하여 약 1.2X106 세포주/ml 농도에서 배양액 전량을 CHO-SFM-SGM1 배지 2.5리터가 들어 있는 배양기에 전량 이송 배양기 가동을 실시하였다. 배양은 37℃로 실시하였고 공기와 산소의 주입으로 50% 이상의 용존산소 농도를 유지하고 중탄산나트륨(sodium bicarbonate)와 이산화탄소 가스의 주입으로 pH를 7.2로 유지하면서 배양하였다. 배양 3일차에 세포농도가 1.5X106세포주/ml 도달 시 단백질 가수분해 물질[대두(soybean) 또는 효모(yeast) 추출 단백질을 산 또는 효소로 가수분해 처리하여 생성된 가수분해 산물]을 주입하여 9일차까지 배양하였고(실시예 4), CHO-SFM-SGM1 배지로 끝까지 배양하거나(비교예 4-1) 배양 3일차에 소디움 부티레이트를 첨가하였다(비교예 4-2).
단백질 가부분해 물질[대두(soybean) 또는 효모(yeast) 추출 단백질을 산 또는 효소로 가수분해 처리하여 생성된 가수분해 산물]을 첨가한 경우는 아무것도 첨가하지 않은 경우와 세포 성장도 및 생존율은 유사하였고, 소디움 부티레이트를 첨가한 경우에는 세포 성장 저하 및 생존율 하락 현상이 관찰되었다(도 3). 또한, 단백질 가수분해 물질[대두(soybean) 또는 효모(yeast) 추출 단백질을 산 또는 효소로 가수분해 처리하여 생성된 가수분해 산물]을 첨가한 경우, 아무것도 첨가하지 않은 경우에 비하여 첨가 시점부터 큰 폭으로 단백질 생산 농도가 증가하여 최종적으로 약 10배의 상승을 가져왔고, 소디움 부티레이트를 첨가한 경우에 비하여서도 약 2배 증가하였다(도 4).
실시예 5. 배양기 이용한 연속 배양
15㎛ 의 메쉬(mesh) 크기를 갖는 스핀-필터가 장착된 7.5리터 배양기(Celligen plus, NBS사)에서 연속식 배양을 실시하였다. 상기 실시예 4에서 실시된 방법으로 회분식 배양을 실시하여 세포 농도가 1.5X106세포주/ml 도달시 배지교환식 연속배양을 실시하였다. 최초 세포성장용 교환배지는 CHO-SFM-SGM1 배지 또는 시판중인 상업화배지를 사용하였으며 배지교환 비율을 하루에 배양액 부피대비 0.5 ~ 4배의 속도로 교환하여 세포농도를 7X106세포주/ml 까지 성장시킨 후 생산배지로 교체하여 배지교환을 하면서 연속배양을 실시, 단백질을 생산하였다. 생산용 교환배지로는 단백질 가수 분해 물질[대두(soybean) 또는 효모(yeast) 추출 단백질을 산 또는 효소로 가수분해 처리하여 생성된 가수분해 산물]이 5g/L 첨가된 CHO-SFM-SGM1배지(실시예 5) 또는 아무것도 첨가되지 않거나(비교예 5-1) 소디움 부티레이트가 1mM 첨가된(비교예 5-2) 배지를 사용하였다.
단백질 가수 분해 물질[대두(soybean) 또는 효모(yeast) 추출 단백질을 산 또는 효소로 가수분해 처리하여 생성된 가수분해 산물]이 5g/L 첨가된 CHO-SFM-SGM1배지의 경우는 최대 세포 농도 약 20X106 세포주/ml까지 배양 중 지속적으로 성장하였다. 즉, 생산배지에 아무것도 첨가하지 않은 경우보다 약 10% 높았으며, 소디움 부티레이트를 첨가한 경우보다 약 2.5배 높았다. 또한, 소디움 부티레이트를 첨가한 경우는 8X106세포주/ml 도달 후 생존율이 급격히 떨어지는 데 반하여, 단백질 가수분해 물질[대두(soybean) 또는 효모(yeast) 추출 단백질을 산 또는 효소로 가수분해 처리하여 생성된 가수분해 산물]을 첨가하거나 아무것도 첨가하지 않은 경우는 배양 종료 시까지 90% 이상의 생존율을 유지하였다(도 5).
단백질 가수분해 물질[대두(soybean) 또는 효모(yeast) 추출 단백질을 산 또는 효소로 가수분해 처리하여 생성된 가수분해 산물]을 첨가한 경우는 생산배양기 동안 단백질 농도가 최대 약 40㎍/ml로 아무것도 첨가하지 않은 경우에 비하여 10 배 증가하였으며, 소디움 부티레이트를 첨가한 경우에 비하여서도 약 2.5 ~ 3배 증가하였다(도 6).
이상에서 설명한 바와 같이 본 발명의 재조합 단백질을 생산하는 동물 세포의 배양 방법은 무혈청 배지에 단백질 가수분해 물질[대두(soybean) 또는 효모(yeast) 추출 단백질을 산 또는 효소로 가수분해 처리하여 생성된 가수분해 산물]을 첨가하여 배양하여 세포의 사멸 현상을 완화시키면서도, 단백질의 분비속도를 최소 5배 이상 증가시킬 수 있는 효과가 있다.
Claims (5)
- 재조합 단백질을 생산하는 동물 세포의 배양 방법으로서,대두(soybean) 또는 효모(yeast) 추출 단백질을 산 또는 효소로 가수분해 처리하여 생성된 가수분해 산물을 준비하는 단계;50% 이상의 산소 농도 및 7.2의 pH를 유지하면서 무혈청 배지에서 세포를 배양하는 단계; 및세포 농도가 1.5×106 세포주/㎖에 도달시 3 g/L 내지 20 g/L의 양의 상기 가수분해 산물을 첨가한 후 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서,대두(soybean) 또는 효모(yeast) 추출 단백질을 산 또는 효소로 가수분해 처리하여 생성된 가수분해 산물이 3 g/L 내지 20 g/L 포함된 무혈청 배지에서 세포를 연속 배양하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,재조합 단백질은 인터페론 베타(inteferon-β), 에리스로포이에틴 (erithropoietin, EPO) 및 혈액응고 제8인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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