CN113502258B - 一种由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法 - Google Patents
一种由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113502258B CN113502258B CN202110777227.7A CN202110777227A CN113502258B CN 113502258 B CN113502258 B CN 113502258B CN 202110777227 A CN202110777227 A CN 202110777227A CN 113502258 B CN113502258 B CN 113502258B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- culture
- cells
- culture solution
- medium
- oxygen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 113
- 239000002243 precursor Substances 0.000 title claims abstract description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 36
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 title claims abstract description 29
- 210000002237 B-cell of pancreatic islet Anatomy 0.000 title description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 66
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 55
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 claims abstract description 37
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 23
- 210000004039 endoderm cell Anatomy 0.000 claims abstract description 19
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 76
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 76
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 76
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 54
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 47
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 47
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 41
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 39
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 claims description 25
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 17
- 108010023082 activin A Proteins 0.000 claims description 17
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 17
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims description 16
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims description 16
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims description 16
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 claims description 14
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 10
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 8
- 101000669917 Homo sapiens Rho-associated protein kinase 1 Proteins 0.000 claims description 8
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims description 8
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 8
- 102100039313 Rho-associated protein kinase 1 Human genes 0.000 claims description 8
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 claims description 8
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 claims description 8
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 claims description 8
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 8
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 claims description 8
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 8
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims description 8
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 claims description 8
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 6
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 abstract description 4
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 15
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 8
- 230000005913 Notch signaling pathway Effects 0.000 description 7
- 229940122531 Anaplastic lymphoma kinase inhibitor Drugs 0.000 description 6
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 5
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 4
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 3
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 13-cis retinol Natural products OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000709687 Coxsackievirus Species 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 description 1
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 description 1
- 108010001127 Insulin Receptor Proteins 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000711386 Mumps virus Species 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 101710183548 Pyridoxal 5'-phosphate synthase subunit PdxS Proteins 0.000 description 1
- 102100035459 Pyruvate dehydrogenase protein X component, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 241000710799 Rubella virus Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009693 chronic damage Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 235000012631 food intake Nutrition 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000037081 physical activity Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 229960003471 retinol Drugs 0.000 description 1
- 235000020944 retinol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011607 retinol Substances 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0676—Pancreatic cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/34—Sugars
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/38—Vitamins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/40—Regulators of development
- C12N2501/42—Notch; Delta; Jagged; Serrate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
- C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
- C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
Landscapes
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法，涉及干细胞分化在医疗中的应用技术领域，包括以下步骤：将人多能干细胞制备为多功能细胞球；培养所得多功能细胞球，使其定向分化为定型内胚层细胞；培养所得定型内胚层细胞，诱导其分化为胰腺前体细胞；培养所得胰腺前体细胞诱导其分化为胰岛β细胞。本发明通过调整各步骤培养液组分，使试验过程和结果都更加稳定，培养液更简单、成本低、易保存；单次试验结果之间差异性更小、产量更高。所得细胞质量也更加均匀、细胞性能更好。从胰腺前体细胞诱导分化为胰岛β细胞基本可以看做一步培养，在保证细胞实现有效的定向分化的前提下，节约了大量的培养时间及培养基。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞分化在医疗中的应用技术领域，具体涉及一种由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法。
背景技术
糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。
1型或2型糖尿病均存在明显的遗传异质性。糖尿病存在家族发病倾向，1/4-1/2患者有糖尿病家族史。临床上至少有60种以上的遗传综合征可伴有糖尿病。1型糖尿病有多个DNA位点参与发病，其中以HLA抗原基因中DQ位点多态性关系最为密切。在2型糖尿病已发现多种明确的基因突变，如胰岛素基因、胰岛素受体基因、葡萄糖激酶基因、线粒体基因等。进食过多，体力活动减少导致的肥胖是2型糖尿病最主要的环境因素，使具有2型糖尿病遗传易感性的个体容易发病。1型糖尿病患者存在免疫系统异常，在某些病毒如柯萨奇病毒，风疹病毒，腮腺病毒等感染后导致自身免疫反应，破坏胰岛素β细胞。
胰岛移植是本世纪兴起的从根本上治疗糖尿病的方法，但前期主要利用胰岛分离后移植，再结合适宜的免疫抑制方案，这类方案极度依赖供体，因此不能实现大规模应用。干细胞分化近年在医疗领域的应用逐渐受到人们的重视和初步开发，也有研究开始将目光投向通过干细胞分化制备胰岛细胞，但目前研究的方法均具有重复性差、产量低等问题，无法实现实验室外的应用，更无法广泛推广到临床应用。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种稳定、重复性好的，单次试验产量高的新的由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法，方案如下：
一种由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法，包括以下步骤：
S1、将人多能干细胞制备为多功能细胞球；
S2、使用培养液2培养所得多功能细胞球，使其定向分化为定型内胚层细胞；
S3、使用培养液3培养所得定型内胚层细胞，诱导其分化为胰腺前体细胞；
S4、使用培养液4培养所得胰腺前体细胞诱导其分化为胰岛β细胞。
S1所述人多能干细胞为贴壁培养的人多能干细胞。
优选地，S1所述制备步骤包括：将贴壁培养的人多功能干细胞消化成细胞小块，使用培养液1重悬后，接种于超低吸附六孔板，进行一阶段培养后，得到规则的细胞小球，然后进行3D悬浮培养，得到多功能细胞球。
优选地，S1所述培养液1为包括ROCK1抑制剂的mTeSR-1完全培养液；接种密度为0.5-1.0×106/cm2。
优选地，S1所述一阶段培养，包括：在37℃、5％氧气条件下静置培养10-18h；在37℃、5％氧气条件下振荡培养3-5h，所述振荡培养，条件为80-100rpm；在37℃、5％氧气条件下振荡培养10-15h，所述振荡培养，条件为50-70rpm；在37℃、5％氧气条件下振荡培养10-15h，所述振荡培养，条件为10-40rpm。
优选地，S1所述3D悬浮培养，培养时间为2-3天。
优选地，S2所述培养液2包括：DMEM培养基、F12培养基、1.0g/L碳酸氢钠、0.2％人血清白蛋白(HSA)、1％青霉素、1％链霉素、100ng/ml重组人激活素-A(Activin A)、50ng/mLTGF-β因子。
优选地，S2所述培养液2中，IMDM培养基和F12培养基体积比为1:1。
优选地，S2所述培养包括：在37℃、5％氧气条件下静置培养3-8h；在37℃、5％氧气条件下振荡培养3-5h，所述振荡培养，条件为30-40rpm；重复上述操作，直到培养总时长达到4天，全程中每隔一天更换一次培养液。
优选地，S3所述培养液3包括：IMDM培养基、F12培养基、1.0g/L碳酸氢钠、0.2％人血清白蛋白(HSA)、0.5mM视黄酸、1×谷氨酰胺(GlutaMAX)、10mM葡萄糖、0.25M的维生素C、40μMSirt1抑制剂、20ng/mLEGF信号因子。
优选地，S3所述培养液3中，IMDM培养基和F12培养基体积比为1:5。
优选地，S3所述培养包括：在37℃、5％氧气条件下静置培养10-15h；在37℃、5％氧气条件下振荡培养1-3h，所述振荡培养，条件为10-25rpm；重复上述操作，直到培养总时长达到5天，全程中每隔一天更换一次培养液。
优选地，S4所述培养液4包括：IMDM培养基、F12培养基、1.0g/L碳酸氢钠、0.2％人血清白蛋白(HSA)、1×谷氨酰胺(GlutaMAX)、10mM葡萄糖、2μMALK抑制剂(K02288)、10μMYO-01027(Notch信号通路抑制剂)。
优选地，S4所述培养液4中，IMDM培养基和F12培养基体积比为1:5。
优选地，S4所述培养包括：在37℃、5％氧气条件下静置培养3-8h；在37℃、5％氧气条件下振荡培养3-5h，所述振荡培养，条件为10-40rpm；重复上述操作，直到培养总时长达到4天，全程中每隔一天更换一次培养液；向培养液中添加终浓度10μM的Repsox(ALK5抑制剂)和终浓度2μM的R428(Axl抑制剂)，继续在37℃、5％氧气条件下静置培养2.5天。
有益效果
本发明的有益效果在于：
本发明在S1步骤中的一阶段培养中加入特定的培养步骤，能够获得更加适用于本发明后续步骤的多功能细胞球，追求的并非细胞球的尺寸、形状等表象表征参数，而是更加适用于本发明后续的定向分化，能够使分化更加顺利、重复性更高。
本发明在诱导定向分化步骤中采用的培养液中仍含有传统的重组人激活素-A(Activin A)和视黄醇酸，但通过调整各步骤培养液的组分，获得了使试验过程和结果都更加稳定的适用于本发明的培养液，且培养液较同用途的现有培养基配方及制备方法均简单、成本低、易保存；另外通过不断优化，获得了能够使单次试验结果之间差异性更小、产量更高的培养方法。所得细胞质量也更加均匀、细胞性能更好。
本发明S4从胰腺前体细胞诱导分化为胰岛β细胞基本可以看做一步培养，在保证细胞实现有效的定向分化的前提下，节约了大量的培养时间及培养基。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
除非特别指出，以下实施例和对比例为平行试验，采用同样的处理步骤和参数。
实施例1：由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞：
S1、将人多能干细胞制备为多功能细胞球；
S2、使用培养液2培养所得多功能细胞球，使其定向分化为定型内胚层细胞；
S3、使用培养液3培养所得定型内胚层细胞，诱导其分化为胰腺前体细胞；
S4、使用培养液4培养所得胰腺前体细胞诱导其分化为胰岛β细胞。
S1所述人多能干细胞为贴壁培养的人多能干细胞。
S1所述制备步骤包括：将贴壁培养的人多功能干细胞消化成细胞小块，使用培养液1重悬后，接种于超低吸附六孔板，进行一阶段培养后，得到规则的细胞小球，然后进行3D悬浮培养，得到多功能细胞球。
S1所述培养液1为包括ROCK1抑制剂的mTeSR-1完全培养液；接种密度为0.5×106/cm2。
S1所述一阶段培养，包括：在37℃、5％氧气条件下静置培养10h；在37℃、5％氧气条件下振荡培养3h，所述振荡培养，条件为800rpm；在37℃、5％氧气条件下振荡培养10h，所述振荡培养，条件为50rpm；在37℃、5％氧气条件下振荡培养10h，所述振荡培养，条件为100rpm。
S1所述3D悬浮培养，培养时间为2天。
S2所述培养液2包括：DMEM培养基、F12培养基、1.0g/L碳酸氢钠、0.2％人血清白蛋白(HSA)、1％青霉素、1％链霉素、100ng/ml重组人激活素-A(Activin A)、50ng/mLTGF-β因子。
S2所述培养液2中，IMDM培养基和F12培养基体积比为1:1。
S2所述培养包括：在37℃、5％氧气条件下静置培养3h；在37℃、5％氧气条件下振荡培养3h，所述振荡培养，条件为30rpm；重复上述操作，直到培养总时长达到4天，全程中每隔一天更换一次培养液。
S3所述培养液3包括：IMDM培养基、F12培养基、1.0g/L碳酸氢钠、0.2％人血清白蛋白(HSA)、0.5mM视黄酸、1×谷氨酰胺(GlutaMAX)、10mM葡萄糖、0.25M的维生素C、40μMSirt1抑制剂、20ng/mLEGF信号因子。
S3所述培养液3中，IMDM培养基和F12培养基体积比为1:5。
S3所述培养包括：在37℃、5％氧气条件下静置培养10h；在37℃、5％氧气条件下振荡培养1h，所述振荡培养，条件为10rpm；重复上述操作，直到培养总时长达到5天，全程中每隔一天更换一次培养液。
S4所述培养液4包括：IMDM培养基、F12培养基、1.0g/L碳酸氢钠、0.2％人血清白蛋白(HSA)、1×谷氨酰胺(GlutaMAX)、10mM葡萄糖、2μM ALK抑制剂(K02288)、10μM YO-01027(Notch信号通路抑制剂)。
S4所述培养液4中，IMDM培养基和F12培养基体积比为1:5。
S4所述培养包括：在37℃、5％氧气条件下静置培养3h；在37℃、5％氧气条件下振荡培养3h，所述振荡培养，条件为10rpm；重复上述操作，直到培养总时长达到4天，全程中每隔一天更换一次培养液；向培养液中添加终浓度10μM的Repsox(ALK5抑制剂)和终浓度2μM的R428(Axl抑制剂)，继续在37℃、5％氧气条件下静置培养2.5天。
实施例2：由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞：
S1、将人多能干细胞制备为多功能细胞球；
S2、使用培养液2培养所得多功能细胞球，使其定向分化为定型内胚层细胞；
S3、使用培养液3培养所得定型内胚层细胞，诱导其分化为胰腺前体细胞；
S4、使用培养液4培养所得胰腺前体细胞诱导其分化为胰岛β细胞。
S1所述人多能干细胞为贴壁培养的人多能干细胞。
S1所述制备步骤包括：将贴壁培养的人多功能干细胞消化成细胞小块，使用培养液1重悬后，接种于超低吸附六孔板，进行一阶段培养后，得到规则的细胞小球，然后进行3D悬浮培养，得到多功能细胞球。
S1所述培养液1为包括ROCK1抑制剂的mTeSR-1完全培养液；接种密度为1.0×106/cm2。
S1所述一阶段培养，包括：在37℃、5％氧气条件下静置培养18h；在37℃、5％氧气条件下振荡培养5h，所述振荡培养，条件为100rpm；在37℃、5％氧气条件下振荡培养15h，所述振荡培养，条件为70rpm；在37℃、5％氧气条件下振荡培养15h，所述振荡培养，条件为40rpm。
S1所述3D悬浮培养，培养时间为3天。
S2所述培养液2包括：DMEM培养基、F12培养基、1.0g/L碳酸氢钠、0.2％人血清白蛋白(HSA)、1％青霉素、1％链霉素、100ng/ml重组人激活素-A(Activin A)、50ng/mLTGF-β因子。
S2所述培养液2中，IMDM培养基和F12培养基体积比为1:1。
S2所述培养包括：在37℃、5％氧气条件下静置培养8h；在37℃、5％氧气条件下振荡培养5h，所述振荡培养，条件为40rpm；重复上述操作，直到培养总时长达到4天，全程中每隔一天更换一次培养液。
S3所述培养液3包括：IMDM培养基、F12培养基、1.0g/L碳酸氢钠、0.2％人血清白蛋白(HSA)、0.5mM视黄酸、1×谷氨酰胺(GlutaMAX)、10mM葡萄糖、0.25M的维生素C、40μMSirt1抑制剂、20ng/mLEGF信号因子。
S3所述培养液3中，IMDM培养基和F12培养基体积比为1:5。
S3所述培养包括：在37℃、5％氧气条件下静置培养15h；在37℃、5％氧气条件下振荡培养3h，所述振荡培养，条件为25rpm；重复上述操作，直到培养总时长达到5天，全程中每隔一天更换一次培养液。
S4所述培养液4包括：IMDM培养基、F12培养基、1.0g/L碳酸氢钠、0.2％人血清白蛋白(HSA)、1×谷氨酰胺(GlutaMAX)、10mM葡萄糖、2μM ALK抑制剂(K02288)、10μM YO-01027(Notch信号通路抑制剂)。
S4所述培养液4中，IMDM培养基和F12培养基体积比为1:5。
S4所述培养包括：在37℃、5％氧气条件下静置培养8h；在37℃、5％氧气条件下振荡培养5h，所述振荡培养，条件为40rpm；重复上述操作，直到培养总时长达到4天，全程中每隔一天更换一次培养液；向培养液中添加终浓度10μM的Repsox(ALK5抑制剂)和终浓度2μM的R428(Axl抑制剂)，继续在37℃、5％氧气条件下静置培养2.5天。
实施例3：由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞：
S1、将人多能干细胞制备为多功能细胞球；
S2、使用培养液2培养所得多功能细胞球，使其定向分化为定型内胚层细胞；
S3、使用培养液3培养所得定型内胚层细胞，诱导其分化为胰腺前体细胞；
S4、使用培养液4培养所得胰腺前体细胞诱导其分化为胰岛β细胞。
S1所述人多能干细胞为贴壁培养的人多能干细胞。
S1所述制备步骤包括：将贴壁培养的人多功能干细胞消化成细胞小块，使用培养液1重悬后，接种于超低吸附六孔板，进行一阶段培养后，得到规则的细胞小球，然后进行3D悬浮培养，得到多功能细胞球。
S1所述培养液1为包括ROCK1抑制剂的mTeSR-1完全培养液；接种密度为0.5-1.0×106/cm2。
S1所述一阶段培养，包括：在37℃、5％氧气条件下静置培养15h；在37℃、5％氧气条件下振荡培养4h，所述振荡培养，条件为90rpm；在37℃、5％氧气条件下振荡培养13h，所述振荡培养，条件为60rpm；在37℃、5％氧气条件下振荡培养13h，所述振荡培养，条件为30rpm。
S1所述3D悬浮培养，培养时间为3天。
S2所述培养液2包括：DMEM培养基、F12培养基、1.0g/L碳酸氢钠、0.2％人血清白蛋白(HSA)、1％青霉素、1％链霉素、100ng/ml重组人激活素-A(Activin A)、50ng/mLTGF-β因子。
S2所述培养液2中，IMDM培养基和F12培养基体积比为1:1。
S2所述培养包括：在37℃、5％氧气条件下静置培养5h；在37℃、5％氧气条件下振荡培养4h，所述振荡培养，条件为35rpm；重复上述操作，直到培养总时长达到4天，全程中每隔一天更换一次培养液。
S3所述培养液3包括：IMDM培养基、F12培养基、1.0g/L碳酸氢钠、0.2％人血清白蛋白(HSA)、0.5mM视黄酸、1×谷氨酰胺(GlutaMAX)、10mM葡萄糖、0.25M的维生素C、40μMSirt1抑制剂、20ng/mLEGF信号因子。
S3所述培养液3中，IMDM培养基和F12培养基体积比为1:5。
S3所述培养包括：在37℃、5％氧气条件下静置培养13h；在37℃、5％氧气条件下振荡培养2h，所述振荡培养，条件为20rpm；重复上述操作，直到培养总时长达到5天，全程中每隔一天更换一次培养液。
S4所述培养液4包括：IMDM培养基、F12培养基、1.0g/L碳酸氢钠、0.2％人血清白蛋白(HSA)、1×谷氨酰胺(GlutaMAX)、10mM葡萄糖、2μM ALK抑制剂(K02288)、10μM YO-01027(Notch信号通路抑制剂)。
S4所述培养液4中，IMDM培养基和F12培养基体积比为1:5。
S4所述培养包括：在37℃、5％氧气条件下静置培养5h；在37℃、5％氧气条件下振荡培养4h，所述振荡培养，条件为30rpm；重复上述操作，直到培养总时长达到4天，全程中每隔一天更换一次培养液；向培养液中添加终浓度10μM的Repsox(ALK5抑制剂)和终浓度2μM的R428(Axl抑制剂)，继续在37℃、5％氧气条件下静置培养2.5天。
对比例1由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞：
S1、将人多能干细胞制备为多功能细胞球；
S2、使用培养液2培养所得多功能细胞球，使其定向分化为定型内胚层细胞；
S3、使用培养液3培养所得定型内胚层细胞，诱导其分化为胰腺前体细胞；
S4、使用培养液4培养所得胰腺前体细胞诱导其分化为胰岛β细胞。
S1所述人多能干细胞为贴壁培养的人多能干细胞。
S1所述制备步骤包括：将贴壁培养的人多功能干细胞消化成细胞小块，使用培养液1重悬后，接种于超低吸附六孔板，进行一阶段培养后，得到规则的细胞小球，然后进行3D悬浮培养，得到多功能细胞球。
S1所述培养液1为包括ROCK1抑制剂的mTeSR-1完全培养液；接种密度为0.5-1.0×106/cm2。
S1所述一阶段培养，包括：在37℃、5％氧气条件下静置培养24h。
S1所述3D悬浮培养，培养时间为3天。
S2所述培养液2包括：DMEM培养基、F12培养基、1.0g/L碳酸氢钠、0.2％人血清白蛋白(HSA)、1％青霉素、1％链霉素、100ng/ml重组人激活素-A(Activin A)、50ng/mLTGF-β因子。
S2所述培养液2中，IMDM培养基和F12培养基体积比为1:1。
S2所述培养包括：在37℃、5％氧气条件下静置培养4天，全程中每隔一天更换一次培养液。
S3所述培养液3包括：IMDM培养基、F12培养基、1.0g/L碳酸氢钠、0.2％人血清白蛋白(HSA)、0.5mM视黄酸、1×谷氨酰胺(GlutaMAX)、10mM葡萄糖、0.25M的维生素C、40μMSirt1抑制剂、20ng/mLEGF信号因子。
S3所述培养液3中，IMDM培养基和F12培养基体积比为1:5。
S3所述培养包括：在37℃、5％氧气条件下静置培养5天，全程中每隔一天更换一次培养液。
S4所述培养液4包括：IMDM培养基、F12培养基、1.0g/L碳酸氢钠、0.2％人血清白蛋白(HSA)、1×谷氨酰胺(GlutaMAX)、10mM葡萄糖、2μM ALK抑制剂(K02288)、10μM YO-01027(Notch信号通路抑制剂)。
S4所述培养液4中，IMDM培养基和F12培养基体积比为1:5。
S4所述培养包括：在37℃、5％氧气条件下静置培养4天，全程中每隔一天更换一次培养液；向培养液中添加终浓度10μM的Repsox(ALK5抑制剂)和终浓度2μM的R428(Axl抑制剂)，继续在37℃、5％氧气条件下静置培养2.5天。
对比例2由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞：
S1、将人多能干细胞制备为多功能细胞球；
S2、使用培养液2培养所得多功能细胞球，使其定向分化为定型内胚层细胞；
S3、使用培养液3培养所得定型内胚层细胞，诱导其分化为胰腺前体细胞；
S4、使用培养液4培养所得胰腺前体细胞诱导其分化为胰岛β细胞。
S1所述人多能干细胞为贴壁培养的人多能干细胞。
S1所述制备步骤包括：将贴壁培养的人多功能干细胞消化成细胞小块，使用培养液1重悬后，接种于超低吸附六孔板，进行一阶段培养后，得到规则的细胞小球，然后进行3D悬浮培养，得到多功能细胞球。
S1所述培养液1为包括ROCK1抑制剂的mTeSR-1完全培养液；接种密度为0.5-1.0×106/cm2。
S1所述一阶段培养，包括：在37℃、5％氧气条件下振荡培养24h，所述振荡培养，条件为60rpm。
S1所述3D悬浮培养，培养时间为3天。
S2所述培养液2包括：DMEM培养基、F12培养基、1.0g/L碳酸氢钠、0.2％人血清白蛋白(HSA)、1％青霉素、1％链霉素、100ng/ml重组人激活素-A(Activin A)、50ng/mLTGF-β因子。
S2所述培养液2中，IMDM培养基和F12培养基体积比为1:1。
S2所述培养包括：在37℃、5％氧气条件下振荡培养4天，所述振荡培养，条件为35rpm，全程中每隔一天更换一次培养液。
S3所述培养液3包括：IMDM培养基、F12培养基、1.0g/L碳酸氢钠、0.2％人血清白蛋白(HSA)、0.5mM视黄酸、1×谷氨酰胺(GlutaMAX)、10mM葡萄糖、0.25M的维生素C、40μMSirt1抑制剂、20ng/mLEGF信号因子。
S3所述培养液3中，IMDM培养基和F12培养基体积比为1:5。
S3所述培养包括：在37℃、5％氧气条件下振荡培养5天，所述振荡培养，条件为20rpm，全程中每隔一天更换一次培养液。
S4所述培养液4包括：IMDM培养基、F12培养基、1.0g/L碳酸氢钠、0.2％人血清白蛋白(HSA)、1×谷氨酰胺(GlutaMAX)、10mM葡萄糖、2μM ALK抑制剂(K02288)、10μM YO-01027(Notch信号通路抑制剂)。
S4所述培养液4中，IMDM培养基和F12培养基体积比为1:5。
S4所述培养包括：在37℃、5％氧气条件下振荡培养4天，所述振荡培养，条件为30rpm，全程中每隔一天更换一次培养液；向培养液中添加终浓度10μM的Repsox(ALK5抑制剂)和终浓度2μM的R428(Axl抑制剂)，继续在37℃、5％氧气条件下静置培养2.5天。
对比例3由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞：
S1、将人多能干细胞制备为多功能细胞球；
S2、使用培养液2培养所得多功能细胞球，使其定向分化为定型内胚层细胞；
S3、使用培养液3培养所得定型内胚层细胞，诱导其分化为胰腺前体细胞；
S4、使用培养液4培养所得胰腺前体细胞；用培养液5培养所得细胞，最终诱导其分化为胰岛β细胞。
S1所述人多能干细胞为贴壁培养的人多能干细胞。
S1所述制备步骤包括：将贴壁培养的人多功能干细胞消化成细胞小块，使用培养液1重悬后，接种于超低吸附六孔板，进行一阶段培养后，得到规则的细胞小球，然后进行3D悬浮培养，得到多功能细胞球。
S1所述培养液1为包括ROCK1抑制剂的mTeSR-1完全培养液；接种密度为0.5-1.0×106/cm2。
S1所述一阶段培养，包括：在37℃、5％氧气条件下静置培养15h；在37℃、5％氧气条件下振荡培养4h，所述振荡培养，条件为90rpm；在37℃、5％氧气条件下振荡培养13h，所述振荡培养，条件为60rpm；在37℃、5％氧气条件下振荡培养13h，所述振荡培养，条件为30rpm。
S1所述3D悬浮培养，培养时间为3天。
S2所述培养液2包括：DMEM培养基、F12培养基、1.0g/L碳酸氢钠、0.2％人血清白蛋白(HSA)、1％青霉素、1％链霉素、100ng/ml重组人激活素-A(Activin A)、50ng/mLTGF-β因子。
S2所述培养液2中，IMDM培养基和F12培养基体积比为1:1。
S2所述培养包括：在37℃、5％氧气条件下静置培养5h；在37℃、5％氧气条件下振荡培养4h，所述振荡培养，条件为35rpm；重复上述操作，直到培养总时长达到4天，全程中每隔一天更换一次培养液。
S3所述培养液3包括：IMDM培养基、F12培养基、1.0g/L碳酸氢钠、0.2％人血清白蛋白(HSA)、0.5mM视黄酸、1×谷氨酰胺(GlutaMAX)、10mM葡萄糖、0.25M的维生素C、40μMSirt1抑制剂、20ng/mLEGF信号因子。
S3所述培养液3中，IMDM培养基和F12培养基体积比为1:5。
S3所述培养包括：在37℃、5％氧气条件下静置培养13h；在37℃、5％氧气条件下振荡培养2h，所述振荡培养，条件为20rpm；重复上述操作，直到培养总时长达到5天，全程中每隔一天更换一次培养液。
S4所述培养液4包括：IMDM培养基、F12培养基、1.0g/L碳酸氢钠、0.2％人血清白蛋白(HSA)、1×谷氨酰胺(GlutaMAX)、10mM葡萄糖、2μM ALK抑制剂(K02288)、10μM YO-01027(Notch信号通路抑制剂)。
S4所述培养液4中，IMDM培养基和F12培养基体积比为1:5；所述培养包括：在37℃、5％氧气条件下静置培养5h；在37℃、5％氧气条件下振荡培养4h，所述振荡培养，条件为30rpm；重复上述操作，直到培养总时长达到4天，全程中每隔一天更换一次培养液。
S4所述培养液5包括：IMDM培养基、F12培养基、1.0g/L碳酸氢钠、0.2％人血清白蛋白(HSA)、1×谷氨酰胺(GlutaMAX)、10mM葡萄糖、10μMRepsox(ALK5抑制剂)和2μM R428(Axl抑制剂)。所述培养包括：继续在37℃、5％氧气条件下静置培养4天，每隔一天更换一次培养液。
经过免疫荧光染色，流式细胞术，荧光定量PCR分析等技术对上述实施例及对比例的步骤S3、S4或最终产物进行表征，经试验，证明上述实施例1-3中的S3步骤结束后，均得到了PDX1阳性的胰腺前体细胞，实施例1-3步骤S4均得到了胰岛β细胞并且能够稳定、大量表达胰岛素；胰岛β细胞的其他各项影响细胞试验性能的参数均达到标准。对比例1S4产物中胰岛β细胞数量较实施例3低47％(二者除培养条件外其他为平行试验)。对比例2S4产物中胰岛β细胞数量较实施例3低75％(二者除培养条件外其他为平行试验)。对比例3最终步骤产物中胰岛β细胞数量较实施例3低5％(二者除S4及以后步骤外其他为平行试验)。可见，本发明提供的方法能够稳定且大量制备性能优越的胰岛β细胞，并且在此基础上实现了试验重复性好、产量高，为该技术实现大规模应用或临床应用奠定了基础。
以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。
Claims (8)
1.一种由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、将人多能干细胞制备为多功能细胞球；
S2、使用培养液2培养所得多功能细胞球，使其定向分化为定型内胚层细胞；
S3、使用培养液3培养所得定型内胚层细胞，诱导其分化为胰腺前体细胞；
S4、使用培养液4培养所得胰腺前体细胞诱导其分化为胰岛β细胞；
S4所述培养液4包括：IMDM培养基、F12培养基、1.0g/L碳酸氢钠、0.2%人血清白蛋白、1×谷氨酰胺、10mM葡萄糖、2μMALK抑制剂K02288、10μMYO-01027S4所述培养液4中，IMDM培养基和F12培养基体积比为1:5；
S4所述培养包括：在37℃、5％氧气条件下静置培养3-8h；在37℃、5％氧气条件下振荡培养3-5h，所述振荡培养，条件为10-40rpm；重复上述操作，直到培养总时长达到4天，全程中每隔一天更换一次培养液；向培养液中添加终浓度10μM的Repsox和终浓度2μM的R428，继续在37℃、5％氧气条件下静置培养2.5天。
2.根据权利要求1所述的由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法，其特征在于：S1所述制备步骤包括：将贴壁培养的人多功能干细胞消化成细胞小块，使用培养液1重悬后，接种于超低吸附六孔板，进行一阶段培养后，得到规则的细胞小球，然后进行3D悬浮培养，得到多功能细胞球。
3.根据权利要求2所述的由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法，其特征在于：S1所述培养液1为包括ROCK1抑制剂的mTeSR-1完全培养液；接种密度为0.5-1.0×106/cm2。
4.根据权利要求3所述的由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法，其特征在于：S1所述一阶段培养，包括：在37℃、5％氧气条件下静置培养10-18h；在37℃、5％氧气条件下振荡培养3-5h，所述振荡培养，条件为80-100rpm；在37℃、5％氧气条件下振荡培养10-15h，所述振荡培养，条件为50-70rpm；在37℃、5％氧气条件下振荡培养10-15h，所述振荡培养，条件为10-40rpm；S1所述3D悬浮培养，培养时间为2-3天。
5.根据权利要求1所述的由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法，其特征在于：S2所述培养液2包括：DMEM培养基、F12培养基、1.0g/L碳酸氢钠、0.2%人血清白蛋白、1％青霉素、1％链霉素、100ng/ml重组人激活素-A、50ng/mLTGF-β因子；S2所述培养液2中，IMDM培养基和F12培养基体积比为1:1。
6.根据权利要求1所述的由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法，其特征在于：S2所述培养包括：在37℃、5％氧气条件下静置培养3-8h；在37℃、5％氧气条件下振荡培养3-5h，所述振荡培养，条件为30-40rpm；重复上述操作，直到培养总时长达到4天，全程中每隔一天更换一次培养液。
7.根据权利要求1所述的由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法，其特征在于：S3所述培养液3包括：IMDM培养基、F12培养基、1.0g/L碳酸氢钠、0.2%人血清白蛋白、0.5mM视黄酸、1×谷氨酰胺、10mM葡萄糖、0.25M的维生素C、40μMSirt1抑制剂、20ng/mLEGF信号因子；S3所述培养液3中，IMDM培养基和F12培养基体积比为1:5。
8.根据权利要求1所述的由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法，其特征在于：S3所述培养包括：在37℃、5％氧气条件下静置培养10-15h；在37℃、5％氧气条件下振荡培养1-3h，所述振荡培养，条件为10-25rpm；重复上述操作，直到培养总时长达到5天，全程中每隔一天更换一次培养液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110777227.7A CN113502258B (zh) | 2021-07-09 | 2021-07-09 | 一种由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110777227.7A CN113502258B (zh) | 2021-07-09 | 2021-07-09 | 一种由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113502258A CN113502258A (zh) | 2021-10-15 |
| CN113502258B true CN113502258B (zh) | 2022-06-21 |
Family
ID=78011968
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110777227.7A Active CN113502258B (zh) | 2021-07-09 | 2021-07-09 | 一种由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113502258B (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109749986A (zh) * | 2019-03-13 | 2019-05-14 | 武汉大学 | 一种由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法 |
| CN112980774A (zh) * | 2021-03-19 | 2021-06-18 | 上海爱萨尔生物科技有限公司 | 一种诱导多能干细胞定向分化制备胰岛β细胞的培养方法 |
-
2021
- 2021-07-09 CN CN202110777227.7A patent/CN113502258B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109749986A (zh) * | 2019-03-13 | 2019-05-14 | 武汉大学 | 一种由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法 |
| CN112980774A (zh) * | 2021-03-19 | 2021-06-18 | 上海爱萨尔生物科技有限公司 | 一种诱导多能干细胞定向分化制备胰岛β细胞的培养方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113502258A (zh) | 2021-10-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106609263B (zh) | 高效诱导多能干细胞向视网膜色素上皮细胞分化的方法 | |
| CN105969720B (zh) | 一种人类血管内皮细胞培养液及其培养方法 | |
| WO2022213704A1 (zh) | 一种高迁徙间充质干细胞及其制备方法和应用 | |
| CN106754668A (zh) | 一种干细胞培养液及注射液 | |
| CN106591224B (zh) | 高纯度鸡前体肌内脂肪细胞的分离纯化及构建其与肌卫星细胞共培养体系的方法 | |
| CN115011560A (zh) | 一种脑胶质瘤类器官、培养基及培养方法 | |
| CN113549596A (zh) | 一种诱导培养基及其使用方法和应用 | |
| CN117106724A (zh) | 一种h3k27m突变型脊髓胶质瘤细胞及其培养方法 | |
| CN110592007B (zh) | 一种间充质干细胞及其制备方法和应用 | |
| CN111534477A (zh) | 小鼠肺组织原代上皮干细胞球培养方法 | |
| CN111909889A (zh) | 一种低成本小鼠肠类器官培养基及培养方法 | |
| CN113502258B (zh) | 一种由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法 | |
| CN103509101B (zh) | 一种扩增脐带血造血干细胞的细胞因子及其培养基 | |
| CN116836933B (zh) | 肝胆癌类器官培养液、培养试剂组合及培养方法 | |
| WO2024146395A1 (zh) | 一种大规模高产量细胞连续培养和收获的生产工艺 | |
| CN112592883B (zh) | 一种小鼠胰腺类器官培养基及其应用 | |
| CN117778313A (zh) | 脑类器官获得间充质干细胞分化方法和应用 | |
| CN108034634B (zh) | 一种从经血中分离宫内膜间充质干细胞的方法 | |
| CN117025528A (zh) | 一种增强杀伤细胞增殖和活性的细胞培养方法 | |
| CN110669732A (zh) | 组合物在将造血祖细胞重编程为造血干细胞中的用途 | |
| CN116042516A (zh) | 一种从人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞球及其制备方法和应用 | |
| CN114807013B (zh) | 一种外周血干细胞分化成内胚层细胞的方法及其应用 | |
| CN110551204A (zh) | 一种亚全能间充质干细胞分泌素的制备方法 | |
| CN117106697A (zh) | Palbociclib在制备CHO细胞无血清培养基中的应用 | |
| CN114763531B (zh) | 诱导神经干细胞分化为星形胶质细胞的方法及用途和组合物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |