KR100658183B1 - Ｂｃｒｐ 변이 유전자의 검출방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 BCRP 변이 유전자의 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 PCR법과 파이로시퀀싱법을 사용하여 BCRP 변이 유전자를 검출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 BCRP 변이 유전자 검출방법은 신속, 정확하게 BCRP 변이 여부, 변이 위치 및 변이 양상을 진단할 수 있으며, 이를 통하여 BCRP의 변이에 따른 약물반응 및 다약제내성 발생 가능성의 개인차를 산출할 수 있다. 따라서 본 발명의 방법은 향후 유전자 변이에 따른 효과적인 약물치료를 위해 유용한 검출방법으로 활용될 수 있다.

BCRP, 변이 유전자, 파이로시퀀싱, PCR

Description

ＢＣＲＰ 변이 유전자의 검출방법{METHOD FOR DETECTION OF GENETIC VARIANTS OF BREAST CANCER RESISTANCE PROTEIN GENE}

도 1a는 자동서열분석기를 이용하여 BCRP 유전자의 야생형, 이형접합형 BCRP V12M 변이 유전자 및 동형접합형 BCRP V12M 변이 유전자를 분석한 결과이다. 박스 부분은 야생형 BCRP 유전자에서 발린에 해당하는 염기서열을 나타낸다.

도 1b는 파이로시퀀서를 이용하여 BCRP 유전자의 야생형, 이형접합형 BCRP V12M 변이 유전자 및 동형접합형 BCRP V12M 변이 유전자를 분석한 결과이다. 음영부분은 야생형 BCRP 유전자에서 발린에 해당하는 염기서열을 나타낸다.

도 2a는 자동서열분석기를 이용하여 BCRP 유전자의 야생형 및 이형접합형 BCRP Q126Stop 변이 유전자를 분석한 결과이다. 박스 부분은 야생형 BCRP 유전자에서 글루타민에 해당하는 염기서열을 나타낸다.

도 2b는 파이로시퀀서를 이용하여 BCRP 유전자의 야생형 및 이형접합형 BCRP Q126Stop 변이 유전자를 분석한 결과이다. 음영부분은 야생형 BCRP 유전자에서 글루타민에 해당하는 염기서열을 나타낸다.

도 3a는 자동서열분석기를 이용하여 BCRP 유전자의 야생형, 이형접합형 BCRP Q141K 변이 유전자 및 동형접합형 BCRP Q141K 변이 유전자를 분석한 결과이 다. 박스 부분은 야생형 BCRP 유전자에서 글루타민에 해당하는 염기서열을 나타낸다.

도 3b는 파이로시퀀서를 이용하여 BCRP 유전자의 야생형, 이형접합형 BCRP Q141K 변이 유전자 및 동형접합형 BCRP Q141K 변이 유전자를 분석한 결과이다. 음영부분은 야생형 BCRP 유전자에서 글루타민에 해당하는 염기서열을 나타낸다.

본 발명은 BCRP 변이 유전자의 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 PCR법과 파이로시퀀싱법을 사용하여 BCRP 변이 유전자를 검출하는 방법에 관한 것이다.

BCRP(Breast cancer resistance protein)는 ATP 에너지를 이용하여 약물을 세포 밖으로 수송하는 단백질로, 독소루비신(doxorubicin), 토포테칸(topotecan), 미토잔트론(mitoxantron), 안트라사이클린 (anthracyclines) 및 이리노테칸(irinotecan) 등의 여러 가지 항암제에 대해 내성 발생 기작과 관련이 있는 것으로 알려져 있다.

최근 BCRP는 유전적 다형성과 이로 인한 단백질의 기능 변이와의 상관관계 가 보고 되고 있다. 특히 BCRP V12M 변이는 단백질이 세포내 비정상적으로 배치되어 단백질 기능의 차이가 발생하고, BCRP Q126Stop 변이는 단백질 번역과정 중 비정상적인 종결로 인하여 불완전한 단백질을 생성하여 BCRP 고유의 기능을 발휘하지 못하며, 또한 BCRP Q141K 변이는 ATP 분자와의 결합부위가 변형된 형태로, 약물 수송 기능에 차이를 유발한다.

상기한 BCRP 변이들은 특히 한국인에서 높은 빈도로 발생하는 것으로 알려져 있어, 질병의 진단 및 치료를 위하여 신속 정확하게 BCRP 변이들을 검출할 수 있는 방법의 개발이 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 BCRP 변이 유전자의 검출방법을 연구하던 중 PCR법과 파이로시퀀싱법을 이용하여 BCRP 변이 유전자를 단시간 내에 정확하게 분석할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 BCRP 변이 유전자의 검출방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(a) 피험자로부터 생물학적 시료를 채취하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계의 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;

(c) 상기 (b) 단계의 DNA를 BCRP 유전자의 두 번째 엑손 영역, 네 번째 엑손 영역 및 다섯 번째 엑손 영역으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 어느 하나의 영역을 증폭할 수 있는 프라이머 세트로 PCR 증폭하는 단계;

(d) 상기 (c) 단계의 PCR 증폭산물을 염기서열 분석용 프라이머와 결합시키는 단계;

(e) 상기 (d) 단계에서 수득된 PCR 증폭산물의 염기서열을 파이로시퀀서로 분석하는 단계; 및

(f) 상기에서 분석된 염기서열과 야생형의 BCRP 유전자의 염기서열을 비교하여, 염기서열 차이가 있는 경우 시료 DNA는 BCRP 변이로 판단하는 단계를 포함하는 인간 BCRP 변이 유전자의 검출방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 BCRP 변이 유전자의 검출방법은 BCRP의 단일염기 다형성 바람직하게는, BCRP V12M, BCRP Q126Stop 및 BCRP Q141K 변이를 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 것을 특징으로 한다.

상기 사람 BCRP 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열은 서열번호 1 및 서열번호 2에 나타낸 바와 같다.

상기 BCRP V12M 변이는 서열번호 2로 표시되는 BCRP 단백질의 아미노산 서 열 중 12번째 아미노산인 발린이 메티오닌으로 치환된 것을 말한다. 더욱 바람직하게는 상기 BCRP V12M 변이는 서열번호 2로 표시되는 BCRP 단백질의 12번째 아미노산인 발린에 해당되는 염기서열(codon)"GTG"중 첫 번째 염기인 G가 A로 치환되어 염기서열이 "ATG" 로 변이된 것을 말한다.

상기 BCRP Q126Stop 변이는 서열번호 2로 표시되는 BCRP 단백질의 126번째 아미노산인 글루타민에 해당되는 염기서열이 전사종결코돈으로 치환된 것으로, 전사종결코돈의 예로는 TAA, TAG 및 TGA가 있다. 더욱 바람직하기로는 BCRP 단백질의 12번째 아미노산인 발린에 해당되는 염기서열(codon)"CAA"중 첫 번째 염기인 C가 T로 치환되어 염기서열이 "TAA"로 변이된 것을 말한다.

상기 BCRP Q141K 변이는 서열번호 2로 표시되는 BCRP 단백질의 141번째 아미노산인 글루타민이 라이신으로 치환된 것을 말한다. 바람직하게는 BCRP 단백질의 141번째 아미노산인 글루타민에 해당되는 염기서열(codon) "CAG"중 첫 번째 염기인 C가 A로 치환되어 염기서열이 "AAG"로 변이된 것을 말한다.

상기 본 발명에 따른 BCRP 변이 유전자의 검출 방법은 바람직하게는 다음과 같은 단계를 포함한다:

(a) 피험자로부터 생물학적 시료를 채취하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계의 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;

(c) 상기 (b) 단계의 DNA를 BCRP 유전자의 두 번째 엑손 영역, 네 번째 엑손 영역 및 다섯 번째 엑손 영역으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 어느 하나의 영역을 증폭할 수 있는 프라이머 세트로 PCR 증폭하는 단계;

(d) 상기 (c) 단계의 PCR 증폭산물을 염기서열 분석용 프라이머와 결합시키는 단계;

(e) 상기 (d) 단계에서 수득된 PCR 증폭산물의 염기서열을 파이로시퀀서로 분석하는 단계; 및

(f) 상기에서 분석된 염기서열과 야생형의 BCRP 유전자의 염기서열을 비교하여, 염기서열 차이가 있는 경우 시료 DNA는 BCRP 변이로 판단하는 단계.

상기 (a) 단계에서 상기 생물학적 시료는 피험자의 혈액, 피부 세포, 점막 세포 및 모발일 수 있다. 바람직하게는 혈액일 수 있다.

상기 (b) 단계에서 상기 (a) 단계의 혈액으로부터 게놈 DNA를 추출하는 방법은 특별히 한정되지 않으며 당업계에 공지된 기술 또는 시판되고 있는 추출용 키트를 사용하여 용이하게 수행할 수 있다. 예를 들면, DNA 추출용 키트는 Qiagen, Inc.(미국 캘리포니아) 및 Stratagene(미국 캘리포니아)에서 구입할 수 있다.

상기 (c) 단계는 분석하고자 하는 DNA 시료를 주형으로 하여 BCRP 변이가 일어나는 부위만을 선택적으로 PCR 증폭하는 단계이다. 바람직하게는, BCRP V12M 변이를 검출하고자 하는 경우에는 BCRP 유전자의 두 번째 엑손 영역만을 선택적으로 증폭하고, BCRP Q126stop 변이를 검출하고자 하는 경우에는 네 번째 엑손 영역만을 선택적으로 증폭하며, BCRP Q141K 변이를 검출하고자 하는 경우에는 다섯 번째 엑손 영역만을 증폭한다. 보다 바람직하게는, BCRP V12M 변이를 검출하고자 하는 경우에는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트를 사용할 수 있으며, BCRP Q126stop 변이의 경우에는 서열번호 6 및 서열번호 7로 표시되는 프라이머 세트를, BCRP Q141K의 경우에는 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 세트를 사용할 수 있다.

PCR 증폭 조건으로는 특별히 한정되지는 않으나, 바람직하게는 PCR 반응 조건으로는 94℃에서 5분간 반응시킨 후 94℃에서 30초, 54℃에서 35초, 72℃에서 20초 동안의 반응을 35회 반복하고 72℃에서 5분간 반응시킨다.

BCRP V12M 변이를 검출하고자 하는 경우, 상기의 방법에 의해 증폭된 PCR 증폭산물의 크기는 278bp로 이루어지며, BCRP 단백질의 12번째 아미노산인 발린을 코딩하는 염기서열은 42번째에 위치한다.

BCRP Q126stop 변이를 검출하고자 하는 경우, 상기 방법에 의해 증폭된 PCR 증폭산물의 크기는 174bp이며, BCRP 단백질의 126번째 아미노산인 글루타민을 코딩하는 염기서열은 103번째에 위치한다.

BCRP Q141K 변이를 검출하고자 하는 경우, 상기 방법에 의해 증폭된 PCR 증폭산물의 크기는 69bp이며, BCRP 단백질의 141번째 아미노산인 글루타민을 코딩하는 염기서열은 41번째에 위치한다.

상기 (d) 단계는 상기 (c) 단계에서 수득한 각각의 PCR 증폭산물을 염기서열분석용 프라이머와 결합시키는 단계이다. 바람직하게는 서열번호 5, 서열번호 8 및 서열번호 11로 이루어진 그룹 중에서 선택된 프라이머를 사용한다.

상기 (e) 단계는 상기 (d) 단계에서 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 파이로시퀀서를 사용하여 분석하는 단계이다.

파이로시퀀서는 DNA 중합반응 과정시 유리된 파이로포스페이트가 설퍼릴레이즈(Sulfurylase)의 존재 하에 ATP로 전환되고, 상기 ATP가 루시퍼레이즈를 활성화시켜 발생되는 발광반응을 전하 커플 카메라(charge couple device camera)로 측정하고, 측정된 반응성은 피크로 표시함으로써 서열을 분석하는 기기이다. 이때, 표시된 각 피크의 높이는 첨가된 염기의 수와 비례하므로, 동형체(homozygote)는 이형체(heterozygote) 피크의 두배로 나타난다.

상기 (f) 단계는 상기에서 분석된 염기서열과 야생형의 BCRP 유전자의 염기서열을 비교하여, 염기서열 차이가 있는 경우 시료 DNA는 BCRP 변이로 판단하는 단계이다.

본 발명에 따른 검출방법은 종래의 제한효소처리법이나 자동염기서열분석법에 비해 매우 빠르고 정확한 변이 유전자 판별할 수 있는 방법이다.

상기 본 발명에 따른 방법은 약제내성을 갖는 환자나 약물의 체내 동태의 개인차와의 BCRP 변이성과의 상관관계를 파악하여, 약물 처방 및 치료 과정을 선택하는데 활용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 방법은 BCRP 변이를 신속하고 정확하게 진단함으로써 BCRP 단백질의 단일염기 다형성과 다약제내성 개인차 및 약물동태 개인차간의 상관 관계를 확립하여, BCRP 단백질의 변이에 의한 질환의 진단 및 치료에 이용될 수 있다. BCRP 변이와 관련된 질환으로는 예를 들면 급성골수아구성백혈병이 있다.

이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

본 발명의 방법에 따른 BCRP V12M 변이 유전자의 분석

<1-1> BCRP 유전자의 PCR 증폭

BCRP V12M 변이 검출을 위한 시료 DNA는 BCRP V12M 변이를 포함하는 90개의 DNA 시료를 임상시험 동의서에 서명을 한 건강한 일반인 자원자의 전혈로부터 추출하여 사용하였다. BCRP V12M 변이 유무는 전장 염기열 분석법으로 확인하였으며 확인이 완료된 시료를 대상으로 본 발명에 따른 분석법을 적용하였다.

BCRP V12M 변이의 검출을 위해 먼저, BCRP 유전자의 두 번째 엑손을 포함한 부분이 증폭될 수 있도록 정방향 및 역방향 프라이머 세트를 합성하였고, 정방향 프라이머의 5' 말단은 비오틴을 연결하였다.

상기 시료 DNA를 주형으로 하여 상기에서 합성한 하기의 프라이머로 PCR을 실시하였다.

정방향 프라이머(서열번호 3)

5'-Biotin-CTCTCCAGATGTCTTCCAGTAATGT-3'

역방향 프라이머(서열번호 4)

5'-GCCAAAACCTGTGAGGTTCA-3'

PCR 반응 조건으로는 94℃에서 5분간 반응시킨 후 94℃에서 30초, 54℃에서 35초, 72℃에서 20초 동안의 반응을 35회 반복하고 72℃에서 5분간 반응시켰다. 반응이 완료된 후 전기영동을 실시하여 PCR 반응산물의 크기를 확인하였다. 그 결과, 278bp 크기의 PCR 반응산물을 확인할 수 있었다.

<1-2> PCR 증폭산물의 파이로시퀀싱

상기 실시예 <1-1>의 PCR 증폭산물을 주형으로 하고 하기의 BCRP V12M 서열분석용 프라이머로 반응시킨 후 파이로시퀀서(pyrosequencer, Pyrosequencing 사)로 서열분석을 실시하여 BCRP의 12번째 아미노산인 발린에 해당하는 코돈이 메티오닌에 해당하는 코돈으로 변이되었는지 여부를 조사하였다.

BCRP V12M 서열분석용 프라이머(서열번호 5)

5'-CATTGGTGTTTCCTTGTGA-3'

실험 결과, 야생형 BCRP 단백질의 12번째 아미노산 서열인 발린에 해당하 는 염기서열인 GTG가 동형접합 돌연변이체에서는 구아닌이 아데닌으로 치환되어 ATG로 변이되었음을 확인할 수 있었다. 이형접합 돌연변이체의 경우에는 구아닌과 아데닌 염기가 모두 검출되었다(도 1a 및 도 1b).

본 발명의 방법에 따른 BCRP V12M 변이 분석 결과를 자동염기서열분석법과 비교한 경우 초회 성공률이 98%였고 정확도는 100%로 나타났다. 이차 분석 후 성공률은 100%였다.

<실시예 2>

본 발명의 방법에 따른 BCRP Q126Stop 변이 유전자의 분석

<2-1> BCRP 유전자의 PCR 증폭

BCRP Q126Stop 변이를 포함하는 90개의 DNA 시료를 임상시험 동의서에 서명을 한 건강한 일반인 자원자의 전혈로부터 추출하여 사용하였다. BCRP V12M 변이 유무는 전장 염기서열 분석법으로 확인하였으며 확인이 완료된 시료를 대상으로 본 발명에 따른 분석법을 적용하였다.

BCRP Q126Stop 변이의 검출을 위해 먼저, BCRP 유전자의 네 번째 엑손을 포함한 부분이 증폭될 수 있도록 정방향 및 역방향 프라이머 세트를 합성하였고, 정방향 프라이머의 5' 말단은 비오틴을 연결하였다. 상기 시료 DNA를 주형으로 하여 상기에서 합성한 프라이머로 PCR 증폭을 수행하였다.

정방향 프라이머 (서열번호 6)

5'-GTCTTAGCTGCAAGGAAAGATCCA-3'

역방향 프라이머 (서열번호 7)

5'-Biotin-ACTATCAGCCAAAGCACTTACC-3'

PCR 반응 조건으로는 94℃에서 5분간 반응시킨 후 94℃에서 30초, 54℃에서 35초, 72℃에서 20초 동안의 반응을 35회 반복하고 72℃에서 5분간 반응시켰다. 반응이 완료된 후 전기영동을 실시하여 PCR 반응산물의 크기를 확인하였다. 그 결과, 174bp 크기의 PCR 반응산물을 확인할 수 있었다.

<2-2> PCR 증폭산물의 파이로시퀀싱

상기 실시예 <2-1>의 PCR 증폭산물을 주형으로 하고 하기의 BCRP Q126Stop 서열분석용 프라이머로 반응시킨 후 파이로시퀀서(pyrosequencer, Pyrosequencing 사)로 서열분석을 실시하여 BCRP의 126번째 아미노산인 글루타민에 해당하는 염기서열에 변이가 발생하여 종결코돈이 생성되었는지 여부를 조사하였다.

BCRP Q126Stop 서열분석용 프라이머(서열번호 8)

5'-AATGTAATTCAGGTTACGTG-3'

실험 결과, 야생형 BCRP 단백질의 126번째 글루타민에 해당하는 염기서열 인 (CAA)가 이형접합 돌연변이체의 경우에는 상기 염기서열 중 시토신이 티민(TAA)으로 변이된 것과 변이되지 않은 것이 모두 검출되었다(도 2a 및 도 2b). 본 발명의 방법에 따른 BCRP Q126Stop 변이 유전자의 분석결과를 자동염기서열분석 결과와 비교한 결과 초회 성공률과 정확도가 각각 100%로 나타났다.

<실시예 3>

본 발명의 방법에 따른 BCRP Q141K 변이 유전자의 분석

<3-1> BCRP 유전자의 PCR 증폭

BCRP Q141K 변이를 포함하는 90개의 DNA 시료를 임상시험 동의서에 서명을 한 건강한 일반인 자원자의 전혈로부터 추출하여 사용하였다. BCRP V12M 변이 유무는 전장 염기열 분석법으로 확인하였으며 확인이 완료된 시료를 대상으로 본 발명에 따른 분석법을 적용하였다.

BCRP Q141K 변이의 검출을 위해 먼저, BCRP 유전자의 다섯 번째 엑손을 포함한 부분이 증폭될 수 있도록 정방향 및 역방향 프라이머 세트를 합성하였고, 정방향 프라이머의 5' 말단은 비오틴을 연결하였다. 상기 시료 DNA를 주형으로 하여 상기에서 합성한 프라이머로 PCR 증폭을 수행하였다.

정방향 프라이머 (서열번호 9)

5'-TGATGTTGTGATGGGCACTC-3'

역방향 프라이머 (서열번호 10)

5'-Biotin-GTTGCAAGCCGAAGAGCT-3'

PCR 반응 조건으로는 94℃에서 5분간 반응시킨 후 94℃에서 30초, 54℃에서 35초, 72℃에서 20초 동안의 반응을 35회 반복하고 72℃에서 5분간 반응시켰다. 반응이 완료된 후 전기영동을 실시하여 PCR 반응산물의 크기를 확인하였다. 그 결과, 69bp 크기의 단일 PCR 반응산물을 확인할 수 있었다.

<3-2> PCR 증폭산물의 파이로시퀀싱

상기 실시예 <3-1>의 PCR 증폭산물을 주형으로 하고 하기의 BCRP Q141K 서열분석용 프라이머로 반응시킨 후 파이로시퀀서(pyrosequencer, Pyrosequencing 사)로 서열분석을 실시하여 BCRP의 141번째 아미노산인 글루타민에 해당하는 코돈이 라이신에 해당하는 코돈으로 변이되었는지 여부를 조사하였다.

서열분석용 프라이머 (서열번호 11)

5'-GACGGTGAGAGAAAACTT-3'

실험결과, 야생형 BCRP의 경우 141번째 글루타민에 해당하는 염기서열인 CAG가 동형접합 돌연변이체에서는 시토신이 아데닌으로 치환되어 AAG로 변이됨으로 이형접합 돌연변이체에서는 시토신과 아데닌이 모두 검출되었다(도 3a 및 도 3b).

본 발명의 방법에 따른 BCRP Q141K 변이 유전자의 분석 결과를 자동염기서열분석결과와 비교한 결과 초회 성공률 및 정확도가 각각 100%로 나타났다.

따라서, 본 발명의 방법에 따르면 BCRP 유전자의 변이를 40분 이내에 신속하게 검출할 수 있었다. 이는, 기존의 자동염기서열분석법이나 제한효소처리법의 경우에는 유전자 변이분석 소요시간이 2시간 이상 소요되는 것을 감안하면 매우 빠르고 정확한 변이 유전자 판별 방법이라 할 수 있다.

<실시예 4>

본 발명의 방법에 따른 한국인을 대상으로 한 BCRP 유전자 변이 검출

실시예 1 내지 3에서 확인된 변이 유전자를 대조군으로 하여, 임상시험 동의서에 서명을 한 건강한 일반인 자원자 183명을 대상으로 변이 유전자의 유무를 검색하였다. 실험방법은 실시예 1 내지 3과 동일하게 실시하였다.

그 결과 BCRP V12M 변이를 나타내는 집단은 전체에서 21.85%를 차지하였으며, BCRP Q126Stop 변이는 1.6 %, BCRP Q141K 변이는 26.6 %로 확인되었다. 즉, 한국인에서는 BCRP V12M 변이, BCRP Q126Stop 변이 및 BCRP Q141K 변이가 높은 수준으로 발생됨을 알 수 있으며, 변이를 나타내는 집단은 약물 수송에 변이가 있는지 여부를 필수적으로 검사하여야 함을 확인할 수 있었다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 BCRP 변이 유전자 검출방법은 신속, 정확하게 BCRP 변이 여부, 변이 위치 및 변이 양상을 진단할 수 있으며, 이를 통하여 BCRP의 변이에 따른 약물반응 및 다약제내성 발생 가능성의 개인차를 산출할 수 있다. 따라서 본 발명의 방법은 향후 유전자 변이에 따른 효과적인 약물치료를 위해 유용한 검출방법으로 활용될 수 있다.

<110> INJE UNIVERSITY <120> METOOD FOR DETECTION OF GENETIC VARIANTS OF BREAST CANCER RESISTANCE PROTEIN GENE <130> DPP050122KR <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2719 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (205)..(2169) <223> BCRP Gene <400> 1 tttaggaacg caccgtgcac atgcttggtg gtcttgttaa gtggaaactg ctgctttaga 60 gtttgtttgg aaggtccggg tgactcatcc caacatttac atccttaatt gttaaagcgc 120 tgcctccgag cgcacgcatc ctgagatcct gagcctttgg ttaagaccga gctctattaa 180 gctgaaaaga taaaaactct ccag atg tct tcc agt aat gtc gaa gtt 228 Met Ser Ser Ser Asn Val Glu Val 1 5 ttt atc cca gtg tca caa gga aac acc aat ggc ttc ccc gcg aca gtt 276 Phe Ile Pro Val Ser Gln Gly Asn Thr Asn Gly Phe Pro Ala Thr Val 10 15 20 tcc aat gac ctg aag gca ttt act gaa gga gct gtg tta agt ttt cat 324 Ser Asn Asp Leu Lys Ala Phe Thr Glu Gly Ala Val Leu Ser Phe His 25 30 35 40 aac atc tgc tat cga gta aaa ctg aag agt ggc ttt cta cct tgt cga 372 Asn Ile Cys Tyr Arg Val Lys Leu Lys Ser Gly Phe Leu Pro Cys Arg 45 50 55 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Lys Asn Leu Leu Gly Asn Pro 380 385 390 cag gcc tct ata gct cag atc att gtc aca gtc gta ctg gga ctg gtt 1428 Gln Ala Ser Ile Ala Gln Ile Ile Val Thr Val Val Leu Gly Leu Val 395 400 405 ata ggt gcc att tac ttt ggg cta aaa aat gat tct act gga atc cag 1476 Ile Gly Ala Ile Tyr Phe Gly Leu Lys Asn Asp Ser Thr Gly Ile Gln 410 415 420 aac aga gct ggg gtt ctc ttc ttc ctg acg acc aac cag tgt ttc agc 1524 Asn Arg Ala Gly Val Leu Phe Phe Leu Thr Thr Asn Gln Cys Phe Ser 425 430 435 440 agt gtt tca gcc gtg gaa ctc ttt gtg gta gag aag aag ctc ttc ata 1572 Ser Val Ser Ala Val Glu Leu Phe Val Val Glu Lys Lys Leu Phe Ile 445 450 455 cat gaa tac atc agc gga tac tac aga gtg tca tct tat ttc ctt gga 1620 His Glu Tyr Ile Ser Gly Tyr Tyr Arg Val Ser Ser Tyr Phe Leu Gly 460 465 470 aaa ctg tta tct gat tta tta ccc atg agg atg tta cca agt att ata 1668 Lys Leu Leu Ser Asp Leu Leu Pro Met Arg Met Leu Pro Ser Ile Ile 475 480 485 ttt acc tgt ata gtg tac ttc atg tta gga ttg aag cca aag gca gat 1716 Phe Thr Cys Ile 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aag 2052 Asn Pro Cys Asn Tyr Ala Thr Cys Thr Gly Glu Glu Tyr Leu Val Lys 605 610 615 cag ggc atc gat ctc tca ccc tgg ggc ttg tgg aag aat cac gtg gcc 2100 Gln Gly Ile Asp Leu Ser Pro Trp Gly Leu Trp Lys Asn His Val Ala 620 625 630 ttg gct tgt atg att gtt att ttc ctc aca att gcc tac ctg aaa ttg 2148 Leu Ala Cys Met Ile Val Ile Phe Leu Thr Ile Ala Tyr Leu Lys Leu 635 640 645 tta ttt ctt aaa aaa tat tct t aaatttcccc ttaattcagt atgatttatc 2200 Leu Phe Leu Lys Lys Tyr Ser 650 655 ctcacataaa aaagaagcac tttgattgaa gtattcaatc aagttttttt gttgttttct 2260 gttcccttgc catcacactg ttgcacagca gcaattgttt taaagagata catttttaga 2320 aatcacaaca aactgaatta aacatgaaag aacccaagac atcatgtatc gcatattagt 2380 taatctcctc agacagtaac catggggaag aaatctggtc taatttatta atctaaaaaa 2440 ggagaattga attctggaaa ctcctgacaa gttattactg tctctggcat ttgtttcctc 2500 atctttaaaa tgaataggta ggttagtagc ccttcagtct taatacttta tgatgctatg 2560 gtttgccatt atttaatata tgacaaatgt attaatgcta tactggaaat gtaaaattga 2620 aaatatgttg gaaaaaagat tctgtcttat agggtaaaaa aagccaccgg tgatagaaaa 2680 aaaatctttt tgataagcac attaaagtta atagaactt 2719 <210> 2 <211> 655 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ser Ser Ser Asn Val Glu Val Phe Ile Pro Val Ser Gln Gly Asn 1 5 10 15 Thr Asn Gly Phe Pro Ala Thr Val Ser Asn Asp Leu Lys Ala Phe Thr 20 25 30 Glu Gly Ala Val Leu Ser Phe His Asn Ile Cys Tyr Arg Val Lys Leu 35 40 45 Lys Ser Gly Phe Leu Pro Cys Arg Lys Pro Val Glu Lys Glu Ile Leu 50 55 60 Ser Asn Ile Asn Gly Ile Met Lys Pro Gly Leu Asn Ala Ile Leu Gly 65 70 75 80 Pro Thr Gly Gly Gly Lys Ser Ser Leu Leu Asp Val Leu Ala Ala Arg 85 90 95 Lys Asp Pro Ser Gly Leu Ser Gly Asp Val Leu Ile Asn Gly Ala Pro 100 105 110 Arg Pro Ala Asn Phe Lys Cys Asn Ser Gly Tyr Val Val Gln Asp Asp 115 120 125 Val Val Met Gly Thr Leu Thr Val Arg Glu Asn Leu Gln Phe Ser Ala 130 135 140 Ala Leu Arg Leu Ala Thr Thr Met Thr Asn His Glu Lys Asn Glu Arg 145 150 155 160 Ile Asn Arg Val Ile Glu Glu Leu Gly Leu Asp Lys Val Ala Asp Ser 165 170 175 Lys Val Gly Thr Gln Phe Ile Arg Gly Val Ser Gly Gly Glu Arg Lys 180 185 190 Arg Thr Ser Ile Gly Met Glu Leu Ile Thr Asp Pro Ser Ile Leu Ser 195 200 205 Leu Asp Glu Pro Thr Thr Gly Leu Asp Ser Ser Thr Ala Asn Ala Val 210 215 220 Leu Leu Leu Leu Lys Arg Met Ser Lys Gln Gly Arg Thr Ile Ile Phe 225 230 235 240 Ser Ile His Gln Pro Arg Tyr Ser Ile Phe Lys Leu Phe Asp Ser Leu 245 250 255 Thr Leu Leu Ala Ser Gly Arg Leu Met Phe His Gly Pro Ala Gln Glu 260 265 270 Ala Leu Gly Tyr Phe Glu Ser Ala Gly Tyr His Cys Glu Ala Tyr Asn 275 280 285 Asn Pro Ala Asp Phe Phe Leu Asp Ile Ile Asn Gly Asp Ser Thr Ala 290 295 300 Val Ala Leu Asn Arg Glu Glu Asp Phe Lys Ala Thr Glu Ile Ile Glu 305 310 315 320 Pro Ser Lys Gln Asp Lys Pro Leu Ile Glu Lys Leu Ala Glu Ile Tyr 325 330 335 Val Asn Ser Ser Phe Tyr Lys Glu Thr Lys Ala Glu Leu His Gln Leu 340 345 350 Ser Gly Gly Glu Lys Lys Lys Lys Ile Thr Val Phe Lys Glu Ile Ser 355 360 365 Tyr Thr Thr Ser Phe Cys His Gln Leu Arg Trp Val Ser Lys Arg Ser 370 375 380 Phe Lys Asn Leu Leu Gly Asn Pro Gln Ala Ser Ile Ala Gln Ile Ile 385 390 395 400 Val Thr Val Val Leu Gly Leu Val Ile Gly Ala Ile Tyr Phe Gly Leu 405 410 415 Lys Asn Asp Ser Thr Gly Ile Gln Asn Arg Ala Gly Val Leu Phe Phe 420 425 430 Leu Thr Thr Asn Gln Cys Phe Ser Ser Val Ser Ala Val Glu Leu Phe 435 440 445 Val Val Glu Lys Lys Leu Phe Ile His Glu Tyr Ile Ser Gly Tyr Tyr 450 455 460 Arg Val Ser Ser Tyr Phe Leu Gly Lys Leu Leu Ser Asp Leu Leu Pro 465 470 475 480 Met Arg Met Leu Pro Ser Ile Ile Phe Thr Cys Ile Val Tyr Phe Met 485 490 495 Leu Gly Leu Lys Pro Lys Ala Asp Ala Phe Phe Val Met Met Phe Thr 500 505 510 Leu Met Met Val Ala Tyr Ser Ala Ser Ser Met Ala Leu Ala Ile Ala 515 520 525 Ala Gly Gln Ser Val Val Ser Val Ala Thr Leu Leu Met Thr Ile Cys 530 535 540 Phe Val Phe Met Met Ile Phe Ser Gly Leu Leu Val Asn Leu Thr Thr 545 550 555 560 Ile Ala Ser Trp Leu Ser Trp Leu Gln Tyr Phe Ser Ile Pro Arg Tyr 565 570 575 Gly Phe Thr Ala Leu Gln His Asn Glu Phe Leu Gly Gln Asn Phe Cys 580 585 590 Pro Gly Leu Asn Ala Thr Gly Asn Asn Pro Cys Asn Tyr Ala Thr Cys 595 600 605 Thr Gly Glu Glu Tyr Leu Val Lys Gln Gly Ile Asp Leu Ser Pro Trp 610 615 620 Gly Leu Trp Lys Asn His Val Ala Leu Ala Cys Met Ile Val Ile Phe 625 630 635 640 Leu Thr Ile Ala Tyr Leu Lys Leu Leu Phe Leu Lys Lys Tyr Ser 645 650 655 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ctctccagat gtcttccagt aatgt 25 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gccaaaacct gtgaggttca 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cattggtgtt tccttgtga 19 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gtcttagctg caaggaaaga tcca 24 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 actatcagcc aaagcactta cc 22 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 aatgtaattc aggttacgtg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 tgatgttgtg atgggcactc 20 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gttgcaagcc gaagagct 18 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gacggtgaga gaaaactt 18

Claims (4)

1. (a) 피험자로부터 생물학적 시료를 채취하는 단계;

   (b) 상기 (a) 단계의 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;

   (c) 상기 (b) 단계의 DNA를 서열번호 3과 서열번호 4, 서열번호 6과 서열번호 7 및 서열번호 9와 서열번호 10으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 프라이머 세트로 PCR 증폭하는 단계;

   (d) 상기 (c) 단계의 PCR 증폭산물을 서열번호 5, 서열번호 8 및 서열번호 11로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 염기서열 분석용 프라이머와 결합시키는 단계;

   (e) 상기 (d) 단계에서 수득된 PCR 증폭산물의 염기서열을 파이로시퀀서로 분석하는 단계; 및

   (f) 상기에서 분석된 염기서열과 야생형의 BCRP 유전자의 염기서열을 비교하여, 염기서열 차이가 있는 경우 시료 DNA는 BCRP 변이로 판단하는 단계를 포함하는 인간 BCRP 변이 유전자의 검출방법.
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