KR100639746B1

KR100639746B1 - 감염에 대한 효소 치료법

Info

Publication number: KR100639746B1
Application number: KR1020027007363A
Authority: KR
Inventors: 데이비드 엠. 앤더슨; 린 리우; 훔그-유 시아오; 더글라스 더블유. 포지
Original assignee: 켐젠 코포레이션
Priority date: 1999-12-10
Filing date: 2000-12-08
Publication date: 2006-10-30
Anticipated expiration: 2020-12-08
Also published as: TWI255189B; MXPA02005735A; AU2577601A; HU230301B1; EP1239872A2; UA78486C2; ATE481981T1; US20040223961A1; SK287956B6; US6780628B2; MX264033B; WO2001041785A2; CA2394856A1; CN1433319A; HUP0203402A2; US20020048576A1; ES2353371T3; CN102172262A; PH12000003381B1; BRPI0016231B8

Abstract

감염 방지제를 함유하지 않는, 세포 표면 단백질 또는 탄수화물을 방출시키는 특징이 있는 특정 부류의 효소는 상당한 감염 방지 활성을 나타낸다. 경구 투여시에 이들 효소는, 예를 들어 인간 및 동물에서의 소화관 감염 치료에 효과적이다. 동물의 경우에는 성장률, 사료 효율 및 총체적 건강 상태의 향상에 매우 유익하다.

세포 표면 단백질, 탄수화물, 방출, 효소, 감염 방지, 소화관 감염

Description

감염에 대한 효소 치료법 {Enzyme Treatment for Infection}

본 발명은 소화관 감염을 치료하거나 또는 그 위험을 저하시키는 것과 관련하여 감염 방지제 (anti-infection agent)로서 효소를 포함하는 조성물 및 이를 사용하는 방법론에 관한 것이다.

1998년 세계 인구 견적 및 산출의 개정판 (Revision of the World Population Estimates and Projections)에서, 국제 연합 경제 및 사회 인구 기구 (the United Nations Department of Economic and Social Affairs Population Division)는 세계 인구가 1999년에는 60억에 도달할 것이라 산출하였다. 이 보고서는 또한 인구가 10억에서 20억으로 증가하는 데 123년이 걸린 것에 비해, 50억에서 60억으로 증가하는 데는 불과 12년 밖에 걸리지 않았다고 공표하고 있다. 21세기 중반까지 산출된 인구는 73억 내지 107억이다. 지난 10년간 현저한 인구 증가는 부분적으로는 기술의 사용 및 집약적인 식량 생산 실행으로 인한 식량 생산의 효과적인 증가를 가져왔기 때문이다. 미래의 인구 증가를 위해, 식량 생산이 더욱 효율적으로 증가가 이루어져 보조를 맞추어야할 필요가 있다.

동물성 육류 생산을 더욱 효과적으로 하는 한 접근법은, 동물용 사료에 최근 널리 퍼져있는 항-미생물성 화학약품 및 항생제의 사용을 포함한다. 대규모 농장 에서는 무리지어 생활하는 생산 조건이므로 감염의 확산이 매우 빠르다. 따라서, 널리 유행하는 질병은 이들 물질의 예방적 및 치료적 이용에 의해 방제한다. 예를 들어, 동물용 사료에 화학약품 (예, 살리노마이신, 모넨신, 록사르손 (3-니트로), 할퀴놀, 카르바독스 및 올라퀸독스) 및 항-미생물성 항생제 (예, 바시트라신, 버지니아마이신, 틸로신, 테트라싸이클린, 클로르테트라싸이클린, 페니실린, 올레안도마이신, 노보바이오신, 린코마이신, 밤베르마이신, 아프라마이신, 스피라마이신, 에리트로마이신, 네오마이신 등)를 혼합하여 콕시듐충 감염을 제어하는 것은 일반적인 방법이다. 이러한 방법은 성장을 촉진하고 사료 효율을 개선시키는 것으로 잘 알려져 있다.

스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae), 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenza), 네이세리아 고노로애 (Neisseria gonorrhoeae), 및 미코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis)와 같은 사람 병원체의 다양한 항생제 내성 증가로 인해, 농장 동물과 관련된 미생물에서 발달된 항생제 내성이 전이가능한 약물 내성 인자를 통해 사람 병원체로 바뀔 수 있다는 두려움이 생겨났다. 항생제를 이용해 사육된 동물은 전이가능한 약물 내성 인자가 있는 박테리아의 원천이라는 증거가 있다 (문헌 [Hooge, Feedstuffs 71(20):59, 1999] 참조). 동물 및 사람에서 사용되는 항생제는 일반적으로 다르지만, 그 메카니즘에는 교차 내성 (cross-resistance)을 야기할 수 있는 유사성이 있다. 어떤 경우, 플루로퀴놀론은 몇몇 동물에서 대장균 감염 (대장균증) 방제용으로 승인되었고, 사람 의약에서도 사용된 다 (상기 후게 (Hooge)의 문헌 참조). 최근, FDA/CVM은 플루로퀴놀론-내성 캠필로박터 (campylobacter)의 출현 및 사람으로의 전이로 인해, 가금류에 플루로퀴놀론 엔로플록사신을 사용하는 것에 대한 허가를 철회할 것을 제안한 바 있다 (문헌 [Murhead, S. Feedstuffs 72(45):1-4, 2000] 참조).

또한, 육류 생산 산업에서는 사료 중 항생제 및 항-미생물제의 사용을 금지할 경우 수확량이 손실되고 동물 질병의 소생이 가능할 수 있다고 염려하고 있다. 예를 들어, 1986년에 스웨덴은 사료 항생제의 사용을 금지하였고 이는 동물 질병의 증가를 가져왔다. 여기에, 치료적 항생제 사용의 증가가 동반되어 전체 항생제 사용이 증가하였을 뿐만 아니라 육류용 동물 생산 비용의 증가가 야기되었다 (문헌 [Smith, Feedstuffs 71(13):1, 1999] 참조). 1998년 12월, EU 각료위원회 (Council of Ministers)는 사료 중 처방전이 필요없는 성장 촉진제로서 정식으로 승인되었던 6가지 항-미생물제의 사용을 중지시키기로 결정하였다 (법령 70/524에 관한 문헌 [Official Journal of the European Communities 29. 12. 98, Council Regulation No. 2821/98] 참조). 2가지 퀴녹살린계 첨가제들도 또한 육류내에 잔류할 수 있다는 염려 때문에 1999년 8월에 금지되었다. 이러한 결정의 결과로 브로일러 닭 (broiler) 중 괴사성 장염; 새끼 돼지에서 클로스트리듐 퍼프린겐스 (Clostridium perfringens)으로 인한 장염; 돼지 이질 및 스피로헤타성 설사; 및 대장균-관련 설사를 포함하는, 공식적으로 억제된 질병의 발병률이 증가하였다 (문헌 [Miller, United States Animal Health Association, 1999 Proceedings "Antibiotic Usages in Food Animal Production and Resistance-European Perspective."] 참조).

매년 내성 병원체로부터의 병원 감염에 의해 30,000명의 사람이 사망하지만, 음식물 매개 병원체로 인한 사망은 훨씬 적다. 음식물 매개 병원체로 인한 사망 중 어느 것도 항생제 내성과는 무관하다 (상기 스미스 (Smith)의 문헌 참조). 따라서, 육류 생산 산업에 의한 항생제의 사용이 사람에서 병원 감염의 약물-내성 병원체 문제점에 기여하는지는 명백하지 않다. 또다른 염려는 내성 병원체로 인한 감염을 치료할 수 있는 새로운 항생제가 부족하다는 것이다 (문헌 [Henry, C. M., Chemical and Engineering News, March 6, 2000, pp 41-58] 참조). 이는 상당한 항생제 내성 병원체가 나타날 경우 감염을 치료하는데 사용할 수 있는 새로운 항생제가 없을 수도 있음을 의미한다. 항생제 개발, 시장 규모 및 규제 문제점에 있어서의 어려움으로 인해 일류 제약 회사들의 R&D 초점이 (특히 동물에서 사용하기 위한) 항생제 개발에서 멀어지게 되었다. 동물에서 사용하기 위한 약물의 등록에 대해 새로 제안된 규칙들이 너무 까다로와 약물의 개발이 중단되고 있다 (상기 스미스의 문헌). 그러나, 새로운 항생제 개발에 참여하고 있는 몇몇 소규모 회사들이 있다 (상기 헨리 (Henry)의 문헌).

특정 동물 집단에서 감염은 이미 보편적이다. 예를 들어, 조류 콕시듐증은 다만 관리만될 뿐 실제로는 제어되지 않는 질병이다. 사실상 모든 무리들이 감염되어 있고 보통 항콕시듐 화학약품을 사료중에 넣어 손상을 막고 내성 균주의 발달을 제한한다. 콕시듐증으로 인하여 가금류 생산업자들은 매년 3억5천만 달러의 손실을 입을 뿐만 아니라 살리노마이신과 같은 항생제 약물에 대한 약물 비용이 든다 (문헌 [Suszkiw, USDA Agricultural Research Service News, October 28, 1997] 참조). 1999년까지 미국에서 콕시듐증에만 매년 약 1억1천4백만 달러가 지출된 것으로 추정된다 (문헌 [Frost & Sullivan, U.S. Pharmaceutical Products for Food Animals, Report 5245-54, 1995] 참조).

집약적인 사육 방법을 이용하여 사육된 동물의 소화관에서 감염을 억제하기 위한 새롭고 더욱 효과적인 방법을 찾는 것이 명백히 필요하다. 이러한 필요성은 신속하게 팽창하는 세계 인구와 보조를 맞추도록 더 양호한 생산 효율성을 얻기 위한 요건을 토대로 이루어진 것이다. 장관 감염에 대한 개선된 억제는 더욱 빠른 성장률 및 개선된 사료 효율을 보장한다. 또한, 사람 병원체에서 항생제 내성 발달 가능성에 대한 염려를 해결하기 위해 동물 사육에 사용하는 항생제에 대한 대안이 필요하다.

모든 항생제와는 다른 방식으로 작용하는 효소-기재 치료법을 사용시 사람 건강에 문제점을 일으키는 내성 병원체 미생물의 진화를 자극할 위험이 없다. 효소는 단백질이므로, 몇몇 항생제 및 항-콕시듐증 화학약품에서처럼 위험한 화학약품 잔류물이 육류 제품으로 혼입될 가능성이 없다 (문헌 [American Feed Control Officials Inc., Official Publication, 1999, "Drugs and Feed Additives, Section 30.0 Enzymes," pp. 206-217, ISBN 1-878341-10-3] 참조).

<발명의 요약>

따라서, 본 발명의 목적은 소화관 감염의 영향을 감소시키기 위한 효소 치료법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 병원체가 소화관의 세포에 결합하는 것을 방해함으로써 소화관 감염의 영향을 감소시키기 위한 메카니즘을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또다른 목적은 감염 또는 괴사성 장염을 야기하는 병원체에 감염된 동물에서 체중 증가 및 사료 효율을 증가시키 위한 접근법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 미생물성 병원체에 감염되거나 감염될 위험이 있는 대상체의 상태를 개선하는 데 효과적인, 경구 투여에 적합한 투여 형태를 제공하는 것이다.

이러한 목적 및 기타 다른 목적들을 달성하기 위해, 본 발명의 한 측면에 따라 (i) 세포 표면 단백질 또는 탄수화물을 방출시키는 결합을 절단하는, 엔도-1,4-β-D-만나나제 이외의 효소, 및 (ii) 효소에 대해 생리적으로 허용되는 담체를 포함하며, 경구 투여에 적합한 형태이며 효소 이외의 감염 방지제를 포함하지 않는 조성물이 제공되었다. 한 실시양태에서, 해당 효소는 세포 표면 단백질을 방출시키는 결합을 절단한다.

바람직한 실시양태에서, 조성물 중에 포함된 효소는 스핑고마이엘리나제 또는 포스포리파제, 특히 C형 또는 D형 포스포리파제이다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 효소는 세포 표면 단백질 또는 탄수화물을 방출시키는 결합을 절단하는 에스테라제, 세레브로시다제 및 카보하이드라제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또다른 실시양태에서, 효소는 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus) 균주, 바람직하게는 ATCC 7004 또는 ATCC 6464로부터 제조된다. 별법으로, 효소는 바실러스 메 가테리움 (Bacillus megaterium) 효소를 코딩하는 재조합 DNA를 발현시킴으로써 얻어진다. 또다른 실시양태에서, 효소는 젤라틴 캡슐 외피에 함유되고, 사료 1kg당 200 IU 내지 4000 IU로 조성물 중에 존재한다.

본 발명의 또다른 측면에 따라, 상기 언급한 성분 (i) 및 (ii)를 갖고, 생리상 허용되는 담체는 효소가 혼입된 식료품인 조성물이 제공되었다. 따라서, 조성물은 효소 이외의 다른 감염 방지제를 함유하지 않는 동물용 사료일 수 있다. 본 발명의 동물용 사료 조성물은 옥수수, 수수, 밀, 보리 또는 귀리와 같은 곡물, 콩 또는 완두콩과 같은 단백질 공급원, 및 비타민류, 아미노산류 및 무기질을 더 포함한다.

본 발명의 또다른 측면에 따라, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 고체 또는 액체 투여 형태의 조성물을 제공한다.

또한, 소화관 감염으로 고통받거나 그 위험성이 있는 대상체에, 세포 표면 단백질 또는 탄수화물을 방출시키는 결합을 절단하는, 엔도-1,4-β-D-만나나제 이외의 효소를 유효량으로 경구 투여하는 것을 포함하는, 소화관 감염을 치료하거나 그 위험성을 경감시키는 방법을 제공한다. 또한, 이 방법은 효소 이외의 감염 방지제의 투여를 포함하지 않는다. 감염은 에이메리아속 (Eimeria) 및 크립토스포리듐속 (Cryptosporidium)과 같은 원충류, 클로스트리듐속 (Clostridium)과 같은 박테리아, 진균류 또는 효모 병원체에 의해 영향받을 수 있다.

(i) 세포 표면 단백질 또는 탄수화물을 방출시키는 결합을 절단하는 효소, 및 (ii) 효소에 대해 생리학상 허용되는 담체를 포함하는, 경구 투여에 적합한 형 태이고 상기 효소 이외의 감염 방지제를 함유하지 않는 조성물도 또한 제공한다.

또한, 소화관 감염으로 고통받거나 그 위험성이 있는 대상체에, 세포 표면 단백질 또는 탄수화물을 방출시키는 결합을 절단하는 효소를 유효량으로 경구 투여하는 것을 포함하며, 상기 효소와 함께 항-미생물적 유효량의 다른 감염 방지제를 투여하는 것을 포함하지 않는, 소화관 감염을 치료하거나 그 위험성을 경감시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 기타 목적, 특징 및 장점은 하기 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 상세한 설명으로부터 본 발명의 주제 및 범위내에서 다양한 변화 및 변형이 당업자들에게 명백하기 때문에, 바람직한 실시양태를 나타내고 있는 상세한 설명 및 특정 실시예들은 단지 예시를 위한 것이다. 또한, 실시예들은 본 발명의 원칙을 설명하고 있으며, 종래 기술의 기술자들에게 뚜렷하게 유용할 경우에 감염의 모든 예에 본 발명의 적용을 구체적으로 설명하고 있는 것을 기대해서는 않된다.

도 1은 바실러스 메가테리움 균주에 의해 생성된 재조합 PI-PLC 효소의 항크립토스포리듐 (anti-cryptosporidial) 활성을 나타내고 있다.

세포 표면 단백질 또는 탄수화물을 방출시키는 결합을 절단하는 능력을 특징으로 하는 특정 클래스의 효소는 경구 투여시, 예를 들어 소화관 감염의 치료에 효과적인 상당한 항생제 활성을 나타낸다는 것을 알게 되었다. 효소 클래스는, 이에 제한되지는 않지만 스핑고마이엘리나제와 C형 및 D형 포스포리파제, 및 동등한 절 단 특이성을 갖는 효소를 포함한다. 따라서, 이러한 클래스의 예는 포스파티딜이노시톨에의 결합을 통해 막-고정된 당단백질 또는 탄수화물을 절단하여 방출시키는 효소이다. 따라서, 효소 포스파티딜이노시톨 특이성 포스포리파제 C (E.C. 3.1.4.10) (또한, 약어로 PI-PLC 또는 1-포스파티딜이노시톨 포스포디에스테라제로 알려져 있음)는 이러한 클래스의 일원이다. 또다른 예는 글리코실포스파티딜이노시톨-특이성 포스포리파제 D, 즉 GPI-PLD이다 (문헌 [Low and Prasad, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:980-984, 1988] 참조).

GPI-PLD 및 PI-PLC 효소는 진핵생물에서 얻은 것에 대해 설명되어 왔다. 문헌 [Low, "Degradation of glycosyl-phosphatidylinisitol anchors by specific phospholipases", Chapter 2, pp 35-63, in MOLECULAR AND CELL BIOLOGY OF MEMBRANE PROTEINS:GLYCOLIPID ANCHORS OF CELL-SURFACE PROTEINS, A. J. Turner (ed.), Ellis Horwood, New York, 1990; Low and Prasad, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:980-984, 1988; Essen et al., Nature 380: 595-602, 1996; 및 Essen et al., Biochemistry 36:2753-2762, 1997]를 참조한다. PI-PLC는 박테리아에 의한 세포외 생성을 비롯하여, 원핵생물에서 얻은 것에 대해 설명되어 왔다. PI-PLC의 공지된 박테리아 공급원은 바실러스 세레우스 (문헌 [Stein and Logan, J. Bacteriol. 85:369-381, 1963; Stein and Logan, J. Bacteriol. 90:69-81, 1965; Ikezawa et al., Biochimica et Biophysica Acta 450:154-164, 1976; Griffith et al., Methods in Enzymology 197:493-502, 1991; Volwerk et al., J. Cell. Biochem. 39:315-325, 1989; and Kuppe et al., J Bacteriol. 171:6077-6083, 1989] 참조), 바실루스 튜링기엔시스 (Bacillus thuringiensis) (문헌 [Ikezawa and Taguchi, Methods in Enzymology 71:731-741, 1981]; 일본 특허 JP 55034039), 스타필로코커스 아우레우스 (문헌 [Low and Finean, Biochem J. 162:235-240, 1977]), 및 클로스트리듐 노비이 (Clostridium novyi) (문헌 [Taguchi and Ikezawa, Arch. Biochem. Biophys. 186:196-201, 1978])이다.

PI-PLC 효소에 대한 개선된 효소 분석 기술은 형광성 기질을 기재로 하여 고안되어 왔다. 문헌 [Hendrickson et al., Biochemistry 31:12169-12172, 1992; Hendrickson, Anal. Biochem. 219:1-8, 1994; Hendrickson et al., Bioorg. Med. Chem. Letters. 1:619-622, 1991]을 참조한다.

확실히 어느 이론의 탓으로도 돌리지 않고, 본 발명자들은 PI-PLC 효소가 세포 표면 단백질 및 다른 글리코실 포스파티딜이노시톨의 포스파티딜이노시톨 당지질 고정자를 절단하는 능력을 갖는다고 강조한다. 상기 로우 (Low)의 문헌, 문헌 [Low and Saltiel, Science 239:268-275, 1988]를 참조한다. 예를 들어, 몇몇 원충류 기생충의 변이체 표면 당단백질, 및 다른 표면 단백질 및 탄수화물은 글리코실 포스파티딜이노시톨 지질 (GPI 고정자)에 의해 고정되고 PI-PLC의 분해 및 방출에 감응성이다. 예시적인 종들은 쉬스토소마속 (Schistosoma), 톡소플라스마속 (Toxoplasma), 플라스모디움속 (Plasmodium), 트리파노소마속 (Tripanosoma), 및 레슈마니아속 (Leishmania) (상기 로우의 문헌) 뿐만 아니라 에이메리아속, 바베시아속 (Babesia), 타일레리아속 (Theileria), 지아르디아속 (Giardia), 렙토모나스속 (Leptomonas) 및 엔트아메바속 (Entamoeba)에 속한다. 문헌 [McConville and Ferguson, Biochemical J. 294:305-324, 1993; Pearce and Sher, J. Immunol. 142:979-984, 1989; Sauma et al., Mol. Med. Biochem. Parasitol. 46:73-80, 1991; Hawn and Strand, Mol. Med Biochem. Parasitol. 59:73-82, 1993]를 참조한다.

세포 표면 성분에 대한 고정 메카니즘은 효모로부터 포유동물까지의 진핵세포에 대해 보편적인 것으로 보인다. 매우 원시적인 진핵생물로 여겨지는 지아르디아 람블리아 (Giardia lamblia)에서 GPI 고정자의 존재는, 이러한 종류의 고정자가 진핵생물에서 일찍 진화되었다는 것을 시사한다. 아케박테리아 (archaebacteria)에서 새로운 포스포글리세롤리피드 GlcNal-6-myo-이노시톨-P-디알킬글리세롤의 발견은 이러한 이해와 일치하며 (문헌 [Nishihara et al., J. Biol. Chem. 267:12432-12435, 1992] 참조), 이는 더욱 복잡하게 진화된 진핵생물의 GPI 고정자 구조에 대한 기초가 된다. 원충류에서, GPI 고정 시스템은 고등 진핵생물에서보다 더욱 중요하게 이용되고, GPI-고정 구조는 곤충 및 포유동물 숙주에서 기생충의 생존에 중요하다는 증거가 있다 (상기 맥콘빌 (McConville) 및 페르거슨 (Ferguson)의 문헌 참조). 예를 들어, 변이체 표면 당단백질의 잦은 절단 (shedding)은 면역계의 공격을 피하기 위한 메카니즘일 수 있다.

원충류인 에이메리아 테넬라 (Eimeria tenella)에는 트리파노소마 브루세이 (Trypanosoma brucei)의 당단백질/당지질과 유사한 포스파티딜이노시톨-고정 구조가 있다. 이들은 막 부착 및 후속 감염에 중요한 것으로 여겨진다. 문헌 [Gurnett et al., Mol. Med. Biochem. Parasitol. 41:177-186, 1990]를 참조한다. 에이메리아의 구조는 트리파노솜 (trypanosome) 리파제 및 바실러스 튜링기엔시스 PI-PLC에 의해 절단된다 (상기 거르넷 (Gurnett)의 문헌). 실현가능한 것으로 입증된다면, 기생충의 PI-PLC를 이용한 생체내 치료는 숙주의 면역계를 도와 소화관으로 유입되는 병원체의 부착 및 감염을 방해할 수 있을 것이다. 에이메리아 종들은 가금류 산업에서 보편적이고 비용적인 문제의 원인이다. 또다른 원충류 기생충인 크립토스포리듐 파르붐 (Cryptosporidium parvum)은 보편적이며, 사람 및 많은 동물에서 급성 설사 질병을 야기한다. 포자소체 단백질인 GP 15/45/60은 DNA 서열을 토대로 GPI 결합 단백질일 것으로 예견되고, 이러한 포자소체 단백질에 반응성인 모노클로날 항체는 감염을 억제한다 (문헌 [Strong, W. B., et al., Infection and Immunity 68:4117-4134, 2000; Cevallos, A. M., et al., Infection and Immunity 68:4108-4116, 2000] 참조). 따라서, 클로스트리듐 파르붐은 PI-PLC로 잠재적으로 치료가능한 또다른 병원체이다.

원핵성 박테리아는 포스파티딜이노시톨에 의해 고정된 표면 당단백질 및 탄수화물을 포함하지 않지만 (상기 맥콘빌 및 페르거슨의 문헌), PI-PLC는 부착 과정을 방해함으로써 박테리아 감염을 역시 감소시킬 수 있다. 병원성 대장균 및 많은 다른 공지의 병원성 장내세균 (Enterobacteriaceae)은 섬모의 말단부에 나타나는 29 kD 만노스-결합 렉틴인 세균성 부착인자 (adhesin) FimH을 발현한다 (문헌 [Abraham et al., Nature 336:682-684, 1988]). 이러한 부착인자가 GPI-고정 분자인 비만 세포의 CD48에 결합한다는 것이 증명되었다 (문헌 [Malaviyaetal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:8110-8115, 1999]). PI-PLC를 이용한 시험관내 분해는 ( 코리네박테리움 디프테리아 (Corynebacterium diphtheria)로부터의) 돌연변이 GPI-고정 디프테리아 독소 수용체의 쥐 NIH3T3 세포에 대한 결합을 감소시켰다 (문헌 [Lanzrein et al., EMBO J. 15:725-734, 1996]). 또한, 클로스트리듐 셉티쿰 (Clostridium septicum)의 알파 독소 및 에어로모나스 하이드로필라 (Aeromonas hydrophila)의 에어로리신 (aerolysin)은 모두 C-말단 GPI-고정자에 의해 세포 표면에 부착되어 있고, PI-PLC를 이용한 처리에 의해 세포 표면으로부터 제거할 수 있다 (문헌 [Gordon et al., J. Biol. Chem. 274:27274-27280, 1999]).

박테리아 감염의 효과를 감소시키 위한 PI-PLC의 메카니즘은 숙주 비만 세포로부터 CD48 결합 부위를 유리시키는 것과 관련된 것이다. 또한, 비만 세포로의 FimH 결합은 염증 반응을 유발한다. 따라서, 본 발명에 따라 결합 부위를 감소시키는 것은 또한 과도해질 수 있는 염증을 감소시켜 주고, 염증 반응이 종양 괴사 인자 α의 분비를 수반하므로 장관 건강 그 자체에 손상을 주는 것을 감소시켜 준다 (상기 말라비야 (Malaviya)의 문헌). 따라서, 염증을 감소시키고 종양 괴사 인자의 분비의 기저가 되는 이러한 메카니즘을 통해, 본 발명에 따른 포스포리파제 처리가 과민성 대장 증후군, 대장염 및 크론병 (Crohn's Disease)과 같은 증상을 특징으로 하는 징후를 완화시킬 것이다 (문헌 [van Deventer. S. J., Ann. Rheum. Dis. 58 (1):I114-I120 (November 1999)]).

또한 바이러스성 감염에 대해서도, 본 발명은 바이러스성 입자와 바이러스가 생체내 감염시킬 수 있는 세포간의 결합을 파괴시킴으로써 효과적이어야 한다. 본원에 기재된 바와 같이 경구 투여의 효율성에 대한 본 발명자들의 발견의 측면에 서, 흥미롭게도 인플루엔자 바이러스를 포스포리파제 C로 예비처리함으로써 50％의 바이러스 인지질의 분비를 야기하여 병아리 배아의 감염이 상당히 감소하였다 (문헌 [Mizutani et al., Nature 204:781-782, 1964]). 반대로, 배양된 병아리 배아의 섬유아세포를 클로스트리듐 퍼프린겐스로부터 단리된 포스포리파제 C로 예비처리하면, 셈리키 포레스트 바이러스 (Semliki Forest Virus)에 의한 세포의 후속 감염이 현저하게 억제되었다 (문헌 [Friedman and Pastan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 59:1371-1378, 1968]. 당업계에서는 이러한 현상에 어떠한 치료적 중요성도 없다고 파악했지만, 한편으로 이들은 본 발명의 기초가 된다고 생각되는 메카니즘 (즉, 감염에 필요한 상호작용을 방해하는 병원체 표면 리간드 및(또는) 그의 동족 세포-막 수용체의 절단)과 일치한다.

본 발명이 바이러스성 감염을 예방하는데 효과적일 수 있는 다른 방법은, 바이러스성 GPI-고정 단백질이 감수성 세포에 결합하는 것을 방해하는 것이다. PI-GPC 분해에 대해 감응성이 있는 바이러스성 GPI-고정 단백질의 예로는 덴규 바이러스 (Dengue Virus) NS1 (비구조적 단백질 1)이 있다 (문헌 [Jacobs et al., FASEB J 14:1603-1610, 2000] 참조). 바이러스에 대한 결합 부위인 숙주 세포 GPI-고정 단백질의 몇몇 예가 있다. 이러한 예로는 GPI-고정 CD55 (붕괴촉진인자, DAF)에 결합하는 사람 에코바이러스 (Ecovirus) 6, 7, 12 및 21과 엔테로바이러스 (Enterovirus) 70이 포함된다 (문헌 [Clarkson et al., J. Virology 69:54975501, 1995; Bergelson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6245-6248, 1994; 및 Karnauchow, et al., J. Virology 70:5143-5152, 1996] 참조). 개 파르보바이러스 (CPV) 감염은 시험관내에서 PI-PLC를 이용한 고양이 세포의 예비처리에 의해 차단할 수 있다 (문헌 [Barbis and Parrish, Brazilian J. Med BioL Res. 27:401-407, 1994]).

감염을 개시하는데 중요하다고 추정되는 몇몇 세포 표면 수용체들은 GPI 고정자 이외의 메카니즘에 의해 막에 부착된다. 여기에는 콜레스테롤 에스테르 (문헌 [Rostand and Esko, J. Biol. Chem. 268:24053-24059, 1993]), 비포스포릴화된 (non-phosphorylated) 글리코스핑고리피드 (문헌 [Karlsson, Ann Rev. Biochem 58:309-350, 1989]) 및 다른 인지질, 예를 들어 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딜세린과 같은 구조가 포함된다 (문헌 [Sylvester, Infect. Immun. 64:4060-4066, 1996]).

따라서, 상기 기재된 이유로 인해 세포 표면으로부터 이들 구조를 방출시키는 활성을 지닌 적절한 에스테라제, 세레브로시다제, 카보하이드라제 및 포스포리파제를 사용하여 이러한 구조를 표적으로 하는 것은 본 발명에 따라 경구 투여시 소화관 감염을 치료하는데 유리한 효과를 나타낼 것이다.

진핵생물에서 포스파티딜이노시톨-연결된 표면 단백질 및 탄수화물의 보편적인 특성에 의해, 세포 표면 단백질 및(또는) 탄수화물에 대한 고정 결합을 절단하기 위해 급성적 또는 예방적인 효소의 투여를 수반하는 본 발명의 치료적 방법론은 원충류, 박테리아, 진균성 및 바이러스성 소화관 감염을 치료하는 데 널리 적용될 것이다. 이러한 목적을 위해, 본 발명의 중요한 측면은 세포 표면 성분의 절단시에만 활성을 나타내는 것은 아닌 효소를 감염 방지제로서 경구적으로 투여할 수 있 으며 생체내에 효과적일 수 있다는 것을 입증하는 것이다. 특히, 대표적으로 적합한 효소인 PI-PLC는 1960년대부터 사용할 수 있었지만 이러한 접근법은 지금까지 제안되지 않았다.

본 발명의 또다른 측면은 상기 기재한 바와 같이 효소를 동물용 사료 제제에서 효과적인 감염 방지제로서 사용하여, 상기 사료를 소비하는 동물에서 소화관 감염을 치료하거나 그 위험성을 경감시키는 것이다. 엔도-1,4-β-D-만나나제를 포함하는 사료 제제가 공지되어 있고, 몇몇 문헌에는 만나나제에 대한 항진균 활성이 제안되어 있다 (문헌 [WO 00/21381 (PCT/EP99/07835) 및 Kudo et al., Experentia 48:227-281, 1992] 참조). 이러한 예에서, 항생제를 함유하지 않는 사료에서의 효소 사용에 대한 가능성이 일반적으로 논의되었지만 만나나제는 승인된 항생제와 조합된다 (문헌 [Adams, Feed Mix (Special 2000), pp 16-18] 참조).

따라서, 본 발명의 한 측면에서는 상기 언급된 절단 활성을 특징으로 하는, 만나나제 이외의 또는 더욱 구체적으로는 엔도-1,4-β-D-만나나제 이외의 효소를 함유하는 사료 조성물을 포함하는 조성물에 관한 것이며, 상기 효소는 예를 들어 문헌 [ENZYME NOMENCLATURE 1992 (Academic Press) (등록 번호 3.2.1.77, 3.2.1.78, 3.2.1.101, 3.2.1.106, 3.2.1.130, 및 3.2.1.137 참조)]에 기재된 바와 같이 상이한 절단 특이성을 갖는 만난-관련 효소와는 구별된다. 또한, 본 발명에서는 만나나제를 포함하지만 다른 감염 방지제는 함유하지 않는 조성물을 고려하고 있다.

따라서, 본 발명에 따라 바실러스 세레우스로부터 얻어지고 PI-PLC 함량에 대해 표준화된 세포외 효소 제제를 사용함으로써, 감염 발생시 체중 증가 및 사료 효율을 상당히 개선시킬 수 있다. 바실러스 세레우스는 음식물-매개 위장염 및 바실러스 세레우스 내안구염을 통상적으로 야기하는 기회감염 병원체이기 때문에 이러한 결과를 예상치 못하였다.

초기의 연구에서는 세포외 비. 안트라시스 (B. anthracis) 또는 비. 세레우스 (B. cereus)의 효소를 토끼에 주입하면 포스파세미아 (phosphasemia) 및 심지어는 죽음까지도 야기한다고 보고하였다. 예를 들어, 문헌 [Stein and Logan, J. Bacteriol. 85:369-381, 1963]를 참조한다. 따라서, 위장염을 야기하는 병원체로부터의 세포외 효소가 세균성 감염에 의해 야기된 질병과 관련하여 본 발명에 따른 치유 효과를 갖는다는 것은 놀라운 사실이다.

바실러스 세레우스는 포스포리파제 C 및 스핑고마이엘리나제로 구성된 PI-PLC 및 세레올리신 AB를 포함하는 다양한 세포외 막-활성 효소 및 세포붕괴 독소를 생성한다 (문헌 [Gilmore, J. Bacteriol. 171:744-753, 1989] 참조). 상기 언급한 효소 제제에서, 비. 세레우스에 의해 생성된 세포외 포스파티딜이노시톨-특이적 포스포리파제 C [E.C. 3.1.4.10]는 활성 성분인 것으로 여겨진다. 본 발명의 효소 치료법은 항콕시듐제 및 항생제로서 효과적으로 작용하였다. 따라서, 이러한 효소 치료법은 특히 현재 사용되는 물질들이 금지될 때, 소화관 감염의 치료에 대한 효과적이고 상업상 실행가능한 접근법이다.

피복되지 않을 경우, 효소는 위장의 위액에 의해 비가역적으로 활성을 잃을 수 있다. 미국 특허 제4,079,125호에는 효소-결핍 포유동물이 섭취하기 위한 조성물을 포함하는 개선된 장내 피복된 효소가 기재되어 있다. 놀랍게도, 피복되지 않 은 PI-PLC를 동물용 사료에 첨가하더라도 병원체 감염의 효과적인 치료를 야기한다.

본 발명에 따른 효소 조성물은 바람직하게는 건조된 고체 또는 액체 경구 조성물로 제형화된다. 이러한 조성물은 일반적으로 완충액, 탄수화물 및(또는) 글리콜과 같은 안정화제를 포함할 것이다. 본 발명에 따라, 정제 또는 캡슐로 혼입하는데 적합한 건조된 보존-안정성 제형의 효소는, 예를 들어 유동화 층 건조기에서 불활성 담체 또는 탄수화물 담체를 사용하여 동결-건조, 분무 건조시킴으로써, 또는 유리-형성 안정화제와 관련된 증발 기술을 이용함으로써 제조될 수 있다 (문헌 [Franks et al., Biopharm. 4:38-55, 1991] 참조). 또다른 접근법은 분말 형성을 위해 아세톤을 사용하여 황산암모늄 침전 또는 용매 침전과 같이 염 침전시킨 후 건조시키고 담체와 혼합하는 것을 포함한다.

특정 탄수화물, 특히 단당류, 이당류 및 저급 올리고당은 중요한 유리-형성 탄수화물이다. 담체로 사용하기 위한 대표적인 탄수화물로는 상기 프랭크 (Franks)의 문헌에 기재된 바와 같이, 크실로스, 프럭토스, 글루코스, 소르비톨 및 말토트리오스가 있다. 탄수화물 담체는 효소와의 상용성, 낮은 흡습성 및 유리한 유리 전이 곡선을 기준으로 선택한다. 안정화제 트레할로스는 상온에서 안정한 생물학적 제제의 제조에 특히 적합하다. 미국 특허 제4,891,319호; 문헌 [Roser, Biopharm. 4 (8):47-53, 1991; Colaco et al., Bio/Technology 10:1007-1011, 1992; Aldridge, Genetic Engineering News, March 15, 1995, pp 10-11]를 참조한다.

본 발명의 효소는 수분 활성을 저하시키고 단백질을 안정화시키기 위한 소르비톨 또는 글리세롤을 사용하여 시럽과 같은 액체로 제형화될 수 있다. 이러한 용액은 통상적으로 제약적으로 사용하기 전에 멸균-여과시킨다.

상기 언급한 바와 같이, 본 발명은 한 측면에서 사료 또는 음식물의 성분으로서 효소의 전달에 관한 것이다. 사료는 주로 곡물, 단백질 공급원, 비타민류, 아미노산류 및 무기질로 구성된다. 곡물에는 통상적으로 옥수수, 수수, 밀, 보리 또는 귀리가 포함된다. 단백질 공급원은 예를 들어 콩 또는 완두콩일 수 있다. 대표적인 무기질, 아미노산류 및 비타민류는 B₁₂, A, 판토텐산, 니아신, 리보플라빈, K, DL-메티오닌, L-리신, 염화콜린, 엽산, 인산이칼슘, 황산마그네슘, 황산칼륨, 탄산칼슘, 염화나트륨, 나트륨 셀레나이트 (sodium selenite), 산화망간, 요오드화칼슘, 산화구리, 산화아연 및 D-활성화 동물 스테롤을 포함한다.

사료에서 사용하기 위해, 염수 (예, NaCl, 15-18％ w/w) 또는 시럽을 사용하여 액체 효소 제제를 제조함으로써 수분 활성을 저하시키고 농축된 생성물에서의 미생물의 증식을 방지할 수 있다. 나트륨 벤조에이트, 프로필파라벤, 나트륨 또는 칼륨 소르베이트, 및 아스코르빌 팔미테이트는 생성물에서 미생물 증식으로 인한 잠재적 손상을 방지하는 데도 사용할 수 있는 승인된 화학약품 보존제의 예이다 (문헌 [Association of American Feed Control Officials, Inc., Official Publication 2000, Part 18, "Chemical Preservatives" pp 215-217, ISBN 1-87834111-1]). 이러한 보존제들을 자동화된 분무 기술에 의해 묽게 희석하여 펠렛 화한 후에 사료에 사용할 수 있다 (문헌 [Fodge et al., Feedstuffs, September 29, 1997] 참조). 이러한 액체 제제는 적합하다면 소르비톨 또는 글리세롤과 같은 안정화 탄수화물을 포함할 수 있다. 열-불안정한 다른 효소 또는 비타민과 같은 사료의 바람직한 성분인 재료들은 효율을 증가시키기 위해 함유될 수 있다.

사료를 비펠렛화 매쉬 형태 (즉, 열처리되지 않음)로 사용하는 경우, 본 발명의 효소는 사료 혼합기에 첨가하기 위한 건조 농축물로 제공될 수 있다. 이러한 건조 효소 농축물은 먼저 10 Kd NMWC 및 다른 적합한 한외여과기를 사용하여 액체 효소 제제를 농축시켜 효소 함량 ％를 높인 후, 매우 건조한 담체, 예를 들어 옥수수 그릿 (grit), 콩 그릿, 또는 사료에서의 사용이 승인된 불활성 재료 또는 불용성 염과 함께 혼합함으로써 제조된다 (상기 문헌 [Official Publication, American Feed Control Officials, Part 582, "Substances generally regarded as safe in animal feeds."] 참조).

저온에서 충분한 활성을 유지하면서 몇몇 사료 분쇄기 중 펠렛화 공정을 견뎌내어 소화관에서 작용할 수 있을 정도로 충분히 안정한 효소의 생성에 사용할 수 있는 많은 기술이 있다. 주로 코딩 DNA 서열의 변화를 통해, 그 다음으로는 화학적 개질을 통해 단백질 구조를 변형시키면, 효소가 활성을 잃지 않고 더욱 안정하게 된다고 공지되어 있다. 이러한 면에서 한 설명은 효소 결정의 화학적 가교결합을 사용한다 (문헌 [Collins et al., Organic Process Research and Development 2 (6):400-406, 1998]). 본 발명 효소의 안정성을 증가시키려는 또다른 접근법은 해당 효소를 코딩하는 유전자의 돌연변이생성에 의한 아미노산의 변이, 또는 셔플링 하기 위해 유전자 또는 유전자의 일부를 얻는 것을 필요로 한다 (문헌 [Crameri et al., Nature 391:288-291, 1998; Arnold, Nature Biotechnol. 16:617-618, 1998b; Zhao et al., Nature Biotechnol. 16:258-235, 1998; Zhao and Arnold, Protein Eng. 12:47-53, 1999]). 효소의 "지시된 진화 (directed evolution)"를 통해 바람직한 특성을 갖도록 돌연변이생성 및 선발하는 것도 또한 실행가능하다. 예를 들어, 문헌 [Giver et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 95:12809-12813, 1998; Liao et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:576-580, 1986; Cherry et al., Nature Biotechnol. 17:379-384, 1999]를 참조한다.

글리코실화, PEG 도입 (PEGylation) 및 숙시닐화 (succinylation)를 비롯한 특정 단백질 변형도 또한 안정성을 강화하고, pH를 최적조건 (본 발명에 사용하려는 효소에 대해 최적화될 수 있는 특성)으로 변화시킨다. 따라서, 본 발명의 치료 방법론에서 적합성을 측정하기 위해 실시예에 따라 시험할 수 있도록 변형된 효소를 제조하는 데 공지된 프로토콜을 사용할 수 있다.

PI-PLC의 효과적인 제조 방법은 비. 세레우스 유전자를 비. 메가테리움으로 클로닝함으로써 생겨난다. 발현 시스템 (문헌 [Rygus and Hillen, Appl. Microbiol. Bacteriol. 35:594-599, 1991])은 바실러스 메가테리움 크실로스 레귤론으로부터의 성분을 사용하고 (문헌 [Rygus et al., Arch. Microbiol. 155:535-542, 1991]), 이는 바이오101 코포레이션 (BIO101 Corp., 캘리포니아주 비스타 소재)로부터 상업적으로 입수가능하다. 테트라싸이클린 내성으로 안정화되고 크실로스 민감성 억제인자에 의해 조절된 플라스미드 중 PI-PLC 유전자 리더 코딩 서열과 바실러스 메가테리움 xylA 유전자의 처음 세개 아미노산 사이에 융합체가 생성되었다. 발현이 증폭된 이러한 유형의 균주는 본 발명에 따른 동물용 사료에 혼입하기 위한, 상업적으로 유용한 양의 PI-PLC를 제조하기 위한 실현가능한 수단을 제공한다.

몇몇 바실러스 세레우스 단리물은 투니카마이신과 같은 항생제를 생성한다 (문헌 [Kamogashira et al., Agric. Biol. Chem. 52:859-861, 1988]). 또다른 바실러스 세레우스의 단리물 (ATCC 53522)은 식물에서 모잘록병 및 뿌리썩음을 방지하기 위한 생물농약 (biocontrol agent)으로서 미국 특허 제4,877,738호 및 제5,049,379호에 기재되어 있다. 이러한 효과는 "쯔비터미신 (Zwittermicin)" (396 달톤 선형 아미노폴리올) 및 "안티바이오틱 (Antibiotic) B" (아미노글리코시드)로 명시되는 2가지 항생제의 작용으로부터 기인한 것이라 믿어진다. 하기 자세한 실시예에서, 이러한 2가지 항생제를 포함할 가능성을 효소 제제로부터 가능한 저분자량 항생제를 배제함으로써 제거할 수 있었다.

특히, 무세포 발효액을 10 Kd의 분자량 컷오프 막에 의해 농축하였다. 10 Kd 초과의 단백질을 함유하는 농축물을 후속 처리에 사용하였다. 상기 핸델스만 (Handelsman)의 문헌에 기재된 바와 같은 저분자량 항생제는 이 필터를 통과할 것이다. 또한, 황산알루미늄 침전물을 사용하여 고분자량 단백질을 침전시켜 용액 중에 저분자량 물질을 남겼다. 황산암모늄 침전물을 재용해한 후, 얻어진 효소 용액을 완충액에 대해 투석하고, 저분자량 항생제를 제거하는 다른 처리를 하였다. 최종적으로, 단백질을 다시 황산암모늄으로 2회 침전시켜 용액에 임의로 잔류하는 저분자량 화합물을 제거하였다.

이러한 4가지 처리를 병용함으로써, 관찰된 항생제 효과가 ATCC 6464 또는 ATCC 7004에 의해 제조된 저분자량 항생제로 인한 것이라는 가능성을 완전히 배제하였다. 발효액도 또한 항생제의 존재 여부를 대장균 시험 균주로 시험하였지만, 항생제 활성이 검출되지 않았다.

본 발명을 하기 예시적인 실시예들을 참조하여 하기에 더 설명하고 있다.

실시예 1 바실러스 세레우스 ATCC 6464 및 ATCC 7004의 동결 모배양액 제조

ATCC에서 얻은 동결건조 세포가 담긴 병을 열고 암버펌(Amberferm) 4015 (Red Star) 10 g/L, 암버렉스(Amberex) 695 (Red Star) 5g/L, 및 염화나트륨 5 g/L로 구성된 종균 배지(pH 7.0)에 접종하고 30 ℃에서 증식시켰다. 이 1차 배양액을 LB 브로쓰 한천 평판 상에 도말하여 얻은 단일 콜로니를 250 ml 배플 플라스크 (Bellco)의 종균 배지 20 ml에 다시 접종하고 30 ℃에서 진탕하면서 증식시켰다. 배양액 밀도가 OD₆₀₀ 값 1.5에 도달하였을 때 멸균한 글리세롤을 약 10 v/v％ 첨가하고 배양액 1.8 ml가 담긴 병을 -80 ℃에서 동결시켰다.

실시예 2 포스파티딜이노시톨 특이적 포스포리파제 C 생산을 위한 바실러스 세레우스 ATCC 6464 및 ATCC 7004 단리물의 증식

각각 30 리터의 바이오스탓트 C 발효기 2개를 수돗물 중의 다음 조성의 배지를 넣어 뱃치를 만들었다: 1 리터 당 영양 육즙 No. 2 (Oxoid) 25 g/L, 트립톤 (Difco) 10 g/L, 효모 추출물 (Difco) 10 g/L, 및 마주(Mazu) DP10P Mod11 소포제 (BASF) 0.1 mL. 이 뱃치의 초기 용적은 9.5 L였고 육즙은 121 ℃에서 40 분 동안 멸균시켰다. 처음의 pH는 멸균 후 암모니아 가스를 이용해 7.0으로 조정하였다.

접종을 위해 연결 기구로 실리콘관을 부착한 흡인기 연결 기구(Bellco)가 달린 4 리터 배플 쉐이크 플라스크 내에 동일한 배지 50 mL로 종균 배양액을 제조했다. 플라스크를 121 ℃의 오토클레이브에서 50 분 동안 멸균한 후 ATCC 주문품으로 제조한 동결 모배양액(실시예 1) 1.8 mL를 접종하였다. 종균 플라스크 배양액을 30 ℃에서 5.5 시간 동안 제어 환경 인큐베이터 진탕기(NBS model G-25) 내에서 200 RPM으로 진탕하면서 증식시켰다. 접종하기 전에 ATCC 7004 배양액의 OD₆₀₀은 1.53이고 pH는 6.58이었다. ATCC 6464 배지는 OD₆₀₀이 1.28이고 pH가 6.79였다.

종균 배양액 500 mL를 30 리터 발효기에 접종하여 다음의 조건하에 조작하였다: 온도 30 ℃, RPM 600에서 혼합, 기류 10 리터/분 및 압력 0.5 바아. 이 1차 배지의 OD₆₀₀은 0.81이었다. 6시간 후에 발효를 멈추었고 최종 OD₆₀₀은 22.1(ATCC 7004) 및 24.2(ATCC 6464)였다. pH를 조절하지 않고 발효를 진행하여 최종 pH는 8.17(ATCC 7004) 및 8.13(ATCC 6464)였다. 발효기로부터 육즙을 수거하여 다음의 처리까지 8 ℃로 냉각해 두었다.

2종의 ATCC 바실러스 세레우스 단리물을 이용하여 사실상 동일한 방법으로 발효기를 2차로 작동시켰다. 이 경우 종균 배양액을 사용하였고, 6시간째에 OD₆₀₀은 2.86(ATCC 7004) 및 1.98(ATCC 6464)였고, pH는 6.69(ATCC 7004) 및 6.65 (ATCC 6464)였다. 주발효 반응은 6.5 시간 동안 일어났고 최종 OD₆₀₀은 35.9(ATCC 7004) 및 33.6(ATCC 6464)였다. 최종 pH는 냉각 시에 8.38(ATCC 7004) 및 8.47(ATCC 6464)였다.

실시예 3 PI-PLC 효소의 여과 및 농축에 의한 세포 수거

실시예 2에 기재된 발효기 뱃치 4개 각각으로부터 단부끼리 부착시킨 2개의 A/G 테크놀로지 (UFP-500-K-6A) 3 mm 중공사(500,000 분자량 컷오프 (500 Kd NMWC)) 필터를 이용하여 세포를 수거하고 세척하였다. 냉각 육즙을 연동 펌프로 약 2 리터/분의 속도로 펌핑하여 보유 저장고에 다시 재순환시켰다. 효소를 함유한 투과액을 얼음 상에서 냉각한 저장고에 수집하였다. 이 1차 세포-함유 육즙의 용적은 약 9 리터였고 약 2 리터로 농축하여 이 때에 10 mM 트리스-HCl (pH 8.5)를 이용해 투석여과를 시작하였다. 총 약 14 리터 용적의 투과액이 수집된 후에 세포 세척을 종결하였다.

단부끼리 부착시킨 2개의 A/G 테크놀로지 (UFP-10-C-4XTCA) 0.5 mm 중공사 10,000 분자량 컷오프 필터(10 Kd)를 이용하여 500 Kd 투과액 (각각의 발효기 당 약 14 리터)을 농축하였다. 농축물을 재순환하면서 동일한 펌핑 방법을 사용하였고, 다만 여기서의 투과액은 버렸다. 각각의 발효기로부터 다음 처리에 쓰일 약 500 mL 용적의 최종 농축액을 얻었다.

실시예 4 PI-PLC 효소의 추가 정제 및 농축

각각의 바실러스 세레우스 발효액으로부터 얻은 10 Kd 한외여과 농축물 (실 시예 3)을 황산 암모늄을 이용해 80 ％ 포화도로 조정하고 얼음 상에서 60 분 동안 혼합하였다. 이 용액을 솔발(Sorvall) GSA 회전장치로 6000 RPM에서 15 분 동안 원심분리시켰다. 상청액을 따리 버리고 침전물을 최소 용적의 10 mM 트리스-HCl, 0.2 mM EDTA (pH 7.5) 중에 용해시킨 다음 냉소에서 동일한 완충액에 대해 투석을 수행하였다.

각 농축물 중의 단백질 농도를 염료-결합 분석 (BioRad)를 이용해 측정하고 PI-PLC의 수준을 HPLC에 기초한 검출법 및 형광 기질(Molecular Probes, Inc., P-3764, 1-피렌부틸 myo-이노시톨-1-포스페이트, 리튬염)을 이용해 측정하였다 (Hendrickson et al., Bioorg. Med. Chem. Letters 1:619-622, 1991). 하기 표 1은 분석 자료를 요약한 것이며 4개의 조제물 각각에 대해 얻어진 순수물 기준의 대략적인 순도 및 총 효소량이 예상되어 있다. 효소 조제물은 다음 처리 때까지 -20 ℃에서 동결 보관하였다.

조 PI-PLC 효소 조제물의 분석에 대한 개요

효소 조제물	ATCC 균주 번호	단백질 mg/L	비활성 U/mg	조제물 중의 총 단백질 mg	예상 순도² ％	순수물 기준의 총 PI-PLC mg
1	7004	1.86	1.75	325	2.92	9.49
2	6464	1.44	0.52	345	0.867	2.99
3	7004	1.35	4.42	208	7.36	15.3
4	6464	2.06	1.72	256	1.95	5.00
¹U=단위=1 마이크로몰/분 ²100％ 순도의 단백질이 비활성 60 U/mg을 갖는다는 가정에 기초(헨드릭슨의 상기 문헌)

실시예 5 동물 사료에 사용하기 전, 효소 조제물의 모으기 및 농축

효소 조제물 1, 2, 3 및 4를 모아 총 용적이 675 ml가 되었다. 황산 암모늄 (492 g)을 천천히 첨가하고 용액을 얼음 상에서 몇 분 동안 혼합하였다. 용액을 원심분리하여 침전을 수집하였다. 펠릿 분획을 최소량의 20 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 중에 용해시켰다.

수득된 용액은 70.9 mL였고 밀도는 1.057 g/cc였다. 단백질 농도는 약 25.5 mg/mL로 측정되었다. PI-PLC 활성은 약 1.13 U/mg으로 측정되었고 PI-PLC의 예상 순도는 1.88 ％였다. 용액 전체를 -20 ℃에서 동결시키고 해동해 사용하여 닭 사료 200 파운드에 균일하게 처리하였다.

실시예 6 바실러스 메가테리움에서 바실러스 세레우스 PI-PLC 유전자의 클로닝 및 발현

포스파티딜이노시톨 특이적 포스포리파제 C(PI-PLC)를 코딩하는 유전자의 서열은 분석된 바 있다. 참조 문헌[Kuppe et al., J. Bacteriol. 171:6077-6083, 1989). PCR 기술을 이용하여 PI-PLC 유전자를 바실러스 세레우스 (ATCC 6464) 염색체 DNA로부터 클로닝하였다. 바실러스 메가테리움용의 발현 벡터인 pMEGA (BIO 101, Vista, CA)를 사용하였다. 2개의 PCR 프라이머, 즉 5'-GACTAGTAATAAGAAGTTAATTTTG-3' (프라이머 1) 및 5'-CGGGATCCATATTGTTTGGTTATTGG-3'(프라이머 2)를 고안하였고 프라이머 1에는 SpeI 부위를 프라이머 2에는 BamHI 부위를 고안하였다.

PCR-증폭 PI-PLC 유전자를 pMEGA SpeI-BamHI 부위에 라이게이션시켜 플라스미드 pCG682를 얻었다. PI-PLC 단백질을 xylA 유전자 산물의 앞에서 3개의 아미노 산과 발현 벡터 내의 SpeI 부위에서 융합시켰다. PI-PLC 유전자는 xylA 프로모터의 조절하에 발현시켰다. 진탕 플라스크 발효를 이용하여 바실러스 메가테리움에서의 포스파티딜이노시톨 특이적 포스포리파제 C 생산량을 구하였다. 10 ㎍/mL 테트라싸이클린 (20 mL)를 함유한 LB 브로쓰에 종균 배지 0.2 mL를 접종하였고 37 ℃, 250 rpm의 진탕기에서 인큐베이션하였다. 약 0.5의 OD₆₀₀에서 D-(+)-크실로스 5 g/L를 첨가하여 xylA 프로모터를 유도하였다. 3 시간 후에 원심분리에 의해 상청액을 수거하였다. 포스파티딜이노시톨-특이적 포스포리파제 C 활성을 형광 기질법 (Hendrickson, et al., Biochemistry 31:12169-12172, 1992; Hendrickson, Anal. Biochem. 219:1-8, 1994)을 이용해 1-피렌부틸-myo-이노시톨-1-포스페이트 기질 (Molecular Probes, Eugene, OR) 및 HPLC 검출법을 이용해 측정하였다.

PI-PLC의 발현 측정

시험 물질	크실로스 첨가	비활성 (단위/mg 단백질)
세포 용해액 분획
비. 메가테라움/pCG682	-	0
비. 메가테라움/pCG682	+	0.436
비. 메가테라움/pCG682	-	0
비. 메가테라움/pCG682	+	0.365
발효 브로쓰 분획
비. 메가테라움/pCG682	-	0
비. 메가테라움/pCG682	+	4.087
비. 메가테라움/pCG682	-	0
비. 메가테라움/pCG682	+	4.56

이 자료는 대부분의 PI-PLC가 세포외에 있으며 D-(+)-크실로스를 첨가한 후에야 발현이 일어남을 보여 준다(표 2). 이 재조합 균주가 실시예 2에서와 같이 증식시킨 평균 야생형 균주의 생산량 (mg/L/OD)에 비해 15배 이상의 생산량을 가지는 것으로 평가됐다.

실시예 7 PI-PLC 생산을 위한 바실러스 메가테리움의 발효

발효에 의한 PI-PLC의 생산에 실시예 6에 기재된 비. 메가테리움/pCG682를 사용하였다. 종균 단계 및 발효 단계의 배지 (PM)은 20 g/L 암버펌 4015 (Universal Flavors Bionutrients, Indianapolis, IN), 10 g/L 암버렉스 695 효모 추출물 (Universal Flavors Bionutrients, Indianapolis, IN), 10 g/L NZ 케이스 플러스 (Quest Internatinal, Hoffman Estates, IL), 2.0 g/L K₂HPO₄, 0.1 g/L MgSO₄.7H₂O 및 초기에 2.0 g/L 글루코스 및 12.5 mg/L 테트라싸이클린을 함유했다. pH는 7.5로 조정하였다.

동결 종균병에서 꺼내 접종하고 30 ℃, 250 RPM에서 진탕하여 종균 단계 (2.8 L 배플 플라스크 중의 500 ml)를 개시하였다. LB 한천 평판 상에서 증식시킨 단일 콜로니를 250 ml 진탕 플라스크 중의 20 mL PM에 첨가하여 종균병을 제조하였다. 30 ℃에서 약 1.0 OD₆₀₀으로 증식한 후 50％ 멸균 글리세롤 5 mL를 첨가하고, 혼합하고, 용액을 2 mL 플라스틱 멸균병에 분배하여 -60 ℃에서 동결시켰다.

9 시간 진탕한 후 약 1.2 내지 1.8 OD₆₀₀ nm로 증식한 후의 500 mL 종균 플라스크를 이용하였다. 2개의 플라스크를 이용하여 동일한 증기 멸균처리한 배지 50 L를 채운 60 L 발효기에 종균접종하였다. 테트라싸이클린을 40％ 에탄올 중의 1 ％ 용액 형태로 멸균 여과하였고 (0.2 마이크론 필터), 멸균하고 30 ℃로 냉각한 후 첨가하였다. 발효기에서 0.1 ml/L의 마주 DF10PMOD11 소포제 (BASF, Gurnee, IL)을 1차 뱃치에 첨가하고, 필요에 따라 발효 중에도 거품 제거를 위해 첨가했다. 1차 발효기 종균 단계의 작업 조건은 다음과 같았다: 압력 0.5 내지 2.5 psig; 온도 30 ℃±0.5 ℃; 교반 200 내지 450 RPM; 공기 살포 25 내지 50 SLPM; 용존 산소량 25％ 이상. pH는 6.9 내지 8.1로 21.25％ H₃PO₄ 또는 5N NaOH를 이용하여 조절하였다. OD₆₀₀이 8 내지 10에 도달했을 때, 내용물을 이용하여 동일한 배지 425 L가 담긴 600 L 생산 발효기에 종균접종하였다.

600 L 생산 발효기의 작업 조건은 다음과 같았다: 압력 0.5 내지 2.5 psig; 온도 30 ℃±0.5 ℃; 교반 100 내지 300 RPM; 공기 살포 250 내지 500 SLPM; 용존 산소량 25％ 이상. pH는 6.9 내지 8.1로 21.25％ H₃PO₄ 또는 5N NaOH를 이용하여 조절하였다. 5시간 째에 초기 글루코스가 소진되고 OD₆₀₀이 약 17이 되었을 때 크실로스 공급(121 ℃의 오토클레이브에서 20 분 동안 예비 멸균처리, 10 kg의 D-(+)-크실로스 및 10 리터의 물 포함)을 개시하였다. D-크실로스는 바살 인스트류먼트사(New Jersey)로부터 구입했다. 초기에는 25 mL/분의 속도로 시작하여 1.5 시간 유지하고 나서 43 mL/분으로 상승시켰다. 22.5 리터의 공급된 크실로스가 모두 소진될 때까지 이 두 번째 속도를 유지하였다. 살포 공기를 50 SLPM 증분으로 500 SLPM까지 증가시켜 용존 산소량을 유지하였다. 기류가 500 SLPM이 되면 RPM을 상승시켰다. 발효는 20 시간 째에 종결하였다. 17 시간째까지 7440 U/L(실시예 4에 정의된 단위)가 축적되었다.

팔 필트론 C10 스키드와 4개의 셀플로 마이크로곤 모듈 (0.2 ㎛ 막 기공, 3.3 m²의 1 mm 직경 섬유)를 이용하여 발효액을 수집하였다. 0.2 ㎛ 막 투과액을 AG/테크놀로지즈 사이즈 85 10K 한외여과막이 장착된 LT100 팔 필트론 스키드를 이용하여 농축하였다. 최종 농축물은 용적이 10 리터였고 -20 ℃에서 동결시켰다.

실시예 8 바실러스 세레우스 발효액은 항생 활성을 갖지 않았다.

바실러스 세레우스(ATCC 7004)를 이용한 발효를 실시예 2에 기재된 방법에 따라 수행하되, 초기 용적을 20 리터로 증가시켰다. 실시예 3 내지 5에 기재된 방법에 따라 제조된 최종 발효액 또는 부분 정제된 PI-PLC에 대하여 항생 물질 존재 여부에 대한 시험을 시험 균주인 대장균 MG1655를 이용하여 수행하였다. 원통형 평판 분석으로 시험을 수행하였다. 참조 문헌[Brantner, Pharmazie 52(1):34-40, 1997]. 효소 시료를 함유하는 원통형 부분 주위에 항생 활성을 보이는 깨끗해진 구역이 관찰되지 않았다.

실시예 9 마이크로타이터 플레이트 형광 분석을 이용한 PI-PLC 분석

실시예 4에서 사용된 Hendrickson et al.의 방법(상게서)에 비해 개선된 생화학적 PI-PLC 시험법을 개발하였다. 4-메틸움벨리페릴-myo-이노시톨-1-포스페이트, N-메틸-모르폴린염 기질은 바이오신쓰(Naperville, Illinois)에서 구입하였다. MTX 랩 시스템(Vienna, Virginia)에서 구입한 플루오로스캔 II 형광 마이크로타이터 플레이트 판독기로 반응을 모니터링하였다. 발효액 또는 효소 농축물의 분석을 위해, 10 mM 트리스-Cl, 0.16％ 데옥시콜레이트, 0.8 mM 4-메틸움벨리페릴-myo-이 노시톨-1-포스페이트, N-메틸 모르폴린염, 및 희석 효소(pH 8.0)를 포함하는 검정색 플라스틱 마이크로타이터 플레이트에서 200 ㎕의 반응을 수행하였다. 필요하다면 0.1％ BSA 수용액으로 효소 희석액을 만들었다. 37 ℃에서 30 분 동안 반응을 수행하고 2 분 간격으로 판독하여 350 nm 여기 및 450 nm 방출을 이용한 메틸움벨리페론의 방출을 관찰하였다.

형광 단위를 메틸움벨리페론의 마이크로몰로 보정하여 효소액 첨가량 당 형성된 단위 (마이크로몰/분)를 산출하였다. pH 8.0에서의 반응은 효소의 최적 pH와 메틸움벨리페론의 최대 형광 pH (pH 10) 사이의 절충값이다. 또한, pH 9.0 이상에서는 효소에 의하지 않은 메틸움벨리페론의 방출 속도가 커지게 된다. 이 분석 조건 하에 비활성 (단위/mg)은 Hendrickson et al. (상게서)의 방법을 사용했을 때보다 약 39.3 배가 더 높다. 동물 사료 실험에서의 효능 시험을 위해, 이 분석법을 이용해 측정한 단위를 이 분석 이전에 사용된 첫번째 시험법과의 용이한 비교를 위하여 동등한 Hendrickson 단위로 환산하였다.

실시예 10 동물 사료에 유효량이 첨가된 PI-PLC의 분석

분석을 위한 한 가지의 pH와 형광도 측정을 위한 다른 pH를 이용하는, 동물 사료에 첨가한 후의 효소 측정을 위해 4-메틸움벨리페릴-myo-이노시톨-1-포스페이트, N-메틸-모르폴린 염에 기초한 PI-PLC 분석법(실시예 9)에 대한 보다 감도가 높은 변형법을 고안하였다. 사료 4 g을 계량하여 0.1 ％ 데옥시콜레이트를 함유한 20 mL의 트리스-Cl (pH 7.5)에 첨가하여 20 g/L 사료를 제조함으로써 사료 시험 재료에서 효소를 추출하였다. 이 슬러리를 NBS G-25 진탕기 (New Brunswick Scientific)로 1 시간 동안 실온에서 250 RPM으로 진탕하였다. 이 슬러리를 1.5 mL 마이크로퓨즈 튜브가 장착된 IEF 마이크로맥스 미량원심분리기로 13,000 RPM에서 원심분리하였다. 0.1 ％ BSA(소 혈청 알부민) 중에 적절한 추출물 희석액을 제조하였다. 사용량 10 U/lb의 사료에서 추출한 시료는 희석하지 않았다.

제1 반응 단계-다음과 같이 튜브를 설정하였다. 표준: 0.12 U/mL PI-PLC(실시예 4에 정의된 단위)의 1:100 또는 1:200 희석액. 블랭크도 포함함. 시료 반응물은 기질을 빛에서 보호하기 위해 호일을 덮었다.

20 ㎕ 트리스-HCl, 0.10 M, pH 6.0

40 ㎕ 데옥시콜레이트 (0.8 ％)

40 ㎕ PI-PLC 기질 (4 mM)

100 ㎕ 효소

200 ㎕/튜브 전체 반응 (25 ℃)

두 번의 시점(30 및 60 분)에서 각 반응물로부터 0.10 mL를 수거하였다. 부분 시료를 65 ℃에서 15 분 동안 가열하여 효소 반응을 중단시키고 얼음 상에서 냉각시켰다. 마지막으로 시료를 12,000 RPM의 미량원심분리기에서 5 분 동안 원심분리하였다.

형광계 판독-120 ㎕의 0.10 M 트리스 완충액 (pH 8.0)을 검은색 플라스틱 평판 안의 마이크로타이터 웰에 가하고 80 ㎕의 반응 시료를 첨가한 후 실시예 7에 기재된 바와 같이 판독하였다. 배경 조절 레벨을 차감하였다. 분 당 형광 단위 생성 속도를 계산하였다. 형광 단위를 반응 생성물의 마이크로몰로 환산하고 처음 의 사료 파운드 당 추출된 효소 단위를 계산하였다.

실시예 11 병원체를 투여한 닭 사료 시험

1. 브로일러 닭 사료 시험 I

1일령 수컷 브로일러 닭으로 1차 사료 시험을 수행하였다. 미국 국립연구소의 가금류 영양 요건(Nutrient Requirement for Poultry, 9판, 1994)에 부합하게 또는 그를 초과하게 고안한 통상의 균일한 닭 사료식인 "초기 (starter) 사료"를 조제하여 으깬 형태로 공급하였다. 닭을 4개의 처리 군으로 하여 우리 (바닥 공간 12 인치 x 24 인치)에 나누고 각 처리군 마다 4번 반복하고 반복 우리 당 6 마리의 닭을 나누었다 (표 3). 21일 간의 시험 기간 동안 물과 사료를 자유롭게 공급하였다. 랜덤화 블록 설계를 이용하여 닭을 우리에 할당하고 우리를 시험군에 할당하였다. 모든 우리, 사료 공급기 및 물 공급기는 시험 시작 전에 소독하였다. 백열 전구를 이용해 계속 빛을 쏘였다(하루 24 시간). 하루에 한번씩 21일 동안 체중을 측정하였다. 21일째에 사료 소비량을 측정하였다.

5일째에, 모든 닭을 한 마리 당 에이메리아 아세불리나 낭포체 (Eimeria acervulina oocyst) 200,000개로 경구 삽관법으로 감염시켰다. 7일 째에 모든 닭에게 물 공급을 통해 500,000 마리의 클로스트리듐 퍼프린겐스(Clostridium perfringens)로 더 감염시켰다. 음성 대조군(T1)은 감염에 대한 어떠한 처리도 하지 않았다. 양성 대조군(T2)는 콕시디오스타트 및 항생제를 사료에 첨가하였다. 항콕시듐 처리 사콕스 (살리노마이신 60 g/ton)와 항생제 BMD-50 (50 g/ton)이었다. 처리군 T3 및 T4에는 야생형 PI-PLC 효소 처리한 사료 (순수물 기준으로 약 0.34 그램 PI-PLC)를 시작한 5 일째에 에이메리아 아세불리나를 경구 삽관할 때 사용하였다. 하나의 균일한 뱃치로 사료를 모두 조제한 다음 항생제 첨가(시험군 T2) 또는 효소 첨가(시험군 T3 및 T4)를 위해 분할하였다. 닭 체중 분석 결과는 표 4에 나타냈고 사료/증가량 계산값은 표 5에 나타내었다.

브로일러 닭 사료 시험 I에 대한 실험 처리

시험군 번호	시험 설명	시험 물질	반복시험	반복시험당 닭의 수
T1	(-) 대조군	없음	4	6
T2	(+) 대조군	콕시디오스타트 및 살리노마이신 처리	4	6
T3	PI-PLC 야생형	0.34 g 효소/톤 (순수물기준)	4	6
T4	PI-PLC 야생형	0.34 g 효소/톤 (순수물기준)	4	6

21일령의 평균 체중 (g)

반복시험	처리
반복시험	T1	T2	T3	T4
1	323.00	341.67	377.83	366.67
2	326.67	321.33	383.83	361.17
3	299.33	337.33	378.83	361.33
4	211.67	254.00	374.33	403.40
평균	290.17	313.58	378.71	373.14
STAT	b	b	a	a
S.D.	46.52	35.22	3.40	17.61
C.V.	16.03	11.23	0.90	4.72

죽은 새의 체중에 대해 보정된 평균 사료 효율 (0-21일)

반복시험	처리
반복시험	T1	T2	T3	T4
1	1.486	1.569	1.407	1.445
2	1.562	1.532	1.423	1.421
3	1.524	1.562	1.432	1.406
4	1.760	1.462	1.438	1.404
평균	1.583	1.531	1.425	1.419
STAT	b	b	a	a
S.D.	0.11	0.04	0.01	0.02
C.V.	6.68	2.78	0.82	1.17

상기 두 개의 표에서 공통 문자가 없는 열의 평균값은 Duncan의 유의도 시험에 따르면 유의하게 상이한 것이다(P<0.05).

II. 브로일러 닭 사료 시험 II

1일령 수컷 브로일러 닭으로 2차 사료 공급을 수행하였다. 기초 사료식은 미국 국립연구소의 가금류 영양 요건(Nutrient Requirement for Poultry, 9판, 1994)을 초과하게 조제하여 균일하게 하기 위해 으깬 형태로 제조하였다. 랜덤하게 배터리식 우리에서 연구를 수행하여 천연 기원의 바실러스 세레우스 유래의 PI-PLC(야생형 PI-PLC) 또는 재조합 바실러스 메가테리움이 21일째까지 육계한 수컷 브로일러 성장에 미치는 영향을 맹검법으로 시험하였다. 천연 기원은 다른 세포외 효소도 함유하나 바실러스 메가테리움 유래의 PI-PLC는 고순도이고 30 Kd NMWC 막을 이용한 한외여과를 통해 더 정제하였다. 8일령에 닭에게 조류 콕시듐충(한 마리 당 200,000개의 에이메리아 아세불리나를 음용수를 통해)을 투여하고 10일령에 클로스트리듐 퍼프린겐스 (한 마리당 음용수를 통해 100,000개)를 투여하였다. 9개의 처리군 각각 (표 6)은 10개의 반복 처리군 또는 우리를 가졌다. 각각의 우리에는 6 마리의 백신접종한 (Newcastle-Bronchtis, Mareks) Cobb x Cobb 수컷 브로 일러를 한 마리당 0.40 ft²의 공간으로 넣었다. 죽은 닭이 있어도 8일 후에는 대체하지 않았다. 전체 시험 기간 동안 (0일 부터 21일까지) 으깬 형태의 사료를 자유롭게 공급하였다.

으깬 형태의, 항생제가 함유되지 않은 공통의 미처리 기초식을 0일에서 7일까지 모든 닭에게 공급하였다. 그후, 으깬 형태의 처리식을 8 내지 21일 동안 9번 공급하였다. 기초식은 ME(대사 에너지 함량)이 1400 kcal/lb)인 조 단백질 22％를 함유하는 통상의 브로일러 초기 사료였다.

브로일러 닭 사료 시험 II에 대한 실험 처리

처리	시험 품목	감염 시험¹
T1	없음	+
T2	바시트라신 메틸렌 디살리실레이트 (BMD, 50 g/톤) 및 살리노마이신 (Sacox, 60 g/톤)	+
T3	바실러스 메가테리움에 의해 생성된 재조합 PI-PLC (3 U/lb)	+
T4	바실러스 메가테리움에 의해 생성된 재조합 PI-PLC (10 U/lb)	+
T5	바실러스 메가테리움에 의해 생성된 재조합 PI-PLC (30 U/lb)	+
T6	바실러스 메가테리움에 의해 생성된 재조합 PI-PLC (90 U/lb)	+
T7	바실러스 세레우스로부터의 PI-PLC (10 U/lb) 및 다른 세포외 효소	+
T8	없음	없음
T9	바실러스 메가테리움에 의해 생성된 재조합 PI-PLC (90 U/lb)	없음
¹새 1마리당 7일령은 200,000개의 이. 아세불리나 낭포체를 음용수를 통해 투여하고, 10일령은 100,000개의 클로스트리듐 퍼프린겐스 박테리아를 음용수를 통해 투여함.

브로일러 닭 사료 시험 II

처리	1	2	3	4	5	6	7	8	9
감염	+	+	+	+	+	+	+	-	-
약물처리	-	+	-	-	-	-	-	-	-
PI-PLC 유형			Rec¹	Rec¹	Rec¹	Rec¹	Wt²		Rec¹
표적 U/lb	-	-	3	10	30	90	10	-	90
평균 측정치 U/lb	0.36	0.32	0.32³	0.71	1.74	5.96	2.46	0.12	5.94
8-21일 중량증가	309.72	333.83	323.24	324.78	320.64	328.29	298.98	326.12	338.8
	cd	ab	bc	ab	bc	ab	D	Ab	a
8-21일 사료 효율 (보정됨)	1.859	1.642	1.702	1.732	1.699	1.739	1.876	1.651	1.650
	c	a	ab	b	ab	b	C	A	a
평균 장 손상 점수	1.447	0.833	1.120	1.133	0.842	0.808	1.267	0.983	0.847
	d	A	bc	bc	a	a	Cd	ab	a
¹바실러스 메가테리움에 의해 생성된 재조합 PI-PLC ²바실러스 세레우스로부터의 야생형 PI-PLC ³PI-PLC의 부가량은 이 실험에서 추출 및 측정하기에 너무 낮아서 배경 수준으로 간주.

1차 시험에서는 감염 박테리아를 음용수를 통해 투여했을 때(실시예 11-I) 모든 범주에서 바실러스 아레우스가 생산한 야생형 PI-PLC가 살리노마이신+BMD 처리군과 동등하게 또는 보다 우수하게 작용하였다 (표 4-5). 재조합 PI-PLC를 이용한 상기의 나중 시험(실시예 11-II, 표 7)은 다양한 농도로 첨가된 PI-PLC가 장관 병변 점수와 사료 효율 (T3-T6)을 낮추고 체중 증가량을 늘리는 투여량-의존성 효과가 있음을 보여준다. 또한, 살리노마이신+BMD 처리 없이 90 U/lb의 재조합 PI-PLC 처리는 장관 병변 점수를 낮추었고 사료 효율 및 체중 증가량에 긍정적인 효과를 나타내었다. 바실러스 세레우스 유래의 야생형 PI-PLC는 이 시험에서 동일 농도 (10 U/lb)에서 그의 상응하는 재조합체만큼 효과적으로 작용하지 않았다.

III. PI-PLC 및 엔도-1,4-β-D-만나나제 효소를 이용한 브로일러 닭 사료 시험 III

랜덤화 Petersime 배터리 우리에서 연구를 수행하여 PI-PLC 및 엔도-1,4-β-D-만나나제(미국 특허 제5,429,828호)가 21일까지 육계한 수컷 브로일러 성장에 미치는 영향을 시험하였다. 조류 콕시듐충(한 마리 당 에이메리아 아세불리나 낭포체 75,000개 및 이. 맥시마 낭포체 1,250개를 경구 삽관)을 8일령에 닭에게 투여하였고 11, 12 및 13일령에 클로스트리듐 퍼프린겐스(10⁸ cfu/mL의 새로운 배양액 1 mL를 매일 경구 삽관)을 투여하였다. 각각의 처리군(표 8)은 8개의 복제군 또는 우리로 구성되며 하나의 우리 마다 14 마리의 마렉(Marek)-백신처치한 Cobb x Cobb 수컷 브로일러(우리 마다 4 마리를 꺼내 병변 점수를 매겼기 때문에 14일째는 10 마리로 줄었음)를 한 마리 당 0.36 ft²의 공간으로 넣었다. 죽은 닭이 발견되면 우리에서 제거했고 대체하지는 않았다. 으깬 형태로 사료를 전체 시험 기간 (0일 내지 21일) 동안 자유롭게 투여하였다.

0 내지 21일 동안 사료식을 으깬 형태로 공급하였다. 기초 사료는 ME가 1400 kcal/lb인 조 단백질 22 ％를 함유한 통상의 브로일러 초기 사료였다.

브로일러 닭 사료 시험 III의 실험 처리

처리	약물처리¹	감염 시험³	PI-PLC	만나나제²
1	+	-	-	-
2	+	-	-	100 MU/T
3	-	+	-	-
4	-	+	-	100 MT/T
5	-	+	바실러스 세레우스에 의해 생성된 야생형 PI-PLC (10 U/lb)	-
6	-	+	바실러스 메가테리움에 의해 생성된 재조합 PI-PLC (30 U/lb)	-
7	-	+	바실러스 메가테리움에 의해 생성된 재조합 PI-PLC (10 U/lb)	100 MU/T
8	-	+	바실러스 메가테리움에 의해 생성된 재조합 PI-PLC (30 U/lb)	100 MU/T
9	+	+	-	-
10	+	+	바실러스 메가테리움에 의해 생성된 재조합 PI-PLC (30 U/lb)	-
¹음식물은 바시트라신 메틸렌 디살리실레이트 (BMD, 50 g/톤) 및 살리노마이신 (Sacox, 60 g/톤)을 함유함. ²100 MU/T는 사료 1톤당 100X10⁶의 활성과 동일함. ³새 1마리당 8일령에는 75,000개의 이. 아세불리나 낭포체 및 1,250개의 이. 맥시마 낭포체를 경구 투여하여 시험하였고, 11, 12 및 13일령에는 매일 10⁸ cfu/ml의 신선한 브로쓰 배양액과 함께 클로스트리듐 퍼프린겐스로 시험하였다.

처리군들을 비교하기 위해 평균 닭 체중 차이에 맞춰 사료 효율을 조정하였다. 감염은 AF/G (체중에 맞춰 조정된 사료 효율)을 약 23％ 정도 악화시켰다(0.147 AF/G 단위). 살리노마이신 및 BMD의 사용은 AF/G를 정상 수준으로 복귀시켰으나 감염에 의해 야기된 장관 병변 감소의 면에서는 이 두 화학약품이 β-만나나제와 PI-PLC의 조합보다 더 우수하지는 않았다. 1 톤 당 1백만 (100MU) 단위의 β-만나나제를 단독으로 또는 일부 PI-PLC와 병용한 결과, 감염 대조군에서 나타난 AF/G 저하의 65 ％ 내지 70 ％ 개선으로 입증되는 바와 같이 감염으로 인한 해로운 결과가 극복되었다(참조 T3 대 T1). β-만나나제는 이. 맥시마보다는 에이메리아 아세불리나에 의해 야기된 장관 병변 점수를 더 많이 낮추는 것으로 나타났다. 사료 중의 PI-PLC로 처리된 감염 닭에서 AF/G의 부분적 회복이 달성되었으나 악화된 정도의 33 내지 41 ％ 만이 극복되었다. 그러나, 두 부류의 PI-PLC는 두 에이메리아 종에 의해 야기된 장관 병변 점수를 모두 낮추었다. 이. 맥시마의 경우, 병변 감소가 통계적으로 유의한 수준이었다. 결과는 표 9에 나타내었다.

IV. 브로일러 닭 사료 시험 IV

랜덤화 Petersime 배터리 우리에서 연구를 수행하여 PI-PLC, 만나나제(미국 특허 제5,429,828호) 및 진균의 만나나제 효소가 21일까지 육계한 수컷 브로일러 성장에 미치는 영향을 시험하였다. 8일령에 닭에게 콕시듐충(한 마리 당 에이메리아 아세불리나 낭포체 75,000개 및 이. 맥시마 낭포체 1,250개를 경구 삽관)을 투여하고, 11, 12 및 13일령에 클로스트리듐 퍼프린겐스 (10⁸ cfu/mL의 새로운 배양액 1 mL를 매일 경구 삽관)을 투여하였다. 각각의 처리군(표 8)은 8개의 복제군 또는 우리로 구성하였다. 처음에 각각의 우리 마다 14 마리의 마렉-백신처치한 Cobb x Cobb 수컷 브로일러(우리 마다 4 마리를 꺼내 병변 점수를 매겼기 때문에 14일째는 10 마리로 줄었음)를 한 마리 당 0.36 ft²의 공간으로 넣었다. 닭을 대체하지는 않았다. 사료와 물을 전체 시험 기간 (0일 내지 21일) 동안 자유롭게 투여하였다. 0 내지 21일 동안 사료식을 으깬 형태로 공급하였다. 기초 사료는 ME가 1400 kcal/lb인 조 단백질 22 ％를 함유한 통상의 옥수수/콩 브로일러 초기 사료였다.

하기 표 10에 요약된 결과는 PI-PLC 또는 만나나제를 2종의 조류 콕시듐충 및 클로스트리듐 퍼프린겐스로 감염된 브로일러 닭의 사료에 첨가한 효과가 재현됨을 보여준다(체중 증가 및 사료 효율 모두에서의 개선). 중요하게는 이 연구는 PI-PLC 또는 만나나제를 항생제인 BMD 없이 살리노마이신과 병용하는 경우(시험 6 및 5)에 근본적으로 미감염 시험의 수준(번호 1 및 2)으로 성능이 회복된다는 것을 보여준다. 이는 항박테리아 기능의 증거이다. 이 경우 PI-PLC/살리노마이신은 만나나제 보다는 다소 우수하게 기능을 하며 감염된 가금류에게 BMD 및 살리노마이신 조합을 첨가하는 미국에서의 현행 방법보다도 우수하게 기능한다(시험 4).

실시예 12 시험관내에서 에이메리아 아세불리나 및 에이메리아 테넬라 포자소체에 의한 생존능 및 세포 침윤에 대한 효소의 영향 측정

에이메리아 아세불리나 포자소체 또는 에이메리아 테넬라 포자소체 및 배양된 새끼 햄스터 신장 (BHK) 세포를 공개된 방법에 의해 제조하였다. 문헌[Augustine, Avian and Poultry Biology Reviews 11:113-122, 2000] 참조. 세포의 예비처리를 위해, 세포 배양액에 표 11에 기재된 바와 같은 효소 희석액을 넣고, 그 후 5분에서 45분까지 형태적 변화를 관찰하였다. 45분 후, 단일층 배양액을 2회 세척하고, 비처리 이. 아세불리나 또는 이. 테넬라 포자소체를 접종하였다. 감염과 동시에 투여하기 위해, 포자소체를 적당한 효소 희석액에 현탁시키고, 바로 세포 배양액에 접종하였다. 45분 동안 배양한 후, 배양액을 고정시키고, 염색한 다음, 침윤을 정량하였다.

효소 처리로 인한 포자소체 또는 세포의 큰 형태학적 변화를 찾기 위해 세포를 관찰하였다. 본 실험에서 사용된 효소 농도에서는 형태학적 변화가 나타나지 않았다. 배양된 세포의 포자소체 침윤은 상기 2가지 방법의 효소 처리 후에, 그리고 효소를 처리하지 않고 조직학적 염색 및 현미경 관찰에 의해 측정하였다. 오거스틴 (Augustine)의 상기 문헌 참조.

표 11의 데이터는 이. 아세불리나 및 이. 테넬라 포자소체 둘 다에서 포자소체 침윤이 상당히 감소했음을 보여준다. 대부분의 실험에서, 비. 세레우스의 세포외 브로쓰에서 생성된 비교적 순수하지 않은 PI-PLC 효소 조제물, 및 재조합 비. 메가테리움의 브로쓰에 생성된 매우 순수한 재조합 PI-PLC 둘 다에서 통계적으로 유의한 침윤 감소가 나타났다. 비. 세레우스 야생형 PI-PLC 조제물을 대략 절반의 양으로 사용한 경우에도 재조합 PI-PLC 조제물은 여전히 활성을 나타내었다. 따라서, 효소를 이용하여 세포를 예비처리하고 세척을 통해 효소를 제거하는 것은 감염과 동시에 효소를 첨가하는 것만큼 효과적이었다. 그러나, 사료로부터 효소를 추출하는 경험을 기초로 하면, 2단계 세척으로 모든 효소가 제거되지는 않는 것 같다.

엔도-1,4-β-D-만나나제가 포함된 효소 조제물도, 감염 전에 세포를 효소로 예비처리하는 경우 2가지 실험에서 통계적으로 유의한 침윤 감소가 나타났다. 각각의 병원체 유형을 가지고 실시한 1가지 실험에서도 이러한 긍정적인 결과가 나타났다. 따라서, 만나나제는 시험관내에서 포자소체 침윤을 감소시키는 데 있어서 비. 세레우스 PI-PLC 만큼 효과적이었다.

효소 처리 및 효소 비처리하에서 에이메리아 아세불리나 또는 에이메리아 테넬라에 의한 시험관내 BHK 세포 침윤

효소 및 농도	세포에 효소 예비 처리 후 세척		감염시에 효소 투여
이. 아세불리나 포자소체	시험 1	시험 2	시험 1	시험 2
대조군	22±1^a	33±4^a	50±4^a	35±7^a
비. 세레우스¹로부터의 PI-PLC 0.0403 U/mL	15±1^b	26±1^ab	33±3^b	25±2^ab
재조합 비. 메가테리움²으로부터의 PI-PLC 0.261 U/mL	14±1^b	22±1^b	16±2^c	18±1^bc
재조합 비. 메가테리움²으로부터의 PI-PLC 0.0261 U/mL	18±1^ab	26±1^ab	36±3^b	9±2^c
엔도-1,4-β-D-만나나제³ 5100 U/mL	16±1^b	29±2^ab	ND⁴	ND
이. 테넬라 포자소체	시험 1	시험 2	시험 1	시험 2
대조군	44±2^a	26±4^a	63±5^a	42±4^a
비. 세레우스¹로부터의 PI-PLC 0.0403 U/mL	38±2^b	21±2^a	52±13^ab	37±2^ab
재조합 비. 메가테리움²으로부터의 PI-PLC 0.261 U/mL	30±1^c	15±0^a	28±2^b	39±4^ab
재조합 비. 메가테리움²으로부터의 PI-PLC 0.0261 U/mL	ND	17±1^a	18±1^c	29±1^b
엔도-1,4-β-D-만나나제³ 5100 U/mL	35±1^b	19±5^a	46±6^ab	ND
침윤 계수는 변이체당 1-3개의 커버슬립에서 측정된 평균±표준편자로 기록함 (BHK 세포는 배양 접시에 삽입된 커버슬립에서 배양함). 상이한 첨자의 시험군내 평균은 유의도가 상이함 (P< 또는 = 0.05). ¹인산염-완충 식염수 중으로 투석된 비. 세레우스로부터의 세포외 효소, 단위는 실시예 4의 방법에 따라 표준화시킴. ²인산염-완충 식염수 중으로 투석된 재조합 비. 메가테리움으로부터의 세포외 효소, 단위는 실시예 4의 방법에 따라 표준화시킴. ³미국 특허 제5,429,828호에 기재된 대로 바실러스 렌투스로부터 얻어 인산염-완충 식염수 중으로 투석된 만나나제, 단위는 켐젠 코포레이션의 환원당 분석에서 정의된 바와 같음. ⁴ND=미측정

실시예 13 크립토스포리듐 감염에 대한 PI-PLC의 시험관내 평가

효소 PI-PLC의 항-크립토스포리듐 활성을 평가하고, 0.001 내지 30 U/ml 범위의 농도에서 4일된 매드인-다바이 (Madin-Darby) 개 신장 (MDCK) 세포를 이용하여 독성을 평가하였다. 효소 단위는 실시예 4의 방법에 의해 정의되었으며, 실시예 9에서와 같이 측정하였다. 사용된 효소 조제물은 재조합 바실러스 메가테리움으로부터 얻었다. 처리는 감염 3시간 후에 개시하였고, 48시간까지 지속하였다.

화학발광 면역분석. 감염시키기 전에, 낭포체를 세척하고, 0.75％의 나트륨 타우로콜레이트가 함유된 DMEM계 배지 중에 재현탁시킨 후, 37℃에서 10분 동안 배양하였다 (You et al., FEMS Microbiol. Letters 136:251-256, 1996; You et al., J. Antimicrobial. Chemother. 41:293-296, 1998). 탈낭 (excystation) 혼합물을 울트라컬쳐 (Ultrculture) 배지로 희석하고, MDCK 세포가 100％의 콘플루언스 (confluence) 상태로 들어있는 플레이트에 재빨리 분배한 후, 울트라컬쳐 배지에서 4일 동안 유지하였다. 접종액을 세포와 함께 3시간 동안 배양한 후, PBS로 세척하고, 시험 효소가 존재 또는 부재하는 신선한 울트라컬쳐 배지로 대체하였다. 플레이트를 37℃의 5％ CO₂ 공기압하에서 48시간 동안 배양하였다. 배양액을 PBS로 세척하고, 보우인 용액 (Bouin's solution)으로 고정시켰다.

고정된 플레이트를 TBST 완충액 (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.05％ 트윈-20)으로 세척하고, 25℃에서 부드럽게 교반하면서 1％ BSA-TBST (1％의 소 혈청 알부민을 함유하는 TBST 완충액)으로 30분 동안 블로킹시켰다. 토끼 항-크립토스포리듐 파르붐 혈청 (1:200 희석)을 플레이트에 넣고, 1시간 동안 배양하였다. TBST로 세척한 후, 샘플을 바이오틴-표지 염소 항-토끼 IgG 및 양고추냉이 (horseradish) 퍼옥시다제-표지 스트렙타비딘 (작용 희석 1:1000, KPL Inc., Gaithersburg, MD)과 함께 배양하였다. 강화 루미놀 (Enhanced Luminol; 4-요오도페놀 및 과산화수소, Aldrich Chemical Co. Inc., Milwaukee, WI)을 기질로서 사용하였다. 플레이트를 ML3000 발광계 (ML3000 Luminometer; Dynatech Lab., Chantilly, VA)로 판독하고, 상대 광단위 (RLU)를 측정하였다. RLU의 평균을 4개의 반복시험 웰로부터 계산하였으며, 모든 실험은 2회 이상 반복하였다.

독성 분석. 시판되는 테트라졸륨 염료 환원 분석 (CellTiter 96; Promega Corp., Madison, WI, USA)을 이용하여 효소를 시험하였다. 요컨대, 하기 기재된 각 농도의 효소를, 콘플루언스 상태의 MDCK 세포 단일층이 들어있는 96-웰 플레이트에 넣었다. 각 희석액을 3배수로 평가하였다. 효소를 단일층 상에서 37℃ 및 5％ CO₂의 조건으로 배양하였다. 48시간째, 플레이트를 1시간 동안 발색시키고, ELISA 플레이트 판독기에서 490 nm로 판독하였다. 결과를 기록하고 분석하였다. 독성 ％는 효소가 포함된 경우의 평균 OD값에서 효소가 없는 배지 대조군의 평균 OD값을 뺀 후, 이를 배지의 OD값으로 나누고, 100을 곱함으로써 계산하였다. 독성 점수는 하기 표와 같이 지정하였다.

독성 ％	점수
0-5％	0
6-25％	1
26-50％	2
51-75％	3
76-100％	4

효소 농도가 3 U/mL 또는 그보다 높은 경우에 상당한 독성이 관찰되었다. 0.1 내지 1 U/mL 범위의 효소는 독성이 없는 것으로 관찰되었다 (표 12). 따라서, 이 농도 범위 (1.0 U/mL 이하)에서 효소의 활성 및 효소의 특이성을 측정하기 위해 일련의 실험을 수행하였다. 제1 실험에서, MDCK 세포를 탈낭 포자소체로 감염시켰다. 3시간 동안 배양한 후, 세포 단일층을 세척하고, 다양한 농도의 효소를 48시간 동안 첨가하였다. 표 13에 기재된 바와 같이, 효소는 시험관내에서 0.01 내지 1 U/mL의 농도 범위에서 항-크립토스포리듐 활성을 나타내었다. 0.1 U/mL의 농도에서는 대략 50％가 억제되었다 (도 1).

비. 메가테리움에서 제조된 재조합 PI-PLC의 MDCK 단일층 세포 배양액에 대한 독성

농도	독성 ％ (95％ CL)	독성 점수
10 U/mL	83	4
3 U/mL	57	3
1 U/mL	13	1
0.3 U/mL	11	1
0.1 U/mL	10	1

PI-PLC 효소의 씨. 파르붐으로 감염된 MDCK 세포 배양액에 대한 활성

처리	단위/mL	억제율	마이크로타이터 플레이트 웰당 평균 크립토스포리듐 수	95％ CL
감염 후 3시간	1	77.36	285.28	0.01
	0.3	77.26	286.5	0.04
	0.1	52.74	595.53	0.18
	0.03	27.62	912.15	0.22
	0.01	7.33	1167.78	0.09
감염	-	0	1260.18	0.09
비감염	-	100	0	0.02

제2 실험은 효소의 특이성을 평가하기 위해 수행하였다. 포자소체를 다양한 농도의 효소로 45분 동안 처리하고, 간단히 세척하였다. 이어서, 처리된 포자소체를 비처리 숙주 세포에 감염시키고, 48시간 동안 성장 및 번식시켰다. 별개의 실험으로, 숙주 세포를 다양한 농도의 효소와 함께 배양하고, 세척한 후, 비처리 포자소체로 감염시켰다. 하기 표 14에 기재된 바와 같이, 포자소체 또는 숙주 세포를 효소로 처리한 결과 부분적인 억제 현상이 나타났다. 이 농도 범위에서는 투여량에 의존적인 억제가 관찰되지는 않았다. 이는 숙주 또는 기생 세포와 효소를 짧은 시간 (45분)동안 처리해서 이거나, 또는 숙주/기생충 수용체의 부분적 또는 불완전한 절단에서 기인한 것 같다. 또한, 다른 숙주/기생충 수용체가 감염에 관여한 상태로 숙주 세포가 성장하였기 때문일 것이다.

포자소체 또는 MDCK 세포의 예비-감염 처리 및 씨. 파르붐의 감염도에 대한 영향

처리	PI-PLC 단위/ml	억제율	마이크로타이터 플레이트 웰당 평균 크립토스포리듐 수	95％ CL
감염전에 처리된 포자소체	1	67.27	412.40	0.02
	0.3	65.64	433.04	0.06
	0.1	57.40	536.80	0.03
	0.03	58.13	527.59	0.03
	0.01	56.98	542.15	0.01

감염전에 처리된 숙주 세포	1	68.76	393.64	0.12
	0.3	50.07	629.24	0.26
	0.1	63.82	455.88	0.19
	0.03	58.53	522.66	0.12
	0.01	56.84	543.85	0.10

감염		0	1260.18	0.09
비감염		100	0	0.02

실시예 14 크립토스포리듐 감염에 대한 PI-PLC의 생체내 평가

면역결핍 SCID 생쥐 모델을 이용하여 효소의 항-크립토스포리듐 효능을 평가하였다. 요컨대, 정제된 낭포체 (6개월 미만 보관)를 0.1％ BSA, PBS (pH 7.2)로 세척하여 이크롬산칼륨을 제거함으로써 낭포체 접종액을 제조하였다. SCID 생쥐 (4-5주)를 10⁶ 낭포체 (IOWA 균주)로 감염시키고, 하기와 같이 처리하였다. 대소변 샘플을 생쥐로부터 수집하고, 불연속 수크로스를 통해 정제한 후, 상기 설명한 바와 같이 유동 세포계수기로 기생충의 양을 측정하였다. 문헌[Arrowwood et al., J. Parasitol. 81:404-409, 1995] 참조.

치료 실험에 대한 처리 방식

생쥐군	A	B	C
생쥐의 수	10	10	10
접종량	10⁶	10⁶	10⁶
화합물	PI-PLC	PI-PLC	위약
투여량 (mg/kg)	90 U/ml	30 U/ml	PBS
경로	사료 중	사료 중	사료 중
빈도	자유로이 공급	자유로이 공급	자유로이 공급

과립화된 생쥐 사료를 PBS 중 30 또는 90 U/lb의 PI-PLC로 피복하거나 PBS로 피복하였다. 모든 생쥐가 자유로이 사료를 먹게하였다. 감염 직후에 생쥐에게 사료를 먹였다. 매주 2회씩 대소변 샘플을 수집하고 체중을 측정하였다. 매일 사료 소비량을 측정하였다. 생쥐에 100 mg/ml의 케타민, 100 mg/ml의 크실라진 및 0.9％의 NaCl을 0.2 cc 주사하여 안락사시켰다.

생쥐가 하루에 소비한 사료량의 평균 및 생쥐 체중을 표 16에 기록하였다. 사료 소비량 또는 체중에 있어서 통계적으로 유의한 차이는 3주가 넘어서야 관찰되었다.

감염 3주 후의 효능. 대소변 샘플을 감염 후 3, 4 및 4.5주에 수집하여, 표 17에 기재된 바와 같은 처리군 및 대조군 SCID 생쥐로부터의 100 ㎕ 샘플에서 크립토스포리듐의 수를 측정하였다. 효소로 처리된 생쥐에서는 기생충의 양이 감소하였다. 처리군에서의 기생충 양을 관찰하였다 (34-54％). 이와 같은 감소 중 일부는 ANOVA 통계 분석을 이용하여 평가시 통계적으로 유의하였다 (하기 기재되고 기 호로 표시됨). 이 효소는 항-크립토스포리듐 치료제로서의 효능이 입증되었다. 효소 투여량이 많거나 효소가 감염 부위로 잘 전달되는 경우에는 효능이 증가했는데, 이는 추가의 실험에서 다루어질 수 있다.

대소변에서 크립토스포리듐을 감소시키는 생체내 PI-PLC의 효능

처리군	효소 투여량 (U/lb)	기생충 양 (낭포체/100㎕) (SD) 21일	억제율	기생충 양 (낭포체/100㎕) (SD) 28일	억제율	기생충 양 (낭포체/100㎕) (SD) 31일	억제율
PI-PLC	90	22.7(11.4)	44.0	26.3(14)^*	48.9	87.5(52.9)	34.0

PI-PLC	30	16.2(4.7)	52.0	23.4(11)^*	54.6	74.3(89.7)⁺	40.0

PBS (대조군)	-	33.5(16.2)	-	50.4 (29)	-	132.1(89)	-
*P값이 0.05 이하로 유의한 수준임 +P값이 0.08 미만임

실시예 15 성장 시험에 사용된 사료 중 효소의 검증

상기 동물 시험에서 사용된 사료로부터 추출된 PI-PLC의 분석은 실시예 10에서와 같이 수행하였다. 그 결과를 표 18 내지 19에 요약하였다.

크립토스포리듐 연구, 생쥐 사료

처리	대조군	30 U/lb	90 U/lb
표적 U/lb	0	30	90
PI-PLC 유형	-	비. 메가테리움으로부터의 재조합체	비. 메가테리움으로부터의 재조합체
PI-PLC 로트번호	-	45-46 SF	45-46 SF
분석 U/lb (추출됨)	0	22.8	66.1
표적의 ％ (추출됨)	-	76.0	73.4

사료로부터의 추출 효율은 사료의 유형에 따라 매우 다르게 나타났다. 생쥐 사료로부터의 추출은 73.4 내지 76％의 효율을 나타냈다 (표 18). 3개의 상이한 곳에서 만들어진 3가지 상이한 닭 사료 조제물에 45 또는 180 U/lb의 재조합 PI-PLC를 로딩한 후, 즉시 추출하여 실시예 9의 분석 방법으로 분석하되, 이때의 로딩양은 실시예 9의 연속 분석 방법의 범위 내에 있었다 (표 19).

상이한 닭 사료 공급원 및 옥수수 가루로부터의 추출 효율 시험

	닭 사료의 공급원
	공급원 1		공급원 2		공급원 3		공급원 4

로딩양 단위/lb	180	45	180	45	180	45	180	45

단위/lb (추출됨)	128	9.3	53.2	3.66	82.7	8.46	134.4	33

첨가 단위의 ％ (추출됨)	71.1	20.7	29.6	8.1	45.9	18.8	74.7	73.3

옥수수 가루로부터의 추출 효율은 생쥐 사료로부터의 추출 효율과 유사한 것으로 나타났다. 그러나, 일부 닭 사료 샘플로부터의 추출은 본 실험 및 다른 실험에서도 불량한 것으로 나타났다.

표 20에 나타낸 시험에서, 추출가능한 효소는 이론상 PI-PLC의 대략 30 내지 45％였으나, β-만나나제는 용이하게 추출할 수 있었으며 그 수율은 대략 100％였다. 상기 기재된 추출 시험을 이용하여 이 사료로 추출할 수 있는 최대의 양은 약 45％였다. 따라서, 분석 결과는 표 20 시험의 사료에 대해 추출된 U/lb가 사용된 로딩양의 기대 범위 내에 있었다.

브로일러 닭 사료 시험 III에 대한 효소 로딩양의 검증

처리번호	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
감염	-	-	+	+	+	+	+	+	+	+
약물처리	+	+	-	-	-	-	-	-	+	+
표적 단위/lb	0	0	0	0	10	30	10	30	0	30
PI-PLC 유형	-	-	-	-	WT	Rec	Rec	Rec	-	Rec
PI-PLC의 분석 단위/lb
평균 단위/lb	0.94	0.76	0.79	0.7	3.08	11.48	4.56	10.18		9.49
표적 ％	-	-	-	-	30.75	38.27	45.57	33.93		31.64

표적 MU/톤	-	100	-	100	-	-	100	100	-	-
헤미셀 만나나제	-	+	-	+	-	-	+	+	-	-
만나나제의 분석 MU/톤
MU/톤	-	124.9	-	135.5	-	-	153.5	172.0	-	-
표적 ％	-	124.9	-	135.5	-	-	153.5	172.0	-	-

특정한 대표적 실시양태 및 상세한 설명이 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기재되었으나, 당업자에게는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 다양한 변화 및 변형이 가능함이 분명할 것이다.

Claims

(i) 포스파티딜이노시톨-특이적 포스포리파제 C 또는 포스파티딜이노시톨-특이적 포스포리파제 D인 효소, 및 (ii) 상기 효소에 대해 생리학상 허용되는 담체를 포함하는, 소화관 감염을 치료하거나 그 위험성을 경감시키기 위한 경구 투여에 적합한 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물이 사료인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 효소 이외의 감염 방지제를 함유하지 않는 조성물.
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제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 안정화제, 탄수화물 담체 또는 보존제를 더 포함하는 조성물.
제9항에 있어서, 상기 안정화제가 완충액, 탄수화물 또는 글리콜인 조성물.
제9항에 있어서, 상기 탄수화물 담체가 크실로스, 프럭토스, 글루코스, 소르비톨 및 말토트리오스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
제9항에 있어서, 상기 보존제가 프로필파라벤, 나트륨 소르베이트, 칼륨 소르베이트 및 아스코르빌 팔미테이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 담체가 상기 효소를 포함하는 식료품인 조성물.
제13항에 있어서, 상기 식료품이 곡물, 단백질 공급원, 비타민류, 아미노산류 및 무기질로 구성된 동물 사료인 조성물.
제14항에 있어서, 상기 곡물이 옥수수, 수수, 밀, 보리 또는 귀리인 조성물.
제14항에 있어서, 상기 단백질 공급원이 콩 또는 완두콩인 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 또는 액체 제제인 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소가 정제 또는 젤라틴 캡슐 외피에 포함된 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 효소가 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus) 균주로부터 제조된 것인 조성물.
제19항에 있어서, 상기 바실러스 세레우스 균주가 ATCC 7004 또는 ATCC 6464인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 효소가 숙주 생물체에서의 재조합 DNA 발현에 의해 수득되는 것인 조성물.
제21항에 있어서, 상기 숙주 생물체가 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium) 균주로부터 유래한 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 효소가 사료 1 kg당 200 IU 내지 4000 IU의 양으로 존재하는 것인 조성물.
소화관 감염으로 고통받거나 그 위험성이 있는 인간을 제외한 대상체에, 포스파티딜이노시톨-특이적 포스포리파제 C 또는 포스파티딜이노시톨-특이적 포스포리파제 D인 효소를 유효량으로 경구 투여하는 것을 포함하는, 상기 인간을 제외한 대상체에서 소화관 감염을 치료하거나 그 위험성을 경감시키는 방법.
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제24항에 있어서, 상기 효소 이외의 감염 방지제의 투여를 포함하지 않는 방법.
제24항에 있어서, 상기 감염이 원충류, 박테리아, 효모, 진균성 또는 바이러스성 병원체에 의해 유발된 것인 방법.
제27항에 있어서, 상기 감염이 원충류 병원체인 에이메리아 (Eimeria) 속에 의해 유발된 것인 방법.
제27항에 있어서, 상기 감염이 원충류 병원체인 크립토스포리듐 (Cryptosporidium) 속에 의해 유발된 것인 방법.
제27항에 있어서, 상기 감염이 박테리아 병원체인 클로스트리듐 (Clostridium) 속에 의해 유발된 것인 방법.
제24항에 있어서, 바실러스 세레우스 균주로부터의 세포외 효소 조제물을 상기 대상체에 경구 투여하는 것을 포함하는 방법.
제31항에 있어서, 상기 바실러스 세레우스 균주가 ATCC 7004 또는 ATCC 6464인 방법.
제24항에 있어서, 상기 효소가 숙주 생물체에서의 재조합 DNA 발현에 의해 수득되는 것인 방법.
제33항에 있어서, 상기 숙주 생물체가 바실러스 메가테리움 균주로부터 유래한 것인 방법.
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(i) 카보하이드라제 또는 세레브로시다제인 효소, 및 (ii) 상기 효소에 대해 생리학상 허용되는 담체를 포함하며, 경구 투여에 적합하고 상기 효소 이외의 감염 방지제를 함유하지 않는, 소화관 감염을 치료하거나 그 위험성을 경감시키기 위한 조성물.
제39항에 있어서, 상기 담체가 상기 효소를 포함하는 식료품인 조성물.
제40항에 있어서, 상기 식료품이 곡물, 단백질 공급원, 비타민류, 아미노산류 및 무기질로 구성된 동물 사료인 조성물.
제41항에 있어서, 상기 곡물이 옥수수, 수수, 밀, 보리 또는 귀리인 조성물.
제41항에 있어서, 상기 단백질 공급원이 콩 또는 완두콩인 조성물.
제39항에 있어서, 고체 또는 액체 제제인 조성물.
제39항에 있어서, 상기 효소가 정제 또는 젤라틴 캡슐 외피에 포함된 것인 조성물.
제39항에 있어서, 상기 효소가 헤미셀룰라제인 조성물.
제46항에 있어서, 상기 헤미셀룰라제가 만나나제인 조성물.
제47항에 있어서, 상기 만나나제가 ATCC 55045인 바실러스 렌투스 (Bacillus lentus)에 의해 생성된 엔도-1,4-β-D-만나나제인 조성물.
제39항에 있어서, 상기 효소가 결합을 절단하여 세포 표면 단백질 또는 탄수화물을 방출시키는 세레브로시다제 및 카보하이드라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
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제39항에 있어서, 안정화제, 탄수화물 담체 또는 보존제를 더 포함하는 조성물.
제53항에 있어서, 상기 안정화제가 완충액, 탄수화물 또는 글리콜인 조성물.
제53항에 있어서, 상기 탄수화물 담체가 크실로스, 프럭토스, 글루코스, 소르비톨 및 말토트리오스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
제53항에 있어서, 상기 보존제가 프로필파라벤, 나트륨 소르베이트, 칼륨 소르베이트 및 아스코르빌 팔미테이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
소화관 감염으로 고통받거나 그 위험성이 있는 인간을 제외한 대상체에, 카보하이드라제 또는 세레브로시다제인 효소를 유효량으로 경구 투여하는 것을 포함하며, 상기 효소와 함께 항-미생물적 유효량의 다른 감염 방지제를 투여하는 것을 포함하지 않는, 상기 인간을 제외한 대상체에서 소화관 감염을 치료하거나 그 위험성을 경감시키는 방법.
제57항에 있어서, 상기 감염이 원충류, 박테리아, 효모, 진균성 또는 바이러스성 병원체에 의해 유발된 것인 방법.
제58항에 있어서, 상기 감염이 원충류 병원체인 에이메리아 속에 의해 유발된 것인 방법.
제58항에 있어서, 상기 감염이 원충류 병원체인 크립토스포리듐 속에 의해 유발된 것인 방법.
제58항에 있어서, 상기 감염이 박테리아 병원체인 클로스트리듐 속에 의해 유발된 것인 방법.
제57항에 있어서, 상기 효소가 바실러스 렌투스 균주로부터 제조된 것인 방법.
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제57항에 있어서, 상기 효소가 숙주 생물체에서의 재조합 DNA 발현에 의해 수득되는 것인 방법.
제64항에 있어서, 상기 숙주 생물체가 바실러스 메가테리움 균주로부터 유래한 것인 방법.
제57항에 있어서, 상기 효소가 헤미셀룰라제인 방법.
제66항에 있어서, 상기 헤미셀룰라제가 만나나제인 방법.
제67항에 있어서, 상기 만나나제가 ATCC 55045인 바실러스 렌투스에 의해 생성된 엔도-1,4-β-D-만나나제인 방법.
제57항에 있어서, 상기 효소가 결합을 절단하여 세포 표면 단백질 또는 탄수화물을 방출시키는 세레브로시다제 및 카보하이드라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
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제2항에 있어서, 상기 효소가 사료 0.4536 kg (1 lb)당 3 U 내지 90 U의 양으로 존재하는 것인 조성물.
제2항에 있어서, 상기 효소가 사료 0.4536 kg (1 lb)당 3 U의 양으로 존재하는 것인 조성물.
제2항에 있어서, 상기 효소가 사료 0.4536 kg (1 lb)당 10 U의 양으로 존재하는 것인 조성물.
제2항에 있어서, 상기 효소가 사료 0.4536 kg (1 lb)당 30 U의 양으로 존재하는 것인 조성물.
제2항에 있어서, 상기 효소가 사료 0.4536 kg (1 lb)당 90 U의 양으로 존재하는 것인 조성물.
제40항에 있어서, 상기 효소가 식료품 0.4536 kg (1 lb)당 3 U 내지 90 U의 양으로 존재하는 것인 조성물.
제40항에 있어서, 상기 효소가 식료품 0.4536 kg (1 lb)당 3 U의 양으로 존재하는 것인 조성물.
제40항에 있어서, 상기 효소가 식료품 0.4536 kg (1 lb)당 10 U의 양으로 존재하는 것인 조성물.
제40항에 있어서, 상기 효소가 식료품 0.4536 kg (1 lb)당 30 U의 양으로 존재하는 것인 조성물.
제40항에 있어서, 상기 효소가 식료품 0.4536 kg (1 lb)당 90 U의 양으로 존재하는 것인 조성물.
제13항에 있어서, 안정화제, 탄수화물 담체 또는 보존제를 더 포함하는 조성물.
제17항에 있어서, 안정화제, 탄수화물 담체 또는 보존제를 더 포함하는 조성물.
제18항에 있어서, 안정화제, 탄수화물 담체 또는 보존제를 더 포함하는 조성물.
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