KR100633808B1

KR100633808B1 - 항산균의 용균 방법 및 그것을 사용한 유전자 증폭 또는검출 방법

Info

Publication number: KR100633808B1
Application number: KR1020047012860A
Authority: KR
Inventors: 가마타다츠오; 이즈미자와유지
Original assignee: 아크레이 가부시키가이샤
Priority date: 2002-05-21
Filing date: 2003-05-21
Publication date: 2006-10-13
Also published as: US20050181363A1; KR20040101234A; US7935483B2; DE60329676D1; EP1506995B1; EP1506995A4; US20070178508A1; ATE445697T1; CN1656211B; JP3910198B2; JPWO2003097816A1; AU2003242353A1; WO2003097816A1; CN1656211A; EP1506995A1

Abstract

본 발명은, 항산균을, 비이온 계면 활성제를 포함하는 액체중에서, 상기 액체의 비점 미만의 온도에서 가열함으로써, 상기 항산균을 용균하는 방법이다. 본 발명의 방법에 의하면, 특수한 장치나 시약을 사용하지 않고, 간단하고 또한 단시간에 항산균을 확실히 용균할 수 있고, 유전자를 추출할 수 있다. 상기 가열 조건은, 96℃에서 10분간이 바람직하다. 또, 비이온 계면활성제로는, d-소르비톨지방산에스테르, 폴리옥시에틸렌글리콜소르비탄알킬에스테르 및 폴리옥시에틸렌글리콜p-t-옥틸페닐에테르 등을 사용할 수 있다. 상기 액체는 pH 8이 바람직하고, EDTA를 포함하는 것도 바람직하다. 또, 가열 처리 전에 항산균을 리파아제로 처리하는 것이 바람직하다.

Description

항산균의 용균 방법 및 그것을 사용한 유전자 증폭 또는 검출 방법{METHOD OF EFFECTING LYSIS OF ACID-FAST BACTERIA AND METHOD OF PERFORMING GENE AMPLIFICATION OR DETECTION THEREWITH}

본 발명은, 항산균(抗酸菌)의 용균 방법 및 그것을 사용한 유전자 증폭 또는 검출 방법에 관한 것이다.

결핵은, 지금 여전히 세계적으로 중요한 세균성 질환이며, 그 치료 방법뿐만아니라 진단 방법은 대단히 중요하다. 결핵의 최종적 확인은, 배양법에 의해 행해지는데, 결핵균의 증식 속도는 대단히 느리기 때문에, 배양법의 전단계에서 실시되는 예비적 진단 방법의 확립이 요구되고 있다. 이러한 예비적 진단 방법으로서, 주목받고 있는 것은, 폴리머라제 체인 리엑션(Polymerase Chain Reaction, PCR)법을 적용한 방법이다. 이 방법은, 결핵균의 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여, 결핵균의 유전자를 증폭하여 검출함으로써, 결핵균의 유무를 판정하는 방법이다.

상기 PCR법을 적용한 예비적 진단 방법에서는, 그 전처리로서 결핵균을 용균하여 유전자를 추출할 필요가 있다. 종래의 용균 방법으로는, 예를 들면 유기 용매 등을 사용한 화학적 방법, 초음파나 동결·융해를 되풀이하는 물리적 방법 등이 있다. 그러나, 결핵균은, 그 세포벽의 지질 함량이 높아, 종래의 용균법에서는, 유전자의 추출을 충분히 행할 수 없었다. 또, 충분한 추출을 행하기 위해서는, 처리 조건을 가혹하게 할 필요가 있고, 그에 따라, 특수한 장치나 시약을 사용할 필요가 있고, 이에 더해 처리 시간의 장기화나 조작의 번잡화 등의 문제가 있었다. 이러한 용균의 문제는, 결핵균을 포함한 항산균 전체의 문제이기도 하다.

본 발명은, 이러한 사정을 감안하여 이루어진 것으로, 특수한 장치나 시약을 사용하지 않고, 간단하고 단시간에 항산균을 용균할 수 있는 방법의 제공을 그 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 제1 용균 방법은, 항산균으로부터 유전자를 추출하기 위한 용균 방법에 있어서, 비이온 계면활성제를 포함하는 액체중에서, 상기 항산균을, 상기액체의 비점 미만의 온도로 가열하는 방법이다.

또, 상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 제2 용균 방법은, 항산균으로부터 유전자를 추출하기 위한 용균 방법에 있어서, 상기 항산균을 리파아제로 처리하는 지질 분해 공정과, 비이온 계면활성제의 존재하에서 상기 항산균을 가열하는 가열 공정을 포함하는 방법이다.

본 발명의 제1 방법에 의하면, 비이온 계면활성제 용액중에서, 항산균을, 예를 들면 96℃에서 10분간 가열하는 것만으로, 충분히 유전자를 추출할 수 있고, 그 후의 유전자 증폭 또는 검출 방법을 간단히 실시할 수 있다. 또, 가열 온도가, 상기 액체의 비점 미만이므로, 돌비(突沸)하여 시료가 비산되는 경우가 없고, 또한 온도 컨트롤이 용이해져, 특별한 가열기를 필요로 하지 않는 등의 이점이 있다.

또, 본 발명의 제2 용균 방법은, 항산균의 세포벽이 지질을 고농도로 포함하고 있는 것에 착안하여, 이것에 기초하여 도달한 것이다. 즉, 본 발명의 제2 용균 방법에서는, 지질 분해 공정에 의해 항산균의 세포벽을 취약화하여, 가열 공정에 의해 용균하는 것이다.

본 발명의 제1 및 제2 용균 방법은, 카오트로픽 시약 등의 특별한 시약 및 초음파 장치 등과 같은 특별한 장치를 사용하지 않고, 간단하게 단시간에 용균처리를 행할 수 있고, 게다가 화학적 방법이므로 시료의 비산의 위험도 적어, 안전한 방법이다. 또, 본 발명의 제1 및 제2 용균 방법은, 유전자의 정제를 행하지 않고, 그대로 유전자 증폭 또는 검출 처리로 이행할 수 있다. 또한, 본 발명의 제1 및 제2 용균 방법은, 유전자의 증폭·검출 방법 뿐만아니라, 예를 들면 유전자 조작 등의 그 밖의 분야에도 적용할 수 있다.

(도면의 간단한 설명)

도 1은 본 발명의 일실시예의 용균 효과를 확인한 결과를 나타낸 전기 영동의 사진,

도 2는 본 발명의 그 밖의 실시예의 용균 효과를 확인한 결과를 나타낸 전기영동의 사진,

도 3은 본 발명의 또 다른 실시예의 용균 효과를 확인한 결과를 나타낸 전기영동의 사진이다.

(발명의 실시를 위한 최적의 형태)

이하에, 본 발명의 제1 용균 방법 및 제2 용균 방법을 더욱 자세히 설명한다.

먼저, 본 발명의 제1 용균 방법에 관해 설명한다.

본 발명의 제1 방법에 있어서, 상기 가열 온도는, 70℃ 이상 100℃ 미만이 바람직하고, 보다 바람직하게는 80℃ 이상 100℃ 미만이고, 가장 바람직하게는 96℃이다. 또, 가열 시간은, 예를 들면 1∼30분이고, 바람직하게는 10분간이다. 상기 액체의 pH는, 예를 들면 pH 7.0∼12.0의 범위이고, 바람직하게는 pH 8.0이다. 상기 액체중의 상기 비이온 계면활성제의 농도는, 예를 들면 0.01∼10중량%이고, 바람직하게는 0.5∼2.0중량%이고, 보다 바람직하게는 1.0중량%이다.

상기 비이온 계면활성제로는, 예를 들면, Span20, Span40, Span60, Span65, Span80, Span85 등(이상, 나카라이테스크사 제조 등)의 d-소르비톨의 지방산에스테르, Tween20, Tween21, Tween40, Tween60, Tween65, Tween80, Tween81, Tween85 등(이상, 나카라이테스크사 제조 등)의 폴리옥시에테틸렌글리콜소르비탄알킬에스테르, TritonX-100 등(이상, 나카라이테스크사 제조 등)의 폴리옥시에틸렌글리콜p-t-옥틸페닐에테르 등이 있다. 이들은, 단독으로 사용해도 되고, 2종류 이상으로 병용해도 된다. 이 중에서, TritonX-100, Tween20, Tween21이 바람직하고, 보다 바람직한 것은 TritonX-100이다.

본 발명의 제1 방법에 있어서, 상기 액체가, 금속 킬레이트제를 더 포함하는 것이 바람직하다. 시료중에는, DNase 등의 유전자 분해 효소가 포함되어 있고, 금속 킬레이트제는, 이것에 의한 유전자의 분해를 방지하는 작용 등을 발휘한다. 상 기 액체중의 상기 금속 킬레이트제의 농도는, 예를 들면 0.1∼100mM이고, 바람직하게는 1.0mM 이다. 상기 금속 킬레이트제로는, 예를 들면 에틸렌디아민4아세트산(EDTA), 에틸렌글리콜-비스(β-아미노에틸에테르)-N,N,N',N'-4아세트산(EGTA), 디아미노시클로헥산4아세트산, o-페난트롤린 및 살리실산이 있다. 이들은 단독으로 사용해도 되고, 2종류 이상으로 병용해도 된다. 이 중에서, 바람직한 것은, EDTA, EGTA이며, 보다 바람직한 것은 EDTA이다.

본 발명의 제1 용균 방법의 대상이 되는 항산균으로는, 새형 결핵균(M. avium), 엠·인트라셀루라레(M. intracellularae), 엠·고르도네(M. gordonae), 사람형 결핵균(M. tuberculosis), 엠·칸사시(M. kansasii), 엠·포르츠이츰(M. fortuitum), 엠·켈로네(M. chelonae), 소형 결핵균(M. bovis), 엠·스크로플라세움(M. scrofulaceum), 파라 결핵균(M. paratuberculosis), 티모테균(M. phlei), 엠·마리눔(M. marinum), 엠·시미에(M, simiae), 엠·스즐가이(M. szulgai), 나균(M. leprae), 엠·크세노피(M. xenopi), 엠·울세란스(M. ulcerans), 쥐나균(M. lepraemurium), 엠·플라베센스(M. flavescens), 엠·테레에(M. terrae), 엠·논크로모제니쿰(M. nonchromogenicum), 엠·말멘스(M. malmoense), 엠·아시아티쿰(M. asiaticum), 엠·바케에(M. vaccae), 엠·가스트리(M. gastri), 엠·트리비알(M. trivia1e), 엠·헤모필럼(M. haemophilum), 엠·아프리카눔(M. africanum), 엠·서모레지스터블(M. thermoresistable) 및 스메그마균(M. smegmatis) 등이 있다.

본 발명의 제1 방법에 있어서, 항산균을 포함하는 생체 시료로는, 예를 들 면, 가래, 수액, 변, 타액, 혈액, 조직, 요 등이 있다.

다음에, 본 발명의 제1 방법은, 예를 들면 이하와 같이 하여 실시할 수 있다. 즉, 먼저 상기 소정 pH의 완충액에, 필요에 따라 EDTA 등의 금속 킬레이트제를 첨가하고, 또한 비이온 계면활성제를 첨가하여 용균 시약액을 조제한다. 상기 완충액으로는, Tris-HCl 버퍼, HEPES 버퍼, MOPS 버퍼, HEPPS 버퍼, TAPS 버퍼, 인산 버퍼 등이 있다. 이 용균 시약액은, 오토클레이브에 의해 고압 증기 멸균하는 것이 바람직하다. 한편, 시료액을 조제한다. 예를 들면, 객담 검체를, N-아세틸-L-시스테인-NaOH법(NALC-NaOH 법)등에 의해, 균질화 및 잡균 처리하여, 이것을 시료액으로 한다. 이것을 원심 분리하여 상청을 제거하고, 남은 침전물(펠릿)에 상기 용균 시약을 첨가한다. 그리고, 히트블록 등을 사용하여, 상기 소정의 온도로 가열함으로써 용균 처리를 행한다. 또한, 가열 방법으로는, 상기 히트블록 외에, 예를 들면, 워터베스, 마이크로웨이브 오븐, 에어베스 등이 있다.

이렇게 하여 용균한 검체는, 그대로 또는 전처리를 실시하여 유전자 증폭 또는 검출 처리를 행할 수 있다. 상기 유전자 증폭 또는 검출 방법으로는, 예를 들면 PCR법, RT-PCR 등의 PCR의 변법 등이 있다. 또, 분석 대상이 되는 유전자로는, DNA, RNA가 있다.

이어서, 본 발명의 제2 용균 방법에 관해서 설명한다.

본 발명의 제2 용균 방법에 있어서, 상기 가열 공정이, 상기 리파아제의 실활 공정을 겸하는 것이 바람직하다. 이렇게 하면, 특별한 공정을 설치하지 않고 리파아제를 실활할 수 있어, 용균 처리에 이어지는 유전자의 증폭 또는 검출 처리 등에 영향을 줄 위험이 없다.

본 발명의 제2 용균 방법에 있어서, 상기 지질 분해 공정 및 상기 가열 공정이, 완충액중에서 실시되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 동일한 완충액중에서 실시되는 것이다. 완충액은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, Tris 완충액, HEPES 완충액, 인산 완충액, 글리신 완충액, 맥킬바인 완충액 등을 들 수 있고, 이 중에서, Tris 완충액, HEPES 완충액이 바람직하다.

본 발명의 제2 용균 방법에 있어서, 상기 지질 분해 공정 및 상기 가열 공정이, 폐쇄계의 동일 용기 내에서 실시되는 것이 바람직하다. 폐쇄계이면, 시료의 비산을 방지할 수 있고, 동일 용기 내이면, 처리 효율이 좋아진다.

본 발명의 제2 용균 방법에 있어서, 상기 지질 분해 공정을 행한 후, 상기 가열 공정을 행해도 되고, 상기 양 공정을 동시에 행해도 된다. 전자의 경우, 예를 들면, 상기 지질 분해 공정의 조건은, pH 4∼8, 온도 37∼60℃ 및 처리 시간 5∼30분간의 조건이고, 상기 가열 공정의 조건은 온도 37∼100℃에서 5∼30분간의 조건이고, 바람직하게는, 상기 지질 분해 공정의 조건은, pH 6∼8, 온도 37∼50℃ 및 처리 시간 5∼20분간의 조건이고, 상기 가열 공정의 조건은, 온도 80∼100℃에서 5∼20분간의 조건이고, 보다 바람직하게는, 상기 지질 분해 공정의 조건은, pH 6.5∼7.5, 온도 37∼50℃ 및 처리 시간 10분간의 조건이고, 상기 가열 공정의 조건은, 온도 90∼98℃에서 10분간의 조건이다. 후자의 경우, 상기 지질 분해 공정 및 상기 가열 공정의 조건은, 예를 들면, pH 4∼8, 온도 37∼60℃ 및 처리 시간 10∼30분간의 조건이고, 바람직하게는, pH 6∼8, 온도 37∼50℃ 및 처리 시간 10∼20분 간의 조건이고, 보다 바람직하게는, pH 6.5∼7.5, 온도 45∼50℃ 및 처리 시간 10∼20분간의 조건이다.

상기 완충액중의 리파아제의 농도는, 예를 들면, 10∼10000units/ml이고, 바람직하게는 100∼2000units/ml, 보다 바람직하게는 200∼1000units/m1이다. 사용하는 리파아제는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면 상품명 리파아제 R「아마노」 G, 상품명 리파아제 M「아마노」10, 상품명 리파아제 G「아마노」50, 상품명 리파아제 AY「아마노」30G, 상품명 리파아제 A「아마노」6 등(이상, 모두 아마노 제약(주) 제조)가 있고, 이들은 단독으로 사용해도 되고, 2종류 이상으로 병용해도 된다. 이 중에서, 바람직한 것은, 상품명 리파아제 G「아마노」50, 상품명 리파아제 AY「아마노」30G이고, 보다 바람직한 것은, 상품명 리파아제 AY「아마노」30G 이다.

상기 완충중의 상기 비이온 계면활성제의 농도는, 예를 들면, 0.01∼10중량%이고, 바람직하게는 0.1∼2.0중량%이고, 보다 바람직하게는 0.5∼1.0중량%이다.

상기 비이온 계면활성제로는, 예를 들면, Span20, SPan40, Span60, Span65, Span80, Span85 등(이상, 나카라이테스크사 제조 등)의 d-소르비톨의 지방산에스테르, Tween20, Tween21, Tween40, Tween60, Tween65, Tween80, Tween81, Tween85등(이상, 나카라이테스크사 제조 등)의 폴리옥시에틸렌글리콜콜소르비탄알킬에스테르, TritonX-l00 등(나카라이테스크사 제조 등)의 폴리옥시에틸렌글리콜p-t-옥틸페닐에테르 등이 있다. 이들은, 단독으로 사용해도 되고, 2종류 이상으로 병용해도 된다. 이 중에서, Tween20, TritonX-100가 바람직하고, 보다 바람직한 것은, TritonX-100이다.

상기 가열 공정에서, 비이온 계면활성제에 더해, 또한, 금속 킬레이트제의 존재하에서, 가열 처리를 행하는 것이 바람직하다. 시료중에는, DNase 등의 유전자 분해 효소가 포함되어 있고, 금속 킬레이트제는, 이것에 의한 유전자의 분해를 방지하는 작용 등을 발휘한다. 상기 액체중의 상기 금속 킬레이트제의 농도는, 예를 들면 0.1∼2.0mM이고, 바람직하게는 0.5∼1.0mM이다. 상기 금속 킬레이트제로는, 예를 들면 에틸렌디아민4아세트산(EDTA), 글리콜에테르디아민4아세트산(EGTA) 및 1,2-시클로헥산디아민4아세트산(CyDTA) 등이 있다. 이들은, 단독으로 사용해도 되고, 2종류 이상으로 병용해도 된다. 이 중에서, 바람직한 것은 EDTA, EGTA이고, 보다 바람직한 것은 EDTA이다.

본 발명의 제2 용균 방법의 대상이 되는 항산균으로는, 상기 제1 용균 방법과 동일하다. 또, 본 발명의 제2 용균 방법에 있어서, 항산균을 포함하는 생체 시료는, 상기 제1 용균 방법과 동일하다.

이어서, 본 발명의 제2 용균 방법은, 예를 들면, 이하와 같이 하여 실시할 수 있다. 즉, 먼저 상기 소정 pH의 완충액에, 리파아제, 비이온 계면활성제, 필요에 따라 EDTA 등의 금속 킬레이트제를 첨가하여 용균 시약액을 조제한다. 이 용균 시약액은, 오토클레이브에 의해 고압 증기 멸균하는 것이 바람직하다. 이 용균 시약액에, 시료를 첨가하고, 먼저 45℃에서 10분간 인큐베이션(지질 분해 공정)하고, 계속해서 96℃에서 10분간 인큐베이션(가열 공정)한다. 전자의 인큐베이션에 의해, 항산균의 세포벽이 취약화되고, 후자의 인큐베이션에 의해 항산균이 용균하는 동시에, 리파아제가 실활한다. 상기 양 인큐베이션 방법은, 히트블록, 워터베스, 서멀사이클러 등에 의해 행할 수 있다. 또한, 이 방법 외에, 상기 용균 시약액에 시료를 첨가하고, 37∼50℃에서 10∼20분간 인큐베이션함으로써, 지질 분해 공정과 가열 공정을 동시에 행해도 된다.

상기 시료는, 예를 들면, 객담 검체를, N-아세틸-L-시스테인-NaOH법(NALC-NaOH법) 등에 의해, 균질화 및 잡균 처리하여 조제해도 된다. 이 시료를 원심 분리하여 상청을 제거하고, 남은 침전물(펠릿)에 상기 용균 시약을 첨가한다.

이렇게 하여 용균한 검체는, 그대로 또는 전처리를 실시하여 유전자 증폭 또는 검출 처리를 행할 수 있다. 상기 유전자 증폭 또는 검출 방법으로는, 예를 들면, PCR법, RT-PCR 등의 PCR의 변법 등이 있다. 또, 분석 대상이 되는 유전자로는, DNA, RNA가 있다.

(실시예)

이어서, 본 발명의 실시예에 관해 비교예와 함께 설명한다. 또한, 실시예1-1, 1-2, 1-3, 1-4는, 본 발명의 제1 용균 방법의 실시예이고, 실시예 2-1, 2-2, 2-3, 2-4는, 본 발명의 제2 용균 방법의 실시예이다.

(실시예 1-1, 비교예 1)

임상 분리 결핵 균주를, 상품명 마이코브로스(극동제약사 제조)에서 McEarland#1의 탁도가 될 때까지 37℃에서 배양하고, 이 균주를 인산 완충액(pH 6.8)으로 희석하여 10배 희석 계열(10²배 희석∼10⁵배 희석)을 작성하여 피검 균액 을 조제했다. 상기 각 농도의 균액을 100μL씩 스크류캡이 부착된 튜브에 분주(分注)하여, 원심 분리(10000g, 15분간)하여 펠릿화한 것을 용균 반응에 사용하는 시료로 했다. 한편, TE 완충액(10mM의 EDTA, 25mM의 Tris-HCl : pH 8.0)에 3중량%의 농도로 상품명 TritonX-100(나카라이사 제조)를 용해하여 용균 시약액을 조제하고, 이것을 오토클레이브로 고압 증기 멸균한 것을 사용했다.

상기 시료의 각각에, 상기 용균 시약 50μL을 첨가하여, 히트블록으로 96℃에서 10분간 가열하여, 용균 처리를 행했다. 또, 비교예 1로서, 상품명 앰플리코어 검체 전처리 키트(일본 로슈사 제조)를 사용하여, 상기 시료를 용균했다.

이렇게 하여 얻어진 실시예 1-1 및 비교예 1의 각 용균 시료액 37.5μL에, 상품명 앰플리코어 증폭 검출 키트(일본 로슈사 제조)의 pre mixture 50μL 및 12 mM 아세트산마그네슘 12.5μL을 첨가하여, 상기 키트의 조작 설명서대로 코버스앰플리코어에서 PCR법에 의한 증폭·검출을 행했다.

상기 증폭·검출의 결과, 실시예 1-1 및 비교예 1 모두, 10⁷배 희석까지는 양성이고, 그 이상의 희석 배율에서는 음성이었다. 이 결과로부터, 실시예 1-1의 용균 처리는, 종래 방법(비교예 1)과 동등한 감도(용균 효율)라고 할 수 있다. 또한, 실시예 1-1의 용균 방법은, 종래 방법(비교예 1)에 비해, 처리 시간이 반으로 단축되었다.

(실시예 1-2, 비교예 2)

임상 분리 결핵 균주를, 상품명 마이코브로스(극동 제약)에서 McEarland#1의 탁도가 될 때까지 37℃에서 배양했다. 이 배양 균주를, 상품명 스프타자임(극동 제약사 제조)로 균질화한 비결핵성 객담으로 희석하여 10배 희석 계열(10⁰배 희석∼10¹⁰배 희석)을 작성하여, 이들을 시료로 했다. 한편, TE 완충액(10mM의 EDTA, 25mM의 Tris-HCl : pH 8.0)에 3중량%의 농도로 상품명 TritonX-100(나카라이사 제조)를 용해하여 용균 시약액을 조제하고, 이것을 오토클레이브로 고압 증기 멸균한 것을 사용했다.

상기 희석 시료의 각각(100μL)에, 상기 용균 시약 50μL을 첨가하여, 히트블록으로 96℃에서 10분간 가열하여, 용균 처리를 행했다. 또, 비교예 1로서, 상품명 앰플리코어 검체 전처리 키트(일본 로슈사 제조)를 사용하여, 상기 시료를 용균했다.

이렇게 하여 얻어진 실시예 1-2 및 비교예 2의 각 용균 시료액 37.5μL에, 상품명 앰플리코어 증폭 검출 키트(일본 로슈사 제조)의 pre mixture 50μL 및 12 mM 아세트산마그네슘 12.5μL을 첨가하여, 상기 키트의 조작 설명서대로 코버스앰플리코어에서 PCR법에 의한 증폭·검출을 행했다.

상기 증폭·검출의 결과, 실시예 1-2 및 비교예 2 모두, 10⁴배 희석까지는 양성이고, 그 이상의 희석 배율에서는 음성이었다. 이 결과로부터, 협잡물 영향하에서도, 실시예 2의 용균 처리는, 종래 방법(비교예 2)과 동등한 감도(용균 효율)라고 할 수 있다. 또한, 실시예 1-2의 용균 방법은, 종래 방법(비교예 2)에 비해, 처리 시간이 반으로 단축되었다.

(실시예 1-3, 비교예 3)

환자로부터 얻어진 객담 검체 90예를, NALC-NaOH법(일본 결핵병학회 편찬「신결핵균 검사지침 2000」)으로, 균질화 및 잡균 처리를 행했다. 상기 처리 후의 객담 검체 100μL을 13,000g에서 10분간 원심하여, 상청 제거 후, 침전물(펠릿)을 회수했다. 한편, TE 완충액(10mM의 EDTA, 25mM의 Tris-HCl : pH 8.0)에 1중량%의 농도로 상품명 TritonX-100(나카라이사 제조)를 용해하여 용균 시약액을 조제하고, 이것을 오토클레이브로 고압 증기 멸균하여 사용했다. 즉, 상기 펠릿에, 상기 용균 시약액 50μL을 첨가하여 현탁시켰다. 이 현탁액을 히트블록으로 96℃에서 10 분간 가열하여, 용균 처리를 실시했다. 한편, 비교예 3으로서, 상품명 앰플리코어 검체 전처리 키트(일본 로슈사 제조)를 사용하여, 상기 시료(펠릿)를 용균했다.

이렇게 하여 얻어진 실시예 1-3 및 비교예 3의 각 용균 시료액 12.5μL에, 상품명 앰플리코어 증폭 검출 키트(일본 로슈사 제조)의 pre mixture 50μL 및 12 mM 아세트산마그네슘 37.5μL을 첨가하여, 상기 키트의 조작 설명서대로 코버스앰플리코어에서 PCR법에 의한 증폭·검출을 행했다. 또, 상기 시료(펠릿)에 대해, 통상법에 의해 배양 검사를 행했다.

이들의 결과, 객담 검체 90예 중, 종래 방법(비교예3)으로 처리한 경우, 결핵 양성이 41예, 음성은 49예이고, 본 발명의 제1 방법(실시예 1-3)으로 처리한 경우, 결핵 양성이 41예, 음성은 49예로서, 양 방법의 결과는 일치했다. 또, 배양 검사에서의 결과는, 42예가 결핵 양성, 48예가 음성이고, 실시예 3 및 비교예 3과의 일치율은 대략 100%(97.8%)였다. 이렇게, 본 발명 방법의 용균 효과는, 종래 방법과 같은 정도이고, 실제의 임상 검사에 있어서도 유용하다고 할 수 있다. 또, 실시예 1-3의 방법은, 비교예 3의 방법보다, 용균 처리 시간이 30분간이나 단축되었다.

(실시예 2-1, 실시예 1-4)

상품명 리파아제 G「아마노」50(아마노 제약사 제조) 및 상품명 리파아제 AY「아마노」30G(아마노 제약사 제조)를 10mM HEPES Buffer(pH 7.0)에 용해시켜 리파아제 시약액을 조제했다. 또, 용균 시약액은, TE buffer(10mM Tris, 1mM EDTA, pH 8.0)에, TritonX-100(나카라이사 제조)를 첨가하여 조제하여, 오토클레이브 멸균하여 사용했다(이하, TE-Triton 시약이라 한다). 시료가 되는 배양 BCG는, 항산균 증식용 액체 배지(상품명 : MycoBroth, 극동제약공업사 제조)에서, 균액이 맥퍼랜드 1상당의 탁도가 될 때까지 배양하여, 이것을 필요에 따라 희석하여 조제했다.

상기 BCG 균액을, 인산 완충액(pH 6.8)을 사용하여 단계 희석(10^-4, 10^-3.5, 10^-3, 10^-2.5, 10^-2)하여 피검 균액을 조제했다. 상기 각 농도의 균액을 100μL씩 스크류 캡이 부착된 튜브에 분주하여, 원심(10,000g, 15분간)하여 펠릿화한 것을 용균 반응에 사용하는 샘플(시료)로 했다. 상기 리파아제 시약액은, 그 농도가, 100, 500, 1000, 2000, 3000(units/mL)의 5단계 농도가 되도록 조제했다. 상기 시료에 상기 각 농도의 리파아제 시약액을 50μL 첨가하고, 볼텍스 후, 가볍게 원심하여 37℃, 30분간 인큐베이션했다. 다음에, TE-Tirotn 시약(Triton 농도 2%) 50μL을 첨가하여, 96℃에서 20분간 가열하여 용균 처리했다. 한편, 리파아제 처리를 행하지 않는 것 외에는, 동일한 처리를 행한 것을 실시예 1-4로 했다.

세포가 용해된 것을 확인하기 위해, 상기의 처리에 의해 얻어진 용균액 100μL 중, 2μL을 template으로 하여 PCR을 행했다. PCR은 94℃에서 1분간의 변성 후, 94℃에서 30초간, 60℃에서 1분간, 72℃에서 1분간의 열 사이클을 30회 행했다. 프라이머의 배열, 반응액의 조성은 다음과 같다.

(PCR 반응 조성)

10 x Ex-Taq Buffer 2.5μL

2.5mM dNTP Mixture 2.0μL

100μM 프라이머① 0.125μL (배열 번호 1)

100μM 프라이머② 0.125μL (배열 번호 2)

Ex-Taq(5u/μL) 0.125μL

D.W. 18.125μL

각 용균 후 샘플 2.0 μ L

합계 25.0μL

상기의 증폭 반응에 의한 산물 각 8μL에 대해, 3% 아가로스 겔 전기 영동을 행했다. 그 결과를 도 1에 나타낸다. 또한, 동 도면의 레인 번호에 흐르게 한 샘플은 이하와 같다.

(도 1의 설명)

① TE-Triton 시약중에서의 열처리만.

②리파아제 G「아마노」50에서 처리 후, TE-Triton 시약중에서 열처리.

리파아제 농도 100units/mL

③리파아제 G「아마노」50에서 처리 후, TE-Triton 시약중에서 열처리.

리파아제 농도 500units/mL

④리파아제 G「아마노」50에서 처리 후, TE-Triton 시약중에서 열처리.

리파아제 농도 1,000units/mL

⑤리파아제 AY「아마노」30G에서 처리 후, TE-Triton 시약중에서 열처리.

리파아제 농도 100units/mL

⑥리파아제 AY「아마노」30G에서 처리 후, TE-Triton 시약중에서 열처리.

리파아제 농도 500units/mL

⑦리파아제 AY「아마노」30G에서 처리 후, TE-Triton 시약중에서 열처리.

리파아제 농도 1,000units/mL

※도면중의 M표시는 100bp 래더 분자량 마커이다.

※①∼⑦의 영역은, 모두 레인 왼쪽부터 10^-4, 10^-3.5, 10^-3, 10^-2.5, 10^-2의 균 샘플.

도 1에서 알 수 있듯이, TE-Triton 시약중에서의 열처리만의 경우(①, 실시예1-4)에도 충분히 용균할 수 있었으나, 리파아제에 의한 전처리를 행한 경우(②∼⑦, 실시예 2-1)쪽이, 더욱 용균 작용이 향상했다.

(실시예 2-2, 실시예 2-3)

상기 BCG 균액을, 인산 완충액(pH 6.8)을 사용하여 단계 희석(10^-4, 10^-3.5, 10^-3, 10^-2.5)한 것을 피검 균액으로 했다. 각 농도의 균액을 100μL씩 스크큐 캡이 부착된 튜브에 분주하여, 원심(10,000g, 15분간)하여 펠릿화한 것을 용균 반응에 사용하는 샘플(시료)로 했다. 한편, 상기 TE-Triton 시약에 리파아제 AY「아마노」30G를 500units/mL의 농도가 되도록 첨가한 것을 용균 시약액으로서 사용했다. 상기 시료에 상기 용균 시약 100μL을 첨가하여, 볼텍스 후, 가볍게 원심한 뒤, 45℃에서 인큐베이션했다. 인큐베이션의 시간은 10분간, 30분간의 2가지 행했다. 계속해서, 각각 96℃에서 10분간 가열하여 용균 처리를 행했다(실시예 2-2). 또, 리파아제 처리와 열처리를 동시에 행한(45℃, 10분간) 것 외에는, 상술한 것과 같은 조작을 행한 것을 실시예 2-3으로 했다.

세포가 용해된 것을 확인하기 위해, 상기의 처리에 의해 얻어진 용균액 100μL 중, 2μL을 template로 하여 PCR를 행했다. PCR의 조건은, 실시예 1과 동일하다. 상기 PCR 증폭 반응 산물 각 8μL을 3% 아가로스 겔 전기 영동법에 의해 확인했다. 그 결과를 도 2에 나타낸다. 또한, 동 도면의 레인 번호에 흐르게 한 샘플은 이하와 같다.

(도 2의 설명)

①리파아제 AY「아마노」30G와 TE-Triton 시약과의 혼합 시약중에서의 리파아제 처리와 열처리의 동시 처리(실시예 2-3).

②리파아제 AY「아마노」30G와 TE-Triton 시약과의 혼합 시약으로 처리.

45℃, 10분간 →96℃, 10분간

③리파아제 AY「아마노」30G와 TE-Triton 시약과의 혼합 시약으로 처리.

45℃, 30분간 →96℃, 10분간

④리파아제 AY「아마노」30G에서 37℃, 10분 처리 후, TE-Triton 시약을 첨가하여 96℃에서 10분간 열처리.

⑤리파아제 AY「아마노」30G에서 37℃, 10분 처리 후, TE-Triton 시약을 첨가하여 96℃에서 10분간 열처리.

※도면중의 M표시는 100bp 래더 분자량 마커이다.

※①∼⑤의 영역은, 모두 레인 왼쪽부터 10^-4, 10^-3.5, 10^-3, 10^-2.5의 균 샘플.

도 2에 도시하는 바와 같이, 지질 분해 처리와 가열 처리를 동시에 행해도(실시예 2-3), 충분히 용균했다. 또, 지질 분해 처리와 가열 처리를 나누어 행하면(실시예 2-2), 더욱 용균 효율이 향상했다. 또한, 지질 분해 처리의 인큐베이션 시간의 영향은 인정되지 않고, 비이온성 계면활성제와 리파아제를 동일한 완충액에 용해시켜도 문제가 없었다.

(실시예 2-4)

TE buffer(10mM Tris, 1mM EDTA, pH 8.0) 및 Tris Buffer(10mM Tris, pH 8.0)에, 각각 TritonX-100(나카라이사 제조)를 1%의 농도가 되도록 첨가하고, 오토클레이브 멸균하여, EDTA 함유 시약 및 EDTA 불함유 시약을 조제했다. 이들을, 이하 각각 TE-Triton 시약(EDTA 함유) 및 Tris-Triton 시약(EDTA 불함유)이라고 한다. 시료가 되는 배양 BCG는, 항산균 증식용 액체 배지(상품명 : MycoBroth, 극동제약 공업사 제조)에서, 균액이 맥퍼랜드 1상당의 탁도가 될 때까지 배양하여, 이것을 필요에 따라 희석하여 조제했다.

상기 BCG 균액을, 인산 완충액(pH 6.8)을 사용하여 단계 희석(10^-4.5, 10^-4, 10^-3.5, 10^-3, 10^-2.5)하여 피검 균액을 조제했다. 상기 각 농도의 균액을 100μL씩 스크류 캡이 부착된 튜브에 분주하고, 원심(10,000g, 15분간)하여 펠릿화한 것을 용균 반응에 사용하는 샘플(시료)로 했다. 상기 TE-Triton 시약 및 Tris-Triton 시약에, 각각 리파아제 AY「아마노」30G를 500units/mL의 농도가 되도록 첨가했다. 이 용액100μL을 상기 시료에 첨가하여, 볼텍스 후, 가볍게 원심한 뒤, 45℃에서 인큐베이션했다. 인큐베이션의 시간은 10분간 및 30분간의 2가지로 행했다. 계속해서, 각각 96℃, 10분간의 열처리를 행했다.

세포가 용해된 것을 확인하기 위해서, 상기의 처리에 의해 얻어진 용균액 100μL 중, 2μL을 template로 하여 PCR를 행했다. PCR의 조건은, 실시예 1과 동일하다. 상기 PCR 증폭 반응 산물 각 8μL을 3% 아가로스 겔 전기 영동법에 의해 확인했다. 그 결과를 도 3에 나타낸다. 또한, 동 도면의 레인 번호에 흐르게 한 샘플은 이하와 같다.

(도 3의 설명)

①∼③ : 리파아제 AY「아마노」30G와 TE-Triton 시약과의 혼합 시약으로 처

리(EDTA 있음).

45℃, 10분간→96℃, 10분간

④∼⑥ : 리파아제 AY「아마노」30G와 Tris-Triton 시약과의 혼합 시약으로

처리(EDTA 없음). 45℃, 10분간 → 96℃, 10분간

※도면중의 M표시는 100bp 래더 분자량 마커이다.

※①∼⑥의 영역은, 모두 레인 왼쪽부터 10^-4.5, 10^-4, 10^-3.5, 10^-3, 10^-2.5의 균 샘플.

도 3에 도시하는 바와 같이, EDTA를 사용하지 않는 경우(④∼⑥)라도, 충분히 용균할 수 있었다. 또, EDTA를 사용하면(①∼③), 더욱 용균 효율을 올릴 수 있었다.

이상과 같이, 본 발명의 용균 방법은, 특수한 장치나 시약을 사용하지 않고, 간단하게 단시간에 항산균을 확실히 용균할 수 있는 방법이다. 따라서, 본 발명 방법을, 예를 들면 유전자의 증폭·검출법에 의한 항산균 검사의 시료의 전처리에 적용함으로써, 검사의 효율화를 간단히 실현할 수 있다.

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항산균(抗酸菌)으로부터 유전자를 추출하기 위한 용균 방법에 있어서, 비이온 계면활성제를 포함하는 액체중에서, 상기 항산균을, 상기 액체의 비점 미만의 온도로 가열하고, 상기 가열 온도가 70℃ 이상 100℃ 미만인, 항산균으로부터 유전자를 추출하기 위한 용균 방법.
제2항에 있어서, 상기 가열 시간이 1∼30분인, 항산균으로부터 유전자를 추출하기 위한 용균 방법.
제2항에 있어서, 상기 가열 조건이 96℃에서 10분간의 조건인, 항산균으로부터 유전자를 추출하기 위한 용균 방법.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액체의 pH가 pH 7.0∼12.0의 범위인, 항산균으로부터 유전자를 추출하기 위한 용균 방법.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액체중의 상기 비이온 계면활성제의 농도가 0.01∼10중량%인, 항산균으로부터 유전자를 추출하기 위한 용균 방법.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 비이온 계면활성제가, d-소르비톨지방산에스테르, 폴리옥시에틸렌글리콜소르비탄알킬에스테르 및 폴리옥시에틸렌글리콜p-t-옥틸페닐에테르로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개인, 항산균으로부터 유전자를 추출하기 위한 용균 방법.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액체가 금속 킬레이트제를 더 포함하는, 항산균으로부터 유전자를 추출하기 위한 용균 방법.
제8항에 있어서, 상기 액체중의 상기 금속 킬레이트제의 농도가, 0.1∼100 mM인 항산균으로부터 유전자를 추출하기 위한 용균 방법.
제8항에 있어서, 상기 금속 킬레이트제가, 에틸렌디아민4아세트산(EDTA), 에틸렌글리콜-비스(β-아미노에틸에테르)-N,N,N',N'-4아세트산(EGTA), 디아미노시클로헥산4아세트산, o-페난트롤린 및 살리실산으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 1개인 항산균으로부터 유전자를 추출하기 위한 용균 방법.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 용균 대상이 되는 항산균이, 새형 결핵균(M. avium), 엠·인트라셀루라레(M. intracellularae), 엠·고르도네(M. gordonae), 사람형 결핵균(M. tuberculosis), 엠·칸사시(M. kansasii), 엠·포르츠이츰(M. fortuitum), 엠·켈로네(M. chelonae), 소형 결핵균(M. bovis), 엠·스크로플라세움(M. scrofulaceum), 파라 결핵균(M. paratuberculosis), 티모테균(M. phlei), 엠·마리눔(M. marinum), 엠·시미에(M, simiae), 엠·스즐가이(M. szulgai), 나균(M. leprae), 엠·크세노피(M. xenopi), 엠·울세란스(M. ulcerans), 쥐나균(M. lepraemurium), 엠·플라베센스(M. flavescens), 엠·테레에(M. terrae), 엠·논크로모제니쿰(M. nonchromogenicum), 엠·말멘스(M. malmoense), 엠·아시아티쿰(M. asiaticum), 엠·바케에(M. vaccae), 엠·가스트리(M. gastri), 엠·트리비알(M. trivia1e), 엠·헤모필럼(M. haemophilum), 엠·아프리카눔(M. africanum), 엠·서모레지스터블(M. thermoresistable) 및 스메그마균(M. smegmatis)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개인, 항산균으로부터 유전자를 추출하기 위한 용균 방법.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항산균을 포함하는 생체 시료가, 가래, 수액, 변, 타액, 혈액, 조직 및 요로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개인, 항산균으로부터 유전자를 추출하기 위한 용균 방법.
항산균의 유전자를 특이적으로 증폭 또는 검출하는 방법에 있어서, 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법에 의해 항산균을 용균하여 유전자를 추출하고, 이것을 시료로 하여 항산균의 유전자를 특이적으로 증폭 또는 검출하는 방법.
항산균으로부터 유전자를 추출하기 위한 용균 방법에 있어서, 상기 항산균을 리파아제로 처리하는 지질 분해 공정과, 비이온 계면활성제의 존재하에서 상기 항산균을 가열하는 가열 공정을 포함하는 항산균으로부터 유전자를 추출하기 위한 용균 방법.
제14항에 있어서, 상기 가열 공정이, 상기 리파아제의 실활(失活) 공정을 겸하는 항산균으로부터 유전자를 추출하기 위한 용균 방법.
제14항 또는 제15항에있어서, 상기 지질 분해 공정 및 상기 가열 공정이, 완충액중에서 실시되는 항산균으로부터 유전자를 추출하기 위한 용균 방법.
제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 지질 분해 공정 및 상기 가열 공정이, 폐쇄계의 동일 용기 내에서 실시되는 항산균으로부터 유전자를 추출하기 위한 용균 방법.
제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 지질 분해 공정을 행한 후, 상기 가열 공정을 행하는 항산균으로부터 유전자를 추출하기 위한 용균 방법.
제18항에 있어서, 지질 분해 공정의 조건이, pH 4∼8, 온도 37∼60℃ 및 처 리 시간 5∼30분간의 조건이고, 상기 가열 공정의 조건이, 온도 37∼100℃에서 5∼30분간의 조건인 항산균으로부터 유전자를 추출하기 위한 용균 방법.
제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 지질 분해 공정 및 상기 가열 공정을 동시에 행하는 항산균으로부터 유전자를 추출하기 위한 용균 방법.
제20항에 있어서, 상기 지질 분해 공정 및 상기 가열 공정의 조건이, pH 4∼8, 온도 37∼60℃ 및 처리 시간 5∼30분간의 조건인 항산균으로부터 유전자를 추출하기 위한 용균 방법.
제16항에 있어서, 상기 완충액중의 리파아제의 농도가, 10∼10000units/ml인 항산균으로부터 유전자를 추출하기 위한 용균 방법.
제14항 또는 제15항에 있어서, 비이온 계면활성제가, d-소르비톨지방산에스테르, 폴리옥시에틸렌글리콜소르비탄알킬에스테르 및 폴리옥시에틸렌글리콜p-t-옥틸페닐에테르로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개인 항산균으로부터 유전자를 추출하기 위한 용균 방법.
제16항에 있어서, 상기 완충액중의 상기 비이온 계면활성제의 농도가, 0.01∼10중량%인 항산균으로부터 유전자를 추출하기 위한 용균 방법.
제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 가열 공정이, 상기 비이온 계면활성제에 추가하여 금속 킬레이트제의 존재하에서 행해지는 항산균으로부터 유전자를 추출하기 위한 용균 방법.
제25항에 있어서, 상기 금속 킬레이트제가, 에틸렌디아민4아세트산(EDTA), 글리콜에테르디아민4아세트산(EGTA), 및 1,2-시클로헥산디아민4아세트산(CyDTA)로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 1개인 항산균으로부터 유전자를 추출하기 위한 용균 방법.
제25항에 있어서, 상기 완충액중의 상기 금속 킬레이트제의 농도가, 0.1∼2.0mM인 항산균으로부터 유전자를 추출하기 위한 용균 방법.
제14항 또는 제15항에 있어서, 용균 대상이 되는 항산균이, 새형 결핵균(M. avium), 엠·인트라셀루라레(M. intracellularae), 엠·고르도네(M. gordonae), 사람형 결핵균(M. tuberculosis), 엠·칸사시(M. kansasii), 엠·포르츠이츰(M. fortuitum), 엠·켈로네(M. chelonae), 소형 결핵균(M. bovis), 엠·스크로플라세움(M. scrofulaceum), 파라 결핵균(M. paratuberculosis), 티모테균(M. phlei), 엠·마리눔(M. marinum), 엠·시미에(M, simiae), 엠·스즐가이(M. szulgai), 나균(M. leprae), 엠·크세노피(M. xenopi), 엠·울세란스(M. ulcerans), 쥐나균(M. lepraemurium), 엠·플라베센스(M. flavescens), 엠·테레에(M. terrae), 엠·논크로모제니쿰(M. nonchromogenicum), 엠·말멘스(M. malmoense), 엠·아시아티쿰(M. asiaticum), 엠·바케에(M. vaccae), 엠·가스트리(M. gastri), 엠·트리비알(M. trivia1e), 엠·헤모필럼(M. haemophilum), 엠·아프리카눔(M. africanum), 엠·서모레지스터블(M. thermoresistable) 및 스메그마균(M. smegmatis)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개인 항산균으로부터 유전자를 추출하기 위한 용균 방법.
제14항 또는 제15항에 있어서, 항산균을 포함하는 생체 시료가, 가래, 수액, 변, 타액, 혈액, 조직, 스웝, 위세정액 및 요로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개인 항산균으로부터 유전자를 추출하기 위한 용균 방법.
항산균의 유전자를 특이적으로 증폭 또는 검출하는 방법에 있어서, 제14항 또는 제15항의 방법에 의해 항산균을 용균하여 유전자를 추출하고, 이것을 시료로 하여 유전자를 특이적으로 증폭 또는 검출하는 방법.