KR100618563B1

KR100618563B1 - 셀룰로오스 결합 도메인을 이용한 효모에서 재조합단백질의 제조방법

Info

Publication number: KR100618563B1
Application number: KR1020030076056A
Authority: KR
Inventors: 정준기; 최의성; 장형욱; 이홍원; 손정훈; 안정오; 지원철
Original assignee: 한국생명공학연구원; 주식회사 이지바이오 시스템; 주식회사 에이스바이오텍
Priority date: 2003-10-29
Filing date: 2003-10-29
Publication date: 2006-08-31
Anticipated expiration: 2023-10-29
Also published as: KR20050040601A

Abstract

본 발명은 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 5’-말단에 셀룰라제(cellulase)의 셀룰로오스 결합 도메인을 코딩하는 유전자가 결합된 DNA 작제물이 효모에서 작용하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 재조합 발현 벡터, 이 재조합 발현 벡터로 형질전환된 효모 숙주세포, 이 숙주세포를 배양하고 이의 배양물에서 셀룰로오스 결합 도메인과 융합된 목적 단백질을 분리 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 목적 단백질의 제조방법 및 이러한 방법으로부터 제조된 셀룰로오스 결합 도메인과 융합된 목적 단백질에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 숙주세포를 배양하고 이의 배양물을 셀룰로오스 담체와 혼합하는 단계를 포함하는, 셀룰로오스 결합 도메인과 융합된 단백질이 상기 셀룰로오스 담체에 부착된 고정화 단백질의 제조방법 및 이러한 방법으로부터 제조된 고정화 단백질에 관한 것이다.

셀룰라제, 셀룰로오스 결합 도메인, 효모, 고정된 단백질

Description

셀룰로오스 결합 도메인을 이용한 효모에서 재조합 단백질의 제조방법{Method for Producing Recombinant Proteins in Yeast using cellulose-binding domain}

도 1은 트리고더마 하지아눔(Trichoderma harzianum)에서 유래된 셀룰라제의 셀룰로오스 결합 도메인 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 염기 서열을 나타낸 것이다.

도 2A는 본 발명의 일실시예에 해당하는 리파제를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 pYEGA-AM-Lip을 도식화한 것이고, 도 2B는 본 발명의 일실시예에 해당하는 리파제를 코딩하는 유전자의 말단에 셀룰로오스 결합 도메인을 코딩하는 유전자가 결합된 DNA 작제물이 효모에서 작용하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 재조합 발현 벡터인 pYEGA-AM-CBDLip을 도식화한 것이다.

도 3은 재조합 발현 벡터 pYEGA-AM-Lip 또는 pYEGA-AM-CBDLip으로 형질전환된 효모를 회분식 배양하고, 생산된 리파제 양을 비교하기 위하여 수행한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 것으로, 도면의 좌측 레인은 pYEGA-AM-Lip으로 형질전환된 효모, 우측 레인은 pYEGA-AM-CBDLip으로 형질전환된 효모에 해당한다.

도 4는 재조합 발현 벡터 pYEGA-AM-CBDLip으로 형질전환된 효모를 유가식 배양하고, 각 시간별로 균체의 건조중량, 리파제 활성 및 포도당의 농도 등을 측정한 결과를 나타낸 것이다(○:균체의 건조중량; ■:세포외 리파제 활성; ●:포도당의 농도).

도 5는 셀룰로오스 결합 도메인과 융합된 리파제(CBDLip)의 셀룰로오스 담체(Avicel)로의 고정 여부를 확인하기 위한 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것으로, 레인 M은 표준 분자량 마커; 레인 1은 융합된 리파제(CBDLip)와 셀룰로오스 담체의 혼합 전; 레인 2는 융합된 리파제(CBDLip)와 셀룰로오스 담체의 혼합 후에 해당한다.

도 6a는 셀룰로오스 담체에 고정된 리파제(CBDLip)의 온도에 따른 활성변화를 나타낸 것이고, 도 6b는 셀룰로오스 담체에 고정된 리파제(CBDLip)의 pH에 따른 활성변화를 나타낸 것이며, 도 6c는 셀룰로오스 담체에 고정된 리파제(CBDLip)의 온도에 따른 열안정성을 나타낸 것이다(●:Lip; ○:CBDLip; ▲:Avicel에 고정화된 CBDLip).

본 발명은 셀룰로오스 결합 도메인을 이용한 효모에서 재조합 단백질 제조방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 5’-말단에 셀룰라제(cellulase)의 셀룰로오스 결합 도메인을 코딩하는 유전자가 결합된 DNA 작제물이 효모에서 작용하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 재조합 발현 벡터 및 이 재조합 발현 벡터로 형질전환된 효모 숙주세포, 이 숙주세포를 배 양하고 이의 배양물에서 셀룰로오스 결합 도메인과 융합된 목적 단백질을 분리 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 목적 단백질의 제조방법 및 이러한 방법으로부터 제조된 셀룰로오스 결합 도메인과 융합된 목적 단백질에 관한 것이다.

재조합 단백질 생산을 위하여 다양한 단핵세포성 숙주세포가 이용되고 있다. 이들 숙주에는 이. 콜라이, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO 및 마우스 세포와 같은 동물 세포, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 및 BMT 10과 같은 아프리카 그린 원숭이 세포 및 조직배양된 인간 세포 및 식물 세포들이 포함된다.

이러한 숙주세포 중에서, 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae)는 1981년에 인터페론(interferon) 생산에 최초로 이용된 후(Hitzeman et al. Nature, 1981, vol.293, p.717), 유용한 외래 단백질 생산에 널리 이용되어 왔다. 효모는 자신의 세포내 발현 및 분비 시스템을 이용하여 목적 단백질을 활성형으로 분비할 수 있으며, 단백질의 N-말단의 메티오닌(methionine) 제거, 당화(glycosylation) 및 디설파이드 결합(disulfide bond)과 같은 해독 후 수식(post-translation modification) 시스템을 가지고 있다. 또한, 효모는 미국 FDA로부터 인체에 대한 안정성이 인정된 GRAS 세포(Generally Regarded As Safe)로 분류되었다.

이와 같이 효모를 이용하여 외래 단백질을 생산할 경우 인체에 안전하며, 동 물 또는 사람 세포에서 발현되는 단백질과 유사한 형태로 수득할 수 있을 뿐만 아니라, 대장균 발현 시스템에 비해 발효 후 정제공정이 현저히 간단하고 리폴딩(refolding)등의 과정 없이 곧바로 활성이 있는 외래 단백질을 얻을 수 있는 장점이 있다. 그러나, 효모에서 재조합 단백질의 생산시, 단백질에 따라 생산성이 상당히 다르며, 대부분의 경우, 그 생산량이 비교적 적은 편이다. 따라서, 많은 연구자들이 여러 종류의 발현 벡터를 개발하여 효모에서 단백질의 발현 및 분비를 증가시키고자 노력하였다.

예를 들면, 유럽특허 제 303,833호는 외래 유전자와 효모의 GAL1 프로모터를 포함한 발현벡터를 이용하여 효모에서 갈락토키나제 - 보바인 프로카이모신(galactokinase - bovine prochymosin) 융합 단백질을 생산하는 방법을 제시하고 있다. 대한민국특허 제97-00097호(또한, Lee et al. Biotechnol. Prog. 1999, Vol.15, p.884)는 인터루킨 1β의 N-말단 24잔기를 분비 항진자(secretion enhancer)로 이용하고, 분비 서열과 함께 외래 유전자 앞에 삽입함으로써 hGCSF와 hGH의 분비효율을 크게 증가시킨 방법을 제시하고 있다. 유럽특허 제 302,723호는 효모의 알파-메이팅 인자(α-mating factor)의 프로모터와 분비 서열을 사용하여 인간 인터페론 감마(interferon-γ), 인간 혈청 알부민, 조직 플라즈미노겐 활성인자(tissue plasminogen activator), 레닌(rennin), 인간 인슐린 유사 성장인자(human insulin-like growth factor) 등을 발현시키는 방법이 제시되어 있다.

본 발명자들 또한 효모에서 재조합 단백질의 발현 및 분비의 향상을 위한 연구를 하던 중, 셀룰로오스 결합 도메인을 코딩하는 유전자가 이종 유전자와 결합되었을 때, 상기 재조합 단백질의 발현 및 분비를 향상시킴을 알아내었다.

따라서, 한 관점으로서, 본 발명은 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 5’-말단에 셀룰라제의 셀룰로오스 결합 도메인을 코딩하는 유전자가 결합된 DNA 작제물이 효모에서 작용하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 재조합 발현 벡터를 제공한다.

다른 관점으로서, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 효모 숙주세포를 제공한다.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 상기 숙주세포를 배양하고 이의 배양물에서 셀룰로오스 결합 도메인과 융합된 목적 단백질을 분리 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 목적 단백질의 제조방법을 제공한다.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 셀룰로오스 결합 도메인과 융합된 목적 단백질을 제공한다.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 상기 숙주세포를 배양하고 이의 배양물을 셀룰로오스 담체와 혼합하는 단계를 포함하는, 셀룰로오스 결합 도메인과 융합된 단백질이 상기 셀룰로오스 담체에 부착된 고정화 단백질의 제조방법을 제공한다.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 셀룰로오스 담체에 부착된 셀룰로오스 결합 도메인과 융합된 단백질의 고정화 단백질을 제공한다.

본 발명은 효모에서 목적 단백질을 유전공학적 방법으로 생산할 때, 상기 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 말단에, 바람직하게는 5’-말단에 셀룰라제의 셀룰로오스 결합 도메인을 연결하여 상기 단백질의 발현 및 분비를 증진시키는 것에 관한 것이다. 이에 따라, 본 발명은 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 5’-말단에 셀룰라제의 셀룰로오스 결합 도메인을 코딩하는 유전자가 결합된 DNA 작제물이 효모에서 작용하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 재조합 발현 벡터를 포함한다. 이러한 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 이용하여 목적 단백질을 생산하게 되면, 상기 목적 단백질은 셀루롤오스 결합 도메인과 융합된 형태로 발현 및 분비될 것이다.

본 발명의 명세서에서 사용된 용어 " 셀룰라제(cellulase)"는 다당류인 셀룰로오스(cellulose)를 이당류인 셀로비오스(cellobiose)로 분해하는 효소를 말한다. 대부분의 셀룰라제는 링커에 의해서 연결된 두 개의 도메인으로 구성되어 있는데, 한 도메인은 고체상(solid) 셀룰로오스와 결합하는 역할을 하여 셀룰로오스-결합 도메인(Cellulose-Binding Domain; CBD)이라고 불리우고, 다른 도메인은 실질적으로 셀룰로오스를 분해하는 촉매 역할을 하여 촉매 도메인(catalytic domain)이라 불린다.

이러한 셀룰라제는 셀룰로오스를 분해할 수 있는 곰팡이 세포에 포함되어 있으며, 본 발명에서는 이러한 셀룰라제에서 유래된 셀룰로오스 결합 도메인을 모두 이용할 수 있다. 바람직하게는 곰팡이에서 유래된 셀룰라제를, 더욱 바람직하게는 트리고더마 속(Trichoderma sp.) 곰팡이에서 유래된 셀룰라제를 이용하는 것이다. 트리고더마 속 곰팡이에는 T. 아트로비리대(T. atroviridae), T. 아우레오비리대(T. aureoviridae), T. 시트리노비리대(T. citrinoviridae), T. 크로세움(T. croceum), T. 글라우쿰(T. glaucum), T. 하지아눔(T. harzianum), T. 인하마툼(T. inhamatum), T. 코닌지(T. koningii), T. 리그노룸(T. lignorum), T. 파르세라모숨(T. parceramosum) 등이 있다. 본 발명에서는 트리코더마 하지아눔에서 유래된 셀룰라제의 셀룰로오스 결합 도메인(도 1)을 이용하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 명세서에 사용된 용어 " 목적 단백질(또는 단백질)"은 본 발명에 따른 유전공학적 방법으로 생산하고자 하는 단백질을 말하는 것으로, 특별히 제한적이지 않다. 바람직하게는 상업적 용도로 이용되고 있어 다량으로 생산될 필요가 있는 단백질들이 포함될 것이다. 단백질들은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 혈청 단백질(예, 인자 VII, VIII 및 IX를 포함한 혈액 인자), 면역글로불린, 사이토카인(예, 인터루킨), α-, β- 및 γ-인터페론, 콜로니 자극 인자(G-CSF 및 GM-CSF 포함), 혈소판 유도된 성장 인자(PDGF), 포스포리파제-활성화 단백질(PLAP), 인슐린, 종양 괴사 인자(TNF), 성장 인자(예, TCFα 또는 TGFβ와 같은 조직 성장 인자 및 내피 성장 인자), 호르몬(예, 소낭-자극 호르몬, 갑상선-자극 호르몬, 항이뇨 호르몬, 색소성 호르몬 및 부갑상선 호르몬, 황체호르몬 분비 호르몬 및 이의 유도체), 칼시토닌(calcitonin), 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(Calcitonin Gene Related Peptide; CGPR), 엔케팔린(enkephalin), 소마토메딘, 에리스로포이에틴, 시상하부 분비 인자, 프롤락틴, 만성 고나도트로핀, 조직 플라스미노겐 활성화제, 성장호르몬 분비 펩타이드(growth hormone releasing peptide; GHPR), 흉선 체액성 인자(thymic humoral factor; THF) 등이 포함된다. 또한, 본 발명의 목적 단백질은 효소를 포함할 것이며, 예로는 탄수화물-특이적 효소, 단백질분해 효소, 산화환원 효소, 트랜스퍼라제, 하이드롤라제, 라이아제, 이소머라제 및 리가제가 포함된다. 구체적인 효소로는 이들로 한정하는 것은 아니지만 아스파라기나제, 아르기나제, 아르기닌 데아미나제, 아데노신 데아미나제, 과산화물 디스뮤타제, 엔도톡시나제, 카탈라제, 키모트립신, 리파제, 우리카제, 아데노신 디포스파타제, 티로시나제 및 빌리루빈 옥시다제를 들 수 있다. 탄수화합물-특이적 효소의 예로는 글루코즈옥시다제, 글루코다제, 갈락토시다제, 글루코세레브로시다제, 글루코우로니다제 등이 포함된다.

본 발명의 한 양태는 리파제를 목적 단백질로 포함시킨 재조합 발현 벡터에 관한 것이다. 상기 리파제는 바람직하게는 미생물에서 유래된 것이다. 미생물에서 유래된 리파제는 계면활성제, 제지 및 식품 공업, 및 유기 합성 등 여러 가지 분야에서 이용되고 있기에 특히 유익하기 때문이다.

본 발명의 명세서에 사용된 용어 “조절 서열(expression control sequence)”은 본 발명의 폴리펩타이드 발현에 필수적이거나 이로운 핵산 서열들을 말한다. 각각의 조절 서열은 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열에 천연적(native) 또는 외래적(foreign)일 수 있다. 그러한 조절 서열에는 이에 제한되는 것은 아니지만, 분비 서열, 폴리아데닐화 서열, 프로펩타이드(propeptide) 서열, 프로모터, 인핸서(enhancer) 또는 업스트림(upstream) 활성화 서열, 시그날 펩타이드 서열 및 전사 종결인자 등을 포함한다. 본 발명에서 조절 서열은 최소한 프로모터를, 바람직하게는 프로모터 및 분비 서열을 포함하는 것이다. 여타의 조절 서열들은 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 발현 양을 더욱 증가시키기 위해서 선택적으로 포함될 수 있다.

아울러, 본 발명의 명세서에 사용된 용어 "효모에서 작용하는 조절 서열"은, 본래 효모에 존재하는 조절 서열 뿐만 아니라, 효모에서 조절 서열로서의 기능을 유지 · 발휘할 수 있는 모든 조절 서열을 말하는 것이다.

본 발명의 명세서에 사용된 용어 "프로모터"는 본 발명의 폴리펩타이드의 전사를 개시하는데 필수적인 핵산 서열을 말한다. 효모에서 작용하는 프로모터의 예에는 효모 알파-메이팅 시스템(α-mating system)의 프로모터, 효모 트리오스 포스파타아제 이소머라제(triose phosphatase isomerase;TPI)의 프로모터, 효모의 해당과정에 관여하는 유전자들(glycolytic genes) 또는 알콜 탈수효소(alcohol dehydrogenase; ADH) 유전자의 프로모터 및 효모의 갈락토오스 대사에 관여하는 효소들(예를 들면, GAL1(galactose kinase) 및 GAL10(uridine diphosphoglucose 4-epimerase))의 프로모터, GADPH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), MOX(methano oxidase), AOX(alcohol oxidase) 프로모터 등이 포함된다.

본 발명의 명세서에 사용된 용어 "분비 서열"(모티프 서열, 리더 서열 또는 시그날 펩타이드)은 발현된 단백질이 세포막 밖으로 수송되도록 유도하는 아미노산 서열을 말한다. 일반적으로 세포막 밖으로 수송되는 표면 단백질 또는 분비 단백 질은 세포막에서 모티브 펩티다제(signal peptidase)에 의해 잘려지게 되는 N-말단 서열을 가지고 있다. 본 발명에서는 분비 서열로, 이에 제한되는 것은 아니지만, 알파-인자 분비 서열(α-factor signal sequence), 킬러 톡신 리더 분비 서열(killer toxin leader signal sequence), 인버타제 분비 서열(invertase signal sequence), 알파-아밀라아제 분비 서열(α-amylase signal sequence) 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 명세서에 사용된 용어 "벡터"는 외래 유전자를 숙주세포 내로 안정적으로 운반할 수 있는 운반체로서의 DNA 분자를 말한다. 유용한 벡터가 되기 위해서는 복제될 수 있어야 하며, 숙주세포 내로 유입될 수 있어야 하고, 자신의 존재를 검출할 수 있는 수단을 구비하여야 한다.

본 발명의 명세서에 사용된 용어 “재조합 발현 벡터”는 일반적으로 외래 유전자가 숙주세포에서 발현될 수 있도록 벡터에 작동가능하게 연결되어 형성된 환상의 DNA 분자를 말한다. 재조합 발현 벡터는 수 개의 카피 및 그의 삽입된 이종의 DNA가 생성될 수 있다. 당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염된 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절 서열 및 해당 유전자를 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵 세포인 경우에는 발현 벡터는 진핵 발현 숙주세포 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.

본 발명의 명세서에 사용된 용어 “작동가능하게 연결된(operably linked)”은 핵산 서열이 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치된 상태를 의미한다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 서열이 성숙한 단백질의 분비에 참여함으로써 기능을 발휘했다면 그 단백질에 작동가능하게 연결된 것이다. 프로모터가 코딩 서열의 전사를 조절했다면 그 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 리보좀 결합 자리가 코딩 서열의 해독이 가능한 위치에 놓여져 있다면 그 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, “작동가능하게 연결된”은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다.

전술한 본 발명의 재조합 발현 벡터는 기본적인 재조합 DNA 기술을 사용해서 제조될 수 있다. 이에 따르면, 상기 재조합 발현 벡터를 구성하는 DNA 단편들, 구체적으로, 셀룰로오스 결합 도메인, 목적 단백질, 조절 서열 및 발현 벡터가 연결되어야 하며, 이는 적합한 제한 효소 부위에서 라이게이션(ligation)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고 뉴클레오타이드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다. 목적한 재조합 발현 벡터를 형성하는데 있어서, 상기 DNA 단편들은 특정한 순서(order)와 방향(orientation)을 고려하여 연결하는 것이 바람직하다. 구체적으로, 재조합 발현 벡터를 제조하는 방법은 다음과 같다.

DNA는 적절한 버퍼(buffer)내에서 특정한 제한 효소를 사용해서 절단될 수 있다. 일반적으로 약 0.2-1μg의 플라스미드 혹은 DNA단편은 약 20μl의 버퍼용액에 해당 제한 효소 약 1-2 단위(unit)와 함께 사용된다. 적절한 버퍼, DNA 농도, 배양 시간과 온도는 제한 효소의 제조업체에 의해서 특정될 수 있다. 일반적으로, 37℃에서 약 1-2 시간 정도 배양하는 것이 적당하지만 일부 효소들은 더 높은 온도를 필요로 한다. 배양 후에, 효소와 다른 불순물들은 페놀과 클로로포름의 혼합물로 상기 소화용액을 추출함에 의해서 제거되어지고, DNA는 에탄올로 침전시켜 수용액 층으로부터 회수할 수 있다. 상업적으로 이용 가능한 정제 키트를 사용하는 것이 보다 바람직할 것이다. 이때 DNA 단편들이 기능성 벡터를 형성할 수 있도록 연결되기 위해서는 DNA 단편의 말단이 서로 상용성이 있어야만 한다.

절단된 DNA 단편들은 전기영동(electrophoresis)을 이용해서 크기별로 분류되고 선택된다. DNA는 아가로스나 폴리아크릴아미드 매트릭스(matrix)를 통해서 전기영동될 수 있다. 매트릭스의 선택은 분리되어질 DNA 단편의 크기에 따라 결정된다. 전기영동 후에 DNA는 전기용출(electroelution)에 의해서 매트릭스로부터 추출되거나, 저용융 아가로스가 사용되어졌다면 아가로스를 용융시키고 그로부터 DNA를 추출한다.

연결되어야할 DNA 단편들은 동일한 몰 양으로 용액에 첨가된다. 이러한 용액은 통상적으로 ATP, 연결 효소(ligase)버퍼, DNA 0.5 μg당 약 10 단위의 T4연결효소와 같은 연결효소를 포함하고 있다. DNA 단편이 벡터에 연결되려면, 벡터는 적합한 제한효소에 의해서 절단되어 선형화된 다음 알칼리성 인산 가수분해 효소 또는 소 내장의 가수분해 효소로 처리하면 된다. 이러한 인산 가수분해 효소 처리는 연결 단계 동안에 벡터의 자가 연결(self-ligation)을 방지한다. 이와 같은 방법을 통해서 제작된 재조합 발현 벡터는 효모 숙주 세포를 형질전환시키는데 사용된다.

상술한 재조합 발현 벡터에 의해 형질전환된 효모 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 효모는 (1) Simon, M.I. et al. editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, vol.194, p.182-7, Academic Press, Inc. New York; (2) Ito, et al. Journal of Bacteriology, 1983, vol.153, p.163; (3) Hinnen et al. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 1978, vol.75, p,1920 및 (4) Clontech Laboratories, Inc, Palo Alto, Calif., USA(Yeastmaker^TM Yeast Transformation System Kit) 등에 공지된 방법에 따라 용이하게 형질전환할 수 있다. 본 발명에서 이용 가능한 효모 숙주세포의 예에는 사카로미세스 속(Saccharomyces sp. 예를 들면, S. cerevisiae), 스키조사카로미세스 속(Schizosaccharomyces sp.), 클리베로미세스 속(Klyveromyces sp.), 피키아 속(Pichia sp. 예를 들면, P. pastoris, P. methanolica), 한세눌라 속(Hansenula sp. 예를 들면, H. polymorpha) 등이 포함된다.

본 발명은 이렇게 형질전환된 효모 숙주 세포를 배양하고 이의 배양물로부터 셀룰로오스 결합 도메인과 융합된 목적 단백질을 분리 정제하는 단계를 포함하는 상기 목적 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에서, 효모 숙주세포는 공지된 기술을 이용해서 폴리펩타이드의 생산에 적합한 영양 배지에서 배양될 수 있다. 예를 들어서, 세포들은 적당한 배지와 폴리펩타이드가 발현 및/또는 분리되는 것을 허용하는 조건 하에, 실시된 실험실 또는 산업용 발효기에서 소규모 혹은 대규모 발효, 셰이크 플라스크 배양에 의해서 배양될 수 있다. 배양은 공지된 기술을 사용해서, 탄소, 질소 공급원 및 무기염을 포함하는 적절한 영양배지에서 일어난다. 적당한 배지는 상업적인 공급자로부터 입수 가능하고, 예를 들면, American Type Culture Collection의 카탈로그 등에 기재된 성분 및 이들의 비율에 따라 만들 수도 있다. 본 발명의 형질전환된 효모 숙주세포는 회분식 또는 유가식 배양으로 배양될 수 있다.

"회분식 배양"은 모든 영양소가 발효 초기에 첨가되는 배양 방식 중의 하나를 말한다. 회분식 발효에서는 배지 내의 필수 영양소 중 하나가 고갈될 때까지, 또는 발효 조건이 바람직하지 않게 될 때까지(예, pH가 미생물 성장을 저해하는 값으로 감소되는 경우) 유기체가 성장한다.

"유가식 배양"은 하나 또는 다수의 영양소를 발효 개시 직후 또는 배양물이 어떤 단계에 도달한 후에, 또는 공급된 영양소가 배양 유체로부터 고갈되는 경우, 배양물에 연속적으로 공급하는 방식의 배양을 의미한다. 유가식 발효에서는 예컨대 pH 조절을 이용하여 바람직한 성장 조건을 유지하도록 일반적으로 기준을 정하고, 필수 영양소를 배양물에 공급하여 1종 이상의 필수 영양소의 고갈을 방지한다. 영양소 공급 속도에 의해 결정되는 성장 속도로 미생물은 계속 증식할 것이다. 일반적으로 단일 영양소, 탄소원이 성장의 제한인자가 된다. 다른 종류의 영양소 제 한을 이용할 수도 있다. 다른 예로는, 질소원에 의한 제한, 산소에 의한 제한, 비타민 또는 아미노산과 같은 특정 영양소에 의한 제한(미생물이 그 화합물에 대한 영양요구성인 경우), 황에 의한 제한 및 인에 의한 제한 등이 있다.

이러한 배양물로부터 본 발명의 폴리펩타이드는 당업계에 공지된 방법에 의해서 분리될 수 있다. 예를 들어서, 폴리펩타이드는 이로써 제한되는 것은 아니지만, 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발, 또는 침전을 포함하는 전통적인 방법에 의해서 영양 배지로부터 분리될 수 있다. 더 나아가 폴리펩타이드는 크로마토그래피(예를 들면, 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기별 배제), 전기영동, 분별용해도(예를 들면, 암모늄 설페이트 침전), SDS-PAGE 혹은 추출을 포함하여 일반에 공지된 다양한 방법을 통해서 정제될 수 있다. 특히, 본 발명의 폴리펩타이드는 셀룰라제에서 분리된 셀룰로오스 결합 도메인을 포함하고 있으므로 셀룰로오스 담체를 컬럼으로 이용하는 크로마토그래피를 통하여 용이하게 분리 정제될 수 있을 것이다.

앞서 주지된 바와 같이, 본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 목적 단백질은 셀룰로오스 결합 도메인과 융합된 형태일 것이다. 본 발명에서는 이렇게 생산된 융합된 형태의 목적 단백질을 제공하며, 이 자체를 최종 생산물로서 이용할 수 있을 것이다. 또한, 이렇게 생산된 융합된 형태의 목적 단백질을 적절한 효소 등을 이용하여 셀룰로오스 결합 도메인을 절단한 다음 추가적인 분리 정제 과정을 거쳐서 비융합된 형태의 목적 단백질을 생산하여 이용할 수 있을 것이다.

본 발명은 추가로 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환된 효모를 배 양하고 이의 배양물을 셀룰로오스 담체와 혼합하는 단계를 포함하는, 셀룰로오스 결합 도메인과 융합된 단백질이 상기 셀룰로오스 담체에 부착된 고정화 단백질의 제조방법을 제공한다. 본 발명에서, 바람직하게는 상기 단백질이 효소인, 고정화 효소의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 이러한 제조방법으로 제조된, 셀룰로오스 담체에 부착된 셀룰로오스 결합 도메인과 융합된 단백질의 고정화 단백질을 제공한다. 본 발명에서, 바람직하게는 상기 단백질이 효소인, 고정화 효소를 제공한다.

본 발명의 명세서에서 "고정화 효소"는 한정된 공간 속에 효소의 이동성을 제한하는 것을 말한다. 효소를 고정화시키면, 효소 재이용이나 효소의 회수 및 정제공정의 생략과 같은 장점이 있으며, 효소 활성을 위하여 더 좋은 조건이 구비될 수도 있다. 특히, 효소의 값은 비싸므로, 효소의 재사용은 많은 공정에서 핵심적인 요소이다. 세포내 효소의 일부는 막과 결합되어 있으므로, 고정화된 효소는 그러한 세포내 효소의 작용을 모방하고 이해하기 위한 모델이 된다. 또 다른 장점은 생산물의 순도가 향상되며, 유출물 처리도 문제도 최소화 된다.

이러한 고정화 효소를 제조함에 있어서, 본 발명에 따라 제조된 단백질, 구체적으로, 효소는 셀룰로오스 결합 도메인과 융합된 형태이므로 담체로서 셀룰로오스 담체를 선택한다면, 추가적인 부착과정 없이 용이하게 고정화 효소를 제조할 수 있을 것이다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1>

셀룰로오스 결합 도메인을 코딩하는 DNA 서열의 제조

셀룰로오스 결합 도메인은 한국생명공학원 유전자은행으로부터 분양받은 트리고더마 하지아눔(Trichoderma hazianum KCTC 16977)의 게놈 DNA를 분리한 다음, 이렇게 분리된 게놈 DNA를 주형으로, 공지된 셀룰로우스 결합 도메인을 코딩하는 DNA 서열의 말단에 상보적인 염기 서열을 갖는 올리고 뉴클레오타이드(서열번호 1 및 서열번호 2; 모두 제한효소 Nde I 인식부위가 포함하고 있음)를 프라이머로 이용하는 PCR을 수행하여 셀룰로오스 결합 도메인을 코딩하는 유전자를 증폭하였다.

이 때, PCR은 최종부피가 50μl가 되도록 20pmol 프라이머, 2.5mM의 dNTP 혼합물, 100ng의 플라스미드 DNA, 5μl의 10 x PCR 완충용액(Solgent Co.), 2.5 unit의 Taq DNA 폴리머라제를 혼합한 다음 상기 혼합액을 94℃에서 10분간 변성, 94℃에서 1분간 변성, 55℃에서 45초간 재결합, 72℃에서 45초간 신장 과정을 34회 반복하였다. 72℃에서 10분간 확장한 다음 반응을 종료하였다. 증폭된 PCR 산물은 0.8% 아가로스 젤[agarose gel (BMA, USA)]에 전기 영동한 후, 큐어엑스 투 젤 추출 키트[Qiaex Ⅱ gel extraction kit (Qiagen, USA)]를 이용하여 분리하였다.

<실시예2>

pYEGA-AM-Lip의 제조

(1) pYEGA-AM의 제조

효모에서 목적 단백질의 효율적인 분비를 위하여 분비 서열로, 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae)의 아밀라아제 분비 서열을 선택하였다. 공지된 아밀라아제 분비 서열을 코딩하는 DNA(서열번호 3 및 서열번호 4: 모두 제한효소 EcoR I 및 Nde I 절단부위를 포함)를 (주)제노텍에서 합성하였다.

효모균에서 작용하는 발현 벡터인 pYEAG(Ahn et al. J. Microbiol. biotech. 2003. 13(3). 451-456)을 제한효소 EcoR I 및 Nde I로 처리한 다음 큐어엑스 투 젤 추출 키트를 이용하여 분리하였다. 이어서, 앞서 합성된 아밀라아제 분비 서열을 코딩하는 DNA와 발현 벡터 pYEAG를 리가제(ligase)로 결합시켰다. 이때 생성된 재조합 발현 벡터는 pYEAG-AM 이라고 명명하였다.

(2) 리파제의 제조

목적 단백질로 바실러쓰 스테레어 썸머필러스(Bacillus stearothermophilus L1)의 리파제를 선택하였다. 상기 리파제는 바실러쓰 스테레어 썸머필러스에서 게놈 DNA를 분리한 후, 이렇게 분리된 게놈 DNA를 주형으로, 공지된 리파제를 코딩하는 유전자의 말단에 상보적인 서열을 갖는 올리고 뉴클레오타이드(서열번호 4 및 서열번호 5 : 각각 제한효소 Nde I 및 HindII 절단부위를 포함)를 프라이머로 하는 PCR을 수행하여 리파제를 코딩하는 유전자를 증폭하였다. 이 때, PCR은 실시예 1에 기재된 바와 동일한 조건에서 수행하였다.

(3) pYEG-AM-Lip의 제조

상기 PCR 산물은 0.8% 아가로스 젤[agarose gel (BMA, USA)]에 전기 영동한 후, 큐어엑스 투 젤 추출 키트[Qiaex Ⅱ gel extraction kit (Qiagen, USA)]를 이용하여 분리하였다. 이렇게 분리된 PCR 산물과 실시예 2의 (1)에서 제조된 발현 벡터 pYEAG-AM(stratagene 사) 각각을 제한효소 NdeⅠ 및 HindIII로 처리한 후 큐어엑스 투 젤 추출 키트를 이용하여 분리하였다. 이어서, 상기 제한효소로 처리된 PCR 산물과 발현 벡터 pYEAG-AM을 리가제로 결합시켰다. 이때 생성된 재조합 발현 벡터는 pYEAG-AM-Lip라고 명명하였다.

<실시예3>

pYEG-AM-CBDLip의 제조

실시예 1에서 제조된 PCR 산물과 실시예 2의 (3)에서 제조된 발현 벡터 pYEAG-AM-Lip 각각을 제한효소 NdeⅠ로 처리하였다. 이어서, 상기 제한효소로 처리된 PCR 산물과 발현 벡터 pYEAG-AM-Lip를 리가제로 연결시켰다. 이때 생성된 재조합 발현 벡터는 pYEAG-AM-CBDLip라고 명명하였다.

<실시예 4>

형질전환체의 제조

전술한 실시예 2 및 3에서 제조된 pYEG-AM-Lip 및 pYEG-AM-CBDLip를 각각 사카로스마이세스 세레비재(Saccharomyces cerevisiae 2805)에 도입시켰다. 아울러, 상기의 발현벡터를 사카로스마이세스 세레비재 효모에 형질전환시켰고, 이렇게 생산된 효모는 Saccharomyces cerevisiae /pYEGA-AM-CBDLip로 명명되었고, KCTC에 2003년 7월 31일자로 기탁번호 KCTC 10504BP로 기탁되었다.

<실시예5>

pYEG-AM-Lip 및 pYEG-AM-CBDLip의 리파제 발현양 비교

상기 형질전환체들을 갈락토오스 3%, 효모 추출액 1%, 펩톤 2%를 함유한 배지를 이용하여 회분식 배양을 실시하였으며, 이렇게 형성된 배양물에서 리파제의 발현양을 비교하였다. 이 결과를 표 1에 나타내었다.

표 1에 나타난 바와 같이, 셀룰로오스 결합 도메인이 연결된 융합 단백질 형태의 리파제 발현이 단독으로 발현하는 리파제 보다 발현양이 약 7배 이상 증가하였고, 분비율도 더 높았다.

pYEGA-AM-Lip과 pYEGA-AM-CBDLip으로 각각 형질전환된 효모의 회분식 배양시 리파제 발현양 비교

발현벡터	세포농도, g/l	배양액내 리파제활성 (U/ml)	세포내 리파제활성 (U/ml)	분비효율¹
pYEGA-AM-Lip	15.3	14	11	56
pYEGA-AM-CBD -Lip	15.5	100	21	83

¹발현된 전체 리파제 활성에 대한 배지내 리파제 활성비

또한, 발현된 리파제를 웨스턴 블럿(Western blot)방법으로 확인하였으며, 이의 결과는 도 3에 나타내었다. 도 3에 의하면, 셀룰로오스 결합 도메인과 융합된 리파제는, 그렇지 않은 리파제보다 큰 분자량(61kDa)을 보였으며, 많은 양이 생산되었음을 알 수 있었다.

<실시예 6>

pYEGA-AM-CBDLip으로 형질전환된 효모의 유가식 배양

리파제를 대량으로 생산하기 위하여, 실시예 5에서 제조된 pYEGA-AM-CBDLip으로 형질전환된 효모(수탁번호 KCTC 10504BP)를 유가식 배양하였다. 표 2는 상기 유가식 배양시 사용된 배지 조성을 나타낸 것이다.

유가식 배양에 사용된 생산 배지 조성

구분	초기배지¹	공급배지¹
포도당	20	200
갈락토오스	-	200
MgSO₄	0.5	5.7
황산암모늄	5	20
K₂HPO₄	3	15
CaCl₂	1	1
효모추출액	5	25
카제인 펩톤	5	20
소량금속, 10X²	1ml	2ml

¹1L당 조성

²10x 소량 금속 1L당 (NH₄)₆MoO₂₃ 3.0g, H₃BO₃ 400g, CuSO₄ 10g, MnCl₂ 80g, ZnSO₄ 10g

먼저, pH 5.5, 온도 30^oC 초기배지에서 형질전환된 효모를 배양하고, 초기 포도당 20g/ℓ이 모두 소비되었을 때, 첨가배지를 공급하기 시작하였다. 공급 속도는 배양액내에 포도당의 농도가 1g/ℓ 이하로 유지되고, 비균체 속도가 0.03~0.05/h가 유지되도록 균체 성장에 따라, 6ml/h에서 70 ml/h까지 단계적으로 증가시켰다.

이 때, 유가식 배양 시간별로 균체의 건조 중량 리파제 활성 및 포도당의 농도를 측정하였다. 각각의 측정방법은 다음과 같이 수행되었다.

(1) 세포 건조량 측정 : 배양액을 원심분리하여 세포를 얻은 후 등장액으로 세척하고, 80℃에서 건조하여 함량을 도달하였을 때의 무게를 측정하였다.

(2) 리파제의 정량법 : 리파제의 역가는 pH-stat 방법을 사용하여 측정하였다.

(3) 글루코오스의 정량법 : 글루코오스의 정량은 글루코오스 분석기를 이용 하였다.

측정 결과는 도 4에 도시하였으며, 이에 따르면, 균체는 배양 후 72시간에 95 g/ℓ의 건조 균체량을 도달하였으며, 리파제는 발현 유도물질인 갈락토오스를 포함한 첨가배지의 공급 후 발현 및 분비되어, 균체의 성장과 함께 증가하다가 배양 말기에 약 2,200 U/ml (단백질 양으로 약 1.2g/ℓ)까지 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 7>

리파제의 셀룰로오스 담체와의 결합에 의한 고정화 효소 제조

셀룰로오스 결합 도메인은 셀룰로오스에 특이하게 결합한다고 문헌에 보고된 바 있다(Linder et al. Journal of Biotechnology, vol.57, p.15). 이에, 본 발명자들은 상기에서 제조된 셀룰로오스 결합 도메인과 융합된 리파제(CBDLip)를 셀룰로오스 담체에 결합시켜 고정화 효소를 제조하고자 하였다.

구체적으로, 상기에서 기술한 유가식 배양액을 원심분리를 통하여, 균체와 리파제(CBDLip)가 포함된 효소액을 분리하였고, 효소 1단위(unit) 당 셀룰로오스인 아비셀(Avicel)을 0.4mg정도 넣고 1시간 동안 혼합시킨 후 원심분리를 통하여 상등액과 리파제(CBDLip)가 결합된 아비셀 각각을 분리하였다. 이러한 과정으로 셀룰로오스 결합 도메인과 융합된 리파제(CBDLip)가 효과적으로 셀룰로오스 담체와 결합할 수 있다는 것을 SDS-PAGE 실험을 통하여 확인하였고, 이의 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 의하면, 효소액에 존재했던 리파제(CBDLip)가 아비셀과 혼합한 후 특이하게 제거됨을 알 수 있는데, 이는 리파제(CBDLip)가 셀룰로오스 담체와 결합하여 원심분리를 통하여 담체와 함께 침전되었기 때문이다.

셀룰로오스 담체에 고정화된 리파제의 활성을 확인하고자 온도에 따른 활성변화, pH 변화에 따른 활성변화 및 온도에 따른 열안정성 등을 측정하여 이의 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에서, 셀룰로오스 담체에 고정화된 리파제는 그렇지 않은 리파제와 같은 효소특성을 보였다. 따라서, 셀룰로오스 결합 도메인과 융합된 리파제(CBDLip)는 셀룰로오스 담체에 효과적으로 고정화됨을 확인할 수 있다.

<비교예 1>

다른 분비 서열(인버타제 분비 서열)의 사용

전술한 실시예에서 분비 서열로 사용된 아밀라아제 분비 서열 대신에 서열번호 6에 명시된 인버타제 시그날 펩타이드(invertase signal peptide)를 사용하여 실시예 2 내지 5에 기재된 바와 동일한 절차에 따라 재조합 발현 벡터를 제조하고, 이 벡터로 형질전환된 효모를 제조한 다음 이를 배양하고, 이의 배양물로부터 리파제를 분리 정제하여 발현 양을 분석한 결과, 셀룰로오스 결합 도메인이 이용된 경우에 리파제의 분비가 5배 정도 향상되는 것을 확인할 수 있었다.

<비교예 2>

다른 프로모터(GAPDH 프로모터)의 이용

전술한 실시예에서 프로모터로 사용된 GAL10 프로모터 대신에 GAPDH 프로모터를 사용하여 실시예 2 내지 5에 기재된 바와 동일한 절차에 따라 재조합 발현 벡터를 제조하고, 이 벡터로 형질전환된 효모를 제조한 다음 이를 배양하고, 이의 배양물로부터 리파제를 분리 정제하여 발현 양을 분석한 결과, 셀룰로오스 결합 도메인이 이용된 경우에 리파제의 분비가 약 3배 정도 향상되었다.

<비교예 3>

다른 목적 단백질(캔디다 속 리파제 또는 브레비바실러스 속 사이클로덱스트린 글리고실트랜스퍼라제)의 이용

전술한 실시예에서 목적 단백질로 사용된 바실러쓰 스테레어 썸머필러스에서 유래된 리파제 대신에 각각 캔디다 안트아르티카(Candida antartica) 유래의 리파제 B(lipase B)와 브레비바실러스 브레비노스(Brevibacillus brevinos)유래의 사이크로덱스트린 글리고실트랜스퍼레이즈(cyclodextrin glycosyltransferase)를 실시예 2 내지 5에 기재된 바와 동일한 절차에 따라 재조합 발현 벡터를 제조하고, 이 벡터로 형질전환된 효모를 제조한 다음 이를 배양하고, 이의 배양물로부터 캔디다 안트아르티카 리파제 또는 브레비바실러스 브레비노스의 사이클로덱스트린 글리고실트랜스퍼라제 분리 정제하여 발현 양을 분석한 결과, 셀룰로오스 결합 도메인이 이용한 경우에 효모에서 각각의 분비를 3배 및 5배씩 증가하였다.

본 발명에 따른 재조합 발현 벡터 및 효모균을 이용하여 목적단백질의 효모균에서의 분비를 향상시켜서, 목적단백질을 대량 생산할 수 있다. 아울러, 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터 및 효모를 이용하여 셀룰로오스 담체에 고정된 고정화 효소를 제조할 수 있다.

<110> Acebiotech Co. Ltd Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Method for Producing Recombinant Proteins in Yeast using cellulose-binding domain <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ggcatatgca gcaaactgtt tgggggc 27 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ggcatatgag agctagttgg cggagt 26 <210> 3 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide <400> 3 aattcatgat ggtcgcgtgg tggtctctat ttctgtacgg ccttcaggtc gcggcacctg 60 ctttggctca tatgaaaggt aagcttg 87 <210> 4 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide <400> 4 tcgacaagct tacctttcat atgagccaaa gcaggtgccg cgacctgaag gccgtacaga 60 aatagagacc accacgcgac catcatg 87 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gaacatatgg catctccacg cgccaatgat 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gcaaagcttt taaggccgca aactcgccag 30 <210> 7 <211> 114 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide <400> 7 atgcttttgc aagctttcct tttccttttg gctggttttg cagccaaaat atctgcctac 60 gaaaacgttc gaaaggaaaa ggaaaaccga ccaaaacgtc ggttttatag acgg 114 <210> 8 <211> 210 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cellulose biding domain <400> 8 cagcaaactg tttgggggca atgcggaggt caaggatgga gcggcccgac tagttgcgtt 60 gctggatctg cttgttctac tctcaacccc tactacgctc aatgcattcc tggagccact 120 accatgtcta ccacaaccaa gccgacctcc gtttcagcat caacgaccag ggcgagtgca 180 acatcgtccg ctactccgcc aactagctct 210 <210> 9 <211> 70 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cellulose binding domain <400> 9 Gln Gln Thr Val Trp Gly Gln Cys Gly Gly Gln Gly Trp Ser Gly Pro 1 5 10 15 Thr Ser Cys Val Ala Gly Ser Ala Cys Ser Thr Leu Asn Pro Tyr Tyr 20 25 30 Ala Gln Cys Ile Pro Gly Ala Thr Thr Met Ser Thr Thr Thr Lys Pro 35 40 45 Thr Ser Val Ser Ala Ser Thr Thr Arg Ala Ser Ala Thr Ser Ser Ala 50 55 60 Thr Pro Pro Thr Ser Ser 65 70

Claims

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목적 단백질을 코딩하는 유전자를 효모에서 작용하는 조절 서열에 작동가능하게 연결시켜 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계; (2) 상기 재조합 발현 벡터로 효모 숙주세포를 형질전환시키는 단계; 및 (3) 상기 형질전환된 효모 숙주세포를 배양하고 이의 배양물로부터 목적 단백질을 분리 정제하는 단계를 포함한 목적 단백질의 제조방법에 있어서,

상기 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 5'-말단에 서열번호 8에 기재된 염기서열을 도입함으로써 상기 목적 단백질의 발현 및 분비율을 증진시키는 방법.