KR100600457B1

KR100600457B1 - 엑센딘 유사체, 이의 제조방법 및 이를 함유한 약제

Info

Publication number: KR100600457B1
Application number: KR1020057012166A
Authority: KR
Inventors: 엘케 호프만; 뤼디거 괴케; 부르크하르트-요하네스 괴케
Original assignee: 로셰 디아그노스틱스 게엠베하
Priority date: 1996-06-05
Filing date: 1997-06-05
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2017-06-05
Also published as: CN1183158C; US6767887B1; DK0915910T3; PT915910E; KR20050085920A; JP3878653B2; CN1227567A; TR199802789T2; AU3173297A; EP0915910A1; JP2006176532A; ES2256888T3; BR9710452A; EP0915910B1; ATE316100T1; HK1022701A1; AU723694B2; WO1997046584A1; JP2000516912A; CA2257119A1

Abstract

본 발명은 당뇨병의 치료에 사용할 수 있는 새로운 엑센딘 유사체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 물질의 제조방법 및 이를 함유한 약제에 관한 것이다. 엑센딘 유사체는 서열번호 1 또는 서열번호 2 로부터 유도된다:

서열번호 1

서열번호 2

엑센딘 유사체, 당뇨병 치료

Description

엑센딘 유사체, 이의 제조방법 및 이를 함유한 약제 {EXENDIN ANALOGUES, PROCESSES FOR THEIR PREPARATION AND MEDICAMENTS CONTAINING THEM}

본 발명은 당뇨병의 치료에 사용될 수 있는 신규의 엑센딘 유사체, 이의 제조방법 및 이를 함유한 약제에 관한 것이다.

발명의 배경

소장과 외분비 췌장사이의 기능적 연관이 육십년대 입증된후 혈장에서 인슐린을 정확하게 측정하는 것이 가능하게 되었다. 경구 글루코오스 투여후 인슐린 반응은 비록 동일한 글루코오스의 혈장치에 도달하더라도 정맥 글루코오스 투여후보다 훨씬 강력하다. 이 "인크레틴 효과" 는 장-섬축(entero-insular axis) 의 기능적 조합에 의해 설명된다. 식후 소장으로부터 방출되고, 뚜렷한 증가수준으로 혈장에서 순환되며, 글루코오스-유도 인슐린 방출을 증폭시키는 장호르몬이 이러한 효과의 원인이 된다. 전형적인 인크레틴 호르몬 위 억제 폴리펩티드 I (GIP) 외에, 현재 글루카곤-유사 펩티드 1(GLP-1) 이 현재 주목을 받고 있다. 상대적으로 짧은 시간안에 GLP-1 은 II 형 당뇨병의 치료의 잠재적 대안에 대한 생리학적으로 가장 주목받는 인크레틴 호르몬 후보가 되었다. 본 발명 은 자연발생 GLP-1 분자의 효과를 모방하는 새로운 물질을 기술한다. 이 새로운 물질은 효율을 유지하면서 증가된 안정성을 특징으로 한다.

항-당뇨병원성작용

GLP-1 의 주입 및 피하주사는 II 형 당뇨병 환자에서 인슐린 분비의 상당한 증가 및 글루카곤 방출의 억제를 유발한다 (Gutniak,M.(1992); Kreymann,B.(1987);Nathan, D.M. (1992); Nauck,M.A. (1993 a & b)). 양쪽 모두 치료에 관한 것이며 GLP-1 의 혈당 강하 효과에 관여된다: 인슐린은 이의 목표 조직에 의한 글루코오스 흡수를 촉진하고 당신생을 억제한다. 또한 GLP-1 유사체는 말초에서 글루코오스 흡수를 증가시킬 것으로 기대된다. 글루카곤 분비의 억제는 글루카곤 생산 A 세포가 GLP-1 수용체를 발현시키지 않기 때문에 간접적인 GLP-1 효과로 간주되어야 한다 (Komatsu,R.(1989)). 반대로, 증가된 인슐린 및 소마토스타틴 방출은 결정적인 인자로 보인다. 양 호르몬은 글루카곤 방출의 억제제로서 공지되어 있다.

두 개의 분자 메카니즘이 확실히 II형 당뇨병에서 GLP-1 유도 인슐린 증가에 기여한다. 글루코오스 유도 인슐린 방출을 직접적으로 증폭시키는 것외에, GLP-1 은 주자극 "글루코오스" 및 또한 가능하게는 추가의 자극에 대한 B 세포의 소집단을 감작시키어 (Fehmann, H.C.(1991)), 전체적으로 좀더 많은 B 세포가 인슐린을 분비하도록 한다. 이러한 프라이밍(priming)효과는 GLP-1 가 이의 상대적으로 짧은 혈장 반감기에도 불구하고 인슐린의 연장된 방출을 가져오는 사실에 대한 가장 적당한 설명이다.

이러한 효과는 증가된 글루코오스치 (> 108mg/dl) 에 좌우된다 (Goeke, R.(1993a)). 이는 GLP-1 을 글루코오스 혈장치와 독립적으로 인슐린 분비에 영향을 미치는 술포닐우레아와 근본적으로 구별지운다. 만일 글루코오스치가 108mg/dl 미만으로 감소하면, 인슐린 분비는 GLP-1 의 정맥주입에도 불구하고 그친다. 따라서 저혈당증은 GLP-1 가 치료학적으로 사용되는 경우 거의 기대되지 않는다. 사실 또한 이러한 것은 기존의 임상 연구에는 기재되어 있지 않다. 그러나, GLP-1 의 약력학 특징은 문제가 된다. 작용의 기간은 이의 매우 짧은 반감기로 인해 제한된다.

치료적관점에서 안정하고 효과가 강한 GLP-1 펩티드 유사체의 합성이 어떠한 경우에도 바람직하다. 현재 펩티드 유사체는 당뇨병의 치료 작용의 기간의 증가에 따른 분해에 대해 안정적인 향상된 치료제를 개발하기 위하여 도마뱀의 독액으로부터 원래 분리된 분자 엑센딘을 기재로 합성되었다. 이 펩티드는 GLP-1 와 동일한 약리학적 효과를 갖으나, 놀랍게도 상당히 더 긴 반감기를 갖는다.

본 발명의 주제로서 기재된 새로운 펩티드 서열은 인슐린 합성 및 인슐린효과, 특히 목표 조직, 근육 및 지방조직으로 글루코오스의 흡수 및 위장의 공복에 대한 작용을 갖는다.

본 발명의 주제

본 발명은 헬로데르마 호리둠 (Heloderma horridum) 또는 헬로데르마 서스펙툼 (Heloderma suspectum) 의 분비물로부터 단리한 펩티드, 엑센딘-3 및 엑센딘-4 의 서열에 기초한다 (Eng.J.et al. (1990, 1992)). 아미노산 서열 및 췌장에 대한 두 펩티드의 효과는 여러 저자에 의해 이미 공표되어 있다 (Eng.J. et al. (1990); Raufman, J.P. (1992); Goeke, R. (1993b); Thorens, B.(1993)). 본 발명의 주제는 엑센딘-3-(1-30) 또는 엑센딘-4-(1-30) 의 아미노산 서열을 함유하는 새로운 결절된 엑센딘 단편이며, 상기 서열의 C-말단은 3 개의 아미노산, 바람직하게는 많아야 1 개의 아미노산으로 단축될 수 있으며, N-말단은 2 개 이하, 바람직하게는 많아야 1 개의 아미노산으로 단축될 수 있다. 놀랍게도, 이러한 엑센딘 단편은 아미노산 서열이 단축되더라도 생물학적으로 활성을 갖는다. 단축된 아미노산 서열이 상대적으로 긴 서열보다 생산하는데 훨씬 경제적이다. 따라서, 하기 서열을 갖는 펩티드 단편이 특히 바람직하다; 특히 엑센딘-3-(1-30) (서열번호 1) 에 기초한 펩티드 단편:

엑센딘-3 에 기초한 서열번호 1

엑센딘-4 에 기초한 서열번호 2

여기에서, 위치 1, 2, 28, 29 또는 30 의 아미노산은 원하는 사슬 길이에 따라 서열의 일부로 포함될 수 있다. 펩티드는 N-말단에서 C-말단쪽으로 번호를 붙인다. X₁ 은 글리신을 제외한 단백질성(proteogenic) 또는 비단백질성 아미노산을 나타낸다.

엑센딘 및 1-27 의 사슬길이를 갖는 엑센딘 유사체가 바람직하고, 1-30 사슬길이의 유사체가 특히 바람직하다.

C-말단에서의 아미노산의 카르복실기 COR₃ 은 유리 형태 (R₃=OH) 또는 생리학적으로 허용되는 알칼리 또는 알칼리토금속염, 예컨대, 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염 형태로 존재할 수 있다. 카르복실기는 또한 일차, 이차 또는 삼차 알코올, 예컨대, 메탄올, 분지 또는 비분지된 C₁-C₆-알킬 알코올, 특히 에틸 알코올 또는 tert-부탄올로 에스테르화될 수 있다. 그러나 카르복실기는 또한 일차 또는 이차 아민, 예컨대 암모니아, 분지된 또는 비분지된 C₁-C₆ 알킬아민 또는 C₁-C₆ 디-알킬아민, 특히 메틸아민 또는 디메틸아민으로 아미드화될 수 있다.

N-말단에서 아미노산 NR₁R₂ 의 아미노기는 유리형태 (R₁, R₂ = H) 또는 생리 학적으로 허용가능한 염의 형태, 예컨대 클로라이드 또는 아세테이트로 존재할 수 있다. 또한 아미노기는 산으로 아세틸화되어 R₁ = H 및 R₂ = 아세틸, 트리플루오로아세틸, 아다만틸이 되거나, 펩티드 화학의 통상의 아미노 보호기 ,예컨대 Fmoc, Z, Boc, Alloc 로 보호된 형태로 존재하거나 N-알킬화될 수 있다 (R₁ 및/또는 R₂ = C₁-C₆ 알킬 또는 C₂-C₈ 알케닐 또는 C₇-C₉ 아르알킬).

알킬잔기는 직쇄, 분지쇄 또는 임의의 환형 알킬 잔기, 바람직하게는 메틸, 에틸, 이소프로필 및 시클로헥실을 의미한다.

모든 엑센딘 단편은 완전히 또는 부분적으로 보호된 유도체로 존재할 수 있다.

본 발명의 추가의 주제는 전술한 특성 및 하기 (a) 내지 (p) 에서 열거한 1 내지 11 개의 변경이 추가로 실행된 서열길이를 갖는 엑센딘 단편이다. 9 개이하, 특히 바람직하게는 하기 (a) 내지 (p) 에 열거된 5 개이하의 변경을 갖는 엑센딘 단편이 바람직하다.

(a) 위치 1 에서의 α-아미노산은 D-His, Ala, D-Ala, Gly, Lys 또는 D-Lys 이고, 이중 Ala, Gly 또는 Lys 가 특히 바람직하다; 또는

(b) 위치 2 에서의 α-아미노산은 Ser, D-Ser, Thr, D-Thr, Gly, Ala, D-Ala, Ile, D-Ile, Val, D-Val, Leu 또는 D-Leu, 바람직하게는 Ser, Thr, Gly, Ala, Ile, Val, 또는 Leu 이다; 또는

(c) 위치 3 에서의 α-아마노산은 Glu, D-Glu, Asp, D-Asp, Ala 또는 D- Ala, 바람직하게는 Glu, Asp 또는 Ala 이다; 또는

(d) 위치 4 에서의 아미노산은 Ala, D-Ala 또는 β-Ala, 바람직하게는 Ala 이다; 또는

(e) 위치 5 에서의 α-아미노산은 Ser, Tyr 또는 Ala 이다; 또는

(f) 위치 6 에서의 α-아미노산은 Ala, Ile, Val, Leu, Cha 또는 Tyr, 바람직하게는 Ala, Ile, Val, Leu, 또는 Tyr 이다; 또는

(g) 위치 7 에서의 α-아미노산은 Ala, D-Ala, Tyr, D-Tyr, Ser, D-Ser 또는 D-Thr, 바람직하게는 Ala, Tyr 또는 Ser 이다; 또는

(h) 위치 8 에서의 α-아미노산은 Ala, Tyr, 또는 Thr 이다; 또는

(i) 위치 9 에서의 α-아미노산은 Ala, D-Ala, Glu, D-Glu 또는 D-Asp, 바람직하게는 Ala 또는 Glu 이다; 또는

(j) 위치 10,11,12,15,16,17,18,19,20,21,24,28,29 에서의 아미노산은 상호 독립적으로 단백질성 또는 비단백질성 D- 또는 L-아미노산, 바람직하게는 단백질성 L-아미노산이다; 또는

(k) 위치 13 에서의 α-아미노산은 중성 L-아미노산, 바람직하게는 중성 단백질성 L-아미노산이다; 또는

(l) 위치 14 에서의 α-아미노산은 안정화를 위해서는 중성 L- 또는 D-아미노산 (L-루신제외), 바람직하게는 Nle, D-Nle, Ala, D-Ala, Ile, D-Ile, Val 또는 D-Val 로 치환되며, Ile, Val 또는 Ala 가 특히 바람직하다; 또는

(m) 위치 22 에서의 α-아미노산은 D-Phe, Tyr, D-Tyr, Leu, D-Leu, Val, D- Val, L-Cha, D-Cha, β-1-Nal, β-2-Nal 또는 β-1-D-Nal 이고, 이중 Tyr, Leu 또는 Val 가 바람직하다; 또는

(n) 위치 23 에서의 α-아미노산은 Leu, D-Leu, D-Ile, Val, D-Val, L-Cha, D-Cha, Tyr, D-Tyr, Phe 또는 D-Phe 이고, 이중 Leu, Val, Tyr 또는 Phe 가바람직하다; 또는

(o) 위치 25, 26 또는 27 에서의 α-아미노산은 중성 L- 또는 D-아미노산, 바람직하게는 중성, 단백질성 L-아미노산이다; 또는

(p) 위치 30 에서의 α-아미노산은 단백질성 또는 비단백질성 D- 또는 L- 아미노산 (글리신 제외), 바람직하게는 Arg, D-Arg, Tyr 또는 D-Tyr, Arg 또는 Tyr 가 특히 바람직하다.

새로운 엑센딘 단편 중에서, 상기 언급한 특성 및 서열 길이를 가지는 것 외에 10 번 위치에 아미노산 루신 및/또는 19 번 위치에 아미노산 발린, 14 번 위치에 메티오닌 대신 아미노산 이소루신 또는 알라닌, 30 번 위치에 아르기닌을 갖는 것이 특히 바람직하다. 엑센딘 단편의 이러한 변형은 특히 10,14,19 및 30 번 위치의 상기한 특히 선호되는 아미노산 외에도, 2 번 위치에 단백질성 20 개의 L-아미노산 중의 하나가 위치하는 것이 바람직하다.

바람직한 엑센딘 유사체는 3 또는 14 번 위치에, 특히 바람직하게는 2 번 위치에 치환을 가지며, 아주 바람직하게는 단백질성 아미노산만을 포함하는 엑센딘 유사체이다.

새로이 단축화되고 안정화된 엑센딘-3과 엑센딘-4 유사체외에도, 본 발명은 또한 유사체를 서열로 연결되고 유사체 내의 아미노산에 해당하면서 임의적으로 자연의 엑센딘 펩티드에는 존재하지 않는 해당 아미노산으로 보충된 유사체 내에 포함되며 보호된 아미노산으로부터 고체상 합성으로 유사체를 준비하는 방법에 관한다.

엑센딘-3 또는 엑센딘-4 서열의 30 위치의 글리신은 다른 단백질성 또는 비단백질성 아미노산으로 치환하여 아미노 말단 보호기를 분리한 후 합성 중 디케토피페라진 형성이 되는 것을 방지한다.

엑센딘-(1-30) 유사체와 단편은 엑센딘-1-(1-39)에 비하여 유리한 바, 이는 이 유사체의 더 짧은 서열이 더 높은 수득율로 보다 간단한 합성을 가능하게 하기 때문이다.

아미노산의 약호와 정의는 순수 응용 화학지 (Pure Appl. Chem. 31, 639-45 (1972) 및 40, 277-90 (1974))에서 추천된 바와 같고 PCT 규칙에도 합치한다 (WIPO 규정 23; Recommendation for the Presentation of Nucleotide and Amino Acid Sequence in Patent Application and in Published Patent Documents). 일자 및 삼자 기호는 하기와 같다.

아미노산 약호

아미노산 삼자기호 일자기호

알라닌 Ala A

아르기닌 Arg R

아스파라긴 Asn N

아스파르트산 Asp D

시스테인 Cys C

글루타민 Gln Q

글루탐산 Glu E

글리신 Gly G

히스티딘 His H

이소루신 Ile I

루신 Leu L

리신 Lys K

메티오닌 Met M

페닐알라닌 Phe F

프롤린 Pro P

세린 Ser S

트레오닌 Thr T

트립토판 Trp W

타이로신 Tyr Y

발린 Val V

기타 아미노산 Xaa X

약호는 D- 또는 D,L-로 특정되지 않는 한 L-아미노산을 나타낸다. D-아 미노산은 일자 기호에서 소문자로 나타낸다. 특정한 천연 혹은 비천연 아미노산은 키랄성이 없으며 예로써 글리신이 있다. 표시에서 모든 펩티드의 N-말단은 왼쪽에, C-말단은 오른쪽에 나타낸다.

비단백질성 아미노산의 예는 하기 표에 그들의 약호와 함께 열거하였다.

β-알라닌 β-Ala

o-아미노벤조산 Oab

m-아미노벤조산 Mab

p-아미노벤조산 Pab

m-아미노메틸벤조산 Amb

ω-아미노헥산산 Ahx

ω-아미노헵탄산 Ahp

ω-아미노옥탄산 Aoc

ω-아미노데칸산 Ade

ω-아미노테트라데칸산 Atd

시트룰린 Cit

시클로헥실알라닌 Cha

α,γ-디아미노부티르산 Dab

α,β-디아미노프로피온산 Dap

메티오닌 술폭시드 Met(O)

Cα-메틸-알라닌 Aib

N-메틸-글리신 (사르코신) Sar

나프틸알라닌 Nal

노르루신 Nle

오르니틴 Orn

1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복시산 Tic

모든 아미노산은 그들의 물리적-화학적 성질에 따라 이하의 주요 세 가지 영역으로 나눌 수 있다.

산성: 아미노산은 수용액과 생리적 pH에서 프로톤을 방출하여 결국 음전하를 가진다.

염기성: 아미노산은 수용액과 생리적 pH에서 프로톤을 획득하여 결국 양전하를 가진다.

중성: 아미노산은 수용액과 생리적 pH에서 비하전된 상태를 가진다.

"양/음전하를 가짐" 또는 "비하전된 상태"의 정의는 아미노산 분류의 상당수의 통계 평균 (최소한 25%)이 상기한 상태임을 뜻한다.

단백질로의 도입이 유전자 코드 정보로 조절되는 20 개의 소위 단백질성 아미노산 외에도, 비단백질성 아미노산 역시 기술한 합성법에 의해 펩티드 서열에 도입될 수 있다. 단백질성 아미노산과 상기한 세 개의 영역으로의 분류를 하기 표에 기재하였다. 비단백질성 아미노산은 유전자적으로 코딩되지 못한다. 비단백질성 아미노산의 예와 그들을 산성, 염기성 또는 중성 아미노산으로 분류한 것이 하기 표에 기재되어있다.

	단백질성	비단백질성
산성	Asp, Glu
염기성	Arg, His, Lys	Dab, Dap, Orn
중성	Ala, Asn, Cys, Gln, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val	β-Ala, Aib, Cit, Cha, Oab, Mab, Pab, Amb, Ahx, Ahp, Aoc, Ade, Atd, Nal, Nle, Sar, Tic

본 발명의 과제가 되는 엑센딘 유사체는 유용한 치료적 특성을 가지고 있다. 이들은 내분비 췌장으로부터의 인슐린 방출을 촉진하기 때문에, 인슐린의 생합성을 증가시키고 말초에서의 포도당 소비를 촉진한다. 이러한 효과는 혈당 수준이 동시에 증가할 때에만 관찰되므로, 이의 투여후의 저혈당은 예측되지 않는다. 또한 엑센딘 유사체는 내분비 췌장으로부터의 글루카곤 방출을 억제하기 때문에 당신생의 저하를 유도한다. 비-인슐린 의존성 당뇨병 (NIDDM)에서 엑센딘 유사체는 현저하게 개선된 대사조건을 도모한다. 특히 근육과 지방 조직에서의 포도당 흡수는 인슐린 분비 효과와 무관하게 증가한다. 글루카곤 방출 억제 효과 때문에 엑센딘 유사체를 인슐린 의존성 당뇨병에 투여하는 것 역시 합당하다. 글루카곤-유사 펩티드 1 (GLP-1)과 공지의 엑센딘-3 및 엑센딘-4 서열과 비교하여, 본 발명의 엑센딘 유사체는 다양한 시험 체계에서 놀랍게도 매우 높은 효능을 가지고 있어 GLP-1, 엑센딘-3 또는 엑센딘-4 서열에 비해 치료용 적용에 보다 적합하다. 새로운 엑센딘 유사체의 이점은 특히 다음과 같다: 분해 및 대사에 대한 높은 안정성, 보다 장기간의 작용시간, 소량의 투여량에서의 효용성. 특히 장기간의 작용시간 또는 특히 소량의 투여량에서 효용성을 가지는 엑센딘-3에 기초한 유사체가 특히 바람직하다.

펩티드 합성에서 고체상과 액체상의 합성이 통상적인 방법이다. 조생성물의 순도와 수득률을 고려하여 특정 단백질을 합성하고자하는 방법을 최적화할 때, 방법 변수들과 사용되는 물질, 예를 들어 지지체, 반응기들을 반응하게 하는 시약, 반응하지 않아야 할 기를 차폐하는 물질 또는 차폐물질을 분리할 수 있는 시약들은 합성될 생성물, 합성될 중간 생성물 및 개시물질에 맞추어져만 한다. 이러한 적용은 많은 방법 변수들의 상호 의존성을 고려할 때, 간단하지만은 않은 문제이다.

통상의 보조제와 첨가제외에 활성 물질로서 각각 또는 함께 본 발명에 따른 펩티드를 포함하는 약제는 바람직하게는 비경구로 투여한다 (피하, 근육내 또는 정맥내로). 그러나 이외의 기타 일반 투여형태로써, 구강, 항문, 협측 (설하를 포함), 폐, 경피, 이온삼투, 질 및 비강 투여를 고려해볼 수 있다. 약물은 인슐린 조절 능력을 가지고 있어서 혈당 수준을 보상하는 유리한 방식을 촉진한다. 약물은 혈당 수준이 20 내지 50 pmol/l 가 될 때 사용하는 것이 유리하다. 이를 위해서는 0.4 - 1.2 pmol/kg/분 의 주입속도가 필요하다. 피하 또는 협측 투여의 경우에는, 갈레누스 형태와 원하는 지속기간에 따라 5-500 nmol의 물질량이 필요하다.

본 발명에 따른 엑센딘 유사체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염은 바람직하게는 멸균 동결건조물로 저장되며 투여 전에 적합한 등장액으로 혼합되어진다. 유사체는 주사, 주입되거나 또는 이 형태로 임의로 점막을 통해서 흡수시킬 수 있다. 안정화제 및 가용화제와 같이 주사용액을 위한 일반 첨가물을 함 유한 주입과 주사에 적합한 통상의 등장액 시스템을 용매로 사용할 수 있다. 생리 식염수 또는 완충제로 등장성으로 만든 임의 용액이 이 경우 바람직하다.

첨가제는 예로써, 점도를 조절하기 위한 주석산 또는 시트레이트 완충제, 에탄올, 착화제 (에틸렌 디아민테트라아세트산 및 그의 비독성 염과 같은 것), 고분자량 중합체 (액체 폴리에틸렌 옥시드와 같은 것) 이다. 주사 용액을 위한 액체 담체 물질은 멸균되어야 하며 바람직하게는 앰퓰에 충전한다. 고체 담체 물질의 예로는, 전분, 락토스, 만니톨, 메틸 셀룰로스, 활석, 고분산 규산, 고분자량 지방산 (스테아르산과 같은 것), 젤라틴, 한천-한천, 인산칼슘, 스테아르산 마그네슘, 동물성 또는 식물성 기름, 고체 고분자량 중합체 (폴리에틸렌 글리콜과 같은 것) 로, 필요하다면 향미료와 감미료를 포함한 구강 투여용의 적합한 제제일 수 있다. 비강 투여를 위해서는, 계면 활성제, 예컨대 콜린산, 타우로콜린산, 체노데옥시콜린산, 글리콜산, 데히드로콜린산, 데옥시콜린산 및 시클로덱스트린을 첨가하여 비강 점막을 통한 흡수를 개선시킬 수 있다..

일일 투여량은 150-500 nmol 범위이다. 생활성의 측정은 글루카곤 유사 펩티드-1, 엑센딘-3 또는 엑센딘-4 에 대한 국제적 표준 제제와 비교하여, 글루카곤 유사 펩티드-1에 대한 통상의 시험법에 따라 측정하는 것을 기초로 한다.

본 발명에 따른 엑센딘 유사체는 문헌 (일례로, 고체상 합성에 관해서는 J.M. Steward and J.D. Young "Solid Phase Peptide Synthesis", 2nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois (1984)과 J.Meienhofer Hormonal Proteins and Peptides, Vol.2 Academic Press, New York (1973): 액체상 합성에 관해서는 E.Schroder and K. Lubke "The Peptides", Vol.1, Academic Press, New York (1965))에 기술된 바와 같은 통상의 펩티드 합성법에 따라 제조할 수 있다.

펩티드 합성의 일반적인 방법

일반적으로 펩티드 합성을 위해서는 자라나는 펩티드 사슬에 보호된 아미노산을 첨가한다. 첫 번째 아미노산 측쇄의 모든 반응성기와 아미노기 및 카르복시기는 보호된다. 이렇게 보호된 아미노산을 비활성 지지체에 결합시키거나 용액 내에서 사용할 수 있다. 펩티드 서열의 다음 아미노산은 아미드 결합 형성을 선호하는 조건하에서 적절히 보호된 후 첫 번째 아미노산에 가해진다. 모든 목적 아미노산들이 올바른 서열로 결합되면, 보호기와 임의의 지지체상은 분리된다. 이렇게 하여 수득한 조 폴리펩티드는 재 침전되고 바람직하게는 크로마토그래피로 정제하여 최종 생성물을 형성한다.

40 개 미만의 아미노산을 가지고 생리적 활성 폴리펩티드의 유사체를 합성하기 위한 바람직한 방법에는 고체상 펩티드 합성이 포함된다. 상기 방법에서, α-아미노 관능기 (N^α) 및 임의 반응성 측쇄는 산-불안정 기 또는 염기-불안정 기로 보호된다. 사용된 보호기는 아미드 결합을 연결하기 위한 조건하에서 안정해야하지만 형성된 폴리펩티드 사슬을 손상시키지 않으면서 용이하게 절단시킬수도 있어야 한다. α-아미노 관능기에 대한 적합한 보호기로는 하기의 기들을 들 수 있으나 이에 국한되는 것은 아니다 : t-부틸옥시카르보닐 (Boc), 벤질옥시카르보닐 (Z), o-클로로벤질옥시카르보닐, 비페닐이소프로필옥시카르보닐, tert.-아 밀옥시카르보닐 (Amoc), α,α-디메틸-3,5-디메톡시벤질옥시카르보닐, o-니트로술페닐, 2-시아노-t-부톡시카르보닐, 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc), 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥스-1-일리덴)에틸 (Dde) 등. 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 이 Nα-보호기로 바람직하게 사용된다.

적합한 측쇄 보호기로는 하기의 기들을 들 수 있으나 이에 국한되는 것은 아니다 : 아세틸, 알릴 (All), 알릴옥시카르보닐 (Alloc), 벤질 (Bzl), 벤질옥시카르보닐 (Z), t-부틸옥시카르보닐 (Boc), 벤질옥시메틸 (Bom), o-브로모벤질옥시카르보닐, t-부틸 (t-Bu), t-부틸디메틸실릴, 2-클로로벤질, 2-클로로벤질옥시카르보닐 (2-CIZ), 2,6-디클로로벤질, 시클로헥실, 시클로펜틸, 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥스-1-일리덴)에틸 (Dde), 이소프로필, 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤질술포닐 (Mtr), 2,3,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐 (Pmc), 피발릴, 테트라히드로피란-2-일, 토실 (Tos), 2,4,6-트리메톡시벤질, 트리메틸실릴 및 트리틸 (Trt).

고체상 합성에 있어서, C-말단 아미노산은 적합한 지지체 물질에 처음부터 결합되어있다. 적합한 지지체 물질은 시약 및 단계별 축합 및 절단 반응을 위한 반응 조건에 대해 불활성이고 사용되는 반응 매질중에 용해되지 않는 것이다. 시판되는 지지체 물질의 예로는, 반응기 및/또는 폴리에틸렌 글리콜로 수식된 스티렌/디비닐벤젠 공중합체 및 클로로메틸화된 스티렌/디비닐벤젠 공중합체, 히드록시메틸화 또는 아미노메틸화된 스티렌/디비닐벤젠 공중합체 등을 들 수 있다. 펩티드산을 제조하기 위한 것이라면 4-벤질옥시벤질알콜 (왕-앵커;Wang-anchor (Wang, S.S. 1973)) 또는 2-클로로트리틸 클로라이드 (Barlos, K. et al. 1989) 로 유도체화된 폴리스티렌 (1 %)-디비닐벤젠 또는 텐타겔 (상표명) (Rapp Polymere, Tuebingen) 이 바람직하게 사용된다. 펩티드 아미드의 경우에 있어서, 5-(4'-아미노메틸)-3',5'-디메톡시페녹시)발레르산 (PAL-앵커) (Albericio, F. et al., 1987) 또는 p-(2,4-디메톡시페닐아미노메틸)페녹시기 (링크-아미드 앵커; Rink-Amid anchor (Rink, H. 1987)) 로 유도체화된 폴리스티렌 (1 %) 디비닐벤젠 또는 텐타겔 (상표명) 이 바람직하다.

고분자 지지체로의 연결은, 에탄올, 아세토니트릴, N,N-디메틸포름아미드 (DMF), 디클로로메탄, 테트라히드로푸란, N-메틸피롤리돈 또는 유사한 용매중에서, 바람직하게는 DMF 중에서 활성화제를 첨가하여 C-말단 Fmoc-보호된 아미노산을 지지체 물질과 실온 또는 승온, 예컨대 40 ℃ 내지 60 ℃, 바람직하게는 실온에서, 2 내지 72 시간, 바람직하게는 약 2 × 2 시간 동안 반응시키므로써 달성될 수 있다.

Nα 보호된 아미노산, 바람직하게는 Fmoc 아미노산과 PAL, 왕 또는 링크 앵커와의 커플링은, 예를 들어, 바람직하게는 HOBt가 첨가된 TBTU가 보조된 1-히드록시벤조트리아졸 또는 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸의 존재하에 또는 부재하에서도, 예컨대, 디이소프로필에틸아민 (DIEA), 트리에틸아민 또는 N-메틸모르폴린, 바람직하게는 디이소프로필에틸아민과 같은 염기가 첨가되거나 또는 첨가되지 않은 채로, 2 내지 72 시간, 바람직하게는 3 시간의 반응시간동안 1.5 배 내지 3 배 과량, 바람직하게는 2 배 과량의 아미노산 및 커플링제하에, 약 10 ℃ 내지 50 ℃, 바람직하게는 25 ℃의 온도에서, 디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈 또는 디클로로 메탄, 바람직하게는 디메틸포름아미드와 같은 용매중에서, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC), N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (DIC) 또는 기타 카르보디이미드, 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TBTU) 또는 기타 우로늄염, o-아실우레아, 벤조트리아졸-1-일-트리스피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (PyBOP) 또는 기타 포스포늄염, N-히드록시숙신이미드, 기타 N-히드록시이미드 또는 옥심과 같은 커플링제의 보조하에 수행될 수 있다. 커플링제 대신에, 상기 기재된 조건하에서 활성 에스테르 (예를 들어, 펜타플루오로페닐, p-니트로페닐 등), N^α-Fmoc-아미노산의 대칭성 무수물, 그의 산염화물 또는 산불소화물을 또한 사용할 수 있다.

N^α-보호된 아미노산, 바람직하게는 Fmoc 아미노산은 DIEA 가 첨가된 디클로로메탄중에서 10 내지 120 분, 바람직하게는 20 분의 반응시간동안 2-클로로트리틸 수지와 바람직하게 커플링되지만, 상기 용매 및 상기 염기의 사용에 국한되는 것은 아니다.

보호된 아미노산의 연속적인 커플링은 대표적으로 자동 펩티드 합성기와 같은 펩티드 합성에 있어서 통상적인 방법에 따라 수행될 수 있다. 고체상에 커플링된 아미노산의 N^α-Fmoc 보호기를 디메틸포름아미드중에서 피페리딘 (10 % 내지 50 %) 으로 5 내지 20 분간, 바람직하게는 DMF 중 50 % 피페리딘으로 2×2 분 및 DMF 중 20 % 피페리딘으로 1×15분간 처리하여 절단한 후, 3 배 내지 10 배 과량, 바람직하게는 10 배 과량인 다음 보호된 아미노산을 디클로로메탄, DMF 또 는 두 용매의 혼합액, 바람직하게는 DMF과 같은 비활성, 비수성, 극성 용매중에서 약 10 ℃ 내지 50 ℃, 바람직하게는 25 ℃ 의 온도에서 이전 아미노산에 커플링시킨다. PAL, 왕 또는 링크 앵커에 첫 번째 N^α-Fmoc 아미노산을 커플링하기 위해 이미 언급된 시약들이 커플링제로써 적합하다. 보호된 아미노산의 활성 에스테르, 그의 염화물 또는 불소화물 또는 대칭성 무수물이 또한 대체물로서 사용될 수 있다.

고체상 합성의 최종 단계에서, 펩티드를 지지체 물질로부터 절단하면서 동시에 측쇄 보호기를 절단한다. 절단은 디메틸술피드, 에틸메틸술피드, 티오아니솔, 티오크레솔, m-크레솔, 아니솔 에탄디티올, 페놀 또는 물과 같은 5 % - 20 % v/v 스캐빈저, 바람직하게는 15 % v/v 디메틸술피드/에탄디티올/m-크레솔 1:1:1 이 첨가된 기타 강산성 매질 또는 트리플루오로아세트산으로 0.5 내지 3 시간, 바람직하게는 2 시간 동안 수행될 수 있다. 완전 보호된 측쇄를 가진 펩티드는 2-클로로트리틸 앵커를 빙초산/트리플루오로에탄올/디클로로메탄 2:2:6 으로 절단하므로써 수득된다. 보호된 펩티드는 실리카 겔 크로마토그래피로 정제될 수 있다. 펩티드가 왕 앵커를 통해 고체상에 연결되어있고 C-말단 알킬아미드화된 펩티드를 수득하고자 한다면, 절단은 알킬아민 또는 플루오로알킬아민으로 아미노분해에 의해 수행될 수 있다. 아미노분해는 약 -10 ℃ 내지 50 ℃ 의 온도, 바람직하게는 약 25 ℃ 의 온도에서 약 12 내지 24 시간, 바람직하게는 약 18 시간의 반응 시간 동안 수행된다. 또한, 펩티드는 예컨대, 메탄올로의 재-에스 테르화에 의해서 지지체로부터 절단될 수 있다.

수득된 산성 용액은 3 내지 20 배 양의 냉에테르 또는 n-헥산, 바람직하게는 10 배 과량의 디에틸 에테르와 부가 혼합되어, 펩티드를 침전시키므로써 에테르중에 남아있는 스캐빈저와 절단된 보호기를 분리한다. 정제는 펩티드를 빙초산으로 수회 재침전시키므로써 한층 더 수행될 있다. 수득된 침전물을 물 또는 tert-부탄올 또는 두 용매의 혼합액중에서, 바람직하게는 tert-부탄올/물의 1:1 혼합액중에서 수합하여 동결 건조시킨다.

수득된 펩티드를 하기 크로마토그래피 방법으로 일부 또는 모두를 정제할 수 있다 : 아세테이트 형태인 약염기성 수지상에서의 이온 교환 크로마토그래피; 비-유도체화된 폴리스티렌/디비닐벤젠 공중합체 (예를 들어, 앰버라이트 (상표명) XAD)상에서의 소수성 흡착 크로마토그래피; 실리카 겔상에서의 흡착 크로마토그래피; 예를 들어, 카르복시메틸 셀룰로스상에서의 이온 교환 크로마토그래피; 예를 들어, 세파덱스 (상표명) G-25 상에서의 분배 크로마토그래피; 역류분배 크로마토그래피; 또는 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC), 특히 옥틸 또는 옥타데실실릴실리카 (ODS) 상에서의 역상 HPLC.

요약하면, 본 발명은 폴리펩티드의 제조방법 및 이들의 약학적으로 이용가능한 염에 관한 것이다. 상기 언급된 바람직한 사슬 길이 및 수식을 갖는 엑센딘-3 또는 엑센딘-4의 생리적 활성의 단축된 유사체 및 동족체를 유도하는 상기 방법에는 적합한 지지체 물질상에 보호된 아미노산을 순차적으로 축합시키는 방법, 지지체 및 보호기를 절단하는 방법 및 수득된 조펩티드를 정제하는 방법이 포함 된다.

아미노산 분석은 아미노산 분석기 420 A (Applied Biosystems Company; Weiterstadt) 로 수행되었다. 분석될 시료 50 내지 1000 pmol을 10 내지 40 μl 용액중 시료 담체에 가한 다음 기체상에서 6 N 염산으로 160 ℃에서 90 분간 완전 자동으로 가수분해시키고, 페닐이소티오시아네이트로 유도체화하고 마이크로보어 (microbore) HPLC 로 온-라인 분석하였다. 질량 분광학적 조사는 이온원인 이온 스프레이가 장착된 API III 트리플-쿼드러플 질량 스펙트로미터 (SCIEX; Thronhill, Canada) 로 수행되었다.

보호된 아미노산 유도체는 예를 들어 노바비오켐 GmbH (Bad Soden) 으로부터 수득될 수 있다.

하기 실시예는 발명의 개념에 대한 예시적인 부분만을 나타내며, 본 발명의 주제를 국한하는 것은 아니다.

실시예 1

HGEGTFTSDLSKQ-Nle-EEEAVRLFIEWLKNGR-NH₂ (서열번호 3)

[Nle¹⁴, Arg³⁰]-엑센딘-4-(1-30)-NH₂

실시예 1 은 MultiSyn Tech 사 (Bochum) 의 다중자동화 펩티드 합성기 SyRo Ⅱ 를 사용하여 5-((4'-아미노메틸)-3',5'-디메톡시페녹시)발레리아닐-알라닐-아미노메틸-폴리스티렌 (1 %) 디비닐벤젠 (부하: 0.5 mmol/g) 상에서 고체상 방법에 의해 0.02 mmol 뱃치 내에서 합성하였다. 아미노산의 α-아미노 관능기를 9-플루 오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 로 보호화하였다. 측쇄 보호기는 Asp, Glu, Ser 및 Thr 에 대해서는 t-부틸 (tBu), Asn, Gln 및 His 에 대해서는 트리틸 (Trt), Lys 및 Trp 에 대해서는 t-부틸옥시카르보닐 (Boc), 그리고 Arg 에 대해서는 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐 (Pmc) 였다. 보호된 아미노산은 활성화제로서 N,N-디이소프로필카르보디이미드/1-히드록시벤조-트리아졸을 사용하고 40 분간 2 회 이중 커플링하여 10 배 과량으로 연속적으로 커플링되었다. 펩티드는 고분자 지지체로부터 갈라지고, 동시에 실온에서 120 분 동안 15 % 에탄디티올/디메틸술피드/m-크레졸 (1 : 1 : 1 v/v/v) 의 존재 하에 트리플루오로아세트산 (85%) 중에서 보호기를 절단하였다. 이어서, 펩티드를 무수 디에틸 에테르로 침전시킨 다음, 무수 디에틸 에테르로 수 회 세척하여 티올을 완전히 제거하였다. 침전물을 물/tert-부탄올 (1:1) 로부터 동결-건조시켜서 조펩티드 62 mg 을 수득하였다. 조펩티드를 37 % 내지 42 % 아세토니트릴/0.9 % TFA 의 농도구배를 이용하여 역상 HPLC 에 의해 30 분 내에 정제하였다. 용출물을 증발, 동결건조하여 97 % 이상의 순도를 갖는 백색 고체 29 mg 을 수득하였다.

아미노산 분석: Ala 1.08 (1); Asx 1.91 (2); Glx 6.10 (6); Phe 1.78 (2); Gly 3.10 (3); His 1.00 (1); Ile 0.88 (1); Lys 2.02 (2); Leu 3.24 (3); Nle 1.10 (1); Arg 1.98 (2); Ser 2.04 (2); Thr 1.99 (2); Val 0.91 (1); Trp O.87 (1)

ESI-MS: 3488.2

실시예 2

HGEGTFTSDLSKQ-Nle-EEEAVRLFIEWLKNGY-NH₂ (서열번호 4)

[Nle¹⁴, Tyr³⁰]-엑센딘-4-(1-30)-NH₂

실시예 2 는 MultiSynTech 사 (Bochum) 의 다중자동화 펩티드 합성기 SyRo Ⅱ 를 사용하여 링크-아미드 앵커 (4-(2',4'-디메톡시페닐-아미노메틸)-페녹시기) (부하: 0.18 mmol/g) 으로 유도체화된 텐타겔 (상표명) (Rapp Polymers, Tuebingen) 상에서 고체상 방법에 의해 0.0076 mmol 뱃치 내에서 합성하였다. 사용된 보호된 아미노산은 실시예 1 과 유사하였다. 보호된 아미노산은 40 ℃ 에서 40 분간 교반하면서 단일 커플링하여 8 배 과량으로 연속적으로 커플링하였다. 디이소프로필에틸아민을 첨가하여 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸-우로늄 테트라플루오로보레이트 (TBTU)/1-히드록시벤조트리아졸을 활성화제로서 사용하였다. 펩티드를 절단하여, 실시예 1 과 유사하게 정제하였다. 95 % 초과의 순도를 갖는 백색 고체 18.1 mg 을 수득하였다.

아미노산 분석: Ala 1.03 (1); Asx 1.90 (2); Glx 6.24 (6); Phe 1.94 (2); Gly 3.12 (3); His 1.02 (1); Ile 1.09 (1); Lys 2.01 (2); Leu 3.06 (3); Nle 1.08 (1); Arg 0.97 (1); Ser 1.98 (2); Thr 1.80 (2); Val 0.93 (1); Trp 1.01 (1); Tyr 0.90 (1).

ESI-MS: 3494.8

실시예 3

HSDGTFTSDLSKQ-Nle-EEEAVRLFIEWLKNGR-NH₂ (서열번호 5)

[Nle¹⁴, Arg³⁰]-엑센딘-3-(1-30)-NH₂

실시예 3 은 실시예 2 에 기재된 방법과 유사하게 합성하였다. 99 % 이상의 순도를 갖는 백색 고체 17.6 mg 을 수득하였다.

아미노산 분석: Ala 0.99 (1); Asx 2.98 (3); Glx 5.16 (5); Phe 2.08 (2); Gly 2.16 (2); His 0.95 (1); Ile 1.03 (1); Lys 2.04 (2); Leu 2.91 (3); Nle 1.05 (1); Arg 1.04 (1); Ser 3.00 (3); Thr 2.05 (2); Val 1.01 (1); Trp 1.18 (1); Tyr 0.98 (1).

ESI-MS: 3504.4

실시예 4

HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGR-NH₂ (서열번호 6)

[Arg^3O]-엑센딘-4-(1-30)-NH₂

실시예 4 는 실시예 1 에 기재된 방법과 유사하게 합성하였다. 96 % 이상의 순도를 갖는 백색 고체 17.9 mg 을 수득하였다.

아미노산 분석: Ala 0.96 (1); Asx 2.01 (2); Glx 6.00 (6); Phe 1.80 (2); Gly 3.21 (3); His 0.96 (1); Ile 1.07 (1); Lys l.92 (2); Leu 2.98 (3); Met 1.06 (1); Arg 1.90 (2); Ser 1.91 (2); Thr 2.09 (2); Val 0.97 (1); Trp 0.84 (1).

ESI-MS: 3508.4

실시예 5

GEGTFTSDLSKQ-Nle-EEEAVRLFIEWLKNGR-NH₂ (서열번호 7)

[Nle¹⁴, Arg³⁰]-엑센딘-4-(2-30)-NH₂

실시예 5 는 실시예 2 에 기재된 방법과 유사하게 합성하였다. 97 % 이상의 순도를 갖는 백색 고체 13.2 mg 을 수득하였다.

아미노산 분석: Ala 1.04 (1); Asx 1.98 (2); Glx 6.08 (6); Phe 1.86 (2); Gly 2.91 (3); Ile 0.96 (1); Lys 1.84 (2); Leu 2.98 (3); Nle 1.04 (1); Arg 1.90 (2); Ser 1.94 (2); Thr 1.92 (2); Val 0.96 (1); Trp 0.85 (1).

ESI-MS: 3350.8

실시예 6

HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRAFIEWLKNGR-NH₂ (서열번호 8)

[Ala²¹, Arg³⁰]-엑센딘-4-(1-30)-NH₂

실시예 6 은 실시예 1 에 기재된 방법과 유사하게 합성하였다. 95 % 이상의 순도를 갖는 백색 고체 11.1 mg 을 수득하였다.

아미노산 분석: Ala 2.08 (2); Asx 1.93 (2); Glx 6.07 (6); Phe 1.74 (2); Gly 2.97 (3); His 0.98 (1) ; Ile 0.87 (1); Lys 2.15 (2); Leu 2.02 (2); Met 0.96 (1); Arg 2.13 (2); Ser 1.87 (2); Thr 2.07 (2); Val 1.04 (1); Trp 0.87 (1).

ESI-MS: 3466.3

실시예 7

HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKAGR-NH₂ (서열번호 9)

[Ala²⁸, Arg³⁰]-엑센딘-4-(1-30)-NH₂

실시예 7 은 실시예 1 에 기재된 방법과 유사하게 합성하였다. 97 % 이상의 순도를 갖는 백색 고체 15.0 mg 을 수득하였다.

아미노산 분석: Ala 1.98 (2); Asx O.98 (1); Glx 6.22 (6); Phe 1.92 (2); Gly 3.03 (3); His 0.99 (1); Ile 1.03 (1); Lys 2.05 (2); Leu 3.03 (3); Met 0.96 (1); Arg 1.84 (2); Ser 1.98 (2); Thr 2.09 (2); Val 1.01 (1); Trp 0.72 (1).

ESI-MS: 3465.4

실시예 8

HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRAFIEWLKAGR-NH₂ (서열번호 10)

[Ala^21,28,Arg³⁰]-엑센딘-4-(1-30)-NH₂

실시예 8 은 실시예 1 에 기재된 방법과 유사하게 합성하였다. 95 % 이상의 순도를 갖는 백색 고체 18.4 mg 을 수득하였다.

아미노산 분석: Ala 3.12 (3); Asx 0.99 (1); Glx 6.04 (6); Phe 1.80 (2); Gly 3.OO (3); His 0.96 (1); Ile 1.02 (1); Lys 1.84 (2); Leu 1.97 (2); Met 0.98 (1); Arg 2.03 (2); Ser 1.91 (2); Thr 1.88 (2); Val 0.99 (1); Trp 0.99 (1).

ESI-MS: 3423.3

실시예 9

유사한 방법으로 하기 고순도 엑센딘 유도체를 제조할 수 있었다.

(Ex-4 = 엑센딘-4, Ex-3 = 엑센딘-3)

엑센딘-유도체 서열번호 서열

하기 실시예는 아미노메틸폴리스티렌 (1 %) 디비닐벤젠이 링크 아미드 앵커 (4-(2',4'-디메톡시페닐-아미노메틸)-페녹시기) (부하: 0.5 mmol/g) 으로 유도체화된 RAM 수지 (상표명) (Rapp Polymers, Tuebingen) 상에서 고체상 방법에 의해 0.02 mmol 뱃치 내에서 합성하였다. 상기 합성은 MultiSyn Tech 사 (Bochum) 의 다중자동화 펩티드 합성기 SyRo Ⅱ 를 사용하여 수행하였다. 사용된 보호된 아미노산은 실시예 1 의 것과 유사하였다. 보호된 아미노산은 교반하면서 40 ℃ 에서 40 분간 단일 커플링하여 5 배 과량으로 연속적으로 커플링하였다. 디이소프로필에틸아민을 첨가하여 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TBTU) 를 활성화제로서 사용하였다. 펩티드의 절단 및 정제는 실시예 1 과 유사하게 수행하였다. 상기 기술한 합성된 펩티드의 수율, 순도, 분석데이타는 하기 표들에 나열된다.

서열 번호 수율 [mg] 순도 [%] ESI-MS

실시예 10 : 약리학적 데이터

엑토펩티다아제 제조에 있어서 또는 신장 미소융모막 제조에 있어서의 펩티드 대사

배경

엑토펩티다아제의 군은 펩티드 호르몬의 후-분비 대사의 원인이 된다. 이러한 효소는 다양한 세포 형태의 세포질막에 결합된다. 이들의 활성 부위는 세포외 공간을 향한다. 또한, 이러한 효소는 근위세뇨관의 쇄자연 (brush border) 막 중에서 높은 농도로 존재한다. 따라서 신장의 쇄자연 미소융모막(BBM)은 적절한 엑토펩티다아제에 대한 적합한 근원이 되고, 합성 펩티드의 대사적 안정성을 위한 인 비트로 테스트로서 사용될 수 있다. 이와 다르게는, 이는 엑토펩티다아제 제조에 사용될 수 있다. 사람 중성 엔도펩티다아제 24.11 뿐만 아니라 디펩티딜 펩티다아제 IV 는, GLP-1 가 상기 엑토펩티다아제 모두의 기질이기 때문에, 예로서 사용된다.

쇄자연 미소융모막의 제조

분획 원심분리법을 사용한 세포내 분획화로 래트 및 돼지 신장 피질의 미소융모막을 단리했다(Booth and Kenny(1975)). 순도 및 막의 수율을 평가하기 위해서, 4 개의 쇄자연 엑토펩티다아제를 형광측정법으로 검출하고, 그 외 마커 효소를 비색법으로 측정했다.

엑토펩티다아제의 제조

정제된 사람 중성 엔도펩티다아제 24.11 을 재조합 형태(Genentech, San Francisco, USA)로 수득하고, 디펩티딜 펩티다아제 IV 을 사람 태반(Calbiochem(Bad Soden))으로부터 단리함으로서 수득했다.

인큐베이션 프로토콜

미소융모막(0.5 - 1 μg 단백질) 또는 각각의 엑토펩티다아제 제제(60 - 300 ng)를, 50 mM NaCl을 함유하는 100 μl 의 HEPES 완충액(50 mM, pH 7.4) 중 10 μg 의 펩티드(약 3 nmol)과 함께 인큐베이션했다. 소정시간 동안(1 시간 이하) 끓여서 반응을 종료했다. 이어서, 샘플을 원심 분리하고(10,000 × g), 150 μl 의 0.1 % TFA 로 희석하고, 역상(RP) HPLC 로 분석했다. 각 샘플을 2 회 측정했다.

HPLC 분석

하기 성분을 갖는 시스템을 HPLC 분석에 사용했다 : 2248 저압 펌프(Pharmacia-LKB, Freiburg), WISP 10B 자동주입기(Millipore-Waters, Eschborn), UV 검출기 SP-4(Gynkotec, Berlin), 저압 혼합 시스템(Pharmacia-LKB, Freiburg) 및 프로그램 매니저 소프트웨어 조절기(Pharmacia-LKB, Freiburg). 이동 용매 A : 0.1 % 트리플루오로아세트산(TFA) 및 B : 아세토니트릴 : 물 : TFA (70 : 29 : 0.1)을 사용하여, 2 원 구배로, Lichrospher C-8(5 μ, 4 × 124 mm (Merk, Darmstadt))상에서, 분리를 수행했다. 이동 용매 A 로 평형시킨 칼럼 상에 244 μl 의 샘플 용액을 주입한 후, 0 % 내지 80 % 의 B 를 1 차 구배로, 인큐베이션 생성물을 80 분 동안 용리하고, 215 nm 에서 UV 흡수를 측정했다.

단백분해 속도의 계산

각 펩티드의 각각의 인큐베이션 기간 동안 2 회 측정하여, 기질 피크의 평균 피크 높이를 시간에 대한 함수로 플롯했다. 예로서 GLP-1 를 사용하여, 샘플 용액 중에서 피크 높이가 펩티드의 양에 대해 직선상으로 비례함을 볼 수 있었다. 게다가, 미소융모막 또는 펩티다아제와 함께 인큐베이션하는 처음 1 시간 동안 시간의 흐름에 따른 피크 높이의 직선적인 감소가 관찰되었다. 따라서, 단백분해 속도는, 기질 피크의 높이에 있어서의 감소분으로부터 측정하며, [μmol 기질/mg 단백질/분]으로 표현된다.

엑센딘 유사체의 분해 안정성

사람 중성 엔도펩티다아제 24.11b 와의 인큐베이션

[Nle¹⁴, Arg³⁰]-엑센딘-4-(1-30)-NH₂ (서열 번호 3)을 상기 언급한 중성 엔도펩티다아제 24.11 과 인큐베이션하고, 분해 속도를 측정했다. 대조군으로 GLP-1-(7-36)-NH₂을 사용했다. 결과를 하기 표 3 에 나타낸다.

	분해속도 [mM/100ng/ml NEP24.11/분]
GLP1-(7-36)-NH₂	0.0586
[Nle¹⁴, Arg³⁰]-Ex-4-(1-30)-NH₂ 실시예 1	0.0083

디펩티딜 펩티다아제 IV 와의 인큐베이션

상기 언급한 바와 같이 표 4 에 기재된 펩티드를 디펩티딜 펩티다아제 IV (DDP-IV) 와 인큐베이션했다. GLP-1-(7-36)-NH₂ 가 50 % 가수분해될 때, 각 인큐베이션을 종료했다. 각 펩티드의 기질 피크를 rpHPLC 시험으로부터 수집하고, 절단된 산물을 배제하기 위해서 질량 분석으로 검사했다.

유사체	서열 번호	DDP-IV 에 대한 기질
[Ala², Nle¹⁴, Arg³⁰]-Ex-3-(1-30)-NH₂	78	단백분해가 없음
GLP1-(7-36)-NH₂		50% 단백분해

쇄자연 미소융모막과의 인큐베이션

상기 프로토콜에 따라 쇄자연 미소융모막(BBM)과 인큐베이션한 후 계산한 단백분해

속도를 표 5 에 나타낸다. GLP1-(7-36)-NH₂ 을 대조군으로 사용했다.

유사체	서열 번호	분해 속도 [ng 펩티드/분/mg BBM]
GLP1-(7-36)-NH₂		880,00
[Lys², Nle¹⁴, Arg³⁰]-Ex-3-(1-30)-NH₂	86	2.05

단리된 췌장도 세포에 의한 인슐린 분비

장기 제거

마취된(0.3 - 0.5 ml 넴부탈/등장 생리 식염수 1 : 4, 복강내투여) 마우스를 정중선 절개로 개복하여, 절개된 2 면, 복막을 고정하고, 횡격막을 따라 늑골궁에서 절개한다. 모든 기관을 팽창시키고, 중성 적색 용액을 좌측 심실로 주입함으로서 붉게 염색했다. 위 및 십이지장을 따라 장간막까지 췌장을 주의 깊게 제거했다. 소화가 될 때가지 췌장을 행크 밸런스 염 용액(HBBS) 중 빙냉 페트리 접시에 두고, 중성 적색 용액을 몇 방울 떨어뜨렸다.

섬 (islet) 의 제조

두 가지 췌장을 셀룰로스로 가볍게 두드리고 튜브 안에 두어, 새로 제조한 콜라게나제 용액 (콜라게나제 (Cl. histolyticum) 0.74 U/mg, Serva, HBBS/물 1:9 중의 2 mg/ml, pH 7.4) 5 ml 을 첨가하고 진탕하면서 37 ℃ 에서 18 분간 배양했다. 이어서, 1000 rpm 에서 1 분간 원심분리했다. 상청액을 버렸다. 2번째 소화 단계에서, 콜라게나제 용액 (1 mg/ml) 5 ml 을 4 분간 배양하고, 진탕한 후 소화되지 않은 조직을 침전시킨다. 상청액을 버리고, 전체 과정을 4∼5 회 반복했다. 이어서, 상청액을 1000 rpm 에서 1 분간 원심분리하고, 콜라게나제 용액을 버렸다. 남아있는 펠렛을 빙냉 HBBS 로 진탕한 후, 얼음 상에 약 10 분간 침전시켰다. 이러한 세척 과정을 3 회 더 반복했다. 입체 확대경 하에서 연분홍색으로 염색된 섬을 세척한 펠렛으로부터 수집하고 배양 배지 (RPMI 1640 (Gibco) 100 ml, 글루타민 1 ml, 페니실린 1 ml, Cibrobay 항생제 (Bayer) 1 ml, 송아지 태아 혈청 10 ml, 1M Hepes 완충액 2 ml) 로 옮겼다. 가능한 한 순수한 배양액을 얻기 위해, 2∼3 회 섬을 수집하고 신선한 배양 배지로 옮겼다.

섬의 자극

배양 배지로부터 수집한 섬 세포를, 에펜도르프 튜브 당 섬 10 개의 양으로 자극 완충액 (NaCl 118 mM, NaH₂PO₄ 0.2 mM, MgCl₂ 0.565 mM, CaCl₂ 1.25 mM, KCl 4.7 mM, Hepes 10 mM, BSA 1 %, 글루코스 3.3 mM; pH 7.4) 200 ml 을 함유한 에펜도르프 튜브에 나누어 담고, 37 ℃ 에서 1 시간 동안 배양기에 두었다. 이어서, 시험할 펩티드를 첨가하고 자극 완충액으로 500 ml 를 채운 다음, 37 ℃ 에서 1 시간 동안 배양했다. 이 섬들을 1000 rpm 에서 1 분간 원심분리했다. 인슐린-RIA (DPC Biermann, Nauheim) 를 사용하여 상청액 중에서 C-펩티드의 양을 측정했다. 각 시험 물질을 4 회씩 (quadruplicate) 에서 측정했다.

엑센딘 유사체의 활성

단리된 섬 세포에 대해 상술한 것과 같이, 엑센딘 유사체 여러 개의 인슐린 분비 활성을 시험했다. 데이터를 예로서 하기 표에 나타낸다.

글루코스 10 mM 의 존재하에 1 시간 후, 단리된 섬으로부터 방출된 인슐린 [mIU/h/10 섬] :

	대조	GLP1-(7-36)-NH₂	서열 번호 84
10 mM 글루코스	30.21
10^-7 (10 mM 글루코스)		53.52	48.94
10^-8(10 mM 글루코스)		42.78	41.72
10^-9(10 mM 글루코스)		29.99	38.76
10^-10(10 mM 글루코스)			35.05

비 췌장의 B 세포내의 세포질 칼슘 농도의 증가 측정 (클로날 B 세포주 INS-1)

INS-1-세포의 배양 (Asfari, M., 1992) :

INS-1 세포를, FCS 10 %, HEPES 완충액 (pH 7.4) 10 mM, L-글루타민 2 mM, 페니실린 100 i.U. /ml, 스트렙토마이신 100 μg/ml, 피루브산 나트륨염 1 mM, 및 2-메르캅토에탄올 50 μM 을 함유한 RPMI 1640 배지에서 37 ℃, 95 % 공기 및 5 % 이산화탄소의 대기하에 배양했다. 6∼8 일간 플라스틱 세포 배양 플레이트에서 배양시킨 후, 아융합 세포를 PBS (포스페이트 완충 식염수) 로 한번 헹군 다음, 0.025 % 트립신 및 0.27 mM EDTA 를 함유한 등장 식염수로 37 ℃ 에서 4 분간 배양시킴으로써 기판으로부터 분리시켰다.

칼슘 측정을 위한 세포의 제조 :

분리한 세포를 Spinner 배지 (FCS 5 % 및 HEPES 25 mM 을 함유한 것외에는 상기와 같은 배양 배지) 에 재현탁시키고, 교반 막대가 장착된 Spinner 병에서 2 시간 30 분 동안 배양했다. 이어서, 원심분리에 의해 배지를 제거하고, 세포를 Spinner 배지에 재현탁시켰다. 이어서, 상기와 동일한 조건하에 2 μM Fura-2/아세톡시메틸 에스테르와 37 ℃ 에서 30 분간 배양했다. Spinner 배지를 세포로부터 세척하여 세포의 Fura 로딩을 종료시켰다 (실온). 이어서, 세포를 실온에서 Spinner 배지에 재현탁시켰다 (2 x 107 세포/ml). 이어서, 칼슘 측정을 위해 현탁액으로부터 세포를 제거했다.

세포질 칼슘 농도의 측정 :

NaCl 136 mM, KCl 4.8 mM, CaCl₂ 2 mM, MgSO₄ 1.2 mM, KH₂PO₄ 1.2 mM, NaHCO₃ 5 mM, 글루코스 10 mM, 술핀피라존 250 μM (Fura-2 가 배지로 유입되는 것을 방지), 및 HEPES 완충액 25 mM 을 함유한 변형 Krebs-Ringer 완충액 (KRBH) (NaOH 로 pH 7.4 로 조절) 중에 37 ℃ 에서 측정했다. 세포 농도는 1∼2 x 106/ml 이었다. 세포 현탁액 1.5 ml 을 37 ℃, 분광비색계 중의 쿠베트 내에서 교반 막대로 교반하여 측정했다. 여기 파장은 340 nm, 방출 파장은 505 nm 이었다. 측정을 끝낼 때, MnCl₂ 50 μM 을, 뒤이어 DTPA (디에틸렌트리아민 펜타아세테이트) 100 μm 을 첨가하여, 세포외 Fura 의 형광을 일시적으로 퀀치함으로써, 측정된 형광에 대한 세포외 형광 인디케이터의 비율을 측정했다. DTPA 를 첨가한 후, 전체 Fura 를 먼저 칼슘 포화시키고, 이어서 칼슘 없는 상태로 전환시켜, 각각의 측정에 있어서 F_max (칼슘 포화 상태) 및 F_min (칼슘 없는 상태) 의 검량치를 측정했다. 이를 위해, Triton X-100 를 0.1 % 첨가하여 세포를 용균시켰다. 고 세포외 칼슘 농도로 접촉시킴으로써 염료를 칼슘으로 포화시켰다. 이어서, 5 mM EGTA (에틸렌비스(옥시에틸렌니트릴로)-테트라아세테이트) 및 20 mM Tris 용액을 첨가하여, 염료를 칼슘 없는 형태로 전환시켰다.

세포질 칼슘 이온 농도를 하기 알고리즘 (R. Tsien 등, Grynkiewicz, G., 1985) 에 따라 계산했다 :

[Ca²⁺]_cyt = ( (F - F_min) / (F_max - F) ) x K_D

(F : 각 측정점의 형광도;

K_D : Fura-2 의 칼슘 복합체의 해리 상수, 225 nM (Grynkiewicz, G., 1985)).

(상기 계산에 앞서, 세포외 Fura 의 존재에 대한 보상을 수행했다. 이를 위해, 망간 첨가에 의해 측정한 형광량 (세포외 Fura) 을 먼저, 측정점의 형광치로부터 뺐다. 그 다음, 이 양을 뺌으로써 F_max 를 교정했다. 끝으로, F_min 에 대한 교정치를 계산했다. 이를 위해 망간의 첨가에 의해 측정한 형광량을 2.24 로 나누었다. 2.24 의 값은 여기 파장 340 nm 에서, 칼슘 포화된 Fura-2 및 칼슘 없는 Fura-2 의 형광치 간의 고유 기계 비례 상수로 결정되었다 (에스테르화되지 않은 유리 Fura-2 로써 측정). 이와 같은 방법으로 교정된 값을 F_min 으로부터 뺐다.)

검측한 펩티드를 CaCl₂ 및 글루코스가 없는 1000 배 농도의 KRBH 용액 (10^-5 M) 으로서 첨가했다.

엑센딘 유사체의 활성

여러 가지 엑센딘 유사체의 생물학적 활성을 상기의 INS-1 세포에 대한 칼슘 분석에서와 같이 시험했다. 데이터를 예로서 도 1 및 표 7 에 나타낸다.

서열 번호	펩티드의 농도 10^-8 M	△[Ca²⁺]_cyt±SD (n=4)
6	[Arg³⁰]-엑센딘-(1-30)-NH₂	64 ± 8 nM
3	[Nle¹⁴, Arg³⁰]-엑센딘-(1-30)-NH₂	63 ± 8 nM
8	[Ala²¹, Arg³⁰]-엑센딘-(1-30)-NH₂	61 ± 11 nM
9	[Ala²⁸, Arg³⁰]-엑센딘-(1-30)-NH₂	65 ± 15 nM
10	[Ala^21,28, Arg³⁰]-엑센딘-(1-30)-NH₂	69 ± 30 nM
	대조: GLP-1-(7-36)아미드	65 ± 10 nM

내분비 췌장의 B 세포 (클로날 B 세포주 INS-1) 에 대한 GLP-1-(7-36)-NH ₂ 와의 경쟁

INS-1-세포 (Asfari, M., 1992) 의 배양

칼슘 농도의 측정 참조

경쟁 실험

분리한 세포를 취하여 Krebs-Ringer 완충액 (25 mM Tris, 120 mM NaCl, 1.2 mM MgSO₄, 5 mM KCl, 1 mM Na-EDTA, 15 mM CH₃COONa, pH 7.4 로 조절, 1 % HSA 및 0.1 % 바시트라신 보충) 에 현탁시켰다. 해당하는 희석액 중에서 검측할 펩티드 30 ml 및 트레이서 (^125I-GLP1-(7-36)-NH₂ 20,000 rpm) 20 ml 를 혼합한 반응 혼합물에 대해, 상기 현탁액으로부터 250 ml 를 각 시간마다 제거했다. 이어서, 37 ℃ 에서 30 분간 배양하고, 13,000 rpm 에서 4 분간 원심분리한 후, 완충액으로 3 회 세척하고, 펠렛에 부착된 방사성 (γ-카운터) 을 측정했다. 시험할 펩티드의 10 가지 다른 희석액 (Krebs-Ringer 완충액 중의 10^-10∼10^-6 M) 으로 배양함으로써 경쟁 곡선을 수득했다.

엑센딘 유사체의 수용체 친화성

데이터를 예로서 하기 표 8 에 나타낸다. GLP-1-(7-36)-NH₂ 를 대조로 사용하였다.

서열 번호	펩티드	Kd_GLP1 ± SD [nM]	Kd ± SD [nM]	Kd/Kd_GLP1
69	[Nle¹⁴, Tyr³⁰]-Ex-3-(1-30)-NH₂	1.04 ± 0.05	0.56 ± 0.08	0.5

참고 문헌

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본 발명의 새로운 펩티드 서열은 인슐린 합성 및 인슐린효과, 특히 목표 조 직, 근육 및 지방조직으로 글루코오스의 흡수 및 위장의 공복에 대한 작용을 갖는다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열 5, 68, 69, 71, 78-82 또는 84-91 중 하나를 가지며, N-말단은 NR₁R₂ (식중 R₁ 은 수소, 아세틸, 트리플루오로아세틸, 아다만틸, Fmoc, Z, Boc, Alloc, C₁-C₆ 알킬, C₂-C₈ 알케닐 또는 C₇-C₉ 아르알킬을 나타내고,

R₂ 는 수소, 아세틸, 트리플루오로아세틸, 아다만틸, Fmoc, Z, Boc, Alloc, C₄-C₆ 알킬, C₂-C₈ 알케닐 또는 C₇-C₉아르알킬을 나타낸다) 를 나타내고,

C-말단은 COR₃ (식중, R₃ 은 OR₄ 이거나 NR₄R₅ (식중, R₄ 는 수소 또는 C₁-C₆ 알킬이고, R₅ 는 수소 또는 C₁-C₆ 알킬이다)이다) 을 나타내는 펩티드 및 이들의 생리학적으로 허용가능한 염 및 에스테르.
제 1 항에 있어서, 인슐린의 방출을 자극하는 펩티드.
통상적인 담체 및 보조 물질외에 제 1 항에서 청구한 1 종 이상의 펩티드를 함유하는, 당뇨병 치료용 약제.
제 1 항에 있어서, 당뇨병 치료용 약제의 제조를 위해 사용되는 펩티드.