KR100571533B1

KR100571533B1 - 신규한 수막염균의 표면 단백질

Info

Publication number: KR100571533B1
Application number: KR1020007006435A
Authority: KR
Inventors: 피크이안리차드안셀름; 제닝스마이클폴; 목슨이.리차드
Original assignee: 더 유니버서티 어브 퀸슬랜드
Priority date: 1997-12-12
Filing date: 1998-12-14
Publication date: 2006-04-14
Anticipated expiration: 2018-12-14
Also published as: CN1284965A; PL205984B1; NO20002990L; US8034358B2; GB9726398D0; US20090270591A1; WO1999031132A1; US20100331537A1; EP1045859A1; CN101684148A; US6197312B1; US6495345B1; CA2314319C; HUP0100094A3; US20050058660A1; TR200001709T2; EP2354230A1; US8067004B2; US20130085262A1; AU1649599A

Abstract

본 발명은 수막염균 유래의 신규한 표면 폴리펩타이드 및 이 단백질을 코딩하는 핵산 및 핵산 서열 유사체에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩타이드 및 핵산을 포함하는 제약학적 조성물 및 수막염균 감염을 치료하고 예방하며 진단하는데 유용한 방법을 개시하고 있다.

수막염, 표면단백질, 나이세리아

Description

신규한 수막염균의 표면 단백질{NOVEL SURFACE PROTEIN OF NEISSERIA MENINGITIDIS}

본 발명은 예를 들면 수막염균(Neisseria meningitidis)에서 얻어지는 신규한 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 진단, 치료용 백신, 예방용 백신, 및 약제의 설계 및/또는 스크리닝하는데 이들을 사용하는 용도에 관한 것이다.

수막염균은 그람음성 세균으로 수막구균성 수막염(meningococcal meningitis) 및 패혈증(septicemia)의 원인 물질(causative agent)이다. 수막염균의 유일한 숙주는 인간으로, 인구의 약 10%가 자각증상이 없는 보균자일 것이다(Caugant, D. 등, 1994, Journal of Clinical Microbiology, 32:323-30).

수막염균은 다당류 캡슐을 발현시킬 수 있으며, 발현된 캡슐의 상태에 따라 세균의 분류가 이루어진다. 수막염균은 A, B, C, 29-E, H, I, K, L, W135, X, Y, 및 Z의 적어도 13가지 이상의 혈청군이 있다. 이중에서 A, B, 및 C의 혈청군이 90%의 수막구균성 질병의 원인이다(Poolman, J.T. 등, 1995, Infectious Agents and Disease, 4:13-28). 혈청군 A 및 C에 대한 백신이 상용화되었지만 혈청군 B의 캡슐형 다당류는 면역원성이 불량하여 인간에 대한 예방기능을 유도하지 않는다.

따라서 이의 다른 막 및 세포외 성분을 백신에 포함하는데 적합한지에 대해 실험하고 있다. 클래스 1, 2, 및 3 (porins) 및 클래스 4(Rmp) 및 5(Opacity 단백질)의 외막 단백질을 예로 포함할 수 있다. 그러나 지금까지 이들 대상 중 어떠한 것도 특히 어린이에 대해서 완전한 보호를 유도할 수 없었다(Romero, J.D., 1994, Clinical Microbiology Review, 7:559-575; Poolman, J.T. 등, 1995 상게 논문).

효과적인 백신을 제조하기 위해서 대부분의 균주에 존재하고 보호 면역반응(세균성 항체)을 유도할 수 있는 수막염균의 성분을 동정하는 것이 필수적이다. 이점에 대해서는 수막염균의 모든 공지의 균주의 99%에서 잘 보존된 22-kDa의 표면 단백질을 개시한 Brodeur 등의 특허(WO 96/29412호 국제공보)를 참조할 수 있다. 정제된 재조합 22 kDa의 표면 단백질을 주사하는 것으로 면역화된 마우스의 80%가 수막염의 치명적인 감염의 진행에 대해 보호되었다. 그러나 이 단백질의 발견에도 불구하고, 이 유기물에 대한 보호효율을 향상하기 위해서 복수의 균주를 잘 보존하고, 수막염균에 대한 면역보호적인 프로파일을 가지고 및/또는 수막염균의 다른 성분과 결합되는 데 사용되는 수막염균의 표면 단백질을 더욱 분리할 필요가 여전히 존재한다.

본 발명자들은 수막염균의 모든 균주에 존재하고 약 62 kDa의 예상 분자량을 가지는 신규한 폴리펩타이드를 코딩하는 신규한 유전자를 발견하였다. 이의 서열 특성, 상동성(homology)에 따라, 이 폴리펩타이드는 부착인자(adhesin)이고, 실험 데이터와 함께 이것은 이후에 설명되는 바와 같이 수막염균에 대한 치료용 및/또는 예방용 백신의 제조에 유용한 표면 단백질을 구성한다는 것을 제안한다.

따라서 본 발명의 하나의 특징은 다음으로 이루어지는 군에서 선택되는 분리된 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 또는 이의 변종 또는 유도체를 제공하고자 하는 것이다: -

(a) SEQ ID NO 2에 따르는 폴리펩타이드;

(b) SEQ ID NO 5에 따르는 폴리펩타이드;

(c) SEQ ID NO 7에 따르는 폴리펩타이드;

(d) SEQ ID NO 9에 따르는 폴리펩타이드;

(e) SEQ ID NO 11에 따르는 폴리펩타이드;

(f) SEQ ID NO 13에 따르는 폴리펩타이드;

(g) SEQ ID NO 15에 따르는 폴리펩타이드;

(h) SEQ ID NO 17에 따르는 폴리펩타이드;

(i) SEQ ID NO 19에 따르는 폴리펩타이드; 및

(j) SEQ ID NO 21에 따르는 폴리펩타이드.

바람직하게, 상기 폴리펩타이드, 단편, 변종, 또는 유도체는 다음으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상에 대해 면역 반응을 일으킨다:

(ⅰ) 수막염균;

(ⅱ) 상기 폴리펩타이드;

(ⅲ) 상기 단편;

(ⅳ) 상기 변종; 및

(ⅴ) 상기 유도체.

본 발명의 다른 특징에 따르면 제1 특징에 따르는 폴리펩타이드, 또는 이의 단편, 또는 상기 단편 또는 폴리펩타이드의 변종 또는 유도체를 코딩하는 분리된 핵산 서열을 제공하는 것이다. 상기 서열은: -

(1) SEQ ID NO 1의 뉴클레오타이드 서열;

(2) SEQ ID NO 3의 뉴클레오타이드 서열;

(3) SEQ ID NO 4의 뉴클레오타이드 서열;

(4) SEQ ID NO 6의 뉴클레오타이드 서열;

(5) SEQ ID NO 8의 뉴클레오타이드 서열;

(6) SEQ ID NO 10의 뉴클레오타이드 서열;

(7) SEQ ID NO 12의 뉴클레오타이드 서열;

(8) SEQ ID NO 14의 뉴클레오타이드 서열;

(9) SEQ ID NO 16의 뉴클레오타이드 서열;

(10) SEQ ID NO 18의 뉴클레오타이드 서열;

(11) SEQ ID NO 20의 뉴클레오타이드 서열;

(12) SEQ ID NO 1, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 및 20 중 하나의 뉴클레오타이드 서열 단편; 및

(13) 상기 서열 중 일부의 뉴클레오타이드 서열 유사체로 이루어진 하나 이상에서 선택되는 것이 바람직하다.

바람직하게 상기 서열은 다음으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상에 대하여 면역반응을 일으키는 산물을 코딩한다:

(ⅰ) 수막염균;

(ⅱ) 상기 제1 특징의 폴리펩타이드;

(ⅲ) 상기 제1 특징의 단편;

(ⅳ) 상기 제1 특징의 변종;

(ⅴ) 상기 제1 특징의 유도체.

본 발명의 또 다른 특징은 상기 서열이 번역 및 전사 조정 핵산에 작동적으로 연결되는 제2 특징에 따르는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 특징은 제3 특징에 따르는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 특징은 제1 특징에 따르는 재조합 폴리펩타이드를 생산하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은: -

(A) 상기 제3 특징에 따르는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하여 상기 재조합 폴리펩타이드를 상기 핵산에서 발현시키는 단계; 및

(B) 상기 재조합 폴리펩타이드를 분리하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 특징은 다음으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상에 결합하는 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다: -

(1) 수막염균;

(2) 상기 제1 특징의 폴리펩타이드;

(3) 상기 제1 특징의 단편;

(4) 상기 제1 특징의 변종; 및

(5) 상기 제1 특징의 유도체.

본 발명의 또 다른 특징은 수막염균을 포함하는 것으로 의심되는 생물학적 샘플에서 수막염균을 검출하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은: -

(A) 환자에서 생물학적 샘플을 분리하는 단계;

(B) 상기 항체 또는 항체 단편을 생물학적 샘플과 혼합하여 혼합물을 형성하는 단계; 및

(C) 상기 혼합물에서 수막염균의 존재를 나타내는 특이적으로 결합된 항체 또는 결합된 항체 단편을 검출하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 특징은 수막염균 세균을 포함하는 것으로 의심되는 생물학적 샘플에서 수막염균 세균을 검출하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은

(Ⅰ) 환자에서 생물학적 샘플을 분리하는 단계;

(Ⅱ) 상기 세균의 존재를 나타내는 상기 샘플에서 제2 특징에 따르는 핵산 서열을 검출하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 특징은 수막염균에 의해 환자의 감염을 진단하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은

(1) 환자에게서 채취한 생물학적 샘플을 본 발명의 폴리펩타이드, 단편, 변종, 또는 유도체와 접촉시키는 단계; 및

(2) 상기 샘플 내에서 상기 폴리펩타이드, 단편, 변종 또는 유도체와 수막염균 항체의 복합물―여기서 상기 복합물은 상기 감염을 지시함―의 존재 또는 부재 를 검사하는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한 상기 제1 특징에 따르는 폴리펩타이드, 제2 특징에 따르는 핵산, 또는 상기의 항체 또는 항체 단편을 생물학적 샘플에서 수막염균 세균을 검출하는 키트에 사용하는 용도에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 특징은 제1 특징에 따르는 분리된 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 또는 이들의 변종 또는 유도체를 포함하는 제약학적 조성물에 관한 것이다.

바람직하게, 상기 조성물은 백신이다.

본 발명의 또 다른 특징은 상기 백신의 제약학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 수막염균에 의한 환자의 감염을 예방하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 특징은 제1 특징에 따르는 폴리펩타이드, 변종, 또는 유도체의 면역활성적 단편을 확인하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은: -

(a) 상기 폴리펩타이드, 변종 또는 유도체의 단편을 생산하는 단계;

(b) 상기 단편을 포유류에 투여하는 단계; 및

(c) 수막염균 및/또는 폴리펩타이드, 변종, 또는 유도체를 특이적으로 결합하는 인자의 생성 및/또는 수막염균 감염에 대한 보호작용을 포함하는 상기 포유류에서 면역반응을 검출하는 단계를 포함한다.

(발명의 상세한 설명)

발명의 명세서 및 첨부한 청구범위에 걸쳐서 달리 정의하지 않는 한, "포함", "포함하는"이라는 용어는 언급된 구성요소 또는 구성요소의 군을 포함하지 만, 이외의 어떠한 구성요소 또는 구성요소의 군을 배제하지 않는 것으로 이해되어야 할 것이다.

폴리펩타이드 서열

본 발명은 SEQ ID NO 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 및 21에 따르는 분리된 폴리펩타이드 또는 이들 각각의 단편, 또는 이의 변종 또는 유도체를 제공한다. 바람직한 실시예에서 본 발명의 폴리펩타이드, 단편, 변종 및 유도체는 수막염균, 상기 폴리펩타이드, 상기 단편, 상기 변종, 및 상기 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상에 대해서 면역 반응을 일으킨다.

SEQ ID NO 2는 이하에서 상세하게 설명되는 바와 같이 수막염 균주 MC58에서 얻어지는 hiaNm 유전자의 약 62 kDa 표면 폴리펩타이드에 해당되는 것이다. SEQ ID NO 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 및 21은 각각 수막염균 균주 BZ10, BZ198, EG327, EG329, H15, H38, H41, P20, 및 PMC21에서 수득되는 뉴클레오타이드 서열에서 유래된 동종의 폴리펩타이드에 해당하는 것이다.

본 발명에서는 "면역 반응을 일으킨다"이라는 단락은 접종되는 포유류에서 상기 폴리펩타이드, 단편, 변종 또는 유도체가 면역반응을 일으킬 수 있는 능력을 의미한다. 상기 반응은 수막염균 및/또는 상기 폴리펩타이드, 단편, 변종 또는 유도체와 특이적으로 결합하거나 및/또는 수막염균 감염에 대한 보호효과를 제공하는 인자의 생산을 포함한다.

"분리된(isolated)"이라는 용어는 천연상태에서 정상적으로 수반되는 성분이 실제적으로 또는 필수적으로 없는 물질을 의미한다.

"폴리펩타이드"라는 용어는 단백질을 포함하는 장쇄 펩타이드를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이 "단편"이라는 용어는 항원 결정기 또는 에피토프를 포함하는 결실 돌연변이 및 예를 들면 적어도 6 이상, 바람직하게는 적어도 10 이상 및 더욱 바람직하게는 적어도 20개 이상의 아미노산의 사슬을 가진 소형 펩타이드를 포함한다. 상기 단편의 6, 7개를 함께 결합할 수도 있다. 이러한 형태의 펩타이드는 종래의 액상 또는 고상의 합성기술을 이용하여 합성하거나 표준 재조합 핵산기술을 통해 얻을 수 있다. 예를 들면 Nicholson 편저의 Blackwell Scientific Publication에 의해 출판된 ""Synthetic Vaccines"에 포함되는 6장의 Atherton 및 Shephard의 "Peptide Synthesis"에서 개시되어 있다. 또한 펩타이드는 본 발명의 폴리펩타이드를 endoLys-C, endoArg-C, endoGlu-C, 및 staphylococcins V8-단백질분해효소와 같은 단백질 분해효소로 소화시켜서 생산할 수도 있다. 소화된 단편은 예를 들면 고성능 액체 크로마토그래프(HPLC) 기술에 의해 정화될 수 있다.

"변종"이라는 용어는 하나 이상의 아미노산이 이종의 아미노산으로 교체되는 폴리펩타이드를 의미한다. 본 발명의 해당 기술분야에서는 일부 아미노산이 폴리펩타이드의 활성 상태를 변경시키지 않고 유사한 특징을 가진 다른 아미노산으로 교체될 수 있다는 것이 잘 알려져 있다(보존적 치환). 본 폴리펩타이드에서 보존적 치환의 예로는 다음의 표와 같이 이루어 질 수 있다:

원래의 잔기	치환의 예
Ala	Ser
Arg	Lys
Asn	Gln, His
Asp	Glu
Cys	Ser
Gln	Asn
Glu	Asp
Gly	Pro
His	Asn, Gln
Ile	Leu, Val
Leu	Ile, Val
Lys	Arg, Gln, Glu
Met	Leu, Ile
Phe	Met, Leu, Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp, Phe
Val	Ile, Leu

작용기에서 실제적인 교환은 표 1에 도시된 것보다 덜 보존적인 치환기를 선택하여 이루어진다. 다른 교체는 비보존적인 치환으로 상대적으로 내성이 적어질 것이다. 일반적으로 폴리펩타이드의 특성에서 가장 큰 변화를 이루어낼 것 같은 치환은 (a) 친수성 잔기(예를 들면 Ser 또는 Thr)가 소수성 잔기(예를 들면 Ala, Leu, Ile, Phe, 또는 Val)로 치환되는 것, (b) 시스테인 또는 프롤린이 다른 잔기로 치환되는 것; (c) 전기적 양성의 측쇄를 가진 잔기(예를 들면 Arg, His, 또는 Lys)가 전기적 음성의 잔기(예를 들면, Glu 또는 Asp)로 치환되는 것; 또는 (d) 대형의 측쇄를 가진 잔기(예를 들면 Phe 또는 Trp)가 소형의 측쇄를 가진 잔기 (예를 들면 Ala, Ser) 또는 측쇄가 없는 잔기(예를 들면 Gly)로 치환되는 것이다.

일반적으로 변종은 SEQ ID NO 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 및 21에서 예로서 나타난 염기 서열과 적어도 75% 이상의 상동성, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 85% 이상, 가장 바람직하게는 적어도 90% 이상의 상동성을 가진 것이다. 상동성은 동일하거나 표 1에서 나타난 보존성 치환을 이루는 아미노산의 개수를 백분율로 표현한 것이다. 상동성은 본 명세서에서 참조되는 GAP(Deveraux 등, 1984, Nucleic Acids Research 12, 387-395)와 같은 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 본 명세서에서 언급된 서열과 동일하거나 실제적으로 다른 길이의 서열은 배열 내에 갭을 삽입하여 비교될 것이다. 상기 갭은 예를 들면 GAP에 의해 사용된 비교 알고리즘에 의해 결정된다. 적합한 변종을 이루는 것은 종래의 기술에 의해 결정될 것이다. 예를 들면 SEQ ID NO 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 및 21에 따르는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산은 예를 들면 전이인자(transposon) 돌연변이 유발인자를 이용한 렌덤 돌연변이 유발인자 또는 위치 지정 돌연변이 유발인자 중 하나를 이용하여 돌연변이될 수 있다. 결과의 DNA 단편은 종래의 기술을 이용하여 이후 E. coli와 같은 적합한 발현 숙주로 클론화되어 원하는 활성을 가지는 클론이 검출된다. 클론이 렌덤 돌연변이 유발기술을 이용하여 유도되는 경우, 양성의 클론은 돌연변이를 검출하기 위해 서열화되어야만 할 것이다. "변종"이라는 용어는 대립유전자의 변종을 자연적으로 발생시키는 것을 포함한다.

"유도체"라는 용어는 변성, 예를 들면 해당 기술 분야에서 알려져 있는 다른 화학 성분과 콘쥬게이션 또는 복합, 또는 후번역 변성기술에 의해 염기 서열에서 유도되는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 유도체는 SEQ ID NO 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 및 21에 따르는 폴리펩타이드 또는 이의 변종에서 아미노산의 결실 및/또는 부가를 포함한다. 상기 유도체는 면역 반응을 유발하는 활성을 유지한다. 아미노산의 "부가"는 폴리펩타이드 또는 이의 변종과 다른 폴리펩타이드 또는 단백질과의 융합을 포함할 수 있다. 이점에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 변종은 더 큰 폴리펩타이드로 혼입될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 상기 더 큰 폴리펩타이드라는 것은 예를 들면 수막염균에 대한 면역활성을 유지하는 것일 것이다. 상기에서 설명된 바와 같은 폴리펩타이드는 예를 들면 수막염균에서 유도되지 않은 추가의 단백질에 융합될 수도 있다. 다른 단백질은 예를 들면 단백질의 정제에 도움을 줄 수 있다. 예를 들면 이점에 대해서 폴리히스티딘 태그 또는 말토오스 결합 단백질이 이하에서 상세하게 설명되는 바와 같이 사용될 수 있다. 또한, 수막염균에 대해 효과적인 면역반응을 유발하거나 다른 변인에 대한 면역 반응을 유발할 수 있다. 다른 가능한 융합 단백질은 면역조절 반응을 유발하는 것이다. 상기 단백질의 특정의 예로는 Protein A 또는 글루타티온 S-전환효소(GST)를 포함한다. 또한, 폴리펩타이드는 캐리어 단백질로 작용하는 경우 올리고당 계통이 백신 성분에 융합될 수도 있다.

본 발명에 의해서 고려되는 다른 유도체는 측쇄에 대한 변경, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 합성 중에 비천연 아미노산 및/또는 이들 유도체의 혼입 및 가교결합제 및 본 발명의 폴리펩타이드, 단편, 및 변종에 대한 형태를 강제하는 기타 방법의 사용을 포함하지만 이것으로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 의해 고려되는 측쇄 변경의 예로는 아세트산 무수물에 의한 아실화; 숙신산 무수물 및 테트라하이드로프탈산 무수물에 의한 아미노기의 아실화; 메 틸아세트이미데이트에 의한 아미딘화; 시아네이트에 의한 아미노기의 카바모일화; 피리독살-5-포스페이트에 의한 리신의 피리독실화에 뒤이은 NaBH₄에 의한 환원; 알데하이드와의 반응으로 환원성 알킬화와 뒤이은 NaBH₄에 의한 환원; 및 2,4,6-트리니트로벤젠 술폰산(TNBS)에 의한 아미노기의 트리니트로벤질화에 의해 아미노기를 변형하는 것을 포함한다.

카르복시기는 o-아실이소우레아 형성에 의해 카보디이미드 활성화와 뒤이은 유도체화에 의해 , 예를 들면 해당 아미드로 변형될 수 있다.

아르기닌 잔기의 구아니딘기는 2,3-부탄디온, 페닐글리옥살 및 글리옥살과 같은 시약으로 헤테로사이클릭 축합산물을 형성하여 변형될 수 있다.

술피드릴기는 시스테인산으로 퍼포름(performic) 산 산화; 4-클로로머쿠리페닐술폰산, 4-클롤로머쿠리벤조에이트; 2-클로로머쿠리-4-니트로페놀, 페닐머쿠리 클로라이드 및 기타 수은제를 이용한 수은의 유도체의 형성; 다른 티올 화합물과 혼합된 디술피드의 형성; 말레이미드, 말레인산 무수물, 또는 기타 치환된 말레이미드와 반응; 아이도아세트산 또는 아이오도아세트아미드와의 카복시메틸화; 및 알칼리 pH에서 시아네이트에 의한 카바모일화와 같은 방법에 의해 변성될 수 있다.

트립토판 잔기는 예를 들면 2-하이드록시-5-니트로벤질 브로마이드 또는 술포닐 할라이드에 의한 인돌 링의 알킬화 또는 N-브로모숙신이미드에 의한 산화에 의해 변성될 수 있다.

티로신 잔기는 3-니트로티로신 유도체를 형성하기 위해 테트라니트로메탄에 의한 질화에 의해 변성될 수 있다.

히스티딘 잔기의 이미다졸 링은 디에틸피로카르보네이트에 의한 N-카르브에톡실화 또는 아이오도아세트산 유도체에 의한 알킬화에 의해 N-카르브에톡실화에 의해 변성될 수 있다.

펩타이드 합성 중에 혼입되는 비천연 아미노산 및 유도체의 예로는 4-아미노산 부티르산, 6-아미노헥산산, 4-아미노-3-하이드록시-5-페닐펜탄산, 4-아미노-3-하이드록시-6-메틸헵탄산, t-부틸글리신, 노어로이신, 노어발린, 페닐글리신, 오르니틴, 사르코신, 2-티에닐 알라닌 및/또는 아미노산들의 D-이성체를 포함하지만 이것으로 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 고려되는 비천연 아미노산의 리스트는 이하의 표 2에 나타나 있다.

비종래의 아미노산	비종래의 아미노산
α-아미노부티르산	L-N-메틸알라닌
α-아미노-α메틸부틸레이트	L-N-메틸아르기닌
아미노사이클로프로판-카르복실레이트	L-N- 메틸아스파라긴
아미노이소부티르산	L-N-메틸아스파르트산
아미노노르보닐-카르복실레이트	L-N-메틸시스테인
사이클로헥실알라닌	L-N-메틸글루타민

사이클로펜틸알라닌	L-N-메틸글루탐산
L-N-메틸이소로이신	L-N-메틸히스티딘
D-알라닌	L-N-메틸로이신
D-아르기닌	L-N-메틸리신
D-아르파르트산	L-N-메틸메타이오닌
D-시스테인	L-N-메틸노어로이신
D-글루타메이트	L-N-메틸노어발린
D-글루탐산	L-N-메틸오르니틴
D-히스티딘	L-N-메틸페닐알라닌
D-이소로이신	L-N-메틸프롤린
D-로이신	L-N-메틸세린
D-리신	L-N-메틸트레오닌
D-메타이오닌	L-N-메틸프립토판
D-오르니틴	L-N-메틸티로신
D-페닐알라닌	L-N-메틸발린
D-프롤린	L-N-메틸에틸글리신
D-세린	L-N-메틸-t-부틸글리신
D-트레오닌	L-노어로이신
D-트립토판	L-노어발린
D-티로신	α-메틸-아미노이소부티레이트
D-발린	α-메틸-γ-아미노부티레이트
D-α-메틸알라닌	α-메틸사이클로헥실알라닌
D-α-메틸아르기닌	α-메틸사이클로펜틸알라닌
D-α-메틸아스파라긴	α-메틸-α-나프틸알라닌
D-α-메틸아스파테이트	α-메틸페니실아민
D-α-메틸시스테인	N-(4-아미노부틸)글리신
D-α-메틸글루타민	N-(2-아미노에틸)글리신
D-α-메틸히스티딘	N-(3-아미노프로필)글리신
D-α-메틸이소로이신	N-아미노-α-메틸부티레이트
D-α-메틸로이신	α-나프틸알라닌
D-α-메틸리신	N-벤질글리신
D-α-메틸메타이오닌	N-(2-카르바밀에디일)글리신
D-α-메틸오르니틴	N-(카르바밀메틸)글리신
D-α-메틸페닐알라닌	N-(2-카르복시에틸)글리신
D-α-메틸프롤린	N-(카르복시메틸)글리신
D-α-메틸세린	N-사이클로부틸글리신
D-α-메틸트레오닌	N-사이클로헵틸글리신
D-α-메틸트립토판	N-사이클로헥실글리신
D-α-메틸티로신	N-사이클로데실글리신

L-α-메틸로이신	L-α-메틸리신
L-α-메틸메타이오닌	L-α-메틸노어로이신
L-α-메틸노어발린	L-α-메틸오르니틴
L-α-메틸페닐알라닌	L-α-메틸프롤린
L-α-메틸세린	L-α-메틸트레오닌
L-α-메틸트립토판	L-α-메틸티로신
L-α-메틸발린	L-N-메틸호모페닐알라닌
N-(N-(2,2-디페닐에틸 카르바밀메틸)글리신	N-(N-(3,3-디페닐프로필 카르바밀메틸)글리신
1-카르복시-1-(2,2-디페닐-에틸 아미노)사이클로프로판

본 발명은 또한 인간에서 면역원으로 작용시키기 위해서 디니트로페놀에 의해 본 발명의 폴리펩타이드, 단편, 또는 변종을 공유결합적으로 변형시키는 것을 고려한다.

바람직하게 본 발명은 SEQ ID NO 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 및 21에 따르는 폴리펩타이드 중 하나로부터 선택되는 폴리펩타이드를 포함한다.

본 발명의 폴리펩타이드는 당업자에게 공지된 적합한 공정에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면 폴리펩타이드는 다음의 단계:

(a) SEQ ID NO 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 및 21 중 어느 하나에 따르는 폴리펩타이드, 또는 이의 단편, 또는 이들의 변종 또는 유도체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열―여기서 뉴클레오타이드 서열은 전사 및 번역 조절 핵산에 작동적으로 연결됨―을 포함하는 재조합 핵산을 제조하는 단계;

(b) 재조합 핵산으로 적합한 숙주 세포를 감염하거나 또는 형질전환하는 단계;

(c) 상기 재조합 핵산에서 유래된 재조합 폴리펩타이드를 발현하기 위해 숙주 세포를 배양하는 단계; 및

(d) 재조합 폴리펩타이드를 분리하는 단계를 포함한다.

상기 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO 1, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 및 20으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하다.

"재조합 폴리펩타이드"는 재조합 기술, 즉 재조합 핵산의 발현을 통해 제조된 폴리펩타이드를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 "재조합 핵산"이라는 용어는 실험실 내에서 핵산을 자연에서 정상적으로 발견되지 않는 형태로 조작하여 형성된 핵산을 의미하는 것이다. 이러한 관점에서, 재조합 핵산은 플라스미드와 같은 염색체외부의 자기복제 벡터 또는 숙주 게놈으로 통합되는 벡터중 하나인 발현 벡터를 포함하는 것이 바람직하다. 일반적으로 이러한 발현 벡터는 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결되는 전사 및 번역 조절 핵산을 포함한다.

"작동적으로 연결되는(operably linked)"이라는 용어는 전사 및 번역 조절 핵산이 전사가 개시될 수 있는 방식으로 상기 뉴클레오타이드, 단편, 변종, 또는 유도체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 관련된 위치로 정해진다는 것을 의미한다. 전사 및 번역 조절 핵산은 일반적으로 발현에 사용된 숙주 세포에 적합할 것이다. 다양한 형태의 적합한 발현 벡터 및 적합한 조절서열은 다양한 숙주 세포에 대해서 해당 분야에서 공지되어 있다.

통상적으로, 전사 및 번역 조절 핵산은 프로모터 서열, 리더 또는 시그널 서열, 리보좀 결합 자리, 전사 개시 및 종료 서열, 번역 개시 및 종료 서열, 및 촉진자 또는 활성자 서열을 포함하지만 이것으로 제한되는 것은 아니다.

공지된 구조적 또는 유도가능한 프로모터는 본 발명에 의해 고려된다. 이 프로모터는 천연적으로 발생하는 프로모터이거나 하나 이상의 프로모터의 인자와 결합한 하이브리드 프로모터일 것이다.

바람직한 실시예에서, 발현벡터는 선택가능한 마커 유전자를 포함하여 형질전환된 숙주 세포의 선택을 허용한다. 선택 유전자는 해당 기술분야에 잘 공지된 것으로 사용된 숙주 세포에 따라 달라질 것이다.

발현 벡터는 또한 융합 파트너(통상적으로 발현 벡터에 의해 제공됨)를 포함하여 본 발명의 재조합 폴리펩타이드가 상기 융합 파트너와 함께 융합 폴리펩타이드로 발현된다. 융합 파트너의 주요한 장점은 상기 융합 폴리펩타이드의 동정 및/또는 정제를 도와준다는 것이다.

상기 융합 폴리펩타이드를 발현시키기 위해서, 본 발명에 따르는 뉴클레오타이드 서열을 발현 벡터로 이동시켜 융합 파트너의 번역 해독 프레임과 본 발명의 뉴클레오타이드 서열이 일치하도록 하는 것이 필수적이다.

융합 파트너의 잘 공지된 예는 친화력 크로마토그래피에 의해 융합 폴리펩타이드의 분리에 특히 유용한 글루타티온-S-트렌스퍼라제(GST), 인간 IgG의 Fc 포션, 말토즈 결합 단백질(MBP) 및 헥사히스티딘(HIS₆)을 포함하지만 이것으로 제한되는 것은 아니다. 친화성 크로마토그래피에 의해 융합 폴리펩타이드 정제의 목적을 달성하기 위해서, 친화성 크로마토그래피의 해당 매트릭스는 각각 글루타티온-, 아밀로즈-, 및 니켈-, 또는 코발트-컨쥬게이트된 수지이다. 상기와 같은 다수의 매트릭스는 (HIS₆) 융합 파트너와 함께 사용가능한 QIAexpress™ 시스템(Qiagen) 및 Pharmacia GST 정제 시스템과 같은 "키트(kit)"의 형태가 사용가능하다.

해당 기술분야에서 잘 알려진 다른 융합 파트너는 녹색의 형광 단백질(GFP)이다. 이 융합 파트너는 본 발명의 융합 폴리펩타이드를 형광의 현미경 검사 또는 흘림 세포계측법(flow cytometry)에 의해 확인하도록 하는 형광의 "태그"로 작용한다. GFP 태그는 본 발명의 융합 폴리펩타이드의 세포내 국부화(subcellular localization)를 검사하는 경우 또는 본 발명의 융합 폴리펩타이드를 발현하는 세포를 분리하는 경우 유용하다. 형광 활성화된 세포 소팅(FACS)과 같은 흐름 세포계측법은 후자의 용도에서 특히 유용한 것이다.

바람직하게 융합 파트너는 Factor X_a 또는 트롬빈과 같은 해당 단백질 분해효소가 본 발명의 융합 폴리펩타이드를 부분적으로 소화하도록 하여 본 발명의 재조합 폴리펩타이드를 유리하는 단백질 분해효소 분열자리를 가진다. 유리된 폴리펩타이드는 이후 크로마토그래피 분리에 의해 융합 파트너로부터 분리될 수 있다.

본 발명에 따르는 융합 파트너는 또한 이의 범위 내에 특정 항체가 사용되는 통상적으로 소형의 펩타이드 서열인 "에피토프 태그"를 포함한다. 특정 모노클로날 항체가 사용되는 에피토프 태그의 잘 공지된 예에는 c-myc, 인플루엔자 바이러스 해모글루티닌 및 FLAG 태그를 포함한다.

본 발명의 재조합 폴리펩타이드는 본 발명에 따르는 폴리펩타이드, 단편, 변종, 또는 유도체를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 생산될 수 있다. 단백질 발현에 적합한 조건은 발현 벡터 및 숙주 세포의 선택에 따라 변경될 것이다. 이것은 당업자가 정규적인 실험에 의해 용이하게 체득된다.

발현에 적합한 숙주 세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다. 본 발명에 따르는 폴리펩타이드의 발명에 바람직한 숙주 세포 중 하나는 세균이다. 사용된 세균은 Escherichia coli일 수 있다. 또한, 숙주 세포는 예를 들면 바쿨로 바이러스(baculovirus) 발현 시스템으로 활용되는 SF9 세포와 같은 곤충의 세포일 수 있다.

재조합 단백질은 예를 들면 본 명세서에서 참고문헌으로 인용되는 Sambrook 등의 MOLECULAR CLONING. A LABORATORY MANUAL(Cold Spring Harbor Press, 1989)의 Section 16 및 17; 본 명세서에서 참고문헌으로 인용되는 Ausubel 등의 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (John Wiley & Sons, Inc. 1994-1998)의 Chapter 10 및 16; 및 본 명세서에서 참고문헌으로 인용되는 Coligan 등의 CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE(John Wiley & Sons, Inc. 1995-1997)의 Chapter 1, 5, 및 6에 개시된 바와 같은 표준의 프로토콜에 의해 용이하게 당업자에 의해 제조될 수 있다.

뉴클레오타이드 서열

본 발명은 또한 상기에 정의된 바와 같은 폴리펩타이드, 단편, 변종, 또는 유도체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 상기 서열은 SEQ ID NO 1, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 ,18, 및 20; SEQ ID NO 1, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 및 20 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열 단편; 및 상기 서열의 뉴클레오타이드 서열 유사체로 이루어진 군에서 선택되는 것이, 바람직하다. 바람직하게, 이들 서열은 상기 정의된 면역 반응을 유발하는 산물을 코딩한다.

이하에서 보다 상세하게 설명되는 바와 같이 SEQ ID NO 1은 수막염균 균주 MC58에서 얻어진 hiaNm 유전자에 해당한다. 이 유전자는 신규한 SEQ ID NO 2의 62 kDa 표면 폴리펩타이드를 코딩한다. SEQ ID NO 3은 MC58 균주의 hiaNm 개시 탐독 프레임 서열인 HiaNm에 해당한다. SEQ ID NO 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 및 20은 각각 수막염균 균주 BZ10, BZ198, EG327, EG329, H15, H38, H41, P20, 및 PMC21으로부터 얻어진 동일한 hiaNm 개시 탐독 프레임에 해당한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같은 "뉴클레오타이드 서열"이라는 용어는 mRNA, RNA, cRNA, cDNA, 또는 DNA로 정해진다.

"뉴클레오타이드 서열 유사체"이라는 용어는 대체로 가혹한 조건하에서 본 발명에 따르는 야생형 뉴클레오타이드 서열과 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 의미하는 것이다. 적합한 혼성화 조선은 이하에서 논의될 것이다.

본 발명의 뉴클레오타이드 서열 유사체는 다음의 단계:

(ⅰ) 적합한 숙주로부터 핵산 추출물을 수득하는 단계;

(ⅱ) 선택적으로 퇴화하는 프라이머들―여기에서 프라이머 각각은 본 발명의 야생형 뉴클레오타이드의 일부를 포함함―을 제조하는 단계; 및

(ⅲ) 핵산 증폭 기술을 이용하여 상기 핵산 추출물로부터 하나 이상의 증폭산물을 증폭하는데 상기 프라이머를 사용하는 단계에 따라 제조될 수 있다.

숙주는 세균인 것이 바람직하다. 바람직하게 숙주는 나이세리아 속에서 유래된 것으로 더욱 바람직한 것은 수막염균(N. meningitidis)에서 유래된 것이다.

바람직하게, 프라이머는 다음으로 이루어진 군에서 선택되는 것이다:-

(1) 5'-TTAGATTCCACGTCCCAGATT-3' (SEQ ID NO 22);

(2) 5'-CTTCCCTTCAAACCTTCC-3' (SEQ ID NO 23);

(3) 5'-GGTCGCGGATCCATGAACAAAATATACCGCAT-3' (SEQ ID NO 24);

(4) 5'-TCACCCAAGCTTAAGCCCTTACCACTGATAAC-3' (SEQ ID NO 25);

(5) 5'-CCAAACCCCGATTTAACC-3' (SEQ ID NO 26);

(6) 5'-AATCGCCACCCTTCCCTTC-3' (SEQ ID NO 27);

(7) 5'-TTTGCAACGGTTCAGGCA-3' (SEQ ID NO 28);

(8) 5'-TATTCAGCAGCGTATCGG-3' (SEQ ID NO 29);

(9) 5'-TGCCTGAACCGTTGCAAA-3' (SEQ ID NO 30); 및

(10) 5'-CCGATACGCTGCTGAATA-3' (SEQ ID NO 31).

적합한 핵산 증폭 기술은 당업자에게 공지된 것으로 본 명세서에서 인용되는 Ausubel 등(1994-1998, 상게 문헌 Chapter 15)에 개시된 바와 같은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR); 본 명세서에서 인용되는 미합중국 특허 제5,422,252호에 개시된 바와 같은 표준 대체증폭(SDA); 본 명세서에서 인용되는 Liu 등(1996, J. Am. Chem. Soc. 118:1587-1594 및 국제 출원 공보 WO 92/01813) 및 Lizardi 등(국제 출원 공보 WO 97/19193호)에 개시된 바와 같은 회전 환 복제(RCR); 본 명세서에서 인용되는 Sooknanan 등(1994, Biotechniques 17: 1077-1080)에 개시된 바와 같은 핵산 서열 계통 증폭(NASBA); 및 본 명세서에서 인용되는 Tyagi 등(1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 5395-5400)에 의해 개시된 바와 같은 Q-β리플리카아제 증폭을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "증폭 산물"은 핵산 증폭기술에 의해 생성되는 핵산 산물을 의미한다.

"혼성화" 또는 "하이브리다이제이션"이라는 용도는 DNA-DNA 하이브리드, DNA-RNA 하이브리드, 또는 RAN-RNA 하이브리드를 제조하기 위한 독특한 뉴클레오타이드 서열의 상보적인 염기의 짝짓기를 의미하는 것이다.

DNA에서 상보적인 염기는

(ⅰ) A와 T; 및

(ⅱ) C와 G이다.

RNA에서 상보적인 염기는

(ⅰ) A와 U; 및

(ⅱ) C와 G이다.

RNA-DNA 하이브리드에서 상보적인 염기는

(ⅰ) A와 U;

(ⅱ) A와 T; 및

(ⅲ) G와 C이다.

통상적으로 실제적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드가 매트릭스(바람직하게 니트로셀룰로즈와 같은 합성막)상에서 고정되는 단계, 혼성화 단계 및 검출 단계를 포함하는 블로팅 기술에 의해 확인되는 것이 통상적이다. 써던 블로팅법은 상보적인 DNA 서열을 확인하는 데 이용되고; 노던 블로팅법은 상보적인 RNA 서열을 확인하는 데 사용된다. 도트 블로팅 및 슬롯 블로팅법은 상보적인 DNA/DNA, DNA/RNA 또는 RNa/RNA 폴리뉴클레오타이드 서열을 확인하는데 사용될 수 있다. 상기 기술은 당업자에게 잘 공지된 것으로 Ausubel 등(1994-1998, 상게 문헌)의 페이지 2.9.1 내지 2.9.20에 개시되어 있다.

상기 방법에 따르면, 써던 블로팅은 겔 전기영동에 의해 크기에 따라 DNA 분자를 분리하는 단계; 합성 막으로 크기에 따라 분별된 DNA를 합성막으로 이동시키는 단계; 및 DNA와 결합된 막을 상보적인 뉴클레오타이드 서열로 혼성화시키는 단계를 포함한다. 도트 블로팅 및 슬롯 블로팅에서 DNA 샘플은 상기와 같은 혼성화 전에 합성막에 직접 적용된다.

대체적인 블로팅 단계는 플라크 또는 콜로니 혼성화의 공정에 의해 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리에서 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 동정하는 경우 사용된다. 이 과정의 통상적인 예는 Sambrook 등(1989, 상게 문헌) Chapter 8-12에 개시되어 있다.

통상적으로 다음의 일반적인 방법을 혼성화 조건을 결정하기 위해서 사용할 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은 상기에서 설명한 바와 같이 합성막으로 블로팅되고 이동된다. 본 발명의 야생형 뉴클레오타이드 서열은 상기에서 설명한 바와 같이 표지되고 이 표지된 뉴클레오타이드 서열의 고정화된 뉴클레오타이드 서열으로 혼성화하는 능력이 분석된다.

당업자라면 다수의 인자가 혼성화에 영향을 미친다는 것을 인지할 것이다. 방사선 표지된 폴리뉴클레오타이드 서열의 특이적 활성은 검출이능한 시그널을 제공하기 위해서 통상적으로 약 10⁸ dpm/㎎ 이상이여야 한다. 10⁸ 내지 10⁹ dpm/㎎의 특이적 활성의 방사선 표지된 뉴클레오타이드 서열은 약 DNA 0.5 pg를 검출할 수 있다. 해당 기술분야에서는 충분한 DNA가 검출이능하도록 막에 고정화되어야만 한다는 것을 잘 알고 있다. 과잉의 고정화된 DNA, 통상적으로 10㎍을 가지는 것이 바람직하다. 10 %(w/v) 덱스트란 설페이트(MW 500,000) 또는 폴리에틸렌 글리콜 6000과 같은 불활성 폴리머를 추가하는 것은 혼성화의 감응성을 증가시킬 수 있다(Ausubel의 상게 문헌 2.10.10 참조).

막에 고정된 뉴클레오타이드 서열과 표지된 뉴클레오타이드 사이의 혼성화에서 의미있는 결과를 달성하기 위해서, 충분한 함량의 표지된 뉴클레오타이드 서열은 세정 이후에 고정화된 뉴클레오타이드 서열에 혼성화되어야만 한다. 세정은 표지된 뉴클레오타이드 서열이 바람직한 정도의 상보성으로 고정화된 뉴클레오타이드 서열으로만 혼성화된다는 것을 확신한다.

본 명세서에서 사용된 "가혹(stringency)"라는 용어는 혼성화도중의 온도 및 이온 강도 조건, 및 특정 유기 용매의 존재 및 부재를 의미하는 것이다. 가혹도가 높을수록 고정된 뉴클레오타이드 서열과 표지된 폴리뉴클레오타이드 서열의 상보성의 정도가 높아질 것이다.

"가혹 조건"은 높은 상보적인 염기를 가지는 뉴클레오타이드 서열이 혼성화되는 조건을 의미하는 것이다.

통상적인 가혹 조건은 예를 들면 (1) 42℃에서 30동안 0.75M 이염기의 인산나트륨/0.5 M 단염기 인산나트륨/1 mM 이나트륨 EDTA/1% 사르코실; 또는 (2) 42℃에서 적어도 30분 이상 6.0 M 우레아/ 0.4% 소디움 라우릴 설페이트/0.1x SSC; 또는 (3) 약 68℃에서 적어도 20분간 0.1x SSC/0.1%의 SDS; 또는 (4) 약 55℃에서 약 60분동안 1x SSC/ 0.1% SDS; 또는 (5) 약 62℃에서 약 60분동안 1x SSC/ 0.1% SDS; 또는 (6) 약 68℃에서 약 60분동안 1x SSC/ 0.1% SDS; 또는 (7) 약 55℃에서 약 60분동안 0.2x SSC/ 0.1% SDS; 또는 (8) 약 62℃에서 약 한시간 동안 0.2x SSC/ 0.1% SDS; 또는 (9) 약 68℃에서 약 60분동안 0.2x SSC/ 0.1% SDS를 포함한다. 자세한 실례는 본 명세서에서 인용되는 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 2.10.1 내지 2.10.16 페이지 및 Sambrook 등, MOLECULAR CLONING. A LABORATORY MANUAL(Cold Spring Harbour Press, 1989) 1.101 내지 1.104를 참조할 수 있다.

가혹한 세척은 통상적으로 42℃ 내지 68℃에서 실행되지만, 당업자들은 다른 온도에서도 가혹 조건에 적합할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 최대의 혼성화는 DNA-DNA 하이브리드의 형성을 위한 Tm 이하의 통상적으로 약 20℃ 내지 25℃에서 이루어진다. Tm은 용융 온도 또는 2개의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열이 분리되는 온도라는 것은 공지된 것이다. Tm의 예측 방법은 공지된 것이다(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 2.10.8 참조). 최대의 혼성화는 DNA-RNA 하이브리드의 Tm 약 10℃ 내지 15℃이하에서 이루어진다.

다른 가혹 조건은 본 기술 분야에서 공지된 것이다, 당업자는 다양한 인자가 혼성화의 특이성을 최적화하도록 조정될 수 있다. 최종 세척의 가혹성의 최적화는 고도의 혼성화를 보장할 수 있다.

고정화된 뉴클레오타이드 서열로 혼성화되는 표지된 뉴클레오타이드 서열을 검출하는 방법은 해당기술에서 기술자에게 잘 공지된 것이다. 이러한 방법으로는 방사선 자동사진법(autoradiography), 화학발광분석법(chemiluminescent), 형광분 석법 및 색채계 분석법을 포함한다.

항체

본 발명은 또한 상술한 폴리펩타이드, 단편, 변종 및 유도체에 대한 항체에 관한 것이다. 이러한 항체들은 본 발명의 폴리펩타이드, 단편, 변종 또는 유도체에 결합하거나 또는 접합(conjugate)하는 적합한 항체라면 어떠한 것도 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 항체는 다중클론 항체(polyclonal antibody)일 수 있다. 상기 항체는 다중클론 항혈청을 얻기 위하여, 본 발명의 폴리펩타이드, 단편, 변종 또는 유도체를 마우스 또는 토끼를 포함하는 생산 종에 주입하여 제조할 수 있다. 다중클론 항체를 제조하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 사용될 수 있는 대표적인 프로토콜(protocol)은 예를 들어 본 명세서에서 인용참조된 Coligan 등의 CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY(John Wiley & Sons, Inc, 1991)과 Ausubel 등의(1994-1998, 상기 문헌)의 특히 11장의 Ⅲ절에 설명되어 있다.

상기 생산 종에서 얻어진 다중클론 항혈청 대신에, 단클론 항체를 일반적인 방법, 예를 들어 본 명세서에서 인용참조된 Koeler 및 Milstein의 논문에 기재된 것과 같은 표준 방법(1975, Nature 256, 495-497) 또는 이를 가장 최근에 변형한 방법, 예를 들어 Coligan 등(1991, 상기 문헌)이 기술한, 본 발명의 폴리펩타이드, 단편, 변종 또는 유도체 중 하나 이상이 접종된 생산 종으로부터 유도된 비장 또는 다른 항체 생산 셀을 불사화(immortalizing)하는 것과 같은 방법을 사용하여 제조할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 언급한 다중클론 또는 단클론 항체의 Fc 또는 Fab 절편 을 포함하는 항체도 본 발명의 범위에 포함한다. 이와 달리 상기 항체는 본 발명의 폴리펩타이드에 대한 단일 사슬 Fv 항체(scFvs)를 포함할 수 있다. 상기 scFvs는 예를 들어 미국 특허 제 5,091,513 호, 유럽 특허 제 239,400 호 또는 본 명세서에서 인용참조된 Winter 및 Milstein의 논문(1991, Nature, 349, 293)에 각가 기술된 방법에 따라 제조될 수 있다.

본 발명의 항체는 천연 또는 재조합체 N. meningitidis 폴리펩타이드를 분리하는데 있어서 친화성 크로마토그래피에 사용될 수 있다. 예를 들어, Coligan 등이 기술한 문헌 9.5장에 기술되어있는 면역친화성 크로마토그래픽 방법을 참조 문헌으로 들 수 있다(1995-1997, 상기 문헌).

상기 항체는 본 발명의 변종 폴리펩타이드에 대한 스크린 발현 라이브러리(screen expression library)에 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는 또한 이후에 설명할 N. meningitidis 감염을 검출하는데 사용될 수 있다.

N. meningitidis 검출

환자에서 N. meningitidis의 존재여부는 환자로부터 생물학적인 시료를 분리하고, 이 생물학적인 시료와 상술한 항체 또는 항체 절편을 혼합하여 혼합물을 형성한 후, 상기 시료에서 N. meningitidis의 존재를 나타내는 혼합물 중에 특이하게 결합된 항체, 또는 결합된 절편을 검출하여 측정할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "생물학적인 시료"는 환자로부터 추출되거나, 처리되지 않거나, 처리되거나, 희석되거나 농축된 시료를 말한다. 적합하게는, 상기 생물학적인 시료는 전 혈액, 혈청, 플라즈마, 타액, 땀, 소변, 복수(ascitic fluid), 복막 액(peritoneal fluid), 활액(synovial fluid), 양수(amniotic fluid), 뇌척수액(cerebrospinal fluid), 피부 생검(skin biopsy) 등으로 이루어진 군에서 선택된다.

상기 복합물의 형성을 측정하는 적절한 기술은 어떠한 것도 사용될 수 있다. 예를 들어, 이것과 관련된 표지를 갖는 본 발명에 따른 항체 또는 항체 단편을 면역분석법(immunoassay)에 활용할 수 있다. 이러한 면역 분석법은 당업자에게 잘 알려진 방사면역측정법(radioimmunoassay), 효소-연결된 이뮤노솔벤트 분석(immuNOorbent assay: ELISAs) 및 면역크로마토그래픽 방법(ICTs)을 포함하나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 각종 면역분석법이 기술된 "CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY"(1994)를 참조 문헌으로 들 수 있다. 면역분석법은 당 분야에서 이해될 수 있는 것과 같은 경쟁 분석법을 포함할 수 있다.

상기 항체 또는 항체 단편과 관련된 표지는

ⅰ. 표지를 상기 항체 또는 항체 단편에 대하여 직접 부착;

ⅱ. 표지를 상기 항체 또는 항체 단편에 대하여 간접 부착, 예를 들어, 상기 표지를 연속적으로 상기 항체 또는 항체 단편에 결합하고, 다른 분석 시약에 부착하는; 및

ⅲ. 상기 항체 또는 항체 단편의 연속적인 반응 생산물에 부착하는 방법에 포함될 수 있다.

상기 표지는 크로모겐, 촉매, 효소, 형광체(fluorophore), 화학루미네센스 분자(chemiluminescent molecule), 유로피움(Eu³⁴)와 같은 란타나이드 이온, 방사성 동위 원소 및 직접 시각 표지를 포함하는 군에서 선택될 수 있다.

직접 시각 표지의 경우에 있어서, 콜로이드 금속성 또는 비-금속성 입자, 염료 입자, 효소 또는 기질, 유기 고분자, 라텍스 입자, 리포좀 또는 기질을 생산하는 시그널을 함유하는 다른 비히클 등의 용도로 사용될 수 있다.

표지로서 사용하기에 적합한 많은 효소가, 본 명세서에서 인용 참조된 미국 특허 제 4,366,241 호, 미국 특허 제 4,843,000 호 및 미국 특허 제 4,849,338 호에 기술되어 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 효소 표지는 알칼린 포스파타아제, 홀스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase), 루시퍼라제, β-갈락토시다제, 글루코스 옥시다제, 라이소자임, 말레이트 디하이드로지나제 등이 포함된다. 상기 효소 표지는 단독으로 또는 용액에 용해된 제 2 효소와 결합하여 사용할 수 있다.

적당하게, 상기 플루오로포어는 플루오르세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate: FITC), 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트(tetramethylrhodamine isothiocyanate: TRITL) 또는 R-피코에리트린(R-Phycoerythrin: RPE)을 포함하는 군에서 선택된다.

본 발명은 또한, N. meningitidis에 의한 환자의 감염을 검출하는 방법까지도 포함하는데, 이 방법은 환자로부터 얻은 생물학적인 시료를 본 발명의 폴리펩타이드, 단변, 변종 또는 유도체와 접촉시키고 상기 혈청에서 상기 폴리펩타이드, 단 편, 변종 또는 유도체 및 N. meningitidis-특이 항체 사이의 복합체의 존재 여부를 결정하는 공정을 포함하는데, 여기에서 상기 복합체의 존재는 감염을 나타내는 것이다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 복합체의 검출은 상기 폴리펩타이드, 단편, 변종 또는 유도체를 당 분야에서 잘 알려진 적당한 표지를 사용하여 검출되게 변형하고 상술 예에서와 같이 적당한 면역분석법에서 상기 변형된 화합물을 사용하여 실시한다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 N. meningitidis 박테리아를 함유하는 것으로 짐작되는 생물학적인 시료에서 상기 박테리아를 검출하는 방법을 제공하며, 이 방법은 환자로부터 상기 생물학적인 시료를 분리하고, 상기 시료에서, 상기 박테리아의 존재를 나타내는 본 발명에 따른 핵산 서열을 검출하는 공정을 포함한다.

상기 핵산 서열의 검출은 적합한 기술이면 어떠한 것도 사용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 표지된 핵산 서열은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 것처럼 환자로부터 얻어진 핵산 추출물의 써던 블럿(Southern blot)에서 탐침(probe)으로서 사용될 수 있다. 이와 달리, 본 발명에 따른 표지된 핵산 서열은 환자로부터 얻은 RNA 추출물의 노던 블럿(Northern blot)에서 탐침으로 사용될 수 있다. 바람직하게, 환자로부터 얻은 핵산 추출물은 본 발명에 따른 핵산 서열의 감각과 비감각(antisense) 서열에 상응하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 또는 얘를 들어 본 명세서에서 인용 참조된 국제 특허 출원 제 WO89/09385호에 기술되어 있는 PCR과 같은 핵산 증폭 반응에서 또는 리가제 사슬 반응(LCR)에서 이들의 플랭킹 서열(flanking sequence)과 함께 사용하는 것이다. 다양한 자동화된 고상 검출 기술(automated solid-phase detection technique)도 또한 적절하다. 예를 들어, 대규모의 면역화된 프라이머 어레이(very large scale immobilized primer array: VLSIPS^TM)를 예를 들어 Fodor 등(1991, Science 251:767-777) 및 Kazal 등(1996, Nature Medicine 2:753-759)이 기술한 것과 같이, 핵산 검출에 사용할 수 있다. 상기 유전적 기술은 당업자에게는 잘 알려져 있다.

약제학적 조성물

본 발명의 또 다른 특징은 N. meningitidis에 의한 감염에 대하여 환자를 보호하기 위한 약제학적 조성물에 활성화제로서 본 발명의 폴리펩타이드, 단편, 변종 또는 유도체를 사용하는 것이다("면역학적인 시약"). 적당하게, 상기 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.

"약제학적으로-허용가능한 담체"는 전신 투여에서 안정하게 사용될 수 있는 고상 또는 액상 충진제, 희석제 또는 캡슐화 기재를 의미한다. 각각의 투여의 경로에 따라, 당해 분야에서 잘 알려진, 약제학적으로 허용가능한 각종 담체가 사용될 수 있다. 이들 담체들은 당, 녹말, 셀룰로즈 및 이의 유도체, 엿기름(malt), 젤라틴, 탈크, 칼슘 설페이드, 식물성 기름, 합성 오일, 폴리올, 알긴산, 포스페이트 완충액, 에멀젼화제, 등장 식염수(isotonic saline) 및 피로겐이 없는 물(pyrogen-free water)을 포함하는 군에서 선택될 수 있다.

본 발명의 상기 조성물을 환자에게 공급하는데 적합한 투여 경로는 어떠한 것도 사용될 수 있다. 예를 들어, 경구, 직장(rectal), 비경구(parenteral), 설하(sublingual), 구강(buccal), 정맥(intravenous), 관절내(intra-articular), 근육내(intra-muscular), 피부내(intra-dermal), 피하(subcutaneous), 흡입(inhalational), 소실내(intralocular), 복막내(intraperitoneal), 뇌실내( intracerebroventricular), 경피(transdermal) 등을 사용할 수 있다. 예를 들어, 면역학적 조성물, 백신 및 DNA 백신의 투여에는 근육내 및 피하 주사가 적절하다.

투약 형태는 정제, 분산액, 현탁액, 주사액, 용액, 시럽, 트로치(troche), 캡슐, 좌약(suppository), 에어로졸, 경피 패치(transdermal patch) 등을 포함한다. 상기 투약 형태는 이 목적을 위하여 특별히 고안된 주사 또는 이식 조절 방출 장치 또는 이러한 종류에 따라 추가적으로 작용하도록 변형시킨 이식체의 다른 형태를 포함한다. 상기 치료제의 조절된 방출은 치료제를 예를 들어 아크릴 수지, 왁스, 고급 지방족 알콜, 폴리액트산(polyactic acid) 및 폴리글리콜 산을 포함하는 소수성 폴리머와 하이드로옥시프로필메틸 셀룰로즈와 같은 셀룰로즈 유도체로 코팅함으로써 일으킬 수 있다. 이외에, 상기 조절된 방출은 다른 폴리머 매트릭스, 리포좀 및/또는 마이크로스피어(microsphere)를 사용하여 일으킬 수 있다.

경구 또는 비경구 투여에 적합한 본 발명의 약제학적 조성물은 각각 본 발명의 치료제 하나 이상을, 분말 또는 입자체(granule)로서, 또는 용액 또는 수용액 중의 현탁액, 비수용액, 수중유 에멀젼 또는 유중수 에멀젼으로, 소정의 양으로 함유하는 캡슐, 향낭(sachet) 또는 정제와 같은 개별 단위로 표시할 수 있다. 상기 조성물은 약제학적 방법 중 어떠한 방법으로도 제조될 수 있으나, 모든 방법은 상 술한 것과 같은 면역학적인 시약 하나 이상을 하나 이상의 필수 성분으로 구성된 담체와 혼합하는 공정을 포함한다. 일반적으로 상기 조성물은 본 발명의 면역학적 시약을 액상 담체 또는 미세하게 분쇄된 고체 담체 또는 이들 양자와 균일하고 섬세하게 첨가혼합한 후, 필요하다면, 상기 생성물을 원하는 형태로 성형하여 제조한다.

상기 조성물을 상기 투약 제형과 상용성있는 방법으로 그리고 N. meningitidis 감염으로부터 환자를 보호하기 위하여 면역학적으로-효과적인 양으로 투여할 수 있다. 본 발명의 내용에 있어서, 환자에게 투여되는 용량은 N. meningitidis의 수준을 감소시키는 것과 같은 기간을 통하여 환자에게 유익한 반응에 영향을 미치기에 또는 N. meningitidis에 의한 감염을 억제하기에 충분해야한다. 투여될 면역성 시약의 양은 나이, 성, 무게 및 일반적인 건강 조건을 포함하여 치료되는 환자에 따라 좌우될 수 있다. 이와 관련하여, 투여에 요구되는 상기 면역성 시약의 정확한 양은 시술자의 판단에 따라 좌우될 수 있다. 치료 또는 N. meningitidis에 대한 예방에서 투여될 면역성 시약의 효과적인 양을 결정하는데 있어서, 의사는 순환되는 플라즈마 수준, 질병의 진전 및 항-N. meningitidis 항체의 생산을 예측할 수 있다. 어떠한 경우에도, 본 발명의 면역성 시약의 적합한 투여량은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 상기 투여량은 본 발명의 면역성 시약의 나노그램 내지 밀리그램의 순일 수 있다.

상기 조성물은 치료용 백신 또는 예방용 백신으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 면역성 시약 하나 이상을 활성제로 함유하는 백신의 제조 방법까지도 제공한다. 상기 백신을 제조하는데 적합한 방법이면 어떠한 방법도 고려될 수 있다. 대표적인 방법은 예를 들어 본 명세서에서 인용 참조되는 NEW GENERATION VACCINES(1997, Levine 등, Marcel Dekker, Inc. 뉴욕, 바셀 홍콩)에 기술된 방법을 포함한다.

본 발명에 따른 면역성 시약은 다른 항원의 B 또는 T 셀 항원 결정 인자(epitope)를 포함하는 다른 항원과 혼합되거나, 접합되거나 또는 융합될 수 있다. 또한, 후술할 담체와 접합될 수 있다.

본 발명의 헵테닉 펩타이드(haptenic peptide)가 사용될 경우(즉, 동계 항체와 반응하나 그 자체는 면역 반응을 나타낼 수 없는 펩타이드), 면역성 담체와 접합될 수 있다. 유용한 담체는 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들면: 티로글로블린; 인간 혈청 알부민 같은 알부민; 독소, 유독소, 파상풍(tetanus), 디프테리아(diptheria), 백일해(pertussis), 슈도모나스(Pseudomonas), E. coli, 스타필로코커스(Staphylococcus) 및 스트렙토코커스(Streptococcus)로부터 얻어진 독소의 모든 돌연변이 교차반응성 물질(mutant crossreactive material: CRM); 폴리(라이신:글루타민산)과 같은 폴리아미노산; 인플루엔자; 로타바이러스 VP6(Rotavirus VP6), 파르보바이러스 VP1 및 VP2(Parvovirus VP1 and VP2); 헤파티티스 B 바이러스 코어 프로테인(hepatitis B virus core protein); 헤파티티스 B 바이러스 재조합 백신 등이 포함된다. 이와 달리, 담체 단백질 또는 다른 면역성 단벡질의 절편 또는 항원 결정 인자가 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 헵테닉 펩타이드는 박테리아 독소, 유독소 또는 CRM의 T 셀 항원 결정 인자에 결합될 수 있다. 이에 관해서는 본 명세서에서 인용참조된 미국 특허 제 5,785,973 호가 참고 문헌이 될 수 있다.

또한, 본 발명의 폴리펩타이드, 단편, 변종 또는 유도체는 Neisseria에 대해, 또는 다른 박테리아 또는 바이러스에 대하여 적용되는 백신 조성물에서 담체 단백질로서 작용할 수 있다.

본 발명의 면역성 시약은 N. meningitidis의 항원 또는 병원성 박테리아 H. influenzae, M. catarrhalis, N. gonorrhoeae, E. coli, S. pneumoniae 등을 포함하는 다른 유기체의 항원과 함께 다가 서브유니트 백신(multivalent subunit vaccine)로 투여될 수 있다. 이와 달리 또는 추가적으로, N. meningitidis의 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드 성분과 함께 투여될 수 있다.

상기 백신은 또한 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 물, 포스페이트 완충 식염수 및 식염수와 같은 부형제(excipient)를 함유할 수 있다.

상기 백신 및 면역성 조성물은 당해 분야에 잘 알려진 면역보조제(adjuvant)를 함유할 수 있다. 적당한 면역보조제는 헥사데실아민, 옥타데실아민, 옥타데실 아미노산 에스테르, 라이소레시틴, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드, N, N-디옥타데실-N',N'비스(2-하이드로옥시에틸-프로판디아민), 메톡시헥사데실글리세롤 및 플루론 폴리올; 피란, 덱스트란설페이트, 폴리 IC 카보폴과 같은 폴리아민; 뮤라밀 디펩타이트 및 유도체, 디메틸글리신, 터프신(tuftsin)과 같은 펩타이드; 오일 에멀젼; 및 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드 또는 알룸과 같은 미네랄 겔, 림포킨, 퀼리에이(QuilA) 및 면역 자극 복합체(ISCOMS)를 포함하나 이에 한정 되는 것은 아니다.

본 발명의 면역성 시약은 약독화 바이러스 호스트(attenuated viral host)에 의해 발현될 수 있다. "약독화 바이러스 호스트"는 천연적으로, 또는 실질적으로 무독성으로 된 바이러스 벡터를 말한다. 바이러스는 적당한 물리적(예를 들어 열처리) 또는 화학적 수단(예를 들어, 포름알데하이드 처리)에 의해 실질적으로 무독성이 될 수 있다. "실질적으로 무독성"은 감염성이 파괴된 바이러스를 말한다. 실제로, 바이러스의 감염성은 바이러스의 면역성을 전달하는 단백질에 영향을 끼치지 않고 파괴된다. 이로부터, 정지상 바이러스 호스트는 생 바이러스(live virus) 또는 비활성화된 바이러스(inactivated virus)를 포함할 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다..

본 발명에 따른 백신에 유용한 약독화 바이러스 호스트는 아데노바이러스, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus), 바람직하게는 백신(예를 들어 본 명세서에서 인용 참조된 Paolette 및 Panicali의 미국 특허 제 4,603,112 호 참조) 및 정지상 Salmonella 균주(strain)(참조. 예를 들어 본 명세서에서 인용 참조된 Stoker의 미국 특허 제 4,550,081 호)와 같은 폭스 바이러스(pox virus)를 포함하는 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 실질적으로 장시간 면역성을 부여할 수 있는 지속된 자극을 유도하기 때문에, 생 백신이 특히 유용하다.

다가 백신은 N. meningitidis의 다른 항원 발현 인자(예를 들어, N. meningitidis의 다른 표면 단백질 또는 항원 발현 인자)를 발현하는 하나 이상의 미생물로부터 제조될 수 있다. 또한, 다른 병원성 미생물의 항원 발현 인자를 백 신에 도입될 수 있다.

바람직한 실시예에 있어서, 본 발명에 따라 핵산 서열을 발현하기 위한 재조합 백신 바이러스의 구조가 포함될 수 있다. 호스트에 도입됨에 따라, 상기 재조합 백신 바이러스는 면역성 시약을 발현하여 이로부터 호스트 CTL 반응을 나타낸다. 예를 들어, 백신 벡터 및 면역 프로토콜에서 유용한 방법이 기술되어 있는 본 명세서에서 인용 참조된, 미국 특허 제 4,722,848 호를 참고 문헌으로 들 수 있다.

본 발명의 면역성 시약을 사용한 치료 투여 또는 면역시킴에 유용한 여러 가지 다른 벡터는 본 명세서에 따라 당업자에게 명백해질 것이다.

다른 실시예에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열이 당해 분야에 알려진 것과 같이 "노출 DNA(naked DNA)"의 형태로 백신으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 인용 참조된 Barry, M 등의 문헌(1995, Nature, 377:632-635)에 기술된 예와 같이, 상기 호스트가 면역 반응을 일으키는 것에 대하여 생체 내에서 폴리펩타이드의 생산을 야기하는, 본 발명의 발현 벡터를 포유 동물에 도입할 수 있다.

검출용 키드(detection kits)

본 발명은 또한 생물학적인 시료에서 N. meningitidis 검출용 키트를 제공한다. 사용한 시험 방법의 특성에 따라 상술한 특정 시약을 하나 이상 함유한다. 이점에 있어서, 상기 키트는 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 단편, 변종, 유도체, 항원, 항원 단편 또는 핵산을 하나 이상 포함할 수 있다. 상기 키트는 또한 임의 로 표지, 양성 및 음성 대조군, 세척액, 희석 완충액 등의 검출용으로 적절한 시약을 포함할 수 도 있다. 예를 들어, 핵산-계열 검출 키트는 (ⅰ) 본 발명에따른 핵산(양성 대조군으로 사용될 수 있음), (ⅱ) 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 사용되는 핵산 증폭 기술에 따른 임의의 DNA 폴리머라제, DNA 리가제 등을 포함할 수 있다.

면역활성 절편의 제조

본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 변종 또는 유도체의 면역활성 절편을 동정하는 방법까지도 제공한다. 이 방법은 필수적으로 폴리펩타이드, 변종 또는 유도체의 단편을 생성시키고, 상기 단편을 포유 동물에게 투여한 후, 상기 동물에서 면역 반응을 검출하는 공정을 포함한다. 이러한 반응은 N. meningitidis 및/또는 상기 폴리펩타이드, 변종 또는 유도체를 특이하게 결합하는 원소의 생성 및/또는 N. meningitidis 감염에 대한 보호 효과를 포함한다.

상기 방법에서 면역활성용 특이 절편을 테스트하기 전에, 천연 항원과 교차-결합하는 항원을 얻기 위하여, 특정 절편을 사용할 수 있는지를 알아보기 위하여, 다양한 예측 방법을 사용할 수 있다. 이러한 예측 방법 Ausubel 등의 문헌 11.14장에 설명되어있는(1994-1998, 상기 문헌) 예와 같이, 아미노-말단 또는 카르복시-말단 서열에 기초할 수 있다. 이와 달리, 이러한 예측 방법은 본 명세서에서 인용 참조된 Kyte 및 Doolittle의 문헌(1982, J. Mol. Biol. 157:105-132) 및 Hopp와 Woods의 문헌(1983, Mol. Immunol. 20:483-489)에 기술된 예와 같이 친수성의 예측에, 또는 본 명세서에서 인용 참조된 Choo 및 Fasman의 문헌(1978, Ann. Rev. Biochem. 47:251-276)에 기술된 예와 같이 이차 구조의 예측에 기초할 수 있다.

일반적으로, 10 내지 15개의 잔기로 구성된 펩타이드 단편은 최적의 결과를 제공한다. 6 만큼 작거나 20 만큼 큰 잔기를 갖는 펩타이드가 성공적으로 수행되었다. 이어서, 상기 펩타이드 단편은 Ausubel 등의 문헌 11.14 및 11.15 항(1994-1998)에 기술되어 있는 예와 같이, 키홀 림페트 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin: KLH) 또는 소 혈청 알부민(bovine serum albumin: BSA)와 같은 담체 분자에 화학적으로 결합시킬 수 있다.

상기 펩타이드는 상술한 예와 같이 동물을 면역시키는데 사용할 수 있다. 천연 또는 원종(patent) 폴리펩타이드로부터 선택되는 펩타이드에 대한 항원 역가는 에를 들어, Ausubel 등의 문헌의 11.16 및 114항(1994-1998, 상기 문헌)에 기술되어 있는 예와 같이 라디오이뮤노분석 또는 ELISA에 의해 측정할 수 있다.

이어서, 항체는 당해 기술 분야에 잘 알려진 것과 같이 암모늄 설페이트 분획법 또는 크로마토그래피법으로 동물의 적당한 생물학적인 유체로부터 정제할 수 있다. 항체 정체에 대한 대표적인 프로토콜은 Ausubel 등의 문헌 10.11 및 11.13항에 기술되어 있다(1994-1998, 상기 문헌).

상기 천연 또는 원종 폴리펩타이드에 대한 항체의 면역반응은 예를 들어 웨스턴 블럿과 같은 적합한 방법에 의하여 측정할 수 있다.

작용성 블로커(Functional blokers)

SEQ ID NO 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 및 21에 따른 폴리펩타이드는 접착성질을 갖는다고 여겨진다. 사실, 상기 폴리펩타이드는 표면 항원(surface antigen)인 Haeophlus influenzae의 접착성과 일부 유사성을 갖는다. 특히 상기 폴리펩타이드는 H. influenzae의 Hia 단백질에 약 67% 동질성을 갖고(Barenkamp, S 및 St. Geme Ⅲ, J. 1996 Molecular Microbiology 19: 1215-1233), H. influenzae의 Hsf 단백질에는 74% 동질성을 갖는다(St. Geme Ⅲ, J. 등, 1996, Journal of Bacteriology 178: 6281-6287; 미국 특허 제 5,646,259 호). 이들을 비교하기 위하여, 상기 GAP 프로그램을 사용하여 갭 중량(gap weight) 3 및 길이 중량(length weight) 0.01이 사용되었다(Deveraux, 1984, 상기 문헌). 이들 단백질의 정렬된 서열을 도 6에 나타내었다. 따라서, 이들 폴리펩타이드가 N. meningitidis 박테리아가 셀에 부착되는 것과 침투하는 것을 방지하기 때문에, 상기 폴리펩타이드 기능의 중단은 중요한 치료 잇점이 될 수 있다. 상기 기능의 중단은 여러 방법으로 일으킬 수 있다.

예를 들어, SEQ ID 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 및 21에 따른 폴리펩타이드와 상호작용하는 셀 표면에서 수용체를 막는 폴리펩타이드 또는 화학적 시약과 같은 잔기가 투여될 수 있다. 이들은 수용체 사이트에 대한 감염 유기체와 경쟁한다. 상기 잔기는 예를 들어 본 발명의 폴리펩타이드, 특히 이들의 단편 또는 기능성 등가물뿐만 아니라 의태물을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용한 단어 "의태물'은 상기 단백질 또는 펩타이드의 특정 기능성 영역과 유사하게 만든 화합물을 말한다. 셀 표면에 박테리아의 결합을 막는 상술한 항체에 대하여 발생되는 항-이디오타입(anti-idiotypic) 항체가 또한 사용될 수 도 있다. 이와 달리, SEQ ID NO 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 및 21에 따른 폴리펩타이드에서 상기 수용체 결합 사이트와 상호작용하는 잔기는 N. meningitidis에 의한 셀의 감염을 효과적으로 방지할 수 있다. 상기 잔기는 보호 항체(blocking antibody), 펩타이드 또는 다른 화학적 시약을 포함할 수 있다.

상기한 모든 잔기, 약물학적으로 허용되는 담체와 결합되는 약물학적 조성물 및, 상기 잔기 또는 조성물을 투여하여 본 N. meningitidis로부터 고통받는 환자를 치료하는 방법은 본 발명의 또 다른 양상이다.

본 발명의 폴리펩타이드는 상기 방법에 있어서 이들을 사용하기 위한 화합물의 스크리닝에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드는 표지와 결합하고, 시험 중 시약의 존재 하에서 셀 배양물에 노출할 수 있다. 그후 상기 셀 표면에 대한 표지된 폴리펩타이드의 결합을 억제하기 위한 시약의 능력을 관찰할 수 있다. 이러한 스크린에서, 상기 표지된 폴리펩타이드는 E. coli 같은 유기체에 직접 사용할 수 있다. 이와 달리, N. meningitidis 그 자체는 폴리펩타이드의 변형되고 검출가능한 형태로 발현되도록 처리할 수 있다. 이 방법에 있어서, 상기 단백질의 3차원 구조가 야생형 박테리아에서 발현되는 것과 매우 유사하기 때문에, 처리된 N. meningitidis 균주가 바람직하다.

도 1은 플라스미드 맵 및 클로닝 전략을 도시하는 도면.

프라이머 A3A 및 A3B(각각 SEQ ID NO 28 및 29)는 AIDA-I의 유사체로 데이터 베이스에서 AIDA-I의 유사체로서 예비적인 서열 데이터에서 동정되는 MC58 영역에서 증폭하는데 사용된다. 프라이머 A3C(SEQ ID NO 30) 및 A3D(SEQ ID NO 31)은 hiaNm을 포함하는 3kbp EagI 단편을 증폭하기 위해 역 PCR에서 사용된다. 이 산물은 클론화되어서 piEAGA3을 제공한다. piEAGA3은 서브클론화되어서 piEagA3.8 및 piEAGA3을 제공한다. 프라이머 HiaNm:M 및 HiaNm:P(각각 SEQ ID NO 22 및 23)은 MC58에서 연속영역을 증폭하는데 사용되어 산물은 클론화되어서 pHiaNm을 제조하였다. 프라이머 Hia-MBPA(SEQ ID NO 24) 및 Hia-MBPB (SEQ ID NO 25)는 hiaNm의 개시 탐독 프래임을 증폭하는데 사용되고, 산물은 클론화되어서 pMALC2로 클론화되어서 pMBP-HiaNm을 제조하였다.

도 2는 다수의 수막염 균주의 게놈 DNA의 써던 블롯.

도 2a는 혈청형 B의 균주로, Lane 1 PMC28, Lane 2 PMC 27, Lane 3 PMC 25, Lane 4 PMC 24, Lane 5 PMC 16, Lane 6 PMC 13, Lane 7 PMC 12, Lane 8 MWt 표준, Lane 9 2970, Lane 10 1000, Lane 11 528, Lane 12 SWZ107, Lane 13 H41, Lane 14 H38, Lane 15 NGH 36, Lane 16 H15, Lane 17 NGG40, Lane 18 NGF26, Lane 19 NGE30, Lane 20 Lane NGE28

도 2b는 B이외의 다른 혈청형의 균주로 Lane 1 PMC3, Lane 2 PMC17, Lane 3 PMC20, Lane 4 PMC23, Lane 5 PMC8, Lane 6 PMC9, Lane 7 PMC11, Lane 8 PMC14, Lane PMC18, Lane 10 PMC21, Lane 11 PMC29, Lane 12 MWt 표준, Lane 13 PMC19, Lane 14 PMC1, Lane 15 PMC6, Lane 16 PMC10, Lane 17 PMC22, Lane 18 PMC26, Lane 19 PMC2. 분자량 마커는 킬로베이스(kb) 쌍으로 표현되었다. 게놈 DNA는 SEQ ID NO 1의 ntp 276-2054에 해당하는 프로브로 혼성화되었다.

도 3은 MBP-HiaNm의 Coomassie 균주의 겔을 도시하는 도면.

IPTG로 유도된 후에 pMALC2 (Lane 2) 또는 pMBP-HiaNm (Lane 3)을 포함하는 세포이다. 화살표는 MBP 및 MBP-HiaNm을 가르킨다.

도 4는 토끼의 면역 혈청으로 배양된 MC58 및 MC58ΔHiaNm 단백질의 웨스턴 블롯.

Lane 1은 kDa으로 표시되는 표준 분자량, Lane 2는 MC58의 총 세포 단백질, Lane 3은 MCΔHiaNm의 총 세포 단백질, Lane 4는 MC59의 OMC 제조물, Lane 5는 MC58ΔHiaNm의 OMc 제조물. 각 레인은 A₂₈₀=3.75의 단백질 부유물의 50μL를 포함한다.

도 5는 도 4에서 웨스턴 블롯 염색된 겔과 평행하게 이동하는 Coomassie 염색된 겔을 도시하는 도면. 레인은 도 4와 동일한 것이다.

도 6은 PILEUP 배열 프로그램을 이용하여 HiaNm, Hia, Hsf의 폴리펩타이드의 서열비교를 도시하는 도면.

도 7은 PILEUP 프로그램을 사용한 수막염균의 10개의 균주에서 HiaNm의 폴리펩타이드 서열들의 서열비교를 도시하는 도면.

본 발명을 쉽게 이해시키고, 실질적인 효과를 설명하기 위하여, 특히 바람직한 실시예를 기술하며, 이하 실시예로 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

분자 클로닝 및 서브클로닝과 hiaNm 돌연변이 구조

hiaNm 유전자는 초기에 표준 방법을 사용하여 PCR 증폭으로 분리하였다. 간단히 설명하면, E. coli의 상기 AIDA-I 단백질의 상동성에 대한 본 발명자들의 선행 작업에 따라(Jennings, M 등, 1995, Microbial Pathogenesis, 19: 391-407, Peak, I. 등 Microbial Pathogenesis, 출판됨), 본 발명자들은 상동성 조사를 실시하여, 상기 프로젝트로부터 얻어진 선행 데이터에 관계된 서열을 동정하여 MC58c3의 게놈 서열을 얻고(미합중국 매릴랜드주 소재의 The Institute for Genomic Research에서 제공됨, ftp://ftp.tigr.org/pub/data/n meningitidis/)상기 상동성 영역을 올리고뉴클레오타이드 A3A(5'-TTTGCAACGGTTCAGGCA-3', SEQ ID NO 28) 및 A3B(5'-TATTCAGCAGCGTACGG-3', SEQ IN NO 29)을 사용하여 PCR(polymerase chain reaction)로 증폭하였다. 얻어진 449 염기쌍(bp) 생성물을 pT7Blue에 클론하여 플라스미드 pNMAIDA3를 형성하였다. 상기 전체-길이의 유전자를 클론하기 위하여, 추가로 올리고뉴클레오타이드를 구성하여 역(inverse) PCR 반응에 사용하였다. 이들 올리고뉴클레오타이드는 A3C(SEQ ID NO 30) 및 A3D(SEQ ID NO 31)이며, 각기 A3A(SEQ ID NO 28) 및 A3B(SEQ ID NO 31)의 상보적인 서열에 상응하였다. 상기 반응을 위한 템플레이트(template)는 EagI을 사용하여 제한 소화하고, 이어서 그 자체를 라이게이션한 MC58의 크로모조말(chromosomal) DNA이었다. 얻어진 3kbp PCR 생성물은 상기 벡터 pCRII(인비트로겐)에 클론하여 플라스미드 piEagA3를 생성하였다. 이를 EagI 및 EcoRI로 소화시키고, 얻어진 클로닝된 DNA를 함유하는 1.4kbp 및 1.6kbp의 단편을 pBluescriptSKII, M13minus(Stratagene)에 클로닝하여 piEagA3.8 및 piEagA3.9를 얻었다. 플라스미드 pHiaNm는 PCR 증폭 hiaNm 및 서열 5' 및 3'으로 생성하여 그것을 SEQ ID NO 1의 뉴클레오타이드 위치(ntp) 113-133 및 2102-2085에 각각 상응하는, 올리고뉴클레오타이드 프라이머 HiaNm:P(5'-TTAGATTCCACGTCCCAGATT-3', SEQ ID NO 22) 및 HiaNm:M(5'-CTTCCCTTCAAACCTTCC-3', SEQ ID NO 23)을 사용하여 생성물을 pT7Blue로 클로닝하였다. 플라스미드 pHiaNmΔKan을 SEQ ID NO 1의 ntp 680에 상응하는 독특한 pH1iaNm의 BglII 사이트로 카나마이신 저항 카세트(kanamycin resistance cassette)를 삽입하여 형성하였다. 상기 카나마이신 저항 카세트는 BamHI를 사용하여 pUC4Kan(Pharmacia)로부터 잘라내었다. pHiaNmΔKan는 박테리아를 플라스미드 DNA를 사용하여 5% CO₂하에서 37℃의 온도로 10% 가열된 말 혈액으로 보충된 브레인 하트 인퓨젼 아가(Brain Heart Infusion agar)(Acumedia Manufacturer's Inc)("BHI 플레이트") 상에 3시간 동안 배양하여 N. meningitidis 균주 MC58로 형질전환(transform)하였다. 단일 콜로니를 갓 만든 선택성 배지로 수집하여, 성장시켜서 추가적인 연구에 사용하였다. 상기 돌연변이 균주를 MC58ΔHiaNm이라 명명한다. 상기 균주에서 hiaNm 유전자의 분열을 SEQ ID NO 1의 ntp 276-2054에 상응하는 탐침을 사용하여 써던 블럿으로 확인하였다.

실시예 2

뉴클레오타이드 서열 분석

뉴클레오타이드 서열 분석은 모델 373a 자동화된 시퀀서(Applied Biosystems)와 함께 제조회사의 설명서(Perkin Elmer)에서 제시한 것과 같은 AmpliTaq DNA 폴리머라제 FS를 갖는 PRISM 염료 전사종결인자(terminator) 시퀀싱 키트 또는 BigDye 전자 종결 인자 시퀀싱 키트를 사용하여 실시하였다. 각 균주에 대하여, hiaNm을 SEQ ID NO 1의 ntp 230-247 및 2114-2097에 상응하고 도 1에 나타낸 것과 같이 프라이머 HiaNm5'A2:5'-CCAAACCCCGATTTAACC-3'(SEQ ID NO 26) 및 HiaNm3'A: 5'-AATCGCCACCCTTCCCTTC-3'(SEQ ID NO 27)을 사용하여 세 개의 각기 다른 PCR 반응으로 증폭하고, 얻어진 생성물을 정제하고 모았다(pool). 이것은 두 개의 스트랜드상에서 직접 시퀀싱하기 위한 템플레이트로 사용되었다. GCG 프로그램(Deveraux 등(1984) Nucleic Acids Research 12, 387-395)과 AssemblyLIGN(Oxford Molecular)를 사용하여 데이터를 분석하였다. 필요에 따라 여러개의 올리고뉴클레오타이드를 생성하여 서열을 완성하였다. 10 균주의 hiaNm의 서열은 SEQ ID NO 1, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 및 20에 나타내었고 이들 유전자의 추정 아미노산 서열은 SEQ ID NO 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 및 21에 나타내었다.

상기 균주로부터 얻어진 hiaNm의 비교 결과에서는 MC58의 hiaNm와 90-99% 상동성을 공유하는 것으로 나타났다. 또한, MC58의 hiaNm은 Haemophilus influenzae의 hia 및 hsf과 62% 및 68% 동질성을 갖는다. 그러나 상기 실험된 균주에서, hiaNm은 1770-1800 bp 길이이다. 이는 각각 3294 및 7059 bp 길이인 hia 및 hsf와는 현저하게 다르다. hiaNm, HiaNm의 예측된 폴리펩타이드는 AIDA-I, 설사성(diarrhoeagenic) Escherichia coli 균주 2787(0126:H27)의 분산 접착성 (diffuse adherence)을 포함하는 부착인자(adhesin), HMW1, 다른 Haemophilus 부착인자, UspAl, Moraxella catarrthalis의 고분자량 단백질 및 Shigella flexneri의 조직 침투를 포함하는 SepA를 포함하는 여러 다른 박테리아 단백질과 상동성을 또한 나타낸다(Benz, I. 및 Schimidt, M.A., 1992, Molecular Microbiology 6:1539-1546, Barenkamp,S.J. 및 Leininger,E. 1992, Infection and Immunity 60: 1302-1313, Aebi,C. 등 1997, Infection and Immunity 65: 4367-4377, Benjelloun-Touimi,Z 등 1995, Molecular Microbiology 17:123-135). 이들(및 여러 다른 단백질)에 대한 상동성은 HiaNm의 첫 번째 50개의 아미노산에서 나타난다. 이들 서열의 분석으로 모든 시험된 HiaNm 서열 중에서 아미노산 50에서 절단 사이트를 갖는, 예측된 시그널 서열이 존재하는 것이 나타났다. 이러한 긴 시그널 서열은 그램-음성 박테리아(Gram-negatvie bacteria)의 외부 멤브레인(outer membrane)에 위치하는 단백질에 공통적인 것이다(Henderson, I 등, 1998, Trends in Microbiology 6: 370-8). HiaNm의 첫 번째 50개의 아미노산과 상동성인 상술한 단백질은 모두 "오토트랜스포터(autotransporter)" 외부 멤브레인 단백질 계열의 종이다(Henderson I, 상기 문헌). 이는 HiaNm이 N. meningitidis의 외부 멤브레인에 위치한다는 것을 강력하게 암시하는 것이다.

실시예 3

써던 블럿 분석

써던 블럿 분석을 표준 방법을 사용하여 실시하였다(Sambrook 등, 상기 문헌, Ausubel 등, 상기 문헌). 간단히 설명하면, 게놈성 DNA는 모세관(capillary)을 나일론 멤브레인으로 전달하기 전에, 아가로스 겔상에서 제한 소화되고 및 전기영동적으로 분리한 다양한 혈청그룹(serogroup)의 N. meningitidis의 70 균주로부 터 제조하였다. 이들 멤브레인을 표지된 탐침으로 혼성화(hybridize)하였다. 사용되는 탐침은 균주 MC58의 hiaNm의 전체 전사 해독 프레임(open reading frame)을 내포하는, SEQ ID NO 1의 ntp 276-2054에 상응한다. 이것을 제조자의 설명서에 따라(Boehringer Mannheim) DIG(디옥시게닌(dioxygenin))으로 표지하였다. 이어서, 면밀하게 세척하였다(2 ×SSC/0.1% SDS로 22℃에서 5분간 두 번 세척한 후, 이어서 2 ×SSC/0.1% SDS로, 68℃에서 30분간 두 번 세척). 제조자가 제안한 대로 니크로-블루-테트라졸리움/브로모-클로릴-인돌릴-포스페이트(NBT/BCIP)를 사용하여 혼성화을 비색적으로(colorimetrically)로 검출하였다. 시험한 모든 균주에서 시그널이 검출되었다. (예를 들어, 도 2). 원형(prototypic) 균주 MC58에 추가하여, 다음 균주를 조사하였다:

균주 명	원천	혈청그룹	균주 명	원천	혈청그룹
PMC 3(J1079)	2^A	A	NGF26	1	B
PMC17(K874)	2	A	NGG40	1	B
PMC 29((H79)	2	A	H15	1	B
PMC23(K750)	2	A	SWZ107	1	B
PMC 12(K852)	2	B	528	1	B
PMC 13(K859)	2	B	2970	1	B
PMC 16(K873)	2	B	1000	1	B
PMC 24(K782)	2	B	MPJB28	3^C	B
PMC 25(K791)	2	B	MPJB56	3	B
PMC 27(K816)	2	B	MPJB88	3	B
PMC 28(K837)	2	B	MPJB157	3	B
BZ10	1^B	B	MPJB328	3	B
BZ47	1	B	MPJB627	3	B
BZ83	1	B	MPJB820	3	B
BZ133	1	B	MPJB945	3	B
BZ147	1	B	PMC 8(K157)	2	C
BZ163	1	B	PMC 9(K497)	2	C
BZ169	1	B	PMC 11(K848)	2	C
BZ198	1	B	PMC14(K860)	2	C
BZ232	1	B	PMC 18(K879)	2	C
NG3/88	1	B	PMC 21(K656)	2	C
NG4/88	1	B	PMC 29(K841)	2	C
NG6/88	1	B	MPJC05	3	C
EG327	1	B	PMJC14	3	C
EG329	1	B	MPJC154	3	C
DK353	1	B	MPJC302	3	C
179/82	1	B	MPJC379	3	C
66/84	1	B	PMC19	2	W
DK24	1	B	MPJWO25	3	W
NGH36	1	B	PMC 1(J603)	2	X
H38	1	B	PMC 6(K131)	2	X
H41	1	B	PMC 10(K526)	2	Y
NGE28	1	B	PMC 22(K685)	2	Y
NGE30	1	B	PMC 26(K810)	2	Y
NGP20	1	B	PMC 2(J1049)	2	Z

^A: 노르웨이 오슬로에 위치한 수막염균(meningococci)에 관한 참고 및 연구를 위한 세계 건강 기구 공동 센터(World Health Organization Collaborating Center for Reference and Research)

^B: 영국 멘체스터에 위치한 공중 건강 실험 서비스 수막염균 참고 실험실(Public Health Laboratory Service Meningococcal Reference Laboratory)

^C: 호주 브리스베인에 위치한 퀸스랜드 대학, 미생물과에 속한, 현재 M.P. Jennings의 균주 수집소인 브리스베인 병원

실시예 4

MBP-HiaNm의 발현 및 부분 정제

플라스미드 벡터를 말토스 결합 단백질과 HiaNm(MBP-HiaNm)의 융합(fusion)으로 구성되는 단백질 발현이 되도록 형성하였다. 플라스미드 pHiaMBP를 프라이머 Hianm-MBPA 5'-GGTCGCCGATCCATGAACAAAATATACCGCAT-3'(SEQ ID NO 24) 및 HiaNm-MBPB 5'-TCACCCAAGCTTAAGCCCTTACCACTGATAAC-3'(SEQ ID NO 25)를 사용하여 MC58로부터 hiaNm을 증폭하여 제조하였다. 이들 프라이머들은 N. meningitidis 균주 MC58의 hiaNm의 개시 및 종결 코돈과 클로닝을 쉽게 하기 위한 처리된 제한 사이트(engineered restriction site)를 내포한다. 올리고뉴클레티드의 플라스미드 제한 지도와 위치를 도 1에 나타내었다. 얻어진 PCR 생성물을 BamHI/HindIII 제한 소화된 플라스미드 pMALC2로 라이게이션하고(New Englnad Biolabs), 얻어진 플라스미드, pHiaMBP(참조 도 1)을 E. coli 균주 DH5α에 재도입하였다. pHiaMBP를 함유하는 상기 E. coli 균주를 제조업자가 제안한 조건하에서 HiaNm-MBP 융합 단백질이 발현하도록 유도하였다(New England Biolabs). pHiAMBP를 함유하는 배양액으로부터 얻은 셀 추출물을 10% SDS-PAGE를 사용하여 분리하고, 상기 융해 단백질을 제조업자의 지시에 따라 미니-겔 전기-용출기(Mini-Gel Electro-eluter)(BioRad)를 사용하여 용출하여 부분적으로 정제하였다. 상기 HiaNM-MBP 융 해 단백질을 함유하는 단편을 토끼 항-MBP 혈청을 사용하여 웨스턴 블럿으로 검출하였다(New England Biolabs). 상기 HiaNm-MBP 융합 단백질의 순도를 SDS-PAGE로 측정한 후, 쿠마시 염색(Coomassi staining)을 하고, 얻어진 단백질의 양을 BCA 분석(Sigma) 또는 280㎚의 파장에서 흡광도로 측정하였다.

실시예 5

다중클론 혈청의 생성

실시예 4에서 얻어진 부분 정제된 HiaNm-MBP 융합 단백질을 사용하여 토끼에 다중클론 혈청을 생성시켰다. 용출된 HiaNmMBP 융합 단백질의 시료를 멸균 포스페이트 완충 식염액 pH 7.4, (PBS)(Sigma)에 대해 투석하였다. 이어서 이것을 50-150㎍/mL의 농도로 면역보조제(MPL + TDM + CWS, Sigma)와 혼합하고, 뉴질랜드산 흰 토끼 2마리에게 2주간의 간격으로 접종하였다. 이들 토끼로부터 혈액을 채취하였다다. 혈액을 상온에서 한시간 동안 응고시킨 후, 4℃에서 하루밤동안 배양한 다음, 4℃에서 4000 ×rpm으로 원심분리하여 혈청을 추출하였다. 상등액을 제거하고, 재차 원심분리하였다. 혈청을 -80℃에서 분취량(aliquot)으로 저장하였다. 얻어진 혈청을 살박테리아 분석와 웨스턴 블럿에 사용하였다(이하 참조).

상기 얻어진 혈청의 특이성을 테스트하기 위하여, 웨스턴 블럿 분석을 실시하였다. 간단하게 설명하면, N. meningitidis 균주 MC58과 MC58ΔHianm의 단백질을 SDS-PAGE에서 전기영동적으로 분리한 후, 세미-드라이 블럿터(Semi-Dry Blotter, BioRad)를 사용하여 니트로셀룰로즈 멤브레인에 전기영동적 이동시켰다. 이어서, 이들을 혈청과 알칼린 포스페이트 접합된 항-토끼 IgG(Sigma)를 차례로 배 양한 다음, NBT/BCIP(Sigma)를 사용하여 비색계(colorimetry) 검출을 하였다. 이러한 실험에서 항체가 MC58 및 MC58ΔHiaNm에 대하여 특이하고, MC58에서는 밴드가 검출되나 MC58ΔHiaNm에서는 밴드가 검출되지 않는, HiaNm-MBP 융합 단백질에 의하여 유발됨이 입증되었다. HiaNm의 추정된 폴리펩타이드의 예측 분자량은 62.3kDa이다. 혈청에 의해 검출된 밴드는 150kDa을 초과하여 겉보기 분자량(apprent MW)으로 이동하였다. 문헌에 보고된 상동성 "오토트랜스포터" 단백질 중 세 개 이상은 이러한 기형 이동을 나타내기도 한다: Moraxella catarrhalis의 고 분자량 외부 멤브레인 단백질 UspAl 및 UspA2는 분자량이 각각 62.5kDa 및 88.3kDa인 것으로 예측되나, 각각 분자량이 85kDa 및 88.3kDa일 때 이동하고, 분자량이 350kDa 내지 720kDa일 때에는 상기 UspA 복합체로서 이동한다(Aebi,C. 등, 1997, Infection and Immunity, 65: 4367-4377, Klingman, K.L. 및 Murphy, T.F., 1994, Infection and Immunity, 62: 1150-1155). 유사하게, Haemophilus influenzae의 Hia는 예측된 분자량은 116이나, 파지(phase)에서 발현될 때, Hia는 200kDa 이상인 때에 이동한다(Barekamp, S 및 St, Geme Ⅲ, J, 1996 Molecular Microbiology 19: 1215-1233).

HiaNm이 N. meningitidis의 외부 멤브레인과 연결된 것을 확인 하기 위하여, 외부 멤브레인 복합체(omc)를, 본질적으로 상술한 것과 같이 제조하였다(van der Ley, P. 등, 1991, Infection and Immunity, 59:2963-71). 간단히 설명하면, 상기 멤브레인을 분쇄하기 위하여 초음파 분해 전에, 박테리아를 10% 가열된 말 혈액 BHI 플레이트로 보충된 Brain Heart Infusion agar(Acumedia Manufacture' Inc)에 서 밤새 성장시키고, 10mM Tris pH 8.0에서 재현탁시키고, 열 파괴하였다. 세포 파편(cellular debris)을 10,000 ×g(rcf, 상대 원심분리력)로 원심분리하여 제거하고, 상등액을 50,000 ×g로 재원심분리하였다. 이 펠렛을 1% 사르코실(sarkosyl)/10mM Tris pH8.4에 재현탁하고 10,000 ×g로 원심분리하였다. 상등액을 75,000 ×g로 원심분리한 후, 상기 펠렛을 Tris pH 8.4에 재현탁한 다음, 280㎚의 파장에서 분광학적으로 정량하였다. 외부 멤브레인 단백질(A280=3.75의 50㎕을 함유하는 상기 사르코실-불용성 분획의 분취량을 SDS-PAGE를 실시하고 상술한 것과 같이 웨스턴 블럿하였다. 도 1에 나타낸 결과는, hiaNm이 비활성화된 것에서, 항-HiaNmMBP 항혈청과의 반응성이 야생형 MC53에서는 관찰되나 MC58ΔHiaNm에서는 관찰되지 않는 것을 입증하고 있다. MC58 배양물에서 동일한 양의 전체 단백질을 함유하는 omc 시료와 전체 셀 시료 사이에서 관찰되는 항-HiaMBP와의 반응성의 증가는 HiaNm의 멤브레인 회합(association)과 일치한다.

실시예 6

살박테리아성 분석

HiaNm에 대한 특이 살박테리아성 항체를 함유하는 항-HiaMBP 항혈청을 확인하기 위하여, 살박테리아성 분석을 야생형 MC58 및 MC58ΔHiaNm을 사용하여 실시하였다. 이 분석은 Hoogerhout 등이 기술한 방법(1995, Infection and Immunity, 63: 3473-3478)을 변형하여 실시하였다. 간단히 설명하면, MC58과 MC58ΔHiaNm을 5% CO₂중에서 37℃로 BHI 플레이트상에서 밤새 성장시켰다. 이 밤새 성장된 배양 물로부터 얻어진 박테리아를 4-6시간 동안 동일한 조건하에 하부배양한 다음, 1mL PBS에서 현탁하였다. 0.2N NaOH/1% SDS에 시료를 용해하고 260㎚ 파장에서 흡광도(여기에서 A₂₆₀=1=10⁹cfu/ml)에 의하여 박테리아의 수를 추정하였다. 박테리아 현탁액을 PBS 중에서 약 10⁵cfu/mL가 되도록 조정하였다. 실험할 토끼 혈청을 56℃에서 45분동안 열 비활성화하였다. 4주 된 뉴질랜드산 흰 토끼로부터 혈청을 모으고, 보체(complement) 공급원으로 사용하였다(Central Animal Breeding House, 퀸스랜드 대학). 상기 분석을 살균 폴리스티렌 평평한-바닥 96 웰 미량적정(flat-bottomed 96 well microtitre) 플레이트에서 실시하였다. 각 웰의 전체 부피는 24㎕이었다: PBS 중에 두 배로 연속적으로 희석된 혈청 12㎕와 (300-900 박테리아를 함유하는) 박테리아 현탁액서 6㎕. 혈청과 박테리아를 10분 동안 상온에서 배양한 다음, PBS에서 80% 보체 6㎕를 첨가하였다(최종 농도 20% vol/vol), a) PBS, 박테리아 및 보체, b) PBS, 박테리아 및 혈청을 대조군으로 하였다. 모든 성분을 첨가하고 혼합한 후, 각 대조군 웰로부터 얻은 7㎕의 분취량을 BHI 플레이트상에 스프레드하였다. 상기 미량적정 플레이트를 이어서 5% CO₂ 중에서 37℃로 60분간 배양하였다. 배양후, 각 웰로부터 얻은 분취량 7㎕를 BHI 플레이트상에 스프레드하였다. 모든 BHI 플레이트를 이어서 5% CO₂에서 37℃로 14-18시간 동안 배양하고, 박테리아 콜로니를 카운트하였다. 혈청 살박테리아성 제거는 가장 높은 상호 희석액(highest reciprocal dilution)에서 90% 이상의 박테리아가 제거되는 것으로 보고되어있다. 사용된 혈청은, 상기 실시예 5에 언급한 것과 같이 웨스턴 블럿 실험에서 사용된 것과 동일한 토끼와 동일한 실험 혈액에서 채취하였다. 이러한 실험은 야생형 균주, MC58과 비교하여 MC58ΔHiaNm에 대한 제거가 감소된 역가(약 3배, 표 4)와 일치하게 나타났으며, 이는 항-HiaMBP 항혈청이 HiaNMdp 대한 특이 살박테리아성 항체를 함유하고 있음을 나타낸다.

균주	역가^a
MC58	12(+/-4.6)
MC58ΔHiaNm	3.5(+/-1)

^a: 네 개의 독립된 실험의 평균값

결론

경쟁적인 DNA는 일부 병원성 박테리아 중에서 독성 결정인자와 회합되어 있다. 이러한 경쟁적인 DNA 모티브(motif)를 사용하는 써던 블럿은 N. meningitidis 균주 MC58에 이러한 모티브를 함유하는 인자(locus) 세 개 이상이 존재한다는 것을 드러낸다(Peak, I. 등, 1996, FEMS Microbiology Letters, 137: 109-114). 상기 유전자를 클로닝하고, 이들 반복 회합된 인자 중의 두 개(nmrep2 및 nmrep3)의 서열 분석에서 약 670개의 아미노산의 전사 해독 프레임이 나타났다(Jennings, M. 등, 1995, Microbial Pathogenesis, 19:391-407, Peak, I. 등, Microbial Pathogenesis, 출판됨). 이러한 결과는 서로에 대한 상동성과, E. coli의 부착인자 AIDA-I의 카르복실-말단에 대한 상동성을 나타낸다. AIDA-I는 1286개의 아미노산 길이이다. 카르복실-말단 영역은 추정되는(putative) 외부 멤브레인 전달 도메인으로 구성되고 상기 성숙 단백질의 아미노-말단 도메인은 상기 접착 인자 도메인으로 구성된다. 상기 아미노-말단 도메인은 상기 추정되는 전달 도메인을 통하여 상기 멤브레인을 교차하며, 패신저 도메인(passenger domain)으로 명명한다.

Nmep2 및 Nmep3은 AIDA-I의 트랜스포터 도메인과 서열 상동성을 공유함에 따라, 이들은 멤브레인 포어를 형성하는 것으로 생각된다. Nmrep2 및 Nmrep3는 AIDA-I 크기의 약 절반이고, AIDA-I의 멤브레인 스패닝(membrane spanning)과 상동성이 있다. 본 발명자들은 AIDA-I의 아미노-말단 도메인에 대한 상동성이 있는 인자가 N. meningitidis에 존재하는 것을 가정하였다. 본 발명자들은 프로젝트로부터 얻어진 데이터에서 이러한 상동성에 대하여 연구하여 N. meningitidis 균주 MC58Δ(TIGR, 상기 문헌)을 서열화하고, E. coli의 AIDA-I와 상동성이 있기 때문에 Haemophilus influenzae 균주 Rd(HI1732)에서 AIDA-I로 명명된 유전자와 상동성을 갖는 하나의 영역을 발견하였다(Fleischmann 등, 1995, Science 269:496-512,). 상기 언급한 상동성에 관해서는, 본 출원인들은 추후에 조사하기로 결정하였다.

상기 유전자를 N. meningitidis MC58 3으로부터, gnmaa84r로 명명된 471 염기쌍 절편에 상응하는 DNA의 PCR 증폭으로 분리하고, 서열을 확인하였다. 또한 PCR 실험은 보다 더 큰 절편의 증폭을 가능하게 하였다. 이들을 클로닝하고 도 1에 나타낸것과 같이 서열 분석을 실시하였다. 상기 유전자는 E. coli의 AIDA-I의 아미노-말단 영역에 상동성이 있는 것으로 나타났고, 상기 유전자가 N. menigitidis(nmrep2 및 nmrep3를 갖는)에서 제 3 의 AIDA-I 상동체로 나타났으므로, 본 발명자들은 상기 유전자를 aida3로 명명하였다. 이어서, adia3와 매우 유 사한, H. influenzae로부터 두 개의 다른 유전자 hia 및 hsf가 발견된 것을 문헌에 발표하였다(Barenkamp, S. 및 St, Geme Ⅲ, J. 1996 Molecular Microbiology 19: 1215-1233, St. Geme Ⅲ, J. 등, 1996, Journal of Bacteriology 178: 6281-6287). 따라서 본 발명자들은 상기 유전자를 hiaNm으로 재명명하였다(HI1732, AIDA-I의 상동체로서 처음 확인된 H. influenzae 유전자는 또한 Barenkamp 및 St. Geme Ⅲ의 논문에 비추어 hia로 재명명되었다.

본 명세서를 통하여, 발명을 어떠한 하나의 실시예 또는 특징으로 제한하지 않고 본 발명의 바람직한 실시예를 기술하는 것을 목적으로 한다. 따라서 당업자라면, 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 예시된 각 실시예에서, 본 명세서에 따라, 다양한 변형과 변경을 할 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 이러한 모든 변형과 변경은 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함되는 것으로 의도한다.

<110> THE UNIVERSITY OF QUEENSLAND ISIS INNOVATION LIMITED <120> NOVEL SURFACE PROTEIN OF NEISSERIA MENINGITIDS <130> IPP000217AU <150> GB 9726398.2 <151> 1997-12-12 <160> 31 <170> KOPATIN 1.5 <210> 1 <211> 2308 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <220> <221> CDS <222> (276)..(2054) <400> 1 gaaaaaccac aggaatttat cagcaaaaac agaaacccca ccgccgtcat tcccgcaaaa 60 gcgggaatcc agacccgtcg gcacggaaaa cttaccgaat aaaacagttt ccttagattc 120 cacgtcccag attcccgcct tcgcggggaa tgacgagatt ttaagttggg ggaatttatc 180 agaaaacccc caacccccaa aaaccgggcg gatgccgcac catccgcccc caaaccccga 240 tttaaccatt caaacaaacc aaaagaaaaa acaaa atg aac aaa ata tac 290 Met Asn Lys Ile Tyr 1 5 cgc atc att tgg aat agt gcc ctc aat gcc tgg gtc gtc gta tcc gag 338 Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp Val Val Val Ser Glu 10 15 20 ctc aca cgc aac cac acc aaa cgc gcc tcc gca acc gtg aag acc gcc 386 Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala Thr Val Lys Thr Ala 25 30 35 gta ttg gcg aca ctg ttg ttt gca acg gtt cag gca agt gct 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ggc gat gcc cta aac gtc aat cag ctg caa aac agc 1442 Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val Asn Gln Leu Gln Asn Ser 375 380 385 ggt tgg aat ttg gat tcc aaa gcg gtt gca ggt tct tcg ggc aaa gtc 1490 Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala Gly Ser Ser Gly Lys Val 390 395 400 405 atc agc ggc aat gtt tcg ccg agc aag gga aag atg gat gaa acc gtc 1538 Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly Lys Met Asp Glu Thr Val 410 415 420 aac att aat gcc ggc aac aac atc gag att acc cgc aac ggt aaa aat 1586 Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile Thr Arg Asn Gly Lys Asn 425 430 435 atc gac atc gcc act tcg atg acc ccg cag ttt tcc agc gtt tcg ctc 1634 Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gln Phe Ser Ser Val Ser Leu 440 445 450 ggc gcg ggg gcg gat gcg ccc act ttg agc gtg gat ggg gac gca ttg 1682 Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp Gly Asp Ala Leu 455 460 465 aat gtc ggc agc aag aag gac aac aaa ccc gtc cgc att acc aat gtc 1730 Asn Val Gly Ser Lys Lys Asp Asn Lys Pro Val Arg Ile Thr Asn Val 470 475 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Thr Glu Lys 130 135 140 Leu Ser Phe Ser Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn Ile Thr Ser Asp Thr 145 150 155 160 Lys Gly Leu Asn Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly Thr Asn Gly Asp Thr 165 170 175 Thr Val His Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu Thr Asp Thr Leu Leu 180 185 190 Asn Thr Gly Ala Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp Asn Val Thr Asp Asp 195 200 205 Glu Lys Lys Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly Trp 210 215 220 Asn Ile Lys Gly Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala Ser Asp Asn Val Asp 225 230 235 240 Phe Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lys 245 250 255 Thr Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Lys Thr Glu 260 265 270 Val Lys Ile Gly Val Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly Lys 275 280 285 Leu Val Thr Gly Lys Asp Lys Gly Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp Glu 290 295 300 Gly Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn Lys 305 310 315 320 Ala Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gln Thr Gly Gln 325 330 335 Ala Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Asn Val 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Tyr Ser 545 550 555 560 Ser Ile Ser Asp Gly Gly Asn Trp Ile Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly 565 570 575 Asn Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gln Trp 580 585 590 *** <210> 3 <211> 1779 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 3 atgaacaaaa tataccgcat catttggaat agtgccctca atgcctgggt cgtcgtatcc 60 gagctcacac gcaaccacac caaacgcgcc tccgcaaccg tgaagaccgc cgtattggcg 120 acactgttgt ttgcaacggt tcaggcaagt gctaacaatg aaagaccaag aaagaaagat 180 ttatatttag accccgtaca acgcactgtt gccgtgttga tagtcaattc cgataaagaa 240 ggcacgggag aaaaagaaaa agtagaagaa aattcagatt gggcagtata tttcaacgag 300 aaaggagtac taacagccag agaaatcacc ctcaaagccg gcgacaacct gaaaatcaaa 360 caaaacggca caaacttcac ctactcgctg aaaaaagacc tcacagatct gaccagtgtt 420 ggaactgaaa aattatcgtt tagcgcaaac ggcaataaag tcaacatcac aagcgacacc 480 aaaggcttga attttgcgaa agaaacggct gggacgaacg gcgacaccac ggttcatctg 540 aacggtattg gttcgacttt gaccgatacg ctgctgaata ccggagcgac cacaaacgta 600 accaacgaca acgttaccga tgacgagaaa aaacgtgcgg caagcgttaa 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1500 aaaggcgtgg cgcaaaactt gaacaaccgc atcgacaatg tggacggcaa cgcgcgtgcg 1560 ggcatcgccc aagcgattgc aaccgcaggt ctggttcagg cgtatttgcc cggcaagagt 1620 atgatggcga tcggcggcgg cacttatcgc ggcgaagccg gttacgccat cggctactcc 1680 agtatttccg acggcggaaa ttggattatc aaaggcacgg cttccggcaa ttcgcgcggc 1740 catttcggtg cttccgcatc tgtcggttat cagtggtaa 1779 <210> 4 <211> 1797 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <220> <221> CDS <222> (1)..(1797) <400> 4 atg aac aaa ata tcc cgc atc att tgg aat agt gcc ctc aat gcc tgg 48 Met Asn Lys Ile Ser Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp 1 5 10 15 gtc gtc gta tcc gag ctc aca cgc aac cac acc aaa cgc gcc tcc gca 96 Val Val Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 20 25 30 acc gtg gcg acc gcc gta ttg gcg aca ctg ttg ttt gca acg gtt cag 144 Thr Val Ala Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gln 35 40 45 gcg aat gct acc gat gac gac gat tta tat tta gaa ccc gta caa cgc 192 Ala Asn Ala Thr Asp Asp Asp Asp Leu Tyr Leu Glu Pro Val Gln Arg 50 55 60 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gta aat gtc ggc gat gcc cta aac gtc aat cag 1152 Thr Val Met Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val Asn Gln 370 375 380 ctg caa aac agc ggt tgg aat ttg gat tcc aaa gcg gtt gca ggt tct 1200 Leu Gln Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala Gly Ser 385 390 395 400 tcg ggc aaa gtc atc agc ggc aat gtt tcg ccg agc aag gga aag atg 1248 Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly Lys Met 405 410 415 gat gaa acc gtc aac att aat gcc ggc aac aac atc gag att acc cgc 1296 Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile Thr Arg 420 425 430 aac ggt aaa aat atc gac atc gcc act tcg atg acc ccg cag ttt tcc 1344 Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gln Phe Ser 435 440 445 agc gtt tcg ctc ggc gcg ggg gcg gat gcg ccc act ttg agc gtg gat 1392 Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp 450 455 460 ggg gac gca ttg aat gtc ggc agc aag aag gac aac aaa ccc gtc cgc 1440 Gly Asp Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Lys Asp Asn Lys Pro Val Arg 465 470 475 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atc gaa tct aca gga gat ata ggt tgg agt ata tat tac gac gat 288 Glu Ile Glu Ser Thr Gly Asp Ile Gly Trp Ser Ile Tyr Tyr Asp Asp 85 90 95 cac aac act cta cac ggc gca acc gtt acc ctc aaa gcc ggc gac aac 336 His Asn Thr Leu His Gly Ala Thr Val Thr Leu Lys Ala Gly Asp Asn 100 105 110 ctg aaa atc aaa caa agc ggc aaa gac ttc acc tac tcg ctg aaa aaa 384 Leu Lys Ile Lys Gln Ser Gly Lys Asp Phe Thr Tyr Ser Leu Lys Lys 115 120 125 gag ctg aaa gac ctg acc agt gtt gaa act gaa aaa tta tcg ttt ggc 432 Glu Leu Lys Asp Leu Thr Ser Val Glu Thr Glu Lys Leu Ser Phe Gly 130 135 140 gca aac ggt aat aaa gtc aac atc aca agc gac acc aaa ggc ttg aat 480 Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn Ile Thr Ser Asp Thr Lys Gly Leu Asn 145 150 155 160 ttt gcg aaa gaa acg gct ggg acg aac ggc gac ccc acg gtt cat ctg 528 Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly Thr Asn Gly Asp Pro Thr Val His Leu 165 170 175 aac ggt atc ggt tcg act ttg acc gat acg ctt gcg ggt tct tct gct 576 Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu Thr Asp Thr Leu Ala Gly Ser Ser Ala 180 185 190 tct cac gtt gat gcg ggt aac caa agt aca cat tac act cgt gca gca 624 Ser His Val Asp Ala Gly Asn Gln Ser Thr His Tyr Thr Arg Ala Ala 195 200 205 agt att aag gat gtg ttg aat gcg ggt tgg aat att aag ggt gtt aaa 672 Ser Ile Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly Trp Asn Ile Lys Gly Val Lys 210 215 220 act ggc tca aca act ggt caa tca gaa aat gtc gat ttc gtc cgc act 720 Thr Gly Ser Thr Thr Gly Gln Ser Glu Asn Val Asp Phe Val Arg Thr 225 230 235 240 tac gac aca gtc gag ttc ttg agc gca gat acg aaa aca acg act gtt 768 Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lys Thr Thr Thr Val 245 250 255 aat gtg gaa agc aaa gac aac ggc aag aga acc gaa gtt aaa atc ggt 816 Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Arg Thr Glu Val Lys Ile Gly 260 265 270 gcg aag act tct gtt att aaa gaa aaa gac ggt aag ttg gtt act ggt 864 Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly Lys Leu Val Thr Gly 275 280 285 aaa ggc aaa ggc gag aat ggt tct tct aca gac gaa ggc gaa ggc tta 912 Lys Gly Lys Gly Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp Glu Gly Glu Gly Leu 290 295 300 gtg act gca aaa gaa gtg att gat gca gta aac aag gct ggt tgg aga 960 Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn Lys Ala Gly Trp Arg 305 310 315 320 atg aaa aca aca acc gct aat ggt caa aca ggt caa gct gac aag ttt 1008 Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gln Thr Gly Gln Ala Asp Lys Phe 325 330 335 gaa acc gtt aca tca ggc aca aaa gta acc ttt gct agt ggt aat ggt 1056 Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Lys Val Thr Phe Ala Ser Gly Asn Gly 340 345 350 aca act gcg act gta agt aaa gat gat caa ggc aac atc act gtt aag 1104 Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gln Gly Asn Ile Thr Val Lys 355 360 365 tat gat gta aat gtc ggc gat gcc cta aac gtc aat cag ctg caa aac 1152 Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val Asn Gln Leu Gln Asn 370 375 380 agc ggt tgg aat ttg gat tcc aaa gcg gtt gca ggt tct tcg ggc aaa 1200 Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala Gly Ser Ser Gly Lys 385 390 395 400 gtc atc agc ggc aat gtt tcg ccg agc aag gga aag atg gat gaa acc 1248 Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly Lys Met Asp Glu Thr 405 410 415 gtc aac att aat gcc ggc aac aac atc gag att acc cgc aac ggc aaa 1296 Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile Thr Arg Asn Gly Lys 420 425 430 aat atc gac atc gcc act tcg atg acc ccg caa ttt tcc agc gtt tcg 1344 Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gln Phe Ser Ser Val Ser 435 440 445 ctc ggc gcg ggg gcg gat gcg ccc act tta agc gtg gat gac gag ggc 1392 Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp Asp Glu Gly 450 455 460 gcg ttg aat gtc ggc agc aag gat gcc aac aaa ccc gtc cgc att acc 1440 Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Asp Ala Asn Lys Pro Val Arg Ile Thr 465 470 475 480 aat gtc gcc ccg ggc gtt aaa gag ggg gat gtt aca aac gtc gca caa 1488 Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val Thr Asn Val Ala Gln 485 490 495 ctt aaa ggt gtg gcg caa aac ttg aac aac cgc atc gac aat gtg aac 1536 Leu Lys Gly Val Ala Gln Asn Leu Asn Asn Arg Ile Asp Asn Val Asn 500 505 510 ggc aac gcg cgc gcg ggt atc gcc caa gcg att gca acc gca ggt ttg 1584 Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gln Ala Ile Ala Thr Ala Gly Leu 515 520 525 gct cag gcc tat ttg ccc ggc aag agt atg atg gcg atc ggc ggc ggt 1632 Ala Gln Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala Ile Gly Gly Gly 530 535 540 act tat ctc ggc gaa gcc ggt tac gcc atc ggc tac tcg agc att tct 1680 Thr Tyr Leu Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser Ile Ser 545 550 555 560 gac act ggg aat tgg gtt atc aag ggc acg gct tcc ggc aat tcg cgc 1728 Asp Thr Gly Asn Trp Val Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn Ser Arg 565 570 575 ggt cat ttc ggt act tcc gca tct gtc ggt tat cag tgg taa 1770 Gly His Phe Gly Thr Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gln Trp *** 580 585 590 <210> 19 <211> 589 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 19 Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp 1 5 10 15 Val Val Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 20 25 30 Thr Val Ala Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Ser Ala Thr Val Gln 35 40 45 Ala Asn Ala Thr Asp Thr Asp Glu Asp Glu Glu Leu Glu Ser Val Ala 50 55 60 Arg Ser Ala Leu Val Leu Gln Phe Met Ile Asp Lys Glu Gly Asn Gly 65 70 75 80 Glu Ile Glu Ser Thr Gly Asp Ile Gly Trp Ser Ile Tyr Tyr Asp Asp 85 90 95 His Asn Thr Leu His Gly Ala Thr Val Thr Leu Lys Ala Gly Asp Asn 100 105 110 Leu Lys Ile Lys Gln Ser Gly Lys Asp Phe Thr Tyr Ser Leu Lys Lys 115 120 125 Glu Leu Lys Asp Leu Thr Ser Val Glu Thr Glu Lys Leu Ser Phe Gly 130 135 140 Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn Ile Thr Ser Asp Thr Lys Gly Leu Asn 145 150 155 160 Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly Thr Asn Gly Asp Pro Thr Val His Leu 165 170 175 Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu Thr Asp Thr Leu Ala Gly Ser Ser Ala 180 185 190 Ser His Val Asp Ala Gly Asn Gln Ser Thr His Tyr Thr Arg Ala Ala 195 200 205 Ser Ile Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly Trp Asn Ile Lys Gly Val Lys 210 215 220 Thr Gly Ser Thr Thr Gly Gln Ser Glu Asn Val Asp Phe Val Arg Thr 225 230 235 240 Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lys Thr Thr Thr Val 245 250 255 Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Arg Thr Glu Val Lys Ile Gly 260 265 270 Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly Lys Leu Val Thr Gly 275 280 285 Lys Gly Lys Gly Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp Glu Gly Glu Gly Leu 290 295 300 Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn Lys Ala Gly Trp Arg 305 310 315 320 Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gln Thr Gly Gln Ala Asp Lys Phe 325 330 335 Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Lys Val Thr Phe Ala Ser Gly Asn Gly 340 345 350 Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gln Gly Asn Ile Thr Val Lys 355 360 365 Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val Asn Gln Leu Gln Asn 370 375 380 Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala Gly Ser Ser Gly Lys 385 390 395 400 Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly Lys Met Asp Glu Thr 405 410 415 Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile Thr Arg Asn Gly Lys 420 425 430 Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gln Phe Ser Ser Val Ser 435 440 445 Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp Asp Glu Gly 450 455 460 Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Asp Ala Asn Lys Pro Val Arg Ile Thr 465 470 475 480 Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val Thr Asn Val Ala Gln 485 490 495 Leu Lys Gly Val Ala Gln Asn Leu Asn Asn Arg Ile Asp Asn Val Asn 500 505 510 Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gln Ala Ile Ala Thr Ala Gly Leu 515 520 525 Ala Gln Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala Ile Gly Gly Gly 530 535 540 Thr Tyr Leu Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser Ile Ser 545 550 555 560 Asp Thr Gly Asn Trp Val Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn Ser Arg 565 570 575 Gly His Phe Gly Thr Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gln Trp *** 580 585 590 <210> 20 <211> 1776 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <220> <221> CDS <222> (1)..(1776) <400> 20 atg aac aaa ata tac cgc atc att tgg aat agt gcc ctc aat gca tgg 48 Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp 1 5 10 15 gtc gtc gta tcc gag ctc aca cgc aac cac acc aaa cgc gcc tcc gca 96 Val Val Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 20 25 30 acc gtg aag acc gcc gta ttg gcg act ctg ttg ttt gca acg gtt cag 144 Thr Val Lys Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gln 35 40 45 gca agt gct aac aat gaa gag caa gaa gaa gat tta tat tta gac ccc 192 Ala Ser Ala Asn Asn Glu Glu Gln Glu Glu Asp Leu Tyr Leu Asp Pro 50 55 60 gta caa cgc act gtt gcc gtg ttg ata gtc aat tcc gat aaa gaa ggc 240 Val Gln Arg Thr Val Ala Val Leu Ile Val Asn Ser Asp Lys Glu Gly 65 70 75 80 acg gga gaa aaa gaa aaa gta gaa gaa aat tca gat tgg gca gta tat 288 Thr Gly Glu Lys Glu Lys Val Glu Glu Asn Ser Asp Trp Ala Val Tyr 85 90 95 ttc aac gag aaa gga gta cta aca gcc aga gaa atc acc ctc aaa gcc 336 Phe Asn Glu Lys Gly Val Leu Thr Ala Arg Glu Ile Thr Leu Lys Ala 100 105 110 ggc gac aac ctg aaa atc aaa caa aac ggc aca aac ttc acc tac tcg 384 Gly Asp Asn Leu Lys Ile Lys Gln Asn Gly Thr Asn Phe Thr Tyr Ser 115 120 125 ctg aaa aaa gac ctc aca gat ctg acc agt gtt gga act gaa aaa tta 432 Leu Lys Lys Asp Leu Thr Asp Leu Thr Ser Val Gly Thr Glu Lys Leu 130 135 140 tcg ttt agc gca aac ggc aat aaa gtc aac atc aca agc gac acc aaa 480 Ser Phe Ser Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn Ile Thr Ser Asp Thr Lys 145 150 155 160 ggc ttg aat ttt gcg aaa gaa acg gct ggg acg aac ggc gac acc acg 528 Gly Leu Asn Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly Thr Asn Gly Asp Thr Thr 165 170 175 gtt cat ctg aac ggt att ggt tcg act ttg acc gat acg ctg ctg aat 576 Val His Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu Thr Asp Thr Leu Leu Asn 180 185 190 acc gga gcg acc aca aac gta acc aac gac aac gtt acc gat gac gag 624 Thr Gly Ala Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp Asn Val Thr Asp Asp Glu 195 200 205 aaa aaa cgt gcg gca agc gtt aaa gac gta tta aac gct ggc tgg aac 672 Lys Lys Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly Trp Asn 210 215 220 att aaa ggc gtt aaa ccc ggt aca aca gct tcc gat aac gtt gat ttc 720 Ile Lys Gly Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala Ser Asp Asn Val Asp Phe 225 230 235 240 gtc cgc act tac gac aca gtc gag ttc ttg agc gca gat acg aaa aca 768 Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lys Thr 245 250 255 acg act gtt aat gtg gaa agc aaa gac aac ggc aag aaa acc gaa gtt 816 Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Lys Thr Glu Val 260 265 270 aaa atc ggt gcg aag act tct gtt att aaa gaa aaa gac ggt aag ttg 864 Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly Lys Leu 275 280 285 gtt act ggt aaa gac aaa ggc gag aat ggt tct tct aca gac gaa ggc 912 Val Thr Gly Lys Asp Lys Gly Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp Glu Gly 290 295 300 gaa ggc tta gtg act gca aaa gaa gtg att gat gca gta aac aag gct 960 Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn Lys Ala 305 310 315 320 ggt tgg aga atg aaa aca aca acc gct aat ggt caa aca ggt caa gct 1008 Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gln Thr Gly Gln Ala 325 330 335 gac aag ttt gaa acc gtt aca tca ggc aca aat gta acc ttt gct agt 1056 Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Asn Val Thr Phe Ala Ser 340 345 350 ggt aaa ggt aca act gcg act gta agt aaa gat gat caa ggc aac atc 1104 Gly Lys Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gln Gly Asn Ile 355 360 365 act gtt atg tat gat gta aat gtc ggc gat gcc cta aac gtc aat cag 1152 Thr Val Met Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val Asn Gln 370 375 380 ctg caa aac agc ggt tgg aat ttg gat tcc aaa gcg gtt gca ggt tct 1200 Leu Gln Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala Gly Ser 385 390 395 400 tcg ggc aaa gtc atc agc ggc aat gtt tcg ccg agc aag gga aag atg 1248 Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly Lys Met 405 410 415 gat gaa acc gtc aac att aat gcc ggc aac aac atc gag att acc cgc 1296 Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile Thr Arg 420 425 430 aac ggt aaa aat atc gac atc gcc act tcg atg acc ccg cag ttt tcc 1344 Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gln Phe Ser 435 440 445 agc gtt tcg ctc ggc gcg ggg gcg gat gcg ccc act ttg agc gtg gat 1392 Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp 450 455 460 ggg gac gca ttg aat gtc ggc agc aag aag gac aac aaa ccc gtc cgc 1440 Gly Asp Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Lys Asp Asn Lys Pro Val Arg 465 470 475 480 att acc aat gtc gcc ccg ggc gtt aaa gag ggg gat gtt aca aac gtc 1488 Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val Thr Asn Val 485 490 495 gca caa ctt aaa ggc gtg gcg caa aac ttg aac aac cgc atc gac aat 1536 Ala Gln Leu Lys Gly Val Ala Gln Asn Leu Asn Asn Arg Ile Asp Asn 500 505 510 gtg gac ggc aac gcg cgt gcg ggc atc gcc caa gcg att gca acc gca 1584 Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gln Ala Ile Ala Thr Ala 515 520 525 ggt ctg gtt cag gcg tat ttg ccc ggc aag agt atg atg gcg atc ggc 1632 Gly Leu Val Gln Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala Ile Gly 530 535 540 ggc ggc act tat cgc ggc gaa gcc ggt tac gcc atc ggc tac tcc agt 1680 Gly Gly Thr Tyr Arg Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser 545 550 555 560 att tcc gac ggc gga aat tgg att atc aaa ggc acg gct tcc ggc aat 1728 Ile Ser Asp Gly Gly Asn Trp Ile Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn 565 570 575 tcg cgc ggc cat ttc ggt gct tcc gca tct gtc ggt tat cag tgg taa 1776 Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gln Trp *** 580 585 590 <210> 21 <211> 591 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 21 Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp 1 5 10 15 Val Val Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 20 25 30 Thr Val Lys Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gln 35 40 45 Ala Ser Ala Asn Asn Glu Glu Gln Glu Glu Asp Leu Tyr Leu Asp Pro 50 55 60 Val Gln Arg Thr Val Ala Val Leu Ile Val Asn Ser Asp Lys Glu Gly 65 70 75 80 Thr Gly Glu Lys Glu Lys Val Glu Glu Asn Ser Asp Trp Ala Val Tyr 85 90 95 Phe Asn Glu Lys Gly Val Leu Thr Ala Arg Glu Ile Thr Leu Lys Ala 100 105 110 Gly Asp Asn Leu Lys Ile Lys Gln Asn Gly Thr Asn Phe Thr Tyr Ser 115 120 125 Leu Lys Lys Asp Leu Thr Asp Leu Thr Ser Val Gly Thr Glu Lys Leu 130 135 140 Ser Phe Ser Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn Ile Thr Ser Asp Thr Lys 145 150 155 160 Gly Leu Asn Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly Thr Asn Gly Asp Thr Thr 165 170 175 Val His Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu Thr Asp Thr Leu Leu Asn 180 185 190 Thr Gly Ala Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp Asn Val Thr Asp Asp Glu 195 200 205 Lys Lys Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly Trp Asn 210 215 220 Ile Lys Gly Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala Ser Asp Asn Val Asp Phe 225 230 235 240 Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lys Thr 245 250 255 Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Lys Thr Glu Val 260 265 270 Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly Lys Leu 275 280 285 Val Thr Gly Lys Asp Lys Gly Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp Glu Gly 290 295 300 Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn Lys Ala 305 310 315 320 Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gln Thr Gly Gln Ala 325 330 335 Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Asn Val Thr Phe Ala Ser 340 345 350 Gly Lys Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gln Gly Asn Ile 355 360 365 Thr Val Met Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val Asn Gln 370 375 380 Leu Gln Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala Gly Ser 385 390 395 400 Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly Lys Met 405 410 415 Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile Thr Arg 420 425 430 Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gln Phe Ser 435 440 445 Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp 450 455 460 Gly Asp Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Lys Asp Asn Lys Pro Val Arg 465 470 475 480 Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val Thr Asn Val 485 490 495 Ala Gln Leu Lys Gly Val Ala Gln Asn Leu Asn Asn Arg Ile Asp Asn 500 505 510 Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gln Ala Ile Ala Thr Ala 515 520 525 Gly Leu Val Gln Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala Ile Gly 530 535 540 Gly Gly Thr Tyr Arg Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser 545 550 555 560 Ile Ser Asp Gly Gly Asn Trp Ile Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn 565 570 575 Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gln Trp *** 580 585 590 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' oligonucleotide primer for PCR <400> 22 ttagattcca cgtcccagat t 21 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' oligonucleotide primer for PCR <400> 23 cttcccttca aaccttcc 18 <210> 24 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' oligonucleotide primer for PCR <400> 24 ggtcgcggat ccatgaacaa aatataccgc at 32 <210> 25 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' oligonucleotide primer for PCR <400> 25 tcacccaagc ttaagccctt accactgata ac 32 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' oligonucleotide primer for PCR <400> 26 ccaaaccccg atttaacc 18 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' oligonucleotide primer for PCR <400> 27 aatcgccacc cttcccttc 19 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer for PCR <400> 28 tttgcaacgg ttcaggca 18 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer for PCR <400> 29 tattcagcag cgtatcgg 18 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer for PCR <400> 30 tgcctgaacc gttgcaaa 18 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer for PCR <400> 31 ccgatacgct gctgaata

Claims

SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 307-332로 표시되는 분리된 폴리펩타이드.
하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 분리된 폴리펩타이드:

(a) SEQ ID NO: 2에 따르는 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드;

(b) SEQ ID NO: 5에 따르는 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드;

(c) SEQ ID NO: 7에 따르는 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드;

(d) SEQ ID NO: 9에 따르는 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드;

(e) SEQ ID NO: 11에 따르는 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드;

(f) SEQ ID NO: 13에 따르는 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드;

(g) SEQ ID NO: 15에 따르는 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드;

(h) SEQ ID NO: 17에 따르는 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드;

(i) SEQ ID NO: 19에 따르는 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드; 및

(j) SEQ ID NO: 21에 따르는 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드.
SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19 또는 SEQ ID NO:21과 90-99% 서열 상동성을 가지는 분리된 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 N. meningitidis의 세포 표면 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 분리된 폴리펩티드 및 융합 파트너를 포함하는 분리된 단백질.
제1항에 따르는 폴리펩타이드를 코딩하는 분리된 핵산.
제2항에 따르는 폴리펩타이드를 코딩하는 분리된 핵산.
제3항에 따르는 폴리펩타이드를 코딩하는 분리된 핵산.
하기 군에서 선택되는 뉴클레오타이드 서열로 표시되는 분리된 핵산:

(1) SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 서열;

(2) SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 서열;

(3) SEQ ID NO: 4의 뉴클레오타이드 서열;

(4) SEQ ID NO: 6의 뉴클레오타이드 서열;

(5) SEQ ID NO: 8의 뉴클레오타이드 서열;

(6) SEQ ID NO: 10의 뉴클레오타이드 서열;

(7) SEQ ID NO: 12의 뉴클레오타이드 서열;

(8) SEQ ID NO: 14의 뉴클레오타이드 서열;

(9) SEQ ID NO: 16의 뉴클레오타이드 서열;

(10) SEQ ID NO: 18의 뉴클레오타이드 서열;

(11) SEQ ID NO: 20의 뉴클레오타이드 서열; 또는

(12) SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 1194-1271.
SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18 또는 SEQ ID NO:20과 90-99% 서열 상동성을 가지는 분리된 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 N. meningitidis의 세포 표면 폴리펩티드를 코딩하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
(ⅰ) 적합한 숙주로부터 핵산 추출물을 수득하는 단계;

(ⅱ) 선택적으로 퇴화하며, 각각이 제7항에 따르는 핵산 서열로 표시되는 프라이머들을 생성하는 단계; 및

(ⅲ) 상기 프라이머를 사용하여 핵산 증폭기술을 통해 상기 핵산 추출물로부터 하나 이상의 증폭산물을 증폭하는 단계

를 포함하는 핵산의 수득방법.
제10항에 있어서,

상기 핵산 추출물이 나이세리아 속 세균에서 유래되는 수득방법.
제11항에 있어서,

상기 핵산 추출물이 수막염균의 균주에서 유래되는 수득방법.
제10항에 있어서,

상기 프라이머가 SEQ ID NO: 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 및 31로 이루어진 군에서 선택되는 수득방법.
제13항에 있어서,

상기 핵산의 증폭 기술이 PCR인 수득방법.
제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따르는 분리된 핵산을 포함하는 발현 벡터로서, 상기 분리된 핵산이 전사 조절 뉴클레오타이드 서열, 번역 조절 뉴클레오타이드 서열, 또는 이들 모두에 작동가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제15항의 발현 벡터로 형질전환되거나 변형되는 숙주 세포.
(A) 재조합 폴리펩타이드가 숙주 세포에 의해 발현되도록 제16항에 따르는 숙주 세포를 배양하는 단계; 및

(B) 상기 재조합 폴리펩타이드를 분리하는 단계

를 포함하는 재조합 폴리펩타이드의 생산방법.
제1항에 따르는 분리된 폴리펩타이드에 결합하는 항체 또는 항원-결합 항체의 단편.
제2항에 따르는 분리된 폴리펩타이드에 결합하는 항체 또는 항원-결합 항체의 단편.
제3항에 따르는 분리된 폴리펩타이드에 결합하는 항체 또는 항원-결합 항체의 단편.
제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 항체 또는 항원-결합 항체 단편이 수막염균과 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항원-결합 항체 단편.
제2항에 따르는 폴리펩타이드를 포함하는 수막균 감염의 검출 또는 진단용 키트
제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따르는 분리된 핵산을 포함하는 수막균 감염의 검출 또는 진단용 키트.
제23항에 있어서,

SEQ ID NO: 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 및 31로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 선택적으로 열안정성 폴리머라제를 상기 분리된 핵산을 동정하는 데 사용하는 검출 또는 진단용 키트.
제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따르는 항체 또는 항원-결합 항체 단편을 포함하는 수막균 감염의 검출 또는 진단용 키트.
삭제
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따르는 폴리펩타이드의 제약학적 유효량을 포함하는 인간의 수막염균 감염의 예방 또는 치료용 제약학적 조성물.
제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따르는 항체 또는 항원-결합 항체 단편을 포함하는 인간의 수막염균 감염의 예방 또는 치료용 제약학적 조성물.
제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따르는 분리된 핵산을 포함하는 인간의 수막염균 감염의 예방 또는 치료용 제약학적 조성물.
제27항에 있어서,

백신인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제28항에 있어서,

백신인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제29항에 있어서,

백신인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따르는 항체 또는 항원-결합 항체 단편을 포함하는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따르는 분리된 폴리펩타이드 동정용 키트.
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