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KR100567277B1 - 항-항-ｔ 세포 수용체 브이베타 항체 또는 이 항체에 의해 인식되는 펩티드 및 내분비선 분비 조절 단백질 ｉ(ｅｓｒｐ１)을 사용하는 질병의 진단 및 치료 방법 - Google Patents

항-항-ｔ 세포 수용체 브이베타 항체 또는 이 항체에 의해 인식되는 펩티드 및 내분비선 분비 조절 단백질 ｉ(ｅｓｒｐ１)을 사용하는 질병의 진단 및 치료 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 자기면역 질환의 여러 조직 표적의 분비 세포 상의 모노클로날 및 폴리클로날 항체 인식 분자를 제공함으로써 자기면역 질환 및 그외에 호르몬 조절장애, 과인슐린혈증 및 인슐린 내성이 관여된 질환을 예방 및 치료하는 통합적 방법을 가능케 한다. 본 발명은 또한 사람 혈청 또는 그외 체액 중 유사한 항체 검출 방법을 제공하며, 이는 진단 키트의 개발에 사용될 수 있다. 본 발명의 치료 방법은 항체, 이들의 표적 분자, 및 항체 및 이들의 표적 분자의 코딩 서열을 포함하는 벡터의 제제를 투여하는 것을 포함한다.
자기면역, 자기항체, 자기면역 질환, 인슐린, 당뇨병

Description

항-항-Ｔ 세포 수용체 브이베타 항체 또는 이 항체에 의해 인식되는 펩티드 및 내분비선 분비 조절 단백질 Ｉ (ＥＳＲＰ１)을 사용하는 질병의 진단 및 치료 방법 {Diagnosis And Treatment of Disease Using Anti-Anti-T-Cell Receptor Vbeta Antibodies or Peptides Which Are Recognized by Said Antibodies, And Endocrine Secretion Regulatory Protein I (ESRP1)}
본 발명은 각종 자기면역 질환 및 그외 질병의 원인인 독특한 자기항체 (autoantibody)의 개발에 관한 것이다. 본 발명은 모노클로날 및 폴리클로날 형태의 자기항체 및 이 항체들이 인식하는 분자의 진단 및 예방 용도를 제공한다. 더 구체적으로는 어린이 및 성인에게서 동일한 특이성으로 자기항체의 발생을 특이적으로 억제하는 억제제로서의 상기 항체 및 이들 항체가 인식하는 분자의 용도를 제공한다. 이들 항체 및 표적 분자는 광범위한 자기면역 질환 및 기타 질병에서의 진단, 예방 치료 용도가 있음을 특허청구한다. 본 발명의 기술적 배경은 대부분 당뇨병에 집중되어 있으나, 이는 단지 설명이나 예시를 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 이것으로 제한하는 것은 아니다.
사람 자기면역 질환의 범위
자기면역 현상과 관련된 질환은 기관 하나의 파괴적 병변을 수반하는 상태, 또는 조직이나 기관의 손상이 널리 퍼진 상태를 포괄하는 범위 내에서 분류될 수 있다.
그 범위 중 기관 특이적인 경우에는 가장 흔히 영향을 받는 기관이 갑상선, 부신, 위, 췌장의 랑게르한스섬 (인슐린 생산 세포가 존재)이며, 기관 비특이적인 경우에는 류마티스성 또는 전신성 (예: 전신성 홍반성루푸스) 장애가 두드러진다. 자기면역 질환은, 드문 경우이긴 하지만 조직 파괴까지 초래할 수 있는 격발성 바이러스 감염과도 관련되어 있다. 자기면역의 경우 손상 과정이 느리게 진행되며 때로는 질환이 만연되기까지 몇 년이 걸린다. 아래에는 자기 항원에 대한 면역 관용 (immunological tolerance)의 붕괴를 수반하는 자기면역 현상이 야기하는 기관 특이적 자기면역 질환을 설명했다.
갑상선
갑상선 자기면역 질환은 다양한 임상 상태를 수반하지만 이런 임상 상태는 공통적인 조직병태 현상을 가져온다. 단핵 림프 세포에 의한 갑상선의 확산 침윤이 그것이다. 이런 질환의 종류로는 1차 점액수종, 하시모토 갑상선염 및 그레이브스병이 있다. 한 질병에서 다른 질병으로의 진행이 드문 것은 아니다. 1차 점액수종은 자발성 갑상선 기능저하증의 가장 일반적인 형태이며, 만성 염증 과정의 마지막 단계이다. 갑상선종 형성은 없고, 갑상선은 거의 완전히 위축된다.
하시모토 갑상선염도 갑상선 기능저하증에 관련되지만 갑상선종을 수반한다. 하시모토 갑상선염의 여러 임상적 형태에서는 갑상선 호르몬의 양이 뇌하수체에 의해 생성된 갑상선 자극 호르몬(TSH) 양의 증가에 의해 보충되거나 TSH 양 상승에도 불구하고 임상적 갑상선 기능저하가 있을 수 있다. 이러한 두 자기면역성 파괴 질 환의 경우 여성이 남성에 비해 병에 걸릴 확율이 5배 정도 높다.
갑상선 항진증의 가장 일반적인 유형은 갑상선종 또는 안구돌출증을 수반하거나 수반하지 않는 그레이브스병이다. 이 병은 여러 번의 완화 및 악화라는 특징이 있다. 그럼에도 불구하고 자기면역 과정은 갑상선 자극 항체의 생성으로 인해 갑상선의 과자극 (hyperstimulation)을 유도하며, 결과적으로 갑상선이 종종 파괴된다. 남성보다는 여성에게서 5 : 1의 비율로 빈발한다.
모든 갑상선 자기면역 질환은 갑상선에 대한 여러 자기항체를 입증함으로써 임상적 진단을 확증한다. 자기항체는 갑상선 세포질 항원 (예: 티로글로불린), 세포 표면 성분 (예: 갑상선 퍼옥시다제), 및 갑상선 세포 표면에 발현된 TSH 수용체 (그레이브스병의 경우)에 대해 유도될 수 있다.
위(胃)
위의 자기면역 질환은 위저(胃底) 또는 유문동(幽門洞)에 관계하며, 위선(胃腺)의 이 2 부위에 영향을 주는 다양한 정도의 염증을 유발한다. 일반적으로 이 과정을 위염이라 부른다. 위저에서는 점막 위축이 관찰되며, 결과적으로 내인성 인자 (IF) 생성이 감소하여 비타민 B12의 흡수가 불량해 지고, 이어서 악성 빈혈이 발병한다. 이런 상태에서는 IF 및 벽 세포에 대한 항체가 생성되며, 이 항체는 이 병에 걸린 환자의 90 %에 존재한다. 결국 벽 세포가 파괴된다. 그러나 주요 세포 및 점액 세포는 이들에 대한 순환 항체가 없음에도 불구하고 파괴된다. 남성에 비해 여성에게서 3 : 1로 빈발한다. 유문동에서의 위 생성 세포에 대한 항체는 일부 전정위염 환자에게서 확인되었다. 이런 종류의 위염은 위궤양을 수반하며, 일부 환자에게서는 위 세포를 자극하는 항체도 확인되었다.
부신, 생식선 및 태반
부신의 자기면역 질환 (아디슨병)은 단핵세포가 이 샘을 과다하게 침윤한다는 것과 부신 항원에 대한 자기항체가 존재한다는 것과 부신염을 특징으로 한다. 증상은 부신 부전에 의한 색소침착과잉, 허약, 피로, 저혈압, 위장 증상 및 저혈당증이다. 이 병도 여성에게서 주로 발병한다. 면역형광법을 사용하면 부신피질의 3개 층을 자기항체가 염색시키지만, 서브타입은 난소, 고환 및 태반의 유사한 스테로이드 생산 세포와도 교차반응할 수 있다. 이런 후자의 특이성이 있는 경우 이들은 증상발현전 또는 임상적인 명백한 생식선 부전과 상관관계가 있다.
뇌하수체
림프성 뇌하수체염은 희귀한 자기면역 질환으로서, 호르몬 대체 요법이 필요한 뇌하수체 기능저하증을 유발한다. 여성에게 빈발하며, 다른 기관 특이적 자기면역 현상 또는 관련 장애와 함께 발생한다. 프로락틴 분비세포에 대한 자기항체가 검출될 수 있으며, 대부분의 경우에 그밖의 다른 기관 특이적 항체도 검출될 수 있다.
다내분비선 자기면역
기관 특이적 자기면역 질환 환자에게서는 내분비선 또는 그외 표적 기관 (예: 위)의 부전과 관련된 증상이 함께 나타날 수 있다. 그러나 병에 걸린 여러 기관의 증후군이 드문 것은 아니며, 하나의 기관 특이적 질병만 걸린 환자에게서도 병에 걸리지 않은 기관에 대한 자기항체가 검출될 수 있다. 갑상선 및 위 자기면 역은 종종 한 개체에게서 동시에 관찰된다. 위저염으로 인해 유발된 악성 빈혈의 발생 빈도는 갑상선 장애 환자에게서 5배 정도 높으며, 또한 악성 빈혈 환자의 30-50 %가 갑상선 병력이 있다.
부신염과 갑상선염 및 부신염과 인슐린 의존성 진성 당뇨병 (IDDM)간에도 관련성 (association)이 존재한다. 어떤 경우에는 갑상선 기능항진증과 아디슨병이 동시에 유발되며, 많은 아디슨병 환자가 적어도 한 가지의 다른 자기면역 질환을 앓는다. 갑상선 기능항진증 및 백반 (피부에서 띄엄띄엄 색소탈실을 유발하는 질환으로, 대부분 피부 멜라닌 생성세포의 자기면역적 파괴에 기인한 것으로 보임)이 드물긴 하지만, 종종 다른 분명한 기관 특이적 질환과 공존한다. 이들 자기면역 장애 사이에 일치하는 혈청학적 특징 (즉, 순환 자기항체가 존재)은 분명한 질병과의 공존보다 훨씬 더 일반적이다. 예를 들면, 벽 세포 항체는 갑상선 장애 환자의 50 %와 IDDM 환자의 30 %에게 존재한다.
IDDM의 병리학과 관련된 통상적 지식
IDDM (I형 당뇨병)의 병인론에 관한 현재의 지식 상태는 각종 순환 자기항체, 순환계 및 췌장도 (인슐린염) 내의 자기반응성 T 세포 및 각종 사이토킨의 주변에 있는 췌장도 β세포의 자기면역적 파괴에 초점이 맞춰져 있다. 따라서 자기항체의 병리학적 역할은 아직 입증되지 않았으나 자기항체가 존재하는 것은 IDDM 환자의 직계 가족에게서 증상발현전 당뇨병을 확인하기 위한 예보성 가치가 있는 것으로 밝혀졌다. 결과적으로 IDDM을 유발하는 면역적 공격은 T 세포 의존적 β세포 파괴인 것으로 여겨진다 (Tisch and McDevitt, 1996). 이런 견해를 뒷받침하는 증거는 발병시 췌장도에서 단핵세포 침윤 (인슐린염)이 나타난다는 것 (Gepts, 1965, Roep and DeVries, 1992), 면역억제제가 발병을 지연시키는데 유효하다는 것 (Bougners et al., 1998), 인슐린염에 걸린 IDDM 환자에게서 췌장 이식편이 파괴되는 것 (Sibley et al., 1985), 지라 T 세포가 당뇨병을 옮길 수 있고 CD4 및 CD8 T 세포 둘다 필요하다는 것을 보여주는 동물 연구 (Bendelac et al., 1987)가 있다. 췌장도 세포 항원에 대해 특이성이 있는, 복제된 CD4 T 세포주도 당뇨병원성이라는 것이 입증되었다 (Haskins and McDuffie, 1992). 그러나 지금까지 T 세포가 췌장도 β세포에 대해 초기 손상을 일으킨다는 증거나 그 표적 항원이 무엇인지를 가리키는 암시는 전혀 없었다.
최근에 췌장도 세포 항원에 대한 순환 T 세포의 자기반응성은 IDDM 환자에게만 국한된 것이 아니고 정도는 덜 하지만 같은 나이의 건강한 대조구에서도 존재한다는 것이 밝혀졌다. 따라서 T 세포 자기면역 현상은 β세포 손상을 유발하는 β세포 기능부전의 결과일 가능성이 높다.
NOD 생쥐에서 질병 진행 동안 사이토킨 프로파일 및 Th1 및 Th2 균형을 검사한 연구에 의하면 Th1 세포 및 Th1형 사이토킨이 IDDM의 발병시 우세한 것으로 밝혀졌다. 사이토킨 양의 변화와 IDDM의 분명한 상관관계를 시험한 자세한 연구가 문헌 (Shimada et al. 1996)에 보고되어 있다. 질병 진행 동안 여러 시간대에 NOD 및 NOD-IAk 생쥐 및 BALB/c 대조구 생쥐로부터 얻은 비세포를 분리하여, CD45RB 저함량 (기억) CD4+ T 세포를 얻었으며, 이들을 항-CD3으로 활성화시켜 분비되는 사 이토킨을 분석했다. NOD 생쥐에게서는 과혈당증의 발병시 또는 발병 직전에 높은 비율의 IFNγ/IL4이 관찰되었다. 위 문헌의 저자들은 NOD 생쥐에게서 IDDM은 질병 진행의 후기까지도 β세포가 실질적으로 파괴되지 않으면서 염증성 β 세포의 기능부전에 따라 진행된다고 제안했다.
β세포의 기능부전은 인슐린이나 C-펩티드에 대한 혈청 프로인슐린양의 상승에 의해 감지되며, 연소성 IDDM의 임상적 출현시 발견되었다 (Ludvigsson and Heding, 1982). 문헌 (Roder et al., 1994)에는 IDDM 환자의 형제자매 (sibling) 중 자가항체 양성을 보인 23인을 정맥내 포도당에 대한 제1상 인슐린 반응 (FPIR)에 따라 2군으로 나눠 수행한 연구가 기재되어 있다. 11인은 FPIR이 감소했고, 이들을 굶겼을 때의 프로인슐린/인슐린 또는 C-펩티드 비율이 FPIR이 정상적인 나머지 보다 2-3배 컸다. FPIR이 낮고 프로인슐린/인슐린 비율이 높은 11인 중 9인은 시험한지 1-28개월 후 당뇨병에 걸렸는데, 이는 나머지 중에서는 아무도 당뇨병에 걸리지 않은 것과 대조를 이룬다.
β세포의 기능부전 및 실질적 파괴는 IDDM의 특징이기는 하지만, 발병한 지 얼마되지 않은 1형 당뇨병과 오래 지속된 1형 당뇨병은 둘다 저혈당증 동안 글루카곤 및 에피네프린 분비 반응과 간의 포도당 생성에도 결함이 있다 (Kleinbaum et al., 1983). 고인슐인혈 및 저혈당 클램프 기술을 사용하는 조심스럽게 통제된 연구 결과는 180분 동안의 인슐린 주입시 글루카곤 양이 정상 개체에게서는 상승하지만 당뇨병 환자에게서는 상승하지 않는다는 것이 밝혀졌다 (Barrou et al., 1994). 간의 포도당 생성도 당뇨병 환자군에서는 상당한 손상을 입는다. 저혈당증의 대응 조절에 있어서의 이러한 결함은 많은 1형 당뇨병에서 집중적인 의학적 관리의 어려운 측면이다.
당뇨병이 장기간 지속되면 글루카곤 분비를 해치게 된다는 것은 분명하지만 당뇨병전증 개체의 글루카곤 분비에 대해서는 알려진 것이 많지 않다. 글루카곤 분비 이상은 당뇨병 동물 모델에서 입증된 바 있다. 당뇨병전증 NOD 생쥐 및 명백한 당뇨병 NOD 생쥐를 대상으로 연구한 결과 당뇨병전증 생쥐를 굶겼을 때 혈당 및 혈장 인슐린 양은 정상으로 드러났으나, 혈장 글루카곤 양은 대조구 생쥐에 비해 현저하게 상승했다 (Ohneda et al., 1984). 즉 당뇨병 발병 전에 기본적인 대사 장애가 존재한다는 뜻이다.
글루카곤은 췌장 α세포에서 분비되며, 간의 포도당 생성을 자극하고 포도당 유도 인슐린 분비를 강화함으로써 정상혈당의 정상적 조절을 유지하는 데 중요한 인자이다. 이는 혈당량을 떨어뜨리지 않으면서 굶긴 쥐에게서 글루카곤을 면역중화시킨 후 인슐린 분비가 급강하했다는 사실에 의해 입증되었다 (Brand et al., 1995).
FACS로 분리한 단일 β세포로부터의 인슐린 분비는 영양분의 공격에 대한 반응이 미약하다. 이런 분비 결함은 이 β세포와 분리된 α세포를 재조합하거나 또는 (Bu)2cAMP 또는 글루카곤을 첨가함으로써 충분히 복구될 수 있다 (Pipeleers et al., 1985). 글루카곤은 β세포에서 cAMP의 양을 상승시키는 중요한 요인이다 (Rasmussen et al., 1990). 단리된 β세포는 무손상 췌장도의 β세포에 비해 cAMP 의 양이 낮게 나타났다. 췌장도에서 cAMP 양의 증가 또는 감소는 포도당에 대한 분비 반응의 상승 또는 저하와 일치한다 (Howell et al., 1973). cAMP의 양은 비-β췌장도 세포와 재응집을 통해 또는 글루카곤의 첨가를 통해 복구할 수 있다 (Schuit and Pipeleers, 1985). β세포에 대한 글루카곤의 직접적 영향은 글루카곤 수용체가 β세포 상에 존재한다는 사실의 입증과 부합한다 (Van Schravendijk et al., 1985). 글루카곤은 또한 분비 자극의 주기성에 영향을 주지 않고도 포도당에 반응하여 박동성 인슐린 분비의 진폭을 향상시키는 것으로 입증되었다 (Marchetti et al., 1994).
세포질 Ca2+ 농도 상승이 인슐린 분비에 필수적이라는 것이 확실해지자 (Prentki and Matschinsky, 1987), 글루카곤이 cAMP 양을 상승시키고 이것이 Ca2+ 양을 증가시킴으로써 인슐린 분비를 자극하게 된다는 주장이 제기되었다. 갖힌 전구물로부터 광분비된 세포내 cAMP의 영향을 받은 Ca2+ 순간분비량을 측정한 복잡한 실험을 통해, Ca2+ 순간분비량 상승이 cAMP에 의해 유발된 엑소사이토시스의 전체 증가의 10%의 원인인 것으로 밝혀졌다 (Ammala et al., 1993). 이와 유사한 방법으로 문헌(Ammala et al., 1993)에서는 또한 Ca2+ 농도가 그 자체만으로는 분비를 진행시키지 못하는 정도일 때 cAMP가 엑소사이토시스를 개시하며 Ca2+ 농도가 이보다 높을 때는 cAMP가 엑소사이토시스를 더 향상시킨다는 것을 밝혀냈다. 문헌 (Westerlund et al., 1997)은 인슐린 분비는 [Ca2+]i가 안정하게 남아있는 조건에서 박동성이 계속 유지되는 것을 밝혀냈다. 이런 실험들에 의해 밝혀진 바로는, cAMP가 Ca2+ 채널 활성화의 분비 작용에 대한 감도 역치를 설정하므로 결국, 포도당 유도에 의한 신속한 인슐린 분비 박동의 진폭을 조절하는데는 글루카곤의 (β세포에서 cAMP 양을 증가시키는) 역할이 가장 중요하게 된다.
글루카곤 분비도 박동적이다. 문헌 (Storch et al., 1993)에 보고된 바로는 간경변증 환자의 글루카곤 혈장 농도는 4.1 - 6.5 분 간격으로 상당히 크게 변화한다. 시험관내 관류 쥐 췌장은 각기 5.8 분 및 6.5 분 간격으로 인슐린과 글루카곤을 분비했으며, 쥐 및 개 췌장의 관류 방향을 바꾸는 것은 호르몬 분비의 주기성에 영향을 주지 않았다 (Stagner and Samols, 1988). 이는 '직접적인 췌장도내 호르몬 상호작용' 또는 '정맥 호르몬 민감성 수용체 메카니즘'이 분비 주기성에 관여할 가능성을 일축한다. 하나의 생쥐 췌장도는 느린 진동 박동 및 빠른 진동 박동에 의한 포도당 자극에 반응하여 인슐린을 분비한다 (Bergsten et al., 1994). 따라서 박동성 인슐린 분비의 메카니즘은 개별 췌장도 내에 존재한다. 이는 [Ca2+]i의 변화 또는 진동수에 영향을 주지 않으면서 진폭을 상승시킨 단백질 키나아제 C의 활성화를 수반하는 실험에 의해 입증된 [Ca2+]i 순간분비량과는 관련이 없다 (Deeney et al., 1996). 이 보고서들은 인슐린 및 글루카곤 분비의 박동성에 대한 조율기가 췌장도 내에 존재하고 있으며, 외부 신경지배 및 직접적 호르몬 상호작용 과 무관하다는 것을 입증한다. 이는 또한 성공적인 췌장 이식편에서 낮은 진동수 박동 및 높은 진동수 박동을 입증함으로써 사람에게서도 정립된 바 있다 (Sonnenberg et al., 1992).
인슐린 비의존성 당뇨병 (NIDDM)에서 조율기의 역할
2형 인슐린 비의존성 당뇨병 (NIDDM)은 베타-세포 기능부전이 현저하게 나타나며 인슐린 내성도 수반한다. 이들 두 요인의 상대적 중요성은 논쟁의 대상이 되어 왔다. 이 병의 초기에는 박동성 인슐린 분비가 현저히 파괴되며, 고진동수 박동이 상실되고 느린 진동의 진폭이 감소한다 (Leahy, 1990; Guillausseau, 1994). 이런 박동성 분비의 유실은 인슐린 내성을 일으키는 주요한 잠재적 원인이 될 수 있다. NIDDM 발병의 조짐을 알아내기 위한 여러 연구를 통해 인슐린 내성 보다는 β세포 기능부전이 NIDDM에 걸리기 쉽게 하는 주요 요인인 것으로 결론지어졌다 (Pimenta et al., 1995, Davis et al., 1995, Nijpels et al, 1996). 따라서 NIDDM의 원인은 β세포의 기능부전을 유도하는 현상과 관련되어야 한다. 본원에서는 이 기능부전이 인슐린 및 글루카곤 둘 다의 박동성 분비를 유지하는 조율기의 파괴에 따른 결과임을 제시한다.
문헌 (Parksen et al., 1995)은 밤새 굶긴 개의 박동성 인슐린 분비 대 기저 인슐린 분비의 기여도를 시험하고, 인슐린의 대부분 (70%)은 박동으로서 분비됨을 밝혀냈다. 따라서 이 계의 파괴는 전체 인슐린 분비에 대해 주요 충격이 될 것이다.
IDDM에 앞서 일어나는 β세포 기능부전의 자연적 내력은 진단시 IDDM의 급전 하는 파괴적 성질 때문에 연구하기가 매우 어렵다. 그러나 문헌 (O'Meara et al., 1995)는 IDDM의 발병에 이르는 13개월의 기간에 걸쳐 한 개체를 연구할 수 있었다. 포도당 섭취를 금하고 당화 헤모글로빈 농도를 정상적 범위로 유지할 때 정맥내 포도당에 대한 인슐린 반응은 감소했다. 분비의 진동 패턴은 유지되었으나 분비 반응은 감소했다.
본 발명은 자기면역 질환의 원인에 관련된 새로운 개념에 관한 것이며, 더 구체적으로는 이 새로운 개념을 1형 및 2형 당뇨병에 예시적으로 (그러나 이것으로 제한되는 것은 아님) 적용하는 것이다. 본 발명은 항-TCR Vβ항체에 대한 반응성이 있는, 약제 또는 진단제로 사용하기 위한 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 또는 이와 기능적으로 등가의 리간드를 제공한다. 이들 분자는 또한 GPI-결합 TCR Vβ쇄, 인지질, 인지질 글리칸, 단일 가닥 DNA 및(또는) 이중 가닥 DNA에 대해서도 반응성을 나타낼 수 있다. 본 발명은 IDDM, NIDDM 또는 기관 특이적 또는 기관 비특이적 자기면역 및 관련 질환의 치료용 의약 제조에 있어서 상기 항체의 용도를 제공한다. 바람직하게는 모노클로날 항체가 본 발명에 따라 사용된다.
당뇨병과 관련하여 본 발명은 당뇨병원성 과정에서 주요 요인이면서 상기 모노클로날 항체와 동일한 특이성이 있는, 새롭게 동정된 자기항체에 의한 α세포 기능의 조절장애 (dysregulation)도 포괄한다. 이 새 개념을 실증하기 위해 본 발명은 상기 모노클로날 항체가 α세포 (상기 병원성 자기항체의 표적임)상의 신호전달 분자 세트 (췌장도에서 조율기로 기능할 수 있음)의 공통적 에피토프를 인식한다는 것을 입증한다.
본 발명은 또한 상기 자기항체의 검출 방법도 제공하며, 뿐만 아니라 IDDM 및 NIDDM을 비롯한 자기면역 및 관련 질병의 예방 및 치료적 개입에 있어서 상기 자기항체, 상기 모노클로날 항체 (MoAb) 및 이 MoAb가 인식하는 분자의 용도를 제공한다.
모노클로날 항체는 사람 췌장도 세포의 배양물로부터의 인슐린 분비를 조절하는데 장애를 유발했다 (더 상세한 사항은 실시예 및 표 1을 참조할 것). 이들 MoAb(IgM) 및 항-글루카곤 MoAb(IgG)에 의한 췌장 절편의 자발적 염색을 통해 이들 모노클로날 항체는 α세포로 위치하며, 이는 형광 항-생쥐 IgM 및 로다민화 항-생쥐 IgG로 각기 검출되었다. 이 항체의 염색 패턴은 동일했는데, 이는 두 항체에 의해 동일한 글루카곤 생성 α세포가 염색되었음을 의미한다.
병원성 자기항체의 α세포에 대한 영향으로 인해 포도당 대응조절 반응성 및 인슐린 분비의 미세조절이 모두 손상되는 것으로 생각된다. 인슐린 분비의 조절장애는 β세포사를 통해 IDDM을 유발하거나 아니면 β세포를 조절장애 상태로 계속 생존시키면서 NIDDM을 유도한다. 이런 두 가지 결과는 개체의 유전적 감수성에 따라 달라진다. IDDM에서는 T 세포 감작이 β세포 손상 보다 부차적이며, 남아있는 β세포사를 가속화시킬 수 있다. 그러나 본 발명자들은 이 이론에 구속되는 것을 원치 않는다.
α세포 표면 분자를 인식하는 MoAb는 아래 실험에서 설명한 바와 같이 생쥐를 항-TCR Vβ모노클로날 항체로 면역접종하여 발생시켰다. 얻어진 클론에 의해 생성된 모노클로날 항체는 항-Vβ면역유발원만을 인식하거나 또는 그 면역유발원 뿐만 아니라 포스파티딜 이노시톨, 포스파티딜 세린, 카르디올리핀 (디아실 글리세롤), ds DNA 및 ss DNA를 인식했다. 이들 후자의 모노클로날 항체는 사람 췌장 α세포 (도 1), 갑상선소포 세포 (도 2), 부신수질 세포(도 3), 위장관 (도 4), 위, 침샘, 난소, 횡문근, 결합조직 (예시를 위한 것일 뿐 이것으로 제한되는 것은 아님)도 인식했다.
본원에 사용된 용어 "기능적으로 등가의"란 해당 분자가 목적하는 결합 부위를 보유하며, 항-TCR Vβ항체와 해리상수 10-4M 이하, 바람직하게는 10-7M 이하, 가장 바람직하게는 10-9M 이하로 결합하는 임의의 거대분자 또는 분자 전체를 포함하며, 본원에서 밝혀진 항 항-TCR Vβ항체의 결합 부위의 형상에 동등한 상보적 형상을 갖는 것을 의미한다.
해당 분자에 대한 친화도가 있는 화합물의 현행 제조 방법은 최근까지도 비교적 기초적인 수준이었다. 그러나 조합적 화학의 개념 및 조합적 라이브러리의 발생으로 원하는 특성을 지닌 분자의 이론적 설계 및 개선이 굉장한 속도로 발전 및 촉진되었다. 이런 기술을 사용하면 본원에서 밝혀진 항체의 결합 부위와 동일하거나 유사한 결합 부위를 갖는 분자를 얻을 수 있다.
그러한 화합물은 이론적 설계, 예를 들면 분자 모델화 및 컴퓨터 시각화를 통상적인 합성법과 병용하여 얻을 수 있다. 이런 기술에서는 항체 결합 부위와 유사한 골격을 갖는 "리드 (lead)" 화합물을 스캐폴드 분산도 및 성분 치환체를 조합 하여 최적화한다.
이와 달리 또는 분자 전체의 구조 유도 설계 (structure-guided design)의 한 단계로서 조합적 화학을 이용하여, 골격 스캐폴드에 입각하여 동종 조합적 배열을 제조함으로써 적절한 결합 부위를 모방한 화합물 구조를 생성하거나 세련화할 수 있다. 이런 단계들은 고상 분할 (solid-phase split)을 이용하는 표준적인 펩티드 또는 유기 분자 합성법을 포함할 수 있으며, 또한 고상법 또는 용액법을 사용하는 가공 또는 병행 조합 유닛 합성법을 재결합시킬 수 있다 (Hogan, 1997 및 그외 참고 문헌 참조).
이와 달리 또는 본 발명의 이런 측면에 따른 분자의 일부로서 기능적 등가물은 서열 상동성이 상당히 큰 동정된 항체 또는 이와 밀접히 관련된 단백질의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 단편이란 전체 단백질 서열 중 항-TCR Vβ항체와 해리상수 10-4M 이하, 바람직하게는 10-7M 이하, 가장 바람직하게는 10-9M 이하로 결합할 수 있는 임의의 부분을 의미한다. 따라서 단백질의 어느 한쪽 말단 또는 1차 아미노산 서열의 내부 스트레치로부터 아미노산이 하나 또는 다수 결실된 단편도 본 발명의 한 측면을 형성한다. 변이체는 예를 들면 항체의 야생형 서열에서 아미노산 치환, 삽입 또는 결실이 일어난 돌연변이체일 수 있다.
본원에 기재된 항체를 모방한 결합 부위가 있는 생체 활성 펩티드는 파아지 라이브러리를 사용하여 제조할 수 있다. 결합 부위에 속하는 것으로 밝혀진 아미노산 잔기를 코딩하는 핵산을 주변 골격 잔기를 코딩하는 핵산과 함께 융합하여 10 내지 1000개의 잔기, 바람직하게는 25 내지 100 잔기의 폴리펩티드 유닛을 제공할 수 있다. 이런 핵산 단편을 파아지 단백질 코딩 단편, 예를 들면 박테리오파아지 fd의 pIII와 융합시켜, 이 융합된 분자를 파이지 표면에 표면제시 (display)할 수 있다. 그다음 파아지 라이브러리를 항-TCR Vβ항체로 스크리닝하여 원하는 클론을 동정한다. 이어서 이들 클론을 반복적으로 돌연변이를 유발시키고 스크리닝하여, 생성된 분자의 표적에 대한 친화성을 개선시킬 수 있다.
본 발명에 따른 항체 또는 이와 기능적으로 등가의 리간드는 척추동물 또는 비척추동물로부터 유래된 것일 수 있다. 바람직한 항체는 건강하거나 또는 병든 사람 또는 동물에게서 얻은 B 세포를 엡스타인-바 바이러스 형질전환이나 그외 방법으로 죽지 않게 만든 (immortalised) B 세포로부터 유래된 것이다.
항체 또는 등가의 리간드는 동물 또는 사람의 체액을 항원 결합 컬럼에 흘려주어 단리할 수 있다. 여기서 동물은 사전에 항원으로 면역접종한 것이거나 병에 걸린 것이거나 약물 또는 먹이로 조작하여 발병시킨 것일 수 있다.
본 발명의 제1 측면에 따른 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 또는 이와 등가의 리간드와 결합하지만 항-TCR Vβ 항체는 아닌, 약제 또는 진단제로 사용하기 위한 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질도 본 발명의 또다른 측면에서 제공한다. 특히 본 발명의 이런 측면에서 사용하기에 바람직한 것은 하기한 클론 1.1, 1.2, 1.3, 3.1, 4.1, 5.1, 5.2 또는 5.3, 이들의 단편 및 이들의 기능적 등가물에 의해 코딩된 단백질이다. 이러한 분자도 IDDM, NIDDM, 또는 그외 기관 특이적 또는 기관 비특이적 자기면역 및 관련 질병의 치료용 의약의 제조에 사용할 수 있다.
이들 분자는 항-항-Vβ모노클로날 항체에 의해 인식되며, 사람 췌장 cDNA λgt11 라이브러리를 스크리닝하여 동정했다. 8개의 cDNA 클론을 정제하여 서열분석했다. 클론 1.1, 1.2 및 1.3은 세크레토그라닌 1형 단백질을 코딩하며, 클론 3.1, 4.1 및 5.1은 67 kd 라미닌 수용체형 단백질을 코딩하며, 클론 5.2는 발명자가 ESRP1 (내분비선 분비 조절 단백질 1)라 명명한 신규 분자를 코딩했다. 클론 5.3은 사람 자이모겐 GP-2-단백질형 단백질을 코딩한다.
이들 분자 모두의 통합적 특징은 이들이 신규 글리코실 포스파티딜 이노시톨 (GPI) 앵커를 통해 세포막에 결합한다는 것이다. 세포 표면 상에서의 GPI 결합 분자의 조절 및 발현은 규명되어 있다 (Low, 1989, Udenfriend and Kodukula, 1995). 이들 아실 잔기는 인슐린 활성화 포스포리파제를 통해 인슐린 작용에 반응한다 (Chan et al., 1988). 이들 분자의 절단 생성물은 α세포 내부로 도입되며, α세포내에서 글루카곤 분비를 조절하는데 필요하다. 이 분자는 재합성되고 막에 재발현되기까지 시간을 필요로 하는데, 이 때문에 글루카곤 분비의 주기성과 글루카곤 및 인슐린 둘다의 박동성 분비가 보장된다. 이런 유형의 메카니즘은 췌장도에서 조율기를 설명할 수 있다. 효소에 의해 절단된 이들 분자 상의 부위에 결합하는 항체는 효소의 작용을 방해하여 글루카곤 및 인슐린 분비의 조절을 파괴할 수 있다.
특이성이 유사한 항체가 인체내에서 생리적으로 유발될 수 있는 메카니즘은 다양하다. 첫째 감염 물질 또는 슈퍼항원 등의 환경적 작용제는 T 세포의 복제 확대를 유도할 수 있으며, 이런 증식 단계 동안에 비정상적으로 발생된 TCR 복합체 일부는 세포내에 갖혀 분해된다. T 세포는 특정한 조건하에서 자멸되어 (apoptosis) 면역원성일 수 있는 분해된 TCR 생성물을 분비하며, 항체 생성의 항-Vβ 및 항-항-Vβ 네트워크 케스케이드를 촉발시킬 수 있다. 두번째로는 문헌 (Bell et al., 1994)에 보고된 바와 같이, GPI 앵커 부착을 위한 신호 펩티드가 TCRβ쇄 폴리펩티드 서열에 존재하며, 세포질 꼬리 서열이 없는 TCRβ쇄가 TCRα가 없는, GPI에 앵커된 단량체 폴리펩티드로서 성숙한 T 세포 하이브리도마 세포주 상에 발현된다. GPI 결합 TCRβ쇄는 TCRβ트랜스제닉 생쥐에서는 검출되었지만 정상적인 생쥐에서는 검출되지 않았으므로, 그러한 Vβ 쇄의 비정상적 발현은 네트워크 반응의 케스케이드를 유도하여 결과적으로 항-항-Vβ반응물에 대한 특이성이 유사한 항체를 얻을 수 있다. 그러한 항체는 본 발명의 다른 실시태양의 사람 혈청에서 검출되었다 (실시예의 표 2 참조).
상기한 cDNA 클론 및 이들이 코딩하는 단백질을 아래에 더 설명했다.
클론 1.1, 1.2, 1.3
이들 3개의 클론 1500 bp, 1400 bp, 900 bp는 각기 세크레토그라닌 1 (Sg1)형 분자를 코딩한다. 세크레토그라닌 1은 657개의 아미노산으로 이루어진 76 kd의 폴리펩티드이며, 이 폴리펩티드는 본래 그 앞에 N-말단 신호 펩티드 (잔기 20개)가 있으나 이는 절단된다 (Benedum et al., 1987). 이 폴리펩티드는 이황화 결합에 의한 루프 구조를 가지며, 내분비선 세포 및 뉴런의 분비 과립으로 보내지는 분비 단백질이다. 신경내분비선 세포주 PC12에서는 엑토사이토시스된 Sg1 분획이 분비 되지 않았으며, 세포막과 결합된 상태로 남아있다는 것이 밝혀졌다 (Pimpliker and Huttner, 1992). 표면 Sg1 (전체 세포 단백질의 대략 10 %)이 내부화되었고 분해되어 가능한 신호전달 성질을 나타냈다. 이런 폴리펩티드는 세포의 표면에 돌출되거나 움푹 들어간 소포(caveolar) 단백질의 특성을 갖는다 (Chang et al., 1994). 생쥐 Sg1 유전자의 프로모터 영역은 cAMP 반응 요소를 포함한다 (Pohl et al., 1990). 세크레토그라닌은 산성 단백질족이다. 이들은 외분비선 세포에서 발견되지 않기 때문에 내분비선 종양을 위한 면역조직화학적 진단 마커로 사용되었다. 또한 Sg1은 헤파린 결합 부착 단백질이며, 기층 부착을 매개하는 것으로 밝혀졌다 (Chen et al., 1992). 흥미로운 것은 13-14일된 설치류 배(胚)에서 Sg1 mRNA 축적이 시작되며, 생후 20일에 최고에 달한다 (Foss-Peters et al., 1989).
클론 3.1, 4.1, 5.1
이외에도 3개의 클론 3.1 (900 bp), 4.1 (900 bp) 및 5.1 (100 bp)은 67 kd의 라미닌 수용체형 단백질을 코딩한다. 라미닌은 부착, 조직 재모델화, 상처 치료, 염증, 종양 세포 전이 등과 같은 여러 세포 기능에서 중요한 역할을 담당하는, 기부 막의 주요 성분이다. 세포외 매트릭스 (ECM)와 이와 접촉하는 세포와의 상호작용은 다른 세포 표면 수용체 (67 kd 라미닌 수용체 등)를 통해 이루어진다. 이 라미닌 결합 단백질은 또한 엘라스틴 콜라겐 IV형과도 결합하며, β갈락토오스 당을 포함하는 글리코결합 친화성 컬럼에서 정제할 수 있는 갈락토렉틴이다. 갈락토오스나 락토오스 등의 β갈락토오스 당은 이런 단백질을 엘라스틴 또는 라미닌 친화성 컬럼으로부터 용출시킬 수 있다 (Hinek, 1994). 분자 상의 렉틴 부위로의 갈 락토당의 결합은 이들의 결합 부위로부터 ECM 리간드를 대체하는 효과를 가질 뿐만 아니라 세포막으로부터 67 kd 단백질을 해리시킨다 (Hinek et al., 1992). 또한 동맥관 유래 평활근 세포 상의 상기 단백질의 결함과 이들 세포의 엘라스틴으로부터의 이탈 및 세포의 이동 능력 간에 일정한 관계가 있음도 입증되었다.
이 단백질의 표면 발현은 번역 조절을 받을 수 있다. mRNA를 높은 수준으로 발현하는 형질전환 세포라고 해서 늘상 그들 표면 상에 단백질을 상응하게 높은 수준으로 발현하는 것은 아니었다 (Landowski et al., 1995). 현미경형광계 및 비디오현미경 실험을 통해, 엘라스틴 또는 활성 펩티드 VGVAPG가 동맥 평활근에 결합되면 자유로운 세포내 Ca2+가 일시적으로 증가되는 것으로 밝혀졌다. 이는 세포 표면 라미닌 또는 엘라스틴 결합 단백질이 세포내 신호전달을 매개하는 진정한 수용체로 작용함을 암시한다 (Hinek, 1994).
이 단백질이 세포막에 부착하는 방식과 관련해서는 여전히 논의의 여지가 있다. 왜냐하면 예상된 아미노산 서열을 분석해도 막횡단 (trasmembrane) 영역의 소수성 도메인 특징을 전혀 규명하지 못했기 때문이다. 정제된 단백질을 메틸 에스테르화한 후 기체 크로마토그래피와 질량분광법을 수행했을 때, 이 단백질이 공유결합된 지방산, 팔미테이트, 스테아레이트 및 올레에이트에 의해 아실화되어 있음이 드러났으나, 결합 화학 (linkage chemistry)이 확실히 밝혀지지는 않았다 (Landowski et al., 1995). 이 단백질을 아실화하면, 라미닌 결합에 따라 달라지는 것과는 별도로 추가의 성질들을 이 단백질에 부여하게 된다. 지질 변형 (modification)은 단백질-단백질 상호작용에 영향을 주는 것으로 증명되었으며, 아실 변형 기도 신호 전달시 제2 메신저를 발생시킬 수 있다.
클론 5.2
대략 1200 bp cDNA인 이 클론에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 기능적으로 특정된 어떠한 단백질과 그다지 큰 유사성이 없다. 따라서 어떤 공지된 단백질과 어떠한 기능적 비교도 할 수 없다. 그러나 이 단백질은 췌장 라이브러리를 스크리닝하는데 사용된 모노클로날 항-항-Vβ에 의해 확인된 단백질과 동일한 에피토프를 갖는다. 따라서 유사한 기능적 성질을 공유한다. 이 단백질은 앞으로 내분비선 분비 조절 단백질 1 (ESRP1)로 부를 것이다.
본 발명의 또다른 실시태양에 따르면 ESRP1, 이의 단편 및 이의 기능적인 등가물을 제공한다. 이 단백질의 서열은 도 7에 제공한다. 이 코딩 핵산의 서열은 본 발명의 이 실시태양의 다른 측면을 이루며, 도 6에 제공한다. 본 발명의 또다른 측면에 다르면 치료 또는 진단에 사용하기 위한 ESRP1 단백질이 제공된다.
본 발명에 따른 ESRP1 단백질 또는 기능적 등가물은 본 명세서에서 동정된 화합물과 동일한 족에 속하는 단백질을 소유한 임의의 유기체로부터 유래된 것일 수 있다. 단백질 족이란 공통적 기능을 공유하고 폴리펩티드 서열에 존재하는 모티프 간에 공통적인 서열 상동성을 보이는 일군의 폴리펩티드를 의미한다.
바람직하게는 단백질, 단백질 단편 또는 기능적 등가물은 포유동물, 바람직하게는 사람으로부터 유래된 것이다.
본 발명의 이 실시태양의 다른 측면에 따르면, ESRP1 단백질, 이의 단편 및 기능적 등가물의 IDDM, NIDDM 또는 기관 특이적 또는 기관 비특이적 자기면역 질환, 심혈관계 질환, 암성 악액질 및 암 또는 그외 항-인지질 항체 및(또는) 과인슐린혈증 및 인슐린 내성이 존재하는 모든 질병의 치료용 의약의 제조에 있어서의 용도가 제공된다.
본 명세서 전체에서 사용된 "기관 특이적 또는 기관 비특이적 자기면역 질환"은 IDDM, NIDDM, 갑상선, 부신, 생식선, 위 및 뇌하수체의 자기면역 질환, 전신성 홍반성루푸스, 전신경화증 및 소그렌스 증후군을 포괄하는 의미이다. "심혈관계 질환"이란 관상 동맥 및 경동맥 질환, 거대혈관 및 미소혈관 협심증, 말초혈관 질환, 동맥경화증 및 고혈압을 포괄하는 의미이다. "암"이란 유방암, 결장직장암, 위암, 자궁내막암, 전립선암, 두경부암, 폐 육종 등을 포괄하는 의미다. "그외 다른 적절한 질병"은 다낭성 난소 증후군, 비만, 쿠싱증후군 및 대사성 증후군 X를 포괄하는 의미다. 이들 질병은 단지 예시를 위한 목적일 뿐 이것으로 제한하려는 것은 아니다.
클론 5.3
대략 2000 bp cDNA 클론인 클론 5.3은 내분비 사람 자이모겐 과립 막 GP-2와 매우 유사한 단백질을 코딩한다. 그러나 클론 5.3은 독자적인 핵산을 가지며, 이로 인해 아미노산이 다르며, 내분비 췌장에 위치한다.
이 cDNA 클론과 반응하는 항체는 내분비 췌장을 염색시킨다는 사실에 미뤄볼 때, 이 cDNA 클론이 코딩하는 단백질은 외분비 GP-2 단백질의 내분비 대응부인 것으로 생각된다. 그러나 외분비 조직에서 그것이 갖고 있는 것과 동일한 기능을 내 분비 세포에도 부여하는 것은 아니다. 내분비 또는 외분비선에서 유래된 것을 cDNA 형질감염시킨 세포주에서 발현된 쥐 GP-2는 외분비 세포에서는 분비 과립으로 표적화되지만 내분비선 세포에서는 그렇지 않은 것으로 밝혀졌다 (Hoops et al., 1993).
외분비선 췌장의 단리된 자이모겐 과립 막 중의 주요 단백질은 GP-2이며, 이는 전체 단백질의 40%를 차지한다 (Ronzio et al., 1978). 사람 및 쥐 단백질은 둘다 글리코실 포스파티딜 이노시톨 (GPI) 결합을 통해 과립 막에 부착되며, 포스파티딜 이노시톨-특이적 포스포리파제 C (PI-PLC)에 의해 막으로부터 떨어져 나갈 수 있다. 자이모겐 과립 막 중의 GP-2의 함량이 높아, 이 단백질이 과립 형성에 중요하다는 가설이 도출되었다. 그러나 GP-2 mRNA는 배아 쥐 췌장에 없으며, GP-2는 출생후 젖을 떼는 기간 동안에만 발현된다는 것이 보고되었다. 쥐 배아 췌장은 다량의 과립을 포함하기 때문에 GP-2는 과립 형성에 필수적인 것은 아니라고 추측할 수 있다 (Dittie and Kern, 1992). 이런 관찰 결과는 또한 GP-2 단백질 및 m-RNA가 태아에 부재하며, 생후 21일째부터 생성되기 시작하는 돼지 췌장에 대한 연구에서 확증되었다. 따라서 태아 과립은 GP-2 단백질이 전혀 없다 (Laine et al., 1996). 당뇨병의 실험 동물 모델에서 젖을 떼는 시기에 항원의 출현은 이 시기에 동시에 인슐린염이 발병하는 것을 설명해 줄 수 있을 것이다.
GP-2 단백질의 정확한 기능적 역할(들)은 알려지지 않았지만, 이 단백질은 자이모겐 과립 내에서 가용형 (40 %) 및 막 결합형 (60 %)으로 존재하기 때문에 세포내 및 세포외 기능을 둘 다 가져야 한다. GP-2 단백질은 설치류 및 돼지에게서 출생 후에 발현되므로, 이 분자에 대한 면역관용은 배 발생 기간 동안 흉선내 보다는 말초적으로 유도되어야 한다. 문헌 (Pulendran et al., 1995) 및 (Shokat and Goodnow, 1995)는 생식선 중심 B 세포가 가용성 항원과 충돌하면 고사한다는 것을 입증했다. 따라서 가용성 GP-2는 생식선 중심 B 세포에 반응성인 GP-2의 면역글로불린 수용체에 결합하여 고사를 촉발함으로써 면역관용을 유도하는 역할을 한다.
막 결합형 GP-2는 프로테아제 및 포스포라파제에 의해 막으로부터 유리될 수 있다. 분비된 친수성 GP-2에 이노시톨 1,2-(시클릭) 모노포스페이트가 존재하기 때문에, 막으로부터 GP-2 절단시 포스포리파제 C가 작용한다는 것이 확인되었다 (Paul et al, 1991). 세포 표면 단백질의 지질 앵커로부터 포스포리파제, 프로테아제 또는 히드롤라제에 의해 잘려 생긴 1,2-디아실글리세롤 및 포스파티드산 또는 이노시톨 글리칸 등의 지질 생성물은 세포내로 도입되어 2차 메신저 경로에 참여할 수 있다. GPI 결합 단백질은 또한 이들의 NH2 말단 도메인의 가교결합을 통해 신호 전달에 직접 관여할 수 있다. 신호 전달은 src족 단백질인 티로신 키나제 p56 lck 및 p59 fyn을 통해 이루어지며, GPI 앵커에 관련되어 있다 (Shenoy-Scaria et al., 1992). GP-2 단백질은 또한 효소 성질도 있으며, 돼지의 자이모겐 과립 막 내의 디- 및 트리-포스파타제 활성이 있는 뉴클레오시드 포스파타제인 것으로 확인되었다. 이는 GP-2 단백질이 세포질에서 에너지를 필요로하는 과정에 관여한다는 것을 함축한다 (Soriani and Freiburghaus, 1996).
GP-2 단백질은 사람 유로모듈린/탐-호스폴 (THP) 단백질과 C 말단 영역에 있 는 450개의 아미노산 스트레치에 걸쳐 53 %의 동일성과 85 %의 유사성이 있다. THP도 GPI-결합된 것이며, 이 두 단백질은 모두 정자 수용체인 Zp2 및 Zp3와 β 글리칸 (TGF-β III형 수용체)을 포함하는 단백질 족에 속하며, 이들 뚜렷히 다른 종류의 단백질과 260개 잔기의 도메인을 공통적으로 갖고 있다는 특징이 있다 (Bork and Sander, 1992). 2000 bp cDNA 클론에 의해 코딩된, 새로 동정된 α 세포 단백질도 이 단백질 족에 속해야 하며, α 세포의 분비 과정을 조절하는데 중요한 기능을 해야 한다.
여러 응용을 위해, 본 발명의 제1 측면에 다른 항체 또는 이와 등가의 리단드, 또는 이런 항체에 의해 인식되는 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 표지 (label), 독소 또는 생체활성 분자 등이 이펙터 또는 리포터 분자에 융합될 수 있다. 본 발명의 또다른 측면에 따르면, 화학적으로 변형되거나, 생체 또는 합성 물질에 결합되거나 또는 효소, 지시 화합물, 약물, 독소 또는 방사성 표지에 결합된, 약제 또는 진단제로서 사용하기 위한 본 발명의 제1 측면에 따른 항체 또는 이와 등가의 리간드 또는 이 항체에 의해 인식되는 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 제공한다.
적절한 표지는 당업자에게 잘 알려져 있을 것이다. 예를 들면 그러한 표지는 항원, 이의 단편 또는 이와 등가의 리간드의 아미노 또는 카르복시 말단에 융합되거나 또는 내부에 부가된 추가의 단백질 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 이렇게 폴리펩티드를 부가하는 목적은 항체, 이의 단편 또는 이와 등가의 리간드의 검출, 발현, 분리 또는 정제를 간편하거나 항체, 이의 단편 또는 이와 등가의 리간 드에 원하는 추가 성질을 불어넣는 것일 수 있다.
특히 융합에 적절한 후보는 루시페라제, 녹색 형광 단백질 또는 양고추냉이 퍼옥시다제 등의 리포터 분자일 것이다. 표지로는 분광법으로 검출할 수 있는 방사성 표지 또는 분자로서, 예를 들면 형광성 또는 인광성 화학기일 수 있다. 스트렙타비딘이나 바이오틴 등의 링커 분자도 사용할 수 있다. 뿐만 아니라 다른 펩티드 또는 폴리펩티드도 융합 후보물질로 사용할 수 있다. 적절한 펩티드는 예를 들면 β-갈락토시다제, 글루타치온-S-트랜스퍼라제, 루시페라제, 폴리히스티딘 태그, 분비 신호 펩티드, 항체의 Fc 영역, FLAG 펩티드, 셀룰로오스 결합 도메인, 칼모듈린, 및 말토오스 결합 단백질일 수 있다.
이들 융합 분자는 화학적 가교결합 등의 방법을 써서 화학적으로 융합될 수 있다. 적절한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들면 시스테인 잔기의 티올기의 가교결합 또는 포름알데히드를 사용한 가교결합 등이 있다. 화학적 가교결합은 대부분의 경우에 시클릭 펩티드 및 표지 등의 비단백질 화합물을 융합하는데 사용할 수 있다.
둘 이상의 단백질 분자를 융합할 필요가 있을 때 선택하는 방법은 대개 유전학적으로 분자를 융합시키는 것이다. 재조합 융합 단백질을 제조하기 위해 관심있는 단백질 또는 단백질 단편을 코딩하는 유전자 또는 유전자 일부분을 조작하여 두 개의 유전자 서열의 코돈이 프레임내(in-frame) 전사되도록 하나의 연속된 유전자를 만든다.
본 발명의 화합물은 또한 지지체에 결합시켜, 신체 조직으로부터 항-항-TCR Vβ 항체를 제거, 분리 또는 추출하는 데 사용할 수 있도 있다. 이 지지체는 적절한 불활성 물질이면 어느 것이나 가능하며, 겔, 자석 및 다른 구슬, 미소구체, 구속 컬럼 및 수지 등이 있을 수 있다.
본 발명에 따른 단백질 또는 펩티드 화합물은 숙주 세포 내에서 발현 벡터 중의 코딩 DNA를 발현시켜 재조합 형태로 발현시키는 것이 바람직하다. 이런 발현 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 여러 방법이 문헌 (DNA Cloning: a practical approach, Volume II: Expression systems, edited by D.M. Glover (IRL Press, 1995)) 또는 (DNA cloning: a practical approach, Volume IV: Mammalian systems, edited by D.M. Glover (IRL Press, 1995))에 상세히 기재되어 있다. 단백질 화합물은 또한 문헌 (Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) 또는 (Protein Engineering: A practical approach, edited by A. R. Rees et al., IRL Press 1993) 등에서 위치지정 또는 랜덤 돌연변이유발법 등의 유전공학적 공지 기술을 사용하여 제조할 수 있다.
적절한 발현 벡터는 선정된 숙주에 따라 선택할 수 있다. 이 벡터는 본 발명의 화합물을 코딩하는 재조합 DNA 분자를 발현 조절 서열에 작동가능하게 결합된 형태로 포함하거나 또는 재조합 DNA 클로닝 비히클 또는 벡터는 상기 재조합 DNA 분자를 숙수 전사계에 의해 인식되는 프로모터의 조절을 받는 상태로 포함할 수 있다.
적절한 숙주는 재조합 단백질을 높은 수준으로 발현하도록 만들어질 수 있고 대량으로 증식하기 간편한, 흔히 사용되는 원핵생물종, 예를 들면 대장균 (E. coli) 또는 진핵생물인 효모 등이 있다. 시험관내에서 증식된 포유동물 세포주도 적합하며, 특히 숙주로서 곤충 세포를 사용하는 바큘로바이러스 발현계 등의 바이러스 유래 발현계를 사용하는 경우에 적합하다. 화합물은 또한 생체내에서도, 예를 들면 곤충의 유충이나 포유동물의 조직 내에서 발현시킬 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면 항-TCR Vβ 항체에 대해 반응성이 있는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 또는 이와 기능적으로 등가의 리간드 또는 이런 항체에 의해 인식되는 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 (항-TCR Vβ 항체는 아님)을 제약상 허용가능한 부형제와 함께 함유하는 제약 조성물을 제공한다. 적절한 부형제는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들면 인산 완충 염수 (0.01 M 인산염, 0.138 M NaCl, 0.0027 M KCl, pH 7.4)가 있다. 제약 조성물은 또한 방부제를 추가로 함유하여 저장 반감기를 길게 보장할 수 있다.
항-TCR Vβ 항체에 대해 반응성이 있는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 또는 이와 기능적으로 등가의 리간드 또는 이런 항체에 의해 인식되는 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 상기 제약 조성물의 유일한 활성 성분일 수 있거나, 국소 (예들 들면 크림의 성분), 경구 또는 비경구 투여용 치료제 포장의 일부를 이룰 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, IDDM, NIDDM 또는 기관 특이적 또는 기관 비특이적 자기면역 질환, 심혈관계 질환, 암성 악액질 및 암 또는 그외 항-인지질 항체 및(또는) 과인슐린혈증 및 인슐린 내성이 존재하는 모든 질병의 치료용 의약의 제조에 있어서, 항-TCR Vβ 항체에 대한 반응성이 있는 항체 또는 이와 등가의 리간드의 용도를 제공한다.
본 발명의 또다른 측면에 따르면, IDDM, NIDDM 또는 기관 특이적 또는 기관 비특이적 자기면역 질환, 심혈관계 질환, 암성 악액질 및 암 또는 그외 항-인지질 항체 및(또는) 과인슐린혈증 및 인슐린 내성이 존재하는 모든 질병의 치료 방법이 제공된다.
본 발명의 또다른 측면에 따르면, 항-TCR Vβ 항체에 대한 반응성이 있는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 또는 이와 등가의 리간드와 결합하지만 항-TCR Vβ 항체는 아닌 펩티드, 올리고 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 IDDM, NIDDM 또는 기관 특이적 또는 기관 비특이적 자기면역 질환, 심혈관계 질환, 암성 악액질 및 암 또는 그외 항-인지질 항체 및(또는) 과인슐린혈증 및 인슐린 내성이 존재하는 모든 질병의 치료용 의약의 제조에 있어서의 용도가 제공된다.
본 발명의 또다른 실시태양에 따르면, 본 발명의 제1 측면에 따른 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 또는 이와 등가의 리간드 및 표적 분자들을 혈액, 혈장 또는 혈청 샘플 또는 그외 체액과 접촉시켜서, 이 표적 분자에 특이적으로 결합하는 자연 발생 자기항체의 양을 평가하는 것을 포함하는 (comprise) 자연 발생 자기항체의 검출 방법이 제공된다. 상기 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 또는 이와 등가의 리간드는 예를 들면 효소로 표지하고, 이 표시된 항체 또는 등가의 리간드가 표적 분자에 대한 자기항체와 경쟁적으로 복합체를 형성하게 할 수 있다. 따라서 이 복합체에 결합된 표지의 양은 상기 샘플 내에 존재하는 자기항체의 농도에 반비례한다. 효소로 표지된다면 복합체의 형성은 효소의 활성의 억제하거나 또는 불활성화시키며, 이때 억제 또는 활성화 정도는 샘플에 존재하는 자기항체의 농도에 반비례한다.
본 발명의 이 실시태양의 한 실시태양의 한 측면에 따르면, 사람 또는 임의의 다른 동물종에서 T 세포 수용체 Vβ 쇄 상의 에피토프를 적어도 하나는 확인하는 항-TCR Vβ 폴리클로날 또는 모노클로날 면역글로불린 분자 또는 이의 일부분일 수 있는 표적 분자를 기질에 결합된 효소에 결합시켜서, 이 표적 분자로 항체가 결합되면 효소가 활성화되어 분광계로 측정가능한 색 변화가 유발되게 한다. 표적 분자는 기질에 결합된 효소에 결합시켜 상기 샘플과 접촉할 수 있는 딥스틱 (dipstick) 상에 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 환자의 자연 발생 자기항체의 양을 검출 또는 정량하기 위한 키트의 한 성분으로서 항-TCR Vβ 항체에 대한 반응성이 있는 항체 또는 이와 등가의 리간드, 또는 항-TCR Vβ 항체에 대한 반응성이 있는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 또는 이와 기능적으로 등가의 리간드에 의해 인식되는 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 (예: ESRP1)의 용도를 제공한다. 이러한 키트는 방사성면역분석 또는 ELISA 키트와 유사할 것이며, 추가로 원하는 화합물의 정확한 정량을 가능하게 하는 검출 수단을 포함할 것이다. 그런 방법은 당업자에게는 자명한 것이다.
항체 또는 이와 등가의 리간드, 또는 이 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 또는 이와 등가의 리간드에 의해 결합되는 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 자기 구슬 또는 아가로오즈 구슬에 결합시키거나 멀티웰 플레이트의 바닥에 고정시킬 수 있다. 이를 이용하여 샘플과 함께 인큐베이션하면 그 다음 샘플로부터 비결합 화합물들을 제거할 수 있다. 이와 달리는 단백질을 SPA (Scintillation Proximity Assay: 신틸레이션 프록시미티 검정) 구슬에 결합시킬 수 있으며, 이 경우에는 비결합 리간드를 제거할 필요가 없다. 비표지된 표준물 한 세트를 사용하여 이들 표준물로 얻은 결과를 측정하려는 샘플로 얻은 결과와 비교할 수 있다.
항-TCR Vβ 항체에 대한 반응성이 있는 항체 또는 이와 등가의 리간드, 또는 항-TCR Vβ 항체에 대한 반응성이 있는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 또는 이와 등가의 리간드에 결합되는 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 환자의 조직에서 자연 발생 자기항체를 검출하는데 사용할 수 있다. 당업계에 일반적인 모든 기술을 그러한 검출 방법에 사용할 수 있으며, 블롯팅법 (Towbin et al., 1979), 구속 컬럼, 겔 지연 (retardation), 크로마토그래피, 또는 당업계에 널리 사용되는 그외 적절한 방법 중 어느 하나 일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 제1 측면에 따른 항체 또는 이와 등가의 리간드를 코딩하거나 또는 본 발명의 제2 측면에 따른 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (comprise), 약제 또는 진단제로 사용하기 위한 cDNA, RNA 또는 게놈 DNA 서열을 제공한다.
단백질 ESRP1와 관련해서는, 바람직한 핵산 분자란 첨부된 도 7에 나타낸 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나 또는 이것과 동의성 (degerate) 또는 실질적으로 상동이거나 상기 서열과 혼성화되는 서열의 일부분과 동일하거나 또는 상보적인 뉴 클레오타이드 단편을 포함한다. "실질적으로 상동"이란 50 % 이상의 서열 상동성, 바람직하게는 60 % 서열 상동성을 보이는 서열이다. 본 발명의 범위에 포함되는 "혼성화 서열"은 표준적인 비엄격 조건 (6 X SSC/50 % 포름아미드, 실온)에서 결합하고, 저엄역 조건 (2 x SSC, 실온, 또는 2 X SSC, 42 도씨) 또는 바람직하게는 표준 고엄격 조건 (예:0.1 x SSC, 65 도씨)에서 세척된 것이다 (여기서 SSC는 0.15 M NaCl, 0.015 M 시트르산 나트륨, pH 7.2).
본 발명에 따른 핵산 서열은 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA, cDNA 또는 RNA일 수 있다. 바람직하게는 핵산 서열은 DNA를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 DNA 서열을 포함하는 클로닝 및 발현 벡터를 포함한다. 그러한 발현 벡터에는 본 발명의 핵산 분자가 적절한 전사 및 번역 조절 서열, 예를 들면 인핸서 요소, 프로모터-오퍼레이터 영역, 종결 중지 서열, mRNA 안정성 서열, 개시 및 중지 코돈 또는 리보솜 결합 부위 등과 프레임내 (in frame) 결합되어 있다.
또한 단백질 서열 중 천연 효과 신호 펩티드가 없는 경우 재조합 단백질이 특정 숙주로부터 분비되도록 하는 것이 편리할 수 있다. 따라서 그러한 벡터의 추가 성분은 분비 신호 및 프로세싱 서열을 코딩하는 핵산 서열일 수 있다.
본 발명에 따른 벡터로는 플라스미드 및 바이러스 (박테리오파아지 및 진핵 바이러스 둘다) 등이 있다. 그러한 많은 벡터 및 발현계는 잘 알려져 있으며, 당업계에 문서화되어 있다. 특히 적절한 바이러스 벡터로는 바큘로바이러스, 아데노바이러스 및 천연두 바이러스를 기본으로 하는 벡터가 있다.
대장균 등의 원핵 세포 내에서 이종 폴리펩티드 및 폴리펩티드 단편을 발현시키는 방법은 당업계에 잘 정립되어 있다 (Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press or DNA Cloning: a practical approach, Volume II: Expression systems, edited by D. M. Glover (IRL Press, 1995)). 배양 중인 진핵 세포 내에서의 발현도 이종 단백질을 얻기 위해 당업자가 선택할 수 있는 옵션이다 (O'Reilly et al., 1994, Baculovirus expression vectors- a laboratory manual (Oxford University Press) or DNA cloning: a practical approach, Volume IV: Mammalian systems, edited by D.M. Glover (IRL Press, 1995)).
적절한 벡터는 본 발명에 따라 사용하기 적합한 펩티드 또는 단백질의 발현을 위해 선택하거나 제작될 수 있으며, 프로모터 서열, 터미네이터 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 그외 적절한 서열 등의 적절한 조절 서열을 포함한다. 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 예를 들면 경우에 따라 박테리오파아지 또는 파아지미드일 수 있다. 더 상세한 것은 문헌 Molecular Cloning: a Laboratory Manual에 기재되어 있다. 핵산의 조작과 관련된 많은 공지 기술 및 프로토콜, 예를 들면 핵산 제작물의 제조, 돌연변이 유발, 서열분석, DNA의 세포내 도입, 유전자 발현, 단백질 분석 등은 문헌 (Short Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al., eds., John Wiley and Sons, 1992) 또는 문헌 (Protein Engineering: A practical approach (edited by A. R. Rees et al., IRL Press 1993)에 상세하게 기재되어 있다. 예를 들면 진핵 세포에서 선정 된 벡터는 바이러스 기재 벡터이다.
본 발명의 또다른 측면은 본 발명의 제1 측면에 따른 항체 또는 이와 등가의 리간드 또는 본 발명의 제2 측면에 따른 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 또 다른 측면에서는 그러한 핵산을 숙주 세포 또는 유기체 내로 도입하는 것을 포함하는 (comprise) 방법을 제공한다. 핵산의 도입은 모든 가능한 기술을 사용할 수 있다. 진핵 세포에서 적절한 기술로서는 인산칼슘 형질감염, DEAE-Dextran, 전기천공법, 리포솜 매개 형질감염 또는 레트로바이러스 또는 그외 바이러스 (예: 천연두, 곤충 세포를 위해서는 바큘로바이러스)를 사용하는 형질도입 (transduction) 등이 있다. 박테리아 세포의 경우 적절한 기술로는 염화칼슘 형질전환법, 전기천공법, 또는 박테리오파아지를 사용하는 형질감염법 등이 있다.
핵산을 도입한 다음에는 유전자 발현을 위한 조건에서 숙주 세포를 배양하는 등의 수단을 써서 핵산의 발현을 유도 또는 가능케 한다.
한 실시태양에서는 본 발명의 핵산이 숙주 세포의 게놈 (예를 들면 염색체)로 통합된다. 통합은 표준 기술에 따라 게놈과의 재조합을 촉진하는 서열을 포함시킴으로써 유도할 수 있다.
본 발명에 따른 화합물을 생식 세포주 내에서 하나 이상 발현 또는 과발현하도록 형질전환한 트랜스제닉 동물도 이의 생산 방법과 함께 본 발명의 또다른 측면을 이룬다. 현재 유기체의 배아 또는 생식 세포주 내로 형질도입 유전자를 도입하는 많은 기술이 존재한다 (Watson et al., 1994, Recombinant DNA (2nd edition), Scientific American Books).
본 발명의 치료적 함의 및 당뇨병에 있어서 미해결 문제에 대한 응용
다음은 예시를 위한 것이지 제한하려는 것이 아니다.
포도당 대응조절 (Counterregulation)의 손상
IDDM 환자의 관리에 있어 주요한 문제는 저혈당증 무자각을 일으키는 집중적인 인슐린 치료로 인한, 부분적으로는 의사에게 책임이 있는 저혈당증의 발생이며, 이는 주로 절충된 포도당 대응조절에 기인한다. 포도당 대응조절의 결함은 포도당 양의 감소에 대한 글루카곤 및 에피네프린 반응의 복합적 결함을 초래한다. 이는 저혈당증의 철저한 회피가 저혈당증 비자각을 역전시킬 수 있지만 결함 있는 대응조절을 역전시킬 수는 없음이 입증되었다 (Cryer, 1995).
오래 지속된 IDDM 환자 뿐만 아니라 갓 진단을 받은 IDDM 환자도 대응조절이 손상되었다. IDDM이 갓 발병한 (5-6일) 20명의 어린이에게서 대응조절 반응을 IDDM이 오래 지속된 47명의 어린이와 비교한 결과, 두 그룹에서 모두 저혈당증에 대한 글루카곤 반응이 대조구에서 보다 낮았다. 에피네프린 반응도 대조구와 비교할 때 갓 IDDM에 걸린 환자에게서 감소되었다 (Hoffman et al., 1994).
본 출원에서 제시하는, 이런 대응조절 결함의 원인은 IDDM 환자에게서 항-항-Vβ자기항체가 존속하여, 상기 기재한 신호전달 분자의 하향조절 (downregulation)을 유발하며 포도당 양의 감소에 대한 알파 세포 및 부신수질 세포의 반응을 제거하는 것이다. 이런 제안은 갓 진단된 당뇨병 환자로서 사고로 죽은 사람으로부터 얻은 췌장 절편의 항-항-Vβ염색의 감소가 관찰된 것과도 부합 한다 (실시예 참조). 또한 류마티스성 관절염 환자를 GPI-결합 CD52 단백질을 억제하는 캄패쓰 (Campath)-1H으로 치료하면, 치료받은 몇몇 환자에게서는 T 세포 및 B 세포 둘다의 CD52 및 그외 GPI 결합 단백질이 사라진다는 문헌 (Brett et al., 1996)의 발견과도 유사하다. CD52 음성 B 세포는 3개월 내에 순환계에서 사라졌으나, CD52 음성 T 세포는 20개월 이상 존속했다. 따라서 IDDM 환자의 이들 항체의 영구보존을 예방한다면 대응조절 결함을 완화되어 결과적으로 저혈당증이 틀림없이 방지될 것이다. 출생 후 항체의 발생을 차단하는 것은 감수성 개체에게서 IDDM을 예방할 것임이 틀림없다. NIDDM은 완전히 치료될 것이다. 이는 Rh 양성 태아를 임신한 Rh 음성 임산부에게 항-D 면역글로불린 (항-D Ig)을 투여하는 것과 유사한 방법으로 수행될 것이다 (Davey, 1979). 이런 치료 형태에서 항체 생산의 차단에 관여하는 가능한 메카니즘은 문헌 (Heyman, 1990)에 기재되어 있다. 추가의 조치로서 병원성 항체로 개체를 면역접종하는 것은 보호성 항-이디오타입 항체를 생성시킬 것이며, 이 항체가 발생되면 병원성 항체와 복합체를 형성할 수 있다.
당뇨성 신장병증
I형 당뇨병에 신장의 관여는 사구체 및 세관의 상피 및 기저막 비대증과 사구체맥관막에서 세포외 매트릭스 성분의 축적이 특징이다 (Lane et al., 1990). 질병이 진행되면 사구체모세관 내강의 제거, 단백뇨증, 및 여과의 감소 등이 유발된다. 과혈당증 및 TGF-β (형질전환 성장 인자-β)의 생성은 당뇨성 신장병증에 연루되어 있다. 포도당 농도가 높으면 사구체맥관막 및 인접 세관 세포의 배양물 중의 TGF-β mRNA 및 단백질이 증가하며, TGF-β는 간접적으로 세포 증식 및 콜라 겐 합성에 대한 포도당의 영향을 매개한다. TGF-β에 대한 항혈청을 투여하면 실험적인 사구체신염을 억제하는 것으로 밝혀졌다 (Border, 1990).
고혈당증은 당뇨병 초기에 TGF-β를 유도할 가능성이 있다. 이런 추측은 사람 당뇨병과 BB 및 NOD 모델 둘 다에서 고혈당증 및 신장 비대증의 발병 후 수일 이내에 TGF-β의 신장 발현이 증가되었다는 입증 사실에 의해 뒷받침된다 (Yamamoto et al., 1993, Sharma and Ziyadeh, 1994).
TGF-β와 그의 수용체와의 결합은 막 고정(anchored) 프로테오글리칸 (β 글리칸)의 도움으로 일어나다. 상기 프로테오글리칸은 II형 신호전달 수용체인 막횡단 세린/트레오닌 키나아제에게로 TGF-β를 제공한다 (Lopez-Castillas et al., 1994). 베타 글리칸은 세포에서 내민 세포외 영역을 가지며, 이 세포외 영역은 TGF-β에 결합할 수 있지만 이것을 신호전달 수용체로 제공할 수는 없어, 결과적으로 TGF-β의 작용을 억제하는 강력한 억제제로 기능할 수 있다. 베타 글리칸은 유로모듈린 및 췌장 분비 과립 막 GP-2를 포함하는 단백질 족에 속한다. TGF-β 내의 유로모듈린 관련 영역의 역할은 입증되어 있다 (Fukushima et al., 1993).
가용형 또는 막결합형으로 존재하는 GP-2 (클론 5.3의 생성물)에 관련된 α 세포 분자는 TGF-β 작용의 억제에 관여하는 단백질 가운데 하나일 수 있다. 병원성 항체의 지연된 작용으로 인한 이들 분자의 하양조절은 TGF-β 억제를 제거하여, 결과적으로 신장에서 TGF-β의 작용성을 증진시킬 수 있다. 병원성 항체에 의해 인식되는 분자의 가용성 펩티드를 투여하면 TGF-β의 억제 및 항체 생성의 억제라는 두 가지 역할을 할 것이다.
췌장 이식
췌장 이식은 심각한 저혈당증의 경향이 있는 1형 당뇨병을 치료하기 위해 점차 수행되고 있다. 이는 인슐린 비의존성을 확립하고 부분적으로는 정상혈당으로 복원하는 두 가지 성과를 볼 수 있다. 그러나 췌장 이식이 근본적인 당뇨병원성 상태를 거스르지 않고 수행된다면, 포도당 대응조절 문제가 재발함과 동시에 병원성 항체가 계속적으로 발생할 것이다.
단계적 저혈당증 클램프 기술을 사용하여 성공적인 췌장 이식 환자 13명을 상대로 한 최근 연구에서는 저혈당증에 대한 글루카곤의 반응이 복원되었음이 입증되었다. 그러나 정상 대조구 또는 신장 이식 환자에 비해 췌장 이식 환자에게서 금식 및 자극 글루카곤 양이 훨씬 더 컸다. 더욱이 C-펩티드 양도 모든 그룹에 비해 상승했다 (Kendall et al., 1997). 이 연구자들은 당뇨병전 상태를 암시하는 이런 관찰 결과에 대해 아무런 논평을 하지 않았다. 그러나 저혈당증에 대한 에피네프린 반응이 췌장 이식 환자에게서는 향상되었으나 건강한 대조구 또는 비당뇨병 신장 이식 환자에게서는 훨씬 낮았다는 것은 보고하고 있다. 이런 관찰 결과로부터 분명히 알 수 있는 바는 건강한 췌장을 당뇨병 환자에게 이식하면 α 세포 및 부신 반응이라는 두 측면에서 볼 때 당뇨병전 상태로 되돌아간다는 것이다. 잠재적인 당뇨병 췌장 이식 환자는 병원성 항체 역가가 증가되는 것을 이식 전에 예방치료해서 이식이 완벽하게 성공할 수 있도록 해야 한다.
자율 신경병증
오래 지속되는 당뇨병은 저혈당증 비자각과는 다른 비가역적 자율 신경병증 과 합병증세를 보일 수 있다 (Cryer, 1994, Dagogo-Jack et al., 1993). 문헌 (Kendall et al, 1997)의 연구에서는 췌장 이식을 통해 저혈당증을 없애면, 심장 자율성 기능부전이 지속됨에도 불구하고 에피네프린 반응 및 저혈당 증상 인식이 둘 다 개선되었다. 그러나 오래 지속된 당뇨병 환자에게 없는 노르에피네프린 반응은 췌장 이식에 의해서도 복원되지 않았다.
자율신경절에서 신경 세포체에 대한 당뇨병원성 모노클로날 항체의 반응성이 아직 시험된 바는 없지만 이들이 인식하는 항원은 이들 세포체에도 존재할 것으로 예상된다. 독특한 GPI 결합 단백질군이 여러 1차 뉴런에서 발현되는 것이 입증되었다. 이들 중 몇몇은 여러가지 초 형성 (ensheathment) 특징에 일치하는 것으로 밝혀졌다 (Rosen et al., 1992). 이런 분자들은 신호전달 특성이 유사할 것이며, α 세포 및 부신수질 세포에 대해 유사한 영향을 미칠 수 있다.
GPI 결합 막 단백질인 섬모 신경영양 인자 수용체 (CNTF)는 말초 당뇨성 신경병증의 일부 유형에 관련되어 있는 것으로 이미 밝혀져 있다. 실험 동물에게 갈락토오스 섭취 또는 스트렙토조토신 처리하여 유도한 고혈당증에서, 좌골 신경에서의 CNTF 유사 활성의 수준은 고혈당증의 1-2 개월 후에 감소했다. 이는 CNTF 단백질의 감소와 함께 일어나지만 mRNA는 감소되지 않는다. 스완(schwann) 세포 손상으로 인한 CNTF의 결함은 실험적 당뇨성 신경병증에서 특정한 기능적, 구조적 이상을 유발할 수 있다. 이런 이상 중 일부는 헥소오스의 알도오스 환원효소 (AR) 대사로 인한 것이며, AR 억제제에 의해 방지될 수 있다. 그러나 CNTF 결함은 이들 억제제에 의해서는 부분적으로만 복원되는데, 이는 AR 활성에 기인된 폴리올 축적 이외의 다른 요인이 CNTF의 발현 감소에 관여한다는 것을 의미한다 (Mizisin et al., 1997). 이는 GPI 결합 분자가 말초 당뇨성 신경병증 및 자율 신경병증에서 중요한 역할을 할 수 있음을 입증한다.
본 발명의 치료 용도와 SLE 및 1차 항-인지질 증후군에서의 미해결 문제에 대한 적용
하기 내용은 예시 목적으로 설명한 것으로서 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.
카르디오리핀과 같은 음이온계 인지질에 대한 특이성을 갖는 항체는 혈전증, 재발성 유산 및 혈소판 감소증에 관련된다 (Harris et al., 1983; Cowchock et al., 1986; Harris et al., 1986). 부분 트롬보플라스틴 시간에 의해 검출되는 루푸스 항응고제라 불리는 전신성 홍반성 루푸스 (SLE) 관련 항체에도 유사하게 적용된다 (Thiagarajan et al; Love and Santoro, 1990). 항응고 효과는 이들 항체가 음이온계 인지질과의 특이적 반응성에 의한 것으로 밝혀졌다 (Sammaritano e tl., 1990). 또한, SLE 환자는 SLE에 대한 진단 마커로서 기능하는 천연 이중가닥 DNA (dsDNA)에 대한 항체를 갖는다 (Veinstein et al., 1983). 항-인지질을 갖는 대부분의 환자는 SLE 또는 관련 자기면역 질환을 갖지만, 일부는 검출가능한 질병을 보이지 않고 '1차 항-인지질 증후군' (PAPS)를 갖는 것으로 생각된다 (Asherson et al., 1989; Branch et al., 1990). 최근에, 상기 항체의 병인학적 중요성은 인간 폴리클로날 항인지질 항체의 수동 전달에 의한 임신 생쥐에서 유산 유도에 의해 확립되었다 (Branch et al., 1990). PAPS는 또한 인간 폴리클로날 및 생쥐 모노클로 날 항-카르디오리핀 항체의 수동 전달에 의해 천연 생쥐에서 유도되었다 (Blank et al,. 1991).
항-인지질 또는 항카르디오리핀 항체는 또한 많은 신경학적 질환에서 발생하고, 그의 역할은 국소 뇌허혈증, 편두통, 콜레라, 졸중 및 다른 질환에서 강조되었다 (Levine and Welch, 1987).
현재 항-인지질 또는 항-dsDNA 항체의 기원은 알려져 있지 않다. 이에 대한 연구는 항-인지질 항체의 리간드 결합 특성에 촛점을 맞추고 있는 것으로 보인다. 환자로부터 유도된 폴리클로날 항-인지질 항체는 대부분의 음이온계 인지질과 교차반응한다 (Lafer et al., 1981; Pengo et al., 1987). 그러나, DNA와 같은 폴리뉴클레오티드에 결합하는 모노클로날 항체가 카르디오리핀 및 다른 음이온계 인지질에도 결합하는 것으로 밝혀졌을 때 다른 리간드에 관심이 분산되었다 (Schoenfeld et al., 1983; Rauch et al., 1984; Smeenk et al., 1987). 이러한 교차반응성은 3개의 탄소 원자에 의해 떨어진 포스포디에스테르 결합 포스페이트기를 모두 함유하는 인지질 및 DNA의 화학적 구조의 유사성 때문인 것으로 생각된다 (Lafer et al., 1981). 또한, 그람 양성 세균으로부터의 리포테이코산 및 그람 음성 세균으로부터의 내독소는 포스페이트 에스테르를 함유하고, 외부 항원 내의 상기 분자는 항-인지질 항체의 발생을 위한 촉발물질일 수 있다고 생각된다 (Carroll et al., 1985).
최근에, 항-dsDNA 항체의 발생은 일부 SLE 환자에서 빈번한 폴리오마 바이러스 재활성화와 밀접한 관련이 있는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 항-dsDNA의 높은 역 가는 또한 바이러스 DNA의 부재하에서도 검출되었다 (Rekvig et al., 1997).
카르디오리핀 및 항-dsDNA 반응성이 둘다 항-항-TCR Vβ 항체의 결합 특이성 내에 포함된다는 것이 이미 입증되었다 (예를 들어 표 3 참조. 방법은 실험 부분 참조). 이것은 항-TCR Vβ모노클로날 항체로 면역처리된 생쥐로부터의 폴리클로날 항체 및 상기 면역처리된 생쥐로부터 생산된 항-항-TCR Vβ 모노클로날 시약 모두의 특성이다. 또한 상기 폴리클로날 생쥐 항혈청은 강력한 항응고 효과를 가졌다.
항-항-TCR Vβ 항체의 병리생리학적 발생의 잠재적 메카니즘은 이미 문헌에서 논의되었다. 그 자체의 발생 또는 보호 항체의 유도 억제시에 폴리클로날 또는 모노클로날 항-항-TCR Vβ 항체의 사용이 지적되었다. 상기 방법은 병원성 항-DNA 및 항-인지질 항체의 조합의 발생을 억제하여 상기 항체에 의해 발생하는 질병을 완화시켜야 한다.
호르몬 조절장애 질병 및 β 세포 기능부전 또는 과인슐린혈증 및 인슐린 내성이 존재하는 질환에 대한 본 발명의 적용
상기한 바와 같이, 항-항-TCR Vβ 항체는 α 섬세포 및 다른 내분비 기관에 결합하여 그 표적 분자가 이들의 분비 메카니즘에 관련됨을 시사한다. 이것은 자기면역 내분비 질병이 한명의 환자에서 하나 초과의 기관에 영향을 줄 수 있고 임상적으로 '비이환된' 기관에 대한 자기항체가 존재할 수 있다는 발견을 설명한다. 이중에서, 공존할 수 있는 질병은 갑상선 기능 저하증, 갑상선 기능 항진증 (Grave 질병), 진성 당뇨병, 아디슨병, 원발성 성선 기능 항진증, 자기면역 위염 및 악성 빈혈증이고, 질병 프로필은 개개인의 유전적 감수성을 반영하는 것으로 추정된다.
다음 설명은 예시적인 것으로 본 발명을 제한하지 않는다.
자기면역 갑상선 질병
자기면역 갑상선 질병의 발생은 일반적인 집단보다는 IDDM 환자에서 실질적으로 더 높다 (Payami and Thomson, 1989). 비정상적인 내당성 및 간의 글루코스 생산 증가는 종종 갑상선 기능 항진증에서 관찰된다 (Wennlund et al., 1986). 글루코스 신생 증가는 8명의 갑상선 기능 항진증으로 진단된 대상에서 기본 상태 및 인슐린 주입 후 모두에서 보고된 과글루카곤혈증의 지표이다 (Moghetti et al., (1994). 또한, 글루코스 투여 또는 음식 섭취 후에 글루카곤 수준의 감소율은 과혈당증이거나 아닌 갑상선 기능 항진증 환자 중에서 상당히 작다 (Kabadi and Eisenstein, 1980; Bech et al., 1996). 또한, 인슐린 분비는 갑상선 기능 항진증 대상에서 조절되지 않는다. 하이퍼글리 클램프 동안과 같은 상이한 질환에서 (O'Meara et al., 1993), 단식 상태 및 음식 섭취 후에 (Bech et al., 1996), 면역반응성 인슐린 농도는 대조구에 비해 갑상선 기능 항진증 환자에서 더 높았다. 면역반응성 인슐린의 증가는 프로인슐린 분비 증가에 의해 설명된다. 또한, 표적 항원에 대한 항-항-Vβ 항체의 결합에 의한 호르몬 분비의 정상적인 음성 피드백 조절의 조절이상 가설과 일치하는, 갑상선 기능 항진증에서 ACTH (아드레노코르티코트로픽 호르몬), 코르티졸 및 성장 호르몬의 분비 증가의 증가가 있다 (Moghetti et al, 1994; Gallagher et al. 1971). 갑상선 기능 항진증에서 이상조절된 글루카곤 및 인슐린 분비는 당뇨병 전증 및 당뇨병 상태와 유사하고, 유사한 방식으로 야간의 TSH 증가는 대부분의 당뇨병 환자에서 더뎌진다 (Coiro et al. 1997).
다낭성 난소 증후군 (PCOS)
1차 인슐린 분비 이상을 나타내는 PCOS 여성에서 정맥내 글루코스에 대한 초기 인슐린 반응의 지속적인 증가가 존재한다 (Holte, 1995). 또한, 상기 여성은 경구 내당성 시험 (OGTT) 동안 과혈당증 및 과인슐린혈증 반응을 갖는다 (Dunaif et al. 1987). 그러나, 골란드 [Golland. 1990] 등은 PCOS 여성이 OGTT 동안 과혈당증에도 불구하고 무뎌진 글루카곤 반응을 갖는다고 보고하였다. 이것은 제2 라인 글루코스 역조절 호르몬, 즉 에피네프린이 PCOS 여성에서 증가되었음을 나타낸다. 안드로겐이 과다한 여성의 절반에서 발견된 부신 안드로겐 과잉증이 이와 일치한다 (Ehrmann et al. 1992). 스테로이드 생산에 대한 아드레날린의 효과는 관류 단리된 부신 및 분자 수준 모두에서 입증되었다 (Ehrhart-Bornstein et al. 1994; Guse-Behling et al. 1992). 전체 부신 수질 내의 부신 피질 세포의 혼합부 또는 부신 피질 내의 부신 수질 세포의 혼합부의 면역염색에 의한 조직학적 시험은 파라크린 메카니즘에 의한 부신피질 기능의 조절자로서의 부신 수질의 기능을 확증한다 (Bornstein et al. 1994). 본 발명에서 기술된 병원성 항체에 의해 인식되는 분자는 부신 수질 세포 상에 풍부하게 존재한다 (도 3). 이러한 항체는 아드레날린 분비를 증가시켜 PCOS에서 부신 안드로겐 과잉증을 야기한다.
부신 안드로겐 과잉증은 종종 일반적으로 LH 증가를 수반하는 난소 안드로겐 과잉증과 동시에 발생한다. 난소 스테로이드 생산의 비정상적 패턴은 난포막 세포의 LH 과자극 및 GnRH에 대한 과도한 반응에 의해서는 부분적으로만 설명될 수 있다. 인슐린 및 인슐린 유사 성장 인자는 난소 스테로이드 생산에서의 속도 결정 효소의 수준을 증가시키고 상기 효소의 LH 유도 하향조절을 역전시킴으로써 난포막 세포의 안드로겐 반응을 증가시킨다 (Hernandez et al. 1988; Magoffin et al. 1990). 따라서, 과인슐린혈증은 난소 기능이상의 주요 원인으로서 제시되었다 (Ehrmann et al., 1995).
또한, 과인슐린혈증은 직접적이 아니라 ACTH 자극과 상승 작용으로서 부신 안드로겐과잉증에서 역할을 수행하는 것으로 보인다 (Moghetti et al. 1996). 뇌하수체 당단백질 호르몬의 분비는 박동성이고, 그 펄스의 붕괴는 생식 기능을 변경시킬 수 있다 (Samuels et al. 1990; Santoro et al. 1986). 배양된 뇌하수체 락토트로프는 TRH 처리에 의해 신속하게 가수분해되는 GPI 결합 분자를 발현하는 것으로 입증되었다 (Benitez et al. 1995). 포스포리파제 C 억제는 TRH의 작용 및 제2 메신저 생성을 억제한다 (Perez et al. 1997). 쥐 뇌하수체 전엽 세포로부터 ACTH의 방출은 포스포리파제 C 활성을 억제함으로써 억제되는 것으로 밝혀졌다 (Won and Orth, 1995). 또한, ACTH의 효과는 포스포리파제 C에 의해 모방된다 (Foster and Veitl, 1995). 빌라 등(Villa, 1995)은 부신피질 세포에서의 알도스테론의 축적은 이노시톨 포스포글리칸에 의해 투여량 의존적 방식으로 억제되어 이들 분자의 조절 기능을 입증한다고 보고하였다. 이러한 관찰은 본원에서 설명된 병원성 항-항-TCR Vβ 자기항체에 의한 포스포리파제 C 작용 부위를 차단하는 보다 광범위한 효과를 입증한다.
비만
과인슐린혈증은 아동 및 성인 비만 모두의 특징이다. 스툰프 등 (Le Stunff and Bougneres (1994))은 비만 기간이 길거나 짧은 아동에서 표준 음식 섭취에 대한 인슐린 반응이 76% 증가하고 단식은 비만 기간에 인슐린 수준을 증가시킨다고 보고하였다. 또한, 비만 기간이 길거나 짧은 비만 아동은 대조집단에 비해 표준 섭취 시험 후에 과혈당증을 보였고, 이것은 최근 비만 아동에서의 글루코스 신생 증가 보고와 일치한다 (Le Stunff and Bougneres 1996).
식후 인슐린 증가는 정상 체중이 달성된 후에 비만 여성에서 지속적인 것으로 밝혀졌다 (Fletcher et al. 1989). 따라서, 과인슐린혈증은 비만을 야기하는 1차 비정상인 것으로 보인다. 성인 비만에서, 과인슐린혈증은 또한 단식 및 식후 상태 모두 동안에 유리 지방산 수준의 증가와 관련된다 (Golay et al. 1986). 글루코스 신생의 증가 및 과인슐린혈증은 비만에서 글루카곤 분비의 조절 이상의 결과인 것으로 보인다. 보리 (Borghi et al. 1984)는 글루코스가 비만 대상에서 글루카곤 분비를 억제할 수 없다고 보고하였다. 골란드 (Golland et al, 1990) 등은 비만 여성이 비만하지 않은 여성보다 글루코스를 경구 투여한지 60분, 90분 및 120분 후에 상당히 큰 글루카곤 반응을 보였음을 보여주었다. 이들 관찰은 모두 당뇨병 전증 및 당뇨병 질환과 유사하게 췌장 α 세포에서의 조절 시그날의 결여를 입증한다.
쿠싱(Cushing) 증후군
이 질병은 주로 비내당성, 당뇨병, 중심 비만, 다모증 및 동맥혈압 증가와 관련된다. 주요 진단적 특징은 20 내지 40%의 환자에서 오래 지속된 ACTH 과다분비로부터 발생할 수 있는 고코르티솔증이고 (Doppman et al. 1988), 이것은 뇌하수 체 선종이 없는 경우에 발생할 수 있고, 코르티솔 분비 증가는 자율 분비되는 마이크로 또는 마크로 결절이 있거나 없는 일측성 또는 양측성 부신 과다증식에 의한 것일 수 있다 (Hermus et al. 1988).
비만하고 당뇨병이 있는 90명의 환자에 대한 최근의 연구에서, 쿠싱 증후군의 발생은 3.3%인 것으로 보고되었다 (Leibowitz et al. 1996). 잘 통제되지 않는 당뇨병으로 제시되는 쿠싱 증후군의 잠복기 및 무증상 환자를 포함하면 상기 수치는 크게 증가한다. 유사한 방식으로, 온화한 만성 고코르티솔증은 단식 코르티솔 및 요 유리 코르티솔의 증가 및 양 코르티코프로핀 방출 호르몬에 대한 반응 증가에 의해 반영되는 제1형 당뇨병에서 보고되었다 (Roy et al. 1993).
ACTH 과다분비는 뇌하수체 선종의 부재 하에, 그러나 과코르티솔혈증의 존재 하에 발생할 수 있고 (Grant and Liddle, 1960), 이는 정상적인 음성 피드백 조절의 조절이상을 시사한다. 몇몇 보고서는 부신, 갑상선, 생식선 등으로부터 자극되는 호르몬의 분비 및 뇌하수체 호르몬 분비 모두의 조절시에 포스포리파제 C의 활성화에 의해 방출되는 GPI-결합 분자 및 이노시톨 포스포글리칸의 역할을 언급하고 있다 (Fanjul et al. 1993; Shaver et al. 1993; Villa et al. 1995). 따라서, 본원에서 설명되는 자기항체는 호르몬의 박동성 분비의 붕괴로부터 분비의 억제 또는 과도한 분비, 및 GPI-결합 분자에 대한 항체가 또한 활성화 시그날에 대한 억제 정보를 상실시킴으로써 세포 증식을 유도하는 것으로 밝혀졌기 때문에 종양의 형성에까지 이르는 병인학적 효과를 가질 것으로 예상된다 (Robinson and Hederer, 1994; Benitez et al. 1995).
대사 신드롬 X 및 심혈관 질병
신드롬 X는 과인슐린혈증, 글루코스 비관용성, 초저밀도 지질단백질 (VLDL) 및 트리글리세리드의 증가, 고밀도 지질단백질 (VLDL)의 감소 및 고혈압의 조합이다. 중심 비만은 또한 상기 신드롬과 관련된다. 상기 신드롬의 1차적인 우발적 비정상은 인슐린 내성인 것으로 생각된다 (Reaven. 1988; Reaven 1995). 흐른셔 (Hrnciar et al. 1992) 등은 일반적인 집단의 5 내지 10%에서, 동맥 고혈압 환자의 15 내지 30%에서, NIDDM의 65 내지 90%에서, 다모증 여성의 10 내지 20%에서, 심근경색 환자의 30 내지 50%에서 상기 신드롬이 존재하는 것으로 추정하였다. 피드롤라 (Piedrola et al. 1996) 등은 새로 관상동맥 질병으로 진단된 환자 40명의 82.5%가 인슐린 내성을 보이고, 40명중 27명이 비정상적 OGTT를 가졌다. 과인슐린혈증 및 인슐린 내성은 말초혈관, 관상동맥 및 경동맥 질병의 심도와 관련이 있고 (Standl 1995; Reaven 1995), 또한 미혈관 안기나 및 절개 유도 관상동맥 허혈증에 관련된다 (Vertergaard et al. 1995).
2930명의 대상에 대한 심혈관 질병 및 신드롬 X 연구에서, 페라니니 등(Ferrannini et al. 1991)은 상기 신드롬의 각각의 질환의 개별 형태는 드물고, 항상 과인슐린혈증과 관련되어 과인슐린혈증이 상기 신드롬의 주요 특징임을 시사한다고 보고하였다 소우어스 등(Sowers et al. 1993)은 또한 과인슐린혈증이 동맥경화증 및 혈관 재모델화를 촉진시킴으로써 고혈압 발생에 작용할 수 있을 것으로 제시하였다. 인슐린 내성은 경동맥 벽 두께의 증가 (Suzuki et al. 1996) 및 경동맥 플라크의 증가 (Laakso et al. 1991)과 관련이 있는 것으로 관찰되었다. 살로 넨 등 (Salonen et al. 1998)에 의한 최근의 유망한 집단 기초 연구는 고혈압 및 이상지질혈증의 병인학에서 인슐린 내성을 포함하는 가설을 지지한다. 몰러 (Moller et al. 1996) 등은 근율 인슐린 수용체 매개 신호 전달의 완전한 결함이 트랜스제닉 생쥐에서 인슐린 내성, 과인슐린 혈증, 비만, 혈장 트리글리드 및 유리 지방산의 증가를 야기한다고 입증하였다. NIDDM에서, 근육 생검은 인슐린 작용의 이노시톨 포스포글리칸 매개인자의 일반화된 결함을 나타내었다 (Asplin et al. 1993). 본원에서 설명되는 병원성 항체는 상기 매개인자와 교차반응하여 이들의 하향조절 및 인슐린의 박동성 분비의 붕괴에 의해 인슐린 내성을 유도할 수 있다.
면역학적으로 매개된 멀티시스템 질병
과인슐린혈증 및 인슐린 내성은 또한 전신성 홍반성 루푸스 및 진행성 전신성 경화증과 같은 멀티시스템 질병에서 현저한 것으로 밝혀졌다. 21명의 상기 환자에서 혈청 단식 인슐린 수준은 정상 대조구의 2배였고, 이들은 상당히 더 높은 트리글리세리드 및 더 낮은 HDL 콜레스테롤 수준을 보였다 (Mateucci et al. 1996).
암
과인슐린혈증, 글루코스 관용성의 당뇨병 패턴, HGP의 증가율 및 인슐린 내성은 유방, 결직장, 위장, 육종, 자궁내막, 전립선, 두경부 및 폐를 포함하는 많은 암과 관련된다 (Tayek 1992, Copeland, Leinster et al. 1987, Copeland, Al-Sumidaie et al. 1987, Tayek 1995, Nagamani et al. 1988). 브루닝 등(Bruning et al. 1992)은 유방암의 로그상 상대 위험이 로그상 C-펩티드 수준과 직선 관계에 있음을 입증하였다. 이것은 BMI (체중 지수) 또는 WHR (허리 대 히프 비율)와 무관하고, 단계 I 또는 단계 II 유방암 여성 223명이 인슐린 내성을 보였고 441명의 대조구보다 상당히 높은 C-펩티드 수준을 보였다. 2569명의 조직학적으로 확인된 유방암 환자와 2588명의 대조구 여성에 대한 최근 연구에서, 유방암과 근래 발병한 당뇨병의 관련이 관찰되었다 (Talamani et al. 1997). 종양 촉진에 있어 인슐린의 직접적인 역할은 쥐의 결장 종양 모델에서 밝혀졌다 (Tran et al., 1996).
또한, 암 악액질은 글루코스 비관용성, 흡수후 고혈당증, 인슐린 내성에 일치하는 전체 신체 글루코스 이용 감소 및 말초 락테이트 생산의 증가라는 특징을 갖는 것으로 보인다. 인슐린 대 글루카곤 비율도 감소되고, 순환 글루카곤 수준의 증가는 많은 암에서 HGP 증가와 일치하는 종양 보유 상태와 관련된다 (Cersosimo et al. 1991). 바틀렛 등 (Bartlett et al. 1995)은 호르몬 요법에 의한 인슐린 글루카곤 비율의 증가가 쥐 모델에서 숙주 동화작용을 선택적으로 지지하고 종양 성장 동력학을 억제함을 입증하였다. 따라서, 대사 교란의 당뇨병 발생 복합체의 발생을 억제하면 암의 발생율을 저하시키고 암 악액질의 증상을 완화시킬 것이다.
본 발명의 진단, 예방 및 치료 용도
다음 실시예는 제한의 의미가 아니라 예시를 위해 제공된다.
본 발명은 모노클로날 또는 폴리클로날 항-항-Vβ 항체 또는 등가의 리간드, 상기 항체에 의해 인식되는 펩티드 단편 또는 분자 및 상기 펩티드 또는 분자를 코딩하는 RNA 또는 DNA 서열을 함유하는 기능적 활성 벡터의 제약 제제를 주사함으로써 자기면역 및 관련 질병의 예방 및 치료에 적용될 수 있다.
항체 주사는 존재하는 B세포를 억제하는 피드백 메카니즘에 의해 또는 보호 항체를 생성시키는 항체 발생의 유전자형 네트워크에 의해 동일한 특이성을 갖는 자기항체의 발생을 억제하도록 고안될 것이다. 병원성 항-항-Vβ 항체에 의해 인식되는 가용성 펩티드 또는 다른 표적 분자는 저투여량 관용성, 이미 활성화된 B 세포의 특이적 차단을 유도하거나 TGF-β와 같은 특이적 신장병의 매개인자의 작용을 보다 많은 소정 투여량에서 차단하기 위해 사용될 것이다. 또한, 적합한 핵산 서열을 함유하는 벡터는 톨레로겐으로서 기능하는 가용성 생성물을 장기간 체내 분비시키기 위해 소정의 요법에 의해 주사될 것이다. 항-항-Vβ 병원성 항체 및 상기 항체의 생성에 사용되는 항-Vβ 면역유발원에 의해 인식되는 펩티드, 단백질 또는 다른 분자는 자기면역 질병에 대한 감수성을 확인하거나 질병 진행의 예후 또는 치료 효능의 표시자로서 혈액, 혈장, 혈청, 타액 또는 다른 체액 내의 항-항-Vβ 항체의 존재를 검출하는 진단 키트의 개발에 사용될 것이다.
본 발명의 다양한 면 및 실시태양은 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명될 것이다. 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 변형이 가능함을 이해할 것이다.
도 1은 형광성 제2 시약에 의해 검출되는 모노클로날 항-항-Vβ 항체를 사용한 정상 인간 췌장 절편의 염색.
도 2는 형광성 제2 시약에 의해 검출되는 모노클로날 항-항-Vβ 항체를 사용한 정상 인간 갑상선 절편의 염색.
도 3은 형광성 제2 시약에 의해 검출되는 모노클로날 항-항-Vβ 항체를 사용 한 정상 인간 부신 절편의 염색.
도 4는 형광성 제2 시약에 의해 검출되는 모노클로날 항-항-Vβ 항체를 사용한 정상 인간 장 절편의 염색.
도 5는 항-항-Vβ 모노클로날 항체 및 형광성 제2 시약을 사용한, 비조절된 케토산성 혈액증으로 인한 당뇨병으로 사망 진단된 아동의 췌장 절편의 염색.
도 6은 ESRP1 유전자의 서열.
도 7은 ESRP1 단백질의 예상된 단백질 서열.
실험예
다음 실시예는 제한의 의미가 아니라 예시를 위해 제공된다.
모노클로날 항체의 발생
생쥐를 TCR Vβ 특이성에 대해 모노클로날 항체 하이브리도마 배양 상청액 0.1 ㎖을 4주간 복강내(ip) 주사하여 면역화시켰다. 이어서, 췌장을 취하여 단세포 현탁액을 제조하였다. 세포를 이 분야 및 관련 분야의 기술자에게 공지되어 있는 표준 기법을 이용하여 Sp2 골수종 세포와 융합시켰다. 항체 생산 클론을 퍼옥시다제 결합 항-Ig 시약을 사용하여 ELISA로 동정하였다. 클론을 면역화제, 이중가닥 및 단일가닥 DNA와 음이온계 인지질에 대해 더욱 스크리닝하였다. 사용된 방법은 이 분야의 기술자에게 공지되어 있는 표준 기법이다.
항-인지질 항체의 검출
가요성 96웰 평저 평판(Falcon, Becton-Dickinson)을 50 ㎕의 에탄올 중 50 ㎍/㎖의 카르디오리핀, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린 및 메탄올 중 50 ㎍/㎖의 포스파티딜이노시톨 (Sigma)로 코팅하였다. 대조구 웰은 희석액만으로 코팅하였다. 평판을 증발시까지 4℃에서 방치하였다. 비결합 부위를 인산염 완충 염수 (PBS) 중 0.1% 인간 혈청 알부민 (HSA)로 블록킹시켰다. 평판을 0.05% Tween 20 (RTM)을 함유하는 PBS로 세척하고, PBS Tween (RTM) 중 혈청의 계열 희석액 또는 MoAb 배양 상층액과 함께 배양하였다. 37℃에서 1시간 동안 또는 4℃에서 밤새 배양한 후, 평판을 다시 상기한 바와 같이 세척하고, 결합 항체를 비오틴화 항-생쥐 Ib (Amersham International plc)의 1:500 희석액을 사용하여 검출하고, 37℃에서 30분간 배양한 후, 적절하게 세척한 다음 1:500의 스트렙타비딘-비오틴화 양고추냉이 퍼옥시다제 복합물 (Amersham International plc)와 함께 37℃에서 30분간 더 배양하였다. O-페닐렌디아민 (Sigma)를 기질로 사용하고, 색도는 Anthos ELISA 판독기를 사용하여 450 ㎚에서 판독하였다.
항-DNA 항체의 검출
96웰 평저 가요성 평판의 웰을 처음에 물 중 50 ㎍/㎖의 폴리-l-라이신으로 실온에서 1시간 동안 배양함으로써 코팅하였다. 폴리-l-라이신 용액을 폐기한 후, 1mM EDTA를 함유하는 PBS 중 10 ㎍/㎖의 단일가닥 또는 이중가닥 DNA (Sigma) 용액 50 ㎕를 각각의 웰에 첨가하고, 평판을 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 평판을 PBS로 세척하였다. 남아있는 결합 부위를 PBS 중 0.1% HSA로 블록킹하였다. 평판을 0.05% Tween 20 (RTM)을 함유하는 PBS로 세척하고, 혈청의 계열 희석액 또는 MoAb 배양 상층액과 함께 배양하였다. 항체의 결합은 항-인지질 항체에 대해 상기한 바와 같이 검출하였다.
항-항-Vβ 항체의 항응고 효과에 대한 시험
다양한 항-TCR Vβ 모노클로날 항체에 의해 면역화시킨 동종번식시킨 생쥐의 몇몇 주로부터의 항혈청을 시험하였다. 5 ㎕의 각각의 항혈청을 95 ㎕의 하드 스펀(hard spun) 정상 인간 혈장과 함께 혼합하고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 여기에 100 ㎕의 적절하게 희석시킨 러셀(Russel) 독사액 (Diagen)과 100 ㎕의 희석시킨 혈소판 대용물(Diagen)을 첨가하고 30초간 배양하였다. 이어서, 100 ㎕의 0.025 M CaCl2를 첨가하고, 응고 시간을 측정하였다. 정상 생쥐 혈청의 존재하의 응고 시간은 약 55초인 반면, 상기 면역 혈청의 존재하에 응고 시간은 10 내지 30분 범위였다. 대조 쥐 항혈청은 정상 생쥐 혈청의 응고 시간보다 응고 시간을 연장시키지 않았다.
당뇨병 췌장 절편의 염색
(당뇨병과 관련되지 않은 원인으로) 사고사한, 최근 진단된 인슐린 의존성 당뇨병 환자로부터 췌장 절편과 정상 사망자 장기 기증자로부터의 췌장 절편을 항-항-Vβ 모노클로날 항체로 염색하였다. 정상 췌장 절편은 기대한 바와 같이 섬세포내 염색을 나타냈지만 (도 1 참조), 당뇨병 췌장은 전혀 염색되지 않거나 매우 희미하게 염색되었다. 이는 이 환자에서 관련 α 세포 항원이 하향조절되거나 중단되었음을 지시한다.
이와 대조적으로, 케톤산성 혈액증으로 사망 진단된 3명의 어린이로부터의 췌장 절편의 항-항-Vβ 염색은 섬세포의 경계 외의 포지티브 염색 세포의 증식을 보여주었다 (도 5). 이는 생체내에서 라미닌 결합 유사 단백질 또는 섬세포의 외부 α 세포의 증식과 이동을 일으키는 다른 표적 단백질과 반응하는 다량의 항체 때문일 수 있다.
상기 기재한 두 시나리오는 빈약한 β 세포를 갖는 개인들에게 있어서 전격성 비제어 케톤-산성증 및 사망 또는 IDDM을 일으키고, 보다 건강한 β 세포를 갖는 개인들에게 있어서 NIDDM을 일으키는 상이한 유전 소질의 개인들에 의한 반응 스펙트럼에 일치할 수 있다.
시험관내 무손상 인간 섬세포에 대한 모노클로날 항-항-V 베타 항체의 영향
사망자 장기 기증자로부터 분리한 인간 섬세포를 10% 태송아지 혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지에서 세척하고, 동일한 배지에서 24-웰 평판에서 웰당 약 200개의 섬세포의 농도에서 배양하였다. 3일후, 2개씩의 웰로부터의 배지를 조심스럽게 취하여 -20℃에서 저장하였다. 이어서, 대조구 웰을 배지 단독으로 배양시키고, 시험군을 동일 부피의 신선한 배지로 희석시킨 항-항-Vβ를 함유하는 하이브리도마 배양 상층액과 함께 배양하였다. 24시간 후, 각각의 웰에서 상층액을 취하여 상기한 바와 같이 저장하고, 배지 단독 또는 상기한 바와 같이 희석시킨 하이브리도마 상층액을 보충하였다. 이를 상층액을 주말 동안 제거하지 않은 것을 제외하고는 2주동안 매일 반복하였다. 실험 기간의 끝에, 저장된 샘플내에 인슐린을 DAKO 인슐린 키트를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 측정하였다. 결과는 시험군 웰 및 대조구 웰 중 인슐린 수준이 실험 시작시와 거의 동일하다는 것을 나타냈다. 항체를 첨가한지 24시간 후, 시험군 웰 내 인슐린 수준이 대조구 웰에서 보다 상당히 더 높게 증가하였다. 3일째에, 항체를 함유하는 웰 중 인슐린 분비는 대조구의 약 50%로 떨어졌다. 4일째에, 시험군 웰에서의 인슐린 분비는 다시 대조구 웰보다 높아졌으며, 5일째에 수준이 유사해졌다. 표 1에 흡광도 (OD) 판독값으로 나타낸 결과는 대조구 웰에서 인슐린 방출은 명백하게 일정하지만, 실험 제1중 동안 시험군 웰에서 급격한 변동이 있었음을 보여주었다. 제2주 동안 시험군 웰에서 인슐린은 하강하였고 10일째에는 분비가 검출되지 않았으며, 대조구 웰에서 분비는 배경 OD 판독치보다 더 높았다. 대조구 웰에서 분비를 추가로 측정할 수 없더라도, 대조군 웰에 있어서 인슐린 분비 감소의 느린 속도는 수일 동안 더 분비가 일어날 수 있음을 나타낸다.
시험관내 인간 섬세포에 대한 모노클로날 항-항-TCR Vβ 항체의 영향
일수 흡광도 일수 흡광도
시험군 대조군 시험군 대조군
1 2.117, 2.063 2.042, 1.848 8 0.699 1.114
2 2.784, 2.751 2.143, 2.044 9 0.777 1.049
3 1.236, 1.057 2.256, 2.240 10 0.585 0.979
4 2.513, 2.377 2.124, 2.187 11 0.482 0.842
5 2.446, 2.450 2.506, 2.545
흡광도는 650㎚에서 참조 필터를 사용하여 450㎚에서 Anthos 2001 평판 판독기를 사용하여 측정하였다. 배양 배지에 대한 흡광도는 0.532이었다.
인간 혈청내 천연 항-항-Vβ 자기항체의 증명
항-항-Vβ 항체를 항-TCR Vβ6 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주로부터의 배양 상층액으로 면역화시킨 생쥐의 비장에서 생산시켰다. 이들 항-항-Vβ 모노클로날은 ELISA에서 항-Vβ 면역유발원에 결합하는 것으로 나타났고; 따라서, 인 간 혈청내 자기 항-항-Vβ 항체의 존재를 검출하기 위한 항원으로서 이 면역화제의 용도가 검토되었다. 항-Vβ 면역유발원을 사용하여 96-웰 평저 평판을 밤새 코팅시키고, 비결합 부위를 블로킹하고, 인간 혈청을 1/30 희석액으로 웰에 첨가하였다. 2시간 동안 배양한 후, 평판을 세척하고, 인간 혈청의 결합을 퍼옥시다제 결합 항-인간 Ig를 사용하여 검출하였다.
표 2는 3명의 당뇨병 전증의 공여자 (이들은 그 후에 당뇨병이 되었다)로부터 얻은 혈청을 사용한 결과를 설명한다. 3 공여자로부터 혈청 샘플링은 우연히 일정 간격을 유지하였고, 진단 1년전에 최고 농도의 자기항체가 나타났다. 제1 샘플의 7개월 이내에 결합 지수 (시험군 OD/대조구 OD)가 4.4에서 6.1로 증가하였고, 진단 2개월 전에 2.9로 감소되었다. 이는 이 항체의 일시성을 증명하고, 장기간 유지되지 않아 질병 발병을 일으키지만, 아마도 T-세포 증식과 비정상적 GPI-결합 TCR Vβ 사슬의 발현을 일으키는 바이러스 또는 다른 감염으로 인해 역가의 증가 에피소드가 수회 있는 것을 나타낸다. 그러나, 자기항체는 환자 3에서 최고 수준에서 7개월 이상 내지 1년 동안 유지되는 것으로 보였다. 이는 앞서 언급한 바와 같이 췌장 β 세포에서 신호전달 분자를 하향조절할 수도 있다.
항-항-TCR Vβ 자기항체가 인간 혈청에 존재한다
공여자 번호 혈청 (일자) IDDM의 진단 (일자) 흡광도
시험군 항원 시험군/대조구 대조구 (배지)
1 5/1989 1/1991 0.082, 0.080 0.124, 0.134
2 2/1989 1/1993 0.087, 0.076 1.5 0.058, 0.054
6/1989 0.079, 0.074 0.076, 0.063
3 5/1987 12/1988 0.074, 0.072 4.4 0.016, 0.017
12/1987 0.109, 0.097 6.1 0.016, 0.018
10/1988 0.060, 0.057 2.9 0.021, 0.019
시험 항원은 항-TCR Vβ생산 모노클로날 세포주로부터의 배양 상층액이었다.
시험군/대조구 지수는 평균 OD 시험군값을 평균 OD 대조구값으로 나누어 구하였다.
모노클로날 항-항-TCR Vβ 항체의 결합 특이성
웰 코트 시약 흡광도
실험 1 실험 2
항-TCR Vβ (면역유발원) 0.413 0.399
배양 배지 (대조구) 0.046 0.040
에탄올 중 카르디오리핀 1.002 0.998
에탄올 (대조구) 0.156 0.126
dsDNA 0.210 0.242
폴리-l-라이신 (대조구) 0.119 0.129
흡광도는 650㎚에서 참조 필터를 사용하여 450㎚에서 Anthos 2001 평판 판독기를 사용하여 측정하였다. 항-TCR Vβ는 배양 상층액 사용하였다.
모노클로날 항체 (MoAb)를 사용하는 췌장 라이브러리의 스크리닝
λgt11 내 라이브러리는 EcoR1 부위에 삽입된 DNA 서열을 갖고, lac 프로모터의 조절 하에 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 따라서, 이들은 항체를 사용하여 스크리닝할 수 있다.
현재의 경우, 웹스터(Webster) 등 [1992, Methods in Molecular Biology 10권, Immunochemical protocols ED. M.Manson]에 의해 기술된 방법을 이용하여 λgt11 인간 췌장 라이브러리 (Promega)를 스크리닝하였다. 간략하게, 박테리아 균주 Y1090을 용융 아가로스와 혼합한 박테리오파지로 형질감염시켜 배지 평판에 플레이팅하였다. 아가로스에 묻힌 박테리아가 성장하였고, 파지가 세포를 용해시켜 투명한 플라크를 형성하는 경우를 제외하고는 연속 론(lawn)을 형성하였다. 적절한 파지 희석에서, 하나의 박테리아를 감염시키는 하나의 파지로부터 각각 별개의 플라크가 발생하였다. 이어서, 아가 평판을 고유의 EcoRI 부위에서 cDNA를 삽입시킨 β-갈락토시다제 유전자 (λgt11 내에)를 유도하는 이소프로필 β-D-티오갈락토사이드 (IPTG)를 흡수시킨 니트로셀룰로스막 (Protran BA85 0.45 ㎛, 82 ㎜, Schleicher and Schuell) 시이트로 덮었다. cDNA가 정확한 리딩 프레임 및 배향으로 있으면, 카르복시 말단에서 β-갈락토시다제 단백질의 연장인 융합 단백질이 생산될 것이다. 이어서, 막이 덮인 평판을 약간 저온에서 배양하여 융합 단백질 생산을 증가시켰다. 이어서, 막을 제거하고 세척하여 박테리아 파편을 제거하고, 항체와 반응하는 단백질 서열을 코딩하는 cDNA 클론을 검출하기 위해 MoAb로 프로빙하였다. 이 절차를 위해, 먼저 막을 세척액 (0.02% Tween (RTM) 20을 함유하는 PBS 중 5% 분유) 중에서 30분간 배양하여 항체의 비특이적 결합을 방지하였다. 이어서, 이들을 세척액으로 세정하고, 순수 MoAb를 포함하는 페트리 접시에 놓고 2-3시간 동안 진탕기 상에 놓았다. 이어서, 항체를 제거하고, 막을 진탕기 상에서 총 30분 동안 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 이어서, 세척 완충액을 제거하고, 막을 진탕기 상에서 적당하게 희석시킨 양고추냉이 퍼록시다제 표지된 항-생쥐 항체 (Sigma) 중에 1시간 동안 담구었다. 이어서, 항체 용액을 폐기하고, 막을 진탕기 상에서 30분에 걸쳐 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 이어서, ECL (강화된 화학발광) 시약 (Amersham Life Sciences)을 사용하여 항체 결합을 검출하였다. 동일한 부피의 2 시약을 혼합하고 막의 단백질 측 상에 1분간 덮었다. 이어서, 과량의 검출 시약을 배수시키고, 막을 Saran 랩에 덮어 카셋트 내에서 방사능사진 필름 (Hyperfilm™-ECL)에 노출시켰다. 필름을 현상시켰고 플라크를 포함하는 아가 평판에 일치시켰다. 포지티브 플라크를 파스퇴르 피펫을 사용하여 집어서, 방부제로서 50 ㎕의 클로로포름을 함유하는 플라크 용리액 (SM:0.1M NaCl, 0.01M MgSO4.7H2O, 0.05M 트리스 베이스, 0.01 %w/v 젤라틴 (돼지 피부 타입 1, pH 7.5로 조정)) 0.5 ㎖에 옮겼다. 포지티브 플라크를 막 상의 모든 플라크가 포지티브가 될 때까지 재스크리닝하였다.
cDNA 클론의 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭
8개의 cDNA 클론 (앞서 기재한 바와 같이 정제한 플라크)을 다음 증폭 혼합물: Taq Plus (Stratagene) 10x 저염 반응 완충액 (Low Salt Reaction Buffer) 5 ㎕; dNTPs (Pharmacia) 각각 200 μM; 전진 및 역행 프라이머 각각 25 pM (전진: GTA GAC CCA AGC TTT CCT GGA GCA TGT CAG TAT AGG AGG; 역행: CTG CTC GAG CGG CCG CAT GCT AGC GAC CGG CGC TCA GCT GG; Perkin Elmer) Taq Plus DNA 중합효소 (Stratagene) 1 유닛; cDNA 템플레이트 2 ㎕; 50 ㎕ 이하의 dH2O을 사용하여 증폭시켰다.
DNA 중합효소를 94℃에서 7분간의 예비 유출 동안 첨가하였다 (즉, 고온 개시시켰다). 반응 혼합물을 100 ㎕의 광유로 덮었다. 튜브를 다음: 94℃ (변성) 1분, 55℃ (어닐링) 2분, 72℃ (연장) 3분, 36 사이클과 같이 프로그램시킨 DNA Thermal Cycler (Perkin-Elmer Cetus, Emeryville, CA)에 넣었다. 마지막 연장은 7분이었다. PCR 생성물을 분석할 때까지 4℃에서 저장하였다.
PCR 생성물의 분석
0.5 ㎍/㎖의 브롬화에티듐을 함유하는 1% 아가로스 겔을 TAE 완충액 (트리스 베이스 242 g, 빙초산 57.1 ㎖, 0.5M EDTA (pH 8.0) 100 ㎖, dH2O 1000 ㎖ 이하) 중에 제조하였다. 10 ㎕의 각각의 PCR 생성물을 샘플 완충액 2 ㎕와 함께 로딩하였다. 2 ㎕의 100 염기쌍과 1 kb DNA 래더(ladder) (Gibco, BRL)를 참조용으로 PCR 생성물의 각각의 면에 로딩하였다. 겔을 100 V에서 1시간 동안 전개시켰다. PCR 생성물을 UV 광하에 가시화하여 Polaroid (RTM) 667 필름 (Polaroid, St. Albans, UK)을 사용하여 촬영하였다.
DNA 서열 결정
PCR 생성물의 확인은 ABI PRISM 염료 터미네이터 사이클 서열 결정(Dye Terminator Cycle Sequencing) 즉석 반응 키트(ready reation kit) 및 ABI 373A 시퀀서 (Applied Biosystems, Perkin-Elmer, Foster City, CA.)를 사용하여 서열 결정함으로써 점검하였다.
사이클 서열 결정 반응 혼합물을 다음과 같다: 터미네이터 즉석 반응 혼합물-8 ㎕, PCR 생성물 (10 내지 30 ng/㎕) 3-6 ㎕, 프라이머 3.2 pM, dH2O 20㎕ 이하, 50 ㎕의 경질 광유로 덮음. 튜브를 DNA Thermal Cycler에 넣고 다음 프로그램에 따라 전개시켰다: 30초간 96℃, 15초간 50℃, 4분간 60℃를 25사이클로 반복함. 20 ㎕ 연장 생성물을 1.5 ㎖의 마이크로원심분리관에 옮겨담고, 3M 아세트산나트륨 (pH 4.6) 2l ㎕와 95% 에탄올 50 ㎕을 첨가하였다. 튜브를 볼텍스시키고 얼음 상에 10분간 놓은 다음, 13,000 rpm에서 15-30분간 원심분리하였다. 에탄올 용액을 폐기하고 펠렛을 75% 에탄올로 세척하였다. 튜브를 재회전시키고, 에탄올 용액을 조심스럽게 제거하고, 펠렛을 진공 원심분리로 건조시켰다.
샘플의 준비 및 로딩
건조 샘플 펠렛을 6 ㎕의 로딩 완충액 (탈이온화 포름아미드 5 부피; 25 mM EDTA (pH 8.0) 1 부피 중 50 ㎎/㎖ 블루 덱스트란)에 재현탁시켰다. 샘플을 볼텍스시키고 원심분리하였다. 이어서, 이들을 2분간 90℃로 가열하고 로딩하기 전까지 얼음 내에서 보관하였다. 샘플을 1500-2000 V에서 30분간 예열시킨 6% 아크릴아미드 겔 상에 로딩하였다. 로딩한 후, 이들을 2000 V에서 12시간 동안 전기영동시켰다. 서열 데이타를 컴퓨터로 분석하였다.
8개의 cDNA 클론을 정제하고 서열 결정하였다. 상기 논의한 바와 같이, 클론 1.1, 1.2 및 1.3이 세크리토그라닌 1 유사 단백질을 코딩하고; 클론 3.1, 4.1 및 5.1이 67kd 라미닌 수용체 유사 단백질을 코딩하며; 클론 5.2가 ESRP1 (엔도크린 분비 조절 단백질 1)로 명명한 새로운 분자를 코딩하는 것으로 밝혀졌다. ESRPI의 서열은 도 7에 도시하였고, 그가 코딩하는 예측 아미노산 서열은 도 6에 도시하였다.
진핵세포 발현 백터(pCR™3-Uni. Invitrogen) 내로 dDNA의 클로닝
본 실험은 단방향 진핵세포 TA 클로닝 키트 (Invitrogen)을 사용하여 수행하였다. 선형화 pCR™3-Uni는 그의 좌측 아암에 5'-포스페이트기를 갖지 않고, 따라서 5'-포스페이트를 갖는 PCR 생성물만을 결찰할 것이다. 따라서, cDNA의 증폭에 사용되는 전진 프라이머를 결찰 반응 이전에 다음과 같이 포스포릴화시켰다: 전진 PCR 프라이머 (50-100 pM) 0.5-1 ㎍, 10x-키나제 완충액 1㎕, 10mM ATP 1㎕, 멸균수 9㎕까지, T4 폴리뉴클레오티드 키나제 (10 단위/㎕) 1㎕를 멸균 0.5 ㎖ 마이크로원심분리관에서 부드럽게 혼합하고 37℃에서 30-40분간 및 94℃에서 5분간 배양한 다음 얼음 상에 놓았다. 이어서, 포스포릴화 전진 프라이머를 앞서 기술한 바와 같이 PCR 생성물을 제조하기 위해 즉시 사용하였고, 10 ㎕의 PCR 생성물을 아가로스 겔 상에서 분석하였다.
결찰 반응은 다음과 같이 설정하였다: 신선한 PCR 생성물 (약 10 ng) 0.5-1.0 ㎕, 멸균수 5.0-5.5 ㎕, 10x 결찰 완충액 1 ㎕, pCR™3-Uni 벡터 (60 ng) 2 ㎕, T4 DNA 리가제 1 ㎕. 혼합물을 14℃에서 4시간 동안 또는 밤새 배양하였다.
결찰 반응물을 Top 10F' 세포 (One Shot)로 형질전환시켰다. 원 샷 세포를 얼음 상에서 해동시키고, 2 ㎕의 0.5M β-머캅토에탄올을 바이알에 첨가하였다. 세포를 1-2 β의 결찰 반응물과 혼합하고 얼음 상에서 30분 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 40℃에서 정확하게 30초간 열 쇼크시켰다. 이어서, 450 ㎕를 바이알에 첨가하였다. 이어서, 이들을 그의 측면 상에 인큐베이터에서 225 rpm으로 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 형질감염된 세포를 암피실린을 포함하는 LB 평판 상 에 플레이팅시키고 37℃에서 밤새 배양하였다. 형질감염체를 집어서 플라스미드의 단리를 위해 배양하였다.
플라스미드 정제
형질감염된 Top 10F' 세포를 암피실린을 포함하는 LB 브로쓰에서 배양하고, 플라스미드 DNA를 Wizard Miniprep (Promega) 키트 또는 초 순수 DNA를 위해 엔도톡신 프리 플라스미드 키트(Endotoxin Free Plasmid Kit, Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 플라스미드 DNA를 PCR에 의한 삽입물의 존재와 배향 및 서열 결정에 대해 분석하였다.
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  30. 글리코실 포스파티딜 이노시톨-결합된 (GPI-결합된) TCR Vβ 쇄; 포스파티딜 이노시톨, 포스파티딜 및 카르디오리핀을 비롯한 인지질; 인지질 글리칸; 단일 가닥 DNA; 및 이중 가닥 DNA로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 분자와 항-TCR Vβ 항체 상의 공통적 에피토프에 대한 반응성을 갖는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 또는 그의 단편을 포함하는, 인슐린 의존성 당뇨병 (IDDM), 인슐린 비의존성 당뇨병 (NIDDM), 자기면역 질환, 심혈관계 질환, 악액질, 암, 또는 그외 항-인지질 항체 및(또는) 과인슐린혈증 및 인슐린 내성이 존재하는 질환의 치료용 제약 조성물.
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  34. 제30항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 단편이 척추동물로부터 제조된 것인 조성물.
  35. 제30항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 단편이 건강하거나 병든 사람 또는 동물로부터 수득된 B 세포를 사용하여 엡스타인-바 바이러스 형질전환 또는 그외 방법에 의해 불멸화된 B 세포로부터 유래된 것인 조성물.
  36. 제30항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 단편이, 동물의 체액을 항원이 결합되어 있는 컬럼으로 통과시켜 단리된 것인 조성물.
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  38. 제30항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 단편이 이펙터 또는 리포터 분자를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 이펙터 또는 리포터 분자가 효소, 지시 화합물, 약물, 독소 및 방사성 표지로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물.
  40. 제30항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 단편이 생체 물질 또는 합성 물질에 결합되어 있는 것인 조성물.
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  45. 제30항에 인용된 바와 같은 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산.
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  47. 제45항의 핵산을 포함하는 발현 또는 클로닝 벡터.
  48. 제47항에 있어서, 상기 벡터가 박테리오파아지 클론, 생물학적 기능성 플라스미드 및 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 발현 또는 클로닝 벡터.
  49. 제47항 또는 제48항의 발현 또는 클로닝 벡터로 안정하게 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포.
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