KR100536860B1

KR100536860B1 - 아세토젖산 신타제 유전자를 코딩하는 유전자

Info

Publication number: KR100536860B1
Application number: KR10-2003-7007120A
Authority: KR
Inventors: 시미즈츠토무; 나카야마이시즈에; 나가야마코조; 후쿠다아츠노리; 다나카요시유키; 가쿠고이치로
Original assignee: 구미아이 가가쿠 고교 가부시키가이샤; 독립행정법인농업생물자원연구소
Priority date: 2000-11-29
Filing date: 2001-11-16
Publication date: 2005-12-16
Anticipated expiration: 2021-11-16
Also published as: US20040088753A1; AU2002214303B2; BR0115712A; NZ526737A; ES2311553T3; CA2430314A1; AU1430302A; ATE397668T1; WO2002044385A1; EP1347056A4; BRPI0115712B8; TWI280279B; EP1347056B1; CN1487998A; JPWO2002044385A1; US7119256B2; CN1245516C; BRPI0115712B1; CA2430314C; KR20030067693A

Abstract

PC계 제초제에 대하여 극히 고도의 저항성을 나타내는 ALS단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

이하의 (a) 또는 (b)의 단백질을 코딩하는 유전자이다.

(a) 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 된 단백질.

(b) 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서 적어도 1이상의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가된 아미노산 서열로서, 피리미디닐카르복시 제초제에 대한 저항성을 가지며, 아세토젖산신타제 활성을 갖는 단백질.

Description

아세토젖산신타제유전자를 코딩하는 유전자{GENE ENCODING ACETOLACTIC ACID SYNTHASE GENE}

본 발명은 분지사슬 아미노산 생합성경로에 있어서 율속(律速)효소인 아세토젖산신타제를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

아세토젖산신타제(이하,「ALS」라 함)는 류신, 발린 및 이소류신 등의 분지사슬 아미노산 생합성경로에 있어서의 율속효소이며, 식물의 성장에 있어서 필수의 효소로서 알려져 있다. ALS는 고등식물전체에 걸쳐서 널리 존재하고 있는 것이 알려져 있고, 각종의 미생물, 예를 들면 효모균(Saccharomyces cerevisiae), 대장균(Escherichia coli), 살모넬라균(Salmonella typhimurium) 등에 있어서도 볼 수 있다.

대장균 및 살모넬라균에는 ALS의 이소효소(isoenzyme)가 3종류 존재하고 있는 것이 알려져 있다. 이들 각각의 이소효소는 효소의 촉매활성을 관리하는 분자량이 큰 촉매서브유닛(catalytic subunit)과 분지사슬아미노산이 결합함으로써, 피드백 저해제로서 기능하는 분자량이 작은 제어서브유닛(regulatory subunit)으로 된 헤테로올리고머이다(참조: Chipman et al., Biochim. Biophys, Acta, 1385, 401-419, 1998). 촉매서브유닛은 각각 Ⅰlv ⅠH, Ⅰlv GM 및 Ⅰlv BN 오페론에 위치하고 있다. 한편, 효모균의 경우, ALS는 단순한 효소이지만 세균과 같이 촉매서브유닛과 제어서브유닛으로 이루어지고(참조: Panget al., Biochemistry, 38, 5222-5231, 1999), 촉매단백질서브유닛은 ILV2좌위에 위치하고 있다.

한편, 식물에 있어서의 ALS의 경우에도 상술한 미생물과 같이, 촉매서브유닛과 제어서브유닛으로 이루어진 것이 알려져 있다(참조: Hershey et al., Plant Molecular Biology, 40, 795-806, 1999). 예를 들면, 쌍자엽식물의 담배의 경우, ALS의 촉매서브유닛은 SuRA 및 SuRB의 두개의 유전자좌위에 의해 코딩되고(참조: Lee et al., EMBO J., 7, 1241-1248, 1988), 옥수수의 경우, ALS의 촉매서브유닛은 als 1 및 als 2의 2개의 유전자 좌위에 코딩되어 있다(참조: Burr et al., Trendsin Genetics, 7, 55-61, 1991; Lawrence et al., Plant Mol. Biol., 18, 1185-1187, 1992). 촉매서브유닛을 코딩하는 유전자에 관해서는 쌍자엽식물의 경우, 담배만이 아니고, 아라비돕시스(Arabidopsis), 유채, 목화, 오나모미(Xanthium), 아마란사스(Amaranthus), 및 댑싸리(Kochia)에 대해서 완전히 염기서열이 결정되어 있다(참조: Chipman et al., Biochim. Biophys, Acta, 1385, 401-419, 1998 및 재공표특허 WO 제 97/08 327호). 그러나, 단자엽식물로 염기서열이 완전히 결정되어 있는 것은 옥수수뿐이다.

한편, 술포닐우레아계 제초제, 이미다졸리논계 제초제, 트리아졸로피리미딘계 제초제, 및 피리미디닐카르복시계 제초제(이하,「PC계 제초제」라 함) 등의 제초제는 이러한 ALS를 저해함으로써, 식물의 성장을 억제하는 것이 알려져 있다(참조: Ray, Plant Physiol., 75, 827-831, 1984; Shaner et al., Plant Physiol., 76, 545-546, 1984; Subramanian er al., Plant Physiol., 96, 310-313, 1991; Shimizu et al., J. Pestic. Sci., 19, 59-67, 1994).

이들 제초제에 대해서 저항성을 갖는 식물로서는 ALS를 코딩하는 유전자에 있어서, 종을 초월해서 보존되어 있는 보존영역 중의 1개 또는 2개의 아미노산치환을 일으키는 1개 또는 2개의 염기치환을 갖는 것이 알려져 있다. 예를 들면, 술포닐우레아계 제초제에 대해서 특이적인 저항성을 갖는 ALS를 코딩하는 것(참조: Kathleen et al., EMBO J., 7, 1241-1248, 1988; Mourad et al., Planta, 188, 491-497, 1992; Guttieri et al., Weed Sci., 43, 175-178, 1995; Bernasconi et al., J. Biol. Chem., 270, 17381-17385, 1995 및 특개소 제 63-71184호 공보), 이미다졸리논계 제초제에 대해서 특이적인 저항성을 갖는 ALS를 코딩하는 것(참조: Mourad et al., Planta, 188, 491-497, 1992; Lee et al., FEBS Lett., 452, 341-345, 1999 및 특개평 제 5-227964호 공보) 또는 술포닐우레아계 제초제와 이미다졸리논계 제초제의 양쪽에 대해서 저항성을 갖는 ALS를 코딩하는것(참조: Kathleen et al., EMBO J. 7, 1241-1248, 1988; Bernasconi et al., J. Biol. Chem., 270, 17381-17385, 1995; Hattori et al., Mol. Gen. Genet., 246, 419-425, 1995; Alison et al., Plant Physiol., 111, 1353, 1996; Rajasekarau et al., Plant Sci., 119, 115-124, 1996 특개소 제 63-71184호 공보, 특개평 제 4-311392호 공보 및 Bernasconi et al., 미국특허 제 5633437호, 1997)를 들 수 있다. 술포닐우레아계 제초제와 이미다졸리논계 제초제의 양쪽에 대해서 저항성을 나타내는 ALS는 PC 제초제나 트리아졸로피리미딘계 제초제에 대해서도 교차저항성을 나타내는 것을 알고 있다(참조: Bernasconi et al., J. Biol. Chem., 270, 17381-17385, 1995). 또한, 술포닐우레아계 제초제에 특이적인 저항성을 나타내는 ALS를 갖는 개체와 이미다졸리논계 제초제에 특이적인 저항성을 나타내는 ALS를 갖는 개체를 교배시켜서 양쪽에 저항성을 나타내는 식물체를 제조하는 시도도 이루어지고 있다(참조: Mourad et al., Mol. Gen. Genet., 243, 178-184, 1994). 또한, ALS를 코딩하는 유전자를 인위적으로 제초제 저항성 유전자로 바꾸는 일도 행해지고 있고(참조: Ott et al., J. Mol. Biol., 263, 359-368, 1996; 특개소 제 63-71184호 공보, 특개평 제 5-227964호 공보, 특개평 제 11-504213호 공보). 1개의 아미노산의 결핍이 술포닐우레아계 제초제와 이미다졸리논계 제초제의 양쪽에 저항성을 나타내는 것이 명백해지고 있다(참조: 특개평 제 5-227964호 공보).

상술한 바와 같이, 제초제에 대한 저항성을 갖는 ALS 및 ALS를 코딩하는 유전자에 대해서 활발하게 연구되어 왔으나, PC계 제초제 저항성을 지표로 하고 PC계 제초제에 대해서 특이적인 저항성을 갖는 변이 ALS유전자에 대해서는 현재까지 보고가 없었다.

여기서 본 발명은 PC계 제초제에 대해서 극히 고도의 저항성을 나타내는 ALS단백질을 코딩하는 유전자, 전기 유전자에 의해 코딩되는 ALS단백질, 전기 유전자를 갖는 재조합벡터, 전기 재조합벡터를 갖는 형질전환체, 전기 유전자를 갖는 식물, 전기 식물의 육성방법, 및 전기 유전자를 선택마커로 해서 사용하는 형질전환세포를 선별하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 변이형 ALS단백질의 아미노산 서열 및 야생형 ALS단백질의 아미노산 서열을 비교한 도면이다.

도 2는 변이형 ALS유전자의 염기서열 및 야생형 ALS유전자의 염기서열을 비교한 도면이다.

도 3은 저항성 변이주의 비스피리백-나트륨(bispyribac-sodium)에 대한 감수성을 나타내는 특성도이다.

도 4는 야생주의 비스피리백-나트륨에 대한 감수성을 나타내는 특성도이다.

도 5는 야생주의 클로르술푸론(chlorsulfuron)에 대한 감수성을 나타내는 특성도이다.

도 6은 저항성 변이주의 클로르술푸론에 대한 감수성을 나타내는 특성도이다.

도 7은 야생주로부터 추출한 ALS단백질 조효소의 음이온 크로마토그램을 나타내는 특성도이다.

도 8은 야생형 ALS단백질 및 변이형 단백질에 있어서의 비스피리백-나트륨에 대한 감수성을 나타내는 특성도이다.

도 9는 야생형 ALS단백질 및 변이형 단백질에 있어서의 클로르술푸론에 대한 감수성을 나타내는 특성도이다.

도 10는 야생형 ALS단백질 및 변이형 단백질에 있어서의 이마자퀸(imazaquin)에 대한 감수성을 나타내는 특성도이다.

도 11은 니혼바레 EST와 옥수수 ALS유전자의 염기서열을 비교한 도면이다.

도 12는 실시예 4에서 수득된 조효소 용액에 있어서의 비스피리백-나트륨에 대한 감수성을 나타내는 특성도이다.

도 13은 실시예 4에서 수득된 조효소용액에 있어서의 클로르술푸론에 대한 감수성을 나타내는 특성도이다.

도 14는 실시예 4에서 수득된 조효소용액에 있어서의 피리티오백-나트륨(pyrithobac-sodium)에 대한 감수성을 나타내는 특성도이다.

도 15는 실시예 4에서 수득된 조효소용액에 있어서의 피리미노백(pyriminobac)에 대한 감수성을 나타내는 특성도이다.

도 16은 실시예 4에서 수득된 조효소용액에 있어서의 벤술푸론-메틸(bensulfuron-methyl)에 대한 감수성을 나타내는 특성도이다.

도 17는 실시예 4에서 수득된 조효소용액에 있어서의 피라조술푸론-에틸(pyrazosulfuron-ethyl)에 대한 감수성을 나타내는 특성도이다.

도 18은 실시예 4에서 수득된 조효소용액에 있어서의 이마조술푸론(imazosulfuron)에 대한 감수성을 나타내는 특성도이다.

도 19는 실시예 4에서 수득된 조효소용액에 있어서의 이마자퀸에 대한 감수성을 나타내는 특성도이다.

도 20은 실시예 4에서 수득된 조효소용액에 있어서의 이마자피르(imazapyr)에 대한 감수성을 나타내는 특성도이다.

도 21은 실시예 4에서 수득된 야생형의 조효소용액, GST-ALS 및 ALS단백질의 비스피리백-나트륨에 대한 감수성을 나타내는 특성도이다.

도 22는 실시예 4에서 수득된 변이형의 조효소용액 및 GST-ALS의 비스피리백-나트륨에 대한 감수성을 나타내는 특성도이다.

도 23은 실시예 4에서 수득된 변이형의 조효소용액 및 GST-ALS의 클로르술푸론에 대한 감수성을 나타내는 특성도이다.

도 24는 실시예 4에서 수득된 변이형의 조효소용액 및 GST-ALS의 이마자퀸에 대한 감수성을 나타내는 특성도이다.

도 25는 W548L 변이만을 갖는 ALS 유전자의 조제법을 나타내는 개념도이다.

도 26은 도 25의 계속이며, W548L 변이만을 갖는 ALS유전자의 조제법을 나타내는 개념도이다.

도 27은 실시예 6(2)에서 수득된 조효소용액에 있어서의 비스피리백-나트륨에 대한 감수성을 나타내는 특성도이다.

도 28은 실시예 6(2)에서 수득된 조효소용액에 있어서의 클로르술푸론에 대한 감수성을 나타내는 특성도이다.

도 29는 실시예 6(2)에서 수득된 조효소용액에 있어서의 이마자퀸에 대한 감수성을 나타내는 특성도이다.

도 30은 실시예 7에서 조제한 바이너리벡터의 조제법을 나타내는 개념도이다.

도 31은 대장균(JM 109)의 단일콜로니로부터 단리한 플라즈미드 중 ALS유전자의 인서트를 확인한 전기영동사진이며, 레인 1은 λHind III/100 bp DNA마커, 레인 2는 변이형 ALS유전자를 유지하는 pMLH 7133으로 형질전환된 대장균 유래 플라즈미드, 레인 3은 야생형 ALS유전자를 유지하는 pMLH 7133으로 형질전환한 대장균 유래 플라즈미드, 레인 4는 GUS유전자(대조구)를 유지하는 pMLH 7133이며, 화살표는 인서트 DNA를 나타내고 있다.

도 32는 플라즈미드 DNA를 주형으로 한 PCR의 결과를 나타내는 전기영동사진이며, 레인 1은 λHind III/100 bp DNA마커, 레인 2 및 5는 야생형 ALS유전자를 유지하는 pBI 121 플라즈미드(대조구), 레인 3 및 6은 변이형 ALS유전자를 유지한다고 여겨지는 pMLH 7133, 레인 4 및 7은 야생형 ALS유전자를 유지한다고 여겨지는 pMLH 7133이며, 화살표는 PCR 산물을 나타내고 있다.

도 33은 ALS유전자의 인서트 방향을 확인한 결과를 나타내는 전기영동사진이며, 레인 1은 λHind III/100 bp DNA마커, 레인 2는 변이형 ALS유전자를 유지하는 pMLH 7133, 레인 3은 야생형 ALS유전자를 유지하는 pMLH 7133, 레인 4는 GUS유전자를 유지하는 pMLH 7133(대조구)이며, 화살표는 PCR 산물을 나타내고 있다.

도 34는 아그로박테리움균을 사용한 벼(니혼바레)의 형질변환방법을 나타내는 플로차트이다.

도 35는 캘러스로부터 재분화 중에 있는 벼(니혼바레)의 사진이다.

도 36은 변이형 ALS유전자로 형질전환한 벼(니혼바레) 캘러스의 비스피리백-나트륨 감수성을 나타내는 특성도이다.

도 37은 야생형벼(니혼바레) 캘러스의 비스피리백-나트륨 감수성을 나타내는 특성도이다.

도 38은 형질전환한 캘러스로부터 조제한 게놈을 주형으로 해서 행한 PCR의 결과를 나타내는 전기영동사진이며, 레인 1은 λHind III/100 bp DNA마커, 레인 2 내지 7은 각각 다른 캘러스 유래의 게놈 DNA를 주형으로 한 경우의 PCR 결과이며, 화살표는 PCR 산물을 나타내고 있다.

도 39는 형질전환 캘러스로부터 조제한 게놈 DNA를 주형으로 행한 PCR의 결과 수득된 PCR산물의 서열분석한 결과를 나타내는 특성도이며, A는 센스프라이머(3-1-4)에 의한 548번째 주변의 해석 결과, B는 안티센스프라이머(ALS-Rsp2)에 의한 548번째 주변의 해석 결과, C는 센스프라이머(3-1-4)에 의한 627번째 주변의 해석 결과, D는 안티센스프라이머(ALS-Rsp2)에 의한 627번째 주변의 해석 결과를 나타내고 있다.

도 40은 변이형 ALS유전자로 형질전환한 벼(니혼바레)의 비스피리백-나트륨 감수성을 측정한 결과를 나타내는 사진이며, A는 변이형 ALS유전자로 형질전환된 벼, B는 야생형 ALS유전자로 형질전환한 벼를 나타내고 있다.

[발명을 실시하기 위한 최상의 형태]

이하에 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 아세토젖산신타제단백질(이하,「변이형 ALS단백질」이라 함)은 벼에서 발현되는 야생형 ALS단백질에 있어서의 소정의 부위를 변이시킴으로써 얻을 수 있다. 본 발명의 변이형 ALS단백질의 아미노산 서열을 서열번호 1로 나타낸다. 또한, 본 발명의 ALS단백질을 코딩하는 유전자의 염기서열을 서열번호 2로 나타낸다.

변이형 ALS단백질은 야생형 ALS단백질에 있어서의 548번째의 트립토판이 류신으로 치환됨과 동시에, 야생형 ALS단백질에 있어서의 627번째의 세린이 이소류신으로 치환된 것이다. 도 1에 변이형 ALS단백질의 아미노산 서열과, 야생형 ALS단백질의 아미노산 서열을 비교한 결과를 나타낸다. 또한, 도 1에 있어서, 1열의 아미노산 서열은 변이형 ALS단백질을 나타내고, 2열의 아미노산 서열은 야생형 ALS단백질을 나타낸다.

변이형 ALS단백질을 코딩하는 유전자(서열번호 2)는 야생형 ALS단백질을 코딩하는 유전자와 비교해서 야생형 ALS단백질에 있어서의 548번째의 트립토판을 코딩하는 코돈이 류신을 코딩하는 코돈으로 치환됨과 동시에, 야생형 ALS단백질에 있어서의 627번째의 세린을 코딩하는 코돈이 이소류신을 코딩하는 코돈으로 치환된 것이다. 도 2에 변이형 ALS단백질을 코딩하는 유전자의 염기서열과, 야생형 ALS단백질을 코딩하는 염기열을 비교한 결과를 나타낸다. 또한, 도 2에 있어서, 1열의 염기서열은 변이형 ALS단백질을 나타내고, 2열의 염기서열은 야생형 ALS단백질을 나타내고 있다.

이 변이형 ALS단백질을 코딩하는 유전자는 일본형 벼품종인 금남풍의 게놈 DNA에 존재하는 야생형 ALS단백질을 코딩하는 유전자에 대해서 상술한 바와 같은 변이를 도입하여 얻을 수 있다. 변이의 도입방법으로서는, 종래부터 공지된 방법을 사용할 수 있고, 예를 들면, 부위특이적 변이도입법을 사용할 수 있다. 부위특이적 변이도입법은 시판의 키트 예를 들면, Mutan-K(다카라슈조주식회사제), GeneEditor(프로메가사제), ExSite(스트라타진사제) 등을 사용해서 행할 수 있다.

또한, 변이형 ALS단백질을 코딩하는 유전자는 PC계 제초제 감수성의 야생주 배양세포를 PC계 제초제의 존재하에 배양하고, 그 후 출현한 PC계 제초제에 대한 저항성을 나타내는 변이주 배양세포로부터 얻을 수 있다. 구체적으로는, 우선 PC계 제초제저항성의 변이형 배양세포로부터 mRNA를 조제하고, cDNA를 합성후 λgt11 파지의 cDNA라이브러리를 작출한다(저항성 특징에 관해서 헤테로 접합성이라고 여겨지는 라이브러리). 이것을 야생형 ALS단백질을 코딩하는 유전자의 일부를 포함하고 있는 핵산프로브(예를 들면, 일본형 벼품종인 니혼바레로부터 수득된 EST(Expression, SequenceTag, GenBank, DDBJ 및 EMBL 수탁번호: C72411)를 사용해서 스크리닝하여, 수득된 양성 클론의 인서트 DNA를 pBluescript Ⅱ SK+로 서브클로닝하여 염기서열을 결정한다. 그 결과, 서열번호 1에 나타내는 아미노산 서열을 코딩하는 인서트 DNA를 갖는 클론을 선택함으로써 변이형 ALS단백질을 코딩하는 유전자를 얻을 수 있다. 또한, 상술한 바와 같이 해서 수득된 변이형 ALS단백질을 코딩하는 유전자를 pBluescript ⅡSK+에 삽입한 플라즈미드는 Mutant ALS cDNA in pBluescript Ⅱ SK+(FERM BP-7348)로서 독립행정법인 산업기술총합연구소 특허생물기탁센터(일본국 구니시로켄 쯔쿠바시 히가시 1-1-1 주오제6)에 평성 12년 11월 2일부로 부다페스트조약에 기초하여 국제기탁되어 있다.

변이형 ALS단백질은 야생형 ALS단백질에 비해서 PC계 제초제에 대한 우수한 저항성을 가질 뿐만 아니라, 술포닐우레아계 제초제 및 이미다졸리논계 제초제에 대해서도 저항성을 갖는다. 특히, 변이형 ALS단백질은 PC계 제초제에 대한 고도의 저항성을 갖는다. 이것은 변이형 ALS단백질을 코딩하는 유전자를 대장균 등의 발현벡터에 삽입하여, 그 발현벡터로 형질전환된 대장균 등의 제초제 감수성을 조사함으로써 판단할 수 있다.

여기서, PC계 제초제로서는 화학식 1에 나타내는 바와 같이, 비스피리백-나트륨(bispyribac-sodium), 피리티오백-나트륨(pyrithiobac-sodium), 피리미노백(pyriminobac)을 예시할 수 있다.

비스피리백-나트륨 피리티오백-나트륨 피리미노백

술포닐우레아계 제초제로서는 화학식 2에 나타내는 바와 같이, 클로르술푸론 (chlorsulfuron), 벤술푸론-메틸(bensulfuron-methyl), 피라조술푸론-에틸(pyrazosulfuron-ethyl), 이마조술푸론(imazosulfron)을 예시할 수 있다.

클로르술푸론 벤술푸론-메틸

피라조술푸론-에틸 이마조술푸론

이미다졸리논계 제초제로서는 화학식 3에 나타내는 바와 같이, 이마자퀸(imazaquin), 이마자피르(imazapyr)를 예시할 수 있다.

이마자퀸 이마자피르

한편, 변이형 ALS단백질을 코딩하는 유전자를 표적으로 하는 식물에 형질전환하여 그 식물에 대해서 PC제초제 저항성을 부여할 수 있다. 식물에 형질전환하는 방법으로서는, 종래부터 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens)을 사용해서 외래 유전자를 표적 식물세포에 도입하는 방법을 열거할 수 있다.

구체적으로는, 아그로박테리움의 Ti 플라즈미드의 T-DNA서열을 포함하고 있는 바이너리 벡터로 변이형 ALS단백질을 코딩하는 유전자를 삽입한다. 이 Ti 플라즈미드를 대장균 등에 형질전환한다. 이어서, 대장균 등에서 증식된 변이형 ALS단백질을 코딩하는 유전자를 유지하는 바이너리 벡터를 헬퍼 플라즈미드를 함유하고있는 아그로박테리움균으로 형질전환한다. 그리고, 이 아그로박테리움균을 표적으로하는 식물에 감염시킨 후, 형질전환 식물에 고정시킨다. 고정된 형질전환식물이 배양세포의 경우에는 종래부터 공지된 방법에 의해 그 식물세포를 완전한 식물에 재생시킬 수 있다.

또한, 변이형 ALS단백질을 코딩하는 유전자를 표적으로 하는 식물에 형질전환시키는 경우, 종래부터 공지된 방법을 사용해서 직접적으로 식물체에 도입해도 무관한다. 또한, 변이형 ALS단백질을 코딩하는 유전자를 갖는 발현벡터를 형질전환하는 방법으로서는 폴리에틸렌글리콜법, 일렉트로포레이션법, 파티클건법 등을 사용할 수 있다.

한편. 변이형 ALS단백질을 코딩하는 유전자는 단자엽식물 및 쌍자엽식물 등의 어떠한 종류의 식물에 형질전환해도 된다. 변이형 ALS단백질을 코딩하는 유전자를 형질전환하는 대상작물로서는 예를 들면, 벼, 옥수수, 밀, 보리, 콩, 면, 유채, 사탕무 및 담배 등을 들 수 있다. 또한, 변이형 ALS단백질을 코딩하는 유전자를 도입하여 건초나 수목 등을 형질전환해도 무관하다.

어느 경우에서도, 변이형 ALS단백질을 코딩하는 유전자를 식물에 형질전환하여 그 식물에 대해서, PC계 제초제, 술포닐우레아계 제초제 및 이미다졸리논계 제초제에 대한 저항성을 부여할 수 있다.

그런데, 변이형 ALS단백질을 코딩하는 유전자는 식물형질전환 실험에 있어서의 선택성 마커로서도 사용할 수 있다. 예를 들면, 목적 유전자를 사용해서 식물세포를 형질전환하는 경우, 변이형 ALS단백질을 코딩하는 유전자와 목적유전자를 갖는 벡터를 식물세포 내에 도입한 후, 그 식물세포를 PC계 제초제의 존재하에서 배양한다. 그 결과, PC계 제초제의 존재하에서 생존하는 식물세포에는 변이형 ALS단백질을 코딩하는 유전자와 함께 목적유전자가 도입된 것을 알 수 있다. 또한, 목적유전자 및 변이형 ALS단백질을 코딩하는 유전자가 식물세포의 염색채에 삽입되었는가 아닌가는 그 식물의 표현형을 관찰한 후, 게놈 서던 하이브리디제이션(genome southern hybridization) 또는 PCR에 의해 이들 유전자의 게놈상의 존재를 조사함으로써 확인할 수 있다.

상술한 목적을 달성하기 위해 본 발명자가 예의 검토한 결과, 야생형 ALS에 있어서의 소정의 아미노산잔기를 소정의 아미노산으로 치환해서 된 변이 ALS가 PC계 제초제에 대해서 극히 고도의 저항성을 나타내는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

(1) 즉, 본 발명은 다음의 (a) 또는 (b)의 단백질을 코딩하는 유전자이다.

(a) 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 된 단백질.

(b) 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서 적어도 1이상의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가된 아미노산 서열로 되고, 또한 피리미디닐카르복시 제초제에 대한 저항성을 갖고, 아세토젖산신타제 활성을 갖는 단백질.

(2) 또한, 본 발명은 (1)에 기재된 유전자에 의해 코딩되는 아세토젖산신타제 단백질이다.

(3) 또한, 본 발명은 (1)에 기재된 유전자를 갖는 재조합벡터이다.

(4) 또한, 본 발명은 (3)에 기재된 재조합벡터를 갖는 형질전환체이다.

(5) 또한, 본 발명은 (1)에 기재된 유전자를 갖고, 피리미디닐카르복시 제초제에 대한 저항성을 갖는 식물이다.

(6) 또한, 본 발명은 (5)에 기재된 식물을 피리미디닐카르복시 제초제 존재하에서 육성하는 것을 특징으로 하는 식물육성방법이다.

(7) 또한, 본 발명은 (1)에 기재된 유전자를 선택마커로서 사용하고, 전기 유전자를 갖는 형질전환세포를 선별하는 방법이다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 다시 상세히 설명하나, 본 발명의 기술적 범위는 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: PC계 제초제 저항성의 벼(금남풍) 배양세포의 조제

벼의 종자(품종: 금남풍, 학명: Oryza sativa var. Kinmaze)의 겨를 제거한 후, 그 종자를 70%의 에탄올 중에 5분간 침지시키고, 약 5%의 안티포르민(antiformin) 중에 20분간 침지시키고, 멸균 증류수로 수회 세정하였다.

이어서, 이 종자를 표 1에 나타내는 조성의 배지상에서 정치배양시켰다.

무기염(무라시게·스쿠그 배지용 혼합염류)	1봉지
티아민·HCl(0.1g/l)	1㎖
니코틴산(0.5g/l)	1㎖
피리독신·HCl(0.5g/l)	1㎖
글리신(2g/l)	1㎖
미오-이노시톨(50g/l)	2㎖
2,4-D(200ppm)	10㎖
수크로스	30g

상기 배지조성 중 2,4-D는 합성 옥신(auxin)이다. 배지를 조제하는 경우, 우선 상기 배지조성을 1리터의 비커에 넣고, 증류수를 가하여 1000㎖로 만들었다. 이어서, 이것을 pH 5.7로 조제하고, 3g의 겔라이트(Gelrite)를 첨가한 다음, 전자레인지를 사용해서 가열해서 겔라이트를 용해시켜 분주기를 사용해서 30㎖씩 배양플라스크에 분주하였다. 이어, 배양플라스크에 3중의 알루미늄박을 씌워서 오토클레이브장치내에서 121℃로 15 내지 20분간 가열멸균하였다. 그 후, 실온까지 냉각시키는 것에 의해 상기 종자를 정치배양하기 위한 배지를 조제하였다.

이어서, 이 배지상에서 유도된 캘러스로부터 배아 부분을 제거하고, 계대(繼代)배양을 행하였다. 그리고, 수득된 캘러스 일부를 PC계 제초제의 하나인 비스피리백-나트륨을 1㎛첨가한 액체배지(표 1의 배지조성과 동일하며, 겔라이트를 첨가하지않은 것) 중에서 대략 2주간에 1회 계대하면서 배양을 행하였다. 그 결과, 2주간 내지 6주간 정도에서 배양세포가 고사하기 시작하여 약 2개월 후에 거의 고사해서 차색으로 변색하고 있는 배양세포집단 중에 변색이 없고, 세포분열을 행하고 있다고 여겨지는 세포괴가 복수개 수득되었다. 이들 세포괴를 단리하여 배양한 결과, 2㎛의 비스피리백-나트륨 존재하에서도 증식하는 복수의 세포주를 얻을 수 있었다.

이어, 수득된 복수의 세포주를 비스피리백-나트륨의 첨가농도를 순차로 올리면서 배양한 결과, 100㎛의 비스피리백-나트륨 공존하에서도 증식할 수 있는 세포주가 수득되었다. 이 비스피리백-나트륨 저항성 배양세포(이하 「저항성 변이주」라 함)를 100㎛의 비스피리백-나트륨을 첨가한 MS-2,4-D 고체배지에서 계대배양하였다. 계대배양한 저항성 변이주의 일부를 채취하여, 비스피리백-나트륨무첨가의 MS-2,4-D 액체배지에 첨가해서 8일 내지 10일간의 주기로 현탁배양하였다.

그리고, 이 저항성 변이주 약 1.5g(습윤중량)를 MS-2,4-D액체배지 50㎖와 소정의 농도의 비스피리백-나트륨을 넣어 둔 200㎖의 3각 플라스크로 이식하여, 약 27℃에서 소정기간 배양하였다. 경시적으로 캘러스의 습윤중량을 측정하여 이식한 저항성 변이주의 습윤중량을 기준으로 해서 상대적인 증식량을 구하였다. 또한, 시험은 비스피리백-나트륨농도를 변화시킨 것을 3번 연속하여 행하고, 표준오차를 산출하였다. 저항성 변이주에 있어서의 비스피리백-나트륨 농도변화와 8일째의 상대중량과의 관계를 도 3에 나타내었다. 또한, 대조군으로서 금남풍의 야생주를 사용해서 같은 실험을 행하여, 비스피리백-나트륨농도와 8일째의 상대중량과의 관계를 측정한 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 야생주에서는 1nM의 비스피리백-나트륨 첨가구에서 증식저해되지 않았으나, 10nM이상의 비스피리백-나트륨 첨가구에서 증식저해되는 것을 알 수 있다. 한편, 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 저항성 변이주에서는 10㎛의 비스피리백-나트륨 첨가구에 있어서도 거의 증식에 영향을 받지 않은 것을 알 수 있다.

한편, 비스피리백-나트륨 대신에 클로르술푸론을 사용한 것 이외는 상술한 바와 같이 야생주 및 저항성 변이주의 증식율을 측정하였다. 야생주에 있어서의 클로르술푸론 농도변화와, 9일째의 상대중량과의 관계를 도 5에 나타내었다. 또한, 저항성 변이주에 있어서의 클로르술푸론 농도변화와 9일째의 상대중량과의 관계를 도 6에 나타내었다.

도 5로 부터 알 수 있는 바와 같이, 야생주에서는 1nM의 클로르술푸론 첨가로 증식저해를 받고 있고, 비스피리백-나트륨의 경우보다도 높은 감수성을 나타내었다. 한편, 도 6으로부터 알 수 있는 바와 같이, 저항성 변이주에서는 1㎛의 클로르술푸론의 첨가에 의해 증식이 강하게 저해되고 있다. 또한, 비스피리백-나트륨 및 클로르술푸론에 대한 감수성은 야생주 및 저항성 변이주에 있어서 배양시간이 길어도 다같이 크게 변화하는 일은 없었다. 또한, 증식속도는 저항성 변이주 및 야생주에 있어서 모두 거의 동일하였다.

이들의 결과로부터 저항성 변이주는 비스피리백-나트륨에 대해서 특이적인 저항성을 갖는 것이 확인되었다. 또한, 저항성 변이주는 야생주와 비교해서 클로르술푸론에 대한 저항성이 향상되고 있는 것도 명백해졌다.

실시예 2: 저항성 변이주로부터 부분정제한 ALS효소의 약제 감수성

본 실시예에서는 실시예 1에서 수득된 저항성 변이주로부터 변이형 ALS단백질을 부분정제하여 수득된 변이형 ALS단백질에 있어서의 약제 감수성을 검토하였다. 변이형 ALS단백질은 다음과 같이 부분정제하였다.

우선, 표 1중 겔라이트를 제외한 조성으로 액체배양법(비스피리백-나트륨 무첨가)에 의해 저항성 변이주를 200g이상 조제하였다. 이어서, 이들의 약 150g를 조직중량의 3배량의 완충액-1(20%v/v)의 글리세롤, 0.5mM의 티아민피로인산(TPP), 10μM의 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(FAD), 0.5mM의 MgCl₂, 조직중량 1/10량의 폴리비닐폴리피롤리돈을 함유하는 100mM의 인산칼륨완충액(pH 7.5)으로 히스코트론(Hiscotron)을 사용해서 균질화하였다. 균질화물을 나일론거즈로 여과시킨 후, 15000×g로 20분간 원심분리시켰다. 원심분리 상등액에 50%포화가 되도록 황산암모늄을 첨가하고, 얼음 중에 약 1시간 방치하였다. 이것을 재차 15000×g로 20분간 원심분리시키고, 그 침전분획을 약 30ml의 완충액-2(20%v/v)의 글리세롤, 0.5mM의 TPP, 0.5mM의 MgCl₂를 포함하는 10mM의 트리스염산 완충액(pH 7.5)에 용해시켰다. 이것을 재차 15000×g로 20분간 원심분리시키고, 그 상등액 분획을 세파덱스G-25(아머샴 파마시아 바이오텍사제)에 적용해서 관통분획을 약 40㎖ 수득하고, 이를 「조효소액(粗酵素液)」이라 하였다.

이어서, 조효소액의 단백질의 농도를 바이오-래드 프로테인 어쎄이(Bio-Rad Protein Assay)의 매뉴얼에 따라 브래드퍼드(Bradford)법으로 측정하였다. 그 후, 조효소액을 와트만필터(와트만사제)로 여과시켜, 단백질량으로서 적정한 양의 조효소액(10 내지 15㎖)를 FPLC장치(아머샴 파마시아 바이오텍사제)를 사용해서 3개 연결한 하이트랩Q(아머샴 파마시아 바이오텍사제)에 적용하였다. 하이트랩Q를 사용해서 단백질 성분을 흡착시킨 후, 베드 볼륨의 3 내지 5배량의 완충액-2로 비흡착분획을 유출시켰다. 그 후, 흡착한 단백질성분을 베드 볼륨의 10배량(150㎖)의 용출액을 사용해서 용출시켰다. 여기서, 용출액은 0 내지 0.4M의 직선농도구배로 완충액-2로 KCl을 용해시킨 것이다. 단백질 성분을 용출시킨 용출액은 복수의 분리채취용 시험관에 5㎖씩 분리채취하였다. 또한, 용출한 단백질 성분에 함유되는 ALS효소를 안정화시키기 위해 20mM의 피루빈산나트륨을 함유하는 완충액-2(0.5㎖)를 사전에 분리채취용 시험관 중에 첨가해 두었다.

이어서, 복수의 분리채취용 시험관에 분리채취된 용출분획에 함유되는 변이형 ALS단백질에 유래하는 ALS활성을 다음과 같이 측정하였다. 측정반응에 사용되는 반응용액은 20mM의 피루빈산나트륨, 0.5mM의 TPP, 0.5mM의 MgCl₂, 10μM의 FAD 및 20mM의 인산칼륨완충액(pH 7.5)으로 된 용액에 측정대상의 용출분획을 혼합시킨 것이며, 이 반응용액을 1㎖사용하였다. 측정반응은 측정대상의 용출 분획을 첨가한 후, 30℃에서 40 내지 60분간 행하였다. 또한, 측정반응은 0.1㎖의 6N황산(또는 0.25N의 수산화나트륨)을 첨가함으로써 정지시켰다.

이어서, 반응이 종료된 반응용액을 60℃에서 10분간 배양시켰다. 이것에 의해 반응용액 중에 함유된 아세토젖산을 아세토인으로 변화시켰다.

이어서, 반응용액 중에 함유된 아세토인을 정량하기 위해 0.5%(w/v)의 크레아틴 1㎖와 2.5N의 수산화나트륨으로 용해시킨 5%(w/v)의 α-나프톨 1㎖을 첨가하여 37℃에서 10분간 배양시켰다. 그 후, 반응용액에서의 흡광도 525nm을 색비교하는 것으로 아세토인을 정량하고, ALS활성을 평가하였다. 또한, 반응용액 중에는 소량의 피루빈산나트륨이 함유되기 때문에 반응시간 0을 대조군으로 하였다.

그 결과, OD525nm에 있어서의 흡광도가 반응용액 0.2㎖당에서 약 7이라고 하는 높은 값으로 되었다. 그러나, 상술한 측정반응을 수산화나트륨으로 정지시키고 ALS활성이외에 의한 아세토인 생성활성을 조사한 결과, 이 외관상의 ALS활성의 80%가까이가 변이형 ALS 단백질이외의 직접적인 아세토인 생성활성인 것을 알았다. 여기서, 변이형 ALS단백질과 변이형 ALS단백질이외의 아세토인 생성활성을 음이온교환수지를 사용한 FPLC로 분리하였다. 이 결과, 도 7에 나타내는 바와 같이, 2개의 활성피크가 검출되었다.

이들 2개의 활성피크 중 어느 쪽에 변이형 ALS단백질이 함유되어 있는가를 판정하기 위해 양피크의 아세토인 생성활성을 조사하였다. 그 결과, 변이형 ALS단백질은 앞서 용출한 피크로 표시되는 분획에 함유되어 있는 것을 알았다.

그리고, 변이형 ALS단백질을 포함하는 효소용액을 사용해서 그 변이형 ALS단백질의 비스피리백-나트륨, 클로르술푸론 및 이마자퀸에 대한 감수성을 조사하였다. 각 제초제에 대한 감수성은 효소용액을 첨가하기 전에, 제초제를 소정의 농도가 되도록 반응액 중에 첨가한 이외는 상술한 측정반응과 같이해서 ALS 활성을 측정하여 평가하였다. 또한, 비교를 위해 야생형 ALS단백질을 동일하게 해서 분리정제하여 실험에 제공하였다. 또한, 비스피리백-나트륨은 수용액으로 하고, 클로르술푸론 및 이마자퀸은 아세톤용액으로 하였다. 아세톤용액은 최종농도 1%로 하였다.

ALS활성저해율과 비스피리백-나트륨농도와의 관계를 도 8에 나타내었다. ALS활성저해율과 이마자퀸농도와의 관계를 도 10에 나타내었다. 또한, 이들 도 8 내지 도 10에 있어서, 백색 4각형을 연결한 그래프는 야생형 ALS단백질을 나타내고, 흑색 4각형을 연결한 그래프는 변이형 ALS단백질을 나타낸다.

또한, 상술한 실험으로부터 ALS활성을 50%저해하는 제초제 농도(I50치)를 프로비트법(probit analysis)에 따라 산출하고, 변이형 ALS단백질에 있어서의 I50치와 야생형 ALS단백질에 있어서의 I50치의 비를 산출하였다. 결과를 표 2에 나타내었다.

화합물	I50(nM)^a)		RS비^b)
화합물	야생주	저항성 변이주	저항성 변이주
비스피리백-나트륨	5.63	421	74.8
클로르술푸론	17.3	92.8	53.6
이마자퀸	1480	16700	11.3

a) 저해 50%농도

b) 표 1의 저해활성으로부터 산출하였다: I50(저항성 변이주)/I50(야생주)

이들 도 8 내지 도 10 및 표 2에 나타내는 바와 같이, 변이형 ALS단백질은 야생형 ALS단백질과 비교해서 제초제 존재하에서도 비교적 높은 ALS활성을 나타냈다. 특히, 변이형 ALS단백질과 야생형 ALS단백질에서는 비스피리백-나트륨 제초제에 대한 감수성이 가장 현저한 차이가 보였다. 즉, 변이형 ALS단백질은 특히 비스피리백-나트륨에 대한 저항성이 우수한 것임을 알 수 있었다.

실시예 3: 변이형 ALS유전자의 클로닝

저항성 변이주로부터 변이형 ALS단백질을 코딩하는 유전자(변이형 ALS유전자)를 클로닝하는 경우 사용하는 프로브를 다음과 같이 조제하였다. 본 실시예에 서 프로브는 옥수수의 ALS유전자와 상동성(相同性)을 나타낸 벼(니혼바레)유래부분 cDNA를 사용하였다.

(1) 옥수수의 ALS유전자와 높은 상동성을 나타낸 벼(니혼바레)유래부분 cDNA의 염기서열의 결정

(사) 농림수산선단기술산업진흥센터 및 농림수산성농업생물자원연구소가 행하고 있는 벼게놈프로젝트의 일환으로서 벼(니혼바레)의 cDNA의 부분염기서열의 결정이 행해지고 있고, cDNA의 부분염기서열 데이터베이스가 구축되어 있다. 이 데이터베이스에 포함되는 약 350bp의 염기서열로 이미 알려져 있는 cDNA 클론(수탁번호: C72411)이 옥수수에 있어서의 ALS유전자와 높은 상동성을 나타내고 있다. 또한, 옥수수에 있어서의 ALS유전자는 완전히 염기서열이 결정되어 있다.

그리고 이 cDNA 클론(수탁번호: C72411)을 농업생물자원연구소로부터 입수하여, 다음과 같은 염기서열을 결정하였다. 또한, 이 cDNA 클론은 ALS 상동 유전자가 pBluescriptⅡSK+ 중에 삽입되어 있고, 대장균내에서 자율복제를 행할 수 있는 형이었다.

우선, 이 ALS 상동 유지(homolog-retaining) 플라즈미드 벡터를 대장균(DH5α)에 형질전환하였다. 플레이트로부터 수득된 백색의 콜로니를 액체배양하여 균체로부터 통상의 방법에 따라 플라즈미드를 추출하였다. 인서트 DNA는 플라즈미드벡터 중의 멀티클로닝사이트의 제한효소, Sal 1 과 Not 1의 사이에 삽입되어 있었기 때문에 이 2개의 효소로 벡터를 절단시켜, 아가로스전기영동(電氣泳動)으로 인서트를 확인하였다. 그 후, 수득된 ALS 상동 유지 플라즈미드벡터를 RNaseA, PEG, LiCl 등을 사용하는 통상의 방법에 따라 정제하여, 프라이머 및 ABⅠ BigDyeTerminator Cycle Sequencing kit를 사용해서 서열 반응을 행하였다. PCR반응의 조건은 프로토콜에 따랐다. 또한, 프라이머는 M13프라이머 및 결정한 염기서열로부터 설계한 합성프라이머를 사용하였다. 수득된 PCR산물을 에탄올 침전으로 정제하여 ABⅠ PRISM 310 서열로 염기서열을 결정하였다.

이 ALS상동 유지 플라즈미드벡터에는 1.6kbp의 인서트 DNA가 들어 있다는 정보였다. 수득된 ALS상동 유지 플라즈미드벡터를 SalⅠ과 NotⅠ의 제한효소로 절단시켜 전기영동을 행한 바, pBluescript Ⅱ SK+에 상당하는 약 3kbp의 밴드와 인서트 DNA단편에 상당하는 1.6kbp의 밴드가 검출되었다(도시 생략). 인서트 DNA부분에 대해서의 전체염기서열을 결정하고, 옥수수의 염기서열의 상동성 검색을 행한결과, 도 11에 나타내는 바와 같이, 84.7%의 상동성을 나타냈다. 따라서, 이 ALS호몰그는 니혼바레에 있어서의 ALS유전자의 부분 cDNA인것으로 판단되었기 때문에 SalⅠ과 NotⅠ로 절단시켜서 절단한 인서트 DNA를 프로브하였다. 또한, 도 11에 있어서, 1열은 니혼바레에 있어서의 ALS유전자의 cDNA의 염기서열이며, 2열은 옥수수에 있어서의 ALS유전자의 염기서열이다.

(2) 저항성 변이주로부터의 mRNA의 조제

우선 액체질소로 동결시킨 저항성 변이주를 유발과 유봉을 사용해서 마찰분쇄한 후, 믹서에 의해 30초간, 미세하게 분쇄하였다. 분쇄 후의 분말을 추출 완충액[(100mM Tris-HCl, pH 9.0, 100mM NaCl, 1중량% SDS, 5mM EDTA) : (β-mercaptoethanol) : (Tris포화페놀)=15 : 3 : 20]중에 현탁한 후 잘 교반하였다. 이 용액을 12000×g로 15분간 원심분리하여 상등액을 회수하여, 200㎖의 PCⅠ[(Tris포화페놀) : (클로르포름) : (이소아밀알코올)=25 : 24: 1]을 첨가하여 4℃에서 10분간 진동시킨 후, 12000×g로 15분간 원심분리시켜 상등액을 회수하였다. 이 조작을 2회 반복하였다. 수득된 상등액에 1/20량의 5M의 NaCl, 2.2배량의 에탄올을 첨가하여 -80℃에서 30분간 정치한 후, 12000×g로 5분간 원심분리함으로써 침전을 회수하였다. 침전물을 70%에탄올로 세정하여 건조시킨 후, 10mM의 β-메르캅토에탄올용액에 용해시켜 이 용액을 27000 ×g로 10분간 원심분리시켜 불용성 분획을 제거한 후, 10M의 LiCl를 1/4량 첨가해서 얼음에서 1시간 정치하였다. 이것을 또한 27000 ×g로 10분간 원심분리시켜 침전을 회수하고, 4㎖의 H₂O 에 용해시킨 후, 260nm의 흡광도를 측정하여 RNA의 농도를 구하였다. 여기에 1/20량의 5M의 NaCl과 2.2배량의 에탄올을 첨가하여 -80℃에서 30분간 정치한 후, 27000 ×g로 10분간 원심분리함으로써 침전을 회수하여 70%에탄올로 세정 후 건조시켰다. 이것을 적당량의 H₂O에 용해시켜서 전체 RNA 용액으로 하였다. 또한, 원심분리조작은 4℃에서 행하였다.

이 전체 RNA로부터 다음의 방법으로 mRNA를 분리정제하였다. 추출한 전체 RNA용액의 액량에 대해서 등량의 2X 결합 완충액(20mM Tris-HCl, pH 7.5, 10mM EDTA, 1M NaCl)를 첨가하였다. 0.1g의 올리고 dT셀룰로오스(아머샴 파마시아 바이오텍사제)를 채운 컬럼을 1X 결합 완충액으 세정한 후, 용출완충액(10mM Tris-HCl, pH 7.5, 5mM EDTA)를 적용하여 용출액을 0.5㎖씩 회수하였다. 또한, 컬럼을 관통한 분획에 대해서는 별도의 올리고 dT 셀룰로오스(아머샴 파마시아 바이오텍사)컬럼에 걸어 동일한 조작을 행하였다. 각 분획의 흡광도로부터 용출된 mRNA의 농도를 계산한 후, 1/10량의 10M의 LiCl과 2.5배량의 에탄올을 첨가해서 -80℃에서 30분간 정치하였다. 이것을 원심분리해서 침전분획을 건조시킨 후, 100㎕의 H₂O에 용해시켰다. 이렇게 해서 수득된 mRNA를 수크로스밀도구배 원심법에 의해 크기분획하였다.

분리정제한 mRNA를 25% 수크로스용액 및 5% 수크로스용액을 사용해서 밀도구배를 부착한 원심관을 적용하여 스윙로터를 사용해서 4℃, 27000rpm으로 15시간 초원심분리를 행하였다. 원심분리 후, 밀도구배의 순으로 각 0.5㎖씩 분획회수하였다. 각각의 분획의 흡광도를 측정하여 회수된 mRNA 의 농도를 계산함과 동시에 ECL키트(ECL direct nucleic acid labelling and detection system, Amersham Pharmacia Biotec사제)에 의한 하이브리다이제이션에 의해 ALS mRNA의 존재를 확인하였다. 하이브리다이제이션은 상기(1)에서 조제한 프로브를 이용해서 42℃에서 16시간 행하였다. 또한, 하이브리다이제이션후의 세정은 키트 첨부의 1차세정 완충액를 사용해서 42℃에서 5분간을 2회, 그 후, 2 ×SSC용액을 사용해서 42℃에서 5분간 1회 행하였다. 세정후의 막은 투명의 프라스틱필름으로 포장하여 키트부속의 발광시약에 침지상태를 유지하고, 그 후 X선 필름에 감광시켰다.

이들 조작에 의해 저항성 변이주로부터는 약 35㎎의 전체 RNA를 추출함과 동시에 약 4㎎의 mRNA를 추출할 수 있었다. 또한, 수크로스 밀도구배원심법에서는 예상되는 분획에 하이브리다이제이션 양성의 반점이 확인되었다.

한편, 야생주를 사용한 바, 약 95㎎의 전체 RNA를 추출함과 동시에 약 7㎎의 mRNA를 추출할 수 있었다. 야생주로부터 mRNA를 추출하는 때에는 저항성 변이주 대신에 야생주를 사용한 것 이외는 상술한 방법을 적용하였다.

(3) 저항성 변이주 유래의 cDNA라이브러리의 조제

상기한 (2)에서 정제한 mRNA 2㎍ 및 cDNA합성키트(Amersham Pharmacia Biotec사)를 사용해서 cDNA의 합성을 행하여 저항성 변이주 유래의 cDNA라이브러리를 조제하였다.

우선 역전사반응에는 키트첨부의 RTase를 사용하고, 그 후의 상보쇄신장 반응(complementary chain elongation reaction)에는 키트에 첨부된 T4 DNApolymerase를 사용하였다. 상보쇄신장 반응시에는 cDNA 합성의 수율을 계산하기 위해 ³²P-dCTP를 첨가하였다. 합성한 cDNA는 어댑터를 부가한 후, in vitro 패키징 방식에 의해 λ파지에 삽입하였다.

cDNA를 부가하는 어댑터로서는 다카라슈조주식회사제의 EcoRⅠ-NotⅠ-Bam HⅠ어댑터를 사용하였다. cDNA를 함유하는 용액에 cDNA에 대해서 몰농도로 50배의 어댑터를 부가하고, 이 혼합 용액에 T4 DNA Ligase(파마시아사제)를 첨가해서 연결 반응을 4℃에서 하루밤 행하였다. 이 반응용액을 아사히팩 GS 710컬럼(아사히가세이고교 주식회사제)를 사용해서 HPCL에 적용하고, 용출액을 파장 260nm의 자외선으로 모니터링하였다. 용출액을 0.5㎖정도씩 25개로 분획하여 각 분획을 세렌코브(Cerenkov)계수기로 측정하여 계수가 높은 분획을 3 내지 4개를 회수하였다. 이 분획을 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제(다카라슈조주식회사제)를 사용해서 어댑터의 5'말단을 인산화한 후, λgt Ⅱ Eco RI암을 부가해서 연결하였다. 연결 반응은 용액에 기가팩 골드 Ⅲ(스트라타젠사제)를 부가해서 실온에서 2시간동안 행하였다. 반응종료후 200㎕의 SM 완충액와 8㎕의 클로르포름을 첨가해서 파지용액으로 하였다. 이 파지용액을 10배 희석하여 이것의 1㎕를 대장균(Y1088)에 감염시킨 후, 0.7%톱아가를 첨가하여 LB플레이트에 뿌려 4시간 내지 8시간 후에 플레이트에 나타난 플라크의 수를 계수함으로써 타이터(titer)를 측정하였다.

DE 81 페이퍼와 세렌코브 계수의 결과로부터 저항성 변이주 유래의 cDNA가 약 74ng 합성된 것을 알 수 있다. 어댑터를 부가한 벡터의 연결 후의 세렌코브계수의 결과로부터 저항성 변이주에 대해서 약 22ng의 인서트가 삽입된 λDNA가 수득되었다. 이 λDNA를 파지에 패키징해서 이것을 저항성 변이주세포 유래의 cDNA라이브러리로 만들었다. 이 라이브러리 용액의 타이터는 16600 pfu/㎕ 였다.

한편, 야생주로부터 추출한 mRNA를 사용해서 상술한 방법에 따라 cDNA라이브러리를 조제하였는 바, 야생주 유래의 cDNA가 약 38ng합성된 것을 알 수 있었다. 또한, 야생주에 대해서 인서트가 삽입된 λDNA가 약 5ng 수득되었다. 또한, 야생주유래의 cDNA라이브러리 용액의 타이터는 18160pfu/㎕였다.

(4) ALS유전자를 포함하는 cDNA의 스크리닝

플레이트에 20,000개 정도의 플라크가 나오도록 상기 (3)에서 조제한 라이브러리 용액을 희석시킨 후, 야생주 유래 및 저항성 변이주 유래의 파지를 각각 10개의 플레이트에 접종하였다. 플라크를 니트로셀룰로스멤브레인(슐레이처 슈넬사제 프로토란 BA85 기공 크기 0.45㎛)에 전사하고, 전사한 니트로셀룰로스멤브레인을 변성용액(0.5M NaOH, 1.5M NaCl)과 중화용액 (1.5M NaCl, 0.5M Tris-HCl, pH 7.5, 1mM EDTA)에 약 20초 침지시켰다. 여과지를 사용해서 니트로셀룰로스멤브레인으로부터 여분의 수분을 제거한 후, 니트로셀룰로스멤브레인을 80℃에서 2시간 베이킹하였다. 또한, 니트로셀룰로스멤브레인 대신에 하이본드-N+(아머샴 파마시아 바이오텍사제)를 사용한 경우에는 베이킹조작은 생략하고, 0.4 M NaOH로 20분간 고정시켰다.

상기 (1)에서 조제한 인서트 DNA를 RI 및 비RI(non-RI)의 2종류의 방법으로 라벨화하여 프로브DNA로서 사용하였다. RI라벨화와 하이브리다이제이션은 다음의 방법으로 행하였다. 우선, 약 200 내지 500의ng의 프로브DNA를 열변성시켰다. BcaBEST DNA labelling kit(다카라슈조주식회사제)를 사용해서 라벨을 행하였다. 이 라벨화 반응에 있어서, 키트에 첨부된 완충액, 랜덤프라이머 및 ³² P-dCTP를 첨가하였다. BcaBEST를 첨가하여 65℃에서 30분간 배양하였다. 그 후, EDTA를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 니트로셀룰로스멤브레인 8매 정도에 프로브가 대략 100ng정도 포함되는 용량을 첨가하여 42℃에서 하루밤 미진동으로 하이브리다이제이션을 행하였다. 하이브리다이제이션 후 2 ×SSC, 0.1% SDS용액으로 3회 세정한 후, BAS 2000이미징 분석기(후지필름주식회사제)의 이미징 플레이트에 약 1시간 노광시켰다. 노광 후, 이미징 분석기를 사용해서 양성클론을 검출하였다.

한편, 비RI 라벨화는 다음의 방법으로 행하였다. 약 200 내지 500ng의 프로브DNA를 열변성시킨 후, ECL 다이렉트DNA/RNA 검출시스템(아머샴 파머시아 바이오텍사제)첨부의 DNA표지시약(퍼옥시다 제) 및 글루타르알데히드를 첨가해서 37℃에서 배양시켰다. 이 경우, 니트로셀룰로스멤브레인막 8매 정도에 대략 100ng정도의 라벨화 프로브DNA가 함유되도록 첨가한 후, 42℃에서 하루밤 미진동으로 하이브리다이제이션을 행하였다. 하이브리다이제이션 종료 후, 일차 세정완충액을 실온에서 10분간, 3회, 그 후, 2 ×SSC에서 실온에서 10분간, 1회 막을 세정하였다. 막을 ECL키트첨부의 발광액에 침지시켜, 30분 내지 3시간에서 X선 필름에 노광시켰다.

하이브리다이제이션(1차스크리닝)의 결과 수득된 양성 파지를 멸균한 이쑤시개로 탑 아가(top agar)로 긁어내어 200㎕의 SM완충액으로 현탁하여 파지용액을 수득하였다. 이 파지 용액을 각 클론마다 적절히 희석하여, 대장균 Y1088주에 감염시켜 LB플레이트에 뿌렸다. 이 새로이 조제한 플레이트를 사용해서 동일하게 하이브리다이제이션 (2차스크리닝)을 행하여, 양성 파지를 200㎕의 SM 완충액에 현탁하여 단일 파지로 하였다. 또한, 2차스크리닝에서 단일파지로서 분리되지 않은 경우, 또 한번 희석을 해서 LB플레이트에 뿌리고, 하이브리다이제이션(3차 스크리닝)을 행하여 단일파지로 하였다.

이 단일파지로부터 다음의 방법으로 λDNA를 조제하였다. 대꽂이 또는 이쑤시개를 사용해서 양성클론의 플라크로부터 모은 λ파지를 신선한 숙주대장균(Y1088) 현탁액을 5㎕함유하는 200㎕의 2 ×YT배지(10mM MgCl₂와 0.2% 말토스를 포함한다)에 접종하였다. 정치상태 42℃에서 하루밤 접종한 후, 재차 숙주대장균(Y1088) 현탁액을 25㎕함유하는 1㎖의 2 ×YT배지(10mM MgCl₂와 0.2% 말토스를 포함한다)에 접종하여 하루밤 진동배양하였다(이상이 이전배양(preculturing)). 이전배양한 용액(10 내지 50㎕)을 10mM의 MgCl₂와 0.5㎖의 대장균 Y1088현탁액을 함유하는 12㎖의 2 x YT배지에 접종하여 비교적 강하게 진동하면서 용균후 탁도가 증가할 때까지 42℃에서 하루밤 배양하였다. 배양종료 후, 50㎕의 클로르포름, 1.2㎖의 5M NaCl를 첨가하여 진동시키면서 42℃에서 10분간 배양시켰다. 이것을 27000 ×g로 10분간 원심분리한 후, 새롭게 원심관에 옮긴 상등액에 5㎖의 50% PEG를 첨가하여 얼음 중에서 1시간 이상 배양시켰다. 이것을 27000 ×g로 10분간 원심분리하여 상등액을 버린 후, 재차 27000 ×g로 원심분리하여 액체부분을 버렸다. 침전분획을 4㎍의 DNase I, 20㎍의 RNase A 및 10mM 의 MgCl₂ 를 포함하는 30mM의 트리스염산완충액 pH 7.5의 300㎕로 현탁시켜 1.5㎖의 튜브로 옮겼다. 이 현탁액을 37℃에서 30분간 배양시킨 후, 7.5㎕의 20% SDS, 3㎕의 프로테이나제 K(10㎎/㎖), 12㎕의 0.5M의 EDTA를 첨가하고, 또한 55℃에서 15분간 배양시켰다. 여기에 150㎕의 페놀을 첨가해서 격렬하게 교반한 후, 토미마이크로 원심분리기 MR150(토미정공사제)를 사용해서 15,000rpm으로 3분간 원심분리하여 물층을 회수하였다. 회수한 물층에 800㎕의 에틸에테르(증류수를 첨가해서 과산화물을 제거한다)를 첨가해서 격렬히 교반한 후, 15,000rpm으로 10초간 원심분리하여, 에테르층을 버렸다. 이 에테르 추출 조작을 반복한 후, 물층에 잔존하는 에테르를 질소가스로 제거하였다. 물층에 30㎕의 5M NaCl, 875㎕의 에탄올을 첨가함으로써 침전된 λDNA를 신속히 회수하여 λ DNA를 1㎖정도의 70%에탄올로 린스한 후 약 1분간 감압하에서 건조시켜서 에탄올을 제거하였다. 이것을 20㎕ 내지 50㎕의 TE완충액(pH 8.0)에 용해시켜 λDNA용액으로 하였다.

수득된 λDNA액 중의 인서트 DNA의 서브클로닝 및 염기서열 결정은 다음의 방법으로 행하였다. 수득된 λDNA용액(1㎕)을 Not I로 절단시켜 인서트 DNA를 잘라냈다. 절단 반응의 반응액 조성은 제한효소 첨부의 설명서에 따라 37℃에서 약 2시간 반응시킨 후, 1% 아가로스겔을 사용한 전기영동으로 인서트 크기를 확인하였다. 인서트 DNA를 갖는 λDNA(10㎕ 내지 20㎕)를 Not I로 절단시켜 인서트 DNA를 절단하였다. 이것을 분리채취용의 아가로스겔로 분리한 후, 상당하는 밴드를 겔로 부터 절단하여 통상의 방법에 의해 인서트 DNA를 정제하였다. 이 인서트 DNA와 BAP처리(새우의 알칼리포스파타제를 사용한 탈인산화 처리)한 벡터를 모델비로 1 : 1의 비율로 혼합하여 T4 DNA 리가제로 16℃, 2시간 이상, 연결 반응을 행하였다. 또한, 인서트 DNA는 Not I로 절단한 것을 재료로 하였기 때문에, BAP처리에 대해서도 Not I로 절단한 벡터에 대해서 행하였다. 연결 종료 후, 그 용액의 일부를 콤피턴트 셀(DH5 α)과 혼합하여, 얼음에서 30분간 방치하였다. 이것을 42℃에서 30초간, 열충격을 가하고 또한 얼음 중에서 2분간 방치하였다. 이어서, SOS를 첨가하여 37℃에서 1시간 배양시킨 후, 2 ×YT(50㎍/㎖의 앰피실린함유)의 100㎕ 및 3% X-Gal 30㎕ 및 1 N IPTG 3㎕를 혼합한 것을 사전에 균일하게 되도록 뿌려 둔 LB배지상 플레이트에 뿌리고, 37℃에서 10시간 이상 배양하였다. 형질전환된 백색 콜로니를 앰피실린함유의 LB배지 또는 2 ×YT배지의 2㎖에 하나의 콜로니를 접종한 후, 37℃에서 하루밤 배양하였다. 이 배양액으로부터 통상의 방법에 의해 플라즈미드를 조제하여, H₂O로 용해시켜서 DNA 농도를 정량한 후, 서열용 PCR반응에 제공하였다. PCR반응 및 염기서열 결정은 상술한 방법으로 행하였다.

이상의 실험으로부터 약 2.2kb의 불완전 길이의 ALS cDNA가 수득되었다. 이 DNA의 5'측으로부터 약 250bp의 위치에 Sma I사이트가 존재하므로 다음의 방법으로 새로운 프로브를 조제하였다. 약 2.2kbp를 유지하는 pBluescript Ⅱ SK+를 숙주대장균의 JM109로 증식시킨 후, 플라즈미드를 자동분리장치(KURABO PI-100)로 추출하였다. 이 플라즈미드를 직접 Sma I로 절단시켜 생성된 약 250bp의 단편을 1%의 아가로스 전기영동으로 분리정제하여 농도를 산출 후, 프로브하였다. 이 프로브를 사용해서 상술한 RI를 사용한 방법에서 재차 라이브러리를 스크리닝하였다. 그 결과 수득된 단일파지로부터 λDNA를 조제하여, 그 λDNA(1㎕)를 Eco RI로 절단시켜 전기영동크기를 확인한 후, 니트로셀룰로스멤브레인에 고정시켰다. 전기영동 후의 겔을 1.5M NaCl를 함유하는 0.5 MNaOH용액 중에 침지시켜 15분간 정도 가볍게 진동시켰다. 그 후 겔을 수세하여 3M의 NaCl를 함유하는 0.5M Tris-HCl pH 7.5에 침지시켜 15분정도 진동시키면서 겔을 중화시켰다. 스테인레스 패드에 20 ×SSC를 바르고 그 중에 공업용의 두꺼운 여과지를 5매 정도 중첩한 대좌를 놓았다. 그 위에 중화후의 겔 멤브레인(소정의 크기로 절단한 니트로셀룰로스멤브레인을 증류수에 데운 후, 20 ×SSC로 또한 10분간 데웠다), 2매 중첩한 여과지를 차례대로 올린 후 그위에 3㎝ 내지 4㎝의 두께의 페이퍼 타올을 중첩시켰다. 그 위에 유리판을 올리고, 그 위에 가벼운 추를 올린 후 약 5분간 플로팅을 행하였다. 이 후 겔과 멤브레인 사이에 기포가 들어있지 않은 것을 확인한 후, 10분간 정도 플로팅을 행하였다. 플로팅종료 후, 멤브레인을 트랜스일루미네이터로 UV처리하고, 15분 내지 30분정도 80℃에서 베이킹하였다. 베이킹종료 후 ³²P라벨한 상술한 250bp프로브 DNA에 의한 하이브리다이제이션(하이브리다이제이션 완충액 조성: 5 ×SSPE, 0.5% SDS 5 × Denharlts, solum sperm DNA, 50% 포름아미드)를 행하여 결합한 밴드의 방사능을 이미징 플레이트에 전사하여 BAS-2000으로 그 결과를 해석하였다. 이 하이브리다이제이션으로 양성을 나타낸 인서트 중에서 비교적 큰 크기를 나타낸 것을 대량으로 조제하여 상술한 방법으로 Eco RI절단 후, BAP처리한 pBluescript IISK+에 서브클로닝하였다(FERM BP-7348). 이것을 대장균(JM 105)에 형질전환하여, 수득된 형질전환체를 액체배양 후, 통상의 방법에 의해 플라즈미드를 조제하여 상술한 방법으로 염기서열을 결정하였다.

그 결과, 완전 길이의 변이 ALS유전자를 포함하는 cDNA를 취득할 수 있었다. 이 cDNA의 염기서열을 서열번호 2에 나타내었다. 또한, 야생주 유래의 cDNA 라이브러리로부터는 완전길이 ALS 유전자를 포함하는 cDNA를 1종류를 취득할 수 있었다. 이들 변이형 ALS 유전자와 야생형의 ALS유전자의 상동성을 비교한 결과를 도 1에 나타내었다.

실시예 4: 변이형 ALS단백질의 발현

실시예 3(4)에서 수득된 플라즈미드를 EcoRI로 절단시켜서 야생형의 ALS유전자를 포함하는 cDNA 및 변이형 ALS유전자를 포함하는 cDNA를 절단한 후, pGEX발현벡터에 각각 삽입하였다. 야생형 ALS유전자를 포함하는 cDNA는 개시코돈보다도 47 염기 긴 5' 비번역영역을 갖고 있으며, GEX-2T의 Eco RI사이트에 삽입하였다. 또한, 변이형 ALS유전자를 포함하는 cDNA는 개시코돈보다도 31 염기 긴 5' 비번역영역을 갖고 있으며, pGEX-4T-3의 EcoRI사이트에 삽입하였다.

이들 대장균(JM 105)에 각각 형질전환하여 형질전환에 의해 수득된 콜로니를 액체배양시켜서 플라즈미드를 추출하고, 제한효소절단 패턴 및 서열에 의해 인서트 DNA의 삽입방향을 확인하였다. 인서트 DNA의 방향이 정확한 클론을 하나씩 선택하여 이것을 2㎖의 앰피실린을 함유하는 LB 배지 중 27℃에서 진동배양하였다. 이 전배양액 1㎖를 사용해서 50㎖ 또는 250㎖의 앰피실린 함유 LB배지에서 본 배양을 행하였다. 하루밤 배양 후, 1mM IPTG를 첨가해서 3시간 내지 4시간, GST융합단백질의 발현유도를 행하였다.

여기서, IPTG를 첨가하고 나서 3 내지 4시간 배양한 후의 ALS활성을 측정한 결과를 표 3에 나타내었다.

시료	ALS활성(OD525/40분/0.05ml)	단백질량(㎎/㎖)	비활성(OD525/40분/mg 단백질)
대조구(플라즈미드없음)	1.41	17.6	1.60
야생주	4.10	18.2	4.5
저항성 변이주	3.62	12.8	5.66

상기 표 3으로부터 알 수 있는 바와 같이, 플라즈미드를 갖지 않는 대조구와 비교해서 야생주 ALS유전자를 갖는 대장균 및 변이형 ALS유전자를 갖는 대장균에서는 3배 내지 4배정도 높은 비활성을 나타냈다. 따라서, IPTG를 첨가하고 나서 3 내지 4시간 배양한 후, 형질전환대장균을 -80℃로 보존하고, 이것을 사용해서 GST융합ALS단백질을 정제하였다. 대장균으로부터의 ALS의 조제와 정제는 다음의 방법으로 행하였다. 우선, -80℃로 보존해 둔 형질전환대장균의 펠릿을 ALS추출 완충액(30%글리세롤과 0.5mM MgCl₂를 포함한 인산칼륨완충액 pH 7.5)에 현탁하였다(배양액 50㎖로부터 수득된 펠릿에 대해서 2.5㎖의 완충액을 첨가). 이 현탁액을 초음파처리(히트시스템 울트라소닉사제, 소니케이터 W-225R, 마이크로칩, 출력제어 8, 약 1초 간격, 40초 2회)한 후, 4℃, 15000 ×g로 20분간 원심분리하여, 그 상등액을 조효소 용액으로 하였다.

조효소용액으로부터의 GST융합ALS 단백질(이하 「GST-ALS」이라 함)의 정제는 다음의 방법으로 행하였다: 배양액 250㎖분의 펠릿으로부터 정제한 조효소용액(12.5㎖)를 글루타티온세파로스 4B 친화성 컬럼[아머샴 파마시아 바이오텍사제, 베드 볼륨은 약 1㎖로 사전에 10㎖의 1 ×PBS(0.14M NaCl, 2.7mM KCl, 10.1mM Na₂HPO₄, 1.8mM KH₂PO₄ pH 7.3)으로 평형화 하였다]에 적용한 후, 10㎖의 1 ×PBS로 그 컬럼을 세정하고, 흡착한 GST-ALS를 2㎖의 10mM 글루타티온 용액으로 4회 용출시켰다. 각각의 분획의 GST활성 및 ALS활성을 측정하여 고활성분획을 모았다. 또한, ALS추출완충액을 사용한 경우에는 상기 컬럼의 흡착율이 나빴기 때문에, 1 ×PBS에서 효소를 추출한 후에 상기 컬럼에 흡착시키는 실험도 병행하였다. ALS활성측정 및 단백질정량은 상술한 방법에 따르고, GST활성은 1-클로로-2,4-디니트로벤젠(2,4-디클로르니트로벤젠(CDNB)으로 약칭함)를 기질로 하는 방법으로 측정하였다. 반응액량을 3㎖, 반응액 조성을 1mM CDNB, 1mM 글루타티온(환원형), 효소 용액, 100mM 인산칼륨완충액 pH 6.5로 하였다. 효소용액을 첨가한 후, 30℃에서 340nm의 흡광도 증가로서 속도분석(rate assay)을 행하였다. 또한, CDNB는 100배농도의 에탄올용액을 조제해서 반응액으로 첨가하였다.

상기 친화성 컬럼에 흡착하지 않는 활성(ALS활성 및 GST활성)도 많이 검출되었지만 친화성 컬럼에 흡착한 부분에 대해서는, 그 대부분의 활성이 처음과 2회째의 글루타티온 용출분획에 검출되었으므로 이것을 합쳐서 정제GST-ALS로 하였다.

이 GST-ALS를 트롬빈프로테아제(25유닛)으로 4℃, 하루밤 절단한 것을 GST 로부터 유리한 ALS로 하였다. 표 4에 조효소 용액, 상기 친화성 컬럼을 사용한 크로마토그래피 및 트롬빈프로테아제 처리 후의 ALS 활성, 단백질량 및 비활성을 나타내었다.

시료	ALS활성(OD525/40분/0.05ml)	단백질량(㎎/㎖)	비활성(OD525/40분/mg 단백질)
야생형 조효소	4.6105	9.6	9.61
크로마토그래피후	0.6083	0.189	64.4
트롬빈처리후	0.1089	0.189	11.5
저항성 변이형조효소	3.1493	12	5.25
크로마토그래피후	0.6025	0.045	268
트롬빈처리후	0.1203	0.045	53.5

또한, 조제한 ALS효소 중에는 대장균 유래의 ALS 활성이 포함된다. 그러나, 표 5에 나타내는 바와 같이, 대장균 유래의 ALS활성은 ALS 아이소자임Ⅰ에 의한 것으로서 1 mM의 발린 첨가에 의해 거의 완전히 저해될 수 있다.

시료*	ALS활성(OD525/40분/0.05ml)	저해율(%)
CK1(플라즈미드없음)	1.2725
CK1+1mM 발린	0.1768	86
CK2(플라즈미드없음)	1.5508
CK2+1mM 발린	0.1831	88

* 2번 연속해서 실험을 행하였다.

실시예 5: 변이형 ALS단백질의 약제 감수성

실시예 4에서 수득된 조효소용액을 사용해서 변이형 ALS단백질의 약제 감수성을 조사하였다. 약제 감수성 시험은 실시예 2와 같은 순서에 따라 행하였다. 이 약제 감수성시험에는 PC제초제로서 비스피리백-나트륨, 피리티오백-나트륨, 피리미노백의 3약제, 술포닐우레아계 제초제로서 클로르술푸론, 벤술푸론-메틸, 피라조술푸론에틸, 이마조술푸론의 4약제, 이미다졸리논계 제초제로서는 이마자퀸, 이마자피르의 2약제를 사용하였다.

이들 약제는 변이형 ALS단백질을 첨가하기 전에, 이들 약제의 소정의 농도의 용액(비스피리백-나트륨과 피리티오백-나트륨은 수용액, 기타는 아세톤용액)을 반응액 중에 첨가하였다. 아세톤의 최종농도는 1%로 하였다. 또한, 대장균내에서 발현하는 벼의 cDNA로부터의 ALS단백질은 발린 비감수성(참조: Kil et al., J. Biochem. Mol. Biol., 31, 287-295, 1998)이기 때문에, 대장균 유래의 ALS활성을 발린으로 저해한 조건하에서 약제 감수성을 시험하였다.

비스피리백-나트륨을 사용한 경우의 감수성을 나타내는 결과를 도 12에 나타내었다. 또한, 클로르술푸론을 사용한 경우의 감수성을 나타내는 결과를 도 13에 나타내었다. 도 12에서 알 수 있는 바와 같이, 비스피리백-나트륨에 의해 야생형 ALS활성이 저해된 것에 비해 변이형 ALS활성은 완전히 저해되지 않았다. 또한, 도 13에서 알 수 있는 바와 같이, 클로르술푸론에 대해서는 변이형 ALS단백질은 야생형 ALS단백질과 비교해서 소정의 농도까지 높은 활성을 유지하였으나, 비스피리백-나트륨의 경우와 비교하면 저항성은 중간정도였다.

또한, 약제로서 피리티오백-나트륨을 사용한 경우의 감수성을 나타내는 결과를 도 14에 나타내고, 약제로서 피리미노백을 사용한 경우의 감수성을 나타내는 결과를 도 15에 나타내고, 약제로서 벤술푸론-메틸을 사용한 경우의 감수성을 나타내는 결과를 도 16에 나타내고, 약제로서 피라조술푸론-에틸을 사용한 경우의 감수성을 나타내는 결과를 도 17에 나타내고, 약제로서 이마조술푸론을 사용한 경우의 감수성을 나타내는 결과를 도 18에 나타내고, 약제로서 이마자퀸을 사용한 경우의 감수성을 나타내는 결과를 도 19에 나타내고, 약제로서 이마자피르를 사용한 경우의 감수성을 나타내는 결과를 도 20에 나타내었다. 또한, 도 12 내지 20에 있어서, 흑색 3각형을 연결한 그래프가 야생형 ALS단백질을 포함하는 조효소용액을 나타내고, 흑색 4각형을 연결하는 그래프가 변이형 ALS단백질을 포함하는 조효소용액을 나타낸다.

이들 도 14 내지 도 20에 나타내는 바와 같이, 변이형 ALS단백질은 야생형 ALS단백질과 비교해서 각 약제에 대해서 우수한 저항성을 갖고 있고, 특히, PC계 제초제에 대해서 우수한 저항성을 갖고 있는 것을 알 수 있다. 또한, 도 12 도 14 및 도 15를 비교하면, 변이형 ALS단백질은 PC계 제초제 중에서 비스피리백-나트륨에 대한 저항성이 가장 우수한 것을 알 수 있다.

이들 결과는 실시예 2의 결과와 상관된다고 판단되기 때문에, 실시예 2에 있어서 PC계 제초제에 대한 저항성을 향상시킨 요인이 변이 ALS형 유전자인 것을 나타내고 있다.

한편, 실시예 4에서 조제한 정제GST-ALS 및 유리ALS를 사용해서 약제 감수성을 시험하였다. 야생형 ALS단백질의 비스피리백-나트륨에 대한 저항성을 나타내는 결과를 도 21에 나타내고, 변이형 ALS단백질의 비스피리백-나트륨에 대한 저항성을 나타내는 결과를 도 22에 나타내었다. 또한, 변이형 ALS단백질의 클로르술푸론에 대한 저항성을 나타내는 결과를 도 23에 나타내고, 변이형 ALS단백질의 이마자퀸에 대한 저항성을 나타내는 결과를 도 24에 나타내었다. 또한, 도 21 내지 도 24에 결과를 나타내는 약제 감수성 시험에 있어서는 발린 비첨가로 행하였다. 또한, 도 21에 있어서, 흑색 3각형을 연결하는 그래프가 야생형 ALS단백질을 포함하는 조효소용액을 나타내고, 흑색 4각형을 연결한 그래프가 야생형GST-ALS를 나타내고, 흑색 원을 연결하는 그래프가 유리된 ALS 단백질을 나타내고 있다. 도 22 내지 도 24에 있어서, 흑색 3각형을 연결한 그래프가 변이형 ALS단백질을 포함하는 조효소용액을 나타내고, 흑색 4각형을 연결한 그래프가 변이형GST-ALS를 나타내고 있다.

이들 도 21 내지 도 24에 나타내는 바와 같이, 정제 GST-ALS에 있어서도 조효소용액을 사용한 경우와 같은 약제 감수성을 나타냈다.

실시예 6: 변이형 ALS유전자에 있어서의 변이개소와 약제 감수성과의 관계

실시예 3(4)에서 결정한 변이형 ALS유전자에 있어서의 변이개소는 도 1에 나타낸 바와 같이, 야생형에 있어서의 548번째의 트립토판(W)이 류신(L)으로 변이한 W5481L변이와 야생형에 있어서의 627번째의 세린(S)이 이소류신(I)으로 변이한 S627I변이였다. 여기서 이들 변이에 의한 약제 감수성에 대한 영향을 검토하기 위해 이들 W548L변이 및 S627I변이의 임의의 변이만을 갖는 변이형 ALS유전자를 조제하여 임의의 한쪽의 변이만을 갖는 ALS단백질의 약제 감수성을 조사하였다.

(1) 변이유전자의 조제

구체적으로, W548L변이만을 갖는 변이형 ALS유전자(이하,「W548L변이형 ALS 유전자」라 함)는 도 25 및 도 26에 나타낸 바와 같이 해서 조제하였다. 우선, ALS-Rsp6이라고 명명한 센스프라이머(5'-CATCACCAACCACCTCTT-3': 서열번호 3)과 ALS-RspF라고 명명한 안티센스프라이머(5'-ACACGGACTGCAGGAATA-3': 서열번호 4)를 사용해서 2점변이형 ALS유전자를 유지하는 pBluescript II SK+(FERMBP-7348)를 주형으로한 PCR를 행하고, W548L변이를 갖고, S627I변이를 갖지 않는 DNA 단편을 증폭시켰다(도 25). 한편, ALS-RspE라고 명명한 센스프라이머(5'-TTACAAGGCGAATAGGGC-3': 서열번호 5)와 MI3R의 안티센스프라이머(5'-GGAAACAGCTATGACCATG-3': 서열번호 6)를 사용해서 야생형 ALS유전자를 유지하는 pBluescript II SK+를 주형으로 해서 627번째의 세린을 코딩하는 영역을 포함하는 DNA 단편을 증폭시켰다(도 25).

이어서, 이들 2개의 DNA단편을 근본으로 해서 SPR법(1개 사슬의 DNA끼리를 서열이 대응하는 말단부분에서 결합시켜 상호를 주형으로 해서 DNA polymerase로 복제시켜서 2개사슬 DNA로하는 유전자 조제법: Self Polymerase Reaction)에 의해 2개의 DNA 단편이 연결한 크기가 큰 DNA단편을 수득하였다(도 26). 수득된 단편을 Acc I 및 Eco RI로 절단한 Acc I-Eco RI 단편을 수득하였다. 또한, 야생형의 ALS 유전자를 삽입한 pGEX-2T 플라즈미드(pGEX-2T-wALS)를 Acc I사이트에서 절단시킨후, Eco RI로 37℃, 1분의 부분절단를 행하여 pGEX-2T 플라즈미드 부분단편을 수득하였다(도 26). 그리고, Acc I-Eco RI 단편과 pGEX-2T 플라즈미드 부분 단편을 연결함으로써 W548L 변이형 ALS유전자를 갖는 플라즈미드를 수득하였다.

또한, S627I변이만을 갖는 변이형 ALS유전자(이하, 「S627I 변이형 ALS유전자」라 함)는 상술한 W548L 변이형 ALS유전자를 조제한 방법에 따라서 얻을 수있다. 즉, pBluescript II SK+(FERM BP-7348)를 주형으로 한 PCR로 ALS-RspE 및 M13R를 프라이머로 사용하고, 야생형 ALS 유전자를 유지하는 pBluescript II SK+를 주형으로 한 PCR로 ALS-Rsp6 및 ALS-RspF를 프라이머로 사용한 것 이외는 동일하게 행하였다.

W548L 변이형 ALS유전자를 갖는 플라즈미드 및 S627I 변이형 ALS유전자를 갖는 플라즈미드를 사용해서 각각 대장균(JM 109주)로 형질전환하였다. 수득된 대장균콜로니의 ALS유전자의 전체 서열을 결정하였는 바, W548L 변이 및 S627I 변이의 1점 변이를 확인할 수 있었다.

(2) 각 변이 단백질의 약제 감수성

W548L 변이형 ALS유전자를 갖는 플라즈미드 또는 S627I 변이형 ALS유전자를 갖는 플라즈미드를 대장균(JM 109)에 형질전환하고, 형질전환에 의해 수득된 콜로니를 액체배양하여, 실시예 4 및 5와 같이 해서 GST유도 단백질의 발현유도를 행하고, 조효소액을 조제하여, 1mM의 발린 존재하에서 ALS의 약제 감수성을 조사하였다.

비스피리백-나트륨을 사용한 경우의 결과를 도 27에 나타내었다. 또한, 클로르술푸론 및 이마자퀸을 사용한 경우의 결과를 도 28 및 도 29에 나타내었다. 비스피리백-나트륨의 도 27로부터 알 수 있는 바와 같이, W548L변이 및 S627I 변이의 각각 1점 변이는 비스피리백-나트륨에 대한 저항성을 부여하고, 그 정도는 W548L변이만의 1점변이 쪽이 S627I 변이만의 1점 변이보다도 높았다.

그러나, 이들 1점변이의 저항성의 정도는 어느 것이나 실시예 5에 나타낸 2점변이의 경우보다도 몇단계 낮은 것으로 나타났다. 즉, W548L변이 및 S627I 변이를 병합해서 갖는 경우에는 W548L변이 또는 S627I 변이의 임의의 것을 갖는 경우로부터 예측되지 않을 정도로 비스피리백-나트륨에 대한 저항성이 현저히 강하게 되었다.

한편, 클로르술푸론의 경우에는(도 28), W548L변이만의 경우에는 클로르술푸론에 대한 저항성을 부여하였으나, S627I 변이만의 경우에는 명확한 저항성은 부여하지 않았다. 또한, W548L변이만의 경우와 W548L변이 및 S627I 변이의 경우를 비교하면 클로르술푸론에 대한 저항성의 정도와 동일 정도였다. 또한, 이마자퀸의 경우에는(도 29), 비스피리백-나트륨과 동일정도의 결과가 얻어졌으나, 본 실시예의 농도범위에서는 2점변이를 병합하는 것에 의한 상승적인 저항성의 증대에 대해서는 확인할 수 없었다.

이상의 결과, 이번에 새로이 발견된 S627I 변이는 W548L변이에 의한 비스피리백-나트륨 저항성을 비약적으로 높일 수 있는 것이 판명되었다. 따라서, W548L변이 및 S627I 변이를 갖는 ALS 유전자는 비스피리백-나트륨에 특이적으로 높은 저항성을 부여하는 유전자인 것으로 결론지었다.

실시예 7: 형질전환식물의 조제

실시예 3(4)에서 결정한 변이형 ALS유전자를 사용해서 벼(니혼바레)를 형질전환하여 형질전환벼의 비스피리백-나트륨저항성을 조사하였다.

(1) 변이 ALS유전자를 삽입한 바이너리 벡터의 조제

벼의 형질전환용으로 개발된 바이너리 벡터인 pMLH 7133(참조: Mitsuhara et al., Plant Cell Physiol., 37, 49-59, 1996)에 하기의 방법에 의해 실시예 3(4)에서 수득된 변이형 ALS유전자를 삽입하였다.

즉, 도 30에 나타내는 바와 같이, 우선, 변이형 ALS유전자를 삽입한 pBluescript II SK+(FERM BP-7348)로부터 변이형 ALS유전자를 멀티 클로닝 사이트의 제한효소 절단부위와 어댑터의 절단부위를 이용해서 절단하였다(Sac I Bam HI에의한 부분절단). 또한, pMLH 7133을 Sac I 및 Bam HI를 사용해서 절단하고, pMLH 7133에 있어서의 GUS영역을 절단해서 직쇄상으로 만들었다. 변이형 ALS 유전자를 포함하는 DNA 단편과 직쇄상의 pMLH 7133을 연결해서 pMLH 7133-ALS를 수득하였다.

수득된 pMLH 7133-ALS를 대장균(JM 105주)에 형질전환하여 수득된 단일콜로니를 액체배양한 후, 플라즈미드를 조제하였다. 조제한 플라즈미드를 Sac I과 Bam HI로 절단하여 인서트의 유무를 확인(도 31)함으로써 변이 ALS유전자를 유지하고 있는 클론을 선별하였다. 인서트가 확인된 플라즈미드를 주형으로 하여 변이 ALS유전자의 적어도 일부를 특이적으로 증폭시키는 2세트의 프라이머를 사용해서 PCR를 행하였다. 프라이머세트는 ALS-Rsp1센스프라이머(5'-GCTCTGCTACAACAGAGCACA-3': 서열번호 7)과 4-83-3안티센스프라이머(5'-GCTTTGCCAACATACAG-3': 서열번호 8)의 세트, 3-1-4센스프라이머(5'-AGGTGTCACAGTTGTTG-3': 서열번호 9)와 3-1-1안티센스프라이머(5'-GCATCTTCTTGAATGGCG-3': 서열번호 10)의 세트를 사용하였다. 그 결과, 특이적인 단편 밴드가 검출되고(도 32), 실시예 3(4)에서 수득된 변이형 ALS유전자가 pMLH 7133벡터에 삽입된 것으로 판단할 수 있었다.

또한, 변이형 ALS 유전자가 정상으로 삽입되었는가 아닌가는 PCR에 의한 인서트의 삽입방향의 확인 및 서열의 결정에 의해 확인하였다. PCR에 의한 인서트의 삽입방향의 확인은 다음의 방법으로 행하였다. pMLH 7133-ALS를 Bco RI로 완전절단함으로써 TNOS부분을 제거함과 동시에 직쇄상으로 만들고, 이것을 주형으로 하여 상기한 ALS-ResI 및 4-83-3의 세트와 3-1-4 및 3-1-1의 세트를 사용해서 PCR를 행하였다. 그 결과(도 33), 예상되는 위치에 PCR산물의 밴드가 확인된 것으로 부터 변이형 ALS 유전자가 순방향으로 삽입되어 있는 것으로 판단되었다. 또한, 변이형 ALS유전자가 역방향으로 삽입되어 있는 경우에는 Eco RI 절단에 의해 그 변이형 ALS유전자부분이 pMLH 7133-ALS로부터 절단되어 버리기 때문에, DNA 단편이 증폭되지 않고, PCR산물이 검출되지 않는다.

한편, 서열의 결정은 pMLH 7133-ALS를 조제하여 이것을 주형으로 하여 변이 ALS유전자의 5'측과 pMLH 7133과의 접합영역에 대해서 행하였다. 또한, pMLH 7133-ALS는 대장균내에서의 복제수가 적은 것으로부터 종래의 20배량의 배양액(2㎖의 배양액 20개분)으로부터 알칼리 SDS법으로 조제하였다. 그 결과, 변이형 ALS유전자는 순방향으로 삽입되어 있다고 판단되었다.

(2) 아그로박테리움균에 대한 바이너리 벡터의 도입

상기 (1)에서 수득된 바이너리 벡터(pMLH 7133-ALS)를 다음과 같이 아그로박테리움균에 도입하였다. 아그로박테리움균으로서는 -80℃에서 보존하고 있는 Agrobacterium tumefaciens EHA 105의 콤피턴트 셀을 얼음 중에서 용해시켜서 사용하였다. Agrobacterium tumefaciens EHA 105 의 콤피텐트 셀을 함유하는 용액에 pMLH 7133-ALS를 첨가하여 얼음 중에서 15분간 방치한 후, 37℃에서 5분간의 열충격을 가하였다. 그 후, 얼음 중에 2분간 방치하고, 이어서, 1㎖의 SOC 액체배지를 첨가하여 28℃에서 2 내지 4시간 천천히 흔들었다. 그 후, 원심분리해서 상등액의 대부분을 버리고 침전된 균체를 남은 상등액에 현탁시켰다. 가나마이신과 하이그로마이신을 각각 50ppm함유하는 LB플레이트 배지에 현탁액을 도포하고, 28℃에서 2 내지 3일 배양하여 단일 콜로니를 얻었다.

(3) pMLH 7133-ALS 도입 아그로박테리움균에 의한 벼의 형질전환

(2)에서 수득된 아그로박테리움균을 멸균한 마이크로스패츌러(micro spatula)로 1/2숟갈정도 취하여, 표 6에 나타낸 아세토시린곤(acetosyringone)을 10㎎/ℓ의 농도로 첨가한 30㎖의 AAM배지(팔콘튜브)에 잘 현탁시켰다.

MgSO₄-7H₂O	250	CaCl₂- 2H₂O	150
NaH₂PO₄-2H₂O	150	KCl	3000
Fe-EDTA	40	MnSO₄-6H₂O	10
ZnSO₄-7H₂O	2	CuSO₄-5H₂O	0.025
CoCl₂-6H₂O	0.025	KI	0.75
H₃BO	3	Na₂NoO₄-2H₂O	0.25
미오-이노시톨	100	니코틴산	1
피리독신-HCl	1	티아민-HCl	10
카사미노산	500	글리신	7.5
L-알기닌	176.7	L-글루타민	900
L-아스파르트산	300	수크로스	68.5
글루코스	36
pH	5.2

(수치는 ㎎/ℓ)

이때 아그로박테리움균의 괴가 남지 않도록 파스퇴르 피펫으로 잘 피펫팅하였으며, 수득된 현탁액을 9㎝ 샬레에 넣었다.

한편, 니혼바레의 종자로 부터 유도하여 표 7에 나타낸 N6D배지에서 전체배양한 캘러스를 스테인레스 메시(mesh)에 넣고, 메시마다 1.5 내지 2분간 아그로박테리움의 현탁액을 뿌렸다(이때, 캘러스 전체가 균액에 침지되도록 약수저로 부드럽게 혼합하였다). 그 후, 스테인레스 메시를 멸균한 여과지상에 놓고, 여분의 균액을 제거하였다. 이와 같이 처리된 캘러스를 표 8에 나타낸 2N6AS고형 배지(아세토시린곤 10㎎/ℓ)에 치상하고(1샬레에 16캘러스), 서지컬 테이프로 밀봉해서 28℃, 암소조건에서 2 내지 3일간 배양시켰다(균체가 캘러스를 희미하게 덮도록 증식하기까지 배양시켰다).

CHU의 분말	1봉지
미오-이노시톨	100
니코틴산	0.5
피로독신-HCl	0.5
티아민-HCl	1
2,4-D	2
카사미노산	300
글리신	2
프롤린	2827
수크로스	30000
겔라이트	4000
카르베니실린	500
하이그로마이신	50
pH	5.8

(수치는 ㎎/ℓ)

CHU의 분말	1봉지
미오-이노시톨	100
니코틴산	0.5
피로독신-HCl	0.5
티아민-HCl	1
2,4-D	2
카사미노산	300
글리신	2
수크로스	30g
글루코스	10g
겔라이트	4000
아세트시릭곤	10
pH	5.2

(수치는 ㎎/ℓ)

3일간의 공존배양(cocultivation)으로 캘러스에 희미하게 균체가 덮일 정도가 된 시점에서 다음의 방법으로 캘러스를 세정하여 아그로박테리움균을 제거하였다. 상술한 바와 같이 처리된 캘러스를 스테인레스 메시에 넣고, 메시마다 N6D액체배지(카르베니실린을 500㎎/ℓ를 포함한다)에 침지하여 그 배지가 백탁하지 않기까지 샬레를 교환하였다. 이 처리에 의해 캘러스에 부착한 아그로박테리움균을 세정시켰다. 그 후, 메시를 멸균한 종이 위에 놓고, 여분의 수분을 제거하였다. 이 캘러스를 N6D고형배지(500㎎/ℓ의 카르베니실린과 50㎎/ℓ의 하이그로마이신을 포함한다)에 장치해서 28℃, 밝은 곳에서 2 내지 3주간 배양시켰다. 또한, 이 조작 후 아그로박테리움이 재차 증식하는 경우에는 동일하게 재차 세정해서 새로운 배지에 치상하였다.

28℃, 밝은 곳에서 2 내지 3주간 배양에 의해 선발한 후, 캘러스를 재분화 배지 (250㎎/ℓ의 카르베니실린과 50㎎/ℓ의 하이그로마이신을 포함한다)에 1샬레에 대해 9캘러스씩 이식하고, 28℃, 밝은조건에서 2 내지 3주간 배양시켰다. 캘러스로부터 줄기잎부와 뿌리부가 각각 1㎝이상 분화한 시점에서, 호르몬프리배지(50㎎/ℓ의 하이그로마이신을 포함한다)에 1샬레에 대해 2 내지 3 캘러스가 되도록 이식하였다. 그 후, 수득된 식물체가 샬레 가득히 퍼진 시점에서 배양토(본 솔, bon sol)에 화분심기하여 훈화시켰다. 또한, 이식시에는 뿌리에 부착하고 있는 배지는 수중에서 완전히 씻어내렸다. 이상의 조작 플로우를 도 34에 나타내었다.

한편, 상기한 화분심기를 하는 시점에서 재분화하지 않은 캘러스의 일부(9주)(도 35)를 실시예 1에서 사용한 비스피리백-나트륨저항성 캘러스 조제용의 개체배지에서 계대배양시켰다. 또한, 이 개체배지에는 10Mm의 비스피리백-나트륨을 함유하고 있다. 그 결과, 9주 중 6개가 정상으로 증식하였다. 그리고, 정상으로 증식된 비스피리백-나트륨 저항성을 나타내는 캘러스 6주의 하나에 대해서 액체배양을 행하여, 비스피리백-나트륨에 대한 약제 감수성을 상세히 조사하였다. 그 결과, 도 36에 나타내는 바와 같이, 2점 변이형 유전자의 유래주인 비스피리백-나트륨저항성의 Sr계통주와 거의 마찬가지로 비스피리백-나트륨저항성을 나타냈다. 또한, 도 37에 나타내는 바와 같이, 야생형벼(니혼바레)의 캘러스에 있어서는 비스피리백-나트륨감수성을 나타냈다. 이것으로 부터 10Mm의 비스피리백-나트륨 함유 고체배지에서 생육한 6주는 모두 강한 비스피리백-나트륨 저항성을 갖는 것으로 판단되었다.

한편, 이들 비스피리백-나트륨캘러스로부터 QIAGEN사의 DNeasy Plant Kit를 사용해서 게놈 DNA를 조제해서 이것을 주형으로 해서 2점 변이부분을 끼우는 센스프라이머(3-1-4: 서열번호 9)와 안티센스프라이머(4-83-3: 서열번호 8)의 세트로 PCR를 행하였다. 그 결과, 도 38에 나타내는 바와 같이, 예상되는 DNA단편이 증폭하였다. 증폭한 DNA단편을 정제 후 염기서열을 조사하였다. 센스사슬을 읽는 데는 프라이머(3-1-4: 서열번호 9), 안티센스사슬을 읽는 데는 프라이머(ALS-Rsp 2: 5'-AGTCCTGCCATCACCATCCAG-3': 서열번호 11)를 사용하였다.

ALS단백질에 있어서의 548번째의 아미노산을 코딩하는 염기서열주변의 해석결과를 도 39A 및 B에 나타내었다. 또한, ALS단백질에 있어서의 627번째의 아미노산을 코딩하는 염기서열주변의 해석결과를 도 39C 및 D에 나타내었다. 이들 도 39A 내지 39D에 나타내는 바와 같이, 이들 주의 2점 변이부위에는 야생형과 변이형의 헤테로의 서열이 확인되었다. 따라서, 변이형 ALS유전자가 게놈 중에 삽입되어 있는 것이 확인되었다. 또한, 9주 중 3개에 있어서는 10Mm 비스피리백-나트륨 존재하에서 생육이 나빴으나, 이것은 도입된 2점 변이형 ALS유전자의 발현량이 낮기 때문이라고 생각된다.

다른 한편, 화분심기한 하이그로마이신저항성의 형질전환 벼 약 80주 중에서 5엽기의 단계에서 정상으로 생육한 것은 변이형 ALS 유전자를 도입한 것으로 27개체, 야생형 ALS유전자를 도입한 것으로 46개체였다. 야생형 ALS유전자를 도입한 쪽이 변이형 ALS 유전자를 도입한 것보다도 건전하게 생육하고 있는 경향이 있었다. 이 시점에서 변이형 ALS유전자도입의 4주 및 야생형 ALS유전자도입의 5주를 적당히 선별해서 1kg a.i./ha의 비스피리백-나트륨염을 0.2% 서펙턴트(surfactant) K를 첨가해서 줄기잎부에 산포하였다. 그 후, 약 40일 후에 생육조사한 결과를 도 40에 나타내었다. 또한, 도 40 중 A의 초장(plant length)은 약 90㎝였다.

도 40에 의해 변이형 ALS유전자를 도입한 1개체가 거의 정상으로 생육하고(A), 이 주가 비스피리백-나트륨 저항성인 것이 판명되었다. 이 비스피리백-나트륨 저항성의 형질전환 벼로 부터 게놈 DNA를 QIAGE사의 DNeasy Plant Kit에의해 조제하여 2점 변이부분을 끼우는 센스프라이머(3-1-4: 서열번호 9)와 안티센스프라이머(4-83-3: 서열번호 8)의 세트로 PCR를 행하여 수득된 DNA단편의 염기서열을 상술한 캘러스의 경우와 같은 방법으로 조사하였다. 그 결과, 이 형질전환 벼에는 2점 변이가 존재하고 있는 것이 확인되었다.

본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 삽입하는 것으로 한다.

이상 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명에 의하면 모든 약제에 대해서 우수한 저항성을 가짐과 동시에, PC계 제초제에 대해서도 극히 고도의 저항성을 나타내는 ALS효소를 코딩하는 ALS유전자를 제공할 수 있다.

<110> KUMIAI CHEMICAL INDUSTRY CO., LTD. NATIONAL INSTITUTE OF AGROBIOLOGICAL SCIENCES <120> GENE ENCODING ACETOLACTIC ACID SYNTHASE GENE <130> PH-1273PCT <150> JP 2000-362630 <151> 2000-11-29 <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 644 <212> PRT <213> Oryza sativa var.Kinmaze <400> 1 Met Ala Thr Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Ser Ala Ala Ala 1 5 10 15 Thr Ala Lys Thr Gly Arg Lys Asn His Gln Arg His His Val Leu Pro 20 25 30 Ala Arg Gly Arg Val Gly Ala Ala Ala Val Arg Cys Ser Ala Val Ser 35 40 45 Pro Val Thr Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Ala Thr Pro Leu Arg Pro 50 55 60 Trp Gly Pro Ala Glu Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala 65 70 75 80 Leu Glu Arg Cys Gly Val Ser Asp Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala 85 90 95 Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Pro Val Ile Thr Asn 100 105 110 His Leu Phe Arg His Glu Gln Gly Glu Ala Phe Ala Ala Ser Gly Tyr 115 120 125 Ala Arg Ala Ser Gly Arg Val Gly Val Cys Val Ala Thr Ser Gly Pro 130 135 140 Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser 145 150 155 160 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Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly Lys Asn Lys Gln Pro His Val Ser 370 375 380 Ile Cys Ala Asp Val Lys Leu Ala Leu Gln Gly Leu Asn Ala Leu Leu 385 390 395 400 Gln Gln Ser Thr Thr Lys Thr Ser Ser Asp Phe Ser Ala Trp His Asn 405 410 415 Glu Leu Asp Gln Gln Lys Arg Glu Phe Pro Leu Gly Tyr Lys Thr Phe 420 425 430 Gly Glu Glu Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Val Leu Asp Glu Leu 435 440 445 Thr Lys Gly Glu Ala Ile Ile Ala Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met 450 455 460 Trp Ala Ala Gln Tyr Tyr Thr Tyr Lys Arg Pro Arg Gln Trp Leu Ser 465 470 475 480 Ser Ala Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ala Gly 485 490 495 Ala Ser Val Ala Asn Pro Gly Val Thr Val Val Asp Ile Asp Gly Asp 500 505 510 Gly Ser Phe Leu Met Asn Ile Gln Glu Leu Ala Leu Ile Arg Ile Glu 515 520 525 Asn Leu Pro Val Lys Val Met Val Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met 530 535 540 Val Val Gln Leu Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr 545 550 555 560 Tyr Leu Gly Asn Pro Glu Cys Glu Ser Glu Ile Tyr Pro Asp Phe Val 565 570 575 Thr Ile Ala Lys Gly Phe Asn Ile Pro Ala Val Arg Val Thr Lys Lys 580 585 590 Ser Glu Val Arg Ala Ala Ile Lys Lys Met Leu Glu Thr Pro Gly Pro 595 600 605 Tyr Leu Leu Asp Ile Ile Val Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met 610 615 620 Ile Pro Ile Gly Gly Ala Phe Lys Asp Met Ile Leu Asp Gly Asp Gly 625 630 635 640 Arg Thr Val Tyr <210> 2 <211> 2279 <212> DNA <213> Oryza sativa var.Kinmaze <400> 2 ctcgccgccg ccgccgccgc caccacccac catggctacg accgccgcgg ccgcggccgc 60 cgccctgtcc gccgccgcga cggccaagac cggccgtaag aaccaccagc gacaccacgt 120 ccttcccgct cgaggccggg tgggggcggc ggcggtcagg tgctcggcgg tgtccccggt 180 caccccgccg tccccggcgc cgccggccac gccgctccgg ccgtgggggc cggccgagcc 240 ccgcaagggc gcggacatcc tcgtggaggc gctggagcgg tgcggcgtca gcgacgtgtt 300 cgcctacccg ggcggcgcgt ccatggagat ccaccaggcg ctgacgcgct ccccggtcat 360 caccaaccac ctcttccgcc acgagcaggg cgaggcgttc gcggcgtccg ggtacgcgcg 420 cgcgtccggc cgcgtcgggg tctgcgtcgc cacctccggc cccggggcaa ccaacctcgt 480 gtccgcgctc gccgacgcgc tgctcgactc cgtcccgatg gtcgccatca cgggccaggt 540 cccccgccgc atgatcggca ccgacgcctt ccaggagacg cccatagtcg aggtcacccg 600 ctccatcacc aagcacaatt accttgtcct tgatgtggag gacatccccc gcgtcataca 660 ggaagccttc ttcctcgcgt cctcgggccg tcctggcccg gtgctggtcg acatccccaa 720 ggacatccag cagcagatgg ccgtgccggt ctgggacacc tcgatgaatc taccagggta 780 catcgcacgc ctgcccaagc cacccgcgac agaattgctt gagcaggtct tgcgtctggt 840 tggcgagtca cggcgcccga ttctctatgt cggtggtggc tgctctgcat ctggtgacga 900 attgcgctgg tttgttgagc tgactggtat cccagttaca accactctga tgggcctcgg 960 caatttcccc agtgacgacc cgttgtccct gcgcatgctt gggatgcatg gcacggtgta 1020 cgcaaattat gccgtggata aggctgacct gttgcttgcg tttggtgtgc ggtttgatga 1080 tcgtgtgaca gggaaaattg aggcttttgc aagcagggcc aagattgtgc acattgacat 1140 tgatccagca gagattggaa agaacaagca accacatgtg tcaatttgcg cagatgttaa 1200 gcttgcttta cagggcttga atgctctgct acaacagagc acaacaaaga caagttctga 1260 ttttagtgca tggcacaatg agttggacca gcagaagagg gagtttcctc tggggtacaa 1320 aacttttggt gaagagatcc caccgcaata tgccattcag gtgctggatg agctgacgaa 1380 aggtgaggca atcatcgcta ctggtgttgg gcagcaccag atgtgggcgg cacaatatta 1440 cacctacaag cggccacggc agtggctgtc ttcggctggt ctgggcgcaa tgggatttgg 1500 gctgcctgct gcagctggtg cttctgtggc taacccaggt gtcacagttg ttgatattga 1560 tggggatggt agcttcctca tgaacattca ggagctggca ttgatccgca ttgagaacct 1620 ccctgtgaag gtgatggtgt tgaacaacca acatttgggt atggtggtgc aattggagga 1680 taggttttac aaggcgaata gggcgcatac atacttgggc aacccggaat gtgagagcga 1740 gatatatcca gattttgtga ctattgctaa ggggttcaat attcctgcag tccgtgtaac 1800 aaagaagagt gaagtccgtg ccgccatcaa gaagatgctc gagactccag ggccatactt 1860 gttggatatc atcgtcccgc accaggagca tgtgctgcct atgatcccaa ttgggggcgc 1920 attcaaggac atgatcctgg atggtgatgg caggactgtg tattaatcta taatctgtat 1980 gttggcaaag caccagcccg gcctatgttt gacctgaatg acccataaag agtggtatgc 2040 ctatgatgtt tgtatgtgct ctatcaataa ctaaggtgtc aactatgaac catatgctct 2100 tctgttttac ttgtttgatg tgcttggcat ggtaatccta attagcttcc tgctgtctag 2160 gtttgtagtg tgttgttttc tgtaggcata tgcatcacaa gatatcatgt aagtttcttg 2220 tcctacatat caataataag agaataaagt acttctatgt aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 2279 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 catcaccaac cacctctt 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 acacggactg caggaata 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ttacaaggcg aatagggc 18 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ggaaacagct atgaccatg 19 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gctctgctac aacagagcac a 21 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gctttgccaa catacag 17 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 aggtgtcaca gttgttg 17 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gcatcttctt gaatggcg 18 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 agtcctgcca tcaccatcca g 21 <210> 12 <211> 644 <212> PRT <213> Oryza sativa var.Kinmaze <400> 12 Met Ala Thr Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Ser Ala Ala Ala 1 5 10 15 Thr Ala Lys Thr Gly Arg Lys Asn His Gln Arg His His Val Leu Pro 20 25 30 Ala Arg Gly Arg Val Gly Ala Ala Ala Val Arg Cys Ser Ala Val Ser 35 40 45 Pro Val Thr Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Ala Thr Pro Leu Arg Pro 50 55 60 Trp Gly Pro Ala Glu Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala 65 70 75 80 Leu Glu Arg Cys Gly Val Ser Asp Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala 85 90 95 Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Pro Val Ile Thr Asn 100 105 110 His Leu Phe Arg His Glu Gln Gly Glu Ala Phe Ala Ala Ser Gly Tyr 115 120 125 Ala Arg Ala Ser Gly Arg Val Gly Val Cys Val Ala Thr Ser Gly Pro 130 135 140 Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser 145 150 155 160 Val Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly 165 170 175 Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile 180 185 190 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Gln Gln Ser Thr Thr Lys Thr Ser Ser Asp Phe Ser Ala Trp His Asn 405 410 415 Glu Leu Asp Gln Gln Lys Arg Glu Phe Pro Leu Gly Tyr Lys Thr Phe 420 425 430 Gly Glu Glu Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Val Leu Asp Glu Leu 435 440 445 Thr Lys Gly Glu Ala Ile Ile Ala Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met 450 455 460 Trp Ala Ala Gln Tyr Tyr Thr Tyr Lys Arg Pro Arg Gln Trp Leu Ser 465 470 475 480 Ser Ala Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ala Gly 485 490 495 Ala Ser Val Ala Asn Pro Gly Val Thr Val Val Asp Ile Asp Gly Asp 500 505 510 Gly Ser Phe Leu Met Asn Ile Gln Glu Leu Ala Leu Ile Arg Ile Glu 515 520 525 Asn Leu Pro Val Lys Val Met Val Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met 530 535 540 Val Val Gln Trp Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr 545 550 555 560 Tyr Leu Gly Asn Pro Glu Cys Glu Ser Glu Ile Tyr Pro Asp Phe Val 565 570 575 Thr Ile Ala Lys Gly Phe Asn Ile Pro Ala Val Arg Val Thr Lys Lys 580 585 590 Ser Glu Val Arg Ala Ala Ile Lys Lys Met Leu Glu Thr Pro Gly Pro 595 600 605 Tyr Leu Leu Asp Ile Ile Val Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met 610 615 620 Ile Pro Ser Gly Gly Ala Phe Lys Asp Met Ile Leu Asp Gly Asp Gly 625 630 635 640 Arg Thr Val Tyr <210> 13 <211> 644 <212> PRT <213> Oryza sativa var.Kinmaze <400> 13 Met Ala Thr Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Ser Ala Ala Ala 1 5 10 15 Thr Ala Lys Thr Gly Arg Lys Asn His Gln Arg His His Val Leu Pro 20 25 30 Ala Arg Gly Arg Val Gly Ala Ala Ala Val Arg Cys Ser Ala Val Ser 35 40 45 Pro Val Thr Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Ala Thr Pro Leu Arg Pro 50 55 60 Trp Gly Pro Ala Glu Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala 65 70 75 80 Leu Glu Arg Cys Gly Val Ser Asp Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala 85 90 95 Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Pro Val Ile Thr Asn 100 105 110 His Leu Phe Arg His Glu Gln Gly Glu Ala Phe Ala Ala Ser Gly Tyr 115 120 125 Ala Arg Ala Ser Gly Arg Val Gly Val Cys Val Ala Thr Ser Gly Pro 130 135 140 Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser 145 150 155 160 Val Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly 165 170 175 Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile 180 185 190 Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Glu Asp Ile Pro Arg Val 195 200 205 Ile Gln Glu Ala Phe Phe Leu Ala Ser Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val 210 215 220 Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Met Ala Val Pro Val 225 230 235 240 Trp Asp Thr Ser Met Asn Leu Pro Gly Tyr Ile Ala Arg Leu Pro Lys 245 250 255 Pro Pro Ala Thr Glu Leu Leu Glu Gln Val Leu Arg Leu Val Gly Glu 260 265 270 Ser Arg Arg Pro Ile Leu Tyr Val Gly Gly Gly Cys Ser Ala Ser Gly 275 280 285 Asp Glu Leu Arg Trp Phe Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val Thr Thr 290 295 300 Thr Leu Met Gly Leu Gly Asn Phe Pro Ser Asp Asp Pro Leu Ser Leu 305 310 315 320 Arg Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Asp 325 330 335 Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val 340 345 350 Thr Gly Lys Ile Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile 355 360 365 Asp Ile Asp Pro 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Gly Phe Asn Ile Pro Ala Val Arg Val Thr Lys Lys 580 585 590 Ser Glu Val Arg Ala Ala Ile Lys Lys Met Leu Glu Thr Pro Gly Pro 595 600 605 Tyr Leu Leu Asp Ile Ile Val Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met 610 615 620 Ile Pro Ile Gly Gly Ala Phe Lys Asp Met Ile Leu Asp Gly Asp Gly 625 630 635 640 Arg Thr Val Tyr

Claims

서열번호 12에 기재된 아미노산 서열로 구성되는 야생형 벼의 아세토젖산 신타제에서 627번째의 아미노산이 세린에서 이소류신으로 치환되고, 피리미디닐카르복시 제초제에 대한 저항성을 가지는 단백질을 암호화하는 유전자.
제 1항에 있어서,

상기 단백질은 서열번호 13에 기재된 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는

유전자.
제 1항에 있어서,

상기 단백질은 서열번호 12에 기재된 아미노산 서열로 구성되는 야생형 벼의 아세토젖산 신타제에서 548번째의 아미노산이 트립토판에서 류신으로 추가로 치환된 것을 특징으로 하는

유전자.
제 3항에 있어서,

상기 단백질은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는

유전자.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 기재된 유전자에 의하여 암호화되는 아세토젖산 신타제 단백질.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 기재된 유전자를 갖는 재조합 벡터.
제 6항에 기재된 재조합 벡터를 갖는 형질전환체.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 기재된 유전자를 선택마커로 사용하여 전기 유전자를 갖는 형질전환 세포를 선별하는 방법.
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