CN118345098B - 一种具有除草剂抗性的玉米ACCase突变型基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有除草剂抗性的玉米ACCase突变型基因及其应用。属于植物基因工程和抗除草剂育种技术领域。本发明的玉米ACCase突变型基因为野生型玉米ZmACC1基因发生以下突变：第5491、5492位碱基发生突变，由C突变为T。本发明发现的突变型基因具有乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂精吡氟禾草灵、精喹禾灵和烯草酮的耐性，将其应用到玉米大豆间作中，突变体材料表现出对除草剂良好的耐性。

Description

一种具有除草剂抗性的玉米ACCase突变型基因及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程和抗除草剂育种技术领域，更具体的说是涉及一种具有除草剂抗性的玉米ACCase突变型基因及其应用。

背景技术

乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase,ACCase)能够催化乙酰辅酶A羧化成丙二酰辅酶A，进入脂肪酸从头合成或者油脂代谢，该步骤是脂肪酸从头合成的第一步，也是脂肪酸从头合成的限速步骤。生物体内的ACCase包括原核型和真核型，真核型的ACCase包括生物素羧化酶结构域、生物素羧基载体蛋白结构域和羧基转移酶结构域。原核型ACCase由BC、BCCP、α-CT和β-CT四个亚基组成，其中BC、BCCP和α-CT为核基因accC、accB和accA编码，β-CT为质体基因accD编码。整个催化反应过程包括，BCCP在BC催化下，CO₂结合到生物素分子或羧基生物素，进一步在CT的催化下，转移到乙酰辅酶A形成丙二酰辅酶A。双子叶植物存在两种形式的ACCase，原核型的ACCase主要存在于叶绿体或质体中，真核型的ACCase主要存在胞质中，而单子叶禾本科植物只存在真核型ACCase，其脂肪酸生物合成在叶绿体(质体)中进行。

ACCase是化学除草剂的重要靶标，以ACCase作为靶标的除草剂能够抑制禾本科植物体内的脂肪酸合成。该类除草剂通过抑制真核型ACCase生成丙二酰辅酶A的羧化反应，抑制脂肪酸合成，有选择性的防除禾本科杂草，对阔叶作物安全。当前基于ACCase开发的抑制剂类除草剂大致分为三类，即芳氧苯氧丙酸酯类(Aryloxyphenoxypropanoates,APP)、芳氧苯基环己二酮类(Aryloxyphenylcy-clohexanedione,CHD)和苯基吡唑啉类(phenylpyrazolin,DEN)。其中，已开发的APP类商业化除草剂达20余种，代表性除草剂有精喹禾灵、高效氟吡甲禾灵、精吡氟禾草灵等。已开发的CHD类商业化除草剂包括烯草酮、烯禾啶和三甲苯草酮等，其中烯草酮的应用最广。DEN类除草剂主要用于谷物田的苗后除草剂，防除禾本科杂草，其代表性除草剂为唑啉草酯，该类除草剂对小麦和大麦的安全性较高。

近年来，我国大力试点大豆玉米带状复合种植。然而，由于玉米是禾本科单子叶植物，大豆作为阔叶类双子叶植物，两者使用的茎叶除草剂对彼此都是致命的，如何在大田间作的同时不影响作物的生长而有效防治杂草是重要难题。

综上，如何提供一种大豆除草剂兼容抗性玉米是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种具有除草剂抗性的玉米ACCase突变型基因及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种具有除草剂抗性的玉米ACCase突变型基因，为野生型玉米ZmACC1基因发生以下突变：第5491、5492位碱基发生突变，由C突变为T。

进一步的，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

一种表达盒，包括上述的玉米ACCase突变型基因。

一种重组载体，包括上述的玉米ACCase突变型基因。

上述的玉米ACCase突变型基因、上述的表达盒或上述的重组载体，在玉米抗除草剂方面的应用。

进一步的，所述除草剂是ACCase抑制剂类除草剂。

进一步的，所述除草剂为精喹禾灵、精吡氟禾草灵或烯草酮。

一种使玉米获得除草剂抗性的方法，使玉米包含上述的玉米ACCase突变型基因。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：本发明发现的突变型基因具有乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂精吡氟禾草灵、精喹禾灵和烯草酮的耐性，将其应用到玉米大豆间作中，突变体材料表现出对除草剂良好的耐性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中ACC蛋白的系统进化树；

图2为本发明实施例1中ACC蛋白的突变峰图；

图3为本发明实施例2中ACC突变体材料M1苗期的除草剂抗性；

图4为本发明实施例3中田间实验结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例所用材料如下：

植物材料

本发明所使用的植物材料为玉米KN5585自交系，委托未米生物科技(江苏)有限公司进行遗传转化材料以及转化材料的后代材料。

载体和菌株

载体：由本实验室保存的基因编辑基础载体pCAMBIA3301。

菌株：Trans1-T1 Phage Resistant ChemicallyCompetent Cell(北京全式金生物技术有限公司，CD501-02)。

酶类：

高保真PCR酶KAPAHiFi HotStart ReadyMixPCRKit(北京巨华泰克科技有限公司，KK2602)；

同源重组酶HiFi DNAAssembly Master Mix(北京百灵克生物科技有限责任公司，E2621L)；

HindⅢ限制性内切酶(北京百灵克生物科技有限责任公司，R0104)；

MauBI限制性内切酶(北京百灵克生物科技有限责任公司，R0113S)。

试剂盒：

QIAquick Gel Extraction Kit(250)(北京强欣博瑞生物技术有限公司，28706)；

AxyPrep质粒提取试剂盒(Axygen，AP-MN-P-250)。

实施例1

1、玉米ACCase基因的获得

通过不同物种的ACC蛋白序列比对与系统进化树(图1)分析，获得玉米的同源基因ZmACC1(基因号：Zm00001d004125)，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

atgtcacagcttggattagccgcagctgcctcaaaggccttgccactactccctaatcgccagagaagttcagctgggactacattctcatcatcttcattatcgaggcccttaaacagaaggaaaagccgtactcgttcactccgtgatggcggagatggggtatcagatgccaaaaagcacagccagtctgttcgtcaaggtcttgctggcattatcgacctcccaagtgaggcaccttccgaagtggatatttcacatggatctgaggatcctagggggccaacagattcttatcaaatgaatgggattatcaatgaaacacataatggaagacatgcctcagtgtccaaggttgttgaattttgtgcggcactaggtggcaaaacaccaattcacagtatattagtggccaacaatggaatggcagcagcaaaatttatgaggagtgtccggacatgggctaatgatacttttggatctgagaaggcaattcaactcatagctatggcaactccggaagacatgaggataaatgcagaacacattagaattgctgaccaattcgtagaggtgcctggtggaacaaacaataataactacgccaatgttcaactcatagtggagatggcacaaaaactaggtgtttctgctgtttggcctggttggggtcatgcttctgagaatcctgaactgccagatgtattgaccgcaaaagggatcgtttttcttggcccacctgcatcatcaatgaatgctttgggagataaggtcggctcagctctcattgctcaagcagccggggtcccaactcttgcttggagtggatcacatgttgaagttccattagagtgctgcttagacgcgatacctgaggagatgtatagaaaagcttgcgttactaccacagaggaagcagttgcaagttgtcaagtggttggttatcctgccatgattaaggcatcctggggaggtggtggtaaaggaataagaaaggttcataatgatgatgaggttagagcgctgtttaagcaagtacaaggtgaagtccctggctccccaatatttgtcatgaggcttgcatcccagagtcggcatcttgaagttcagttgctttgtgatcaatatggtaatgtagcagcacttcacagtcgtgattgcagtgtgcaacggcgacaccagaagattattgaagaaggtccagttactgttgctcctcgtgagacagttaaagcacttgagcaggcagcaaggaggcttgctaaggctgtgggttatgttggtgctgctactgttgagtatctttacagcatggaaactggagactactattttctggaacttaatccccgactacaggttgagcatccagtcaccgagtggatagctgaagtaaatctgcctgcagctcaagttgctgttggaatgggcatacctctttggcagattccagaaatcagacgtttctatggaatggactatggaggagggtatgacatttggaggaaaacagcagctcttgctacaccatttaattttgatgaagtagattctcaatggccaaagggccattgtgtagcagttagaattactagtgaggacccagatgatggtttcaaacctactggtgggaaagtgaaggagataagttttaaaagcaagcctaatgtttgggcctacttctcagtaaagtctggtggaggcattcatgaatttgctgattctcagttcggacatgtttttgcatatgggctctctagatcagcagcaataacaaacatgactcttgcattaaaagagattcaaattcgtggagaaattcattcaaatgttgattacacagttgacctcttaaatgcttcagactttagagaaaacaagattcatactggttggctcgacaccagaatagctatgcgtgttcaagctgagaggcccccatggtatatttcagtggttgggggtgctttatataaaacagtaaccaccaatgcagccactgtttctgaatatgttagttatctcaccaagggccagattccaccaaagcatatatcccttgtcaattctacagttaatttgaatatagaagggagcaaatacacaattgaaactgtaaggactggacatggtagctacaggttgagaatgaatgattcaacagttgaagcgaatgtacaatctttatgtgatggtggcctcttaatgcagttggatggaaacagccatgtaatttatgcagaagaagaagctggtggtacacggcttcagattgatggaaagacatgtttattgcagaatgaccatgatccatcaaagttattagctgagacaccctgcaaacttcttcgtttcttggttgctgatggtgctcatgttgatgcggatgtaccatacgcggaagttgaggttatgaagatgtgcatgcctctcttgtcacctgcttctggtgtcattcattgtatgatgtctgagggccaggcattgcaggctggtgatcttatagcaaggttggatcttgatgacccttctgctgtgaaaagagctgagccatttgatggaatatttccacaaatggagctccctgttgctgtctctagtcaagtacacaaaagatatgctgcaagtttgaatgctgctcgaatggtccttgcaggatatgagcacaatattaatgaagtcgttcaagatttggtatgctgcctggacaaccctgagcttcctttcctacagtgggatgaacttatgtctgttctagcaacgaggcttccaagaaatctcaagagtgagttagaggataaatacaaggaatacaagttgaatttttaccatggaaaaaacgaggactttccatccaagttgctaagagacatcattgaggaaaatctttcttatggttcagagaaggaaaaggctacaaatgagaggcttgttgagcctcttatgaacctactgaagtcatatgagggtgggagagagagccatgcacattttgttgtcaagtctcttttcgaggagtatcttacagtggaagaactttttagtgatggcattcagtctgacgtgattgaaacattgcggcatcagcacagtaaagacctgcagaaggttgtagacattgtgttgtctcaccagggtgtgaggaacaaagctaagcttgtaacggcacttatggaaaagctggtttatccaaatcctggtggttacagggatctgttagttcgcttttcttccctcaatcataaaagatattataagttggcccttaaagcaagtgaacttcttgaacaaaccaaactaagtgaactccgtgcaagcgttgcaagaagcctttcggatctggggatgcataagggagaaatgagtattaaggataacatggaagatttagtctctgccccattacctgttgaagatgctctgatttctttgtttgattacagtgatcgaactgttcagcagaaagtgattgagacatacatatcacgattgtaccagcctcatcttgtaaaggatagcatccaaatgaaattcaaggaatctggtgctattactttttgggaattttatgaagggcatgttgatactagaaatggacatggggctattattggtgggaagcgatggggtgccatggtcgttctcaaatcacttgaatctgcgtcaacagccattgtggctgcattaaaggattcggcacagttcaacagctctgagggcaacatgatgcacattgcattattgagtgctgaaaatgaaagtaatataagtggaataagtgatgatcaagctcaacataagatggaaaagcttagcaagatactgaaggatactagcgttgcaagtgatctccaagctgctggtttgaaggttataagttgcattgttcaaagagatgaagctcgcatgccaatgcgccacacattcctctggttggatgacaagagttgttatgaagaagagcagattctccggcatgtggagcctcccctctctacacttcttgaattggataagttgaaggtgaaaggatacaatgaaatgaagtatactccttcgcgtgaccgccaatggcatatctacacactaagaaatactgaaaaccccaaaatgttgcatagggtgtttttccgaactattgtcaggcaacccaatgcaggcaacaagtttacatcggctcagatcagcgacgctgaagtaggatgtcccgaagaatctctttcatttacatcaaatagcatcttaagatcattgatgactgctattgaagaattagagcttcatgcaattaggacaggtcattctcacatgtatttgtgcatactgaaagagcaaaagcttcttgacctcattccattttcagggagtacaattgttgatgttggccaagatgaagctaccgcttgttcacttttaaaatcaatggctttgaagatacatgagcttgttggtgcaaggatgcatcatctgtctgtatgccagtgggaggtgaaactcaagttggactgtgatggccctgcaagtggtacctggagagttgtaactacaaatgttactggtcacacctgcaccattgatatataccgagaagtggaggaaatagaatcgcagaagttagtgtaccattcagccacttcgtcagctggaccattgcatggtgttgcactgaataatccatatcaacctttgagtgtgattgatctaaagcgctgctctgctaggaacaacagaacaacatattgctatgattttccgctggcctttgaaactgcactgcagaagtcatggcagtccaatggctctactgtttctgaaggcaatgaaaatagtaaatcctacgtgaaggcaactgagctagtgtttgctgaaaaacatgggtcctggggcactcctataattccgatggaacgccctgctgggctcaacgacattggtatggtcgcttggatcatggagatgtcaacacctgaatttcccaatggcaggcagattattgttgt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IDNO:2。

2、玉米ACCase突变位点的获得和植物表达载体的构建

选择玉米ZmACC1基因的核苷酸序列5’-GACCAGCCTATTATTTTAACAGG-3’，SEQ IDNO:3作为靶位点。利用CRISPR/Cas9介导的精准编辑进行碱基编辑。

以本实验室保存的基因编辑基础载体pCAMBIA3301为骨架载体进行构建。

ZmACC-CBE碱基编辑载体元件主要包括：

(1)由玉米Ubiquitin基因的启动子启动的nCas9(D10A)融合evoCDA1脱氨酶的蛋白表达框，以NOS terminator为终止子。(2)evoCDA1脱氨酶序列的N端加入一个核定位信号序列NLS(碱基序列为：5’AAGCGCCCCGCCGCCACCAAGAAGGCCGGCCAGGCCAAGAAGAAGAAG-3’，SEQID NO:4)。(3)evoCDA1脱氨酶以长度33个氨基酸的连接肽(氨基酸序列为：TDAEYVRIHEKLDIYTFKKQFSNNKKSVSHRCYVLFELKRRGERRACFWGYAVNKPQSGTERGIHAEIFSIRKVEEYLRDNPGQFTINWYSSWSPCADCAEKILEWYNQELRGNGHTLKIWVCKLYYEKNARNQIGLWNLRDNGVGLNVMVSEHYQCCRKIFIQSSHNQLNENRWLEKTLKRAEKRRSELSIMFQVKILHTTKSPAV，SEQ ID NO:5)连接在nCas9(D10A)的N端，nCas9(D10A)的C端连接一个UGI。(4)esgRNA(碱基序列为：5’-GTTTCAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTGAAATAAGGCTAGTCCGTTAT CAACTTGAACAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTcccggg-3’，SEQ ID NO:6)由RNA聚合酶Ⅲ类启动子ZmU6-2启动，以poly T终止。

通过同源重组将靶位点序列插入到ZmU6-2启动子与esgRNA骨架序列之间。靶位点扩增片段ZmU6-2、esgRNA扩增引物如下：

U6-HF:5’-CGGGTCACGCTGCACTGCAGAAGCTTCTAATTGGCCCTTACAAAAT-3’，SEQ ID NO:7；

U6-HR:5’-GAAACGTTAAAATAATAGGCTGGTCGGAGCGGTGGTCGCAGCTGAAC TTATAAG-3’，SEQ ID NO:8；

esgHF:5’-GACCAGCCTATTATTTTAACGTTTCAGAGCTATGCTGGAAACAGC-3’，SEQ ID NO:9；

esgHR:5’-CCCGGGAAAAAAGCACCGACTCGGTGCC-3’，SEQ ID NO:10。

通过同源重组后，将测序正确克隆质粒转化农杆菌EHA105，菌落PCR验证正确后用于玉米幼胚转化。

3、玉米幼胚遗传转化

将上述正确质粒导入农杆菌EHA105菌株；进行剥胚侵染、共培养、愈伤诱导、分化成苗、诱导生根的过程，最终获得阳性转化幼苗。具体步骤如下：

农杆菌介导的玉米遗传转化

(1)受体材料的处理

将玉米自交系KN5585种子浸泡水中37℃4h，在28℃平皿中萌发48h，将发芽后的种子置于装营养土的盆中培养，待授粉后10天，选取幼胚做为诱导愈伤组织材料。在操作台中将玉米幼穗用75％(体积分数)乙醇消毒10min，无菌水冲洗干净后，晾干。用手术刀切掉籽粒一半，然后用镊子将幼胚分离出来，放置无菌水中待用。

(2)愈伤组织诱导和继代培养

将幼胚放置N6培养基(BINDER，AA958)，28℃暗培养一周，将生长旺盛，颜色鲜艳的愈伤组织切成小块，放置在N6培养基上继续培养，每两周继代一次，保持愈伤组织的良好状态，并选取长势良好的愈伤组织，待用。

(3)农杆菌侵染

取出保存的农杆菌，接种摇菌，待OD₆₀₀值为0.8左右，5000r/min离心10min，收集菌体，用侵染buffer(1L侵染buffer是将4g含N6 vitamin的N6 Salts，2mg 2，4-D，100mg肌醇，0.7g L-脯氨酸，68.4g蔗糖，36g葡萄糖，1mL AgNO₃(10mg/mL)，1mL As(100mol/L)和水混匀得到的，PH5.2)悬浮菌体，使OD₆₀₀值为0.5左右，然后28℃，150r/min振荡0.5h，得到侵染液。将(2)中选取的长势良好的愈伤组织浸泡侵染buffer中1h，然后转移至含农杆菌的侵染液浸泡15min，晾干，得到侵染后的愈伤组织。

(4)共培养、恢复培养

将侵染后的愈伤组织放置共培养基(1L共培养基是将4g含N6 vitamin的N6Salts，2mg 2，4-D，30g蔗糖，8g琼脂，1mL AgNO₃(10mg/mL)，1mL As(100mol/L)，3mL L-半胱氨酸(100mg/mL)和水混匀得到的，PH5.8)，20℃培养3天，转至恢复培养基(1L恢复培养基是将4g含N6 vitamin的N6 Salts，2mg 2，4-D，0.7g L-脯氨酸，30g蔗糖，0.5gMES，4g植物凝胶，1mL AgNO₃(10mg/mL)，1mL头孢霉素(250mg/mL)和水混匀得到的，PH5.8)培养10天，然后转至加入草铵膦的恢复培养基筛选阳性愈伤组织。

(5)分化、再分化、生根、炼苗

将上述阳性愈伤组织转至诱导胚状体培养基(1L诱导胚状体培养基是将4.43g含MS vitamin的MS Salts(含肌醇)，0.25mg 2，4-D，30g蔗糖，5mg 6-BA，4g植物凝胶，1mLCefo(250mg/mL)和水混匀得到的，PH5.8)，暗培养2周，然后转至分化培养基(1L分化培养基是将4.43g含MS vitamin的MS Salts(含肌醇)，30g蔗糖，4g植物凝胶，1mL Cefo(250mg/mL)和水混匀得到的，PH5.8)，待长出绿苗后转移至生根培养基(1L生根培养基是将2.215g 1/2MS，30g蔗糖，51.55mg MS vitamin，4g植物凝胶和水混匀得到的，PH5.8)生根，长到一定高度，暴露在空气中炼苗培养3天，移苗。

(6)Bar试纸条筛选阳性植株

取植株叶片3厘米左右，放入管中研磨充分，加入500μl的buffer，插入Bar试纸条(上海佑隆生物科技有限公司，目录号：EnviroLogixAS03)，出现阳性条带的植株即为T0代阳性转基因植株。

4、玉米ACCase突变体的获得及分析

通过农杆菌介导的玉米幼胚遗传转化获得T0代阳性转基因植株，提取叶片DNA，分别扩增靶位点序列，进行sanger测序。研究发现，ZmACC1基因上发生了如下突变：

第5491、5492位碱基发生突变，由C突变为T，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。所获得材料命名为M1(图2)(第5487位也发生了突变，但该突变下氨基酸不变不产生影响)。

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IDNO:1。

突变后的氨基酸序列第1831位氨基酸由P突变为F。

T0通过测交获得T1代，后进一步自交获得无转基因元件插入，且突变位点纯合的M1突变体材料。

实施例2

玉米ACCase突变体材料的除草剂抗性

将获得的M1突变体材料播种在苗钵中，于两叶期分别喷施75μmol/L、150μmol/L、300μmol/L、600μmol/L浓度的精喹禾灵、精吡氟禾草灵和100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L、600μmol/L烯草酮除草剂，喷施后14天观察突变体材料的除草剂抗性。如图3所示。

结果表明，野生型对照材料在浓度为75μmol/L的精喹禾灵、精吡氟禾草灵和100μmol/L烯草酮除草剂处理后死亡，而M1突变体材料对精喹禾灵、精吡氟禾草灵和烯草酮除草剂具有抗性。

实施例3

田间实验

将获得的M1突变体材料播种在大田，于四叶期分别喷施300μmol/L浓度的精喹禾灵除草剂，喷施后14天观察突变体材料的除草剂抗性。如图4所示。结果表明，野生型对照材料在浓度为300μmol/L的精喹禾灵除草剂处理后死亡，而突变体材料对精喹禾灵除草剂具有抗性。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (6)

1.一种具有除草剂抗性的玉米ACCase突变型基因，其特征在于，为野生型玉米ZmACC1基因发生以下突变：第5491、5492位碱基发生突变，由C突变为T；

所述玉米ACCase突变型基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种表达盒，其特征在于，包括权利要求1所述的玉米ACCase突变型基因。

3.一种重组载体，其特征在于，包括权利要求1所述的玉米ACCase突变型基因。

4.权利要求1所述的玉米ACCase突变型基因、权利要求2所述的表达盒或权利要求3所述的重组载体在玉米抗除草剂方面的应用；

所述除草剂是ACCase抑制剂类除草剂。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述除草剂为精喹禾灵、精吡氟禾草灵或烯草酮。

6.一种使玉米获得除草剂抗性的方法，其特征在于，使玉米包含权利要求1所述的玉米ACCase突变型基因；

所述除草剂是ACCase抑制剂类除草剂。