KR100519477B1

KR100519477B1 - 트리크로산, 우르소데스옥시콜린산계 유도체 및 유백피추출물을함유한 치주질환 예방 및 치료제 조성물

Info

Publication number: KR100519477B1
Application number: KR10-1998-0031395A
Authority: KR
Inventors: 석재균; 김문무; 김상년; 김정훈; 박상기
Original assignee: 주식회사 엘지생활건강
Priority date: 1998-08-01
Filing date: 1998-08-01
Publication date: 2005-12-14
Anticipated expiration: 2018-08-01
Also published as: KR20000012854A

Abstract

본 발명은 트리크로산(triclosan), 우르소데스옥시콜린산(ursodesoxycholic acid)계 유도체 및 유백피 추출물(ulmus extract)을 함유한 치주질환 예방 및 치료제 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 치주질환 예방 및 치료제 조성물은 구강세균의 살균효과와 치주질환 예방 효과가 우수할 뿐만아니라, 치주질환을 치료할 수 있어서 구강 위생의 증진을 도모한다.

Description

트리크로산, 우르소데스옥시콜린산계 유도체 및 유백피추출물을 함유한 치주질환 예방 및 치료제 조성물

본 발명은 트리크로산(triclosan), 우르소데스옥시콜린산(ursodesoxycholic acid)계 유도체 및 유백피 추출물(ulmus extract)을 함유한 치주질환 예방 및 치료제 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 치주질환 예방 및 치료제 조성물은 구강세균의 살균효과와 치주질환 예방 효과가 우수할뿐만아니라, 치주질환을 치료할 수 있어서 구강 위생의 증진을 도모한다.

치주칠환은 임상적으로 치은염증과 출혈, 치주낭의 형성 및 치조골의 파괴등으로 인하여 치아의 상실을 가져오는 것을 말한다. 이러한 치주질환은 세균의 집락형성 및 세균의 치주조직침투, 치주조직이 파괴되는 과정으로 진행되는데, 먼저 구강내 타액중의 타액 단백질이 상아질과 백악질 표면에 흡착되면서 피막을 형성하고 이러한 피막표면에 주로 스트렙토코커스(Streptococcus)와 악티노마이시스 (Actinomyces)와 같은 세균이 성장하면서 프라그를 형성하고 시간이 경과함에 따라 이러한 프라그가 치근단 방향으로 이동함과 동시에 포피로모나스(Porphyromonas)와 악티노바실러스(Actinobacillus)와 같은 혐기성 그람음성균이 성장하여 이러한 세균, 세균성분, 세균산물들이 치은열구상피를 통하여 치은결합조직내로 침투하여 치주낭이 형성되고 이러한 세균의 대사결과 치주조직에 유독한 황화수소, 암모니아, 유독한 아민과 같은 세포의 독소를 분비함과 동시에 세포벽구성분인 리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharide)와 같은 내독소에 의하여 직접조직이 파괴되거나, 생체 면역계를 자극하여 자극된 체액성 및 세포성 면역계의 여러작용에 의하여 세포외부로 분비된 활성산소, 프로스타글란딘즈(Prostaglandins), 루코트리엔즈(Leukotri- ens), 히스타민(Histamine), 그리고 인터루킨즈(Interleuckins), 튜머 니크로시스 펙터 알파(Tumour Necrosis Factro α)와 같은 여러종류의 사이토카인(Cytokine) 등에 의하여 잇몸염증이 유발되고, 세균 및 백혈구로부터 분비된 콜라게나제와 같은 효소에 의하여 치주조직의 기질인 콜라겐이 분해되어 잇몸퇴축이 일어나고, 계속 방치하게 되면 치주질환으로 진행된다.

이러한 치주질환의 발생을 예방하기 위한 노력으로 치주질환균을 단시간 노출로 사멸시킬 수 있는 클로르헥시딘 글루코네이트(Chlorhexidine gluconate), 세틸피리디움 클로라이드(Cetylpyridium chloride) 및 상귀나린(Sanguinarine)과 같은 항균제가 개발되어 양치액 및 치약과 같은 구강제품에 적용되어 왔으나 아직까지도 치주질환의 발생은 근본적으로 예방하지 못하고 있는 실정이다.

그리하여 최근에는 국내에서도 몰약, 상백피, 승마, 녹차, 감초, 황금, 포공영, 금은화 등과 같은 생약추출물을 사용하여 치주질환을 억제시키려는 노력이 활발하게 일어나고 있으나 치주질환을 유발시키는데 있어 결정적인 역할을 하는 프로스타글란딘의 생성을 억제시키거나 치주조직을 분해시키는 콜라게나제의 활성을 억제시키는 식물추출물은 확인되지 않고 있는 실정이며 대개의 경우 프라그의 형성을 억제시키거나 항균, 소염, 수렴, 지혈, 혈액순환촉진과 같은 한방약재의 작용을 통하여 치주질환의 발생을 예방하는 정도이다.

현재까지 치주질환을 치료할 수 있는 방법으로 가장 널리 사용되고 있는 방법은 치주조직을 분해시키는 콜라게나제 효소의 활성을 억제시키거나 염증 유발물질인 사이토카인이나 프로스타글란딘의 생성을 억제시키는 약효제를 사용하는 것이다.

유럽 공개 특허 제 528468 A1 호는 트리크로산을 함유하는 치약 및 구강청정제를 개발하여 치주질환 유발물질인 프로스타글란딘의 생성을 억제하여 치주질환을 억제시킬 수 있다는 것을 확인하여 치주질환을 치료할 수 있는 방법을 제시하였고, USP 5356615 호에서는 트리크로산을 사용한 구강제품을 개발하여 프라그형성 억제에 우수한 효과가 있음을 제시한 바 있으며, USP 5571501 호에서도 트리크로산의 구강 미생물의 살균효과에 대한 효능을 제시한 바 있고, 또한 임상예방치과(Clinical Preventive Dentistry vol. 14(16), 1992)등에서는 트리크로산을 사용하여 프라그형성 억제 및 치주질환 예방효과 등을 제공하려 하였다. 미국 공개 특허 제 5,2308,895 A 호는 테트라사이크린(Tetracycline)을 함유하는 약효물질이 지속적으로 송달되는 시스템을 개발하여 치주조직을 분해시키는 콜라게나제의 효소활성을 억제함으로써 치주질환을 치료할 수 있다는 것을 확인하였고, 국내특허출원 제 96-61927 호와 제 96-69522 호에서는 유백피추출물이 치주조직을 분해시키는 콜라게나제의 효소활성을 억제함과 동시에 콜라겐의 합성을 촉진시켜 치주조직의 재생에 우수한 효과가 있음을 제시하였다. 그리고 치주질환에서 염증 유발물질인 사이토카인이나 프로스타글란딘의 생성을 억제시키는 약효제로 우르소데스옥시콜린산의 효능을 국내특허출원 제 96-30337 호와 제 96-30449 호에서 제시한 바 있다. 하지만 상기에서 소개한 약효제는 치주질환을 치료하는데 있어 치주질환 유발물질의 생성을 억제시킬 뿐만 아니라 치주조직분해효소의 활성을 억제시키며 동시에 잇몸염증을 유발하는 사이토카인이나 프로스타글란딘 등의 생성을 억제시키는 세가지 작용을 가지지 못하고 있어 치주질환을 완전히 치료하는데는 한계성을 가지고 있다. 특히 테트라사이크린의 경우는 장기간 사용시 부작용의 우려가 높아 부작용으로 구토, 위장관의 동통호소, 설사, 치아착색 등이 아주 자주 발생되며 임산부나 어린아이는 삼가해야 하는 한계성이 있고 그람음성균의 내성균주 발현도 문제가 될 수 있다.

이에 본 발명자들은 구강위생증진과 치주질환의 예방 및 치료를 위해서 구강유해미생물의 효과적인 살균과 잇몸염증을 매개하는 물질인 사이토카인이나, 프로스타글란딘의 생성을 효과적으로 억제하여 치주질환 유발물질의 생성을 억제하며, 치주조직분해효소의 활성을 억제시키고 치주조직의 재생을 촉진시키는 조성물을 찾고자 연구하었다. 이에 본 발명자들은 구강유해미생물에 대한 강한 살균효과를 가진 것을 실험을 통해 확인하였고 또 의학적, 독성학적 안전성을 인정받고 있는 트리크로산을 본 발명의 유효 살균제로 선정하였다. 또한 본 발명자들은 치주조직을 분해시키는 콜라게나제의 활성 측정법과 콜라겐합성 정량법을 확립하여 인체에 대한 안전성이 확보되어 있는 한방약재 및 식물추출물을 대상으로 탐색을 하여 콜라게나제의 활성을 억제시키고 콜라겐 합성을 촉진시키는데 우수한 효과를 나타낸 유백피추출물을 치주조직파괴를 방지하고 조직재생에 유효한 약효제로 선정하였다. 그리고 본 발명자들은 치주질환을 유발시키는 사이토카인인 튜머 니크로시스 펙터 알파 및 인터루킨즈의 메신저 알엔에이(massenger RNA) 단계의 정량법, 그리고 프로스타글란딘(PGE₂)의 정량법, 슈퍼옥사이드 생성 측정법과 같은 과학적인 방법을 사용하여 치주질환을 유발시키는 사이토카인 및 프로스타클란딘(PGE₂) 생성을 억제시키는데 탁월한 효능을 나타낸 우담 및 웅담의 약효성분인 우르소데스옥시콜린산(Ursodesoxycholic acid), 체노데스옥시콜린산(Chenodesoxycholic acid) 및 그의 유도체인 타우로우르소데스옥시콜린산(Taurodesoxycholic acid) 중 1종 이상을 치은염증의 예방 및 치료제로 선정하였다.

따라서 본 발명자들은 이들 세 약효제를 동시에 적용할 경우가 이들 약효제를 단독, 또는 두가지를 혼합하여 사용할 경우 보다 구강위생 증진과 치주질환 예방 치료에 그 효능, 효과를 극대화 시킬 수 있음을 확인하였고, 치주질환을 지닌 환자를 대상으로 하여 임상시험 결과 이들 유효성분을 단독 또는 두가지 약효제를 동시에 사용하는 것보다 이들 약효제 세가지를 동시에 사용할 경우에 효능이 극대화됨을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 조성물은 트리크로산 0.001 내지 1 중량%, 우르소데스옥시콜린산계 유도체 0.001 내지 1 중량% 및 유백피추출물 0.001 내지 3 중량%를 함유한다.

트리크로산은 2,4,4'-트리클로로-2'-히드록시디페닐 에테르로 구성되며, 세균의 세포막에서 항균활성을 가지며 치아잔류효과가 뛰어난 것으로 알려져 있다.

유백피는 한국의 중부이북과 중국에 분포하는 느릅나무과 식물인 비술나무(Ulmus pumila)의 줄기부분 또는 뿌리부분의 근피를 채취하여 햇볕에 말린 것으로, 약리작용으로 이수, 소종, 통림, 수종, 단독작용이 있는 것으로 알려져 있으며, 주요성분으로는 베타시토스테롤(β-Sitosterol), 식물스테롤, 및 탄닌 등으로 구성되어 있다. 유백피추출물은 느릅나무의 뿌리껍질의 극성 및 비극성 추출물 모두를 포함하며, 느릅나무는 비술나무(Ulmus pumila), 참느릅나무(Ulmus parvifolia Jacq.), 왕느릅나무(Ulmus macrocarpa Hance), 큰잎느릅나무(Ulmus macrocarpa var. amcrophylla Nak.), 당느릅나무(Ulmus davidiana Planch) 등의 모든 종류의 느릅나무를 통칭한다.

우담(Fel tauri, Bos taurus demesticus Gemlin 의 쓸개)과 웅담(Fel ursi, Selenarctos thibetanus G. Cuvi 등의 쓸개)은 인체에 대한 안전성이 확보되어 있고 생약제로서 이담, 진정, 진경, 만성간염, 인후종, 구활생창 및 소염 등에 효능이 알려져 있고, 주요 약효 성분으로 우르소데스옥시콜린산, 체노데스옥시콜린산 및 그의 유도체인 타우로우르소데스옥시콜린산을 포함한다.

이하 본 발명의 상세한 설명은 다음과 같다.

본 발명에 사용된 트리크로산은 그 함량이 전체 조성물에 대해서 0.001 내지 1 중량%내에서 일정비율로 혼합하여 사용하는 것이 바람직하다.

유백피의 생약추출물의 제조방법은 건조생약재를 음건 세절하고 분말화시켜 가루 50 g 에 95 % 에탄올 500 ml 를 가하여 3 일간 침적추출한후 1번 와트만지(Whatman No. 1)를 이용하여 그 추출물을 여과시킨다음 감압농축시킨 후 본 발명에 사용한다. 본 발명에 사용된 유백피 생약추출물의 함량은 각각 0.001 내지 3 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 1 중량%를 혼합하여 구강제품 조성물에 사용하는 것이 적당하다. 이 생약추출물의 함량이 각각 0.001 중량% 미만인 농도에서는 치주질환에 대한 효능, 효과를 기대할 수 없고 3 중량%를 초과할 경우에는 세가지 약효제에 의한 상승효과를 기대할 수 없다. 그리고 본 발명에 사용된 또 다른 유효성분인 우르소데스옥시콜린산, 체노데스옥시콜린산 및 그의 유도체인 타우로우르소데스옥시콜린산의 함량은 각각 또는 혼합하여 구강제품 조성물에 사용하는 것이 적당하다. 전체 조성물에 대하여 0.001 내지 1 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 0.1 중량%를 혼합한다. 우르소데스옥시콜린산계 유도체의 함량이 각각 0.001 중량% 미만인 농도에서는 치주염증에 대한 효능, 효과를 기대할 수 없고 1 중량%를 초과할 경우에는 세가지 약효제에 의한 상승효과를 기대할수 없다.

본 발명은 구강제품인 치약, 구강청정제, 구강용 연고제 등의 통상적인 성분에 치은염 발병의 원인 물질을 제거함과 동시에 면역학적인 치은염증의 치료 및 예방을 위하여 트리크로산과 유백피추출물 그리고 우르소데스옥시콜린산, 체노데스옥시콜린산 및 그의 유도체인 타우로우르소데스옥시콜린산 중에서 1종 이상을 유효 성분으로 하여 이들 물질을 동시에 적용하는 구강위생 증진 및 치주질환 예방 및 치료를 위한 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 다른 성분으로는 구강용 조성물의 종류 및 사용 목적에 따라 통상 사용하는 성분의 적당량을 사용하여 배합한다. 예를 들어 본 발명의 치약 조성물을 다음과 같은 방법으로 제조할 수 있다.

연마제 성분으로는 인산일수소칼슘, 침강실리카, 실리카젤, 중조, 탄산칼슘, 함수알루미나, 불용성메타인산나트륨, 피로인산나트륨 등을 1종 또느 2종 이상 혼합하여 1 내지 90 중량% 사용하며, 치아의 재석회화를 촉진시켜 치아의 조직을 강화시키는 약효제인 불소화합물로는 불화나트륨, 제일불화인산나트륨을 혼용 또는 단독 사용할 수 있고 그 함량은 0.01 내지 2.0 중량%가 적당하다. 함량이 0.01 중량% 이하의 농도에서는 효과가 없고 2.0 중량%를 초과할 경우에는 인체의 안전성에 영향을 줄 수 있기 때문에 구강용 제제로서 적합하지 못하다.

치약조성물의 상태유지 및 건조방지를 위하여 습윤제를 사용하는데, 이러한 습윤제로는 글리세린, 소리비톨액, 폴리에틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜 등이 있으며 단독 또는 2종 이상 혼합하여 20 내지 60 중량% 사용한다. 또한 치약 성분 중 액체와 고체성분을 결합시켜 치약의 형태를 유지하고 안정성을 확보하기 위하여 사용되는 것은 껌, 아카시아껌 등의 천연 또는 합성 고분자물질이며 그 사용량은 0.1 내지 5 중량%이다. 기포제는 연마제의 세정작용을 보완하며 약효제를 칫솔이 도달하기 힘든 부위까지 침투시켜 주는 것은 물론 기포를 발생시켜 양치감을 증대시켜 주는 역할을 하며 세정작용을 도와주고 약효제의 분산 및 침투를 빠르게 하고 계면장력을 감소시켜 주므로 구강내 이물질이 쉽게 떨어지는 작용을 한다. 주로 사용되는 기포제로는 음이온 계면활성제인 라우릴 황산나트륨, 알킬황산나트륨이 사용되고 보조적으로 비이온 계면활성제인 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 공중합체, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산, 알칸올아미드 지방산 에스테르, 수크로오스 지방산에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산에스테르, 폴리옥시에틸렌 지방산에스테르 및 폴리옥시에틸렌 아주까리경화유 유도체가 사용된다. 기포제의 사용량은 음이온 또는 비이온 계면활성제를 단독 또는 2 종 이상 혼용하여 0.5 내지 5 중량%를 사용하는 것이 바람직하다.

그 외에도 덥덥하거나 다소 쓴맛을 조절하기 위하여 향료와 감미제가 사용되는데 향료에는 주로 천연 향료인 페파민트와 스피아민트 오일이 많이 사용되며 치약 중에 0.1 내지 1 중량% 사용한다. 감미제는 합성 또는 천연의 비발효성 당 등이 주로 사용되며 대표적인 것으로는 삭카린나트륨, 아스파탐, 락토오스, 말토오스, 자이리톨 등이 있으며, 적당한 감미제로는 삭카린 감미제 등을 0.05 내지 1 중량% 사용하는 것이 바람직하다. 그리고 치약 조성물의 pH를 조정하는 완충제로는 정인산의 알카리금속염, 특히 제일 인산나트륨, 제2 인산나트륨, 제3 인산나트륨, 구연산 및 구연산나트륨, 인산, 염산, 수산화나트륨 그리고 피로인산나트륨 및 피로인산염 등을 사용할 수 있다. 치약 조성물의 제조 및 사용 중에 발생할 우려가 있는 미생물의 오염을 방지하기 위하여 일반적으로 식품 및 의약품에 사용이 허가되어 있는 파라옥시 안시향산메틸, 안식향산, 안식향산나트륨, 살리실산 등을 단독 또는 혼합하여 0.1 내지 0.5 중량% 사용한다.

본 발명의 다른 구강위생 증진 및 치주질환 예방 및 치료를 위한 조성물은 통상 그제품에 사용되는 성분의 적당랑을 사용하고 약효제로 트리크로산과 유백피추출물 그리고 우르소데스옥시콜린산, 체노데스옥시콜린산 및 그의 유도체인 타우로우르소데스옥시콜린산 중에서 1종 이상을 유효성분으로 하여 이들 세물질을 동시에 적용하여 사용하는 것을 특징으로 한다.

이하 실험예에서는 트리크로산, 유백피추출물 및 우르소데스옥시콜린산을 다음 표 1에 제시된 조성으로 함유한 실험군을 사용하여 살균효과 등에 대해 실험하였다.

[표 1]

<실험예 1. 실험군 1 내지 15의 구강미생물에 대한 살균효과>

실험에는 악티노마이시스 비스코서스(Actinomyces viscosus ATCC 15987)와 칸디다 알비칸스(Candida albicans ATCC 10231) 및 스트렙토코커스 무탄스(Streptococcus mutans ATCC 10449) 그리고 악티노바실러스 악티노마이세툼코미탄스(Actinobacillus actinomycetumcomitans ATCC 33384)와 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis ATCC 381)의 5 가지 균주들을 사용하였다.

이 균주들 중 Actinomyces viscosus ATCC 15987 과 Candida albicans ATCC 10231는 YM 배지(글루코스 10g/L, 효모 추출물 3g/L, 맥아 추출물 3g/L, 박토펩톤(bactopeptone) 5g/L)에서 배양하였고, Streptococcus mutans ATCC 10449 는 TH 배지 (토드 휴위트액(Todd Hewitt broth) 30g/L, 수크로스 50g/L)에서 배양하였으며, Actinobacillus actinomycetumcomitans ATCC 33384 와 Porphyromonas gingivalis ATCC 381 는 티오글리콜레이트 배지(Thioglycollate Medium)에서 배양하였다. 배양온도는 Actinomyces viscosus ATCC 15987 가 26 ℃로 혐기성 배양기에서 배양하였고, Candida albicans ATCC 10231 및 Streptococcus mutans ATCC 10449 는 37℃ 이며, Actinobacillus actinomycetumcomitans ATCC 33384 와 Porphyromonas gingivalis ATCC 381 는 37 ℃의 혐기성 배양기에서 배양하였다.

살균력시험은 이들 균주들을 계대배양하고, 24 시간 3 회에 걸친 전배양후 실시하였으며, 각각의 적절한 실헙군배지 9.9 ml에 실험군 약효제 0.1 ml를 첨가한후 1×10⁶ 의 균주를 접종하였다. 그리고 18 시간동안 배양한후 한천 희석법(agar dilution method)를 이용하여 콜로니 카운트(colony count)로 균주를 측정하였다.

<실험결과>

실험결과에서 실험군 2, 5, 7, 8, 9, 12, 14, 15, 16, 19, 21, 22에서 미생물의 성장이 관찰되지 않았으며, 이것은 트리크로산이 구강 미생물에 대해서 우수한 살균효과가 있음을 나타낸다.

<실험예 2. 실험군 1 내지 22 의 슈퍼옥사이드생성 억제효과>

전신질환이 없는 건강한 성인으로부터 구연산을 항응고제로 사용하여 채집된 정맥혈액을 1200 rpm 에서 10 분 동안 원심분리한 후에 일차적으로 중층의 백혈구농축액을 회수하여 이차적으로 RPMI 1640 배지와 1:1 의 비율로 희석한 후에 50 ml 의 원심분리관에 Ficoll-Paque 12 ml을 첨가한 후에 희석된 혈액 30 ml을 중층이 되도록 주의 깊게 첨가하여 1600 rpm 에서 30 분 동안 원심분리한 후에 혈청이 포함된 상층을 제거하고 단핵세포가 함유된 증층을 주의 깊게 회수한 다음에 3 배의 RPMI 1640 배지를 첨가하고 800 rpm 에서 10 분 동안 원심분리시킨다음 상등액을 버리고 RPMI 1640 배지를 10 ml 첨가하고 부드럽게 피펫팅한다음 800 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후에 상등액을 버리고 HBSS(HANKS' BALANCED SALT SOLUTION) 완충 용액을 첨가하여 피펫팅한 후에 사람의 단핵백혈구를 24-웰 프레이트에 10⁶ cell/well 되게 0.45 ml 분주하고 95 % 공기, 5 % CO₂, 100 % 습도 조건하에서 무균적으로 2 시간동안 배양한 후에, FMLP((N-Formyl-Met-Leu-Phe)를 10^-6 M 되게 0.05 ml 처리하고 37 ℃ 에서 14 분 동안 배양하여 세포를 자극한 다음에 80 μM 되게 0.1 ml 사이토크롬 C(Cytochrome C), 30 ㎍ 되게 0.1 ml 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(Superoxide dismutase), 실험군의 조성물을 0.1 ml 첨가하고, 나머지 총반응액이 0.9 ml 되게 HBSS(HANKS' BALANCED SALT SOLUTION)를 첨가한 후 37 ℃에서 10 분간 보온하고 자극물질인 식균화된 자이모산 A(Zymosan A)를 최종농도 1.3 mg/ml 되게 0.1 ml을 첨가하고 진탕하면서 37 ℃에서 90 분간 보온한 후에, 4 ℃에 10 분간 넣어 반응을 정지시킨 다음에 4 ℃, 1500 rpm, 10 분 동안 원심분리한 후 상등액을 550 nm 에서 광학밀도를 측정하고 슈퍼옥사이드 음이온의 생성량은 다음식에 의하여 계산된다.

이상의 시험결과에서 실험군 8, 15, 22에서 보는 바와 같이 트리크로산과 유백피 그리고 우르소데옥시콜린산을 동시에 처방하였을 경우에 슈퍼옥사이드 생성 억제효과가 이들을 단독으로 처방했을 경우보다 더 우수하게 나타났다. 이로 미루어 볼 때 트리크로산과 유백피 그리고 우르소데스옥시콜린산을 동시에 적용하였을 경우 슈퍼옥사이드 생성 억제효과를 상승시키는 것을 알 수 있다.

<실험예 3. 실험군 1 내지 22의 치주조직분해효소인 콜라게나제의 효소활성에 대한 억제효과>

본 발명 조성물을 가지고 치주조직분해효소인 콜라게나제에 대한 억제효과를 실시한 실험결과는 다음과 같다.

본 시험방법은 진행과정에서 치주질환원인균인 포피로모나스 진지발리스와 다핵성백혈구(Polymorphonucle leukocytes) 및 중성백혈구(Neutrophil)로 부터 분비된 치주질환환자의 타액과 치은열구액속에 함유된 콜라게나제 효소의 작용에 의하여 치주조직의 기질인 콜라겐이 분해되어 잇몸퇴축이 일어나는 생체구강환경을 모방한 실험방법이다. 1.5 ml 에펜돌프튜브(Eppendorf)에 2 %의 적색콜라겐 기질인 아조콜(Azocoll)용액 100 ㎕를 각각 참가하여 한 개의 에펜돌프튜브는 블랭크(Blank)로 사용하고 3 개의 튜브에는 시그마 사로부터 구입한 콜라게나제 타입 1인 표준효소용액(콜라겐 분해활성도: 315 units /mg)을 10, 100, 200 ppm 되게 첨가하고 실험군튜브의 각각에 치주질환 환자의 타액과 치은열구액으로부터 세파릴(Sepharyl) S-200 크로마토그래피를 통하여 순수분리된 콜라게나제 효소 100 ㎕를 첨가하여 튜브 각각에 본 발명 조성물(실험군 1 내지 22)을 10 ㎕ 처리한 후 완충용액(0.05 M Tris-HCl, 1 nM CaCl₂, 7.8)를 총반응액이 500 ㎕ 되게 첨가하여 37 ℃ 항온기에서 18 시간 동안 반응시키고 에펜돌프튜브를 10000 g에서 5 분 동안 원심분리시켜 분해되지 않은 콜라겐은 침전시키고 분해된 콜라겐을 함유하는 상등액을 취하여 540 nm에서 흡광도를 측정하여 표준활성도 곡선을 작성하고 표준곡선으로부터 효소의 활성농도를 환산하여 효소활성도를 평가하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

이상의 시험결과에서 실험군 8, 15, 22에서 보는 바와 같이 트리크로산과 유백피추출물 그리고 우르소데스옥시콜린산을 동시에 처방하였을 경우에 콜라게나제 활성에 대한 억제효과가 이들을 단독으로 처방했을 경우 보다 더 우수하게 나타났다. 이로 미루어 볼때 트리크로산과 유백피 그리고 우르소데스옥시콜린산을 동시에 처방하였을 경우에 콜라게나제 활성에 대한 억제효과를 상승기키는 것을 알 수 있다.

<실험예 4. 실험군 1 내지 22 의 단핵 백혈구의 튜머 니크로시스펙터 알파 생성에 대한 억제효과 >

혈액에서 분리한 혈액 단핵백혈구를 24-웰 프레이트에 0.8 ml 첨가하여 10⁶ Cell/well 되도록 분주하고 RPMI 1640 배지 200 ㎕를 첨가한 웰을 실험군으로 하여 24 시간 동안 배양하였다. 튜머 니크로시스펙터 알파의 항체가 부착된 96-웰 프레이트의 웰에, 표준용액(0, 10.24, 25.6, 64, 160, 400 pg/well)을 50 ㎕ 첨가한다음 실험군 웰에 상기의 세포배양액 50 ㎕ 첨가하고, 모든 웰에 50 ㎕의 비오틴일화 항체 시약(Biotinylated Antibody Reagent)를 첨가한 다음 25 ℃ 에서 2 시간 동안 유지시킨 후 세척완충용액으로 3회 세척하고, 스트렙타비딘(Streptavidin)-H 콘주게이트(Conjugate)를 모든 웰에 첨가하여 다시 25 ℃에서 30 분 동안 유지시킨 후 다시 세척완충용액으로 3번 세척하고 100 ㎕ 의 효소 기질을 즉시 첨가하고, 25 ℃, 암실에서 플레이트의 뚜껑을 열어둔 채로 30 분 동안 유지시키고 0.18 M 황산 100 ㎕를 첨가한 후 마이크로프레이트판독기로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 표준용액의 흡광도 값으로 표준곡선(Standard Curve)을 작성하여 실험군의 인터루킨 생성랑을 산정한다.

E. coli LPS로 자극한 사람 단핵백혈구의 튜머 니크로시스 펙터 알파 생성에 대한 효능, 효과를 시험한 결과, 실험군 8, 15, 22 에서 보는 바와 같이 트리크로산과 유백피 그리고 우르소데스옥시콜린산을 동시에 처방하였을 경우에 투머 니크로시스 펙터 알파의 생성 억제효과가 이들을 단독으로 처방했을 경우보다 더 우수하게 나타났다. 이로 미루어 볼 때 트리크로산과 유백피 그리고 우르소데스옥시콜린산을 동시에 처방하였을 경우에 튜머 니크로시스 펙터 알파의 생성 억제효과를 상승시키는 것을 알 수 있다.

<실험예 5. 실험군 1 내지 22 의 단핵백혈구의 인터루킨(IL-1 β) 생성에 대한 억제효과 >

혈액에서 분리한 혈액 단핵백혈구를 24-웰 프레이트에 첨가한 웰을 대조군, E. coli LPS(250 ppm) 100 ㎕를 첨가한 웰 및 LPS(250 ppm) 100 ㎕와 본 발명의 조성물 100 ㎕를 첨가한 웰을 실험군으로 하여 18 시간 동안 배양한다. 인터루킨(IL-1 β)의 항체가 부착된 96-웰 프레이트의 웰에, 표준용액(0, 10.24, 25.6, 64, 160, 400 pg/well)을 50 ㎕ 첨가한다음 실험군 웰에 상기의 세포배양액 50 ㎕를 첨가하고, 모든 웰에 50 ㎕의 비오틴일화 항체 시약을 첨가한 다음 25 ℃에서 3 시간 동안 유지시킨 후 세척완충용액으로 3 회 세척하고, 스트렙타비딘-HRP 콘주게이트를 모든 웰에 첨가하여 다시 25℃ 에서 30 분 동안 유지시킨 후 다시 세척완충용액으로 3 번 세척하고 100 ㎕ 의 효소기질을 즉시 첨가하고 25 ℃, 암실에서 프레이트의 뚜껑을 열어둔 채로 30 분 동안 유지시키고 0.18 M 황산 100 ㎕를 첨가한 후 마이크로프레이트판독기로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 표준용액의 흡광도 값으로 표준 곡선을 작성하여 실험군의 인터루킨 생성량을 산정한다.

E. coli LPS 로 자극한 사람 단핵백혈구의 IL-1 β생성에 대한 효능, 효과를 시험한 결과, 실험군 8, 15, 22 에서 보는 바와 같이 트리크로산과 유백피 그리고 우르소데스옥시콜린산을 동시에 처방하였을 경우에 IL-1 β의 생성 억제효과가 이 들을 단독으로 처방했을 경우보다 더 우수하게 나타났다. 이로 미루어 볼때 트리크로산과 유백피 그리고 우르소데스옥시콜린산을 동시에 처방하였을 경우 IL-1 β의 생성 억제효과를 상승시키는 것을 알 수 있다.

<실험예 6. 실험군 1 내지 22 의 단핵 백혈수의 프로스타글란딘(PGE₂) 생성에 대한 억제효과 >

조성물을 가지고 치주질환 유발물질인 프로스타글란딘의 생성에 대한 억제효과를 실시한 실험결과는 다음과 같다. 본 시험방법은 치주질환 진행과정에서 치주질환원인균인 포피로모나스 진지발리스의 세포벽 구성분인 리포폴리사카라이드로 사람의 단핵백혈구를 자극하여 유발된 프로스타글란딘(PGE₂)의 생성을 비교 평가하였다. 구체적인 시험방법은 염소의 항-마우스 lgG를 부착시킨 96-웰 프레이트의 블랭크 웰에 50 ㎕ 완충액(0.9 % NaCl, 0.1 % 소혈청 알부민, 0.5 % 카톤(Kathon)을 함유하는 0.1 M 인산완충용액)을 첨가하고, 표준(0, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320 pg) 웰에는 50 ㎕의 적당농도의 표준용액을 첨가한 다음 본 발명 조성물 50 ㎕를 실험군으로 설정된 웰에 첨가하고, 50 ㎕의 PGE₂ 에 대한 항체를 블랭크 웰을 제외한 모든 웰에 첨가한 후 50 ㎕의 PGE₂콘쥬게이트 퍼옥시다제를 블랭크웰을 제외한 모든 웰에 첨가하고 96웰-프레이트를 덮고 25 ℃에서 1 시간 동안 유지시킨 후 세척완충용액(0.05% 트윈 20을 함유하는 인산완충용액: pH 7.5)로 4 번 세척하고 상온에서 150 ㎕의 효소기질 (20%의 디메틸포르마이드에 용해된 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘/과산화수소)를 즉시 첨가하고 25 ℃에서 30 분 동안 유지시키고 1 M 황산 100 ㎕를 첨가한 후 마이크로프레이트판독기로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 표준용액의 흡광도 값으로 표준 곡선을 작성하여 실험군의 프로스타글란딘 생성량을 산정한다.

E. coli LPS로 자극한 사람 단핵백혈구의 PGE₂생성에 대한 효능, 효과를 시험한 결과, 실험군 8, 15, 22에서 보는 바와 같이 트리크로산과 유백피 그리고 우르소데스옥시콜린산을 동시에 처방하였을 경우에 PGE₂의 생성 억제효과가 이들을 단독으로 처방했을 경우보다 더 우수하게 나타났다. 이로 미루어 볼 때 트리크로산과 유백피 그리고 우르소데스옥시콜린산을 동시에 처방하였을 경우 PGE₂의 생성 억제효과를 상승시키는 것을 알 수 있다.

<실험예 7. 실험군 1 내지 22 의 치은섬유아세포의 폴라겐 단백질 생성에 대한 효과>

일차 배양(Primary Culture)한 치은섬유아세포를 24-웰 프레이트에 10⁶ cell/well 되도록 분주한 다음 10% FBS가 함유된 DMEM 배지에서 하루동안 배양한 후 다음날 기존의 배지를 신선한 배지로 교체하여 24 시간 동안 배양한 후에 HBSS 완충용액으로 바닥에 붙은 세포층을 세척한 다음 혈청과 프롤린이 포함되지 않은 MEM 배지 0.8 ml를 첨가한 다음 본 발명 조성물을 처리한 후 ¹⁴C-프롤린(10 μCi) 100 ㎕를 포함한 배양액으로 세포를 배양하여, 24 시간이 경과한 후에 총단백질과 콜라겐 단백질을 측정하였다. 먼저 세포외 총단백질의 합성량을 측정하기 위하여 각 웰의 배양액을 한쪽 끝을 봉인한 투석관에 넣고 다른쪽 끝을 봉인하여 냉 완충액(Tris-HCl 0.05 mol/L, NaCl 0.2 mol/L, CaCl₂ 0.05 mol/L, 페닐메틸술포닐 플루오라이드 0.3 mN)로 24시간 투석을 완료한 다음 각각 100 ㎕를 취하여 카운팅 바이알(Counting Vial)에 담아 10 ml의 신틸레이션 칵테일(Scintillation coctail)을 넣어 액체 신틸레이션 카운터(Liquid Scintillation Counter(LSC))로 1 분간 방사능을 측정하였다. 세포내 총단백질의 합성량을 측정하기 위하여 세포배양액을 제거한 각 웰에 0.1 N NaOH 및 페닐메틸술포닐 플루오라이드 0.3 mN를 첨가한 다음 60 ℃에서 3분 동안 유지하여 세포막을 파괴시킨 후 세포균질액을 한 쪽 끝을 봉인한 투석관에 넣고 다른쪽 끝을 봉인하여 냉 완충액(Tris-HCl 0.05 mol/L, NaCl 0.2 mol/L, CaCl₂ 0.05 mol/L, 페닐메틸술포닐 플루오라이드 0.3 mN)로 24시간 투석을 완료한 다음 각각 100 ㎕를 취하여 카운팅 바이알에 담아 10 ml의 신틸레이션 칵테일을 넣어 액체 신틸레이션 카운터로 1 분간 방사능을 측정하였다. 세포내·외 콜라겐 단백질의 합성량을 측정하기 위하여 투석을 완료한 세포배양액 및 세포균질액을 각각 100 ㎕ 취하여 1.5 ml 마이크로튜브에 넣고 콜라게나제 완충액(0.5 M Tris-HCl, 1 mN CaCl₂, 0.3 mN 페닐메틸술포닐 플로오라이드), 콜라게나제 효소(100 ppm) 100 ㎕를 첨가한 후에 3 시간 동안 37 ℃에서 유지시켜 콜라겐을 완전히 분해시킨 다음에 분해되지 않은 단백질을 제거하기 위하여 50 %의 트리클로로아세트산 및 1 % 타닌산를 함유하는 용액을 500 ㎕ 첨가한 다음에 4 ℃에서 30 분 동안 침전시킨 후에 1000×g에서 5 분간 원심분리시킨 다음에 상등액을 분리시킨 다음에 100 ㎕를 취하여 카운팅 바이알에 담아 10 ml의 신틸레이션 칵테일을 넣어 LSC로 1분간 방사능을 측정하였다.

사람의 섬유아세포의 콜라겐 합성에 대한 효능, 효과를 연구하기 위하여 ¹⁴C-프롤린을 포함한 세포배양액에 본 발명 조성물을 처리한 결과, 실험군 8, 15, 22 에서 보는 바와 같이 트리크로산과 유백피 그리고 우르소데스옥시콜린산을 동시에 처방하였을 경우에 콜라겐 합성 촉진효과가 이들을 단독으로 처방했을 경우보다 더 우수하게 나타났다. 이로 미루어 볼 때 트리크로산과 유백피 그리고 우르소데스옥시콜린산을 동시에 처방하였을 경우 콜라겐 합성 촉진효과를 상승시키는 것을 알 수 있다.

구강위생 증진과 치주질환 예방 및 치료를 위해서 살균효과 및 치주질환 예방 효과가 우수한 트리크로산과 치주질환의 억제를 위하여 치주조직의 기질인 콜라겐 단백질을 분해하는 콜라게나제 효소의 활성을 억제시킴과 동시에 콜라겐 단백질 합성을 촉진시키는 유백피추출물, 그리고 또 다른 성분으로 슈퍼옥사이드, 프로스타클란딘(PEG₂), 튜머 니크로시스 펙터 알파, 인터루킨-1 β의 생성을 억제하여, 치주질환을 치료하는 데스옥시콜린산 중에서 1 종 이상을 유효성분으로 하여 이들 물질을 동시에 적용하였을 경우 앞서 실험한 실험항목에서 나타난 것과 같이 구강위생증진과 치주질환에 대한 상당한 상승효과를 확인할 수 있다.

<실시예 1 내지 9 및 비교예 1 내지 3>

이하는 본 발명을 자세히 설명하기 위한 실시예 및 비교예로서 치약 조성물의 예이다. 실험예의 실험군을 첨가한 치약을 사용하여 프라그형성 억제효과 실험 및 치은염증 형성억제효과 실험을 실시하였다. 이들 치약조성물의 제조순서는 다음과 같다. 습윤성분인 소르비톨액에 카르복시메틸셀루로오스 나트륨, 사카린, 방부제 등 분말성분을 분산시키고 정제수로 묽힌 다음 혼합기에서 1차 혼합하고 그 다음에 인상일수소 칼슘 등의 연마제와 약효제를 투입하고 혼합하였다. 그리고 마지막으로 기포제인 알킬황산 나트륨, 안전제류, 향료성분을 넣고 진공상태하에서 혼합함으로써 치약조성물을 제조하였다.

실험방법은 먼저 피검자를 선별한 후 구강검진에 대한 설명을 해준다음 실시예 및 비교예 각각에 피검자를 무작위 10 명씩을 나누고 올바른 잇솔질 방법을 교육시킨 후 구강검진을 실시하여 치태지수(Quigley-Hein Index modified by Turesky) 및 치은염 지수(Gingival Bleeding Index, Loe-Silness Index)를 측정한다. 그리고 실험군 전 치아에 대하여 스케일링을 실시한 후 대조 치약을 2 주일 사용토록 한 다음 구강검진을 실시하고, 이 때 치태지수 및 치은염 지수를 초기치로 하였다. 실시예 치약 및 비교예 치약을 각 피검자에게 나누어 주고 잇솔질은 평상시와 동일한 방법으로 1 일 3 회 6 개월간 실시토록 하고 구강검진을 실시하여 치태지수 및 치은염 지수를 점수화 하였다. 실험결과는 실험군의 초기치와 6개월 후 점수를 비교하여 각각 T-test로 통계적 유의성을 검정하였다.

<실험결과>

<논의>

1. 실시예 1 내지 9 와 비교예 1 내지 3 을 6개월간 사용 후 치태지수를 측정하여 통계적으로 유의차 검정을 한 결과 치태형성억제 효과에 있어서 실시예 1 내지 9 와 비교예 1 내지 3 에서 사용전과 사용후에서 유의한 효과가 있음이 확인되었고 우르소체스옥시콜린산과 유백피추출물 그리고 트리크로산을 동시에 처방한 경우 프라그형성 억제효과가 탁월하여 단독으로 사용하는 것보다 혼용하여 사용하는 것이 월등히 좋은 것으로 나타났다.

2. 실시예 1 내지 9 와 비교예 1 내지 3 을 6 개월간 사용 후 치은염 지수를 측정하여 통계적으로 유의차 검정을 한 결과 치은염 완화 효과에 있어서 실시예 1 내지 9 와 비교예 1 내지 3 에서 사용전과 사용후에서 유의한 효과가 있음이 확인 되었고 우르소데스옥시콜린산과 유백피추출물 그리고 트리크로산을 동시에 처방한 경우 치은염 완화 효과가 탁월하여 단독으로 사용하는 것보다 혼용하여 사용하는 것이 월등히 좋은 것으로 나타났다.

<실시예 10. 잇몸 연고의 제조>

다음 조성으로 잇몸 연고를 제조하였다.

<실시예 11. 구강 청정제의 제조>

다음 조성으로 구강 청정제를 제조하였다.

실시예 10 내지 11 에 있어서 공히 프라그형성 억제 효과 및 치은염증 완화 효과가 우수한 결과를 얻었다.

본 발명의 치주질환 예방 및 치료제 조성물은 프라그 형성 억제 및 치은염증 형성 억제 효과가 우수하여 구강세균의 살균효과와 치주질환 예방 효과가 우수할 뿐만아니라, 치주질환을 치료할 수 있어서 구강 위생의 증진을 도모한다.

Claims

트리크로산 0.001 내지 1 중량%, 우르소데스옥시콜린산계 유도체 0.001 내지 1 중량% 및 유백피 추출물 0.001 내지 3 중량%를 함유하며, 상기 우르소데스옥시콜린산계 유도체가 우르소데스옥시콜린산, 체노데스옥신콜린산, 타우로우르소데스옥 시콜린산 또는 이들의 혼합물인 치주질환 예방 및 치료제 조성물.
제 1항에 있어서, 유백피 추출물이 느릅나무의 뿌리 껍질의 에탄올 추출물을 포함하며, 이 느릅나무가 비술나무, 참느릅나무, 왕느릅나무, 큰잎 느릅나무 및 당느릅나무 중에서 선택되는 치주질환 예방 및 치료제 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 조성물의 제형이 페스트제, 연고, 액제, 젤 또는 분무제인 치주질환 예방 및 치료제 조성물.