JP3140412B2 - 牛膝または楡白皮抽出物を含有する口腔用組成物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は牛膝または楡白皮抽
出物を含有する口腔用組成物に関する。更に具体的に、
本発明は牛膝または楡白皮から抽出された、歯周疾患に
対し治療効果の優れた牛膝または楡白皮抽出物中から少
なくとも一つを有効成分として含有する口腔用組成物に
関する。本発明の組成物の一例として歯磨組成物と軟膏
剤組成物等が挙げられる。

【０００２】

【従来の技術】歯周疾患とは臨床的に歯肉炎症と出血、
歯周嚢の形成および歯槽骨の破壊等により歯牙の喪失を
もたらすことをいう。かかる歯周疾患は、細菌の集落形
成および細菌の歯周組織浸透、歯周組織の破壊からなる
一連の過程で進行されるが、まず口腔内唾液中の唾液蛋
白質が象牙質と白亜質表面に吸着されつつ皮膜を形成
し、このような皮膜表面に主にストレプトコッカス（St
reptococcus)とアクチノミセス (Actinomyces)のような
細菌が成長しつつプラークを形成し、時間が経過するに
つれてこのようなプラークが歯根端方向に移動すると同
時にポーフィロモナス (Porphyromonas)とアクチノバチ
ルス (Actinobacillus) のような嫌気性グラム陰性菌が
成長してかかる細菌、細菌成分、細菌産物らが歯肉列口
（pocket）上皮を通して歯肉結合組織内に浸透して歯周
嚢が形成され、かかる細菌の代謝結果、歯周組織に有毒
な硫化水素、アンモニア、アミンのような細胞の毒素を
分泌すると同時に、細胞壁構成成分であるリポ多糖のよ
うな内毒素によって直接組織が破壊されるか、同時に生
体免疫体を刺激し、刺激された体液性および細胞性免疫
系の種々の作用によって細胞外部に分泌された活性酸
素、プロスタグランジン、ロイコトリエン、ヒスタミ
ン、インターロイキン等のような種々のサイトカイン等
によって歯肉炎症が誘発され、細菌および白血球から分
泌されたコラゲナーゼのような酵素によって歯周組織の
基質であるコラーゲンが分解され歯肉退縮が起こり、継
続放置すると歯周疾患に進行する。

【０００３】かかる歯周疾患の発生を予防するための努
力として、歯周疾患菌を短時間露出させ死滅させること
のできるクロロヘキシジングルコネート、セチルピリダ
ムクロライド（cetylpyridum chloride ）、サングイナ
リン（sanguinarine）およびトリクロサン（triclosan
）のような抗菌剤と、トリアムシノロンアセトニド（t
riamcinolone acetonido ）のような消炎剤が開発さ
れ、歯磨き液、歯磨、軟膏のような口腔製品に適用され
て来たが、未だに歯周疾患の発生は根本的に予防できな
い実情である。

【０００４】そこで最近は、韓国国内においても没薬、
桑白皮、升麻、緑茶、甘草、黄ごん、蒲公英、金銀花、
トウモロコシのような生薬抽出物を使用して歯周疾患を
抑制しようとする努力が活発に行われているが、歯周疾
患の誘発に決定的な役割のプロスタグランジンの生成を
抑制させるか、歯周組織を分解させるコラゲナーゼの活
性を抑制させる植物抽出物は確認できない実情であり、
殆どの場合、プラークの形成を抑制するか、抗菌、消
炎、収斂、止血、血液循環促進のような漢方薬剤の作用
で歯周疾患の発生を予防するに過ぎない。現在まで歯周
疾患の治療方法として最も広く使用されているのは、歯
周組織を分解させるコラゲナーゼ酵素の活性を抑制する
か、或いは歯周疾患誘発物質であるプロスタグランジン
の生成を抑制する薬理学的活性成分を使用する方法であ
る。

【０００５】かかる方法の例として、米合衆国特許第５
２３０８９５号にはテトラサイクリンを含有する薬効物
質が持続的に送達されるシステムを開発して歯周組織を
分解させるコラゲナーゼの酵素活性を抑制することによ
って歯周疾患が治療できると記述されており、ヨーロッ
パ公開特許第５２８４６８ Ａ１号にはトリクロサン
（triclosan ）を含有する歯磨および口腔清浄剤で歯周
疾患誘発物質であるプロスタグランジンの生成を抑制し
て歯周疾患を抑制することによって歯周疾患が治療でき
る方法が提示されている。

【０００６】しかし、上記の薬理学的活性成分は、歯周
疾患の治療過程で歯周疾患誘発物質の生成を抑制すると
いう作用と歯周組織分解酵素の活性を抑制するという作
用との二つの作用の中で一つの作用のみを有するので、
歯周疾患を完全に治療するに限界があるだけでなく、合
成物質であるので長期間使用する場合、種々の副作用の
恐れがある。特に、テトラサイクリンは普通２５０ｍｇ
（１錠）を１日４回投与して１日に総１０００ｍｇずつ
を５〜７日間投与する。一般的にテトラサイクリンを投
与すると臨床的に、また細菌学的に定常的な状態まで好
転しているのが報告されており、歯石除去後テトラサイ
クリンを１日投与する場合、相当によい効果を示すとの
結果が出ている。低濃度の長期投与についての研究報告
書をみると、テトラサイクリンを１日１０００ｍｇずつ
２週間投与した後、２５０ｍｇを１日１回ずつ４８週間
続いて投与すると、臨床的に歯肉炎が減少され、歯肉縁
下歯垢中運動性菌株がなくなり、歯周嚢深さや細菌付着
度喪失が減少される結果が示されるものと報告された。
しかし、低濃度のテトラサイクリンを長期間使用すると
グラム陰性菌の耐性発現がしばしば起こることになり、
かかる耐性菌株の発現は抗生剤投与を中止する場合にも
しばしば発生するので非常に注意しなければならない
し、副作用としては嘔吐、胃腸管の疼痛呼訴、下痢、歯
牙着色等がしばしば発生し、妊産婦や子供には禁止しな
ければならないなどの問題がある。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】そこで本発明者らは、
長期間の使用にも副作用や毒性が殆どないと同時に優れ
た歯周疾患治療効果を示す物質を見出すため、多様な漢
方薬剤および植物抽出物を対象として歯周組織を分解さ
せるコラゲナーゼの活性測定法と歯周疾患を誘発させる
インターロイキン−１β（interleukins- １β）および
プロスタグランジン (ＰＧＥ₂ ) の定量法、スーパーオ
キシド生成測定方法、コラーゲン合成定量法のような科
学的な方法を利用してコラゲナーゼの活性を抑制させる
か、インターロイキン−１β（interleukins- １β）お
よびプロスタグランジン生成を抑制させるに卓越した効
能を示し、コラーゲン合成を促進させる漢方および植物
抽出物をスクリーニングした。その結果、後述の通り、
牛膝または楡白皮の特定抽出物が歯周疾患誘発物質の生
成を抑制すると同時に、歯周組織分解酵素の活性を抑制
させると共にコラーゲン合成を促進させる効果のあるこ
とを確認し、本発明を完成するに至った。

【０００８】すなわち、本発明は、以下のとおりであ
る。 （１）牛膝抽出物、楡白皮抽出物またはこれらの混合物
を含有する口腔用組成物。 （２）抽出溶媒が水、メタノール、エタノール、プロパ
ノールまたはブタノールであることを特徴とする（１）
に記載の組成物。 （３）口腔用組成物が歯磨組成物である（１）に記載の
組成物。 （４）牛膝抽出物および楡白皮抽出物を各々単独に０．
００１〜５重量％含有することを特徴とする（３）に記
載の組成物。 （５）牛膝抽出物および楡白皮抽出物を各々単独に０．
０１〜３重量％含有することを特徴とする（３）に記載
の組成物。 （６）牛膝抽出物および楡白皮抽出物を共に混合して
０．００２〜１０重量％含有することを特徴とする
（３）に記載の組成物。 （７）更に研磨剤としてリン酸１水素カルシウム、沈降
シリカまたは炭酸カルシウムを各々２０〜６０重量％含
有することを特徴とする（３）に記載の組成物。 （８）更にフッ素化合物としてフッ化ナトリウム及び／
または第１フッ化リン酸ナトリウムを各々０．１〜２重
量％含有することを特徴とする（３）に記載の組成物。 （９）口腔用組成物が歯周疾患治療用軟膏剤である
（１）に記載の組成物。 （１０）組成物の総重量を基準として牛膝抽出物を０．
００１〜５重量％の比で含有することを特徴とする
（９）に記載の組成物。 （１１）組成物の総重量を基準として楡白皮抽出物を
０．００１〜５重量％の比で含有することを特徴とする
（９）に記載の組成物。 （１２）組成物の総重量を基準として牛膝抽出物と楡白
皮の混合物を０．００２〜１０重量％の比で含有するこ
とを特徴とする（９）に記載の組成物。 （１３）更に界面活性剤、可溶化剤、湿潤剤、薬効伝達
剤、緩衝剤、防腐剤、甘味剤および香料のうち、いずれ
か１種または２種以上を配合させた（９）〜（１１）の
いずれかに記載の組成物。 （１４）界面活性剤としてポリオキシエチレン−ポリオ
キシプロピレン共重合体を組成物の総重量を基準として
５〜３０重量％の比で配合させた（１３）に記載の組成
物。 （１５）可溶化剤として低級アルコール溶媒を組成物の
総重量を基準として１〜２０重量％の比で配合させた
（１３）に記載の組成物。 （１６）湿潤剤としてグリセリン、ソルビトール液、ポ
リエチレングリコール２００、ポリエチレングリコール
４００、ポリエチレングリコール６００およびポリエチ
レングリコール１０００、プロピレングリコール、ポロ
サマーおよびモノグリセリドから選択された１種または
２種以上の成分を組成物の総重量を基準として５〜４０
重量％の比で配合させた（１３）に記載の組成物。 （１７）薬効伝達剤としてゼラチンまたはペクチンまた
はこれらの混合物を組成物の総重量を基準として１〜３
０重量％の比で配合させた（１３）に記載の組成物。 （１８）緩衝剤として第１リン酸ナトリウム、第２リン
酸ナトリウム、第３リン酸ナトリウム、クエン酸および
クエン酸ナトリウム、リン酸、塩酸、水酸化ナトリウム
およびピロリン酸ナトリウムおよびピロリン酸塩から選
択された１種または２種以上の成分を配合させｐＨを
５．０〜８．０に調整した組成物。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明の目的は牛膝抽出
物、楡白皮抽出物またはこれらの混合物を含有する口腔
用組成物を提供することにある。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明の口腔用組成物において有
効成分として使用される生薬抽出物は、牛膝または楡白
皮から抽出される。本発明の有効生薬中の一つである牛
膝は韓国の全地域、日本、中国の黄河以南地域に分布す
る植物である牛膝（Achyranthes japonica、Achyranthe
s fauriei、Achyranthes bidentata ) の根を掘り出し
て髭根を除去した後日干しにしたものであって、灰黄色
または黄褐色の棒状、またはやや曲がった長さ１５〜９
０cm、径３〜７cmの円周形として多数の縦皺および所々
に脇髭の跡がある。折られた面は灰白色または淡褐色で
あって偏平であり、中心部の木部は黄白色、質は堅くて
砕けやすい。殆ど無臭であり、味は少し甘く、粘液性で
ある。横断面を顕微鏡で見ると皮部と木部は明確な形成
層として区別できる。木部の中心には小さい原生木部が
あり、柔細胞中には水酸化カルシウムの結晶を含有し、
澱粉粒が見えない。薬理作用として利尿作用、通経、関
節炎等に効能のあるものと知られており、主要成分とし
てはサポニン、オレアノリック配糖体（oleanolic glyc
oside ）、昆虫変態ホルモン〔イノコステロン (inokos
terone）, エクジステロン（ecdysterone)〕、ベタイン
ハイドレイト（betaine hydrate ）等で構成されてい
る。

【００１１】更に本発明の組成物において使用される有
効生薬である楡白皮は、韓国の中部以北と中国および日
本に分布する楡科植物であるUlmus macrocapra、Ulmus
pumila、Ulmus davidiana の幹部分または根部分の根皮
を採取して日干しにしたものであって、薬理作用として
利水、消腫、通淋、水腫、丹毒作用のあるものと知られ
ており、主要成分としてはβ−シトステロール（β−si
tosterol）、植物ステロールおよびタンニン等で構成さ
れている。 "楡白皮" という用語は国家および地域に従
って "楡根皮" あるいは "樹白皮" とも言われている
が、通常 "楡白皮" が多く使用されている。

【００１２】本発明において牛膝抽出物および楡白皮抽
出物は、各々水またはアルコール抽出物を使用する。本
発明で使用される牛膝抽出物と楡白皮抽出物は、それぞ
れ乾燥した牛膝と楡白皮を陰干しにし、細く切った後に
粉末化して水またはアルコールで抽出し濾過して、濾液
を減圧下で濃縮させて固形エキスを得る。

【００１３】牛膝と楡白皮の抽出に使用できるアルコー
ル抽出溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパ
ノール、ブタノール等のような炭素数１〜４の低級アル
コール溶媒が挙げられ、好ましくはエタノールを使用す
る。

【００１４】本発明の生薬抽出物は、歯磨組成物または
軟膏剤組成物に含有され歯周疾患治療作用を示す。本発
明による各組成物において牛膝と楡白皮の抽出物は、組
成物の総重量を基準として各々０．００１〜５重量％、
好ましくは０．０１〜３重量％の比で使用するのが適当
である。本発明の組成物において牛膝と楡白皮の抽出物
を混合して配合させる場合にも各々の抽出物は上記のよ
うな配合比で存在するようにするのが好ましい。しか
し、二つの生薬抽出物を配合する場合には、組成物の総
重量を基準として０．００２〜１０重量％であってもよ
い。各々の生薬抽出物の含量が０．００１重量％未満の
場合は歯周疾患に対し目的の効能および効果が期待でき
ず、５重量％を越える場合は製品の安定性が低下するこ
とがあるので望ましくない。上記抽出物の重量％は、牛
膝、楡白皮それぞれの固形エキスとしての重量％であ
る。

【００１５】＜歯磨組成物＞本発明による歯磨組成物は
具体的に次のような方法で製造することができる。

【００１６】研磨剤成分としてはリン酸１水素カリウ
ム、沈降シリカ、シリカゲル、重曹、炭酸カルシウム、
含水アルミナ、不溶性メタリン酸ナトリウムおよびピロ
リン酸ナトリウム中から選択された１種または２種以上
を使用する。好ましい研磨剤成分はリン酸１水素カルシ
ウム、含水シリカ、炭酸カルシウムである。研磨剤成分
は通常歯磨組成物全体で１〜９０重量％使用されるが、
好ましくは２０〜６０重量％である。

【００１７】歯牙の再石灰化を促進させ歯牙の組織を強
化させる薬効成分としては、フッ素化合物が挙げられ、
具体的にはフッ化ナトリウムまたは第１フッ化リン酸ナ
トリウムを単独でまたは両者を混合して使用する。その
含量は、歯磨組成物全体で０．０１〜２．０重量％が適
当である。薬効成分の含量が０．０１重量％未満では効
果が十分でなく、２．０重量％を越える場合は人体の安
全性に影響することがあるので、口腔用製剤として使用
するには適当でない。

【００１８】湿潤剤は、歯磨組成物の状態維持および乾
燥防止のために使用するが、かかる湿潤剤としてはグリ
セリン、ソルビトール液、ポリエチレングリコールおよ
びプロピレングリコール等が挙げられ、これらを単独で
または２種以上混合して歯磨組成物全体で２０〜６０重
量％使用する。

【００１９】また、歯磨成分中、液体と固体成分を結合
させ歯磨の形態を維持し安全性を確保するために結合剤
を使用するが、かかる結合剤としては主にアルギン酸ナ
トリウムまたはカルシウム塩、カルボキシメチルセルロ
ースナトリウム、ザンタンガム、アカシアガム、カラギ
ナン等の天然または合成高分子物質が挙げられ、その含
量は歯磨組成物全体で０．１〜５重量％を使用する。

【００２０】発泡剤は研磨剤の洗浄作用を補完し、薬効
成分を歯ブラシが到達しにくい部位まで浸透させること
は勿論、気泡を発生させ歯磨き感を増大させる役割を
し、洗浄作用を助け、薬効成分の分散および浸透を早く
し、界面張力を減少させるので、口腔内異物質が容易に
とれる。主に使用される発泡剤としては、陰イオン界面
活性剤であるラウリル硫酸ナトリウム、アルキル硫酸ナ
トリウムが使用され、補助的に非イオン界面活性剤であ
るポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、共重合
体、ポリエキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチ
レンソルビタン脂肪酸、アルカノールアミド脂肪酸エス
テル、スクロース脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン
ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸
エステルおよびポリオキシエチレン硬化ヒマシ油誘導体
が使用される。発泡剤の含量は陰イオンまたは非イオン
界面活性剤を単独でまたは２種以上混合して０．５〜５
重量％を使用するのが好ましい。

【００２１】上記添加剤以外にも、爽快感を与え、多少
苦い味を調節するため香料と甘味剤を使用してもよい。
香料としては、天然香料であるペパーミントとスペアミ
ントオイルを多く使用する。香料の使用量は、歯磨組成
物全体で０．１〜１重量％である。甘味剤としては、合
成または天然の非発酵性糖等が主に使用され、代表的な
ものとしてはサッカリンナトリウム、アスパルテーム、
ラクトース、マルトース、キシリトール等が挙げられ、
好ましくはサッカリンナトリウム等である。甘味剤の使
用量は、歯磨組成物全体で０．０５〜１重量％である。

【００２２】そして、歯磨組成物のｐＨを調整する緩衝
剤としては、例えば正リン酸のアルカリ金属塩、特に第
１リン酸ナトリウム、第２リン酸ナトリウム、第３リン
酸ナトリウム、クエン酸およびクエン酸ナトリウム、リ
ン酸、塩酸、水酸化ナトリウム、そしてピロリン酸ナト
リウムおよびピロリン酸塩等が挙げられ、好ましくは第
１リン酸ナトリウム、第２リン酸ナトリウム、第３リン
酸ナトリウムである。上記緩衝剤から選択された１種ま
たは２種以上の成分を配合して、ｐＨを５．０〜８．０
に調整する。

【００２３】防腐剤は、歯磨組成物の製造および使用中
に発生する恐れのある微生物の汚染を防止するために使
用する。防腐剤としては、一般的に食品および医薬品に
使用が許可されている防腐剤が使用でき、具体的にはパ
ラオキシ安息香酸メチル、安息香酸、安息香酸ナトリウ
ム、サリチル酸等が挙げられる。これらの防腐剤は、単
独でまたは２種以上混合して使用できる。防腐剤の使用
量は、歯磨組成物全体で０．０１〜０．５重量％であ
る。

【００２４】本発明の歯磨組成物において牛膝と楡白皮
の抽出物を混合使用する場合は、抽出物の使用量は、歯
磨組成物全体で０．００２〜１０重量％である。両者の
混合比は、牛膝：楡白皮が１：５０００〜５０００：１
程度であり、好ましくは１：０．１〜１：１０．０であ
る。

【００２５】＜軟膏剤組成物＞本発明の軟膏剤組成物に
は、軟膏剤の製造分野において通常的に使用される添加
剤、例えば軟膏剤の状態を安定化させる界面活性剤、可
溶化剤、湿潤剤、口腔軟組織に対する薬効伝達剤、緩衝
剤、防腐剤、甘味剤および香料等の成分を更に配合させ
ることができる。

【００２６】本発明の軟膏剤組成物において軟膏剤の状
態安定性のための界面活性剤としては、ポリオキシエチ
レン−ポリオキシプロピレン共重合体が使用されるが、
例えばプルロニックＦ−１２７またはプルロニックＦ−
１０８のようなプルロニック誘導体が使用できる（プル
ロニックは登録商標である。）。本発明の軟膏剤組成物
においてこのような界面活性剤は、組成物の総重量を基
準として５〜３０重量％の比で配合して使用することが
できる。

【００２７】本発明の軟膏剤組成物には、牛膝と楡白皮
の抽出物に対する可溶化剤として低級アルコール溶媒が
使用できる。かかる目的で使用される低級アルコール溶
媒にはエタノール、イソプロピルアルコール等があり、
二つ以上のアルコール溶媒を混合して使用することもで
きる。本発明の組成物において低級アルコール溶媒は、
軟膏剤組成物の総重量を基準として１〜２０％の比で配
合させるのが好ましい。

【００２８】本発明の軟膏剤組成物には更に軟膏剤の状
態維持および乾燥防止のために湿潤剤を使用するが、か
かる湿潤剤としてはグリセリン、ソルビトール液、ポリ
エチレングリコール２００、ポリエチレングリコール４
００、ポリエチレングリコール６００およびポリエチレ
ングリコール１０００のようなポリエチレングリコー
ル、プロピレングリコール、ポロサマー（Poloxamer40
7) およびモノグリセリド(Myverol 18-99)中から選択さ
れた１種の成分を単独で使用するか、または２種以上の
成分を混合して使用することができる。湿潤剤の使用量
は組成物の総重量を基準として５〜４０重量％であるの
が好ましい。

【００２９】一方、口腔軟組織に粘着して有効成分の薬
効が伝達できるようにする薬効伝達剤としては、ゼラチ
ンおよびペクチンを各々単独でまたは配合して組成物の
総重量を基準として１〜３０重量％の比で使用できる。

【００３０】軟膏組成物のｐＨを調整する緩衝剤として
は、正リン酸のアルカリ金属塩（特に第１リン酸ナトリ
ウム、第２リン酸ナトリウム、第３リン酸ナトリウ
ム）、クエン酸およびクエン酸ナトリウム、リン酸、塩
酸、水酸化ナトリウムおよびピロリン酸およびピロリン
酸塩（主としてナトリウム塩）等が挙げられ、好ましく
は第１リン酸ナトリウム、第２リン酸ナトリウム、第３
リン酸ナトリウムである。上記緩衝剤から選択された１
種または２種以上の成分を配合して、ｐＨを５．０〜
８．０に調整する。

【００３１】上記添加剤以外にも、本発明の組成物が特
に口腔内に適用するという点を考慮して、爽快感を与
え、多少苦い味を調節するため香料と甘味剤を使用して
もよい。香料としては、天然香料であるペパーミントと
スペアミントオイルを多く使用する。香料の使用量は、
歯磨組成物全体で０．１〜１重量％である。甘味剤とし
ては、合成または天然の非発酵性糖等が主に使用され、
代表的なものとしてはサッカリンナトリウム、アスパル
テーム、ラクトース、マルトース、キシリトール等が挙
げられ、好ましくはサッカリンナトリウム等である。甘
味剤の使用量は、歯磨組成物全体で０．０５〜１重量％
である。

【００３２】防腐剤は、歯磨組成物の製造および使用中
に発生する恐れのある微生物の汚染を防止するために使
用する。防腐剤としては、一般的に食品および医薬品に
使用が許可されている防腐剤が使用でき、具体的にはパ
ラオキシ安息香酸メチル、安息香酸、安息香酸ナトリウ
ム、サリチル酸等が挙げられる。こられの防腐剤は、単
独でまたは２種以上混合して使用できる。防腐剤の使用
量は、歯磨組成物全体で０．０１〜０．５重量％であ
る。

【００３３】本発明の軟膏剤組成物を臨床的に利用する
場合には、上記のような比で配合された組成物を１日に
歯周疾患のある患部に５０〜５００ｍｇ、好ましくは１
００〜３００ｍｇが適用されるように使用するのが適合
するが、歯周疾患の重症度、患部の大きさ等の要因を考
慮して適切に増減することもできる。

【００３４】

【実施例】本発明を以下の実施例および比較例により更
に詳しく説明するが、本発明がこれらによって何ら制限
されるものではない。

【００３５】製造例１ 乾燥した牛膝を粉末化させ得られた粉末５０ｇを取って
９５％エタノール５００mlを加えて３日間沈滴抽出した
後、１番ワトマン（Whatman No. 1)を利用して濾過した
後に減圧下で濃縮させ、乾燥した牛膝抽出物１５ｇを得
た。

【００３６】製造例２ 乾燥した楡白皮を粉末化させ得られた粉末５０ｇを取っ
て９５％エタノール５００mlを加えて３日間沈滴抽出し
た後、１番ワトマン（Whatman No. 1)を利用して濾過し
た後に減圧下で濃縮させ、乾燥した楡白皮抽出物２０ｇ
を得た。

【００３７】実施例１−１８および比較例１−１８ 下記の表１乃至９に示された組成成分比に従って実施例
および比較例の歯磨組成物を製造した。

【００３８】

【表１】

【００３９】

【表２】

【００４０】

【表３】

【００４１】

【表４】

【００４２】

【表５】

【００４３】

【表６】

【００４４】

【表７】

【００４５】

【表８】

【００４６】

【表９】

【００４７】実験例１−１：本発明の歯磨（実施例１−
１〜１−１８）のスーパーオキシド生成に対する抑制効
果 全身疾患のない健康な成人からクエン酸を抗凝固剤とし
て使用して採集した静脈血液を１２００ｒｐｍで１０分
間遠心分離した後、中層の白血球濃縮液を回収した。こ
の中層の白血球濃縮液に、ＲＰＭＩ１６４０培地を１：
１の比率になるように加えて希釈した。５０ｍｌの遠心
分離管にFicoll-Paque １２ｍｌを添加した後、上記希
釈した血液３０ｍｌが中層となるように注意深く添加し
て１６００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。血清が包含
されている上層を除去し、単核細胞が含有されている中
層に３倍のＲＰＭＩ１６４０培地を注意深く添加して希
釈した後、８０ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄液
を捨て、ＲＰＭＩ１６４０培地を１０ｍｌ添加して和や
かにピペッティングした後８００ｒｐｍで１０分間遠心
分離した。上澄液を捨ててＨＢＳＳ(hanks'balanced sa
lt solution)緩衝溶液を添加してピペッティングした
後、得られたヒトの単核白血球を２４−ウェルプレート
に１０⁶ cell／ウェルとなるように０．４５ｍｌ分注
し、９５％空気、５％ＣＯ₂ 、１００％湿度条件下で無
菌的に２時間培養した。この後にFMLP(N-Formyl-Met-Le
u-Phe)を１０^-6Ｍとなるように０．０５ｍｌ加えて、３
７℃で１５分間培養して細胞を刺激した後に、８０μＭ
となるように0.1 ｍｌのチトクロームＣ（ Cytochrome
C ）を添加し、３０μｇとなるように０．１ｍｌのスー
パーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）を添加し、細胞毒
性のある界面活性剤を除外した実施例及び比較例の３倍
希釈した歯磨組成物を０．１ｍｌ添加し、残りの総反応
液が０．９ｍｌとなるようにＨＢＳＳ(hanks'balanced
salt solution)を添加した後３７℃で１０分間保温し
た。その後、刺激物質である食菌化された zymosan Aを
最終濃度１．３ｍｇ／ｍｌとなるように０．１ｍｌ添加
して、振とうしながら３７℃で９０分間保温した後、１
０分間４℃に保ち、反応を停止させた後、４℃、１５０
０ｒｐｍで、１０分間遠心分離した後、上澄液を採取し
た。この上澄液の５５０ｎｍにおける吸光度を測定し、
スーパーオキシドアニオンの生成量を次式より求めた。

【００４８】

【数１】

【００４９】測定結果は次の表１０に示した。

【００５０】

【表１０】

【００５１】以上の実験結果から、牛膝抽出物を０．０
０１％以上含有している実施例１−１、５、７、９、及
び１１においてスーパーオキシド生成抑制効果が牛膝抽
出物の濃度が増加するにつれて上昇するものと示された
一方、楡白皮抽出物を含有している実施例１−２、４、
６、８、１０及び１２においてはスーパーオキシド生成
抑制効果がないものと示された。牛膝抽出物と楡白皮抽
出物の両方を含有している実施例１−１３、１４、１
５、１６、１７及び１８もスーパーオキシド生成に対す
る抑制効果が牛膝抽出物の濃度に従って上昇するものと
示された。

【００５２】実験例１−２：本発明の歯磨（実施例１−
１〜１−１８）の歯周組織分解酵素であるコラゲナーゼ
の酵素活性に対する抑制効果 本発明の歯磨きで歯周組織分解酵素であるコラゲナーゼ
に対する抑制効果を実施した実験結果は下記の通りであ
る。本試験方法は、進行過程において歯周疾患原因菌で
ある Porphyromonas gingivalis と Polymorphonuclear
leukocytes 及び中性白血球(Neutrophil)から分泌され
た歯周疾患患者の唾液と歯肉列口（pocket）液中に含有
されているコラゲナーゼ酸素の作用によって歯周組織の
基質であるコラーゲンが分解され歯肉退縮が起こる生体
口腔環境を模倣した実験方法である。

【００５３】２５個の１．５ｍｌエッペンドルフチュー
ブに２％の赤色コラーゲン基質であるアゾコール溶液
（ Azocoll溶液）１００μｌを各々添加した。一つのエ
ッペンドルフチューブはブランクとして使用し、三つの
チューブにはシグマから購入したコラゲナーゼタイプＩ
である標準酵素溶液（コラーゲン分解活性度：３１５un
its/mg）を１０、１００、２００ｐｐｍとなるように添
加した。残りのチューブの各々に歯周疾患患者の唾液と
歯齦列口液とからセファクリル S-200クロマトグラフィ
ーにより純粋分離されたコラゲナーゼ酸素１００μｌを
添加し、更に一つのチューブは対象群として使用し、残
りのチューブの各々には細胞毒性のある界面活性剤を除
外した実験群歯磨（実施例１−１〜１−１８）と比較群
歯磨（比較例１−１〜１−１８）を蒸溜水と１：２の比
率で混合して完全に均質化させたものを５０００ｇで１
０分間遠心分離した。この後、上清を１０μｌで処理し
た後、緩衝溶液(0.05M Tris-HCl, InM CaCl₂ ,7.8)を総
反応液が５００μｌとなるように添加して３７℃で１８
時間反応させた後、これらのエッペンドルフチューブを
１００００ｇで５分間遠心分離させ分解されないコラー
ゲンは沈殿され、分解されたコラーゲンを含有する上清
を取って５４０ｎｍで吸光度を測定して標準活性度曲線
を作成した。標準活性度曲線から酵素の活性濃度を換算
して実験群と対象群の酵素活性度を比較評価して次のよ
うな結果を得た（表１１及び表１２参照）。

【００５４】

【表１１】

【００５５】

【表１２】

【００５６】以上の実験結果から、牛膝抽出物を０．０
１％以上含有している実施例１−１、５、７、９及び１
１においてコラゲナーゼ活性に対する抑制効果が牛膝抽
出物の濃度が増加するにつれて上昇するものと示され
た。楡白皮抽出物を含有している実施例１−２、４、
６、８、１０及び１２においてもコラゲナーゼ活性に対
する抑制効果が楡白皮濃度が増加するにつれて上昇する
ものと示された。牛膝抽出物と楡白皮抽出物の両方がコ
ラゲナーゼ活性に対する抑制効果が優れており、牛膝抽
出物と楡白皮抽出物の両方を含有している実施例１−１
３、１４、１５、１６、１７及び１８においては上昇効
果のあるものと示された。

【００５７】実験例１−３：本発明の歯磨（実施例１−
１〜１−１８）の単核白血球のインターロイキン（ＩＬ
−１β）生成に対する抑制効果 血液から分離した血液単核白血球を２４−ウェルプレー
トに１０⁶ cell/ ウェルとなるように０．８ｍｌ添加し
て分注した。ＲＰＭＩ１６４０培地２００μｌを添加し
たウェル対象群、E.coliリポ多糖（ＬＰＳ）(250ppm)１
００μｌを添加したウェル及び LPS(250ppm) １００μ
ｌと細胞毒性のある界面活性剤を除外した実施例（１−
１〜１−１８）及び比較例（１−１〜１−１８）の３倍
希釈した歯磨組成物１００μｌを添加したウェルを実験
群として24時間培養した後、アラキドン酸５０μｌを添
加して更に３０分間培養した。インターロイキン（ＩＬ
−１β）の抗体が付着された９６−ウェルプレ−トのウ
ェルに上記の細胞培養液５０μｌを添加し、全てのウェ
ルに５０μｌのビオチン化抗体試薬を添加した後に、２
５℃で３０分間保持した後、洗浄緩衝溶液で３回洗浄し
たものに、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ（ＨＲＰ）結合体（Streptavidin-HRPConjugat
e）を全てのウェルに添加して更に２５℃で３０分間保
持させた後再び洗浄緩衝溶液で３回洗滌した。これに、
１００μｌの酵素基質を直ちに添加して２５℃、暗室で
プレートの蓋を開けたまま３０分間保持し、０．１８Ｍ
硫酸１００μｌを添加した後、マイクロプレート判読機
で４５０ｎｍの吸光度を測定して標準溶液の吸光度値と
して標準曲線を作成して実験群のインターロイキン生成
量を算定した。測定結果を次の表１３に示す。

【００５８】

【表１３】

【００５９】E.coli LPSで刺激したヒト単核白血球のＩ
Ｌ−１βの生成に対する効能、効果を試験した結果、
０．０１％濃度以上の牛膝抽出物を含有している１−
３、５、７、９及び１１においての抑制効果が牛膝抽出
物の濃度が増加するにつれて上昇しているものと示され
た反面、楡白皮抽出物を含有している実施例１−２、
４、６、８、１０及び１２においてはＩＬ−１βの生成
抑制効果がないものと示された。牛膝抽出物と楡白皮抽
出物の両方を含有している実施例１−１３、１４、１
５、１６、１７及び１８もスーパーオキシド生成に対す
る抑制効果が牛膝抽出物の濃度に従って上昇するものと
示された。

【００６０】実験例１−４：本発明の歯磨（実施例１−
１〜１−１８）の単核白血球のプロタグランジン（ＰＧ
Ｅ₂ ) 生成に対する抑制効果 本発明の歯磨で歯周疾患誘発物質であるプロスタグラン
ジンの生成に対する抑制効果を実施した。実験結果は下
記の通りである。本試験方法は歯周疾患進行過程で歯周
疾患原因菌である porphyromonoas gingivalisの細胞壁
構成成分であるリポ多糖によりヒトの単核白血球を刺激
して誘発されたプロスタグランジンの(PGE₂ )の生成を
抗原−抗体の免疫診断法により、細胞毒性のある界面活
性剤を除外した実験群歯磨（実施例１−１〜１−１８）
と比較群歯磨（比較例１−１〜１−１８）を蒸溜水と
１：２の比率で混合して完全に均質化させ５０００ｇで
１０分間遠心分離させ上清を処理した後、抑制効果を比
較評価した。具体的な試験方法は、山羊の抗−マウスＩ
ｇＧを付着させた９６−ウェルレートのブランクウェル
に緩衝溶液(0.9% NaCl, 0.1% 牛血清アルブミン, 0.5%
Kathon を含有する 0.1M リン酸緩衝溶液) を５０μｌ
添加し、標準(0, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320p
g) ウェルには５０μｌの適当濃度の標準溶液を添加し
た。これに、上記の通りに製造された細胞毒性のある界
面活性剤を除外した実験群歯磨（実施例１−１〜１−１
８）と比較群歯磨（比較例１−１〜１−１８）５０μｌ
を実施例と比較例群に設定されたウェルに添加し、５０
μｌのＰＧＥ₂ に対する抗体をブランクウェルを除外し
た全てのウェルに添加し、５０μｌのＰＧＥ₂ 結合ペル
オキシダーゼをブランクウェルを除外した全てのウェル
に添加し、９６−ウェルプレートで覆い、２５℃で１時
間保持した後洗浄緩衝溶液（0.05 Tween 20 を含有する
リン酸緩衝溶液: pH7.5 ）で４回洗浄し、常温で１５０
μｌの酵素基質（20% のジメチルホルムアミドに溶解さ
れた 3,3',5,5'- テトラメチルベンジジン／過酸化水
素）を直ちに添加して２５℃で３０分間反応させた。こ
れに、１Ｍ硫酸１００μｌを添加した後マイクロプレー
ト判読機で４５０ｎｍの吸光度を測定して標準溶液の吸
光度値で標準曲線を作成し、実験群のプロスタグランジ
ン生成量を算定する。測定結果を次の表１４と１５に示
す。

【００６１】

【表１４】

【００６２】

【表１５】

【００６３】E. coli LPS で刺激したヒト単核白血球の
ＰＧＥ₂ 生成に対する効能、効果を実施した結果、牛膝
抽出物を含有している１−３、５、７、９及び１１にお
いての抑制効果が牛膝抽出物の濃度が増加するにつれて
上昇するものと示された反面、楡白皮抽出物を含有して
いる実施例１−２、４、６、８、１０及び１２において
はＰＧＥ₂ 生成抑制効果がないものと示された。牛膝抽
出物と楡白皮抽出物の両方を含有している実施例１−１
３、１４、１５、１６、１７及び１８もＰＧＥ ₂ 生成抑
制効果が牛膝抽出物の濃度に従って上昇するものと示さ
れた。

【００６４】実験例１−５：本発明の歯磨（実施例１−
１〜１−１８）の歯齦繊維牙細胞のコラーゲン蛋白質生
成に対する効果 前培養した歯肉繊維牙細胞を２４−ウェルプレートに１
０⁶ cell／ウェルとなるように分注した後、１０％ＦＢ
Ｓが含有されているＤＭＥＭ培地で一日間培養した翌日
既存の培地を新鮮な培地に交替して更に２４時間培養し
た。この後、ＨＢＳＳ緩衝溶液で底に付いている洗浄層
を洗浄した後に血清とプロリンが包含されていないＭＥ
Ｍ培地０．８ｍｌを添加し、細胞毒性のある界面活性剤
を除外した実験群歯磨（実施例１−１〜１−１８）と比
較群歯磨（比較例１−１〜１−１８）を蒸溜水と１：２
の比率で混合したものを加え、完全に均質化させ５００
０ｇで１０分間遠心分離させ上清を処理した後、¹⁴Ｃ−
プロリン（１０Ｃｉ）１００μｌを包含した培養液で細
胞を培養した。２４時間経過後に総蛋白質とコラーゲン
蛋白質を測定した。まず、細胞外総蛋白質の合成量を測
定するために各ウェルの培養液を一方を封印した透析管
に入れた後、他方を封印して冷緩衝液 (Tris-HCl 0.05m
ol/L, NaCl 0.2mol/L, CaCl₂ 0.05mol/L,フェニルメチ
ルスルホニルフルオリド 0.3mN) で２４時間透析を完了
した後、各々１００μｌを取ってカウントバイアルに入
れて１０ｍｌのシンチレーションカクテルを入れ液体シ
ンチレーションカウンター（ＬＳＣ）で１分間放射能を
測定した。細胞内総蛋白質の合成量を測定するために細
胞培養液を除去した各ウェルに０．１Ｎ ＮａＯＨおよ
びフェニルメチルスルホニルフルオリド０．３ｍＮを添
加した後に６０℃で３０分間維持して細胞膜を破壊させ
た後、細胞均質液を一方を封印した透析管に入れた後に
他方を封印して冷緩衝液(Tris-HCl 0.05mol/L ，Nacl
0.2mol/L, CaCl₂ 0.05mol/L, フェニルメチルスルホニ
ルフルオリド 0.3mN) で２４時間透析を完了した後、各
々１００μｌをとってカウント用バイアルに入れて１０
ｍｌのシンチレーションカクテルを入れＬＳＣで１分間
放射能を測定した。細胞内・外コラーゲン蛋白質の合成
量を測定するために透析を完了した細胞培養液及び細胞
均質液を各々１００μｌ取って１．５ｍｌのマイクロチ
ューブに入れてコラゲナーゼ反応緩衝液（0.05M Tris-H
Cl,lmM CaCl₂, 0.03mM フェニルメチルスルホニルフル
オリド) 、コラゲナーゼ酵素(100ppm)１００μｌを添加
した後に３時間３７℃で反応させコラーゲンを完全に分
解させた後、分解されない蛋白質を除去するために５０
％のトリクロロ酢酸１％及びタンニン酸を含有する溶液
を５００μｌ添加した後に４℃で３０分間沈殿させた後
に１０００ｘｇで５分間遠心分離させた後、上清を１０
０μｌ取ってカウント用バイアルに入れて１０ｍｌのシ
ンチレーションカクテルを入れＬＳＣで１分間放射能を
測定した。測定結果を次の表１６に示す。

【００６５】

【表１６】

【００６６】ヒトの繊維牙細胞のコラーゲン合成に対す
る効能、効果を研究するため、¹⁴Ｃ−プロリンを含有す
る細胞培養液に本発明歯磨組成物を以上の通りに処理し
た結果、楡白皮抽出物を含有している１−２、４、６、
８、１０及び１２においてはコラーゲン合成促進効果が
楡白皮の濃度が増加するにつれて上昇するものと示され
た反面、牛膝抽出物を含有している実施例１−３、５、
７、９及び１１においてはコラーゲン合成促進効果がな
いものと示された。牛膝抽出物と楡白皮抽出物の両方を
含有している実施例１−１３、１４、１５、１６、１７
及び１８もコラーゲン合成促進効果が楡白皮抽出物の濃
度に従って上昇するものと示された。

【００６７】実施例１−６：本発明の歯磨（実施例１−
１〜１−１８）の効能、効果に対する臨床実験 本発明の歯磨で歯周疾患治療に対する臨床実験を実施し
た結果は下記の通りである。実験対象者は歯列が揃って
欠損歯牙のない歯周疾患患者を対象として年齢別３０歳
から５０歳まで１０歳間隔で性別に従って３０名ずつ精
密な口腔検診を実施して１２０名の実験対象群を選別し
た後、６０名ずつ分けて実験群歯磨（実施例１−１〜１
−１８）と比較群歯磨（比較例１−１〜１−１８）の歯
周疾患治療効果に対する臨床実験を次のような方法で行
った。まず、本発明の歯磨の臨床実験方法は次のような
方法で行った。実験対象群を実験群と比較群に分けた後
に口腔保健教育及び正しい歯磨き方法を教習させた後、
全ての実験対象群に同様の対照歯ブラシを供給して歯面
細磨を実施して初期歯肉炎指数を点数化し、実験群歯磨
と比較群歯磨を供給して使わせて１週、１ヵ月、３ヵ
月、６ヵ月経過後に口腔検診を実施して歯肉炎指数を検
査し、歯肉炎指数の測定方法は歯肉消息子を歯肉列口内
に挿入して力を入れない状態で各歯牙周囲を連続して探
針し、３０秒後に出血状態を測定して下記のような方法
で点数を記録して結果を得た。 点数 内容 ０点： 無出血状態 １点： 点状出血状態 ２点： 線状出血状態 ３点： 歯間部位三角形出血状態 ４点： 歯肉全体出血状態 測定結果を下記の表１７に示す。

【００６８】

【表１７】

【００６９】以上の実験結果から、歯周疾患を誘発させ
るＩＬ−１とプロスタグランジンの生成及びスーパーオ
キシドを抑制させ歯周組織を分解させるコラゲナーゼの
酵素活性を抑制することのできる牛膝抽出物と或いはコ
ラーゲン合成を促進させ、コラゲナーゼの酵素活性を抑
制することのできる楡白皮抽出物を含有した本発明の歯
磨（実施例１−１〜１−１２）の歯周疾患治療効果は１
週から６カ月経過時まで牛膝抽出物あるいは楡白皮抽出
物を含有しない比較例（１−１〜１−１８）よりその効
能が優れたものと示されており、比較例の歯肉炎指数は
１ヵ月後から時間が経過するにつれて持続的に上昇する
反面、本発明により開発された歯磨の使用時に歯周疾患
の発生は抑制され歯肉炎指数は時間が経過しても顕著に
減少するものと示されており、牛膝抽出物と楡白皮抽出
物の両方を含有している実施例１−１３、１４、１５、
１６、１７及び１８においては歯周疾患抑制に対する上
昇効果のあるものと示された。

【００７０】実施例２−１〜２−１８及び比較例２−１
〜２−１８ 下記の表１８〜２６に記載の成分配合比により通常の軟
膏剤製造方法に従って各々の成分を緩衝液に溶解及びゲ
ル化させ、本発明による軟膏剤組成物（実施例２−１〜
２−１８）と比較組成物（比較例２−１〜２−１８）を
製造した。

【００７１】

【表１８】

【００７２】

【表１９】

【００７３】

【表２０】

【００７４】

【表２１】

【００７５】

【表２２】

【００７６】

【表２３】

【００７７】

【表２４】

【００７８】

【表２５】

【００７９】

【表２６】

【００８０】実験例２−１：本発明の軟膏剤のスーパー
オキシド生成抑制効果 歯周疾患の誘発物質であるスーパーオキシドの生成に対
する本発明の軟膏剤組成物の抑制効果を次のような方法
で測定した。全身疾患のない健康な成人からクエン酸を
抗凝固剤として使用して採集した静脈血液を１２００ｒ
ｐｍで１０分間遠心分離した後、中層の白血球濃縮液を
回収した。この中層の白血球濃縮液に、ＰＲＭＩ１６４
０培地で１：１の比率になるよう加えて希釈した。５０
ｍｌの遠心分離管にFicoll-Paque１２ｍｌを添加した
後、上記希釈した血液３０ｍｌが中層となるように注意
深く添加して１６００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。
血清が包含されている上層を除去し、単核細胞が含有さ
れている中層に新しい遠心分離管に滅菌したピペットで
注意深く抜いた後、３倍量のＰＲＭＩ１６４０培地を添
加して８００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を捨
ててＰＲＭＩ１６４０培地を１０ｍｌ添加して和やかに
ピペッティングした後８００ｒｐｍで１０分間遠心分離
した。上清を捨ててＨＢＳＳ（hanks' balanced salt s
olution ）緩衝溶液を添加してピペッティングした後に
ヒトの単核白血球を２４−ウェルプレートに１０⁶ cell
／ウェルとなるように０．４５ｍｌずつ分注して９５％
空気、５％ＣＯ₂ 、１００％湿度条件下で無菌的に２時
間培養した後、ＦＭＬＰ（N-Formyl-Met-Leu-Phe）０．
０５ｍｌ（１０^-6Ｍ）で処理して３７℃で１５分間培養
して細胞を刺激した。ここにチトクロームＣ０．１ｍｌ
（８０μＭ）、ＳＯＤ ０．１ｍｌ（３０μＭ）、及び
ＨＢＳＳで３倍稀釈した実施例及び比較例の軟膏組成物
０．１ｍｌずつを添加した後、総反応液が０．９ｍｌと
なるようにＨＢＳＳを添加して３７℃で１０分間保温
し、刺激物質である食菌化されたZymosan Ａを最終濃度
１．３ｍｇ／ｍｌとなるように０．１ｍｌの量を添加し
た。反応混合物を振とうしつつ３７℃で９０分間保温し
た後、４℃の冷蔵庫に１０分間入れて反応を停止させた
後４℃で１０分間１５００ｒｐｍで遠心分離した。５５
０ｎｍで上清の吸光度を測定し、スーパーオキシドアニ
オンの生成量を次の式により計算した。

【００８１】

【数２】

【００８２】測定結果は次の表２７に示した。

【００８３】

【表２７】

【００８４】上記の表２７に記載の結果から、牛膝を
０．００１％以上含有している実施例２−１、５、７、
９及び１１においてスーパーオキシド生成抑制効果が牛
膝の濃度が増加するにつれて上昇するものと示された反
面、楡白皮を含有している実施例２−２、４、６、８、
１０及び１２においてはスーパーオキシド生成抑制効果
がないものと示された。牛膝と楡白皮の両方を含有して
いる実施例２−１３、１４、１５、１６、１７及び１８
もスーパーオキシド生成に対する抑制効果が牛膝の濃度
に従って上昇するものと示された。

【００８５】実験例２−２：本発明の軟膏剤のコラゲナ
ーゼ酵素の活性に対する抑制効果 本発明による軟膏剤組成物の歯周組織分解酵素であるコ
ラゲナーゼに対する抑制効果を次のような方法で実験し
た。本試験方法は歯周疾患の進行過程において歯周疾患
原因菌であるPorphyromonas gingivalisとPolymorphonu
clear leukocytes及び中性白血球から分泌された歯周疾
患患者の唾液と歯肉列口液中に含有されているコラゲナ
ーゼ酵素の作用によって歯周組織の基質であるコラーゲ
ンが分解され歯肉退縮が起こる生体口腔環境を模倣した
実験方法である。２５個の１．５ｍｌエッペンドルフチ
ューブ各々に２％の赤色コラーゲン基質であるアゾコー
ル溶液を１００μｌずつ添加した。一つのエッペンドル
フチューブはブランクとして使用し、三つのチューブに
はシグマ社から購入したコラゲナーゼタイプ１標準酵素
溶液（コラーゲン分解活性度：３１５units/mg）を１
０、１００、２００ｐｐｍとなるように添加した。残り
のチューブの各々には歯周疾患患者の唾液と歯肉列口液
からセファクリルS-200 クロマトグラフィーにより純粋
分離されたコラゲナーゼ酵素１００μｌを添加してこの
中の一つのチューブは対照群として使用し、残りのチュ
ーブの各々には本発明による実験群軟膏（実施例２−１
〜２−１８）と比較群軟膏（比較例２−１〜２−１８）
を蒸留水と１：２の比率で混合して完全に均質化させ５
０００ｇで１０分間遠心分離させた上清１０μｌをマイ
クロピペットで添加し、緩衝溶液（０．０５Ｍ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ， ｌｎＭ ＣａＣｌ₂ ７．８）を総反応
液が５００μｌとなるように添加した。各々のエッペン
ドルフチューブを３７℃恒温器に入れて１８時間反応さ
せた後１００００ｇで５分間遠心分離させ分解されない
コラーゲンを沈澱させ、分解されたコラーゲンを含有す
る上清を取って５４０ｎｍで吸光度を測定して標準酵素
溶液が添加されたチューブから得た結果から標準活性度
曲線を作成し、標準曲線から残りのチューブにおいての
酵素の活性濃度を換算して実験群と対照群の酵素活性度
を比較評価した。測定結果は次の表２８に示した。

【００８６】

【数３】

【００８７】

【表２８】

【００８８】上記の表２８に記載の結果から、牛膝を
０．００１％以上含有している実施例２−１、５、７、
９及び１１においてコラゲナーゼ活性に対する抑制効果
が牛膝の濃度が増加するにつれて上昇するものと示さ
れ、楡白皮抽出物を含有している実施例２−２、４、
６、８、１０及び１２においてもコラゲナーゼ活性に対
する抑制効果が楡白皮濃度が増加するにつれて上昇する
ものと示され、牛膝抽出物と楡白皮抽出物の両方がコラ
ゲナーゼ活性に対する抑制効果が優れており、牛膝抽出
物と楡白皮抽出物の両方を含有している実施例２−１
３、１４、１５、１６、１７及び１８においては上昇効
果のあるものと示された。

【００８９】実験例２−３：本発明の軟膏剤の単核白血
球のインターロイキン（IL-1β) の生成に対する抑制効
果 本発明による軟膏剤組成物の歯周疾患誘発物質であるイ
ンターロイキン（IL-1β) の生成に対する抑制効果を次
のような方法で測定した。２４−ウェルプレートに血液
から分離した血液単核白血球０．８mlを加えて１０⁶ ce
ll／ウェル濃度となるように分注し、ＲＰＭＩ１６４０
培地２００μｌを添加したウェルを対照群、E.coli LPS
(250ppm)１００μｌを添加したウェル及びLPS(250ppm)
１００μｌとＲＰＭＩ１６４０培地で３倍希釈した軟膏
剤１００μｌを添加したウェルを実験群として２４時間
培養した後、アラキドン酸５０μｌずつを添加して更に
３０分間培養した。ＩＬ−１βの抗体が付着された９６
−ウェルプレートのウェルにＩＬ−１βの標準溶液
（０，１０．２４，２５．６，６４，１６０，４００pg
／ウェル）５０μｌを添加した後、実験群ウェルに上記
の細胞培養液５０μｌを添加し、全てのウェルにビオチ
ン化された抗体試薬５０μｌずつを添加した後に２５℃
で３０分間維持させた後、洗浄緩衝溶液（Tween ２０
０．０５重量％を含有する０．０１M リン酸塩緩衝溶
液，pH７．５）で３回洗浄した。全てのウェルにアウト
レプトアビジン−HRP 結合体１００μｌを添加して更に
２５℃で３０分間維持させた後再び洗浄緩衝溶液で３回
洗浄し、１００μｌの酵素基質を直ちに添加して２５
℃、暗室でプレートの蓋を開けたまま３０分間維持させ
０．１８Ｍ硫酸１００μｌを添加した後、マイクロプレ
ート判読機で４５０ｎｍで吸光度を測定して標準溶液の
吸光度値から標準曲線を作成し、これに基づいて実験群
のインターロイキン生成量を算定した。測定結果は次の
表２９に示す。

【００９０】

【表２９】

【００９１】上記の表２９に記載の結果から、E.coli L
PSで刺激したヒト単核白血球のＩＬ−１βの生成に対す
る本発明の軟膏剤の抑制効果を試験した結果、０．０１
％濃度以上の牛膝抽出物を含有している実施例２−３、
５、７、９及び１１においての抑制効果が牛膝抽出物の
濃度が増加するにつれて上昇しているものと示された反
面、楡白皮抽出物を含有している実施例２−２、４、
６、８、１０及び１２においてはＩＬ−１βの生成抑制
効果がないものと示された。牛膝と楡白皮の両方を含有
している実施例２−１３、１４、１５、１６、１７及び
１８もＩＬ−１β生成に対する抑制効果が牛膝の濃度に
従って上昇するものと示された。

【００９２】実験例２−４：本発明の軟膏剤の単核白血
球のプロスタグランジン（ＰＧＥ₂ ）生成に対する抑制
効果 歯周疾患誘発物質であるプロスタグランジンの生成に対
する本発明の軟膏剤組成物の抑制効果を次のような方法
で実験した。本試験方法は歯周疾患進行過程において歯
周疾患原因菌である porphyromonasgingivalis の細胞
壁構成成分であるリポ多糖がヒトの単核白血球を刺激し
て誘発されたＰＧＥ₂ の生成を抗原−抗体免疫診断法で
実験群軟膏剤（実施例２−１〜２−１８）と比較群歯磨
及び軟膏剤（比較例２−１〜２−１８）を蒸留水と１：
２の比率で混合して完全に菌質化させ５０００ｇで１０
分間遠心分離させ上清を処理した後、抑制効果を比較評
価した。具体的な実験方法は次のようである。山羊の抗
−マウスＩｇＧを付着させた９６−ウェルプレートのブ
ランクウェルに５０μｌ緩衝溶液（０．９％NaCl, ０．
１％牛血清アルビミン，０．５％Kathonを含有する０．
１M リン酸緩衝溶液）を添加し、標準ウェルには５０μ
ｌの適当濃度（０，２．５，５，１０，２０，４０，８
０，１６０，３２０pg）のＰＧＥ₂ の標準溶液を添加し
た後、上記の通りに製造された実験群軟膏剤（実施例２
−１〜２−１８）と比較群軟膏剤（比較例２−１〜２−
１８）５０μｌを実施例と比較例群に設定されたウェル
に添加し、ＰＧＥ₂ に対する抗体５０μｌをブランクウ
ェルを除外した全てのウェルに添加した後ＰＧＥ₂ 結合
パーオキシダーゼ５０μｌをブランクウェルを除外した
全てのウェルに添加し、９６−ウェルプレートで覆い２
５℃で１時間維持させた後、洗浄緩衝溶液（０．０５ T
ween２０を含有するリン酸緩衝溶液：pH７．４）で４回
洗浄し、常温で酵素基質（２０％のジメチルホルムアミ
ドに溶解された３，３’，５，５’−テトラメチルベン
ジン／過酸化水素）１５０μｌを直ちに添加して２５℃
で３０分間維持させ、１Ｍ硫酸１００μｌを添加した
後、マイクロプレート判読機で４５０ｎｍで吸光度を測
定して標準溶液の吸光度値から標準曲線を作成し、この
標準曲線から実験群のプロスタグランジン生成量（単位
ｐｇ）を算定した。測定結果を次の表３０に示す。

【００９３】

【表３０】

【００９４】上記の表３０に記載の結果から、E.coli L
PSで刺激したヒト単核白血球のＰＧＥ₂ 生成に対する本
発明の軟膏剤組成物の抑制効果を試験した結果、牛膝抽
出物を含有している２−３、５、７、９及び１１におい
ての抑制効果が牛膝抽出物の濃度が増加するにつれて上
昇するものと示された反面、楡白皮抽出物を含有してい
る実施例２−２、４、６、８、１０及び１２においては
ＰＧＥ₂ 生成抑制効果がないものと示された。牛膝と楡
白皮の両方を含有している実施例２−１３、１４、１
５、１６、１７及び１８もＰＧＥ₂ 生成抑制効果が牛膝
の濃度に従って上昇するものと示された。

【００９５】実験例２−５：本発明の軟膏剤の歯肉繊維
牙細胞のコラーゲン蛋白質生成に対する効果 本発明の軟膏剤組成物が歯肉繊維牙細胞のコラーゲン蛋
白質の生成に及ぼす影響を次のような方法で測定した。
前培養した歯肉繊維牙細胞を２４−ウェルプレートに１
０⁶ cell/ ウェルとなるように１０％ＦＢＳが含有され
ているＤＭＥＭ培地１mlを各ウェルに分注して一日間培
養した翌日、既存の培地を新鮮な培地に交替して２４時
間培養した後にＨＢＳＳ緩衝溶液で底に付いている洗浄
層を洗浄した後、血清とプロリンが包含されていないＭ
ＥＭ培地０．８mlを添加した後、直ちに実験群軟膏剤
（実施例２−１〜２−１８）と比較群軟膏剤（比較例２
−１〜２−１８）をＤＭＥＭ培地で１：２の比率で希釈
して完全に均質化させ５０００ｇで１０分間遠心分離さ
せ得た上清１００μｌを処理した後、直ちに¹⁴Ｃ−プロ
リン（１０μＣｉ）１００μｌを包含した培養液で細胞
を培養した。２４時間経過後にコラーゲン蛋白質を測定
した。まず、細胞外総蛋白質の合成量を測定するために
各ウェルの培養液を一方を封印した透析管に入れて他方
を封印して冷緩衝液（Tris-HCL ０．０５mol/L, NaCl
０．２mol/L, CaCl₂ ０．０５mol/L, フェニルメチル
スルホニルフルオリド０．３mN）で２４時間透析させた
後、各々１００μｌを取ってカウント用バイアルに入れ
てシンチレーションカクテル１０mlを加え、ＬＳＣで１
分間放射能を測定した。細胞内総蛋白質の合成量を測定
するために細胞培養液を除去した各ウェルに０．１Ｎ
ＮａＯＨ及びフェニルメチルスルホニルフルオリド０．
３ｍＮずつを添加した後に６０℃で３０分間維持して細
胞膜を破壊させた後、細胞菌質液を一方を封印した透析
管に入れて他方を封印して冷緩衝液（Tris-HCL ０．０
５mol/L, NaCl ０．２mol/L, CaCl ₂ ０．０５mol/L,
フェニルメチルスルホニルフルオリド０．３mN）で２４
時間透析させた後、各々１００μｌを取ってカウント用
バイアルに入れてシンチレーションカクテル１０mlを加
え、ＬＳＣで１分間放射能を測定した。細胞内・外総コ
ラーゲン蛋白質の合成量を測定するために透析を完了し
た細胞培養液及び細胞均質液を各々１００μｌ取って
１．５mlマイクロチューブに入れてコラゲナーゼ反応緩
衝液（０．０５M Tris-HCl, １mMCaCl ₂ , ０．０３mN
フェニルメチルスルホニルフルオリド）、コラゲナー
ゼ酵素（１００ppm ）１００μｌを添加した後、３時間
３７℃で維持させコラーゲンを完全に分解させた後、分
解されない蛋白質を除去するために５０％のトリクロロ
酢酸及び１％タンニン酸を含有する溶液５００μｌを添
加した後に４℃で３０分間沈殿させた後、１０００ｘｇ
で５分間遠心分離させた後に上清を１００μｌ取ってカ
ウント用バイアルに入れてシンチレーションカクテル１
０mlを加え、ＬＳＣで１分間放射能を測定した。測定結
果を次の表３１に示す。

【００９６】

【表３１】

【００９７】上記の表３１に記載の結果から、¹⁴C-プロ
リンを包含した細胞培養液に本発明の軟膏組成物を処理
した結果、楡白皮抽出物を含有している実施例２−２、
４、６、８、１０及び１２においてはコラーゲン合成促
進効果が楡白皮の濃度が増加するにつれて上昇するもの
と示された反面、牛膝抽出物を含有している実施例２−
３、５、７、９及び１１においてはコラーゲン合成促進
効果がないものと示された。牛膝と楡白皮の両方を含有
している実施例２−１３、１４、１５、１６、１７及び
１８もコラーゲン合成促進効果が楡白皮の濃度に従って
上昇するものと示された。

【００９８】実験例２−６：本発明の軟膏剤の歯周疾患
治療効果（臨床実験） 本発明の軟膏剤の歯周疾患治療に対する治療効果を次の
ような臨床実験方法で確認した。実験対象者を実験群と
比較群に分けた後、歯面細磨を実施して初期歯肉炎指数
を測定し、実験群軟膏剤と比較群軟膏剤を供給して１回
に２００mg、１日に食後３回ずつ使わせて１週及び１ヵ
月後に口腔検診を実施して歯肉炎指数を検査した。ここ
で、各場合の歯肉炎指数は歯肉消息子を歯肉列口内に挿
入して力を入れてない状態で各歯牙周囲を連続して探針
し、３０秒後に出血状態を測定して下記の表３２のよう
な基準で点数を記録して結果を得た。測定結果を下記の
表３３に示す。

【００９９】

【表３２】

【０１００】

【表３３】

【０１０１】上記の表３３に記載の結果から、歯周疾患
を誘発させるＩＬ−１βとプロスタグランジンの生成及
びスーパーオキシドを抑制させ歯周組織を分解させるコ
ラゲナーゼの酵素活性を抑制することのできる牛膝とま
たはコラーゲン合成を促進させ、コラゲナーゼの酵素活
性を抑制することのできる楡白皮抽出物を含有した本発
明の軟膏（実施例２−１〜２−１２）の歯周疾患治療効
果は１週から１ヵ月経過時まで牛膝または楡白皮を含有
しない比較例（２−１１〜２−１８）よりその効能が優
れたものと示されており、比較例の歯肉炎指数は１ヵ月
以後から時間が経過するにつれて持続的に上昇する反
面、本発明により開発された軟膏の使用時に歯周疾患の
発生は抑制され歯肉炎指数が時間が経過しても顕著に減
少するものと示されており、牛膝と楡白皮の両方を含有
している実施例２−１３、１４、１５、１６、１７及び
１８においては歯周疾患抑制に対する上昇効果のあるも
のと示された。

【０１０２】

【発明の効果】本発明による歯磨組成物及び軟膏剤組成
物は、歯周疾患誘発物質であるスーパーオキシド、プロ
スタグランジン（ＰＧＥ₂ ）、インターロイキン−１β
の生成を抑制するだけでなく、歯周組織の基質であるコ
ラーゲン蛋白質を分解するコラゲナーゼ酵素の活性を抑
制させると同時にコラーゲン蛋白質合成を促進させるこ
とによって、歯周疾患を効果的に治療することができ
る。

フロントページの続き (72)発明者 スォク ゼキュン 大韓民国、デジョン、デドックグ、ヨン チュックドン、102、ジュゴンアパート、 107−403 (72)発明者 チェ キョンチョル 大韓民国、デジョン、ソグ、マンニョン ドン、サンロックスアパート、101− 1505 (56)参考文献 特開 平６−256148（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−279303（ＪＰ，Ａ) 特開 平８−231361（ＪＰ，Ａ) 特開 昭50−898（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−247210（ＪＰ，Ａ) 特開 平８−268854（ＪＰ，Ａ) 特開 平８−40858（ＪＰ，Ａ) 特開 平８−175941（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−176518（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−60920（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−265019（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−170413（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−181972（ＪＰ，Ａ) 特表 平７−504186（ＪＰ，Ａ) 特表 平８−502970（ＪＰ，Ａ) 白井 光太郎ら 監修兼翻譯，「註頭 國譯本草網目（第五冊）」，春陽堂，昭 和五年，ｐｐ．258−266（本草網目草部 第十六巻 牛膝) ＰＡＮ ＳＨＥＮＧ−ＬＩ，ｅｔ ａ ｌ．，’Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ Ｃｈｉ ｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｈｅｒ ｂｓ Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｒａｔｅ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｄｏｎｔｉ ｃ Ｔｏｏｔｈ Ｍｏｖｅｍｅｎｔ’, Ｓｙｏｙａｋｕｇａｋｕ Ｚａｓｓｈ ｉ，46（２），1992，ｐｐ．131−135 赤松金芳，「新訂和漢薬（第１版第５ 刷）」，医歯薬出版株式会社，昭和55 年，ｐｐ．475−476 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 7/26 A61K 35/78 A61P 1/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＴＥＣＨＡＢＳ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (19)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 楡白皮抽出物を含有する口腔用組成物。
2. 【請求項２】 牛膝抽出物と楡白皮抽出物との混合物を
   含有する口腔用組成物。
3. 【請求項３】 抽出溶媒が水、メタノール、エタノー
   ル、プロパノールまたはブタノールであることを特徴と
   する請求項１または２に記載の組成物。
4. 【請求項４】 口腔用組成物が歯磨組成物である請求項
   １または２に記載の組成物。
5. 【請求項５】 牛膝抽出物および楡白皮抽出物を各々単
   独に０．００１〜５重量％含有することを特徴とする請
   求項４に記載の組成物。
6. 【請求項６】 牛膝抽出物および楡白皮抽出物を各々単
   独に０．０１〜３重量％含有することを特徴とする請求
   項４に記載の組成物。
7. 【請求項７】 牛膝抽出物および楡白皮抽出物を共に混
   合して０．００２〜１０重量％含有することを特徴とす
   る請求項４に記載の組成物。
8. 【請求項８】 更に研磨剤としてリン酸１水素カルシウ
   ム、沈降シリカまたは炭酸カルシウムを各々２０〜６０
   重量％含有することを特徴とする請求項４に記載の組成
   物。
9. 【請求項９】 更にフッ素化合物としてフッ化ナトリウ
   ム及び／または第１フッ化リン酸ナトリウムを各々０．
   １〜２重量％含有することを特徴とする請求項４に記載
   の組成物。
10. 【請求項１０】 口腔用組成物が歯周疾患治療用軟膏剤
    である請求項１または２に記載の組成物。
11. 【請求項１１】 組成物の総重量を基準として牛膝抽出
    物を０．００１〜５重量％の比で含有することを特徴と
    する請求項１０に記載の組成物。
12. 【請求項１２】 組成物の総重量を基準として楡白皮抽
    出物を０．００１〜５重量％の比で含有することを特徴
    とする請求項１０に記載の組成物。
13. 【請求項１３】 組成物の総重量を基準として牛膝抽出
    物と楡白皮抽出物の混合物を０．００２〜１０重量％の
    比で含有することを特徴とする請求項１０に記載の組成
    物。
14. 【請求項１４】 更に界面活性剤、可溶化剤、湿潤剤、
    薬効伝達剤、緩衝剤、防腐剤、甘味剤および香料のう
    ち、いずれか１種または２種以上を配合させた請求項１
    ０〜１３のいずれかに記載の組成物。
15. 【請求項１５】 界面活性剤としてポリオキシエチレン
    −ポリオキシプロピレン共重合体を組成物の総重量を基
    準として５〜３０重量％の比で配合させた請求項１４に
    記載の組成物。
16. 【請求項１６】 可溶化剤として低級アルコール溶媒を
    組成物の総重量を基準として１〜２０重量％の比で配合
    させた請求項１４に記載の組成物。
17. 【請求項１７】 湿潤剤としてグリセリン、ソルビトー
    ル液、ポリエチレングリコール２００、ポリエチレング
    リコール４００、ポリエチレングリコール６００および
    ポリエチレングリコール１０００、プロピレングリコー
    ル、ポロサマーおよびモノグリセリドから選択された１
    種または２種以上の成分を組成物の総重量を基準として
    ５〜４０重量％の比で配合させた請求項１４に記載の組
    成物。
18. 【請求項１８】 薬効伝達剤としてゼラチンまたはペク
    チンまたはこれらの混合物を組成物の総重量を基準とし
    て１〜３０重量％の比で配合させた請求項１４に記載の
    組成物。
19. 【請求項１９】 緩衝剤として第１リン酸ナトリウム、
    第２リン酸ナトリウム、第３リン酸ナトリウム、クエン
    酸およびクエン酸ナトリウム、リン酸、塩酸、水酸化ナ
    トリウムおよびピロリン酸ナトリウムおよびピロリン酸
    塩から選択された１種または２種以上の成分を配合させ
    ｐＨを５．０〜８．０に調整した請求項１４に記載の組
    成物。