KR100513218B1

KR100513218B1 - 효소복합체

Info

Publication number: KR100513218B1
Application number: KR10-1998-0033813A
Authority: KR
Inventors: 만프레드 링펠
Original assignee: 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
Priority date: 1997-08-21
Filing date: 1998-08-20
Publication date: 2005-10-25
Anticipated expiration: 2018-08-20
Also published as: CA2245173A1; ES2214667T3; KR19990023742A; CN1210147A; JPH11113568A; EP0897977B1; DE59810882D1; US5981233A; BR9803758A; JP3831123B2; CA2245173C; DK0897977T3; EP0897977A2; AU737987B2; EP0897977A3; CN1184312C; AU8085898A

Abstract

본 발명은 호밀의 증류폐액에서 고형 성분을 제거하고, 물 및 다른 휘발성 물질을 증발시켜서 비휘발성 성분을 농축시키고, 이어서 상기로부터 생성된 호밀 농축액의 묽은 증류폐액을 오토클레이빙시킴으로써 전처리된 호밀의 묽은 증류폐액(stillage)을 크실라나제 유도 물질인 동시에 탄소 공급원으로서 배양에 사용함을 포함하는, 크실라나제를 생성하는 미생물인 트리코더마(Trichoderma) 속을 영양 배지에서 배양하므로써 크실라나제가 풍부한 효소 복합체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 본 방법의 다른 특징에서, 탈유 대두분(de-oiled soya meal) 또는 대두분 액이 추가의 크실라나제 유도 물질 및 질소 공급원으로서 사용되며, 탈유 대두분 또는 대두분 액을 전처리된 호밀의 묽은 증류폐액에 첨가하므로써 크실라나제 생성이 더욱 증가된다. 본 발명에 따른 방법에서 제조되는 효소 복합체는 동물 사료 산업, 특히 사육 조류 영양물에서 바로 사용할 수 있다. 예를 들어 호밀, 보리 또는 라이밀을 함유한 사료에서 효소 복합체를 사용하면 비전분성 다당류의 반영양 작용(antinutritive action)을 감소시키는데 있어서 유리한 영향을 미치며, 동물 장에서 영양물의 소화능 및 흡수성을 개선시킨다.

Description

효소 복합체{ENZYME COMPLEX}

본 발명은 호밀의 전처리된 묽은 증류폐액을 크실라나제(xylanase) 형성의 유도 물질로서 사용하여 크실라나제가 풍부한 효소 복합체를 제조하는 발효 방법에 관한 것이다.

공지된 바와 같이, 크실라나제는 크실란(또는 "우드 검(wood gum)")을 크실로즈와 다른 당으로 가수분해하는 헤미셀룰라제에게 주어진 효소의 이름이다. 이 효소는 엔도-1,4-β-D-크실라나제 또는 1,4-β-D-크실란 크실라노히드로라제로도 알려져 있으며, EC 3.2.1.8 효소류에 속한다. 크실란은 상이한 조성의 짧은 측쇄를 갖는 1,4-β-글리코사이드 연결된 D-크실로피라노즈로부터의 다당류이며, 분자내에 아라비노즈, 글루코즈, 갈락토즈 및/또는 글루쿠론산 뿐만 아니라 아세틸기와 메틸기를 함유하는 것으로, 많은 낙엽수와 침엽수의 성분일 뿐만 아니라 곡류, 겨, 펙틴, 트래거캔스 고무 및 식물 검 등의 성분이다. 이들이 나무에 존재하는 것을 고려할 때, 크실란은 가장 광범위한 각종 천연 물질에 속한다. 이들의 구조적 상이함을 고려할 때, 분지되고 부분적으로 아세틸화된 크실란을 완전히 분해하려면 크실란을 크실로즈와 다른 당으로 가수분해시키는 다양한 크실라나제의 작용이 필요하다. 이러한 크실라나제의 작용 방식은 복잡하며, 항상 다른(어느 정도 상승적으로 작용하는) 효소와 함께 작용한다.

크실라나제는 트리코더마(Trichoderma), 페니실리움(Penicillium), 아스퍼길러스(Aspergillus), 타라로마이시스(Talaromyces) 및 스포로트리쿰(Sporotrichum)과 같은 균류; 및 클로스트리디움(Clostridium), 셀룰로모나스(Cellulomonas), 바실러스(Bacillus), 터모논스포라(Thermononspora) 및 루미노코커스(Ruminococcus)와 같은 박테리아에 의해 형성된다. 크실라나제는 셀룰로즈 산업에서 주로 증백제 및 개선제로서 사용되고 최근에는 동물 사료의 제조에서 사용된다. 동물 사료의 용도에 있어서, 호밀, 보리 또는 라이밀을 함유하는 사료에서 외인성 효소(예: 크실라나제)의 사용에 관한 연구는 비전분성 다당류의 반영양 작용을 감소시키는데 대한 각 제제의 유익한 영향 및 동물 장에서의 영양분의 개선된 소화능 및 흡수성에 관한 것이다. 가장 중요한 효소 그룹은 최근에 특히 영계 사육시 사용되는 것으로, 보리, 밀 및 호밀과 같은 곡류 형태에 존재하는 비전분성 다당류를 가수분해시킬 수 있는 효소로만 이루어진다. 이러한 효소를 함유하는 여러 제제는 예컨대 록사자임 G(Roxazyme G; 로슈(Roche)의 등록 상표이며, 주요 효소로서 셀룰라제, β-글루카나제 및 크실라나제를 함유한다)와 같이 이미 시판된다. 이러한 제제는 동물 사료에서의 전술한 이점 때문에 동물 사료와 혼합된다. 본 발명에 따라 제조된, 크실라나제가 풍부한 효소 복합체는 이들 제제를 제조하기 위해 매우 유용한 물질로서 작용한다. 사육 조류의 영양물중 사료 첨가제로서의 크실라나제의 용도는 중요한 사용 분야를 나타내며, 상기 첨가제를 포함하지 않은 에너지가 부족한 곡류 형태(예: 보리, 오트, 호밀 및 라이밀)에서 얻어지는 영양가와 비교할 때 제조되는 영계 사료의 영양가가 실질적으로 증가한다(문헌[Mh. Vet. Med. 48, 213-217 (1993)] 및 이에 언급된 문헌 참조].

전술된 바와 같이, 본 발명은 기본적으로 탄소 공급원, 질소 공급원 및 특정 염을 함유하는 영양 배지에서 크실라나제를 생성하는 미생물인 트리코더마 속을 배양하는 단계 및 형성된 크실라나제가 풍부한 (또한 동시에 셀룰라제와 β-글루카나제가 감소된) 효소 복합체를 영양 배지로부터 단리시키는 단계에 의해 상기 효소 복합체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 특히, 트리코더마 속 미생물은 셀룰로즈 분해를 뚜렷이 선호하는 다당류 분해 활성을 갖고 있다(즉, 상기 활성은 바람직하게는 셀룰로즈 분해에 관한 것이다). 특히 크실란 분해 활성을 선택적으로 증가시킬 목적으로 상기 활성 스펙트럼을 변화시키기 위해 많이 시도하였다. 이 때문에, 크실라나제 형성을 유도하기 위하여 영양 배지(발효 배지)에 크실란-함유 물질을 첨가하여 왔다. 정제된 크실란, 밀 기울, 보리 영, 분쇄된 옥수수 속(옥수수 속 가루), 짚, 및 호밀의 묽은 증류폐액이 이들의 예이다. 이런 수단을 이용하여 활성 스펙트럼을 보다 높은 크실라나제 활성 쪽으로 대체하는 것이 가능하다(기술 배경으로서 독일 특허 명세서 DD 278 359호 및 DD 291 673호; 유럽 특허 공개공보 0 455 928호; 문헌 [Appl. Microbiol. Biotechnol. 40, 224-229 (1993)]; 및 [Enzyme & Microb. Technol. 18, 495-501(1996)]을 참조한다). 특히, 이러한 유도 물질의 효과는 호밀의 묽은 증류폐액을 사용하여 비용 효과적인 방식으로 이루어질 수 있다. 그러나, 호밀의 묽은 증류폐액은 농도가 증가함에 따라 각 미생물의 성장 및 효소 형성에 억제 효과를 나타낸다.

최근에는 놀랍게도, 물 및 다른 휘발성 성분을 증발시키므로써 유도 물질로서 사용된 호밀의 묽은 증류폐액을 특수하게 전처리하면 처리하지 않은 호밀의 묽은 증류폐액이 갖고 있는 활성 억제라는 전술된 단점이 상쇄되는 것과 동시에 유도 물질의 활성을 증가시켜서, 이와 같이 처리된 호밀의 묽은 증류폐액의 농축된 형태가 사용하기에 유리함이 밝혀졌다. 처리 결과로서 유도되고, (발효조에서) 미생물을 배양하는 중에 이루어지는 효소 형성은 효소 스펙트럼에 상당한 변화를 제공한다. 크실란 분해 활성이 다른 효소의 활성, 즉 셀룰로즈 분해 활성과 글루칸 분해 활성을 수 백% 초과한다. 놀랍게도, 크실라나제에 유리하도록 크실라나제 대 셀룰라제의 비가 이동된다.

본 발명의 목적은 특정한 영양 배지에서 크실라나제를 생성하는 미생물인 트리코더마 속을 배양하므로써 크실라나제가 풍부한 (또한 동시에 셀룰라제 및 β-글루카나제가 감소된) 효소 복합체를 제조하는 것이다.

본 목적은 크실라나제의 형성을 유도하는 시약(이후, "크실라나제 유도 물질"이라 함)인 동시에 탄소 공급원으로서 호밀의 전처리된 묽은 증류폐액을 배양에 사용함으로써 본 발명에 따라 달성되며, 이때 상기 전처리는 호밀의 묽은 증류폐액으로부터 고형 성분을 제거하고, 물 및 다른 휘발성 물질을 증발시켜서 비휘발성 성분을 농축시키고, 이어서 이로부터 생성된 호밀의 묽은 증류폐액을 오토클레이빙시키는 것을 포함한다.

크실라나제가 풍부한 효소 복합체를 제조하기 위해 본 발명에 따른 방법에서 사용할 수 있는 크실라나제-생성 미생물인 트리코더마 속으로서, 특히 야생 균주 QM 6a로부터 유도된 트리코더마(T.) 리세이(reesei)(예: QM 9123, Q 9414, M 18.2, M 18.2-y, Rut M-7 및 Rut NG-14)가 고려된다(몬테네코트(Bland S. Montenecourt)의 문헌["Trichoderma reesei cellulases", Trends in Biotechnology, Vol.1, No.5, pages 156-160, 1983] 및 이에 언급된 문헌을 참조한다).

전술된 미생물 균주의 일부, 즉 QM 6a가 ATCC 13631, CCM F-560, CMI-45548, DSM 768로서, QM 9123이 ATCC 24449로서, QM 9414가 ATCC 26921, CCM F-522, DSM 769로서, M 18.2가 DSM 10683로서, 또한 M 18.2-y가 DSM 7537로서 기탁되었다.

트리코더마 리세이 미생물 균주인 QM 6a, QM 9123 및 QM 9414는 국제 기탁 당국, 예를 들면 도이췌 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하(DSM; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) 및/또는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection; ATCC)의 목록에 기재되어 있으며, 이들 및 다른 공급원에서 시판한다. 미생물 균주 M 18.2는 장기 보관을 위해 1996년 5월 14일자로 독일 데-12489 베를린 루도베르 차우씨 5 소재의 바이오프락트 게엠베하(Biopract GmbH)에 의해 DSM에 기탁되어 수탁번호 DSM 10683번을 받았고, 1998년 6월 12일자로 DSM은 바이오프락트 게엠베하로부터 부다페스트 조약하의 기탁으로 전환시켜 달라는 신청서를 접수하였다. 결국, 미생물 균주 M 18.2-y는 1989년 8월 31일자로 부다페스트 조약하에 제나에서 젠트랄인스티튜트 퓌어 미크로비엘레 운트 엑스페리멘텔레 테라피(ZIMET; Zentralinstitut fur mikrobielle und experimentelle Therapie)에서 기탁되어 수납번호 IMET 43915번을 받았다. 1993년 3월 4일자로 상기 균주는 브라운쉬바이히에서 DSM으로 양도되어 새로운 수탁번호 DSM 7537번을 받았다. 소유권 변동에 의해 미생물 균주 트리코더마 리세이 M 18.2-y는 최종적으로 에프 호프만-라 롯슈 아크리엔게젤샤프트의 소유가 되었다.

본 발명에 따른 방법에서 크실라나제 유도 물질인 동시에 탄소 공급원으로서 사용되는 호밀의 전처리된 묽은 증류폐액은 곡물 증류소에서 얻을 수 있고 일반적으로 폐기 생성물로 여겨지는 묽은 증류폐액(찌꺼기 또는 증류소의 "양조 찌꺼기")으로부터 나온다. 호밀의 (미처리된) 묽은 증류폐액은 하기의 공지된 방식으로 호밀로부터 주정 생산된다. 호밀, 물 및 효소(엑소- 및 엔도글루카나제)를 기본으로하여, 호밀 전분을 알코올로 발효시키는 것은 약 30℃에서 3일에 걸쳐 효모에 의해 이루어진다. 알콜을 증류한 후, 호밀 전분을 거의 함유하지 않은 혼합물이 호밀의 묽은 증류폐액으로서 남는다.

서로 다른 배치(batch)로부터 얻은 호밀의 묽은 증류폐액의 성분은 천연 생성물에서 일반적인 것처럼 다소의 차이가 있으나, 주로 탄수화물(셀룰로즈, 헤미셀룰로즈, 펜토산), 소량의 알부민, 미네랄 물질 및 지방 뿐만 아니라 잔량의 에탄올과 다른 이스트 발효 생성물을 포함한다.

호밀의 묽은 증류폐액의 전처리는 필수적으로 고형 성분의 제거, 비휘발성 성분의 농축 및 수득된 농축물의 오토클레이빙을 포함한다. 이러한 전처리 단계는 하기의 바람직한 특징을 갖는다:

- 호밀의 묽은 증류폐액의 고형 성분은 플레이트 분리기(예: 독일 오엘드 소재의 웨스트팔리아 세퍼레이터 아게(Westfalia Saparator AG)의 SA 1 유형)를 사용하여 윗물을 따라내고 분리시켜 제거한다. 폐기할 고형 성분-함유 분획물의 부피는 호밀의 묽은 증류폐액의 부피의 약 30 내지 약 50%에 이른다.

- 약 40 내지 약 50℃의 비등 온도, 및 상기 온도에 상응하는 호밀의 고형 성분을 함유하지 않은 묽은 증류폐액의 증기압에서 진공 회전 증발기(독일 제나 소재의 숏트 앤드 겐(Schott & Gen)사의 VUV 20-I 유형)를 사용하여 호밀의 고형 성분을 함유하지 않은 묽은 증류폐액중 비휘발성 성분을 농축한다. 이러한 조건하에서, 약 1시간후에 호밀의 고형 성분을 함유하지 않은 묽은 증류폐액의 부피를 원하는 대로, 즉, 약 80 내지 약 90% 감소시켰다. 따라서, 비휘발성 성분의 농축은 약 1:5 내지 약 1:10(약 5 내지 약 10배)에 이른다.

- 호밀의 농축시킨, 고형 성분을 함유하지 않은 묽은 증류폐액을 약 30분 이상동안 약 121℃(편의상 121±1℃)에서 오토클레이빙한다.

호밀의 전처리된 묽은 증류폐액 뿐만 아니라 다른 탄소 공급원이 본 발명에 따른 방법에서 영양 배지로 고려되며, 예를 들어 특히 락토즈, 셀룰로즈, 크실란, 밀 기울, 글루코즈 시럽, 및 분무 건조된 옥수수를 달인 액체이다.

특히 바람직한 추가의 탄소 공급원은 락토즈, 셀룰로즈 및 귀리 영의 크실란이다.

영양 배지의 질소 공급원으로서, 특히 황산 암모늄[(NH₄)₂SO₄], 암모니아수[NH₃-H₂O] 및 탈유 대두분(유기 질소 공급원으로서)이 고려된다. 질소 함량은 편의상 탄소 공급원을 기준으로 20% 이상에 이른다.

중수소 인산칼륨(KH₂PO₄)이 예컨대 영양 배지에 대한 인 공급원으로서 고려된다. 인 함량은 편의상 탄소 공급원을 기준으로 2.5중량% 이상에 이른다.

영양 배지는 편의상 추가의 염을 함유하며, 특히 황산 마그네슘, 황산 철, 황산 망간 및 황산 아연 뿐만 아니라 염화 칼슘과 염화 코발트가 고려된다.

영양 배지의 추가적인 성분으로서 소포제, 예컨대 M-30(독일 하이델베르그의 서바 페인바이오케미카(Serva Feinbiochemica), 글라나폰(Glanapon) DG 102(오스트리아 비엔나 브세티 소재) 또는 MAZU 8005(아일랜드 코르크 소재의 퀘스트 인터내셔날(Quest International))을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 방법에서, 배양 배지의 전체 부피를 기준으로 10배로 농축한 전처리된 묽은 증류폐액 약 35 내지 약 45g/ℓ, 바람직하게는 약 40g/ℓ을 편의상 사용한다. 트리코더마 리세이의 접종원의 부피는 편의상 배양 배지의 전체 부피의 약 10%에 이른다.

배양을 위한 pH 값은 편의상 약 5.5 내지 약 6.5의 범위, 바람직하게는 약 6.0이다. 배양 배지에서의 pH 값은 약 12.5 내지 약 25%의 농도(NH₃ 기준)의 암모니아수를 사용하여 편의상 조정한다.

배양 온도는 편의상 약 28 내지 약 34℃, 바람직하게는 약 31℃이다.

사용되는 발효 장치는 외부 감염을 차단하도록 조심해야 하는 전적으로 통상적인 배양 용기(발효조)일 수 있다. 이러한 배양 용기는 일반적으로 특히 교반 장치 및 공기 공급용 기화 장치를 가지는데, 이는 본 발명에 따라 수행되는 배양이 미생물의 호기성 침지 배양이기 때문이다. 교반 속도 및 공기 공급은 편의상 배양 배지중 산소 함량이 산소 포화치의 약 10% 미만으로 감소하지 않게 조절한다.

본 발명에 따른 방법을 수행하기에는 제 1 단계(배치상)가 배치 발효, 및 이어서 기질 도입 단계(공급 배치상(fed batch phase))를 포함하는 이른바 "공급 배치법"이 특히 적합하다.

배치상은 영양 배지에서 균사체를 배양하기 위한 것이며, 이로써 발효조의 도입(접종)은 편의상 하기 (i) 내지 (iii)의 3개 단계로 이루어진다:

(i) 미생물의 보존 저장물로부터 경사 아가 배양물의 분생자를 멸균 수돗물로 세정한다. 이 물은 편의상 유화제, 예컨대 Tween 80(등록상표; 이 경우에 바람직하게는 약 1g/ℓ의 농도)를 함유한다. 이 분생자 현탁액은 적합하게는 5 x 10⁸개의 분생자/ℓ 이상, 특히 5 x 10⁸ 내지 1 x 10⁹개의 분생자/ℓ로 조정한다.

(ii) 탄소 공급원으로서 글루코즈 또는 셀룰로즈, 또는 포스페이트, 니트레이트, 우레아, 펩톤 및 미량의 원소(예를 들어 하팔라(R. Haapala), 팍키넨(E. Parkkinen), 수오미넨(P. Suominen) 및 링코(S. Linko)의 문헌[Production of extracellular enzymes by immobilized Trichoderma reesei in shake flask cultures, Appl. Microbiol. Biotechnol. 43, 815-821 (1995)]을 참조한다)를 기본으로하여 트리코더마 리세이 속의 미생물을 위한 공지된 영양 배지를 함유한 진탕 플라스크에 (i) 단계에서 생성된 분생자 현탁액을 주입한다. 분생자 현탁액 대 영양 배지의 부피비는 편의상 약 1:25 내지 약 1:50이다. 이 진탕 플라스크에서, 분생자를 약 31±1℃(30 내지 32℃), 편의상 약 31℃에서 약 200 내지 약 300rpm, 바람직하게는 약 250rpm의 진탕 빈도로, 충분히 분지된 균사체를 갖는 배양 배질이 형성되는 시점까지 배양한다. 포자 형성이 인지되지 않아야 한다.

(iii) (ii) 단계에서 생성된 배양 배지를 발효조에 주입하여 발효조내의 배양 배지 대 영양 배지의 부피비가 편의상 약 1:5 내지 약 1:10, 바람직하게는 약 1:5가 되게 한다.

효소의 형성은 주로 후속의 공급 배치상에서 발생한다. 바람직하게는 유도 물질로서 호밀의 전처리된 묽은 증류폐액, 유기 질소 공급원으로서 탈유 대두분 또는 대두분 액 및 탄소 공급원으로서 락토즈로 이루어진 기질 용액의 첨가(기질의 도입)는 조절 장치, 또는 균사체중 특정한 이산화탄소 방출의 분석에 의해 지지되는 조절 공정에 의해 적절히 조절된다. 기질 도입은 예컨대 발효로부터의 배기 가스중 이산화탄소 농도에 의해 조절되거나 또는 실험적으로 결정된 시간제에 따라 수행할 수 있다.

본 발명의 다른 특징에 따르면, 추가의 탈유 대두분 또는 대두분 액이 (추가적인) 질소 공급원으로서 사용된다. 탈유 대두분 또는 대두분 액을 호밀의 전처리된 묽은 증류폐액에 첨가하므로써 크실라나제의 생성이 더욱 증가된다는 것이 입증되었다. 따라서, 탈유 대두분 또는 대두분 액이 크실라나제 유도 물질의 작용을 갖는 것으로 추측된다.

탈유 대두분은 편의상 시판되는 분쇄 대두 제품이다. 배양 배지에서 탈유 대두분의 농도는 편의상 배치상에서는 1ℓ의 영양 배지당 약 20 내지 30g이고, 공급 배치상에서는 편의상 1ℓ의 기질 용액당 약 15 내지 25g이고, 바람직하게는 각각 약 25g/ℓ 및 약 20g/ℓ이다.

택일적으로 사용되는 대두분 액은 탈유 대두분 성분의 수용액이다. 대두분 액은 탈유 대두분을 물에 현탁(약 35g/ℓ)하여 제조한다. 이 현탁액을 약 10분동안 끓이고, 실온까지 냉각시킨후에 고형 성분을 여과로 제거한다. 고형 성분을 함유하지 않은 여액(대두분 액)의 부피는 여과시키기 전의 대두분 현탁액 부피의 약 80%에 이른다. 대두분 액은 바람직하게는 공급 배치상에서 탈유 대두분에 대한 대안물로서 사용되며, 대두분 액의 부피는 탈유 대두분의 칭량된 양에 상응한다.

그 자체로 공지된 방법에 따라 본 발명에 따라 생산된 효소 복합체의 분리 및 그의 정제와 농축을 수행할 수 있다. 이를 위해 무균 조건뿐만 아니라 낮은 배지 온도(약 5℃ 내지 약 15℃) 및 낮은 pH 값(약 4 내지 4.5)이 기본적으로 요구된다. 본 절차는 편의상 다음을 포함한다:

- 원심분리나 여과 또는 미세여과(microfiltration)에 의해 발효 배지로부터 바이오매스를 분리하는 단계;

- 한외여과에 의해 효소 복합체를 농축하는 단계;

- 고형 효소 제제의 제조를 위해, 상기 효소 복합체를 농축시킨 후에 분사 건조시키는 단계.

본 발명에 의해 수득된 효소 복합체의 주된 응용 분야는 동물 사료 생산 분야에서 사료 첨가제로서 사용되는 것이다. 본 효소 복합체는 후처리가 필요 없는 발효 배지로서, 배양 여과물로서, 효소 농축물로서, 또는 고체 제제로서 사용될 수 있다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 설명된다.

실시예

공급 배치 발효에서 트리코더마 리세이 M 18.2-y(Trichoderma reesei M 18.2-y)(DSM 7537)를 이용하여 크실라나제가 풍부한 효소 복합체를 제조하였다.

호밀 농축액의 묽은 증류폐액을 제조하기 위하여, 호밀의 묽은 증류폐액중 고형 성분을 함유하지 않은 분획물을 진공하에 약 50℃에서 7.5배로 농축시키고 121℃에서 약 30분동안 오토클레이빙시켰다.

배치상에 사용하기 위한 영양 배지를 제조하기 위하여, 락토즈 20.8g/ℓ, 미세결정질 셀룰로즈 8.3g/ℓ, 탈유 대두분 25g/ℓ, 호밀 농축액의 묽은 증류폐액 33.3㎖/ℓ, KH₂PO₄ 3.75g/ℓ, (NH₄)₂SO₄ 6.0g/ℓ, MgSO₄·7H₂O 0.5g/ℓ, CaCl₂·2H₂O 0.5g/ℓ, FeSO₄·7H₂O 6.25㎎/ℓ, MnSO₄·H₂O 2.0㎎/ℓ, ZnSO₄·7H₂O 1.75㎎/ℓ 및 CoCl₂·6H₂O 2.5㎎/ℓ로 이루어진 영양 배지 1800㎖를 5ℓ들이 발효조에서 20분동안 121℃로 오토클레이빙시키고 12.5% 암모니아수로 pH 6.0으로 조정하였다.

공급 배치상에 사용하기 위한 기질 용액을 제조하기 위하여, 락토즈 300g/ℓ, 셀룰로즈 10g/ℓ, 대두분 액 500㎖/ℓ 및 호밀 농축액의 묽은 증류폐액 107㎖/ℓ로 이루어진 기질 및 유도 물질 용액 1000㎖를 20분동안 121℃로 오토클레이빙시켰다. (대두분 액 500㎖를 제조하기 위하여, 대두분 20g를 물 600㎖에 현탁시키고, 이 현탁액을 10분동안 끓이고 고형 성분을 여과로 제거하였다.)

배치상에서 발효조를 300㎖의 진탕 플라스크 예비 배양물로 접종시켰다. 적합한 접종물을 제조하기 위하여 저장소에서 1ℓ당 TWEEN 80(등록상표; 폴리에톡시소르비탄 올레이트) 1g을 함유하는 멸균된 수돗물 약 3㎖ 씩을 2개의 경사 아가 튜브에 도입하고, 아가 표면 둘다로부터의 분생자를 털어내었다. 다음 단계에서 영양 배지 100㎖를 각각 함유하는 3개의 진탕 플라스크에 동일한 부피의 분생자 현탁액을 주입하였다. 영양 배지는 글루코즈 20g/ℓ, KH₂PO₄ 15.0g/ℓ, (NH₄)₂SO₄ 4.8g/ℓ, CaCl₂·2H₂O 0.3g/ℓ, MgSO₄·7H₂O 0.3g/ℓ, FeSO₄·7H₂O 5.0㎎/ℓ, MnSO₄·H₂O 1.6㎎/ℓ, ZnSO₄·7H₂O 1.4㎎/ℓ 및 CoCl₂·6H₂O 2.0㎎/ℓ로 이루어졌다. 그 다음, 진탕 플라스크 예비배양물을 약 250rpm의 진탕 빈도에서 31℃로 배양하였다. 배지의 pH 값은 조정하거나 조절하지 않는다. 배양 초기의 pH 값은 약 5이었으나, 말기에는 약 3.5이었다. 약 28시간의 배양 주기후에, 발효조에 진탕 플라스크 예비배양물을 주입하였다. 12% 암모니아수를 사용하여 pH 값을 6.0으로 조정하였다. 교반기 캐스캐이드(cascade) 조절을 이용하여 31℃에서 산소 함량을 약 10%의 산소 포화치로 고정시켰다. 21시간동안 배양한 후, 발효조 배기 가스에서의 제 1 CO₂ 최대치를 초과하였고, 따라서 배치상의 말기에 이르렀다.

공급 배치상에서 사용하기 위해, 배기 가스에서 CO₂ 함량이 제 1 최대치의 80%로 감소한 후에 기질을 불연속적으로 첨가하기 시작하였다. 각각을 첨가하여 또 다시 CO₂ 최대치가 되게 하였다. 배기 가스에서의 CO₂ 함량이 이전 최대치의 80%로 감소한 후에 자동 분배식으로 첨가가 이루어졌다. 기질 용액중 첨가된 부피는 배양 배지 1ℓ당 락토즈 1.5g의 첨가에 상응하고, 50시간 발효한 배양 배지 1ℓ당 락토즈 2.0g의 첨가에 상응하였다.

72시간후에 10℃로 냉각시키고 pH 값을 4.5로 조정하므로써 발효를 완료하였다. 균사체를 여과하여 제거하고 잔류한 발효 용액을 분석하였다. 발효 배지에서의 효소 활성은 크실라나제 2625U/㎖, β-글루카나제 555U/㎖ 및 카복시메틸셀룰라제(CMCase) 330U/㎖이었다.

발효 배지중 용해된 단백질의 농도는 17.0g/ℓ에 이르렀다.

효소 활성 및 단백질 농도 측정

크실라나제(엔도-1,4-β-크실라나제)의 활성을 50℃에서 20분동안 40mM 아세트산 나트륨 완충액(pH 6.0)중 0.5% 크실란 현탁액(귀리 영의 크실란, 로쓰(Roth)사)으로 접종하여 결정하였다. 크실라나제 1 유닛트(U)는 1분당 크실로즈 1몰을 해리하였다.

β-글루카나제(엔도-1,3-1,4-β-글루카나제)의 활성은 50℃에서 20분동안 40mM의 아세트산 나트륨 완충액(pH 6.0)중 0.5%의 리헤닌 현탁액(독일, 칼스루헤 소재의 칼 로쓰 게엠베하(Carl Roth GmbH))로 접종하여 결정하였다.

카복시메틸셀룰라제(엔도 1.4-β-글루카나제)의 활성은 50℃에서 20분동안 40mM의 아세트산 나트륨 완충액(pH 6.0)중 2.0%의 카복시메틸셀룰로즈 나트륨염 용액(칼 로쓰 게엠베하)으로 접종하여 결정하였다. β-글루카나제 또는 카복시메틸셀룰라제의 1 유닛트(U)는 1분당 글루코즈 1몰을 해리하였다.

비신콘산에 근거한 로우리(Lowry) 방법을 변형시킨 방법(시그마(Sigma) 공정 번호 TPRO-562(미국 세인트 루이스 소재의 시그마 케미칼 캄파니(Sigma Chemical Co.))을 사용하여 단백질을 침전(트리클로로아세트산을 첨가)시킨 후 단백질의 농도를 결정하였다.

본 발명에 따른 효소 복합체를 예를 들어 호밀, 보리 또는 라이밀을 함유한 사료에 사용하면 비전분성 다당류의 반영양 작용을 감소시키는데 대해 유리한 영향을 미치며, 동물 장에서의 영양물의 소화능 및 흡수성을 개선시킨다.

Claims

호밀의 증류폐액에서 고형 성분을 제거하고, 물 및 다른 휘발성 물질을 증발시켜서 비휘발성 성분을 농축시키고, 이어서 상기로부터 생성된 호밀의 묽은 증류폐액의 농축액을 오토클레이빙시킴으로써 전처리된 호밀의 묽은 증류폐액을 크실라나제 유도 물질인 동시에 탄소 공급원으로서 배양에 사용함을 포함하는,

크실라나제를 생성하는 미생물인 트리코더마(Trichoderma) 속을 영양 배지에서 배양하므로써 크실라나제가 풍부한 효소 복합체를 제조하는 방법.