JPH11113568A - 酵素複合体 - Google Patents
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- JPH11113568A JPH11113568A JP10232707A JP23270798A JPH11113568A JP H11113568 A JPH11113568 A JP H11113568A JP 10232707 A JP10232707 A JP 10232707A JP 23270798 A JP23270798 A JP 23270798A JP H11113568 A JPH11113568 A JP H11113568A
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- A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
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- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 キシラナーゼの豊富な（かつ同時に、セルラ
ーゼおよびβ−グルカナーゼの低下した）酵素複合体
を、Trichoderma属のキシラナーゼ産生微生物を特別な
栄養培地中で培養することにより製造すること 【解決手段】 培養物中で予備処理したライムギの希薄
アルコール蒸留廃液をキシラナーゼの誘導物質として、
および同時に炭素源として用いることを含み、その予備
処理にはライムギの希薄アルコール蒸留廃液の固体構成
成分の除去、水分および他の揮発性物質の蒸発による非
揮発性成分の濃縮、ならびにそれに続く得られたライム
ギの希薄アルコール蒸留廃液の濃縮物のオートクレーブ
処理を含む、製造方法。
ーゼおよびβ−グルカナーゼの低下した）酵素複合体
を、Trichoderma属のキシラナーゼ産生微生物を特別な
栄養培地中で培養することにより製造すること 【解決手段】 培養物中で予備処理したライムギの希薄
アルコール蒸留廃液をキシラナーゼの誘導物質として、
および同時に炭素源として用いることを含み、その予備
処理にはライムギの希薄アルコール蒸留廃液の固体構成
成分の除去、水分および他の揮発性物質の蒸発による非
揮発性成分の濃縮、ならびにそれに続く得られたライム
ギの希薄アルコール蒸留廃液の濃縮物のオートクレーブ
処理を含む、製造方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、予備処理したライ
ムギの希薄アルコール蒸留廃液（stillage）をキシラナ
ーゼ形成の誘導物質として用いてキシラナーゼの豊富な
酵素複合体を製造するための発酵方法に関する。
ムギの希薄アルコール蒸留廃液（stillage）をキシラナ
ーゼ形成の誘導物質として用いてキシラナーゼの豊富な
酵素複合体を製造するための発酵方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】公知のように、キシラナーゼとは、ヘミ
セルラーゼに与えられた酵素の名前で、キシラン(もし
くは「木化ゴム」)をキシロースおよび他の糖に加水分
解する。この酵素はまたエンド−１，４−β−Ｄ−キシ
ラナーゼもしくは１，４−β−Ｄ−キシランキシラノヒ
ドロラーゼとしても知られ、ＥＣ３．２．１．８酵素分
類に属する。キシランは、それ自身、１，４−β−グリ
コシド結合Ｄ−キシロピラノース由来の多糖類で、異な
る組成の短い側鎖を有し、分子内にアラビノース、グル
コース、ガラクトースおよび／またはグルクロン酸なら
びにアセチル基およびメチル基をも含み、多くの落葉樹
および針葉樹の、ならびに穀物、フスマ、ペクチン、ト
ラガカント、植物ゴムなどの成分である。森におけるそ
れらの存在に注目すると、キシランは、幅広い種々の天
然の物質に属している。それらの構造の多様性という観
点から、分枝した、部分的にアセチル化されたキシラン
の完全な分解には、種々のキシラナーゼの作用が必要で
あり、それによりキシランはキシロースおよび他の糖に
加水分解される。キシラナーゼの作用のこの態様は複雑
で、常に他の酵素(ある程度、相乗的に作用する)との関
係から理解される。
セルラーゼに与えられた酵素の名前で、キシラン(もし
くは「木化ゴム」)をキシロースおよび他の糖に加水分
解する。この酵素はまたエンド−１，４−β−Ｄ−キシ
ラナーゼもしくは１，４−β−Ｄ−キシランキシラノヒ
ドロラーゼとしても知られ、ＥＣ３．２．１．８酵素分
類に属する。キシランは、それ自身、１，４−β−グリ
コシド結合Ｄ−キシロピラノース由来の多糖類で、異な
る組成の短い側鎖を有し、分子内にアラビノース、グル
コース、ガラクトースおよび／またはグルクロン酸なら
びにアセチル基およびメチル基をも含み、多くの落葉樹
および針葉樹の、ならびに穀物、フスマ、ペクチン、ト
ラガカント、植物ゴムなどの成分である。森におけるそ
れらの存在に注目すると、キシランは、幅広い種々の天
然の物質に属している。それらの構造の多様性という観
点から、分枝した、部分的にアセチル化されたキシラン
の完全な分解には、種々のキシラナーゼの作用が必要で
あり、それによりキシランはキシロースおよび他の糖に
加水分解される。キシラナーゼの作用のこの態様は複雑
で、常に他の酵素(ある程度、相乗的に作用する)との関
係から理解される。
【０００３】キシラナーゼは、菌類、例えば、Trichode
rma、Penicillium、Aspergillus、TalaromycesおよびSp
orotrichumおよび細菌類、例えば、Clostridium、Cellu
lomonas、Bacillus、ThermononsporaおよびRuminococcu
sによって作られる。それらは、セルロース業界で主に
漂白剤および向上剤(improving agent)として、最近で
は動物飼料の製造に用いられている。後者の分野の応用
に関して、外来性の酵素、例えばキシラナーゼの、ライ
ムギ、オオムギ、またはライコムギ(triticale)を含有
する飼料における使用に関する研究は、それぞれの調製
物が、非デンプン性の多糖類の反栄養的作用の低下に与
える好ましい影響、および栄養分の動物の腸における改
善された消化性および吸収を指摘している。最も重要な
酵素群は、今日ではブロイラーの飼育に特に用いられて
おり、オオムギ、コムギおよびライムギのような穀物タ
イプに存在する非デンプン性の多糖類を加水分解するこ
とのできる酵素のみからなる。そのような酵素を含むい
くつかの調製物は、既に市場に出ており、例えば、Roxa
zyme（登録商標）G（Roche）は、セルラーゼ、β−グル
カナーゼおよびキシラナーゼを主な酵素として含有す
る。そのような調製物は、動物の飼育において先に述べ
た利点があるので動物の飼料に混合される。本発明によ
り製造されるキシラナーゼが豊富な酵素複合体は、これ
らの調製物の製造に非常に有用な物質として提供され
る。飼料添加物として家禽栄養物にキシラナーゼを用い
ることは、重要な応用分野であり、例えば、製造される
ブロイラー飼料は、そのような飼料添加物のないエネル
ギーの少ない穀物タイプ、例えば、オオムギ、オートム
ギ、ライムギおよびライコムギによって達成されるもの
と比較して、実質的に増加した栄養価を有する〔Mh. Ve
t.-Med. 48, 213-217(1993)およびその中で引用された
参考文献〕。
rma、Penicillium、Aspergillus、TalaromycesおよびSp
orotrichumおよび細菌類、例えば、Clostridium、Cellu
lomonas、Bacillus、ThermononsporaおよびRuminococcu
sによって作られる。それらは、セルロース業界で主に
漂白剤および向上剤(improving agent)として、最近で
は動物飼料の製造に用いられている。後者の分野の応用
に関して、外来性の酵素、例えばキシラナーゼの、ライ
ムギ、オオムギ、またはライコムギ(triticale)を含有
する飼料における使用に関する研究は、それぞれの調製
物が、非デンプン性の多糖類の反栄養的作用の低下に与
える好ましい影響、および栄養分の動物の腸における改
善された消化性および吸収を指摘している。最も重要な
酵素群は、今日ではブロイラーの飼育に特に用いられて
おり、オオムギ、コムギおよびライムギのような穀物タ
イプに存在する非デンプン性の多糖類を加水分解するこ
とのできる酵素のみからなる。そのような酵素を含むい
くつかの調製物は、既に市場に出ており、例えば、Roxa
zyme（登録商標）G（Roche）は、セルラーゼ、β−グル
カナーゼおよびキシラナーゼを主な酵素として含有す
る。そのような調製物は、動物の飼育において先に述べ
た利点があるので動物の飼料に混合される。本発明によ
り製造されるキシラナーゼが豊富な酵素複合体は、これ
らの調製物の製造に非常に有用な物質として提供され
る。飼料添加物として家禽栄養物にキシラナーゼを用い
ることは、重要な応用分野であり、例えば、製造される
ブロイラー飼料は、そのような飼料添加物のないエネル
ギーの少ない穀物タイプ、例えば、オオムギ、オートム
ギ、ライムギおよびライコムギによって達成されるもの
と比較して、実質的に増加した栄養価を有する〔Mh. Ve
t.-Med. 48, 213-217(1993)およびその中で引用された
参考文献〕。
【０００４】上で述べたように、本発明は、該酵素複合
体の製造方法、すなわちTrichoderma属のキシラナーゼ
産生微生物を栄養培地内で（その栄養培地は基本的に炭
素源、窒素源および特定の塩を含有している）培養し、
そして形成されたキシラナーゼが豊富な（かつ同時にセ
ルラーゼならびにβ−グルカナーゼが減少している）酵
素複合体をその栄養培地から単離することによる製造方
法に関する。特に、Trichoderma属の微生物は、セルロ
ース分解を明らかに優先する多糖類分解活性（すなわ
ち、この活性はセルロースの分解を選択的に行う）を生
じるものとして効果的である。この活性の範囲を変えよ
うとする多くの試み、とりわけ、キシラン分解活性を選
択的に増加させようとする目的を持つ試みがなされてき
た。この目的のため、キシラン含有物質は、キシラナー
ゼ形成の誘導を達成するために栄養培地(発酵培地)に加
えられてきた。精製したキシラン、コムギフスマ、オオ
ムギ包頴、粉砕したトウモロコシの穂軸（トウモロコシ
の軸の粉末：maize spindleflour）、ワラ、およびライ
ムギの希薄アルコール蒸留廃液がこれらの例である。こ
の手段により、より高いキシラナーゼ活性の方へ活性の
スペクトルを転置することが可能である（技術的背景と
してドイツ特許明細書ＤＤ２７８３５９号およびＤＤ２
９１６７３号；欧州特許公開（ＥＰ）第０４５５９２８
Ａ１号；Appl. Microbiol. Biotechnol. 40, 224-229(1
993)；ならびにEnzyme & Microb. Technol. 18, 495-50
1(1996)を参照されたい）。特に、この誘導物質効果
は、ライムギの希薄アルコール蒸留廃液を用いる費用効
率のよい方法で達成することができる；しかしながら、
ライムギの希薄アルコール蒸留廃液は、濃度の上昇と共
にそれぞれの微生物の成長と酵素形成に阻害的影響を示
す。
体の製造方法、すなわちTrichoderma属のキシラナーゼ
産生微生物を栄養培地内で（その栄養培地は基本的に炭
素源、窒素源および特定の塩を含有している）培養し、
そして形成されたキシラナーゼが豊富な（かつ同時にセ
ルラーゼならびにβ−グルカナーゼが減少している）酵
素複合体をその栄養培地から単離することによる製造方
法に関する。特に、Trichoderma属の微生物は、セルロ
ース分解を明らかに優先する多糖類分解活性（すなわ
ち、この活性はセルロースの分解を選択的に行う）を生
じるものとして効果的である。この活性の範囲を変えよ
うとする多くの試み、とりわけ、キシラン分解活性を選
択的に増加させようとする目的を持つ試みがなされてき
た。この目的のため、キシラン含有物質は、キシラナー
ゼ形成の誘導を達成するために栄養培地(発酵培地)に加
えられてきた。精製したキシラン、コムギフスマ、オオ
ムギ包頴、粉砕したトウモロコシの穂軸（トウモロコシ
の軸の粉末：maize spindleflour）、ワラ、およびライ
ムギの希薄アルコール蒸留廃液がこれらの例である。こ
の手段により、より高いキシラナーゼ活性の方へ活性の
スペクトルを転置することが可能である（技術的背景と
してドイツ特許明細書ＤＤ２７８３５９号およびＤＤ２
９１６７３号；欧州特許公開（ＥＰ）第０４５５９２８
Ａ１号；Appl. Microbiol. Biotechnol. 40, 224-229(1
993)；ならびにEnzyme & Microb. Technol. 18, 495-50
1(1996)を参照されたい）。特に、この誘導物質効果
は、ライムギの希薄アルコール蒸留廃液を用いる費用効
率のよい方法で達成することができる；しかしながら、
ライムギの希薄アルコール蒸留廃液は、濃度の上昇と共
にそれぞれの微生物の成長と酵素形成に阻害的影響を示
す。
【０００５】驚くべきことに、誘導物質として用いるラ
イムギの希薄アルコール蒸留廃液の水とその他の揮発性
物質の蒸発による特別な予備処理が、天然のライムギの
希薄アルコール蒸留廃液の上記の不都合な阻害活性を打
ち消すと共に、誘導物質としての活性を増加させ、その
結果、そのように処理した濃縮型のライムギの希薄アル
コール蒸留廃液が使用に好都合であるということが見出
された。その処理の結果として誘導され、微生物の培養
の間に（発酵槽内で）実現した酵素の形成は、酵素のス
ペクトルに顕著な変化をひきおこす：キシラン分解活性
は他の酵素の活性、すなわち、セルロース分解およびグ
ルカノース分解活性より数百％優れている：セルラーゼ
に対するキシラナーゼの比は、キシラナーゼの方に驚く
べきシフトを実現した。
イムギの希薄アルコール蒸留廃液の水とその他の揮発性
物質の蒸発による特別な予備処理が、天然のライムギの
希薄アルコール蒸留廃液の上記の不都合な阻害活性を打
ち消すと共に、誘導物質としての活性を増加させ、その
結果、そのように処理した濃縮型のライムギの希薄アル
コール蒸留廃液が使用に好都合であるということが見出
された。その処理の結果として誘導され、微生物の培養
の間に（発酵槽内で）実現した酵素の形成は、酵素のス
ペクトルに顕著な変化をひきおこす：キシラン分解活性
は他の酵素の活性、すなわち、セルロース分解およびグ
ルカノース分解活性より数百％優れている：セルラーゼ
に対するキシラナーゼの比は、キシラナーゼの方に驚く
べきシフトを実現した。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、キシ
ラナーゼの豊富な（かつ同時に、セルラーゼおよびβ−
グルカナーゼの低下した）酵素複合体を、Trichoderma
属のキシラナーゼ産生微生物を特別な栄養培地中で培養
することにより製造することである。
ラナーゼの豊富な（かつ同時に、セルラーゼおよびβ−
グルカナーゼの低下した）酵素複合体を、Trichoderma
属のキシラナーゼ産生微生物を特別な栄養培地中で培養
することにより製造することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】この目的は、本発明によ
り、予備処理したライムギの希薄アルコール蒸留廃液を
キシラナーゼ形成の誘導物質として（以後、「キシラナ
ーゼ誘導物質」という）、および同時に炭素源として培
養中で用いることにより達成され、その予備処理にはラ
イムギの希薄アルコール蒸留廃液の固体構成成分の除
去、水分および他の揮発性物質の蒸発による非揮発性成
分の濃縮、ならびにそれに続く得られたライムギ濃縮物
の希薄アルコール蒸留廃液のオートクレーブ処理を含
む。
り、予備処理したライムギの希薄アルコール蒸留廃液を
キシラナーゼ形成の誘導物質として（以後、「キシラナ
ーゼ誘導物質」という）、および同時に炭素源として培
養中で用いることにより達成され、その予備処理にはラ
イムギの希薄アルコール蒸留廃液の固体構成成分の除
去、水分および他の揮発性物質の蒸発による非揮発性成
分の濃縮、ならびにそれに続く得られたライムギ濃縮物
の希薄アルコール蒸留廃液のオートクレーブ処理を含
む。
【０００８】キシラナーゼの豊富な酵素複合体の製造の
ための本発明による方法に用いられ得るTrichoderma属
のキシラナーゼ産生微生物としては、特に、野生型のＱ
Ｍ６ａ株、例えば、ＱＭ９１２３、ＱＭ９４１４、Ｍ１
８．２、Ｍ１８．２−ｙ、Ｒｕｔ Ｍ−７、およびＲｕ
ｔ ＮＧ−１４から誘導されるTricoderma(T.)reesei変
異体（Bland S. Montenecourt, “Torichoderma reesei
cellulases”, Trend in Biotechnology, Vol. 1 No.
5, 156-160頁、1983およびその中で引用されている参考
文献を参照されたい）が考慮される。
ための本発明による方法に用いられ得るTrichoderma属
のキシラナーゼ産生微生物としては、特に、野生型のＱ
Ｍ６ａ株、例えば、ＱＭ９１２３、ＱＭ９４１４、Ｍ１
８．２、Ｍ１８．２−ｙ、Ｒｕｔ Ｍ−７、およびＲｕ
ｔ ＮＧ−１４から誘導されるTricoderma(T.)reesei変
異体（Bland S. Montenecourt, “Torichoderma reesei
cellulases”, Trend in Biotechnology, Vol. 1 No.
5, 156-160頁、1983およびその中で引用されている参考
文献を参照されたい）が考慮される。
【０００９】前記の微生物の株のいくつかは寄託されて
おり、すなわち、 ＱＭ６ａ： ATCC 13631，CCM F-560，CMI 45548，DSM 768； ＱＭ９１２３： ATCC 24449 ＱＭ９４１４： ATCC 26921，CCM F-522，DSM 769； Ｍ１８．２： DSM 10683；および Ｍ１８．２−y： ＤＳＭ ７５３７ である。
おり、すなわち、 ＱＭ６ａ： ATCC 13631，CCM F-560，CMI 45548，DSM 768； ＱＭ９１２３： ATCC 24449 ＱＭ９４１４： ATCC 26921，CCM F-522，DSM 769； Ｍ１８．２： DSM 10683；および Ｍ１８．２−y： ＤＳＭ ７５３７ である。
【００１０】微生物Ｔ．ｒｅｅｓｅｉの株、QM6a、QM91
23およびQM9414は、国際寄託機関、例えば、Deutsche S
ammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH
(DSM)および／またはAmerican Type Culture Collectio
n(ATCC)のカタログに載っており、そしてこれらおよび
他のソースから市販されている。微生物Ｍ１８．２株
は、ＤＳＭに１９９６年５月１４日に、Biopract GmbH,
Rudower Chaussee 5, D-12489 Berlinにより、長期保
存のため寄託され、寄託番号ＤＳＭ １０６８３を割り
当てられた。１９９８年６月１２日、ＤＳＭはBiopract
GmbHから寄託をブダペスト条約下のものに移行するよ
う要請された。最後に、微生物Ｍ１８．２−ｙ株は、元
々１９８９年８月３１日にJenaのZentralinstitut fur
mikrobielle und experimentelle Therapie(ZIMET)にブ
ダペスト条約に基づいて寄託され、寄託番号ＩＭＥＴ４
３９１５を与えられた。１９９３年３月４日この株はBr
aunschweigのＤＳＭに移され、新しい寄託番号ＤＳＭ７
５３７を与えられた。所有権の変更により、微生物T.re
esei Ｍ１８．２−ｙ株は、最終的に、F.Hoffmann-La R
oche AGの所有物となった。
23およびQM9414は、国際寄託機関、例えば、Deutsche S
ammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH
(DSM)および／またはAmerican Type Culture Collectio
n(ATCC)のカタログに載っており、そしてこれらおよび
他のソースから市販されている。微生物Ｍ１８．２株
は、ＤＳＭに１９９６年５月１４日に、Biopract GmbH,
Rudower Chaussee 5, D-12489 Berlinにより、長期保
存のため寄託され、寄託番号ＤＳＭ １０６８３を割り
当てられた。１９９８年６月１２日、ＤＳＭはBiopract
GmbHから寄託をブダペスト条約下のものに移行するよ
う要請された。最後に、微生物Ｍ１８．２−ｙ株は、元
々１９８９年８月３１日にJenaのZentralinstitut fur
mikrobielle und experimentelle Therapie(ZIMET)にブ
ダペスト条約に基づいて寄託され、寄託番号ＩＭＥＴ４
３９１５を与えられた。１９９３年３月４日この株はBr
aunschweigのＤＳＭに移され、新しい寄託番号ＤＳＭ７
５３７を与えられた。所有権の変更により、微生物T.re
esei Ｍ１８．２−ｙ株は、最終的に、F.Hoffmann-La R
oche AGの所有物となった。
【００１１】本発明による方法においてキシラナーゼ誘
導物質としてかつ同時に炭素源として用いられる予備処
理したライムギの希薄アルコール蒸留廃液は、穀物蒸留
所から得られ、通常は廃棄物と考えられている希薄蒸留
廃液（ビナス(vinasse)または蒸留所の“蒸留廃液”(di
stillery “slop”)）に由来する。(処理されていない)
ライムギの希薄アルコール蒸留廃液は、以下の公知の方
法でライムギから酒精(spirit)生成物となる：ライム
ギ、水および酵素（エキソ−およびエンド−グルカナー
ゼ）を基に、ライムギ澱粉のアルコールへの発酵を、酵
母により３０℃で３日にわたって行う。アルコールの蒸
留後、ライムギ澱粉がほとんどない混合物が、ライムギ
の希薄アルコール蒸留廃液として残る。
導物質としてかつ同時に炭素源として用いられる予備処
理したライムギの希薄アルコール蒸留廃液は、穀物蒸留
所から得られ、通常は廃棄物と考えられている希薄蒸留
廃液（ビナス(vinasse)または蒸留所の“蒸留廃液”(di
stillery “slop”)）に由来する。(処理されていない)
ライムギの希薄アルコール蒸留廃液は、以下の公知の方
法でライムギから酒精(spirit)生成物となる：ライム
ギ、水および酵素（エキソ−およびエンド−グルカナー
ゼ）を基に、ライムギ澱粉のアルコールへの発酵を、酵
母により３０℃で３日にわたって行う。アルコールの蒸
留後、ライムギ澱粉がほとんどない混合物が、ライムギ
の希薄アルコール蒸留廃液として残る。
【００１２】異なるバッチからのライムギの希薄アルコ
ール蒸留廃液の成分は、天然の生成物にはつきものの変
化を受けやすく、主に炭水化物（セルロース、ヘミセル
ロース、ペントサン類）、少量のアルブミン、無機物お
よび脂肪ならびに酵母発酵の残りの量のエタノールおよ
び他の産物を含む。
ール蒸留廃液の成分は、天然の生成物にはつきものの変
化を受けやすく、主に炭水化物（セルロース、ヘミセル
ロース、ペントサン類）、少量のアルブミン、無機物お
よび脂肪ならびに酵母発酵の残りの量のエタノールおよ
び他の産物を含む。
【００１３】ライムギの希薄アルコール蒸留廃液の予備
処理は、実質的に、固体の除去、非揮発性成分の濃縮お
よび得られた濃縮物のオートクレーブ処理を含む。これ
らの予備処理の工程は、以下の好ましい特徴を有する： −ライムギの希薄アルコール蒸留廃液の固体構成成分
の、デカンテーションおよびプレート分離機（例えば、
SA1型Westfalia Separator AG, Oelde, Germany）を用
いる分離による除去。廃棄されるべき固体含有画分の容
量は、ライムギの希薄アルコール蒸留廃液の容量の約３
０％〜約５０％の量である。 −バキュームロータリーエバポレーター(例えば、VUV20
-I型、Schott &Gen, Jena, Germany)を、約４０℃〜約
５０℃の沸騰温度で、固体を含まないライムギの希薄ア
ルコール蒸留廃液の温度に対応した蒸気圧で用いる、固
体を含まないライムギの希薄アルコール蒸留廃液の非揮
発性成分の濃縮。これらの条件下で、固体を含まないラ
イムギの希薄アルコール蒸留廃液の約８０％〜約９０％
という所望の容量の減少が約１時間で達成される。非揮
発性成分の濃度は、したがって、約１：５〜約１：１０
になる（約５〜約１０倍） −濃縮した固体を含まないライムギの希薄アルコール蒸
留廃液の少なくとも約３０分間の約１２１℃（便利に
は、１２１±１℃）でのオートクレーブ処理。
処理は、実質的に、固体の除去、非揮発性成分の濃縮お
よび得られた濃縮物のオートクレーブ処理を含む。これ
らの予備処理の工程は、以下の好ましい特徴を有する： −ライムギの希薄アルコール蒸留廃液の固体構成成分
の、デカンテーションおよびプレート分離機（例えば、
SA1型Westfalia Separator AG, Oelde, Germany）を用
いる分離による除去。廃棄されるべき固体含有画分の容
量は、ライムギの希薄アルコール蒸留廃液の容量の約３
０％〜約５０％の量である。 −バキュームロータリーエバポレーター(例えば、VUV20
-I型、Schott &Gen, Jena, Germany)を、約４０℃〜約
５０℃の沸騰温度で、固体を含まないライムギの希薄ア
ルコール蒸留廃液の温度に対応した蒸気圧で用いる、固
体を含まないライムギの希薄アルコール蒸留廃液の非揮
発性成分の濃縮。これらの条件下で、固体を含まないラ
イムギの希薄アルコール蒸留廃液の約８０％〜約９０％
という所望の容量の減少が約１時間で達成される。非揮
発性成分の濃度は、したがって、約１：５〜約１：１０
になる（約５〜約１０倍） −濃縮した固体を含まないライムギの希薄アルコール蒸
留廃液の少なくとも約３０分間の約１２１℃（便利に
は、１２１±１℃）でのオートクレーブ処理。
【００１４】予備処理したライムギの希薄アルコール蒸
留廃液だけでなく、他の炭素源も、本発明による方法の
栄養培地のために考慮される、すなわち、とりわけ、ラ
クトース、セルロース、キシラン、コムギフスマ、グル
コースシロップおよび噴霧乾燥したコーンスティープリ
カー（corn steep liquor）である。
留廃液だけでなく、他の炭素源も、本発明による方法の
栄養培地のために考慮される、すなわち、とりわけ、ラ
クトース、セルロース、キシラン、コムギフスマ、グル
コースシロップおよび噴霧乾燥したコーンスティープリ
カー（corn steep liquor）である。
【００１５】特に好ましいさらなる炭素源は、ラクトー
ス、セルロース、オートムギの包頴のキシランである。
ス、セルロース、オートムギの包頴のキシランである。
【００１６】栄養培地のための窒素源としては、とりわ
け、硫酸アンモニウム〔（ＮＨ4)2ＳＯ4〕、アンモニア
水〔ＮＨ3−Ｈ2Ｏ〕および脱脂した大豆粗びき粉（有機
窒素源として）が考慮される。窒素含有量は、便利に
は、炭素源を基にして、少なくとも２０％の量である。
け、硫酸アンモニウム〔（ＮＨ4)2ＳＯ4〕、アンモニア
水〔ＮＨ3−Ｈ2Ｏ〕および脱脂した大豆粗びき粉（有機
窒素源として）が考慮される。窒素含有量は、便利に
は、炭素源を基にして、少なくとも２０％の量である。
【００１７】リン酸二水素カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）は、
例えば、栄養培地のためのリン源として考慮に入れる。
リン含有量は、便利には、炭素源を元にすると少なくと
も２．５％である。
例えば、栄養培地のためのリン源として考慮に入れる。
リン含有量は、便利には、炭素源を元にすると少なくと
も２．５％である。
【００１８】栄養培地は、便利には、さらなる塩を含有
し、そのため、とりわけ硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫
酸マンガンおよび硫酸亜鉛ならびに塩化カルシウムおよ
び塩化コバルトが考慮される。栄養培地は、リン源、好
ましくはリン酸二水素カリウムおよび／または塩、好ま
しくは硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガンおよび
硫酸亜鉛、ならびに塩化カルシウムおよび塩化コバルト
もまた有することができる。
し、そのため、とりわけ硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫
酸マンガンおよび硫酸亜鉛ならびに塩化カルシウムおよ
び塩化コバルトが考慮される。栄養培地は、リン源、好
ましくはリン酸二水素カリウムおよび／または塩、好ま
しくは硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガンおよび
硫酸亜鉛、ならびに塩化カルシウムおよび塩化コバルト
もまた有することができる。
【００１９】栄養分の更なる成分として、例えば、消泡
剤、例えばＭ−３０(Serva Feinbiochemica, Heidelber
g, Germany)、Glanapon DG102(Bussetti, Vienna, Aust
ria)またはMAZU 8005(Quest International, Cork, Ire
land)を用いることができる。
剤、例えばＭ−３０(Serva Feinbiochemica, Heidelber
g, Germany)、Glanapon DG102(Bussetti, Vienna, Aust
ria)またはMAZU 8005(Quest International, Cork, Ire
land)を用いることができる。
【００２０】本発明の方法において、約３５〜約４５g/
l、好ましくは約４０g/lの、培養培地の全容量を元にす
ると１０倍に濃縮された予備処理したライムギの希薄ア
ルコール蒸留廃液が用いられる。Trichoderma reeseiの
接種の容量は、便利には、培養培地の全容量の約１０％
の量である。
l、好ましくは約４０g/lの、培養培地の全容量を元にす
ると１０倍に濃縮された予備処理したライムギの希薄ア
ルコール蒸留廃液が用いられる。Trichoderma reeseiの
接種の容量は、便利には、培養培地の全容量の約１０％
の量である。
【００２１】培養のためのpH値は、便利には、約５．５
〜約６．５の範囲にあり、好ましくは約６．０である。
培養培地中でのpH値の調整は、便利には、（ＮＨ3をも
とにして）約１２．５％〜約２５％の濃度のアンモニア
水により行われる。
〜約６．５の範囲にあり、好ましくは約６．０である。
培養培地中でのpH値の調整は、便利には、（ＮＨ3をも
とにして）約１２．５％〜約２５％の濃度のアンモニア
水により行われる。
【００２２】培養温度に関しては、便利には約２８℃〜
約３４℃、好ましくは３１℃である。
約３４℃、好ましくは３１℃である。
【００２３】用いる発酵装置は、完全に従来の培養容器
（発酵槽）であってよく、外からの感染を排除するた
め、予防措置が採られている。そのような培養容器は、
通常、とりわけ、空気供給のための撹拌装置(arrangeme
nt)およびガス化装置があるが、それは、本発明により
行われる培養が微生物の通気液体培養だからである。撹
拌速度および空気供給は、便利には、培養培地中の酸素
含有量が酸素飽和値の約１０％よりも下がらないように
調節される。
（発酵槽）であってよく、外からの感染を排除するた
め、予防措置が採られている。そのような培養容器は、
通常、とりわけ、空気供給のための撹拌装置(arrangeme
nt)およびガス化装置があるが、それは、本発明により
行われる培養が微生物の通気液体培養だからである。撹
拌速度および空気供給は、便利には、培養培地中の酸素
含有量が酸素飽和値の約１０％よりも下がらないように
調節される。
【００２４】本発明による方法を行うのに特に適してい
るのは、最初の工程（バッチ相）にバッチ発酵、それに
続く基質誘導工程（流加相）を含むいわゆる「流加培養
技術」である。このバッチ相は、栄養培地中での菌糸体
の培養のために供され、それにより発酵槽の注入（接
種）が便利に３つの工程(ｉ)〜(iii)で行われる。
るのは、最初の工程（バッチ相）にバッチ発酵、それに
続く基質誘導工程（流加相）を含むいわゆる「流加培養
技術」である。このバッチ相は、栄養培地中での菌糸体
の培養のために供され、それにより発酵槽の注入（接
種）が便利に３つの工程(ｉ)〜(iii)で行われる。
【００２５】（ｉ)微生物の保存株から傾斜培養した寒
天培養物の分生子を、滅菌水道水ですすぐ。この水には
便利には乳化剤、例えばTween（登録商標）80（好まし
くはこの場合、約１g/lの濃度）を含有する。分生子懸
濁物は、少なくとも５×１０8分生子/l、特に５×１０8
〜１×１０9/lに適切に調整される。
天培養物の分生子を、滅菌水道水ですすぐ。この水には
便利には乳化剤、例えばTween（登録商標）80（好まし
くはこの場合、約１g/lの濃度）を含有する。分生子懸
濁物は、少なくとも５×１０8分生子/l、特に５×１０8
〜１×１０9/lに適切に調整される。
【００２６】(ii)Ｃ−源としてグルコースまたはセルロ
ース、リン酸、硝酸、尿素、ペプトンおよび微量元素を
基にしたTrichoderma reesei属の微生物用の公知の栄養
培地を適切に有する振盪フラスコ〔例えば、R.Haapala,
E.Parkkinen, P.Suominen andS. Linko, “Production
of extracellular enzymes by immobilized Trichoder
ma reesei in shake flask cultures”, Appl. Microbi
ol. Biotechnol. 43, 815-821(1995)を参照〕に工程
（ｉ）で製造された分生子懸濁物を注入する。栄養培地
に対する分生子懸濁物の容量比は、便利には約１：２５
〜約１：５０である。これらの振盪フラスコ内で、分生
子を約３１℃±１℃（３０℃〜３２℃）で、便利には約
３１℃で、振盪振動数を約２００〜約３００rpmで、好
ましくは約２５０rpmで、良く分枝した分生子を有する
培養培地が形成されるようになるまで培養する。胞子の
形成は認められるべきではない。
ース、リン酸、硝酸、尿素、ペプトンおよび微量元素を
基にしたTrichoderma reesei属の微生物用の公知の栄養
培地を適切に有する振盪フラスコ〔例えば、R.Haapala,
E.Parkkinen, P.Suominen andS. Linko, “Production
of extracellular enzymes by immobilized Trichoder
ma reesei in shake flask cultures”, Appl. Microbi
ol. Biotechnol. 43, 815-821(1995)を参照〕に工程
（ｉ）で製造された分生子懸濁物を注入する。栄養培地
に対する分生子懸濁物の容量比は、便利には約１：２５
〜約１：５０である。これらの振盪フラスコ内で、分生
子を約３１℃±１℃（３０℃〜３２℃）で、便利には約
３１℃で、振盪振動数を約２００〜約３００rpmで、好
ましくは約２５０rpmで、良く分枝した分生子を有する
培養培地が形成されるようになるまで培養する。胞子の
形成は認められるべきではない。
【００２７】(iii)発酵槽には、工程(ii)で生成された
培養培地が注入され、その結果、発酵槽内の栄養培地に
対する培養培地の容量比は、便利には、約１：５〜約
１：１０、好ましくは約１：５である。
培養培地が注入され、その結果、発酵槽内の栄養培地に
対する培養培地の容量比は、便利には、約１：５〜約
１：１０、好ましくは約１：５である。
【００２８】酵素の形成は、主に続く流加培養相で起き
る。誘導物質として基質溶液、好ましくは予備処理した
ライムギの希薄アルコール蒸留廃液、有機窒素源として
脱脂した大豆粗びき粉または大豆粗びき粉の浸漬液(soy
a meal liquor)、ならびに炭素源としてラクトースの添
加(基質誘導)は、分生子の特異的な二酸化炭素の放出の
制御装置または分析的に補助された工程制御という手段
により適切に調整される。基質誘導は、例えば、発酵に
より排出されたガスの二酸化炭素濃度という手段により
測定することもできるし、あるいは経験に基づいて決定
された時間管理により行うこともできる。
る。誘導物質として基質溶液、好ましくは予備処理した
ライムギの希薄アルコール蒸留廃液、有機窒素源として
脱脂した大豆粗びき粉または大豆粗びき粉の浸漬液(soy
a meal liquor)、ならびに炭素源としてラクトースの添
加(基質誘導)は、分生子の特異的な二酸化炭素の放出の
制御装置または分析的に補助された工程制御という手段
により適切に調整される。基質誘導は、例えば、発酵に
より排出されたガスの二酸化炭素濃度という手段により
測定することもできるし、あるいは経験に基づいて決定
された時間管理により行うこともできる。
【００２９】本発明の別の面によると、さらなる脱脂し
た大豆の粗びき粉または大豆の粗びき粉の浸漬液は、
（さらなる）窒素源として用いられる。さらなるキシラ
ナーゼ産生の増加は、脱脂した大豆の粗びき粉または大
豆の粗びき粉の浸漬液の予備処理したライムギの希薄ア
ルコール蒸留廃液への添加により達成されることが確立
された。したがって、脱脂した大豆の粗びき粉または大
豆の粗びき粉の浸漬液は、キシラナーゼ誘導物質の作用
を有すると考えられる。したがって、脱脂した大豆の粗
びき粉または大豆の粗びき粉の浸漬液をさらなるキシラ
ナーゼ誘導物質かつ窒素源として用いることができる。
た大豆の粗びき粉または大豆の粗びき粉の浸漬液は、
（さらなる）窒素源として用いられる。さらなるキシラ
ナーゼ産生の増加は、脱脂した大豆の粗びき粉または大
豆の粗びき粉の浸漬液の予備処理したライムギの希薄ア
ルコール蒸留廃液への添加により達成されることが確立
された。したがって、脱脂した大豆の粗びき粉または大
豆の粗びき粉の浸漬液は、キシラナーゼ誘導物質の作用
を有すると考えられる。したがって、脱脂した大豆の粗
びき粉または大豆の粗びき粉の浸漬液をさらなるキシラ
ナーゼ誘導物質かつ窒素源として用いることができる。
【００３０】脱脂した大豆粗びき粉は、大豆を挽いた便
利な市販の製品である。培養培地中の脱脂した大豆の粗
びき粉の濃度は、便利には、バッチ相で栄養培地に対し
て約２０〜３０g/l、流加培養相で基質溶液に対して約
１５〜２５g/l、好ましくはそれぞれ、約２５g/lおよび
２０g/lである。
利な市販の製品である。培養培地中の脱脂した大豆の粗
びき粉の濃度は、便利には、バッチ相で栄養培地に対し
て約２０〜３０g/l、流加培養相で基質溶液に対して約
１５〜２５g/l、好ましくはそれぞれ、約２５g/lおよび
２０g/lである。
【００３１】代わりに用いられる大豆粗びき粉の浸漬液
は、脱脂した大豆粗びき粉の成分の水溶液である。大豆
粗びき粉の浸漬液は、脱脂した大豆粗びき粉を水に懸濁
することにより製造される（約３５g/l）。この懸濁物
を、約１０分間沸騰させ、室温にまで冷却した後、固体
構成成分を濾過して除く。固体を含まない濾液（大豆粗
びき粉の浸漬液）の容量は、濾過前の大豆粗びき粉懸濁
物の容量の約８０％である。大豆粗びき粉の浸漬液は、
好ましくは流加培養相で、脱脂した大豆粗びき粉の重量
に相当する大豆粗びき粉の浸漬液の容量で、脱脂した大
豆粗びき粉の代替物として用いられる。
は、脱脂した大豆粗びき粉の成分の水溶液である。大豆
粗びき粉の浸漬液は、脱脂した大豆粗びき粉を水に懸濁
することにより製造される（約３５g/l）。この懸濁物
を、約１０分間沸騰させ、室温にまで冷却した後、固体
構成成分を濾過して除く。固体を含まない濾液（大豆粗
びき粉の浸漬液）の容量は、濾過前の大豆粗びき粉懸濁
物の容量の約８０％である。大豆粗びき粉の浸漬液は、
好ましくは流加培養相で、脱脂した大豆粗びき粉の重量
に相当する大豆粗びき粉の浸漬液の容量で、脱脂した大
豆粗びき粉の代替物として用いられる。
【００３２】本発明により製造された酵素複合体の懸濁
物の分離およびその精製と濃縮は、それ自身公知の方法
により行うことができる。これの基本的な要件は、低い
培地温度(約５℃〜約１５℃)、低いpH値(約４〜４．
５)、ならびに無菌条件である。その手順は便利には： −発酵培地からバイオマスを遠心分離または濾過ならび
に精密濾過(microfiltration)により分離すること； −限外濾過により酵素複合体を濃縮すること； −固体酵素調製物の製造のため、酵素複合体の濃縮の次
に噴霧乾燥を行うことができること、 を含む。
物の分離およびその精製と濃縮は、それ自身公知の方法
により行うことができる。これの基本的な要件は、低い
培地温度(約５℃〜約１５℃)、低いpH値(約４〜４．
５)、ならびに無菌条件である。その手順は便利には： −発酵培地からバイオマスを遠心分離または濾過ならび
に精密濾過(microfiltration)により分離すること； −限外濾過により酵素複合体を濃縮すること； −固体酵素調製物の製造のため、酵素複合体の濃縮の次
に噴霧乾燥を行うことができること、 を含む。
【００３３】本発明により得られた酵素複合体の主な適
用分野は、動物飼料製造における食品添加物としての利
用である。この酵素複合体は、未処理発酵培地として、
培養の濾液として、酵素濃縮物として、または固体調製
物として用いられる。
用分野は、動物飼料製造における食品添加物としての利
用である。この酵素複合体は、未処理発酵培地として、
培養の濾液として、酵素濃縮物として、または固体調製
物として用いられる。
【００３４】本発明は以下の実施例により例示される。
【００３５】
【実施例】キシラナーゼが豊富な酵素複合体を、Tricho
derma reesei Ｍ１８．２−ｙ（ＤＳＭ７５３７）を用
いて流加培養で製造した。
derma reesei Ｍ１８．２−ｙ（ＤＳＭ７５３７）を用
いて流加培養で製造した。
【００３６】ライムギの希薄アルコール蒸留廃液の製造
については、ライムギの希薄アルコール蒸留廃液の固体
を含まない画分を減圧下で約５０℃で７．５倍に濃縮
し、１２１℃で３０分間オートクレーブにかけた。
については、ライムギの希薄アルコール蒸留廃液の固体
を含まない画分を減圧下で約５０℃で７．５倍に濃縮
し、１２１℃で３０分間オートクレーブにかけた。
【００３７】バッチ相のための栄養培地の製造について
は、ラクトース２０．８g/l、微結晶セルロース８．３g
/l、脱脂した大豆粗びき粉２５g/l、ライムギの希薄ア
ルコール蒸留廃液濃縮物３３．３ml/l、ＫＨ2ＰＯ4
３．７５g/l、（ＮＨ4）2ＳＯ4６．０g/l、ＭｇＳＯ4・
７Ｈ2Ｏ ０．５g/l、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．５g/l、
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６．２５mg/l、ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ
２．０mg/l、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．７５mg/lおよび
ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ２．５mg/lからなる１８００mlの
栄養培地を１２１℃で５lの発酵槽内で２０分間オート
クレーブ処理し、１２．５％のアンモニア水でpHを６．
０に調整した。
は、ラクトース２０．８g/l、微結晶セルロース８．３g
/l、脱脂した大豆粗びき粉２５g/l、ライムギの希薄ア
ルコール蒸留廃液濃縮物３３．３ml/l、ＫＨ2ＰＯ4
３．７５g/l、（ＮＨ4）2ＳＯ4６．０g/l、ＭｇＳＯ4・
７Ｈ2Ｏ ０．５g/l、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．５g/l、
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６．２５mg/l、ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ
２．０mg/l、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．７５mg/lおよび
ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ２．５mg/lからなる１８００mlの
栄養培地を１２１℃で５lの発酵槽内で２０分間オート
クレーブ処理し、１２．５％のアンモニア水でpHを６．
０に調整した。
【００３８】流加培養用の基質溶液の製造については、
ラクトース３００g/l、セルロース１０g/l、大豆粗びき
粉の浸漬液５００ml/l、およびライムギの希薄アルコー
ル蒸留廃液の濃縮物１０７ml/lからなる基質および誘導
物質の溶液１０００mlを１２１℃で２０分間オートクレ
ーブ処理した。（大豆粗びき粉の浸漬液５００mlの製造
は、大豆粗びき粉２０ｇを６００mlの水に懸濁し、懸濁
物を１０分間沸騰させ、固体含有物を濾過した。）
ラクトース３００g/l、セルロース１０g/l、大豆粗びき
粉の浸漬液５００ml/l、およびライムギの希薄アルコー
ル蒸留廃液の濃縮物１０７ml/lからなる基質および誘導
物質の溶液１０００mlを１２１℃で２０分間オートクレ
ーブ処理した。（大豆粗びき粉の浸漬液５００mlの製造
は、大豆粗びき粉２０ｇを６００mlの水に懸濁し、懸濁
物を１０分間沸騰させ、固体含有物を濾過した。）
【００３９】バッチ相では、発酵槽は、３００mlの振盪
フラスコ前培養物により接種された。適当な接種物を調
整するため、１g/lのTWEEN（登録商標）80（ポリエトキ
シソルビタンオレエート）を含有する滅菌水道水約３ml
ずつを、保存株からの２つの斜面培養寒天チューブに入
れ、両方の寒天の表面からの分生子を振り落とした。次
の工程では、それぞれ１００mlの栄養培地の入った３つ
の振盪フラスコに、等量の分生子懸濁物を注入した。栄
養培地は、グルコース２０g/l、ＫＨ2ＰＯ4１５．０g/
l、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ４．８g/l、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ
０．３g/l、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．３g/l、ＦｅＳＯ4
・７Ｈ2Ｏ ５．０mg/l、ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ １．６mg/
l、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．４mg/lおよびＣｏＣｌ2・
６Ｈ2Ｏ ２．０mg/lからなる。次いで、振盪フラスコ前
培養物を３１℃で、振盪の振動数が約２５０rpmで培養
した。培地のpH値は、調整も調節もしなかった。培養の
開始時にはpH値は約５で、最後には約３．５であった。
約２８時間の培養時間の後、発酵槽にこれらの振盪フラ
スコ前培養物を注入した。次いで、pH値を１２％アンモ
ニア水で６．０に調整した。酸素含有量は、スターラー
カスケード調節を用いて、３１℃での酸素飽和値の約１
０％に保持した。２１時間培養した後、発酵槽排出ガス
中で最初にＣＯ2最大が上回り、したがってバッチ相の
終了に達した。
フラスコ前培養物により接種された。適当な接種物を調
整するため、１g/lのTWEEN（登録商標）80（ポリエトキ
シソルビタンオレエート）を含有する滅菌水道水約３ml
ずつを、保存株からの２つの斜面培養寒天チューブに入
れ、両方の寒天の表面からの分生子を振り落とした。次
の工程では、それぞれ１００mlの栄養培地の入った３つ
の振盪フラスコに、等量の分生子懸濁物を注入した。栄
養培地は、グルコース２０g/l、ＫＨ2ＰＯ4１５．０g/
l、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ４．８g/l、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ
０．３g/l、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．３g/l、ＦｅＳＯ4
・７Ｈ2Ｏ ５．０mg/l、ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ １．６mg/
l、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．４mg/lおよびＣｏＣｌ2・
６Ｈ2Ｏ ２．０mg/lからなる。次いで、振盪フラスコ前
培養物を３１℃で、振盪の振動数が約２５０rpmで培養
した。培地のpH値は、調整も調節もしなかった。培養の
開始時にはpH値は約５で、最後には約３．５であった。
約２８時間の培養時間の後、発酵槽にこれらの振盪フラ
スコ前培養物を注入した。次いで、pH値を１２％アンモ
ニア水で６．０に調整した。酸素含有量は、スターラー
カスケード調節を用いて、３１℃での酸素飽和値の約１
０％に保持した。２１時間培養した後、発酵槽排出ガス
中で最初にＣＯ2最大が上回り、したがってバッチ相の
終了に達した。
【００４０】流加培養相については、基質の不連続な添
加を、排出ガス中のＣＯ2含有量が最初の最大の８０％
まで下がった後に行った。それぞれの添加によりさらな
るＣＯ2最大に至った。この添加は、排出ガス中のＣＯ2
含有量が以前の最大の８０％まで下がった後に、自動的
に一部分ずつ行った。基質溶液の添加容量は、培養培地
１lあたりラクトース１．５ｇ、および５０時間発酵の
培養培地１lあたりラクトース２．０ｇの添加に相当し
た。
加を、排出ガス中のＣＯ2含有量が最初の最大の８０％
まで下がった後に行った。それぞれの添加によりさらな
るＣＯ2最大に至った。この添加は、排出ガス中のＣＯ2
含有量が以前の最大の８０％まで下がった後に、自動的
に一部分ずつ行った。基質溶液の添加容量は、培養培地
１lあたりラクトース１．５ｇ、および５０時間発酵の
培養培地１lあたりラクトース２．０ｇの添加に相当し
た。
【００４１】発酵は、７２時間後に、１０℃まで冷却し
pH値を４．５に調整することにより終了させた。胞子を
濾過により除き、残りの発酵溶液を分析した。発酵培地
中の酵素活性は： キシラナーゼ： ２６２５U/ml β−グルカナーゼ： ５５５U/ml カルボキシメチルセルラーゼ(CMCase) ３３０U/ml であった。発酵培地中に溶解したタンパク質の濃度は、
１７．０g/lであった。
pH値を４．５に調整することにより終了させた。胞子を
濾過により除き、残りの発酵溶液を分析した。発酵培地
中の酵素活性は： キシラナーゼ： ２６２５U/ml β−グルカナーゼ： ５５５U/ml カルボキシメチルセルラーゼ(CMCase) ３３０U/ml であった。発酵培地中に溶解したタンパク質の濃度は、
１７．０g/lであった。
【００４２】酵素およびタンパク質の測定 キシラナーゼ（エンド−１，４−β−キシラナーゼ）の
活性は、４０mM酢酸ナトリウム緩衝液中（pH６．０）
０．５％キシラン懸濁物（オートムギの包頴由来のキシ
ラン、Roth）と５０℃で２０分間インキュベーションす
ることにより測定した。１単位のキシラナーゼは、１分
あたり１モルのキシロースを放出した。
活性は、４０mM酢酸ナトリウム緩衝液中（pH６．０）
０．５％キシラン懸濁物（オートムギの包頴由来のキシ
ラン、Roth）と５０℃で２０分間インキュベーションす
ることにより測定した。１単位のキシラナーゼは、１分
あたり１モルのキシロースを放出した。
【００４３】β−グルカナーゼ（エンド−１，３−１，
４−β−グルカナーゼ）の活性は、４０mM酢酸ナトリウ
ム緩衝液中（pH６．０）０．５％リケニン懸濁物(liche
nin、Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany)と５０℃で
２０分間インキュベーションすることにより測定した。
４−β−グルカナーゼ）の活性は、４０mM酢酸ナトリウ
ム緩衝液中（pH６．０）０．５％リケニン懸濁物(liche
nin、Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany)と５０℃で
２０分間インキュベーションすることにより測定した。
【００４４】ＣＭＣase（エンド−１，４−β−グルカ
ナーゼ）の活性は、４０mM酢酸ナトリウム緩衝液中（pH
６．０）２．０％カルボキシメチルセルロースナトリウ
ム塩溶液（Carl Roth GmbH）と５０℃で２０分間インキ
ュベーションすることにより測定した。１単位（Ｕ）の
β−グルカナーゼまたはＣＭＣaseは、１分あたり１モ
ルのグルコースを放出した。
ナーゼ）の活性は、４０mM酢酸ナトリウム緩衝液中（pH
６．０）２．０％カルボキシメチルセルロースナトリウ
ム塩溶液（Carl Roth GmbH）と５０℃で２０分間インキ
ュベーションすることにより測定した。１単位（Ｕ）の
β−グルカナーゼまたはＣＭＣaseは、１分あたり１モ
ルのグルコースを放出した。
【００４５】タンパク質の測定は、bicinchonic acidに
基づくLowryによる変法を用いてタンパク質沈殿（トリ
クロロ酢酸の添加）に続いて行った。Sigma Proceduer
No.TRPO-562(Sigma Chemical Co. St.Leuis, USA)。
基づくLowryによる変法を用いてタンパク質沈殿（トリ
クロロ酢酸の添加）に続いて行った。Sigma Proceduer
No.TRPO-562(Sigma Chemical Co. St.Leuis, USA)。
Claims (1)
- 【請求項１】 Trichoderma属のキシラナーゼ産生微生
物を栄養培地内で培養することによるキシラナーゼの豊
富な酵素複合体の製造方法であって、培養物中に、予備
処理したライムギの希薄アルコール蒸留廃液をキシラナ
ーゼの誘導物質として、および同時に炭素源として用い
ることを含み、その予備処理にはライムギの希薄アルコ
ール蒸留廃液の固体構成成分の除去、水分および他の揮
発性物質の蒸発による非揮発性成分の濃縮、ならびにそ
れに続く得られたライムギの希薄アルコール蒸留廃液の
濃縮物のオートクレーブ処理を含む、製造方法。
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| PL1989302T3 (pl) | 2006-02-14 | 2019-03-29 | Bp Corp North America Inc | Ksylanazy, kodujące je kwasy nukleinowe i sposoby ich wytwarzania i stosowania |
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| CN111454817B (zh) * | 2020-03-27 | 2025-03-25 | 刘文治 | 一种利用酒糟生产发酵饲料原料的方法和装置 |
| CN116064487B (zh) * | 2023-03-21 | 2024-03-26 | 南京高新工大生物技术研究院有限公司 | 一种固定化里氏木霉高产纤维素酶的方法 |
| KR102748831B1 (ko) * | 2023-07-03 | 2025-01-03 | 전남대학교산학협력단 | 배박 효소 처리물을 유효성분으로 포함하는 장건강 개선용 조성물 및 그의 제조방법 |
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| DE291673C (ja) * | ||||
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1998
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- 1998-08-12 DE DE59810882T patent/DE59810882D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-12 EP EP98115157A patent/EP0897977B1/de not_active Expired - Lifetime
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