[go: up one dir, main page]

KR100505380B1 - 핵산의 회수기구 및 방법 - Google Patents

핵산의 회수기구 및 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR100505380B1
KR100505380B1 KR10-2003-7009955A KR20037009955A KR100505380B1 KR 100505380 B1 KR100505380 B1 KR 100505380B1 KR 20037009955 A KR20037009955 A KR 20037009955A KR 100505380 B1 KR100505380 B1 KR 100505380B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nucleic acid
solid phase
reagent
chip
recovery
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
KR10-2003-7009955A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20030078897A (ko
Inventor
사쿠라이도시나리
요코바야시도시아키
Original Assignee
가부시끼가이샤 히다치 세이사꾸쇼
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가부시끼가이샤 히다치 세이사꾸쇼 filed Critical 가부시끼가이샤 히다치 세이사꾸쇼
Publication of KR20030078897A publication Critical patent/KR20030078897A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100505380B1 publication Critical patent/KR100505380B1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/10—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices
    • G01N35/1081—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices characterised by the means for relatively moving the transfer device and the containers in an horizontal plane
    • G01N35/109—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices characterised by the means for relatively moving the transfer device and the containers in an horizontal plane with two horizontal degrees of freedom
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/02—Burettes; Pipettes
    • B01L3/0275—Interchangeable or disposable dispensing tips
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F2101/00—Mixing characterised by the nature of the mixed materials or by the application field
    • B01F2101/23—Mixing of laboratory samples e.g. in preparation of analysing or testing properties of materials
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0631—Purification arrangements, e.g. solid phase extraction [SPE]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N2035/00178—Special arrangements of analysers
    • G01N2035/00237—Handling microquantities of analyte, e.g. microvalves, capillary networks
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/10—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices
    • G01N2035/1027—General features of the devices
    • G01N2035/103—General features of the devices using disposable tips
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/10—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices
    • G01N2035/1027—General features of the devices
    • G01N2035/1048—General features of the devices using the transfer device for another function
    • G01N2035/1058—General features of the devices using the transfer device for another function for mixing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/0099—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor comprising robots or similar manipulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/02—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor using a plurality of sample containers moved by a conveyor system past one or more treatment or analysis stations
    • G01N35/028—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor using a plurality of sample containers moved by a conveyor system past one or more treatment or analysis stations having reaction cells in the form of microtitration plates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/10—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices
    • G01N35/1004—Cleaning sample transfer devices
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y10T436/25375—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.]
    • Y10T436/255—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.] including use of a solid sorbent, semipermeable membrane, or liquid extraction

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Devices For Use In Laboratory Experiments (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)
  • Automatic Analysis And Handling Materials Therefor (AREA)

Abstract

본건 발명은, 핵산을 함유하는 생물시료로부터 간편하게 핵산의 회수를 하기 위한 핵산의 회수기구와 방법을 제공한다.
실리카함유의 고상을 액체에 접촉 가능한 상태로 내장한 핵산 포착용 칩으로서, 고상이 통수부를 가지고, 통수부에 있어서의 고상과 고상과의 평균간격이 25㎛ 이하가 되도록 한다.

Description

핵산의 회수기구 및 방법{INSTRUMENT AND METHOD FOR COLLECTING NUCLEIC ACIDS}
본 발명은, 핵산의 회수장치에 관한 것으로, 핵산을 함유하는 물질로부터의 핵산의 회수기구에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 핵산의 검사에 의한 유전자진단을 위한 체액성분으로부터의 내인성, 또는 외래성의 유전자로서 존재하는 핵산성분의 회수기구에 관한 것이다.
분자생물학의 진보에 따라, 유전자에 관한 수많은 기술이 개발되고, 또 그들 기술에 의하여 많은 질환성 유전자가 분리·동정되었다. 그 결과, 의료분야 에서도 진단, 또는 검사법에 분자생물학적인 기법이 도입되어, 종래 불가능하였던 진단이 가능하게 되거나, 검사일수의 대폭 단축이 달성되고 있다.
이 급격한 진보는, 주로 핵산증폭법, 특히 PCR법[polymerase chain reaction : 폴리머라제 연쇄반응, Saiki et al., Science, 239, 487-491(1988)]에 의존하는 바가 크다. PCR법은, 용액 중의 핵산을 배열 특이적으로 증폭시키는 것이 가능하기 때문에, 예를 들면 혈청 중에 극미량밖에 존재하지 않는 바이러스를 그 바이러스의 유전자인 핵산을 증폭하여 검출함으로써, 간접적으로 증명할 수 있다.
그러나, 이 PCR법을 임상 장소에서 일상검사에 사용하였을 때에, 몇가지 문제점이 존재한다. 그 중에서도 특히 전처리에 있어서의 핵산의 추출, 정제공정의 중요성이 지적되고 있다[오시마 외, JJCLA, 22(2),145-150(1997)]. 이것은 핵산정제시에 제거하지 못한 저해인자의 영향에 의한 것으로, 혈액 중의 헤모글로빈, 추출공정에서 사용되는 계면활성제 등이 알려져 있다. 또 추출공정에 관해서는 사용방법에 따른 번잡한 조작과 숙련자에 의한 막대한 노동력이 필요하게 된다. 그 때문에 병원의 검사실에 신규로 유전자검사를 도입할 때의 장해가 되고 있어, 이 공정의 자동화가 열망되고 있다.
또 분자생물학적인 연구를 행하는 기관에서는, 유전자 재조합 조작을 행하기 위한 재료로서, 플라스미드 DNA가 빈번하게 사용되고 있으나, 노동력을 줄이고자 하는 점 등으로부터, 검사실의 경우와 마찬가지로, 핵산을 추출하여 정제하는 공정의 자동화가 요망되고 있다.
핵산을 함유하는 생물시료로부터 저해인자를 함유하지 않는 정제도가 높은 상태로 핵산을 회수하기 위한 종래의 방법으로서는, 단백질분해효소의 존재 하에서 생물시료에 계면활성제를 작용시켜, 핵산을 유리상으로 하고, 페놀(및, 클로로포름)과 혼합하여, 원심분리기에 의한 수상(水相)·유기상(有機相) 분리를 수회 행한 후, 수상으로부터 알콜에 의하여 침전물의 형태로 핵산을 회수하는 방법이 알려져 있다. 그러나, 이 조제방법은 공정 내에 극물(劇物)인 페놀 등의 유기용제를 사용하고, 또는 원심분리공정을 필요하기 때문에, 원심분리기의 로터에 대한 용기의 출입이나 원심분리 후의 용액의 분취(分取) 등의 자동화가 매우 곤란하다는 문제가 존재한다.
일본국 특허제2680462호에는, 카오트로픽물질의 존재 하에서 핵산과 결합하는 것이 가능한 실리카입자를 핵산결합용 고상(固相)으로서 사용하는 것을 나타내고 있다. 이 특허2680462에는, 실리카입자의 현탁액과 카오트로픽물질로서의 구아니딘티오시아네이트 완충액을 넣은 반응용기에, 핵산을 함유하는 시료를 가하여 혼합하고, 핵산이 실리카입자에 결합한 복합체를 원심분리에 의하여 침강시킨 후, 상청(上淸)을 폐기하고, 남은 복합체에 세정액을 가하여 세정하고, 재침전시킨 복합체를 에탄올수용액으로 세정한 후 아세톤으로 세정하고, 아세톤을 제거하여 건조시킨 복합체에 용리용 완충액을 가하여 핵산을 용리하여 회수하는 방법이 기재되어 있다.
또 일본국 특개평7-250681호 공보는, 유리분말층을 2매의 유리섬유필터와 멤브레인필터에 끼운 4겹 구조의 여과부재를 가지는 카트리지용기를 사용하여 DNA 추출액을 정제하는 방법을 나타내고 있다. 이 일본국 특개평7-250681호 공보에서는, 조제된 DNA 함유 배양액을 전처리하여 트랩필터에 집균하고, 용리용 시약을 첨가하여 플라스미드 DNA를 세포 밖으로 용출시킨 것을 정제용 시료로 한다. 정제공정에서는, 카트리지용기에 정제용 시료와 요오드화나트륨을 첨가하여, 카트리지용기에 진공감압, 또는 원심분리처리를 행하여, 카트리지용기의 유리분말층에 플라스미드 DNA를 흡착시킨다. 이어서, 카트리지용기에 세정용 완충액을 첨가하여 진공감압, 또는 원심분리처리에 의하여 세정하고, 그후 카트리지용기에 용출용 완충액을 가하여 진공감압, 또는 원심분리처리를 행하여, 플라스미드 DNA를 용출한다.
또한, 일본국 특개평11-266864호 공보는, 실리카함유의 고상을 내장한 핵산포착용 칩에 의한 핵산의 정제방법과 정제용 장치를 나타내고 있다. 이 방법에서는 핵산포착용 칩을 액체 흡배용 가동 노즐에 탈착 가능하게 접속하고, 고상에의 핵산의 결합을 촉진시키는 물질과 핵산함유 시료와의 혼합액을 소정용기로부터 액체 흡배용 가동 노즐에 접속된 핵산포착용 칩 내로 흡인하여, 핵산을 고상에 결합시킨 후, 핵산포착용 칩 내의 액체를 배제하고, 이어서 세정액을 흡인, 배출함으로써 핵산 포착 칩 내를 세정하고, 세정후의 핵산포착용 칩 내에 용리액을 흡입하여, 고상으로부터 용리된 핵산을 함유하는 용리액을 정제품 용기에 토출한다.
도 1은 본 발명의 실시예인 핵산 포착용 칩의 도면,
도 2는 본 발명의 실시예인 핵산 정제용 장치의 평면도,
도 3은 도 2의 핵산 정제용 장치의 개략 외관도,
도 4는 도 2의 실시예에 있어서의 전기계의 구성을 나타내는 블록 다이어그램,
도 5는 도 2의 실시예에 있어서의 핵산 포착용 칩을 접속한 분주기의 개략구성을 나타내는 도,
도 6은 도 2의 실시예에 있어서의 칩을 노즐에 설치하는 동작의 설명도,
도 7은 도 2의 실시예에 있어서의 칩을 노즐로부터 떼어 내는 동작의 설명도,
도 8은 본 발명의 실시형태 1에 의한 결과를 나타내는 그래프,
도 9는 본 발명의 실시형태 1에 의한 결과를 나타내는 그래프이다.
※도면의 주요부분에 대한 부호의 설명
10, 32 : 실린지 펌프 12 : 검체랙
15 : 분주용 칩 16, 33 : 아암
17, 34 : 노즐홀더 19 : 세정액병
20 : 용리액병 22 : 결합촉진제병
24 : 처리용기 26 : 정제품용 용기
27 : 칩 분리기 31, 31a, 31b : 핵산 포착용 칩
36 : 분주 노즐 39 : 액체 흡배용 가동노즐
상기한 선행기술 중, 일본국 특허제2680462호에서는, 극물인 페놀의 사용은 피할 수 있으나, 실리카입자에 핵산을 결합시킨 후의 실리카입자와 용액의 분리에는 원심분리공정을 필요로 하여, 페놀에 의한 추출법과 마찬가지로 원심분리공정의 자동화가 문제가 된다.
또 일본국 특개평7-250681호 공보에 기재된 방법에서는, 유리분말층을 2매의 유리섬유필터와 멤브레인필터에 끼워 넣은 카트리지용기로 함으로써, 원심분리처리의 공정을 진공감압으로 치환하는 것은 가능하여, 자동화에 적합한 방법이라고 할 수 있으나, 용액의 흐름이 한 방향으로 한정되어, 플라스미드 DNA, 또는 용출용 완충액과 유리분말의 접촉효율이 저하되어 회수효율에 악영향을 준다.
또한, 일본국 특개평11-266864호 공보에 기재된 방법에서는, 고상을 내장한 핵산포착용 칩을 액체 흡배용 가동노즐에 탈착 가능하게 접속함으로써, 용액의 흐름을 쌍방향으로 함으로써, 핵산, 또는 용리액과 고상의 접촉효율을 향상시키고, 또한 용이하게 자동화가 가능한 방법이나, 그 핵산포착용 칩에 관하여 구성예에 관해서는 기재되어 있으나, 보다 바람직한 사용형태에 관한 기재는 되어 있지 않았다.
본 발명의 목적은, 핵산을 함유하는 재료로부터의 신속, 간편하고, 신뢰도가 높은 핵산 회수기구와 핵산 회수방법의 제공에 있고, 특히 생물시료 중에 존재하는 핵산성분의 회수에 바람직한 기구와 방법의 제공에 있다.
또 본 발명의 목적은, 핵산을 함유하는 재료로부터의 자동화에 적합한 핵산 회수기구와 핵산 회수방법의 제공에 있고, 특히 생물시료 중에 존재하는 핵산성분의 자동회수에 바람직한 기구와 방법의 제공에 있다.
본 발명에 의거하는 핵산의 회수기구는, 바람직하게는 핵산 포착 칩이다. 본 발명은, 실리카 함유의 고상을 액체에 접촉 가능한 상태로 내장한 핵산 회수기구에 있어서, 고상이 통수부를 가지고, 그 통수부에 있어서의 고상과 고상과의 평균간격이 25㎛ 이하인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의거하는 핵산의 회수기구는, 실리카 함유의 고상을 액체에 접촉 가능한 상태로 내장한 핵산 포착용 칩에 있어서, 고상이 통수부를 가지고, 그 통수부에 있어서의 고상과 고상과의 평균간격이 25㎛ 이하인 것을 특징으로 하는 핵산 포착 칩을 사용하여,
핵산을 함유하는 샘플로부터, 핵산을 유리하기 위한 제 1 시약을 혼합하여, 핵산의 유리를 촉진하는 제 1 공정과,
유리된 핵산을 함유하는 액과 제 2 시약을 혼합한 후, 압력변화에 의하여 핵산 포착 칩 내로 흡인하여, 고상과 혼합액을 접촉시켜 토출하는 제 2a 공정과,
고상을 세정하기 위하여 제 2 시약을, 압력변화에 의하여 핵산 포착 칩 내로 흡인하여, 고상과 제 2 시약을 접촉시킨 후, 토출하는 제 2b 공정과,
고상 및 핵산 포착 칩 내에 잔존하는 제 1 시약, 및/또는 제 2 시약을 제거하기 위하여 제 3 시약을 압력변화에 의하여 핵산 포착 칩 내로 흡인하여, 고상과 제 3 시약을 접촉시킨 후, 토출하는 제 3a 공정과,
핵산 포착 칩 내에서 제 3 시약의 제거를 촉진하기 위하여, 핵산 포착 칩 내에 통기를 행하는 제 3b 공정과,
잔존하는 제 3 시약을 세정하기 위하여 , 제 4 시약을 압력변화에 의하여 핵산포착 칩 내로 흡인하여, 고상과 제 4 시약을 접촉시킨 후, 토출하는 제 4 공정과,
고상으로부터 핵산을 용리하기 위하여 제 5 시약을 압력변화에 의하여 핵산 포착 칩 내로 흡인하여, 고상과 제 5 시약을 접촉시킨 후, 토출하는 제 5 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한 고상이, 입상물 또는 섬유상물로 이루어지는 경우는, 평균 구멍지름은 평균간격의 것을 의미하고, 25㎛ 이하인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는, 처리대상의 시료가 바뀔 때마다 핵산 포착용 칩은, 새로운 것으로 교환된다. 또 제 2a, 제 2b, 제 3a, 제 4, 제 5의 각 공정에서는, 일단 흡입한 용액을 소정의 용기에 토출하고, 다시 핵산 포착용 칩 내로 흡인하는 것을 반복하여 행하여, 고상과 용액의 접촉확립을 높게 한다. 또한 제 2a, 제 2b 공정에서의 토출시에는, 용액의 전량 토출에 따라, 거품의 발생, 재흡인시의 흡인 저항증대 등의 불편이 발생하기 때문에, 그 전량을 토출하지 않고, 고상부가 반드시 용액에 접한 상태를 유지하도록 제어하는 것이 바람직하다.
핵산함유 시료로서는, 전혈, 혈청, 객담, 소변 등의 생체시료나 배양세포, 배양세균 등의 생물학적인 시료, 또는 전기영동 후의 겔로 유지된 상태의 핵산, DNA 증폭효소 등의 반응산물이나 소정제상태의 핵산을 함유하는 물질 등을 대상으로 할 수 있다. 또한 여기서의 핵산이란, 2본쇄, 1본쇄, 또는 부분적으로 2본쇄 또는 1본쇄구조를 가지는 디옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)을 함유한다.
핵산 포착용 칩에 내장되는 고상은, 유리입자, 실리카입자, 석영여과지 및 그 파쇄물, 석영울, 규조토 등 산화규소를 함유하는 물질, 또는 플라스틱 등의 표면에 실리카를 피복한 물건 등, 산화규소를 함유하는 것이면 이용이 가능하다. 고상은 사용 중에 칩 내에 남긴 상태로 하는 것, 즉 고상이 칩 밖으로 나오지 않도록 고상을 유지하는 것이 필요하여, 칩 내에 통수부분을 가진 상태로 설치될 필요가 있고, 또 이 통수부분은 연속되어 있는 것이 바람직하다. 고상의 형상으로서는, 다공성, 입상, 섬유상이 있고, 통수부분에 있어서의 고상과 고상과의 평균간격이란, 다공성재이면 그 구멍 내의 평균 구멍지름을 의미하고, 입자형상물, 섬유형상물이면 입상물 사이 또는 섬유상물 사이의 평균간격의 것을 의미하며, 각각 25㎛ 이하이다. 본 발명의 바람직한 고상은 석영울이고, 바람직하게는 그 양측에 석영입자를 소결시켜 작성한 유지재를 배치하여 고상으로서 사용하는 석영울 사이의 평균간격을 제어한다.
또한 여기서 석영울 사이의 평균간격이란, 석영울이 원주형상이라고 가정하고, 그것을 균일하게 공간 내에 배치하였을 때에 생기는 석영울과 석영울 사이의 평균적인 간격을 나타내고, 석영울을 설치하는 공간의 체적과 단면적과 길이, 설치하는 석영울의 중량과 비중과 평균직경에 의하여 결정된다.
예를 들면, 석영울을 설치하는 부분의 형상이 반경 1.5mm의 원주형상이고, 석영울을 설치하는 길이가 h인 경우, 석영울의 비중을 2.22g/㎤, 석영울의 평균반경을 4.5㎛, 설치하는 석영울의 양을 5mg으로 한 경우, 석영울 사이의 평균간격(l)은 다음의 식에 의하여 산출할 수 있다.
l [m] = 5.O4 ×1O-4 ·h1/2 - 9.0 ×1O-6
핵산 포착용 칩에 압력변화에 의하여 흡인과 토출을 행하게 하기 위한 장치로서는, 핵산 포착용 칩의 한쪽 끝과 꼭 맞는 형상을 가지고, 압력변화를 의도적으로 부여할 수 있는 것이면, 특별히 제한되지 않고, 수동의 피펫이나 실린지를 이용할 수 있으나, 안정적인 핵산회수를 위해서는 흡인량, 토출량, 흡인속도, 토출속도 등의 제어가 필요하기 때문에, 자동장치와의 조합이 바람직하다.
제 1 공정에서 사용하는 시약으로서는, 핵산함유 시료로부터 핵산의 유리를 촉진할 수 있으면 사용 가능하나, 고점도인 물질의 사용은 바람직하지 않다. 또 회수대상으로 하는 핵산이 RNA인 경우에는, RNA 분해효소에 의한 작용을 방지하기 위하여 RNase 저해제의 첨가나 구아니딘티오시아네이트의 사용이 바람직하다.
제 2a 공정에서 사용하는 시약으로서는, 실리카를 함유하는 고상에의 핵산의 결합을 촉진하는 물질이면 사용 가능하고, 일반적으로 카오토픽시약이라 불리우는 것을 사용할 수 있다. 이때 회수대상이 RNA인 경우에는, 제 1 공정과 동일한 이유때문에 구아니딘티오시아네이트를 사용하는 것이 바람직하고, 최종 농도는 3mol/L 이상, 최종 pH가 산성인 것이 바람직하다.
제 3a 공정에서 사용하는 시약으로서는, 핵산의 고상에의 결합을 유지하면서, 제 2 공정에서 사용한 핵산의 결합을 촉진하는 물질을 세정하는 것이면 사용 가능하고, 에틸알콜, 이소프로필알콜 등을 70% 이상의 농도로 사용하는 방법이 공지이나, 회수 후의 핵산을 PCR 등에 이용할 때에는, 이들 물질이 악영향을 미치는 것이 알려져 있어, 사용하는 농도는 그 소정의 기능을 가지는 범위에서 가능한 한 낮은 농도로 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서의 바람직한 실시예에서는, 그러한 점에서, 25mmol/L 아세트산 칼륨을 함유하는 50% 에틸알콜을 사용한다.
제 4 공정에서 사용하는 시약으로서는, 핵산의 고상에의 결합을 가능한 한 유지하면서, 제 3 공정에서 사용한 알콜을 세정하고, 최종공정으로 제 3 공정에서 사용한 시약이 넘어가는 것을 피할 필요가 생긴다. 본 발명에 있어서의 바람직한 실시예에서는 그러한 점에서 50mmol/L의 아세트산 칼륨을 사용하고, 또한 액온이 20℃ 이하인 상태로 사용한다.
제 5 공정에서 사용하는 시약으로서는, 고상으로부터 핵산을 용리하는 작용을 가지는 물질이면 사용 가능하고, 저염농도의 수용액이나 순수가 공지의 방법이다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는, 10mmol/L 비신(pH 8.5), 0.1mmol/L EDTA를 사용한다.
이하, 본 발명에 의거하는 일 실시예인 핵산 회수기구를 도 1을 참조하여 설명한다.
도 1은 핵산 포착용 칩의 구성을 나타내는 도면이다. 핵산 포착용 칩(31)은, 상단이 압력변화를 발생시키는 기구, 또는 자동장치의 접속 노즐의 선단에 기밀하게 감합되는 내경을 가지고 있고, 하단을 향하여 서서히 내경이 가늘어지도록 형성된다. 핵산 포착용 칩(31)은 투명 또는 반투명한 합성수지로 이루어진다. 칩 (31)의 선단측에는 고상이 유출하는 것을 방지하기 위하여, 및 고상의 평균간격을 규정하기 위한 원판형상의 저지부재(101a)를 칩(31)의 상단으로부터 압입하여, 고상(102)을 끼우는 형태로, 저지부재(101b)를 고상(102)이 소정의 평균간격을 유지할 수 있도록 설치한다. 이들 저지부재(1O1a, 1O1b)는, 액체 및 기체가 용이하게 통과할 수 있는 다수의 구멍을 가지나, 그 구멍은 고상(102)의 유출을 저지할 수 있는 크기이다.
저지부재(1O1a, 1O1b)의 재질로서는, 직경 약 0.1mm의 석영입자를 핵산 포착용 칩(31)의 소정위치의 내경에 맞춘 형상으로 소결시킨 것을 사용한다.
고상으로서 석영울(도시바 케미컬제품, 그레이드 B, 울의 직경 6∼12㎛) 5mg을 사용한다.
다음에, 핵산 포착용 칩과 조합시켜 사용하는 핵산 정제용 장치를 도 2 내지 도 7을 참조하여 설명한다. 도 2는 일 실시예의 장치의 평면도, 도 3은 그 외관도, 도 4는 전기계의 블록 다이어그램, 도 5는 핵산 포착용 칩을 접속한 분주기의 개략도, 도 6은 액체 분주용 칩의 설치동작의 설명도, 도 7은 칩을 떼어 내는 동작의 설명도이다.
도 2 및 도 3에 있어서, 핵산의 정제용 장치(100)는 수평방향(X 방향)으로 이동 가능한 2개의 아암(16, 33)을 구비한다. 한쪽의 아암(16)에는 분주노즐(36) (도 6)을 유지하는 노즐 홀더(17)가 아암(16)의 길이방향을 따라 수평방향(Y 방향)으로 이동 가능하게 설치되어 있다. 다른쪽 아암(33)에는 액체 흡배용 가동노즐(39)(도 5)을 유지하는 노즐 홀더(34)가 아암(33)의 길이방향을 따라 수평방향(Y 방향)으로 이동 가능하게 설치되어 있다. 노즐 홀더(17, 34)는, 대응하는 아암(16, 33)에 대하여 모두 상하방향(Z 방향)으로 동작할 수 있다. 아암(16)의 수평이동영역과 아암(33)의 수평이동영역은, 부분적으로 오버랩되기 때문에, 각 아암의 설치높이위치를 다르게 하고 있다.
본체 가대의 작업면(5)에는, 미사용의 다수의 분주용 칩(15)을 탑재한 3개의 칩랙(14a, 14b, 14c)이 소정의 영역에 세트된다. 이들 칩랙(14)은, 도 6에 나타내는 바와 같이, 각 분주용 칩(15)을 삽입할 수 있는 구멍을 가지고 있고, 분주용 칩의 선단이 작업면(5) 또는 칩랙 바닥면에 접촉하지 않는 높이를 가진 박스형을 이룬다. 각 칩랙(14a, 14b, 14c)은 각각 최대 48개까지의 분주용 칩(15)을 유지할 수 있다.
또 작업면(5)에는, 미사용의 다수의 핵산 포착용 칩(31)을 탑재한 칩랙(30)이 소정 영역에 세트된다. 칩랙(30)의 형상은, 앞의 칩랙(14)과 동일하다. 이 예에서는 칩랙(30) 위에 최대 48개까지의 핵산 포착용 칩(31)을 유지할 수 있다.
작업면(5)에는, 처리대상이 되는 검체, 즉 핵산을 함유하는 시료를 수용한 검체용기(13)가 복수개씩 유지되는 검체랙(12)이 소정영역에 세트된다. 이 예에서는 각 검체랙(12)은 6개의 검체용기(13)를 유지할 수 있다. 또 검체랙(12)은 8개 또는 그 이상의 수를 세트할 수 있다.
또 작업면(5)에는, 미사용의 처리용기(24)를 다수 유지한 용기랙(23)이 소정 영역에 세트된다. 용기랙(23)은, 최대 48개까지의 처리용기(24)를 유지할 수 있다. 또한 작업면(5)에는 미사용의 정제품용 용기(26)를 다수 유지한 용기랙(23)이 소정영역에 세트된다. 이 정제품용 용기는, 정제처리가 이루어진 핵산 함유액을 시료별로 회수하는 것이다. 이 예에서는 용기랙(25)은, 최대 48개의 정제품용 용기 (26)를 유지할 수 있다.
작업면(5)에는 프라이밍시에 분주노즐(36)로부터 방출되는 물을 받아 들임과 동시에 분주노즐(36)의 홈포지션이 되는 액받이부(11)와, 분주작업을 하는 분주칩 (15)을 세정하기 위한 세정부(18)와, 분주노즐(36)에 접속된 분주용 칩(15) 및 액체 흡배용 가동노즐(39)에 접속된 핵산 포착용 칩(31)을 각각의 노즐로부터 떼어 내기 위한 칩 분리기(27)와, 프라이밍시에 액체 흡배용 가동노즐(39)로부터 방출되는 물을 받아 들임과 동시에 상기 가동노즐(39)의 홈포지션이 되는 액받이부(28)와, 핵산 포착용 칩(31)으로부터의 불필요한 액을 배출하기 위한 폐액구(29)가 설치된다.
또 작업면(5)상의 각각의 소정위치에는, 제 3a 공정에서 사용하는 제 3 시약병(19), 제 5 공정에서 사용하는 제 5 시약병(20), 제 1 공정에서 사용하는 제 1 시약병(21), 제 4 공정에서 사용하는 제 4 시약병(102) 및 제 2a, 제 2b 공정에서 사용하는 제 2 시약병(22) 등이 세트된다.
도 6에 나타내는 실린지 펌프(10)와 도 5에 나타내는 실린지 펌프(32)는, 각각 본체 가대에 설치되어 있고, 액체의 흡입동작과 토출동작의 제어가 각 펌프 독자로 이루어진다. 도 6에 나타내는 바와 같이, 노즐 홀더(17)에 유지된 분주 노즐(36)은, 가요성의 관(42)을 거쳐 액체 흡배용의 실린더 펌프(10)에 연통되어 있다. 분주 노즐(36) 내 및 관(42) 내에는 순수가 채워져 있고, 실린지 펌프(10)는 도시 생략한 순수공급원에 접속되어 있다. 도 5에 나타내는 바와 같이, 노즐 홀더 (34)에 유지된 가동노즐(39)은, 가요성의 관(35)을 거쳐 실린지 펌프(32)에 접속되어 있다. 가동노즐(39)내 및 관(35)내에는 순수가 채워져 있고, 실린지 펌프(32)는 도시 생략한 순수 공급원에 접속되어 있다.
분주노즐(36)에 대한 분주용 칩(15)의 접속을 위한 장착 및 가동노즐(39)에 대한 핵산 포착용 칩(31)의 접속을 위한 장착은, 각각 대응하는 칩랙(14, 30) 위에 있어서, 각 노즐을 강하시켜 칩을 노즐의 선단에 끼워 맞춤으로써 달성된다. 또 분주노즐(36)에 접속된 분주용 칩(15) 및 가동노즐(39)에 접속된 핵산 포착용 칩(31)을 각각의 노즐로부터 떼어 내는 경우는, 칩 분리기(27)를 이용한다. 도 2 및 도 7에 나타내는 바와 같이 칩 분리기(27)는, 소정의 높이위치에 판상부재를 가지고 있고, 이 판상부재에는, 분주칩(15)의 머리부(52)및 핵산 포착용 칩(31)의 머리부 (54)의 외경보다도 작고, 또한 분주노즐(36) 및 가동노즐(39)의 외경보다 큰 폭의 슬릿(55)이 형성되어 있다. 슬릿(55)이 위치하는 높이보다도 각 칩의 머리부(52, 54)가 낮은 상태로 노즐(36, 39)을 슬릿 내에 침입하도록 수평 이동시키고, 이어서 노즐 홀더(17, 34)를 상승시키면 머리부(52, 54)가 판상부재의 하면에 맞닿고, 노즐 홀더의 추가 상승에 의하여 칩(15, 31)이 노즐로부터 빠져 떨어진다. 빠져 떨어진 칩은 칩 폐기구(50)(도 2)로 낙하하여 회수박스(도시 생략) 내로 회수된다.
도 4에, 도 2의 핵산 정제용 장치의 전기계의 구성을 나타낸다. 동작제어부로서의 퍼스널펌퓨터(PC)(60)에는, 조작조건 및 검체정보를 입력하기 위한 조작패널로서의 키보드(61), 입력정보나 경고정보 등을 표시하기 위한 표시장치로서의 CRT (62), 장치의 각 기구부를 제어하는 기구제어부(65) 등이 접속된다. 기구제어부 (65)는, 실린지 펌프(10)에 흡배동작을 행하게 하게 하기 위한 피스톤 구동용 스테핑모터(71), 실린지 펌프(32)에 흡배동작을 행하게 하게 하기 위한 피스톤 구동용 스테핑모터(72), 노즐 홀더(17)를 수평이동 및 상하 이동시키기 위한 스테핑모터 (73), 노즐 홀더(34)를 수평이동 및 상하 이동시키기 위한 스테핑모터(74), 아암 (16)을 수평 이동시키기 위한 AC 서보모터(75), 아암(33)을 수평 이동시키기 위한 AC 서보모터(76) 등을 제어한다. 정제장치의 각 부는, 소정의 프로그램에 따라 동작된다.
다음으로, 사용하는 고상의 평균간격에 차이를 가지게 한 도 1에 나타내는 핵산 포착용 칩을 사용하여, 도 2의 핵산 정제장치에 의하여 혈청 중의 C형 간염 바이러스의 유전자를 회수하였을 때의 실험예를 설명한다. 처리용 시료는, WHO의 국제표준(International Standard)으로 가치부여를 행한 2차 표준 C형 간염 혈청을 C형 간염 음성의 혈청으로 100IU/mL 가 되도록 조제하여, 도 2의 장치의 검체용기(13)에 분주하였다. 도 2의 장치의 자동조작에 의하여 아암(16), 노즐 홀더(17)에 의하여 분주용 칩(15)을 설치하고, 검체용기(13)로부터 200㎕의 시료를 흡인하여, 처리용기 (24)에 분주하였다. 시료분주 후, 아암(16), 노즐 홀더(17)의 동작에 의하여 사용한 분주용 칩(15)을 칩 분리기(27)의 작용에 의하여 떼어 낸다. 그후 아암(16), 노즐 홀더(17)에 의하여 신규로 분주용 칩(15)을 설치하고, 제 1 시약병(21)으로부터 700㎕의 제 1 시약을 흡인하여, 시료를 분주한 처리용기(24)에 토출하고, 그대로 5회 흡인·토출을 행하여, 전량을 처리용기(24)에 토출하여 10분간 방치하였다. 또한 여기서 제 1 시약에는, 2% Triton X-100(LKB제), 5.5mol/L 구아니딘티오시안산염 (와코쥰야쿠고교(주), 생화학용)을 함유하는 MES(2-morpholino-ethane sulfonic acid : 2-모르폴리노에탄술폰산, (주)도진 카가쿠연구소제품) 완충액을 사용하였다.
토출후, 아암(16), 노즐 홀더(17)의 동작에 의하여 사용한 분주용 칩(15)을 칩 분리기(27)의 작용에 의하여 떼어낸다. 소정의 시간이 경과한 후, 아암(16), 노즐 홀더(17)에 의하여 신규로 분주용 칩(15)을 설치하고, 제 2 시약병(22)로부터 제 2 시약을 100㎕ 흡인하여, 시료와 제 1 시약의 혼합액이 들어 간 처리용기(24)에 토출하여 5회 흡인·토출을 행하고, 전량을 처리용기(24)에 토출하였다. 또한 여기에서 제 2 시약에는, 1% Triton X-100 (LKB제품), 5.0mol/L 구아니딘테오시안산염(와코쥰야쿠고교(주)제품, 생화학용)을 함유하는 MES((주)도진 카가쿠연구소제품)완충액을 사용하였다.
그 사이에, 아암(33), 노즐 홀더(34)에 의하여 핵산 포착용 칩(31)을 설치하고, 시료, 제 1 시약, 제 2 시약의 혼합액을 처리용기(24)로부터 실린지(32)의 동작에 의하여 흡인하였다.
흡인 후, 흡인한 혼합액을 핵산 포착 칩(31)의 위쪽의 저지부재(101b)를 혼합액이 넘지 않은 위치까지, 처리용기(24)에 토출하고, 다시 핵산 포착 칩(31)의 아래쪽의 저지부재(101a)를 혼합액이 넘지 않는 위치까지 흡인한다. 이 흡인과 토출의 조작을 10회 반복한 후, 처리용기(24) 내의 혼합액을 전량 흡인하고, 다시 유지부재 (101a)를 혼합액이 넘지 않는 위치까지 공기를 흡인한다. 그후 아암(33), 노즐 홀더(34)의 제어에 의하여 액받이(29)로 핵산 포착 칩(31)을 이동시켜, 흡인한 혼합액을 유지부재(101b)를 넘지 않는 위치까지 토출하고 다음 동작까지 대기한다.
그 사이에 아암(16), 노즐 홀더(17)에 의하여 신규로 분주용 칩(15)을 설치하고, 제 2 시약병(22)으로부터 800㎕의 제 2 시약을 흡인하여 처리용기(24)에 전량을 토출하였다. 토출 후, 아암(16), 노즐 홀더(17)의 동작에 의하여 사용한 분주용 칩(15)을 칩 분리기(27)의 작용에 의하여 떼어 낸다. 그 사이에 아암(33), 노즐 홀더(34)의 제어에 의하여 핵산 포착 칩(31)을 이동시키고, 제 2 시약을 혼합액의 경우와 동일한 동작에 의하여 5회 흡인과 토출을 반복한 후, 처리용기(24) 내의 혼합액을 전량 흡인하고, 다시 유지부재(101a)를 혼합액이 넘지 않는 위치까지 공기를 흡인한다. 그후 아암(33), 노즐 홀더(34)의 제어에 의하여 액받이(29)로 핵산 포착 칩 (31)을 이동하여 흡인한 제 2 시약을 유지부재(101b)를 넘지 않는 위치까지 토출하고, 다음 동작까지 대기한다.
그 사이에, 아암(16), 노즐 홀더(17)에 의하여 신규로 분주용 칩(15)을 설치하고, 제 3 시약병(19)로부터 400㎕의 제 3 시약을 흡인하여 처리용기(24)에 전량을 토출하였다. 토출 후, 아암(16), 노즐 홀더(17)의 동작에 의하여 사용한 분주용 칩(15)을 칩 분리기(27)의 작용에 의하여 떼어낸다. 그 사이에 아암(33), 노즐 홀더(34)의 제어에 의하여 핵산 포착 칩(31)을 이동시키고, 제 3 시약을 혼합액의 경우와 동일한 동작에 의하여 3회 흡인과 토출을 반복하여 제 1 회째의 세정을 행한다. 세정 후, 처리용기(24) 내의 혼합액을 전량 흡인하고, 다시 유지부재(101a)를 혼합액이 넘지 않는 위치까지 공기를 흡인한다. 그후 아암(33), 노즐 홀더(34)의 제어에 의하여 액받이(29)로 핵산 포착 칩(31)을 이동하여, 흡인한 제 3 시약을 전량 토출하고 대기한다.
그 사이에 아암(16), 노즐 홀더(17)에 의하여 신규로 분주용 칩(15)을 설치하고, 제 3 시약병(19)으로부터 800㎕의 제 3 시약을 흡인하여 처리용기(24)에 전량을 토출하였다.
또한 여기서 제 3 시약에는, 25mmol/L 아세트산칼륨(와코쥰야쿠고교(주)제품, 시약특급)을 함유하는 50% 에탄올(와코쥰야쿠공업(주)제, 시약특급)을 사용하였다.
토출후, 아암(16), 노즐 홀더(17)의 동작에 의하여 사용한 분주용 칩(15)을 칩 분리기(27)의 작용에 의하여 떼어 낸다. 그 사이에 아암(33), 노즐 홀더(34)의 제어에 의하여 핵산 포착 칩(31)을 이동시켜 제 3 시약을 3회 흡인과 토출을 반복하고, 제 2 회째의 세정을 행한다. 세정 후, 처리용기(24)내의 혼합액을 전량 흡인하고, 다시 유지부재(1O1a)를 혼합액이 넘지 않는 위치까지 공기를 흡인한다. 그후 아암(33), 노즐 홀더(34)의 제어에 의하여 액받이(29)로 핵산 포착 칩(31)을 이동시켜 흡인한 제 3 시약을 전량 토출하고, 다시 그대로의 위치에서 공기 1mL를 흡인, 토출하는 조작을 10회 반복하여 대기한다.
상기 제 2회째의 제 3 시약에 의한 조작을 다시 반복하여 행하였다. 또한 이 세정조작은, 필요하면 다시 반복하여 행할 수 있다.
제 3 시약에 의한 세정조작 후, 아암(16), 노즐 홀더(17)에 의하여 신규로 분주용 칩(15)을 설치하고, 제 4 시약병(102)으로부터 200㎕의 제 4 시약을 흡인하여 처리용기(24)에 전량을 토출하였다.
또한, 여기서 제 4 시약에는 50mmol/L 아세트산칼륨(와코쥰야쿠고교(주)제, 시약특급)을 사용하였다.
토출 후, 아암(16), 노즐 홀더(17)의 동작에 의하여 사용한 분주용 칩(15)을 칩 분리기(27)의 작용에 의하여 떼어 낸다. 그 사이에 아암(33), 노즐 홀더(34)의 제어에 의하여 핵산 포착 칩(31)을 이동시켜, 제 4 시약을 3회, 흡인과 토출을 반복하여 고상의 세정을 행하였다. 세정 후, 처리용기(24)의 전량을 흡인하고, 다시 공기를 흡인하여 아암(33), 노즐 홀더(34)의 제어에 의하여 핵산 포착 칩(31)을 액받이(29)로 이동하여, 전량을 토출하고, 다시 그대로의 위치에서 공기 1mL를 흡인, 토출하는 조작을 10회 반복하여 대기한다.
제 4 시약에 의한 세정 후, 아암(16), 노즐 홀더(17)에 의하여 신규로 분주용 칩(15)을 설치하고, 제 5 시약병(20)으로부터 60㎕의 제 5 시약을 흡인하여, 처리용기(24)에 전량을 토출하였다.
또한 여기서 제 5 시약에는, 0.1mmol/L 에틸렌디아민4아세트산((주)니혼진제, 유전자공학연구용)을 함유하는 10 mmol/L 비신((주)도진화학연구소제품) 완충액 (PH 8.5)을 사용하였다.
토출 후, 아암(16), 노즐 홀더(17)의 동작에 의하여 사용한 분주용 칩(15)을 칩 분리기(27)의 작용에 의하여 떼어 낸다. 그 사이에 아암(33), 노즐 홀더(34)의 제어에 의하여 핵산 포착 칩(31)을 이동하여, 제 5 시약을 20회, 흡인과 토출을 반복하여 핵산의 용리를 행하였다. 용리 후, 핵산 포착용 칩(31) 내의 전량을 토출한다. 토출 후, 아암(33), 노즐 홀더(34)의 제어에 의하여 사용한 핵산 포착용 칩 (31)을 칩 분리기(27)의 작용에 의하여 떼어 낸다. 그 사이에 아암(16), 노즐 홀더 (17)에 의하여 신규로 분주용 칩(15)을 설치하고, 용리액이 들어간 처리용기(24)로부터 전량을 흡인하고, 다시 소량의 공기를 흡인한 후, 아암(16), 노즐 홀더(17)의 제어에 의하여 정제품용 용기(26)의 위치로 분주용 칩을 이동하여, 분주 칩(15) 내의 전량을 정제품 용기(26)에 토출하였다. 토출 후, 아암(16), 노즐 홀더(17)의 동작에 의하여 사용한 분주용 칩(15)을 칩 분리기(27)의 작용에 의하여 떼어 내었다.
동일한 조작을, 핵산 포착용 칩(31)의 고상(102)의 양을 일정하게 하여, 유지 부재(1O1a)와 유지부재(1O1b)의 거리를 바꾸어 작성한 석영울 사이의 평균간격이 다른 핵산 포착용 칩에 의하여 행하였다.
회수 후의 시료는, Roche사의 COBAS AMPLICOR와 코바스 앰플리코어 HCV v2.0시약에 의하여 평가를 행하였다. 회수한 각각의 시료 48.5㎕와, HCV 마스터믹스 v2.0 41.7㎕, HCV 망간시약 8.3㎕, HCV 내부 콘트롤 v2.0 1.5㎕를 혼합하여, 시약 키트에 부속의 순서도에 따라, 장치의 조작을 행하여, 회수한 시료에 의한 HCV의 평가를 행하였다. 결과를 도 8에 나타낸다.
도 8의 결과로부터 평균간격의 증가에 따라, 동일농도의 C형 간염 바이러스의 회수결과에 대하여, COBAS AMPLICOR의 흡광도 출력이 저하하는 것을 알 수 있다. 이것은 평균간격의 증가에 따라 C형 간염 바이러스의 개수(改修)량이 감소되고 있는 것을 나타내고 있고, 평균간격이 21㎛ 이상에서는 현저하게 회수효율이 저하되는 것을 나타내고 있다. 또한 COBAS AMPLICOR는 흡광도가 4.000를 초과한 경우, *.*** 로 표시되나, 여기서는 4.0O0으로 계산을 행하였다.
또 상기의 평균공간을 가지는 핵산 포착용 칩(31)에 대하여, 1mL의 용액을 흡인하였을 때의 평균유속을 측정하였다. 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9의 결과로부터, 평균간격의 감소에 따라 평균유속이 저하하는 것을 알 수 있다. 이것에는 평균간격을 좁힘으로써, 용액의 흡인, 또는 토출시의 대기시간이 증대하는 것을 의미하며, 평균간격의 감소는, 1시료당 장치의 처리시간을 증대시키게 되어 장치의 가동효율을 저하시키게 된다.
그 때문에 도 8 및 도 9의 결과로부터, 도 1의 핵산 포착용 칩과 도 2의 장치에 의하여 C형 간염 바이러스 유전자의 회수를 실용 충분한 상태에서 행할 수 있는 것, 핵산 포착용 칩의 바람직한 평균간격이 13 내지 21㎛의 범위인 것을 알 수 있다.
다음에 카올로픽제를 다른 물질로 바꾸어 도 2의 핵산 정제장치에 의하여 혈청 중의 비형 간염 바이러스의 유전자를 회수하였을 때의 실험예를 설명한다.
핵산 포착용 칩(31)은 도 1의 구조에 의해 석영울과 석영울 사이의 평균간격이 16㎛가 되도록 제작하였다. 도 2의 핵산 정제장치(100)의 장치구성은 바꾸지 않고서, 제 1 시약병(21) 및 제 2 시약병(22)에 넣는 시약의 조성을 제 1 공정 시약은 2% TritonX-100, 6mol/L 구아니딘염(와코쥰야쿠고교(주)제, 생화학용)을 함유하는 MES((주)도진카가쿠연구소제품) 완충액으로 바꾸고, 제 2 공정 시약은 5mol/L 구아니딘염산염(와코쥰야쿠고교(주)제품, 생화학용)을 함유하는 MES((주)도진카가쿠연구소제품)완충액으로 바꾸었다. 제 3 공정, 제 4 공정, 제 5 공정 시약은, 상기한 C형 간염 바이러스 유전자 회수시와 동일한 조성의 물질을 사용하였다.
처리용 시료는, 항B형 간염 바이러스항체에 양성반응을 나타내는 혈청을 사용하였다. 상기 핵산 포착용 칩(31)과 제 1 공정으로부터 제 5 공정 시약의 조합에 의하여 상기한 C형 간염 바이러스 유전자회수시와 동일한 장치동작에 의하여 B형 간염 바이러스유전자의 회수를 행하였다. 회수에 요한 시간은 약 20분이었다.
또 회수상태를 비교하기 위하여 기존의 방법으로서, 단백질 핵산 효소, 41 (5), 458-459(1996)에 기재한 방법에 따라 행하였다. 회수에 요한 시간은 하루 반이었다.
회수 후의 시료는, 다까라주조(주)제품의 PCR 전용 시약키트를 사용하고, (주)사와데·테크놀로지사에 합성을 의뢰한 증식용 프라이머에 의하여 B형 간염 바이러스유전자 중의 특정한 414염기의 증폭을 시험하였다. PCR처리시의 유전자 증폭 시스템은 TP3000(다까라주조(주)제품)을 사용하여, 제일 먼저 94℃의 열변성을 3분간 행한 후, 94℃의 열변성 30초, 55℃의 어닐링 30초, 72℃의 신장반응 30초를 45회 반복하고, 다시 72℃에서 10분간 가온하여, PCR처리를 행하였다. PCR 처리후, 그 일부를 3% 아가로스겔에 의하여 전기영동을 행하여, SYBR GreenI(FMC Bioproducts 제품)에 의하여 형광염색을 행하였다. 그 결과, 종래법과 동일한 정도의 PCR의 증폭대역이 얻어졌다. 이것은, 종래법과 동등한 회수효율로, 보다 단시간에 목적 유전자의 회수를 행할 수 있음을 나타내고 있다.
다음에 도 2의 핵산 정제장치에 의하여 혈청 중에 혼재하는 B형 간염 바이러스와 C형 간염 바이러스의 유전자를 회수하였을 때의 실험예를 설명한다.
핵산 포착용 칩(31)은 도 1의 구조로 고상의 평균간격이 16㎛가 되도록 제작하였다. 처리시료는 상기한 2종의 혈청을 혼합하여 혼합한 상태에서 각 바이러스농도가, 상기 실시시의 2배가 되도록 조제하였다.
상기한 C형 간염 바이러스 유전자를 회수하였을 때와 동일한 시약조성 및 동일한 장치동작에 의하여 유전자 회수를 행하고, 제 5 공정 시약만을 분주량을 60㎕에서 120㎕로 바꾸어 실시하였다.
회수 후의 시료는, 48.5㎕를 상기한 COBAS AMPLICOR에 의한 C형 간염 바이러스 유전자의 검출에 사용하고, 50㎕를 상기한 PCR처리에 의한 B형 간염 바이러스 유전자의 검출에 사용하였다. 그 결과, 2종의 다른 바이러스를 혼재한 시료로부터, 각각의 유전자를 단독으로 회수한 경우와 동등한 효율로 회수할 수 있었다. 이것은 혼재하는 바이러스의 유전자를 동시에 회수 가능한 것을 나타냄과 동시에, RNA(리보핵산) 및 DNA(디옥시리보핵산)이라는 성질이 다른 핵산을 동시에 회수할 수 있는 것을 나타내고 있다.

Claims (19)

  1. 실리카함유의 고상을 액체에 접촉 가능한 상태로 내장한 핵산 회수기구 또는 상기 기구를 구비하는 핵산 자동회수장치에 있어서,
    고상이 다수의 통수부를 가지고, 그 통수부에 있어서의 고상과 고상과의 평균간격이 25㎛ 이하(단, 0은 아니다)인 것을 특징으로 하는 핵산 회수기구 또는 핵산 자동회수장치.
  2. 제 1항에 있어서,
    평균간격이 13㎛ 이상인 것을 특징으로 하는 핵산 회수기구 또는 핵산 자동회수장치.
  3. 제 2항에 있어서,
    고상이 섬유상물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 핵산 회수기구 또는 핵산 자동회수장치.
  4. 제 2항에 있어서,
    고상이 석영울인 것을 특징으로 하는 핵산 회수기구 또는 핵산 자동회수장치.
  5. 제 4항에 있어서,
    석영울 사이의 평균간격이 13㎛ 내지 21㎛ 인 것을 특징으로 하는 핵산 회수기구 또는 핵산 자동회수기구.
  6. 제 4항에 있어서,
    석영울의 직경이 6㎛ 내지 12㎛ 인 것을 특징으로 하는 핵산 회수기구 또는 핵산 자동회수기구.
  7. 제 3항에 있어서,
    상기 섬유상물의 거리를 유지하기 위하여, 유체유통 가능한 저지부재로, 고상을 끼운 형상으로 하는 것을 특징으로 하는 핵산 회수기구 또는 핵산 자동회수기구.
  8. 제 7항에 있어서,
    저지부재의 재질이 석영입자를 소결한 것임을 특징으로 하는 핵산 회수기구 또는 핵산 자동회수기구.
  9. 제 1항에 있어서,
    핵산 회수기구가 핵산 포착 칩인 것을 특징으로 하는 핵산 회수기구 또는 핵산 자동회수기구.
  10. 압력변화에 의하여 흡인과 토출이 가능한 장치에 접속된 핵산 포착용 칩으로서, 상기 핵산 포착 칩은 실리카함유의 고상을 액상에 접촉 가능한 상태로 내장되고, 상기 고상이 통수부를 가지고, 그 통수부에 있어서의 고상과 고상과의 평균간격이 25㎛ 이하인 핵산 포착용 칩을 사용하는 핵산 회수방법에 있어서,
    핵산을 함유하는 샘플로부터 핵산을 유리하기 위한 제 1 시약을 샘플과 혼합하여 핵산의 유리를 촉진하는 제 1 공정과,
    유리된 핵산을 함유하는 액과 제 2 시약을 혼합한 후, 혼합액을 압력변화에 의하여 핵산 포착 칩 내로 흡인하여, 고상과 혼합액을 접촉시켜 토출하는 제 2a 공정과,
    고상을 세정하기 위하여 제 2 시약을 압력변화에 의하여 핵산 포착 칩 내로 흡인하여, 고상과 제 2 시약을 접촉시킨 후, 토출하는 제 2b 공정과,
    고상 및 핵산 포착 칩 내에 잔존하는 제 1 시약 및/또는 제 2 시약을 제거하기위하여 제 3 시약을 압력변화에 의하여 핵산 포착 칩 내로 흡인하여, 고상과 제 3 시약을 접촉시킨 후, 토출하는 제 3a 공정과,
    핵산 포착 칩 내에서 제 3 시약의 제거를 촉진하기 위하여 핵산 포착 칩 내에 통기를 행하는 제 3b 공정과,
    잔존하는 제 3 시약을 세정하기 위하여 제 4 시약을 압력변화에 의하여 핵산 포착 칩 내로 흡인하여, 고상과 제 4 시약을 접촉시킨 후, 토출하는 제 4 공정과,
    고상으로부터 핵산을 용리하기 위하여 제 5 시약을 압력변화에 의하여 핵산 포착 칩 내로 흡인하여, 고상과 제 5 시약을 접촉시킨 후, 토출하는 제 5 공정을 포함하는 핵산 회수방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    고상이 섬유상물로 이루어지고, 섬유상물과 섬유상물과의 평균거리가 25㎛ 이하인 것을 특징으로 하는 핵산 회수방법.
  12. 실리카를 함유하는 고상에의 핵산의 결합을 촉진하는 촉진물질과,
    핵산을 함유하는 혼합액으로부터 핵산을 회수하는 핵산 회수방법에 있어서,
    평균간격이 25㎛ 이하인 실리카함유 고상으로 이루어지는 통수부에, 혼합액을 흘리는 단계와,
    핵산의 고상에의 결합을 유지하면서 촉진물질을 세정하는 세정시약에 의하여, 핵산의 결합한 고상을 세정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 회수방법.
  13. 제 12항에 있어서,
    평균간격이 13㎛ 이상인 것을 특징으로 하는 핵산 회수방법.
  14. 제 13항에 있어서,
    고상이 섬유상물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 핵산 회수방법.
  15. 제 13항에 있어서,
    고상이 석영울인 것을 특징으로 하는 핵산 회수방법.
  16. 제 15항에 있어서,
    석영울 사이의 평균간격이 13㎛ 내지 21㎛인 것을 특징으로 하는 핵산 회수방법.
  17. 제 15항에 있어서,
    석영울의 직경이 6㎛ 내지 12㎛인 것을 특징으로 하는 핵산 회수방법.
  18. 제 13항에 있어서,
    고상으로부터 핵산을 용리하는 작용을 가지는 물질에 의하여, 핵산을 결합한 고상으로부터 핵산을 용리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 회수방법.
  19. 제 12항에 있어서,
    혼합액의 평균유속이 10μL/s 내지 50μL/s 인 것을 특징으로 하는 핵산 회수방법.
KR10-2003-7009955A 2001-03-28 2001-12-20 핵산의 회수기구 및 방법 Expired - Fee Related KR100505380B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
WOPCT/JP01/02577 2001-03-28
PCT/JP2001/002577 WO2002078847A1 (fr) 2001-03-28 2001-03-28 Instrument et procede permettant de recuperer de l'acide nucleique
PCT/JP2001/011212 WO2002078846A1 (fr) 2001-03-28 2001-12-20 Instrument et procede de recolte d'acides nucleiques

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20030078897A KR20030078897A (ko) 2003-10-08
KR100505380B1 true KR100505380B1 (ko) 2005-07-29

Family

ID=11737173

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR10-2003-7009955A Expired - Fee Related KR100505380B1 (ko) 2001-03-28 2001-12-20 핵산의 회수기구 및 방법

Country Status (6)

Country Link
US (2) US20040122222A1 (ko)
EP (1) EP1374997B1 (ko)
JP (3) JP3619514B2 (ko)
KR (1) KR100505380B1 (ko)
DE (1) DE60121477T2 (ko)
WO (2) WO2002078847A1 (ko)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7470546B2 (en) * 2000-05-31 2008-12-30 Infineon Technologies Ag Method and arrangement for taking up a first medium, which is present in a first phase, into a capillary device
JPWO2004044243A1 (ja) * 2002-11-13 2006-03-09 株式会社日立ハイテクノロジーズ 核酸の増幅方法及びその装置
ES2604352T3 (es) * 2003-02-05 2017-03-06 Iquum, Inc. Procesado de muestras
JP2004337108A (ja) * 2003-05-16 2004-12-02 Hitachi High-Technologies Corp 核酸精製装置、核酸捕捉用チップ、及び核酸精製方法
EP1508809B1 (en) * 2003-08-20 2007-02-28 Sysmex Corporation Sample analyzer and nucleic acid detector
US20050175499A1 (en) * 2004-02-06 2005-08-11 Quest Diagnostics Investments Incorporated Method of reducing cross sample contamination during filter sampling
JP4090443B2 (ja) * 2004-02-24 2008-05-28 株式会社日立ハイテクノロジーズ 核酸回収器具、その部品、及び核酸回収器具の生産方法
DE602005022196D1 (de) * 2004-07-23 2010-08-19 Biosystem Dev Llc Vorrichtung für einen immunoassay und verfahren zu ihrer verwendung
US20060166223A1 (en) * 2005-01-26 2006-07-27 Reed Michael W DNA purification and analysis on nanoengineered surfaces
JP2006311803A (ja) * 2005-05-06 2006-11-16 Hitachi High-Technologies Corp 核酸精製方法、及び核酸精製器具
JP4699868B2 (ja) * 2005-11-04 2011-06-15 株式会社日立ハイテクノロジーズ 核酸精製方法及び核酸精製器具
EP2041318A2 (en) * 2006-06-26 2009-04-01 Blood Cell Storage, Inc. Device and method for extraction and analysis of nucleic acids from biological samples
US8163535B2 (en) * 2006-06-26 2012-04-24 Blood Cell Storage, Inc. Devices and processes for nucleic acid extraction
US8012349B2 (en) 2006-11-20 2011-09-06 Orbital Biosciences, Llc Small volume unitary molded filters and supports for adsorbent beds
US9428746B2 (en) 2007-10-31 2016-08-30 Akonni Biosystems, Inc. Method and kit for purifying nucleic acids
US10125388B2 (en) 2007-10-31 2018-11-13 Akonni Biosystems, Inc. Integrated sample processing system
US20090111193A1 (en) 2007-10-31 2009-04-30 Cooney Christopher G Sample preparation device
US7759112B2 (en) * 2007-10-31 2010-07-20 Akonni Biosystems, Inc. Apparatus, system, and method for purifying nucleic acids
CA2742598A1 (en) * 2008-11-04 2010-05-14 Blood Cell Storage, Inc. Nucleic acid extraction on curved glass surfaces
GB201010237D0 (en) * 2010-06-18 2010-07-21 Lgc Ltd Methods and apparatuses
JP5773280B2 (ja) * 2010-06-18 2015-09-02 東洋紡株式会社 抗酸菌の溶菌とその核酸の分離を同時に行う方法
EP2455764A1 (en) * 2010-11-18 2012-05-23 BTP TECNO S.r.l. Diagnostic apparatus for organic samples analysis
US8629264B2 (en) 2011-05-19 2014-01-14 Blood Cell Storage, Inc. Gravity flow fluidic device for nucleic acid extraction
KR20140066567A (ko) 2012-11-23 2014-06-02 주식회사 엘지화학 리튬 이차전지용 전해액 및 이를 포함하는 리튬 이차전지
US10429403B2 (en) 2014-06-17 2019-10-01 Yamaha Hatsudoki Kabushiki Kaisha Head device for mounting dispensing tip thereon, and movement device using same
WO2017175821A1 (ja) * 2016-04-07 2017-10-12 田辺工業株式会社 粉体採取器、粉体採取装置及び自動粉体採取システム
WO2019133865A1 (en) * 2017-12-29 2019-07-04 Beckman Coulter, Inc. Probe washing arrangement with multiple configurations for sample analyzer and method of using
WO2024149910A2 (en) * 2023-05-10 2024-07-18 Untap Ltd. Automated extraction of nucleic acid samples from a plurality of samples

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3639949A1 (de) * 1986-11-22 1988-06-09 Diagen Inst Molekularbio Verfahren zur trennung von langkettigen nukleinsaeuren
NL8900725A (nl) * 1989-03-23 1990-10-16 Az Univ Amsterdam Werkwijze en combinatie van middelen voor het isoleren van nucleinezuur.
DE4014605A1 (de) * 1990-05-07 1991-11-14 Kronwald Separationstechnik Gm Mehrteiliger chromatographiesaeulenanschluss
DE4321904B4 (de) * 1993-07-01 2013-05-16 Qiagen Gmbh Verfahren zur chromatographischen Reinigung und Trennung von Nucleinsäuregemischen
US6165478A (en) * 1994-09-20 2000-12-26 Hitachi Chemical Company, Ltd. DNA encoding Chlamydia pneumoniae antigenic polypeptide
DE19512369A1 (de) * 1995-04-01 1996-10-02 Boehringer Mannheim Gmbh Vorrichtung zur Isolierung von Nukleinsäuren
US5939259A (en) * 1997-04-09 1999-08-17 Schleicher & Schuell, Inc. Methods and devices for collecting and storing clinical samples for genetic analysis
JP4025399B2 (ja) * 1997-10-28 2007-12-19 株式会社日立製作所 核酸の回収方法及び装置
JPH11266864A (ja) * 1998-03-19 1999-10-05 Hitachi Ltd 核酸の精製方法および精製用装置
EP0943619B1 (en) * 1998-03-19 2004-11-10 Hitachi, Ltd. Chip for use in nucleic acid separation, structural element and process for forming the structural element
JP2000175683A (ja) 1998-03-19 2000-06-27 Hitachi Ltd 核酸分離に用いるチップと構造体の形成方法
JP3490329B2 (ja) * 1999-03-04 2004-01-26 株式会社日立製作所 核酸分離容器、核酸分離容器の製造方法及び核酸の分離方法
JP2000336098A (ja) * 1999-05-28 2000-12-05 Hitachi Ltd 核酸精製装置
JP2000350577A (ja) * 1999-06-09 2000-12-19 Aloka Co Ltd 核酸断片の分離方法及び核酸シークエンス前処理方法並びに装置

Also Published As

Publication number Publication date
WO2002078847A1 (fr) 2002-10-10
EP1374997A1 (en) 2004-01-02
DE60121477D1 (de) 2006-08-24
US20110015381A1 (en) 2011-01-20
JP3619514B2 (ja) 2005-02-09
EP1374997B1 (en) 2006-07-12
US20040122222A1 (en) 2004-06-24
KR20030078897A (ko) 2003-10-08
US8183054B2 (en) 2012-05-22
JP4081468B2 (ja) 2008-04-23
JP3663207B2 (ja) 2005-06-22
JPWO2002078846A1 (ja) 2004-07-22
WO2002078846A1 (fr) 2002-10-10
DE60121477T2 (de) 2007-02-15
JP2005110687A (ja) 2005-04-28
EP1374997A4 (en) 2004-05-12
JP2004290211A (ja) 2004-10-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100505380B1 (ko) 핵산의 회수기구 및 방법
JP3425902B2 (ja) 検体の前処理装置
US20020007054A1 (en) Method for purifying nucleic acid and apparatus using the same
CN108103057B (zh) 用于纯化核酸的方法和试剂盒
JP5202732B2 (ja) 核酸抽出装置
JP5977921B2 (ja) 核酸を精製することを目的とした装置、システムおよび方法
JP3630493B2 (ja) 分注機を利用した液体処理方法およびその装置
US20100204462A1 (en) Pipette tip with separation material
US20070269829A1 (en) Instrument and method for nucleic acid isolation
JP2007124952A (ja) 核酸精製方法及び核酸精製器具
JP2002191351A (ja) 核酸の精製用装置および核酸捕捉用チップ
JPH11127854A (ja) 核酸の回収方法及び装置
CN100415881C (zh) 用于预处理试样的装置
US20040175735A1 (en) Process for recovery of nucleic acids
EP1437407B1 (en) Apparatus for collecting nucleic acid and method of collecting nucleic acid
JP3776320B2 (ja) 複数の核酸を同一固相で回収する方法及び装置
JP2000166556A (ja) 核酸の回収方法及び装置
US20060228736A1 (en) Blood testing method, nucleic acid extraction method, and nucleic acid extraction device
KR100211129B1 (ko) 분주기를 이용한 액체처리방법 및 그 장치
HK1218573B (en) Method and kit for purifying nucleic acids
HK1145158A (en) Pipette tip with separation material

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
PA0105 International application

Patent event date: 20030728

Patent event code: PA01051R01D

Comment text: International Patent Application

PA0201 Request for examination

Patent event code: PA02012R01D

Patent event date: 20030728

Comment text: Request for Examination of Application

PG1501 Laying open of application
E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20050228

Patent event code: PE09021S01D

E701 Decision to grant or registration of patent right
PE0701 Decision of registration

Patent event code: PE07011S01D

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event date: 20050711

GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20050725

Patent event code: PR07011E01D

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20050726

End annual number: 3

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration
PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20080722

Start annual number: 4

End annual number: 4

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20090720

Start annual number: 5

End annual number: 5

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20100719

Start annual number: 6

End annual number: 6

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20110617

Start annual number: 7

End annual number: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20120629

Year of fee payment: 8

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20120629

Start annual number: 8

End annual number: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130705

Year of fee payment: 9

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20130705

Start annual number: 9

End annual number: 9

LAPS Lapse due to unpaid annual fee
PC1903 Unpaid annual fee

Termination category: Default of registration fee

Termination date: 20150609