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KR100453786B1 - 셀룰로오즈 결합도메인 융합단백질 및 이를 이용하는 방법 - Google Patents

셀룰로오즈 결합도메인 융합단백질 및 이를 이용하는 방법 Download PDF

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KR100453786B1
KR100453786B1 KR10-2001-7013956A KR20017013956A KR100453786B1 KR 100453786 B1 KR100453786 B1 KR 100453786B1 KR 20017013956 A KR20017013956 A KR 20017013956A KR 100453786 B1 KR100453786 B1 KR 100453786B1
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KR
South Korea
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cbd
protein
fusion protein
binding
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KR10-2001-7013956A
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KR20030096451A (ko
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오데드 쇼세요브
이타이 쉬피에길
마레에이. 골드스타인
로이에이치. 도이
Original Assignee
이섬 리서치 디벨러프먼트 컴파니 오브 더 히브루 유니버시티 오브 예루살렘
더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
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Publication date
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Abstract

본 발명은 높은 친화력으로 셀룰로오스에 결합할 수 있는 CBD 단백질과 제 2 단백질로 구성된 CBD 융합단백질 산물에 관하는데, 여기서 제 2 단백질은 단백질 A, HSP 단백질 또는 2개이상의 부분으로 구성되는 폴리펩티드등이다.
본 발명은 또한, 소요의 물질을 감지하는 진단키트에 관하는데; 상기 키트는
(a) (ⅰ) 높은 친화력으로 셀룰로오스에 결합할 수 있는 CBD 및 (ⅱ) 소요 물질에 결합할 수 있는 제 2 단백질로 구성된 CBD 융합단백질 산물;
(b) 감지가능한 라벨; 그리고
(c) 셀룰로오스로 구성된다.
본 발명은 또한, 상기 셀룰로오즈 결합도메인 융합단백질 산물을 이용하는 방법에 관한다.

Description

셀룰로오즈 결합도메인 융합단백질 및 이를 이용하는 방법{A CELLULOSE BINDING DOMAIN FUSION PROTEIN AND THE METHOD USING IT}
단백질의 고정
생물학적 활성 단백질을 포함한 화학물질의 고정은 산업에서 상당히 중요하다. 최근에는 고정화 방법이 다양하게 개발되었다. 그러나 이들 대부분 방법은 고형 매트릭스의 화학적 변형을 요구한다. 일반적으로 이와 같은 변형은 매트릭스에 리간드의 공유결합에 의한 것으로 대부분의 경우에, 리간드의 활성손실뿐 아니라 의약 또는 식품공정에 매트릭스가 사용되기 전에 제거되어야 하는 독성 유기성분물을 포함할 수 있다. 다양하게 사용되는 생성물의 일반적인 예는 단백질 A-세파로스이다. 이와 같은 고가의 생성물은 친화성 크로마토그래피에 의한 IgG 정제 및 많은 진단과정에 사용된다.
결합도메인과 함께 기능적 도메인(촉매등)을 포함하는 키메라 단백질의 이용은 상당히 신규한 것이고, 특히 단백질 정제방법에 매우 유용한 것으로 이미 증명된 바 있다. 가령, 글루타티온 S-전이효소 유전자 융합 시스템은 글루타티온 S-전이효소의 C-단부에 융합된 소요의 유전자를 발현시키도록 고안되었다. 제조한 단백질은 글루타티온-세파로스 칼럼을 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
기능적 도메인과 결합도메인을 가지는 키메라 단백질의 또 다른 예는 대장균과 스타필로코커스 아우레스 세포에서 융합단백질을 다량 발현을 허용하기 위해 디자인된 Protein-A 유전자 융합벡터이다(B. Nilsson, et al. (1985) EMBO J. 4(4):1075-1080). 단백질 A의IgG 결합도메인은 IgG-세파로스 칼럼을 사용하여 융합단백질의 신속한 정제방법을 제공한다. 유사시스템은 Ni-수지 칼럼을 사용하여 히스티딘 헥사머 융합단백질 또는 금속 킬레이트 크로마토그래피 또는 IPTG-세파로스에서 정제된 베타-갈락토시다제 융합단백질에 기초하여 개발되었다. 모든 방법은 상당한 가격의 화학적 변형을 요구하고, 많은 경우에 매우 독성이 큰 화합물을 사용하는 세파로스, 아크릴비드 또는 유리비드와 같은 고가 매트릭스를 이용해야 한다. 한편, 셀룰로오스는 우수한 물리적 성질을 가지면서도 저렴하여 단백질 고정에 매력적인 고형 매트릭스가 될 수 있다.
셀룰로오스
셀룰로오스는 와인과 과일쥬스 처리에 사용되는 엔도-베타 글루코시다제 효소의 고정에 매우 유용하다(Shoseyov et al. J. Agric. Food Chem. 38:1387-1390 [1990].). 그러나 고정은 셀룰로오스의 화학적 변형을 요구하고, 패킹된 컬럼과 관련된 응용에는 적합하지 않은 솜털같은 압착물질이 된다.
화학적 변형없이 리간드에 결합될 셀룰로오스 기질(즉 "생물고정화 된")은 생성고형 매트릭스가 자연적 그리고 비-독성이기 때문에("화학적 변형"없이) 장점을 가진다. 또한 생성 고형 매트릭스가 이의 물리적 성질을 보유하고 상당히 가격이 저렴할 경우 장점이 있다. 현재 셀룰로오스 가격은 글루카티온-세파로스와 IPTG-세파로스보다 100-500배 낮고, 이는 식품과 제약학적 산업에 매우 안정하고 적절한 저가의 매트릭스를 만들 수 있다. 최근에는 Greenwood et al. (FEBS. Lett.224(1):127-131 [1989].)은 효소 알칼리인 포스포타제에 셀룰로모나스 피미 엔도 글루카나제의 셀룰로오스 결합부분을 융합하였다. 재조합 융합단백질은 이의 포스포타제 활성과 셀룰로오스에 결합하는 능력을 보유한다(U.S. Patent No. 5,137,819).
불행하게도, 셀룰로모나스 피미 셀룰로오스 결합부분은 셀룰로오스에 대해 상대적으로 낮은 친화력을 나타낸다. 가령, 융합단백질의 30% 이상이 0.5 M NaCl, 50mM 트리스-HCl(pH 7.5)에 의해 세척된다. C. 피미 셀룰로오스 결합부분의 제 2 단점은 셀룰로오스 섬유가 C. 피미 결합부분과의 결합시에 파괴되는 것이다(Din et al., Bio/Technology 9:1096-1098 [1991]). 따라서, C. 피미 셀룰로오스 결합부분이 비록 셀룰로오스 활성에 나타내지 않더라도, 고형 매트릭스의 모양에 물리적 변화에 등가가 되는 셀룰로오스 기질 섬유의 파괴는 문제가 되고, 바람직하지 못하다(7.3).
셀룰라제
많은 셀룰라제와 키티나제와 같은 다른 가수분해성 효소는 이들 기질에 대해 높은 친화력을 가진다(Shoseyov, et al., PNAS USA 87:2192-2195 [1990]; Cabib, Methods Enzymol. 161, pp, 460-462 [1988]). 결정형 셀룰로오스와 셀룰라제 사이에 강한 결합은 결정형 셀룰로오스를 분해하는 셀룰라제의 능력에 직접 관계하고(Klyosov, Biochemistry 29:10577-10585 [1990], 반면에 강한 결합은 무정형 셀룰로오스를 분해할 수 있는 셀룰라제의 능력에는 필수적인 것이 아님을 볼 수 있었다.
Shoseyov, et al., (PNAS USA 87:2192-2195 [1990]은 클로스트리듐 셀룰로보란스에서 셀룰라제 "복합체"의 정제를 보고한 바 있다. 이와 같은 셀룰라제 "복합체"는 결정형 셀룰로오스에 대한 셀룰라제 활성을 나타내고 카르복시메틸 셀룰로오스에 대해서도 활성을 나타내며, 이는 몇가지 상이한 폴리펩티드로 구성된 큰 단백질 복합체이다. 효소활성이 없는 큰(ca. 200KD) 주요 셀룰로오스 결합단백질(cbpA)은 촉매효소에 의해 결정형 셀룰로오스로 분해되기 위해서는 촉매효소와 같이 어울려야 한다는 것이 밝혀졌다. 그러나 이와 같은 cbpA의 관계가 무정형 셀룰로오스의 효소적 분해에는 필수적인 것이 아니다. Shoseyov, et al., (PNAS USA 89:3483-3487 [1992]에서는 cbpA 내에 4개의 별도의 "가상"셀룰로오스 결합도메인의 설명을 포함하는 cbpA의 유전자의 DNA 서열과 클로닝에 대해 보고하고 있다.
열 쇼크 단백질(HSP)
열 쇼크 단백질(HSP)은 다양한 스트레스 조건하에 진핵과 원핵생물에서 유도될 수 있다. HSP는 이들의 분자량에 기초하여 유사 단백질 집단으로 나눌 수 있다.
발생동안에 독특하게 상당수준의 서열보존을 가지고 있는 60 KD HSP(hsp 60)족은 자가면역 질환에서 강력한 항원으로 관심이 입증된다(W. Van Eden (1991) Immunol. Rev. 121:1; W. Van Eden, Thole R. Van der Zee, A. Noordzij, J.D.A. Van Einbden, E.J. Hensen, and I.R. Cohen (1988) Nature 331:171; M.B.J. Billingham B. Carney, R. Bulter, and M.J. Colston (1990) J. Exp. Med.171:339).
실험상으로도 hsp 60에 대한 반응은 조절 T-세포 컨트롤에 대한 것임을 알 수 있다. 적어도 부분적으로 T 세포활성은 포유류 내생 HSP에 대해 관한 것이다(B. Herman et al. (1991) Eur. J. Immunol. 21:2139).
hsp 60 단백질 족에 대한 코딩 유전자는 클론되고, 미코박테리움 튜머클로시스, 미코박테리움 레프리, 미코박테리움 보비스 BCG, 대장균, 차이니스 헴스터 쥐와 사람세포를 포함하는 상당수의 종에서 서열화시켰다(V. Mera et al. (1986) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83:7013; S. Jindal et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9:2279; O.J. Picketts et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:12001; T.M. Shinnick (1987) J. Bacteriol. 169:1080; T.M. Shinnick et al. (1988) Infect. Immun. 56:446; T.J. Venner and R.S. Gupta (1990) Nucl. Acids. Res. 18:5309).
하기에서 상술하는 바와 같이, 본 발명에 따라 열쇼크 단백질(HSP), 이의 일부 항-HSP 항체와 이의 일부는 CBD-융합 생성물에 사용될 수 있다.
미코박테리움과 사람 hsp 60의 면역반응은 사람과 동물모델에 자가면역 당뇨병의 발생에 복합된 것으로 보인다.
면역 우세 항원 이외에 다양한 시스템에서 hsp 60 족과 단백질은 새로이 합성된 폴리펩티드 사슬의 적절한 꼬임에 "분자 샤프롱"을 실행하는 것으로 보이고, 일부 경우에 올리고머성 단백질 복합체 형태의 항원이 된다(S.M. Hemmingsen et al. Nature 333:330; R.J. Ellis (1990) Sem. Cell Biol. 1:1-9).
쥐의 모델 시스템에서 hsp 60 항원에 대한 T-임파세포 인슐린 의존성 진성당뇨병(IDDM)에서는 인슐라이티스의 개시에서 감지할 수 있고, 이들 T-임파세포는 베타세포 hsp 65가 반응성을 인지할 수 있다(D. Elias et al. (1990) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87:1576-1580).
따라서, 셀룰로오스 특히 결정형 셀룰로오스에 높은 가역적 친화력을 나타내는 셀룰로오스 결합 단백질의 발견에는 불충분한 필요성이 남아있고 결정 셀룰로오스 기질의 섬유를 파괴하는 능력 또는 셀룰라제 활성에 대해서 밝혀지지 않았다(즉 "무정형" 효과는 나타내지 않음).
본 발명은 신규의 셀룰로오스 결합도메인(CBD) 단백질의 셀룰로오스 결합특정, 분자 클로닝과 확인에 대해 상술한다. 또한, CBD와 소요의 제 2 단백질로 구성된 융합생성물의 생산을 위한 발현시스템의 구성에 대해서도 상술한다.
본 발명은 자연적으로 연합된 다른 폴리펩티드 또는 단백질과 독립적으로 기능을 할 수 있는 CBD의 발견에 관하고, CBD는 Kd가 1.5uM 내지 0.5uM 적절하게는 1.4 uM 내지 0.8uM의 범위를 가지는 결정형 셀룰로오스와 키틴에 높은 친화성을 가지는 것으로 발견되었다. 특히 다양한 결정형 셀룰로오스 시료에서 CBD는 Kd가 약 1.2 uM을 나타낸다. CBD는 실제 셀룰라제 활성이 없으며, 상당히 놀라운 것은 CBD는 형태-변형 특징(즉 무정형 효과는 없음)을 나타내지 않는 것으로 특징화될 수 있다. CBD와 제 2 단백질로 구성된 CBD-융합 생성물이 셀룰로오스에 CBD의 아비드 결합능을 보유하고 있다는 발견이다.
본 발명은 상당범위의 pH와 상이한 완충조건에서 CBD가 셀룰로오스에 절대적인 결합을 하고, 즉 상당량의 CBD가 결정형 셀룰로오스에 결합하고 물에 노출되는 경우 셀룰로오스로부터 CBD를 방출시키는 것이 실패한다는 발견이다. 완전히 대조적으로 주요 cbpA 단백질과 C. 피미로부터 결합부분은 물에 노출되는 경우 셀룰로오스로부터 즉시 해리된다. 게다가 6M 구아니딘-HCl, 6M 요소 또는 비이온성 계면활성제와 같은 변성용액에 노출되면 셀룰로오스로부터 CBD가 유리된다. 따라서 CBD 단백질 기능과 성질은 셀룰로오스에 이의 결합이 자연적으로 연합된 다른 나머지 단백질과는 상당히 독립적이다.
따라서, 본 발명은 높은 친화성을 가지면서 셀룰로오스에 결합할 수 있는 분리형 CBD 단백질을 제공하고, 이는 자연적으로 연합된 다른 단백질이 없는 상태이다.
본 발명의 구체예에서 CBD 단백질은 도면 1에서 나타낸 아미노산 서열로 구성된다. 또 다른 구체예에서 CBD 단백질은 제 1 도의 아미노산 서열에 적어도 70% 유사성, 적절하게는 80% 유사성을 가지는 아미노산 서열로 구성된다. 본 발명의 다른 편에서 핵산은 도면 1 에 나타낸 핵산서열에 적어도 60%, 적절하게는 70-80% 유사성을 가지는 것을 볼 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서 CBD 단백질은 셀룰로오스에 높은 결합 친화력을 가진다. 더욱 적절하게는 본 발명의 CBD는 약 1.5 uM의 Kd, 적절하게는 1.0 uM의 Kd를 가진다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 높은 친화력으로 셀룰로오스에 결합할 수 있는 CBD 단백질과 제 2 단백질로 구성된 CBD 융합단백질을 제공하고, 이때 상기 CBD단백질은 자연에서 발생할 수 있는 것으로 자연적으로 연합된 다른 단백질이 없다. 특히 본 발명의 구체예에서 제 2 단백질은 단백질 A 이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서 제 2 단백질은 HSP 단백질이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서 CBD에 융합된 제 2 단백질은 두 개 이상의 폴리펩티드 부분으로 구성될 수 있다. 가령, CBD는 항체 또는 이의 등가단백질에서 가변 경사슬(VL)과 가변 중사슬(VH)에 융합될 수 있다.
본 발명의 구체예에서는 CBD 또는 CBD 융합생성물의 생산방법을 제공한다. CBD 단독 또는 CBD 융합생성물에도 적용할 수 있는 예시적 과정은 CBD 융합산물을 인코드하는 핵산을 제공하고, 이때 CBD 융합생성물은 CBD 와 제 2 단백질로 구성되고 CBD는 자연상태에서 연합할 수 있는 다른 단백질없이 높은 친화성으로 셀룰로오스 또는 키틴에 결합하고; 숙주세포내로 핵산을 유입시킬 수 있는 수단을 사용하거나 또는 숙주세포에 핵산을 형질감염시키고; CBD 융합단백질을 발현시키는데 적합한 조건하에 형질전환된 숙주세포를 배양시키는 단계로 구성된다. 상기 방법에서 제 2 단백질은 N-단부 아미노산과 C-단부 아미노산으로 구성될 수도 있다. 숙주세포의 형질감염은 일렉트로포레이션, 주사, 칼슘 클로라이드 침전과 레트로바이러스 유입을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 공지기술로 실시할 수 있다.
본 발명의 또 다른 편에서 CBD 융합 생성물의 정제방법은 셀룰로오스와 재조합 융합생성물로 구성된 비가용성 결합 복합체의 형성에 적합한 조건에서 효과량의 셀룰로오스와 재조합 CBD 융합체를 접촉시키고, 혼합물로부터 비가용성 셀룰로오스-CBD 융합체를 분리하고; 그리고 셀룰로오스-CBD 융합 생성물 결합 매트릭스에서 CBD 융합단백질을 회수하는 것으로 구성된다.
본 발명의 구체예에서, 본 발명의 CBD 융합단백질의 정제방법은 CBD 융합체의 제 2 단백질의 N-단부 아미노산의 상측 절단부위를 인코드하는 핵산을 제공하는 것으로 구성된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, CBD 융합단백질의 제 2 단백질의 C-단부 아미노산의 하류 절단부위를 인코드하는 핵산을 제공하는 것으로 구성된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명의 CBD 융합단백질 정제방법은 CBD 융합단백질의 제 2 단백질의 C-단부 아미노산의 하류 절단부위와 제 2 단백질의 N-단부 아미노산의 상류 절단부위를 인코드하는 핵산을 제공하는 것으로 구성된다.
유사하게, CBD는 효과량의 셀룰로오스와 CBD로 구성된 혼합물과 접촉에 의해 정제된다. 배출시약과 결합복합체의 처리후 생성된 비가용성 CBD-셀룰로오스 결합복합체의 분리는 정제된 CBD를 제공한다.
발명의 또 다른 편에서는 자연상태에서 연합될 다른 핵산이 없이 높은 친화력으로 셀룰로오스에 결합할 수 있는 CBD 단백질을 인코드하는 분리형 핵산을 제공한다. 본 발명의 단백질을 인코드하는 분리된 핵산은 cbd 유전자에 유사성을 가지는 서열의 게놈 라이브러리 또는 cDNA를 스크린하는데 있어 프로브로 유용하다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 CBD를 인코드하는 핵산으로 구성된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 추가편에는 소요의 물질을 감지하는 진단키트에 관계하는데; (a) (ⅰ) 자연적으로 결합된 다른 단백질없이 높은 친화력으로 셀룰로오스에 결합할 수있는 CBD와 (ⅱ) 소요 물질에 결합할 수 있는 제 2 단백질로 구성된 CBD 융합생성물; (b) 감지가능한 라벨; 그리고 (c) 셀룰로오스로 구성된다. 이와 같은 진단키트에는 셀룰로오스 대신에 키틴을 사용할 수 있다. 본 발명의 구체예에서, CBD 융합체의 제 2 단백질은 단백질 A, HSP 단백질, HSP 항체, HSP 관련 단백질, 펩티드 또는 이의 항원부위일 수 있다. "펩티드" 의미는 2-20개 아미노산으로 구성된 분자를 포함한다. 상술된 진단키트의 CBD 융합체에는 제 2 단백질에 친화력으로 결합할 수 있는 리간드를 추가로 포함할 수 있는데, 이와 같은 리간드는 소요의 물질에 결합할 수 있다. "리간드" 의미는 어떠한 비-공유적 수단에 의해 제 2 분자에 결합할 수 있다. 가령 주요 IgG는 CBD에 융합되는 단백질 A에 친화력으로 결합될 수 있다. 그 다음 IgG는 특정단백질, 펩티드 또는 호르몬에 대한 리간드로 작용한다.
본 발명의 또 다른 편에서는 테스트 시료에 소요의 물질의 존재를 감지하는 면역 검사방법이 공지되는데, 이는 (a) 소요의 물질과, (ⅰ) 자연상태에서 결합될 수 있는 다른 단백질없이 높은 친화력으로 셀룰로오스에 결합할 수 있는 CBD와 (ⅱ) 소요의 물질에 결합할 수 있는 제 2 단백질로 구성된 CBD 융합체 효과량을 포함하는 테스트 샘플을 CBD 융합체의 제 2 단백질에 소요의 물질이 결합할 수 있도록 허용되는 조건하에 배양시키고; (b) 비가용성 셀룰로오스-CBD 융합 생성물 결합 복합체를 제공하기 위해 (a) 단계에 사용된 양의 CBD 융합체에 효과적으로 결합할 수 있는 양으로 셀룰로오스를 첨가하고; (c) 결합안된 성분들에서 비가용성 셀룰로오스-CBD 융합 생성물을 분리하고; (d) 감지가능한 라벨의 효과량과 비가용성-셀룰로오스-CBD 융합생성물을 배양하고, 라벨은 소요의 물질과 결합할 수 있고; 그리고 (e) 결합안된 성분에서 (d)단계의 비가용성 셀룰로오스-CBD 융합생성물을 분리하고 라벨의 존재유무를 결정하여 테스트 샘플에서 소요의 물질의 유무를 확인하는 것으로 구성된다.
테스트 시료에서 소요의 물질을 감지하는 또 다른 방법도 상술하고 있는데; (a) 소요의 물질을 고정시킬 수 있는 비가용성 매트릭스와 소요의 물질을 포함할 수도 있는 테스트 시료와 접촉시키고; (b) (ⅰ) 자연상태에서 결합될 수 있는 다른 단백질없이 높은 친화력으로 셀룰로오스에 결합할 수 있는 CBD와 (ⅱ) 소요의 물질에 결합할 수 있는 제 2 단백질로 구성된 CBD 융합체 효과량과 비가용성 매트릭스를 CBD 융합체의 제 2 단백질에 소요의 물질이 결합할 수 있도록 허용되는 조건하에 배양시키고; (c) 결합안된 성분들에서 비가용성 셀룰로오스-CBD 융합 생성물을 분리하고; (d) 감지가능한 라벨이 비가용성-셀룰로오스-CBD 융합생성물에 결합할 수 있는 조건하에서 (c)단계의 비가용성 매트릭스를 배양하고; 그리고 (e) 결합안된 성분에서 (d)단계의 비가용성 매트릭스를 분리하고 라벨의 존재유무를 결정하여 테스트 샘플에서 소요의 물질의 유무를 확인하는 것으로 구성된다.
이 방법에는 (ⅰ) 셀룰로오스-CBD 융합생성물 결합 복합체를 형성하기 위해 CBD 융합생성물에 셀룰로오스 결합을 허용하는 조건하에 충분한 셀룰로오스 양과 (c) 단계의 비가용성 매트릭스를 접촉시키고; (ⅱ) 결합안된 셀룰로오스를 포함하여 결합안된 성분으로부터 (ⅰ)단계의 비가용성 매트릭스를 분리하는 단계로 구성된다. 이 방법은 특히 셀룰로오스-CBD 융합단백질 결합복합체에서 소요의 물질 또는 셀룰로오스-CBD 융합단백질 결합 복합체의 결합을 허용할 수 있는 라벨을 사용한다. 테스트 샘플은 혈액, 요소, 점액, 타액, 점막, 눈물, 질분비물 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 체액이 될 수 있다. 셀룰로오스는 키틴으로 대체될 수도 있다. 또한 비가용성 매트릭스는 전기영동 겔 블랏이 될 수도 있다.
본 발명의 구체예에서 이 방법은 단백질 또는 펩티드의 감지를 위한 것이고, 따라서 CBD 융합체의 제 2 단백질은 단백질 또는 펩티드에 대한 항체일 수 있다. 항체는 단클론 항체 또는 다클론성 항체일 수 있다. 또는 본 발명의 CBD는 직접 또는 링커를 통하여 소요의 항체와 공액될 수 있다.
소요의 물질은 단백질, 펩티드, 호르몬, 핵산 또는 다른 프로브-표적분자에 결합할 수 있는 바이오틴화된 프로브로 구성될 수 있다. 이 경우, 적절한 제 2 단백질은 스트렙타아비딘이다. 라벨에 효소가 포함되는 경우, 방법에는 효소에 대한 충분한 양의 기질을 첨가하는 단계로 구성되고, 이때 기질은 효소에 의해 감지가능한 화합물로 전환될 수 있다.
검사는 또한 경쟁성 방식으로 실행될 수 있다. 전술한 방법에서 단계 (d)는 소요의 라벨된 물질로 구성된 감지가능한 라벨의 효과량과 비가용성 셀룰로오스-CBD 융합체를 배양하고, 라벨은 소요의 물질에 결합이 안된 것으로 남아있는 CBD 융합체의 제 2 단백질에 결합할 수 있고, 단계 (e)는 결합안된 성분에서 단계(d)의 비가용성 셀룰로오스 CBD 융합체 결합복합체를 분리하는 단계로 실행되고, 이는 콘트롤 샘플에서 관찰된 시그날에 관련된 테스트 샘플에서 관찰된 시그날로 구성된다.
본 발명의 구체예에서 CBD 융합 생성물은 디프 스틱에 포함될 수도 있다. 여기에서 본 발명의 목적은 CBD 융합 생성물로 구성된 테스트 시료에 소요의 물질을 감지하는데 유용한 스틱을 제공하는데, 이는 자연상태에서 결합될 수 있는 다른 단백질없이 높은 친화력으로 셀룰로오스에 결합할 수 있는 CBD와 (ⅱ) 소요의 물질에 결합할 수 있는 제 2 단백질로 구성된다. 적절하게는 제 2 단백질은 단백질 A, HSP 단백질, HSP 항체, 교차-반응성 HSP-관련 단백질, 펩티드 또는 이의 항원성부분, 효소, 호르몬, 항원과 항체에서 선택될 수도 있다.
유사하게, 본 발명의 목적은 시그날 증폭 시스템을 제공하는데 (a) (ⅰ) 자연상태에서 결합할 수 있는 단백질이 없는 높은 친화성을 가지고 셀룰로오스에 결합할 수 있는 CBD와 (ⅱ)키메라 프로브에 결합할 수 있는 제 2 단백질, 프로브는 소요의 물질에 결합할 수 있는 것으로 구성된 제 1 CBD 융합 생성물과 (b) (ⅰ) 자연상태에서 연합할 수 있는 다른 단백질이 없는 높은 친화력으로 셀룰로오스에 결합할 수 있는 CBD와 (ⅱ) 감지가능한 화합물을 생성하기 위해 기질에서 작용할 수 있는 효소로 구성된 제 2 CBD 융합체로 구성된다.
또 다른 구체예에서: (a) (ⅰ) 자연상태에서 결합할 수 있는 단백질이 없는 높은 친화성을 가지고 셀룰로오스에 결합할 수 있는 CBD와 (ⅱ) 키메라 프로브에 결합할 수 있는 제 2 단백질, 프로브는 소요의 물질에 결합할 수 있는 것으로 구성된 CBD 융합체와; (b) 라벨된 CBD, CBD는 자연상태에서 연합할 수 있는 다른 단백질없이 높은 친화력으로 셀룰로오스에 결합할 수 있는 능력을 보유하는 것으로 구성된 또 다른 신호증폭 시스템을 제공한다.
이와 같은 신호증폭 시스템은 키메라 프로브를 포함하고 페블-밀드된 셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 매트릭스를 포함할 수도 있다.
이와 같은 신호증폭 시스템에는 세포 또는 조직에서 핵산을 확인하기 위한 시스템과 손실서열은 올리고뉴클레오티드 관련된 터모사이클성 DNA 증폭을 이용할 수 있는 방향에서 확인된 핵산의 길이를 연장하는 시스템이 포함되는데, 이때 DNA-특이 프라이머와 퇴행성 벡터-특이적 또는 올리고-dT 결합 제 2 올리고뉴클레오타이드가 특이적 합성을 준비하는데 사용될 수도 있다.
마지막으로 본 발명의 추가 목적은 약물과 연합된 CBD로 구성된 약물 수송 시스템을 제공하는 것으로 CBD는 자연적으로 연합된 다른 단백질없이 높은 친화력으로 셀룰로오스에 결합할 수 있는 능력을 보유한다. 이와 같은 약물 수송시스템에서 약물은 직접적으로 또는 링커를 통하여 CBD에 공액될 수 있다. 많은 공액방법이 공지되어 있다. 가령, 사이클로헥실카르보디이미드와 같은 아실활성제가 존재할 수 있고, 이는 아미드 또는 에스테르 결합을 형성하는데 사용될 수도 있다. 따라서, 아미노 또는 OH와 같은 친핵기를 가지는 약물은 카르복시 단부에 부착될 수 있다. 한 구체예에서 이와 같은 약물 수송시스템은 서방형 시스템일 수 있고, 이때 소요의 약물은 셀룰로오스에 결합된 CBD에서 서서히 방출된다.
한 구체예에서 수송될 약물은 항-곰팡이제이다. 적절한 약제에는 암포테리신 B, 니스타틴, 언데글린산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 약물은 일반적으로 클로트리마졸과 같은 이미다졸이 된다. 이와 같은 약물 수송시스템은 비경구, 구강, 국소 또는 흡입에 의해 투여될 수 있는 조성물내에 결합시키는 것도 고려할수 있다. 특히, 투여경로는 비강, 각막 또는 질내를 포함하나, 이에 한정시키지는 않는다. 또한 조성물은 고형, 겔, 액체 또는 분무형으로 될 수도 있다.
여기에서 상술하고 있는 약물 수송시스템은 세포막에 셀룰로오스성 또는 키틴물질을 포함하고 있는 이스트 또는 곰팡이제와 같은 감염성 또는 병원성제에 약물을 수송하는데 유용하다. 이와 같은 물질에는 아스퍼러질러스 퓨미가투스, 칸디다 또는 모니리아 또는 에피테마토 사이트족을 포함하나, 이에 한정시키지 않는다. 본 발명의 약물 수송시스템을 이용하면 질병 또는 감염의 효과적인 치료에 요구되는 약량을 상당히 감소시킬 수 있고, 따라서 일반적으로 상당히 독한 항-곰팡이 또는 항-피코성 약물의 효과를 개선시킨다. 따라서 부작용을 감소시키거나 더 유용하게는 제거할 수도 있다.
본 발명의 또 다른 편은 식물조직의 성장을 수정시키기 위한 CBD의 능력에 관한다. 이와 같은 능력은 농업에 이용될 수 있고, 이때 바람직하게는 화분 튜브성장 또는 뿌리성장을 촉진시키는데 바람직하다. 또한, 상당한 농도에서 CBD는 뿌리성장을 저해하는 능력이 있기 때문에 바람직하지 못한 식물의 성장을 저해하는데 유용한데, 가령, 잡초등이 해당된다. 또 다른 실시예에서 CBD는 버섯과 같은 곰팡이의 성장을 촉진시키는데 이용될 수 있는데, 이때 CBD는 키틴에 결합되어 담자과 또는 과일 몸체의 발생 또는 성장을 촉진시킨다.
본 발명의 또 다른 편에서 중장을 포함하는 곤충의 엑소스켈톤과 다른 곤충부분의 키틴에 결합할 수 있는 CBD의 능력에 관계한다. 이와 같은 능력은 생-살충제로써 유용한데, 이때 CBD는 바실러스튜링기네시스(BT)와 같은 곤충 유해물 또는BT 독소 유전자를 발현하는 다른 미생물 또는 곰팡이를 분비하는 키티나제와 같은 것을 조절하는데 유용한 미생물에 결합될 수도 있다. CBD는 곤충의 키틴부분에 미생물을 결합시키는 기능을 하는데, 미생물에 의해 생산된 독소 또는 효소는 곤충해충의 죽음을 유도하게 된다. 키티나제 활성을 나타내는 미생물에는 엔테로박터와 스트렙토마이세스의 박테리아 균주와 아스퍼질러스, 페니실리움과 트로코데르마의 곰팡이 균주를 포함한다. 본 발명의 한 구체예에서, CBD-미생물 복합체는 곤충 해충에 의한 감염위험시에 또는 감염된 식물부분에 직접 적용하거나 또는 CBD-미생물 복합체는 감염된 부분 또는 곤충해충에 감염된 식물에 독이 된 먹이에 고정시킬 수도 있다. 또 다른 구체예에서 CBD-미생물 복합체는 나무를 죽이는 해충에 의한 감염을 방지하거나 조절하기 위해 나무 또는 셀룰로오스-기초한 생성물에 제공될 수 있다. 가령, CBD-미생물 복합체는 전화막대 또는 나무 또는 셀룰로오스 기초한 구성성분에 제공되고, 이때 CBD 성분은 침투성 해충에 단단히 결합되고, 미생물 복합체는 해충을 효과적으로 조절할 수 있다.
본 발명의 또 다른 편은 독성 환경오염의 생물학적 치유 또는 분해에 유용한 곰팡이를 포함한 곰팡이에서 발견되는 키틴에 CBD가 결합할 수 있는 능력에 관계한다. 본 발명의 한 방식에 따르면, CBD 융합단백질은 제 2 성분이 환경오염을 분해하는 효소인 것에 사용된다. CBD-효소 융합단백질은 셀룰로오스 기질에 고정되고 효소적 분해에 의해 환경으로부터 오염물질을 제거하는데 사용된다. 가령, 수면 또는 수면아래에 장치를 두는 것이다. 또 다른 방식에 따르면 CBD는 살충제와 같은 환경 오염물질을 분해하는 등의 생치유에 유용한 효소를 분비하는 곰팡이에 결합된다. CBD-곰팡이 복합체는 셀룰로오스 기질에 고정시켜 벌채 또는 톱질 작용 동안에 남게 되는 산물을 포함하는 나무와 같은 또는 DOT를 포함하는 살균제와 같은 환경 오염물질을 효소적으로 분해하는 유용한 장치를 제공한다. 한 예에서 CBD는 흰색 로트 곰팡이 가령, 파네로체이트 치로스포리움과 복합되어 리그닌 과산화효소, 망가네이즈 과산화효소를 생산하고 살충제 DTT를 분해한다. CBD-곰팡이 복합체는 환경으로부터 DTT와 같은 살충제를 제거하기 위한 생치유에 유용하다.
제 1도는 뉴클레오티드(상측;orig, 제 2 라인, 상보)와 유추한 CBD의 아미노산 서열을 나타낸다.
제 2도는 CBD의 유전자 단편 인코딩의 클로닝과 준비를 나타낸다.
A는 CbpA 의 1차 구조 분석으로 N-단부 신호펩티드, 독특한 CBD부분, 4개 친수성 반복부위(흰색화살표)와 9개 소수성 반복 부위(흑색화살표)를 포함하고 있다.
B는 cbpA 유전자를 따라 PCR 프라이머의 위치를 나타낸다. CBD 인접부분에 프라이머서열과 cbpA DNA 서열을 포함하고 있다. PCR 생성물에는 밑줄 친 NcoI 와 BamHI 부위를 포함하고 있다. 유전자 단편의 ATG 개시코돈은 NcoI 부위내에 위치하고 있고, ATG 정지코돈은 BamHI 부위에 인접하고 있다.
C. pET-CBS의 구조, pET-8c 벡터내로 클론된 CBD 유전자 단편을 포함하고 있다. 벡터에는 유도성 CBD 생산을 위해 필수적인 전사와 해독신호를 포함한다.
제 3도는 CBD 단백질의 발현과 정제를 나타낸다.
세포로부터의 모든 단백질은 pET-8c(라인2)에 머무르고, 라인3에서는 pET-CBD에 융해된 pET-CBD 세포로부터의 세포단편과 용융된 pET-CBD 세포로부터의 체단편(라인 5) 최종 PC 완충액으로 세척한 Avicel pellet(라인 6), 정제된 CBD단백질(라인 7)을 15% 아크릴아미드겔에 얹는다. 각 라인은 각 단편의 총 단백질에 0.005% 씩 얹고, 단 6라인은 10배 농축시켰다. 미리 착색한 분자량 표식(라인 1,8)은 각 2.6, 5, 12.7, 18.1, 29와 44KDa의 이동성을 가진다.
제 4도는 CBD-Avicel(R) 결합의 시간 과정이다.
CBD(2.0 umol 총 단백질)과 Avicel(R) (1 ㎎/㎖)은 7단락에서 설명하는 것과 같이 균등화시키고, 단 큰 총 중량은 다양한 시간에서 취한 샘플을 제공하기 위해 사용한다. 각 시간대 샘플을 세척하고 단락7에서와 같이 검사한다(도면 9 의 표 1).
제 5도는 Avicel(R)에 결합된 CBD의 이중플롯이다. 0.5 ㎎ Avicel(R)은 (B)으로, 1 ㎎ Avicel(R)은 (J)로 그리고 2 ㎎ 은 △(H)로 나타낸다.
인세트: PCmax 대 사용된 Avicel(R)의 양이다.
검사용적은 1.0 ㎖이다.
제 6도는 Avicel(R)에 CBD 결합의 플롯을 나타낸다.
[PC]/[P] 대 PC를 Avicel(R) 3양에 대해 나타낸 것이다. [PC]/[P]는 면적없는 비율로 나타내고 [PC]는 uM로 나타낸다. 1 ㎎ Avicel(R)은 ●으로 2 ㎎ Avicel(R)은 □로 3 ㎎은 ■으로 나타낸다.
제 7도는 셀룰로론(R)에 CBD 결합을 이중 상호플롯으로 나타낸다. 배양혼합물에는 ㎖ 당 0.5 ㎎ 셀룰로론(R)을 포함한다.
제 8도는 셀룰로오스와 IgG 에 CBD-ProtA 융합단백질이 결합한다. 1M 아세트산은 선택적으로 CBD-ProtA:IgG를 방출하나 CBD-ProtA:셀룰로오스 "bond"는 방출하지 않는다.
제 9도는 비가용성 기질에 CBD 단백질의 흡수를 나타낸다.
제 10도는 CBD의 과발현과 정제를 나타낸다.
제 11도는 CBD 융합 생성물에 결합된 셀룰로오스 또는 키틴은 라벨된 CBD가 감지하는 신호증폭 시스템을 나타낸다. 소요의 물질은 키메라 프로브에 결합한다.
제 12도는 사차 CBD 융합 생성물:CBD-ProteinA(IgG)에 결합하는 소요의 물질을 나타내는 신호의 증폭 시스템을 나타낸다.
제 13도는 겔 전기영동에서 샘플을 감지하는 것으로 CBD-ProtA-셀룰로오스에 의한 IgG 정제를 나타낸다. 라인 a는 사람혈청이다. 라인 b는 CBD-ProtA-셀룰로오스에 결합하지 않는 사람혈청 단백질이다. 라인 c는 ProtA에 IgG의 결합이 일어난 후, 시료를 PBS로 제 1 세척후에 결합안된 단백질을 나타낸다. 라인 d는 아세트산 세척에 의해 회수된 IgG 단편이다.
제 14A와 B는 CBD-처리된 셀룰로오스 섬유는 고유로 남아 있는데, 즉 CBD는 셀룰로오스 파괴 무정형 활성을 가지지는 않는다. 제 14A는 CBD로 처리된 면섬유를 나타내고, B는 처리안된 면섬유(콘트롤)를 나타낸다.
제 15도는 셀룰로오스에 CBD-ProtA의 결합능에 pH와 NaCl 농도의 효과를 설명하는 것이다.
제 16도는 아스퍼르질러스 나이져에 CBD 결합을 설명한다. 라인 a 는 CBD와 아스퍼르질러스 나이져를 나타내고, 라인 b는 CBD 없이 아스퍼르질러스 나이져(콘트롤)를 나타내고, 라인 c는 CBD 단독이다.
제 17도는 스토도프테라 리토랄리스에 CBD 결합을 설명하는 것이다. 라인 a는 CBD없이 스포도프테라 리토랄리스에 미드-거트막이다(콘트롤). 라인 b는 CBD가 있는 미드-거트막이 된다.
제 18도는 헬리오티스 아르미게라에 CBD 결합을 설명한다. 라인 a는 CBD 없이 헬리오티스 아르미게라의 미드-거트막이다(콘트롤). 라인 b는 CBD가 있는 헬리오티스 아르미게라의 미드-거트막이다.
제 19도는 화분 튜브성장에 CBD와 BSA(콘트롤)의 효과를 설명한다.
제 20A와 B는 흰 형광 밝은 물질로 착색된 화분 튜브의 결정형 세포벽 성분에 CBD의 효과를 설명한다. 20A 도는 CBD 처리한 화분튜브는 상측부분에서 밝은색 없이 지적한 비-결정 화분튜브팁을 생산한다. 20B도는 밝은 색으로 지적된 많은 결정세포벽 성분들을 포함한다.
제 21A와 B도에서는 CBD 처리한 화분 튜브의 금-면역 라벨링을 설명한다. 제 21A도는 화분 적절하게는 끝부분에 CBD 처리된 금-라벨이 있음을 나타낸다. 21B도는 CBD 처리없이 콘트롤로써 화분을 나타낸다.
제 22도는 아라비도시스 탈리나 씨드링의 뿌리성장에 CBD의 효과를 설명한다. 상이한 문자는 뿌리길이 값 사이에 통계적 상이성을 나타낸다(p≤0.05).
제 23도는 CBD 처리된 아라비도시스 탈리나 씨드링의 금-면역 라벨링을 설명한다. 이 도면은 금-라벨링이 뿌리에 제한되고 새싹에는 라벨이 없음을 나타낸다.
제 24도는 흰색 형광 밝은색으로 착색한 아라비도시스 탈리나 씨드링을 설명한다. 이 도면은 단지 뿌리에만 접근가능한 셀룰로오스를 나타낸다.
본 발명은 높은 친화성으로 그리고 가역적 방식으로 셀룰로오스에 결합할 수 있는 셀룰로오스 결합도메인(CBD)단백질의 확인에 관한다. 본 발명의 CBD는 분자에 생물학적 활성분자의 생-고정에 유용하다. 본 발명의 CBD는 CBD 융합단백질을 형성하기 위해 제 2 단백질에 융합될 수도 있다. CBD 융합단백질에 CBD 단백질의 존재는 셀룰로오스와 배양에 의해 CBD 융합단백질의 용이하고 선택적인 정제를 허용한다. 제 2 단백질의 예로는 단백질 A, 단백질 G, 스트렙타아비딘, 아비딘, Taq 중합효소, 다른 중합효소, 알카리 포스포타제, RNase, DNase, 다양한 제한효소, 과사화효소, 엔도-1,4-베타-글루카네이즈, 엔도-1,3-베타-글루카네이즈와 같은 글루카네이즈 키티나제와 다른 베타와 알파 글루코시다제, 베타와 알파 글루코로니다제, 아밀라제, 글루코실-트란스퍼라제, 포스포-트란스퍼라제, 클로람페니콜-아세틸-트란스퍼라제와 같은 트란스퍼라제, 베타 락타마제와 다른 항생제 수정과 분해효소, 루시퍼라제, 에스트라제, 리파제, 단백질 분해효소, 박테리오신, 항생제, 효소저해제, 상이한 성장인자, 호르몬, 수용체, 막단백질, 핵단백질, 전사와 해독인자와 핵산 수정효소를 포함한다. 특히, CBD 단백질은 진단키트와 면역검사에 유용한 CBD 융합 생성물을 형성하기 위해 항체 또는 항원 결정부위에 융합될 수 있다.
따라서, CBD와 HSP 에피토프의 이용하여 특정항체(예로, 열쇼크 단백질(HSP)항체)의 존재를 확인하기 위해 체액을 테스트한다. 역으로, HSP 단백질, 교차-활성 HSP-관련 단백질 또는 이의 항원부분은 CBD-HSP 항체 융합단백질을 사용하여 감지할 수 있다.
"CBD" 또는 "CBD 단백질" 또는 "셀룰로오스 결합도메인 단백질"은 도면1에 나타낸 아미노산 서열로 구성된 단백질을 말하는 것으로 높은 친화력으로 가역적 방식으로 셀룰로오스에 결합할 수 있는 능력을 가지는 기능적 유사 또는 기능적 유도체를 가지고 있다면 이도 포함한다. 본 발명의 CBD는 자연적으로 결합된 다른 단백질없이 즉, 전술한 것과 같이 주요 cbpA 단백질로 제공된다. 또한 폴리펩티드에서 하나 이상의 예정된 아미노산이 치환, 삽입, 또는 결실될 수도 있는데 가령, CBD 개선된 생물학적 성질을 가지거나 또는 다양한 결합과 발현수준을 만들게 된다. 본 발명에 속하는 소요의 CBD 단백질의 일부는 글리코실화 수정을 포함하나, 이에 한정되지 않는 자연발생 분자의 공유적 또는 비-공유적 수정을 선택적으로 포함할 수 있다. 재조합 DA 기술을 사용하여 잔기결실, 치환 또는 삽입된 본 발명의 CBD 단백질은 아래 핵산을 변형시킴으로써 만들 수 있다. 본 발명의 CBD을 인코드하는 DAN에서 만들어질 수 있는 수정 또는 돌연변이는 리딩프레임을 변경하지 않기 때문에, mRNA 2차 구조를 만드는 상보적 부분을 참조하지 않는다(European PatentPublication No. EP 75,444).
본 발명의 CBD 단백질은 제 1 도에 나타낸 아미노산 서열에 적어도 70% 적절하게는 80%, 더욱 적절하게는 90% 최적으로는 95%의 유사성을 가지는 것이다. "X% 유사성" 용어는 단백질 전장을 통하여 X% 유사성을 가지는 서열에만 국한시키지는 않는다. 70% 유사성은 도면1의 CBD 단백질내에 확인된 기능적 부분에서 발생하는 X% 유사성을 포함하는 경향이 있다. 기능적 부분의 예는 높은 친화성을 가지고 비가역적 방식으로 셀룰로오스에 결합할 수 있는 능력을 가진 아미노산 세트가 될 수 있다. 이와 같은 단백질 유사성은 "CBD 기능적 유사체"로써 여기에서 언급될 수 있다. 구체예에서 이와 같은 기능적 부분은 약 100개 아미노산이다. 구체예에서 이와 같은 기능적 부분은 약 50개 아미노산을 가진다. 본 발명의 가장 바람직한 CBD 단백질은 제 1 도의 아미노산 서열로 구성된 것이다.
여기에서 사용된 "CBD-기능적 유도체"는 높은 친화력과 가역적 방식으로 셀룰로오스에 결합할 수 있는 제 1 도에 나타낸 CBD 단백질 아미노산의 "단편", "가변체", "유사체" 또는 "화학적 유도체"를 의미하고, 적절하게는 약 2 내지 160개 아미노산, 적절하게는 25 내지 125개 아미노산, 가장 적절하게는 50 내지 100개 아미노산이 된다.
"단편"은 제 1 도의 CBD 단백질에서 유도된 CBD 단백질을 지시하는데 사용되고 자연발생 서열을 가질 수 있다. 이와 같은 단편은 전체길이 단백질의 단백질 분해에 의해 생성될 수 있다. 또는 이와 같은 단편은 자연발생 서열내에 하나 이상의 C-단부, N-단부에서 하나 이상의 아미노산을 삭제하기 위해 CBD 단백질을 인코드하는 DNA 서열의 적절한 수정에 의해 재조합적으로 수득될 수 있다. CBD 단백질의 단편은 기능적 유도체의 확인 또는 유용성을 결정하기 위해 높은 친화력과 가역적 방식으로 셀룰로오스에 결합할 수 있는 능력을 선별하게 된다.
여기에서 사용된 "가변체"는 아미노산 서열내에 글리코실화 패턴 또는 비공유적 또는 공유적 방식으로 수정된 분자를 의미하는데, 여기에는 돌연변이를 포함한다. 높은 친화력을 가지고 가역적 방식으로 셀룰로오스에 결합하는 능력이 최종구조에 포함된다면, 본 발명내에 속하는 가변체의 일부는 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함한다. CBD 단백질에 아미노산 치환은 관련부분의 극성, 하전, 용해성, 소수성, 친수성 또는 양쪽성에 기초하여 만들 수 있다. 가령, 음하전을 띤 아미노산에는 아스파르트산, 글루타민산을 포함하고; 양전하를 띤 아미노산에는 리신과 아르기닌을 포함하고; 비하전된 극성머리기 또는 비극성 머리기를 가지는 아미노산은 루이신, 이소루이신, 발린; 글리신, 알라닌; 아스프라긴, 글루타민; 세틴, 트로닌; 페닐알라닌, 티로산을 포함하여 유사 친수성을 가지는 것끼리 묶은 것이다. 가변체의 정의에는 높은 친화력을 가지고 가역적 방식으로 셀룰로오스에 결합할 수 있는 능력을 보유하는 자연발생 CBD 서열내에 하나 이상의 C 단부와 N 단부에서 추가의 아미노산을 가지는 단백질을 말한다.
여기에서 사용하는 "화학적 유도체"는 자연 발생 또는 다양한 CBD 단백질의 화학적 수정에 의해 생산된 CBD 단백질에 관계한다. 화학적 수정의 예로는 알킬, 아실 또는 아미기에 의해 서로 대체할 수 있다.
여기에서 사용하는 "높은 친화력으로 셀룰로오스에 결합"은 1.5 내지 0.5 적절하게는 1.4 내지 0.8 uM의 Kd를 가지는 CBD 단백질의 능력을 의미한다. 좀더 적절하게는 높은 친화력 결합은 Kd 값이 1.1 가장 적절하게는 약 1.0을 가지는 CBD가 결정형 셀룰로오스에 결합하는 능력을 의미한다.
여기에서 사용하는 "가역적 방식의 셀룰로오스 결합"은 비이온성 계면활성제를 포함하는 계면활성제 6M 우레아, 6M 구아니딘-HCl과 같은 용액에 의해 셀룰로오스-CBD 단백질 결합 복합체에서 방출될 수 있는 CBD 단백질의 능력에 관한다. 그러나 방출된 CBD 또는 융합 생성물이 재구성될 수 있도록 이와 같은 변성 시약이 사용될 수 있다. 가령, CBD는 하기 6.1.4, 7.1.1, 7.2.1 와 8.1.4에서 상술하고 있는 재생조건에 변성된 단백질이 당하도록 6M 요소 또는 6M 구아니딘-HCl을 처리함으로써 재구성될 수 있다.
여기에서 사용하는 "CBD 융합단백질"은 적어도 2개 단백질, CBD 단백질과 제 2 단백질과 함께 결합하는 것을 의미한다. 본 발명의 구체예에서 제 2 단백질은 제 3 단백질과 융합되거나 결합될 수 있다. 본 발명에서 제 2 단백질의 예로는 핵산 수정효소와 같은 효소, 단백질 분해효소, 호르몬 또는 호르몬 전구체, 폴리펩티드, 펩티드, 항체, 항원, 항원 에피토프와 이의 가변체와 같은 것을 포함한다. 본 발명의 구체예에서 제2단백질은 단백질 A 이고, 적절한 구체예에서 제 2단백질은 HSP 단백질이 된다. 한 구체예에서 융합단백질은 CBD 단백질, 단백질 A 또는 항-HSP 재조합 IgG로 구성된다. 본 발명의 CBD 융합단백질은 제 2 단백질의 N 단부에 인접하거나 상류에 화학적 또는 효소적 절단부위와 제 2 단백질의 C 단부에 인접한 또는 하류의 효소적 또는 화학적 절단부위로 구성되어 절단제의 사용을 통하여 CBD융합단백질에서 제 2 단백질을 회수하는 수단을 제공한다.
여기에서 사용하는 "CBD 융합단백질-셀룰로오스 결합 복합체"는 셀룰로오스가 CBD 융합단백질의 CBD 단백질에 결합할 때 형성된 복합체를 의미한다.
"핵산"은 DNA 또는 RNA 서열이 될 수 있는 5′-3′ 포스포디에스테르 결합으로 된 핵산의 나열로 이루어진 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 핵산이 DNA인 경우, 뉴클레오티드 서열은 단일 또는 이중가닥이 된다. 높은 친화력으로 셀룰로오스에 결합할 수 있는 CBD 단백질을 인코드하는 RNA 또는 DNA인 핵산을 인코드하는 CBD 단백질은 이와 같은 CBD 단백질을 인코드하는 핵산서열에 상보적이거나 또는 CBD 단백질에 인코드하는 핵산서열과 하이브리드되고 이는 엄격한 조건하에 단단히 결합할 수 있다.
"본 발명의 CBD 단백질을 인코드하는 핵산" 문구에는 게놈, cDNA, 합성과 반-합성 오리진의 핵산을 포함하는데, 이때 자연적으로 연합되는 폴리뉴클레오티드의 어느 부분과도 연합되어 있지 않고 자연적으로 연결된 것보다는 폴리뉴클레오티드에 연결되며, 여기에는 CBD가 높은 친화력으로 셀룰로오스에 결합할 수 있는 능력을 보유하는 한 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체 또는 이의 복합체의 단일 또는 이중가닥의 중합체를 포함한다. 여기에는 방사능 활성, 화학적 라벨, 메틸화, 캡, 하전된 링커(즉, 포스티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)에 의한 뉴클레오티드간의 수정, 펜던트부분, 인터칼레이터, 킬레이타 등이 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 수정이 포함되는 조건에서 핵산에 의해 인코드된 CBD는 높은 친화력과 가역적 방식으로 셀룰로오스에 결합될 수 있는능력을 보유한다.
CBD 인코딩 핵산은 본 발명의 CBD 단백질 또는 CBD 융합단백질을 발현시킬 수 있는 재조합 발현벡터를 만드는데 사용될 수 있다. 핵산구조는 여기에 전사와 해독 조절정보를 포함하는 경우에 단백질을 발현시킬 수 있고 이와 같은 서열은 뉴클레오티드 코딩서열에 "작동적으로 연결된" 것이다. "작동할 수 있도록 연결된"은 전사와 궁극적으로 해독이 허용되는 방향으로 조절 DNA 서열과 발현될 DNA 서열이 연결된 것을 의미한다.
CBD 융합단백질 발현벡터 제조에서 CBD 단백질을 인코드하는 핵산은 CBD 단백질과 제 2 단백질의 오픈 리딩 프레임이 고유로 남아있어 CBD 융합단백질의 해독이 될 수 있도록 제 2 단백질을 인코드하는 핵산에 결합 또는 연결될 수 있다. CBD 핵산은 높은 친화력으로 가역적 방식으로 결합하거나 또는 CBD 인코드하는 mRNA를 생산하는 셀룰로오스 결합도메인을 생산하는다양한 세포원에서 얻을 수 있다. CBD 인코드하는 핵산의 적절한 원으로는 클로스트리듐 셀룰로보란이 된다. CBD 인코드 핵산은 6.1에서 상술하는 것과 같이 수득될 수 있다.
본 발명의 CBD 단백질을 인코드하는 핵산은 세포원에서 분리하고 정제한 DNA에서 수득하거나 게놈 클로닝에 의해 수득한다. cDNA 또는 클론의 게놈 라이브러리는 공지의 기술을 이용하여 만들 수 있고, 유전자의 일부에 상보적인 뉴클레오티드 프로브와 특정 CBD를 인코드하는 핵산을 스크린할 수 있다. CBD 단백질을 인코드하는 보존된 뉴클레오티드 부위를 감지할 필요가 있는 경우에, 뉴클레오티드 프로브는 중간에 보존된 CBD 뉴클레오티드 사열에 기초한다. CBD 단백질을 인코드하는 독특한 뉴클레오티드 부분의 감지가 필요한 경우 뉴클레오티드 프로브는 독특한 CBD 뉴클레오티드 사열에 기초한다. 또는 cDNA 또는 게놈 DNA는 적절한 올리고뉴클레오티드 프라이머와 함께 PCR 클로닝을 위한 주형으로 사용될 수도 있다. 전체 길이 클론 즉, 소요의 CBD 단백질의 전체 코딩부분을 포함하는 것은 완전한 코딩서열을 만들기 위해 발현벡터를 만드는데 선택되거나 또는 겹치는 cDNA가 함께 연결될 수 있다. 또는 CBD-인코딩 DNA는 본 기술에 표준화된 기술을 이용하여 전체 또는 부분적으로 화학적 합성에 의해 합성될 수 있다.
많은 벡터가 이용될 수 있고, 적절한 벡터의 선택은 1) 핵산증폭 또는 핵산발현에 사용할 수 있느냐, 2) 벡터내로 삽입될 핵산의 크기, 그리고 3) 벡터가 형질도입된 숙주세포에 따라 달라진다. 각 벡터에는 2기능(핵산의 증폭 또는 발현) 및 경쟁할 숙주세포에 따라 다양한 성분을 포함한다.
"숙주세포" 용어는 배양물에서 세포가 성장할 수 있고, CBD 또는 CBD 융합단백질을 발현할 수 있는 세포를 의미한다. 본 발명의 숙주세포는 시험관에서 배양물내에 세포의 진핵, 원핵생물 및 곤충세포를 포함한다. 숙주세포 균주는 삽입된 서열의 발현조절 또는 소요의 방식으로 유전자 생성물을 수정하고 진행하는 것으로 선택될 수 있다. 특정 프로모터로부터의 발현은 특정 유도물질(즉, 메탈로티오닌 프로모터의 경우 아연과 카드뮴) 존재하에 상승될 수 있다. 따라서 CBD 단백질 또는 CBD 융합단백질의 발현은 조절될 수 있다. 발현을 조절하는 능력은 CBD 단백질 또는 CBD 융합단백질이 숙주세포에 치명적인 경우 중요하다. 단백질의 수정(즉, 포스포릴화반응)과 진행(절단)은 단백질의 기능에 중요하다. 상이한 숙주세포는단백질의 해독후 진행과 수정에 대한 특이적 기작과 특징을 가진다. 적절한 세포주 또는 숙주시스템은 발현된 CBD 단백질 또는 CBD 융합단백질의 정확한 수정과 진행을 확인하기 위해 선택될 수 있다. 적절하게는 숙주세포는 단백질 분해효소의 최소량을 분비하게 된다.
본 발명에서 숙주세포는 높은 친화력으로 셀룰로오스에 결합할 수 있는 본 발명의 CBD 단백질 또는 CBD 융합단백질을 인코드하는 핵산으로 구성된다. 본 발명의 CBD 단백질의 클로닝과 발현을 위한 적절한 숙주세포는 원핵세포이다. 원핵세포는 다량의 핵산의 신속한 생산, 부위직접 돌연변이에 사용되는 단일 가닥 핵산 주형의 생산, 동시에 많은 돌연변이체의 선별과 발생된 돌연변이체의 핵산서열에 특히 유용하다. 본 발명의 CBD 단백질의 클로닝과 발현에 유용한 원핵세포로는 스트렙타진이 대장균 균주 XLI-블루이다. CBD 융합단백질의 클로닝과 발현에 유용한 또 다른 원핵 세포로는 스타필로코커스 아우레우스이다. 또 다른 예로는 인비타트로겐 회사(San Diego, CA)의 피치아 발현키트이다.
다양한 발현벡터/숙주 시스템은 CBD 단백질과 CBD 융합단백질의 재조합 발현을 위해 본 기술에 숙지된 자가 일반적으로 사용할 수 있다. 이와 같은 시스템은 소요의 CBD 또는 코스미드 DNA 발현벡터로 형질 전환된 박테리아와 같은 미생물; 소요의 CBD 코딩서열을 포함하는 재조합 이스트 발현벡터로 형질도입된 이스트; 소요의 CBD 코딩서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현벡터(베큘로바이러스)로 감염된 곤충세포 시스템; 소요의 CBD 코딩서열을 포함하는 재조합 플라스미드 발현벡터(Ti 플라스미드)로 형질감염된 식물세포 시스템; 안정하게 증폭된(CHO/dhfr, CHO/글루타민 합성효소) 또는 이중-미이너트크로모좀에서 불안정하게 증폭된(쥐 세포주) CBD 핵산 다중 복사체를 포함하도록 조작된 세포주를 포함하여 재조합 바이러스 발현벡터(아데노바이러스, 베시니아 바이러스)로 감염된 동물세포 시스템이 포함되나, 이에 한정하지는 않는다.
벡터성분에는 일반적으로 시그날서열, 복제기원, 하나이상의 표시유전자, 강화요소, 프로모터와 전사 종료서열과 같은 것을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 이들 벡터의 발현요소들은 이들의 강도와 특이성이 매우 다양하다. 이용된 숙주/벡터 시스템에 따라 적절한 전사와 해독요소가 이용될 수 있다. 가령, 원핵세포 시스템에서 클로닝할 때 프로모터는 원핵세포 게놈에서 분리한 프로모터(박테리아성 트립토판 프로모터)가 이용될 수 있다. 재조합 DNA 또는 합성기술에 의해 생산된 프로모터는 삽입된 서열의 전사를 위해 이용될 수 있다.
신호서열은 벡터성분이 될 수도 있고, 이는 벡터에 삽입될 CBD 핵산의 일부일 수도 있다. 신호서열은 CBD 서열 앞에 자연적으로 또는 비자연적으로 발생한 서열이 될 수도 있다. 신호서열은 숙주세포에 의해 인지되고 진행되는 것이다. 복제원점은 숙주 유기체의 복제개시를 위한 독특한 부위를 의미한다. 선택적 유전자로 구성된 벡터의 클로닝과 발현벡터가 될 수도 있다. 이 유전자는 선택적 배양배지에서 성장시킨 형질 전환된 숙주세포의 생존 또는 성장에 필수적인 단백질을 인코드한다. 선택적 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환 안된 숙주세포는 배양배지에서 생존하지 않는다. 일반적인 선택 유전자는 암피실린과 같은 항생제 또는 단백질에 저항성; 상보적 자가 영양 결핍; 복합배지에서 이용할 수 있는 결정적인 영양제를 공급하는 단백질을 인코드한다. 선택과정 중 하나는 숙주세포의 성장을 잡을 수 있는 약물을 이용한다. 이형유전자로 형질전환이 성공적으로 된 세포는 약물 저항성을 가지는 단백질을 발현하고, 따라서 선택적 섭생을 살아남게 된다.
발현과 클로닝 벡터는 통상적으로 소요의 폴리펩티드를 인코드하는 핵산에 선택적으로 연결되고 숙주유기체에 의해 인지될 수 있는 프로모터를 포함한다. 프로모터는 특정 핵산서열의 해독과 전사를 조절할 수 있는 구조적 유전자의 개시코돈에 해독안된 서열(약 100 내지 1000bp)이고, 이는 CBD 단백질 또는 CBD 융합단백질을 인코드하는 서열에 작동식으로 연결된다. 이와 같은 프로모터는 두 가지 종류, 유도성과 구성요소로 나눌 수 있다. 유도성 프로모터는 배양조건 중 일부변화, 가령, 온도변화와 영양소 유무에 반응하여 이들의 조절하에 핵산으로부터 전자의 증가된 수준을 개시하는 프로모터이다. 이때, 다양한 숙주세포에 의해 인지되는 다수의 프로모터가 공지되어 있다. 이와 같은 프로모터는 제한효소 절단에 의한 원료핵산에서 프로모터를 빼내고, 분리된 프로모터는 벡터내에 삽입하여 소요의 폴리펩티드를 인코드하는 핵산에 작동식으로 연결될 수 있다. 자연 발생 프로모터 서열과 많은 이형 프로모터는 소요의 폴리펩티드의 직접적인 증폭 또는 발현에 사용될 수 있다. 그러나 이형 프로모터가 적절한데 이는 자연 발생 프로모터와 비교할 때, 더 많은 전사와 소요의 폴리펩티드가 다량 발현을 허용한다. 일반적으로 숙주세포와 경쟁할 수 있는 종에서 유도된 컨트롤 서열과 프로모터를 포함하는 플라스미드 벡터가 숙주와 함께 이용된다. 벡터는 보통 복제부위와 형질전환된 세포에서 표현형 선택을 제공할 수 있는 표식서열을 가지고 있다. 가령, 대장균은 일반적으로 대장균에서 유도된 플라스미드인 pBR322를 이용하여 형질전환된다(Bilivar, et al., Gene 2:95 [1977]). pBR322 플라스미드는 암피실린과 테트라사이클린 저항성 유전자를 가지고, 따라서 형질전환된 세포를 확인하는 용이한 수단을 제공한다. pBR322 플라스미드 또는 다른 미생물 플라스미드는 재조합 DNA 구조에 일반적으로 사용되는 다른 컨트롤 요소와 프로모터를 포함하도록 수정된다.
원핵숙주와 사용하기에 적합한 프로모터에는 β-락타마제와 락토즈 프로모터 시스템(Chang et al., Nature, 275:615 [1978]; and Goeddel et al., Nature 281:544 [1979]; 알칼리 포스포타제, 트립토판(trp) 프로모터 시스템(Goeddel Nucleic Acids Res. 8:4057 [1980] and EPO Appln. Publ. No. 36,776)과 tac 프로모터와 같은 하이브리드 프로모터(H.de Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 [1983])를 포함한다. 그러나 다른 기능적인 박테리아 프로모터가 적합하다. 이들 뉴클레오티드 서열이 일반적으로 공지되고, 이는 필요한 제한효소 부위를 공급하기 위해 링커 또는 어뎁터를 사용하여 프로레라신(Siebenlist et al., Cell 20:269 [1980])을 인코드하는 핵산서열에 연결하는 것은 이미 공지된 바 있다. 박테리아 시스템에 사용할 수 있는 프로모터는 프로레라신을 인코드하는 핵산에 작동식으로 연결된 샤인-달가노(S.D.) 서열을 포함할 수 있다.
원핵 숙주세포에 사용되는 발현벡터에는 전사종료와 mRNA의 안정화를 위해 필수적인 서열을 포함한다.
전술한 성분의 하나 이상과 소요의 코딩과 컨트롤 서열을 포함하는 적절한벡터의 제조에는 표준 연결기술이 이용된다. 분리한 플라스미드 또는 핵산단편은 절단하고, 제단하여 소요의 플라스미드를 발생시키기 위해 재연결된다.
본 발명의 실행에 특히 유용한 것은 CBD 단백질을 인코드하는 핵산을 원핵세포에서 발현시키기 위해 발현벡터이다. 일반적으로, 숙주세포에서 효율적으로 복제할 수 있는 발현벡터의 이용과 관계하는데, 숙주세포는 상당수의 발현벡터 복사체를 축적하여 발현벡터에 의해 인코드된 소요의 폴리펩티드를 상당수준으로 합성하게 된다.
숙주세포는 본 발명의 전술한 발현 또는 클로닝벡터로 형질감염, 적절하게는 형질전환되고 프로모터를 유도하고 형질전환체를 선택하고 또는 소요의 서열을 인코드하는 유전자를 증폭시키기 위해 통상의 영양배지를 적절히 변형시켜서 여기에 배양시킨다.
"형질전환"은 핵산이 유기체내에서 크로모좀의 요소 또는 크로모좀에 합체되어 복제할 수 있도록 유도하는 것이다. 다른 말이 없는 경우, 숙주세포의 형질전환을 위해 여기에서 사용된 방법은 Cohen, F.N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 69:2110 (1972)에서 상술한 것과 같이 염화칼슘을 이용한 칼슘처리 방법이다.
만들어진 플라스미드에 정확한 서열을 확인하기 위한 분석에서 연결 혼합물은 대장균 K12 균주 294(ATCC 31446)를 형질전환시키기 위해 사용되고, 적절한 암피실린 또는 테트라사이클린 저항성에 의해 성공적으로 형질전환체를 선택할 수 있다. 형질전환체에서 플라스미드 Messing et al., Nucleic Acids Res. 9:309(1981)의 방법 또는 Maxam et al., Methods in Enzymology 65:499 (1980)의 방법에 의해 분석하여 준비할 수 있다.
숙주세포는 본 발명의 발현벡터로 형질전환되고, 프로모터를 유도하고, 형질전환체를 선택하고 또는 유전자를 증폭시키는데 적합하도록 변형된 통상의 배지에서 배양시킨다. 온도, pH 등과 같은 배양조건은 발현을 위해 선택된 숙주세포의 것과 같은 것으로 사용하고, 이는 통상의 지식을 가진 자가 알 수 있을 것이다.
본 발명의 폴리펩티드를 생산하는데 사용되는 원핵세포는 Sambrook et al. (1989) Electrophoresis buffers in Molecular Cloning (Nolan, C. ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, pp. B. 23-24; Sambrook et al. (1988) Bacterial Media in Molecular Cloning (Nolan, C, ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, pp. A.1-4에서 상술한 것과 같은 배지에서 배양시킨다.
본 발명의 CBD 단백질 또는 CBD 융합단백질을 생산하기 위한 숙주세포의 선택은 적어도 4가지 일반적인 방식에 의해 이루어지는데:
(a) DNA-DNA, DNA-RNA 또는 RNA, 안티센스 RNA 하이브리드 반응: 본 발명의 CBD 단백질을 코딩하는 핵산의 존재는 CBD 코딩서열에 유사한 뉴클레오티드로 구성된 PCR 반응을 위한 하이브리드 프로브 또는 프라이머를 이용하여 핵산 하이브리드에 의해 감지할 수 있고;
(b) "표식" 유전자 기능의 유무: 본 발명의 CBD 단백질을 인코드하는 핵산을 가지는 숙주세포의 선택은 항생제 저항성과 같은 특정 유전자 기능의 유무에 기초하여 확인되고 선택된다. 가령 CBD 코딩서열이 클로닝 또는 발현벡터의 표식유전자 서열내에 삽입되면, 코딩서열을 포함하는 재조합체는 표식유전자 기능이 없는 것으로 확인된다. 또는 표식유전자가 CBD 코딩서열을 발현을 조절하기 위해 사용된 동일 또는 상이한 프로모터의 컨트롤 하에 CBD 핵산서열에 인접하여 위치할 수도 있다. 유도 또는 선택에 의한 표식유전자의 발현은 CBD 코딩서열의 발현을 나타내고;
(c) 숙주세포에서 CBD 단백질 또는 CBD 융합단백질 mRNA 전사체의 발현에 의해 측정된 전사수준평가: CBD 코딩부분의 전사활성은 하이브리드 검사에 의해 측정될 수도 있다. 가령, 폴리아데닐화된 RNA는 분리하고 CBD 코딩서열 또는 이의 특정부분에 유사한 프로브를 사용하여 노던 블랏에 의해 분석한다. 또는 숙주세포의 총 핵산은 이와 같은 프로브에 하이브리드를 검사하고; 그리고
(d) 면역검사와 높은 친화력으로 가역적 방식으로 셀룰로오스에 결합할 수 있는 단백질의 능력에 의해 측정된 CBD 단백질 또는 CBD 융합단백질의 감지로, CBD 단백질의 발현은 웨스턴 블랏 또는 RIAs와 같은 면역검사에 의해 면역학적으로 측정할 수 있다. CBD 단백질의 발현은 높은 친화력으로 가역적 방식으로 셀룰로오스에 결합할 수 있는 발현된 단백질의 능력에 의해 검사된다.
"세포"와 "세포 배양물"은 서로 상호교환식으로 사용될 수 있는 용어이다. 또한 모든 자손이 전달적이고 또는 불연속적 돌연변이로 인하여 정확히 동일한 함량의 DNA를 가지지는 않는다. 세포를 선별할 때 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 가지는 돌연변이 자손이 포함된다.
여기에서 사용한 "견숙조건"은 (1) 0.015 M NaCl/0.0015M 시트레이트나트륨/0.1% SDS 50 ℃와 같은 낮은 이온강도와 높은 온도를 이용하고, (2) 50% (V/V) 포름아미드와 0.1% 소혈청알부민/0.1% 피콜/0.1% 폴리비닐피롤리돈/50mM 인산나트륨 완충액 pH 6.5 750mM NaCl, 75mM 시트레이트 나트륨 42℃와 같은 포름아미드를 하이브리드동안에 변성제로 이용하거나; 또는 (3) 50% 포름아미드, 5 ×SSC(0.75M NaCl, 0.075M 피로포스페이트 나트륨, 5 × 덴하르느 용액, 초음파 분쇄된 연어 정자 DNA(50 g/㎖), 0.1% SDS와 10% 덱스트란 설페이트 42℃를 이용하여, 42℃에서 0.2×SSC와 0.1% SDS로 세척하는 조건을 의미한다.
여기에서 사용된 "회수"는 특정 조건하에 셀룰로오스-CBD 단백질 결합 복합체에서 CBD 단백질을 방출시키기 위해 셀룰로오스 CBD 단백질 복합체의 능력을 의미하고, 상기 조건에는 6M 요소 또는 6M 구아니딘-HCl 과 같은 변성제등의 방출제를 사용하는 것이 포함된다. 셀룰로오스-CBD 단백질 결합복합체에서 CBD 단백질의 방출능력을 가지는 임의 방출제가 CBD 단백질을 회수하는데 사용될 수도 있다. 적절하게는 CBD는 단지 일시적으로 변성되고 방출제에 의해 비가역적으로 분해되지는 않는다. 따라서 CBD는 하기 7.1.1, 7.2.1 와 8.1.4에서 상술하고 있는 용출된 단백질을 재구성함으로써 회수할 수 있다.
여기에서 사용한 "절단제"는 원하는 경우 CBD 융합단백질의 제 2 단백질과 같은 특정부분을 절단하거나 방출하기 위해 특이적으로 CBD 단백질 또는 CBD 융합단백질을 절단하는데 사용되는 시약을 의미한다. 여기에서 적절한 절단제는 엔도프로테아제, 프로호르몬 전이효소 즉 PC1, PC2, 퓨린, Kex2, 서브틸리신 또는 이의 돌연변이체와 같은 효소; 유기와 무기산, 하이드록실아민, N-브로모숙신아미드와시아노겐 브로마이드와 같은 화학물질이 포함된다. 단백질 분해효소의 다양성에 의해 촉진된 펩티드 결합의 가수분해는 The Enzymes, 3rd Edition, Boyer Ed., Academic Press, Vol. Ⅲ [1971]; Meth. Enzymology., Vol. ⅩⅠⅩ, Perlman and Lorand, Ed., New York: Academic Press [1970]; Meth. Enzymol., Vol. XLV, Lorand, Ed. New York: Academic Press [1976]; Drapeau, J. Biol. Chem., 253:5899-5901 [1978] and Drapeau, Meth. Enzymology., 47:89-91 [1977]에서 상술하고 있다. 광범위한 화학시약 목록은 Witcop in Advances in Protein Chemistry, Anfinsen et al., ed., 16:221-321, Academic Press, New York [1961], including Table Ⅲ on p. 226을 참고한다. 여기에서 적합한 다른 절단제는 이물질이 CBD 융합단백질의 환원 또는 산화형에 작용하는지 그리고 절단시 소요의 결합이 유지하는지에 따라 이해할 수 있을 것이다. CBD 융합단백질의 절단에 사용되는 조건은 이용된 절단제에 따라 달라지고, 조건은 절단제가 제공된 경우 공지의 기술에 숙지된 자가 결정할 수 있을 것이다.
본 발명의 CBD 융합단백질은 소요의 위치 즉, 제 2 단백질의 인접한 또는 상류 또는 CBD 융합단백질의 제 2 단백질의 N 단부에 인접하여 또는 상류 또는 융합단백질의 제 2 단백질이 융합단백질의 내간 아미노산인 경우 소요의 절단제에 의해 절단하는데 필수적인 코돈으로 구성되도록 고안되고 만들어진다.
여기에서 사용된 "글리코실화"와 유도체는 글리코단백질을 생산하기 위해 단백질의 당잔기를 첨가하는 해독후 수정공정임을 의미한다. 글리코실화는 포유류 세포의 사이토졸, 엔도플라스믹레티큘롬 또는 골지체에서 일어날 수 있다. 또는적절한 글리코실 기증자에 의해 합성방식으로 이루어질 수도 있다(Kahne, et al. J. Am. Chem. Soc., 111:6881-2 [1989]).
본 발명은 테스트 샘플 특히, 조직 추출물 또는 혈청 또는 소변과 같은 생물학적 유체와 같은 생물학적 시료를 본 발명의 CBD 융합단백질의 사용을 통하여 샘플내에 소요의 단백질의 진단학적 감지에 관계한다. 생물학적 시료는 포유류 적절하게는 사람의 것이 된다. 시료에서 감지될 소요의 적절한 단백질은 HSP 단백질, HSP 항체, 교차-반응 HSP 관련 단백질 또는 이의 항원부분이 된다. 가령 포유류의 생물학적 샘플에 HSP 항체의 존재는 인슐린 의존성 진성 당뇨병(IDDM)의 암시이다. 구체예에서 CBD 단백질 A 융합단백질은 제 2 단백질, IgG 항체로 구성되는데, 가령 IgG 항-HSP의 경우 항원존재를 감지하는데 사용되고, HSP의 경우 본 기술에 공지된 면역검사 포맷을 이용하여 생물학적 샘플에서 항원의 존재를 감지한다. 또는 CBD 융합단백질의 제 2 단백질은 항원 결정부위를 인지하는 항체의 감지에 유용한 에피토프 즉 항원 결정부위로 구성된다.
단백질 A는 IgG 분자의 Fc 부분에 결합할 수 있고, 따라서 항체를 침전시키는 스타필로코커스 아우레우스의 세포벽에서 발견된 단백질이다. 단백질 A는 RIA 또는 ELISA와 같은 면역검사에 유용성을 가지는데, 이는 항체 또는 항원-항체 복합체를 분리하는데 이용될 수 있다.
본 발명에서 단백질 A는 CBD 융합단백질의 적절한 제 2 단백질이다. CBD-단백질 A 융합단백질은 항체의 존재 또는 그 양과 농도 또는 항원-항체 복합체를 감지하는 진단학적 면역검사에 유용성을 가진다.
본 발명의 CBD-단백질 A 융합단백질은 셀룰로오스와 CBD-융합단백질로 구성된 진단키트에 유용성을 가진다. 이때 CBD 융합단백질 성분은 항원-항체 복합체 또는 항체와 같은 IgG 제 2 성분과 셀룰로오스에 결합할 수 있는 능력을 보유한다. 본 발명의 CBD 융합단백질은 항체 또는 항원 결정부위 즉 에피토프의 친화성 정제의 수단으로 유용하다. 본 발명의 적절한 항원 결정체는 HSP 단백질과 관련 단백질 또는 이의 항원부분이 된다. CBD 융합단백질의 적절한 제 2 단백질은 HSP 단백질 또는 항-HSP IgG를 포함한다. 본 발명에서 CBD-HSP 에피토프 융합단백질은 사람의 혈청에서 발견되는 HSP 항체양을 측정하도록 고안된 면역검사에 유용성을 가진다.
본 발명의 또 다른 구체예에서 CBD-융합단백질은 이의 촉매활성을 가지는 효소인 제 2 성분과 셀룰로오스 또는 키틴에 결합할 수 있는 능력을 보유한 CBD 성분으로 구성된다. 구체예에서 CBD-융합단백질은 셀룰로오스 또는 키틴의 고형기질에 효소 촉매화된 반응을 허용하는 수단으로써의 유용성을 가진다. 상기와 같이, CBD 효소 융합된 단백질의 표준 화학적 방법 또는 재조합 방법에 의해 핵산을 인코드하는 효소와 CBD의 발현에 의해 정제된 효소준비물에 정제된 CBD를 연결시킴으로써 준비할 수 있다. 구체예에서 CBD-융합단백질의 제 2 성분은 헤파리나제 효소이다. CBD-헤파리나제는 셀룰로오스 기질에 고정되어 헤파린을 사카라이드 부분으로 전환되는 것을 촉진시킨다.
본 발명의 또 다른 편에는 식물조직의 성장을 수정시킬 수 있는 CBD의 능력에 관계한다. 이와 같은 능력은 농업에 응용할 수 있는데 가령 화분 튜브성장 또는 뿌리성장을 촉진시킬 수 있다. 또한 고농도의 CBD는 뿌리성장을 저해시키는 능력을 가지므로 잡초와 같은 불필요한 식물의 발생을 저해하는데 유용하다. 또 다른 예에서 CBD는 버섯과 같은 곰팡이의 성장을 촉진시키는데 이용될 수 있고, 이는 CBD가 키틴에 결합하여 담자과 또는 과일의 발생과 성장을 촉진시킨다.
본 발명의 또 다른 편에는 중장을 포함한 곤충외피와 다른 부분의 키틴에 결합할 수 있는 CBD의 능력에 관한다. 이와 같은 능력은 생-살충제로써 유용한데, 이때 CBD는 바실러스 튜링기네시스(BT)와 같은 곤충 유해물 또는 BT 독소 유전자를 발현하는 다른 미생물 또는 곰팡이를 분비하는 키티나제와 같은 것을 조절하는데 유용한 미생물에 결합될 수도 있다. CBD는 곤충의 키틴부분에 미생물을 결합시키는 기능을 하는데, 미생물에 의해 생산된 독소 또는 효소는 곤충해충의 죽음을 유도하게 된다. CBD-미생물 복합체는 곤충 해충에 의한 감염위험시에 또는 감염된 식물부분에 직접 적용하거나 또는 CBD-미생물 복합체는 감염된 부분 또는 곤충해충에 감염된 식물에 독이 된 먹이에 고정시킬 수도 있다. 또 다른 구체예에서 CBD-미생물 복합체는 나무를 죽이는 해충에 의한 감염을 방지하거나 조절하기 위해 나무 또는 셀룰로오스-기초한 생성물에 제공될 수 있다. 가령, CBD-미생물 복합체는 전화막대 또는 나무 또는 셀룰로오스 기초한 구성성분에 제공되고, 이때 CBD 성분은 침투성 해충에 단단히 결합되고 미생물 복합체는 해충을 효과적으로 조절할 수 있다.
본 발명의 또 다른 편은 독성 환경오염의 생물학적 치유 또는 분해에 유용한 곰팡이를 포함한 곰팡이에서 발견되는 키틴에 CBD가 결합할 수 있는 능력에 관계한다. 본 발명의 한 방식에 따르면, CBD 융합단백질은 제 2 성분이 환경오염을 분해하는 효소인 것에 사용된다. CBD-효소 융합단백질은 셀룰로오스 기질에 고정되고 효소적 분해에 의해 환경으로부터 오염물질을 제거하는데 사용된다. 가령, 수면 또는 수면아래에 장치를 두는 것이다. 또 다른 방식에 따르면 CBD는 살충제와 같은 환경 오염물질을 분해하는 등의 생치유에 유용한 효소를 분비하는 곰팡이에 결합된다. CBD-곰팡이 복합체는 셀룰로오스 기질에 고정시켜 벌채 또는 톱질 작용 도안에 남게되는 산물을 포함하는 나무와 같은 또는 DDT를 포함하는 살균제와 같은 환경오염물질을 효소적으로 분해하는 유용한 장치를 제공한다. 한 예에서는 CBD는 흰색 로트 곰팡이 가령, 파네로체이트 치로스포리움과 복합되어 리그닌 과산화효소, 망가네이즈 과산화효소를 생산하고 살충제 DTT를 분해한다. CBD-곰팡이 복합체는 환경으로부터 DTT 와 같은 살충제를 제거하기 위한 생치유에 유용하다.
여기서 사용한 "항체"는 다클론항체, 단클론항체(MAbs), 키메라 항체, 단일사슬항체, 항-이디오타입(항-Id) 항체와 전술한 에피토프-결합단편을 포함한다. 에피토프는 항원성분자의 항원결정부위를 의미한다.
IgG는 항체의 종류로 IgG는 모든 이뮤노글로블린의 80%를 나타내는 2개의 경사슬과 중사슬을 포함하는 사량체이다.
"감지가능한 라벨"은 효소, 방사능 라벨된 분자, 형광물질, 입자, 화학발광체, 효소기질 또는 공인자, 효소저해제, 자성입자를 포함하여 직간접적으로 신호를 제공하는 것을 의미한다. 본 발명의 감지가능한 라벨에 유용한 효소로는 알칼리 포스포타제와 말 양고추냉이 과산화효소이다. 다양한 방법이 소요의 단백질에 감지가능한 라벨을 결합시킬 수 있는데, 가령 소요의 단백질에 말 양고추냉이 과산화수소를 부착시키기 위해 4,4′-디플로로-3,3′-디니트로-페닐설폰과 같은 2가 기능물질을 이용하는 것이 포함된다. 부착된 효소는 감지가능한 반응혼합물을 만들기 위해 기질과 반응하게 된다.
본 발명의 범위에는 소요의 물질의 펨토그람양을 감지할 수 있도록 CBD 단백질로 구성된 감지가능한 라벨을 이용하는 신호증폭 시스템이다. 이 방법에서 제 1 단백질은 셀룰로오스-CBD 융합체 결합 복합체 형성에 적합한 조건하에 셀룰로오스 섬유와 배양되는 CBD 융합체의 일부이다. 과도하게 라벨된 CBD 즉 효소에 결합 또는 융합된 CBD는 과도한 라벨된 CBD의 결합을 허용하기 위해 적합한 조건하에서 셀룰로오스-CBD 융합체와 배양한다. 셀룰로오스-CBD 융합 생성물 결합 복합체에 과도한 라벨된 CBD의 결합은 소요 물질의 극소량 감지를 허용한다. 본 발명의 신호 증폭방식에서 적절한 셀룰로오스 섬유는 페블-밀된 셀룰로오스 섬유이다. 페블-밀된 셀룰로오스 섬유는 다양한 화학적 염료 또는 UV 조도시에 강력한 밝은 청색 형광을 생성하도록 셀룰로오스에 결합하는 칼코플로머와 혼합될 수도 있다.
본 발명의 범위에는 고형-상 중합효소 사슬반응(PCR)이 포함되는데 제 1 CBD 단백질은 셀룰로오스-CBD 융합 생성물 결합 복합체 형성을 위해 적당한 조건하에 셀룰로오스 섬유와 배양된 CBD 융합 생성물의 일부이며, 열적 증폭반응은 결합 복합체에서 일어난다.
또한, 본 발명의 범위에는 스트렙타아비딘/바이오틴 감지시스템의 이용도 포함된다. 바이오틴은 스트렙타아비딘에 강력하고 비가역적으로 결합한다. 본 발명의 이편에서 스트렙타아비딘에 융합된 CBD로 이루어진 CBD 융합 생성물이 제공된다. 뉴클레오티드 또는 단백질은 소요의 물질에 결합할 수 있는 바이오틴화된 키메라 프로브를 형성하기 위해, 본 기술에 숙지된 자에 의해 바이오틴화할 수 있다. 바이오틴화된 프로브는 소요의 물질과 배양시키고, CBD-스트렙타아비딘은 바이오틴화된 프로브와 배양시키고 감지 가능한 라벨은 바이오틴화된 프로브를 측정하고, 궁극적으로는 소요의 물질을 측정하는데 사용된다. 감지가능한 라벨은 상기 신호 증폭 방법에서의 것이거나 또는 형광체 혹은 화학적 착색일 수도 있다.
또한 본 발명의 영역에는 CBD 융합체의 요법적 또는 진단학적 이용이 포함되는데, 이때 CBD 융합 파트너는 단클론 항체이다. 가령, CBD 융합 생성물은 (ⅰ) 높은 친화력으로 그리고 자연적으로 결합되는 다른 단백질없이 셀룰로오스에 결합할 수 있는 CBD와 (ⅱ) 항원에 결합할 수 있는 단클론 항체로 구성된 CBD 융합체는 항원을 생산하는 암세포에 약물/셀룰로오스 복합체 또는 가상제/셀룰로오스 복합체를 표적시키는 방법에 사용될 수도 있다. 이 구체예에서 CBD-단클론 항체(또는 유사항체 단편, scFv 단편 또는 이의 항원- 결합부분) 융합체는 포유류에 투여할 수 있다. 동시에 또는 CBD 융합체의 투여후에 약물/셀룰로오스 또는 가상제/셀룰로오스 복합체가 투여된다. 항원 표적부위에 산재된 CBD-융합체에 약물/셀룰로오스 또는 가상제/셀룰로오스 복합체의 결합은 약물 또는 가상제가 관련부위에 소요의 치료요법적 또는 진단학적 활성을 나타내게 된다.
실시예 1: 셀룰로오스 결합도메인의 클로닝을 위한 실험과정
1.1. 재료와 방법
1.1.1. 박테리아 균주와 플라스미드
대장균 XL1 청색착색은 StrateGene(La Jolla, CA)이고, 이는 모든 클로닝 실험에서 사용되었다. 대장균 VL21(DE3)와 pET-8c는 상술한 바와 같다(Studier et al., J. Mol. Biol. 189:113-130 [1986]).
1.1.2. 물질
PC 완충액(pH 7)에는 50mM KH2PO4, 10mM Na 3C6H507(sodium citrate), and 1mM NaN3)을 포함한다. TEDG 완충액(Chang et al., J. Bacteriol. 172:3257-3263 [1990])에는 10mM 트리스, pH 7, 0.1mM EDTA, 0.1mM DTT와 5% v/v 글리세롤을 포함한다. 트리스가 pH 7에서 완충능이 낮기는 하나, 완충액은 수소이온을 생산하지도 사용하지도 않기 때문에 적합하다. 사용된 모든 다른 화학물질은 상업적으로 이용할 수 있는 최고의 순도이다. Avicel(R) PH101 (lot #1117)은 FMC Corp.(Philadelphia, PA)에서 구입했다. 흡수편은 Seamless Rubber Co.(New Haven, CT)에서 구입했다. 게껍질의 키틴은 Sigma에서 구입했다. 다른 모든 결합물질은 Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.에서 구입했다. 각 폴리사카라이드는 사용하기 전에 PC 완충액으로 2회 세척한다. 폴리사카라이드의 양은 nigeran, Cellulon(R), and cotton을 제외하고는, 제조업자에서 공급하는 건조중량을 의미한다. 이들 세 개 물질은 검사에 방해가 되는 큰 입자크기를 가진다. 니게르란은 온수에서 용해하고, 여과후 얼음에서 냉각시켜 재결정화한다. Cellulon(R)과 면섬유의 크기는 5분간 Gifford-Wood mini-mill로 공정하여 감소시킨다.
1.1.3. CBD의 클로닝
가상 CBD에 인접한 cbpA(cbpA 잔기 28-189)(Shoseyov et al., PANS USA 89:3483-3487 [1992])의 부분에 상보적인 DNA 프라이머는 Gene Assembler Plus (Pharmicia)에 의해 합성될 수 있다. 전방 프라이머는 pET-8c 벡터 클로닝 부위에 클론될 때, 해독시작 코돈으로 작용하기 위해 유전자 단편과 ATG 인-프레임과 NcoI 제한 효소부위(인지서열: CCATGG)를 포함한다. 역 프라이머에는 종료코드와 BamHI 부위를 포함한다. PCR은 각 프라이머 20pmol, 200uM dNTP와 주형으로 1ng cbpA DNA[벡터 PGEMEX-1(Promega)내로 클론된]것을 이용하여 총 100㎍ 용적으로 실행한다. Taq 중합효소는 제조업자에 의해 추천한 완충 조건을 이용한다. PCR은 전술한 것과 같이 40회 실시한다(Innis et al., Optimization of PCRs In: PCR Protocols Ed. Innis et al., Pub. Academic Press, San Diego, pp. 3-12 [1990]). PCR 생성물은 페놀/클로로포름 추출후에 에탄올 침전 그리고 70% 에탄올로 세척하고, 그 다음 진공하에 건조하여 정제하고 27㎕ 증류수에 재현탁시킨다. DNA는 NcoI과 BamHI 절단하고 TBE 완충액에 2.5% 저용융점 아가로스(Nuseieve GTG, FMC)(Sambrook et al. (1989) Electrophoresis buffers in Molecular Cloning(Nolan, C. ed.)에서 실시한다. 에티디움 브로마이드에 의해 착색된 DNA 띠는 저-파장 UV에 의해 확인하고 겔에서 절단해낸다. 벡터, 플라스미드 pET-8c는 1㎍ pET-8c DNA를 NcoI/BamHI으로 절단하고, 겔에서 직선화된 DNA 띠를 절단하여 준비한다. 벡터와 삽입 DNA는 100 ng 벡터와 300 ng 삽입제를 이용하여 Takara Ligation kit로 연결한다. 연결된 플라스미드는 컴피턴트 대장균 XL1-블루 착색을 형질전환시키는데 사용하고, 이는 100 ㎍/㎖ 암피실린과 12.5 ㎍/㎖ 테트라사이클린을 포함하는 LB플레이트(Sambrook et al. (1989) Bacterial Media in Molecular Cloning (Nolan, C. ed.), Cold Spring harbor Laboratory Press, NY, pp. A. 1-4.)에서 도말한다. 37℃에서 24시간 배양후에 콜로니를 선별하고, 암피실린과 테트라사이클린이 있는 액체 LB 배지에서 성장시킨다. 각 배양물에서 플라스미드 DNA는 (Sambrook et al. (1989) in Molecular Cloning (Nolan, C. ed.), Cold Spring harbor Laboratory Press, NY) 전술한 것과 같이 구하고 제한효소로 절단하고 유전자 단편의 삽입을 증명한다. 삽입서열은 Shoseyov et al. (1992) PNAS USA 89:3483-3487에서 보고된 동일 과정을 이용하여 DNA 서열에 의해 확인한다.
1.1.4. CBD의 발현
과발현벡터(pET-CBD)는 대장균 BL21(DE3)에 17 kDa CBD를 과생산하게 한다. CBD는 항체에 적으로 70 ㎎/L로 누적된다. 그러나 수용성-CBD 20 ㎎/L의 추가양이 대장균의 수용성 추출물에서 회수될 수 있다. 맑아진 추출물은 (Sigmacell 20) 셀룰로오스와 혼합하고; CBD-셀룰로오스 복합체는 1M NaCl 용액을 세척하고, 그 다음 증류수로 세척하여 비-특이적 단백질을 제거하고, 순수 셀룰로오스는 6M 구아니딘-HCl로 용출된다. CBD는 실온에서 서서히 투석에 의해 완전히 재생되고, 여기에는 셀룰로오스에 결합할 수 있는 능력을 보유한다(도면 10, 라인 2).
실시예 2: CBD 단백질의 정제
2.1. CBD 단백질의 준비
2.1.1. CBD 단백질의 정제
삽입체를 포함하는 플라스미드 DNA는 대장균 BL21(DE3)을 형질전환시키는데사용된다. 플라스미드-포함 배양물은 암피실린(100 ug/㎖)을 포함하는 배지 NZCYM(Sambrook et al. (1989) in Molecular Cloning (Nolan, C. ed.)에서 37 ℃에서 성장시킨다. 이 점에서 IPIG는 최종농도가 1mM 이 되도록 첨가한다. 4h 후, 세포는 원심분리에 의해 수득하고, 10 ug/㎖ RNAse 와 DNAse I 1ug/㎖을 포함하는 50mM 포스페이트/12mM 시트레이트를 pH 7(PC) 완충액에서 재현탁시키고, 45초간 최대 출력에서 Biosonic Ⅱ Sonicator로 얼음에서 초음파 분리에 의해 분해되고, 15초 가냉각후 총과정을 4회 반복한다. 1L 세포 배양물의 비가용성 부분은 원심분리(30분, 12,000 g, 4℃)에서 수득하고, 20 ㎖ 6M 구아니딘 HCl에서 재현탁시킨다. 간헐적인 교반과 함께 30분간 얼음에서 유지시키고 펠렛을 파괴한다. 비가용성 찌꺼기는 원심분리에 의해 제거한다(12,000 g 30분, 4℃). 가용성 구아니딘 HCl 추출물은 4 ℃ 2시간동안 TEDG 재생 완충액으로 총 400 ㎖ 용적으로 점진적으로 희석한다. 암모니움 설페이트는 80% 포화되게 첨가한다. 4 ℃ 4 시간후에 침전된 단백질은 원심분리(30분 12,000, 4℃)에 의해 수득하고, 40 ㎖ PC 완충액에서 재현탁시키고 PC 완충액에 대해 투석시킨다.
cbpA의 CBD 단백질 단편의 추가 정제는 셀룰로오스에 친화성 크로마토그래피에 의해 실행한다: 3회 추가 1.0 g Av-pH 1인 미세결정 셀룰로오스는 용액에서 CBD 단백질을 제거하는데 사용된다. 각 첨가부분에 현탁액은 균등하게 한다(실온에서 1시간 동안 서서히 교반). 셀룰로오스는 원심분리에 의해 수득하고 다음 첨가전에 제거한다. 3 g 셀룰로오스는 1M NaCl/PC 완충액으로 1회 세척하고 PC 완충액으로 2회 세척한다. 정제된 CBD는 10 ㎖ 6M 요소로 3회 세척에 의해 셀룰로오스로부터용출한다. 요소부분은 모으고 PC 완충액에 대해 투석한다(실온 4℃). 최종 정제된 단백질 농도는 MicroBCA 단백질 검사키트(Pierce, Rockford, IL), BSA를 이용하여 발색방법에 의해 분석된다.
2.1.2. CBD-셀룰로오스 해리 상수결정과 셀룰로오스 결합능
CBD 단백질 샘플(일반적으로 0 내지 100 ㎍)을 1 ㎎/㎖ BSA와 소요의 셀룰로오스(일반적으로 PC 완충액에 1㎎/㎖ BSA와 10 ㎎/㎖ 셀룰로오스를 포함하는 원액 슬러리에 1 ㎎이 첨가됨)가 보충된 PC 완충액을 포함하는 1.5 ㎖ 용량 마이크로퓨즈 튜브에 첨가한다. 강력한 경쟁자 즉 셀로비오즈(4 ㎎/㎖) 또는 카르복시메틸 셀룰로오스(CMC, 4 ㎎/㎖)를 PC/BSA 완충액에 20 ㎎/㎖ 원액 200 ㎕을 첨가하여 포함한다. 최종용적은 항상 1 ㎖이다. 다른 말이 없는 한, 완충액의 pH는 7.0 이다. 다른 pH 값에서 실험하는 경우 PC/BSA 완충액은 농축 HCl 또는 NaCl를 첨가함으로써 조정한다.
검사튜브는 1 시간동안 37 ℃에서 서서히 수직회전(20RPM)에 의해 혼합된다. 샘플은 1 분간 마이크로퓨즈에서 회전시켜 셀룰로오스와 셀룰로오스-단백질 복합체를 침전시킨다. 완충액 제거후에, 펠렛은 PC 완충액 1 ㎖에서 재현탁시켜 세척한다. 세척액은 원심분리에 의해 분리하고 버린다. 펠렛은 최종 1 ㎖ PC 완충액으로 재현탁시킨다(원심분리 단계는 [C]와 [PC]가 동일수준으로 농축되기 때문에 균형을 깨뜨리지 않도록 한다).
검사튜브에서 고유 BSA(1 ㎎/㎖)중 단지 0.1 ㎍만이 세척후 남아있게 되고, 이는 펠렛 10 ㎕의 액상용적에 비-특이적 흡착이 없다는 것을 의미한다. 이와 같이 잔류 BSA로 인한 임의의 색발생은 0 CBD 콘트롤 튜브에서 계산된다. 잘 혼합된 현탁액 150 ㎕를 취하여 MicroBCA 키트에서 단백질을 결정한다. 제조업자의 지시에 따르고, 단 샘플용적은 PC 완충액과 0.5 ㎖이 되게 하고 0.5 ㎖ BCA 작용시약을 첨가한다. 검사혼합물은 30 분간 60 ℃에서 배양시킨다. 단백질 농도는 Shimadzu 160 U 분광광도계에서 562㎚에 맑은 상층액으로부터의 발색정도를 결정한다. CBD 단백질의 첨가가 없는 검사튜브는 셀룰로오스와 잔류 BSA에 의한 소량의 발색을 보정하는데 이용된다. 데이터는 BSA 표준과 비교하고, 각 샘플에서 셀룰로오스에 결합된 단백질 량을 결정하기 위해 만든 희석액을 상응하게 조정한다. 실제 감지한계는 0.2 ㎍/㎖ 이다. 희석액 보정후에 이는 검사튜브에 셀룰로오스에 결합된 약 0.034 nmol에 상응한다. 자유 CBD 단백질 농도 [P]1은 튜브에 첨가된 총 CBD [P]에서 결합 단백질 농도 [PC]를 빼서 결정한다.
[P] = [P]t- [PC] (1)
시스템은 단순한 상호 균형 작용으로 추정하여 분석하였다(Segel, 1975);
(2)
이때 해리상수 Kd는 다음과 같이 정의된다 :
(3)
데이터는 W와 셀룰로오스의 상이한 고정수준에서 1/[PC] 대 1[P] 의 이중 상호 플롯에 의해 분석하고 ;
(4)
그리고 [PC]/[P] 대 [PC]의 스케차트 플롯에 의해 분석한다.
(5)
셀룰로오스는 가용성 성분이 아니고, [C]는 단위용적당 완충액에 노출된 셀룰로오스 표면에 결합부위 농도를 나타낸다. 유사하게, [PC]는 단위 용적당 결합부위-단백질 복합체의 농도를 나타낸다. 직선은 DeltaGraphProfessional plotting application (Deltapoint, Inc., Monterey, CA)을 이용하여 least-squares 방법에 의해 지정된다. 각 점은 동일 결합검사 튜브에서 세 개 독립 단백질 검사의 평균이다. 셀룰로오스의 적어도 2개의 상이한 양이 Kd와 PCmax/g 셀룰로오스를 결정하는데 사용된다. 이 값은 도면 9, 표 1 에 나열된 값을 제공하기 위해 평균한다.
실험은 셀룰로오스에 CBD 결합시에 온도효과를 결정하기 위해 실행한다. 200 ㎕ CBD(40 ㎍)을 300 ㎕ 50 mMPC 완충액 pH 6, 1M NaCl(최종 농도)와 1 ㎎ 셀룰로오스에 첨가한다. 몇 가지 상이한 CBD/셀룰로오스 혼합물을 간헐적으로 혼합하면서 1시간동안 상이한 온도에서(16-60℃) 배양시킨 다음 100,000g에서 5분간 원심분리시킨다. 펠렛은 1 M NaCl을 포함하는 PC 완충액 pH 6으로 2회 세척한다. 40 ㎕ 6M 구아니딘-HCl은 실온에서 현탁되고 배양된 펠렛에 첨가한다. 원심분리후20 ㎕ 샘플은 780 ㎕ ddH20으로 희석하고 Bio Rad 키트를 사용하여 단백질 농도를 결정한다.
2.1.3. 다른 폴리사카라이드에 결합의 결정
CBD 단백질에 다른 것도 기질이 되는지를 결정하기 위해 실란, 니게란, 세파덱스(R) G-75와 키탄을 검사에 사용하였다. 모든 경우에, 사용된 방법은 셀룰로오스에 결합을 결정하기 위해 사용된 것과 동일하다. 키틴이 MicroBCA 검사에 매우 높은 배경치를 나타내고, 이는 60℃ 배양시간에 비례하여 증가하고, 색발생 시간은 15분으로 감소된다. 키틴의 높은 배경 때문에 단지 두 개의 상이한 단백질 농도가 이용되었다.
2.2. 결과
2.2.1. 결합분석을 위한 CBD 정제
cbpA의 CBD 부위(잔기 28-189)를 선택적으로 생산하기 위해 올리고 뉴클레오티드 프라이머는 cbpA의 67-86 과 558-579 염기에 상보적이 되도록 고안한다(도면 1). 도면 2에서 본 바와 같이, 이들 프라이머는 PCR 생성물의 한 단부에 NcoI 부위와 ATG 개시코돈 그리고 다른 단부에는 BamHI 부위에 이어 ATG 정지 코돈이 생성될 수 있도록 잘못된 쌍(mismatches)을 이루게 고안된다. 이와 같은 유전자 단편은 T7 DNA 중합효소 발현 플라스미드인 pET-8c내에 클론되고, 이는 플라스미드 pET-CBD가 된다(Studier, F., and B.A. Moffatt (1986) J. Mol. Biol. 189:113-130). 클론된 유전자 단편은 CBD 의 N-단부에서 메티오닌을 코드하나, CBD의 나머지는 cbpA의 28 내지 189 잔기에 상응한다. 단백질 단편은 약 17634의 분자량을가진다. 삽입은 DNA 서열화에 의해 증명된다. CBD 단백질은 대장균 BL21(DE3) 세포에 있는 pET-CBD 에 의해 생성된다. IPTG의 첨가후에 이와 같은 숙주균주는 pET 벡터에서 T7 프로모터를 인지하는 T7 RNA 중합효소를 생산한다. cbd 유전자 단편은 이와 같은 유도성 프로모터하에 있고, CBD 단백질은 유도후에 대량으로 합성된다(도면 3). 4시간 생산공정 후에, 용해된 세포로부터의 가용성 추출물에는 극소량의 CBD 단백질을 포함하고, 대부분의 CBD 단백질은 비가용성 부분에서 발견된다. 이 단백질은 농축된 구아니딘 하이드로클로라이드에 즉시 용해되고 TEDG 완충액에 서서히 희석에 의해 재생된다. 이와 같은 방식으로 준비된 단백질은 Avicel(R)에 결합되어 CBD를 입증한다. 이와 같은 부분이 대부분 CBD 단백질이라 하더라도 상술한 검사는 매우 고순도의 단백질을 요구한다. 이와 같은 순도는 7.1.1.에서 상술한 단일 셀룰로오스-친화력 결합단계에 의해 제공된다. 친화력-정제된 CBD 단백질은 코마시 브릴리언트 블루로 착색하였을 때, 단일띠로 아크릴아미드겔에서 나타낸다. 약 70 ㎎ CBD 단백질은 1L 배양물에서 수득한 세포로부터 회수된 것이다.
2.2.2. 셀룰로오스에 CBD 의 결합의 시간별 과정과 온도의 효과
CBD와 Avicel(R) 의 상호작용의 시간별 과정(도면 4)은 공정에 몇 가지 특징을 가진다.
(a) Avicel(R) 1.0 ㎎/㎖와 2.0 uM CBD([P].)의 초기농도에서 1.2 uM 복합체[PC]의 교평부 값이 60분간 도달할 수 있다. 별도의 실험에서 셀룰로오스 샘플의 최대 CBD 결합능력은 2.1 umoles x g(-1)이고, 이는 총 2.1 uM 셀룰로오스 부위([C]0)의 효과농도에 상응한다. 균형이 이루어지면 [P][C]/[PC]로 정의된 Kd는 약 0.6 uM이다.
(b) 가역적 Bi Uni 반응(Capellos & Bielski, 1980; Wilkinson, 1980)을 위한 적분 속도식에서 계산된 합체(K1)의 2차 속도 상수는 약 2.7 ×10(4) M(-1) × min(-1)(5-60분간 점들의 평균치)이다. k(1)Kd로 계산된 복합체의 해리속도 상수(k-1)은 1.6×10(-2)×min(-1)(t1/2=43분)이다. 복합체 해리의 상대적으로 긴 t1/2은 결합된 CBD의 별다른 손실없이 한번에 C+PC 펠렛 세척하는 것을 허용한다(초기펠렛의 재현탁과 재원심분리는 1분 이내 완료하고, 이 기간동안에 결합된 CBD는 3% 미만으로 손실된다). 상당기간 배양후에 측정된 [PC]는 감소하고, 이는 18시간 후에 최대치의 약 50% 수준으로 떨어진다. 이와 같은 감소는 단백질의 점진적인 변성에 의한 것이다. 이 효과로부터 인공적인 것을 감소시키기 위해 "균형"이 "종료"된 가장 짧은 배양시간을 이용한다(60분간 초과한 결합의 증가는 실험에러로 관찰된다). 셀룰로오스에 CBD 결합은 4.5+/-0.5 ㎎/gr 셀룰로오스이고 16-60 ℃의 온도범위에서는 영향을 받지 않는다.
2.2.3. CBD-셀룰로오스 결합 친화성과 결합능의 분석
도면 5에서는 Avicel(R) 미세결합 셀룰로오스에 순수 CBD의 결합의 일반적인 진단성 플롯을 나타낸다. 실험 오차범위내에서 플롯은 Avicel(R) gram 당 결합된 2.1umole [PC]max와 약 0.6 uM Kd를 생산한다. 후자값은 Avicel(R) g 당 CBD 단백질 약 37 ㎎에 상응한다. 진단성 플롯의 직선은 CBD-셀룰로오스 상호작용이 단지 한 형태로 발생함을 제시한다.
Avicel(R) 이외의 셀룰로오스형에도 CBD가 결합할 수 있는지에 대해서도 조사하였다. 도면 9 표 1에서는 각 기질에서 발견된 Kd와 PCmax의 값을 나타낸다. Sigmacell 20와 50은 셀룰로오스의 미세결정형이다. 이들 물질은 CBD에 역시 결합한다. 흡수면과 Cellulon(R) 섬유(아세토박터 실리늄에서의 결정형 셀룰오스)와 같은 큰 결정형도 더 많은 CBD(기질 g 당 최고 6.4 umol CBD)에 결합할 수 있다. 그러나, 고유 결정형이 적게 포함된 섬유와 마이크로 입자 셀룰로오스는 소량의 CBD의 결합함을 볼 수 있다. CBD-셀룰로오스 해리상수는 모든 셀룰로오스형에서 거의 동일했고, PCmax는 30배 범위에서 다양하였다.
2.2.4. 결합부위 경쟁
CBD 단백질에 대해 가용성 탄수화물이 Avicel(R)와 경쟁하는지를 결정하기 위해 셀로비오즈(β-1,4 결합 포도당 이량체)와 CMC(셀룰로오스의 가요성 유도체)를 Avicel(R) 무게/용적이 4배인 일부 검사에 포함시킨다(1 ㎎Avicel(R), ㎖당 4 ㎎ 셀로비오즈 또는 CMC). 도면 9 표 1에서 Kd 또는 PCmax에 상당한 차이가 없는 것으로 나타났고, 이는 가용성 탄수화물이 Avicel(R)에 대한 CBD 결합에 영향을 끼치지 않음을 나타낸다.
2.2.5. 해리상수에서 pH 의 효과
C. 셀룰로보란은 pH 7에서만 번성하는 호중구 유기체로써(Sleat et al., 1984)이 pH는 대부분의 결합검사에 사용된다. 그러나 다른 실험에서는 Kd와 PCmax가 pH 5.0-8.0에서 상당한 변화가 없음을 나타내었다. 또한, pH 3.5의 산성 PC 완충액 또는 pH 9.5의 염기성 완충액은 1-분 세척동안 Avicel(R)에서 CBD를 제거하지 못한 것으로 나타났다.
2.2.6. 다른 폴리사카라이드에 CBD 의 결합
실란, 세파덱스(R) G-75, 니게란, 키틴은 CBD의 결합 특이성을 밝히는데 사용되었다. 이들 중 키틴만이 CBD 펩티드의 측정가능한 결합을 나타낸다. 도면 9, 표 1 키틴-CBD Kd와 결합능은 Avicel(R) CBD 값과 유사하였다.
2.3. 결과
우리 결과는 cbpA는 셀룰로오스 결합을 위한 도메인을 포함하고, 이 도메인은 cbpA의 나머지와는 독립적인 기능을 하는 것이다. 정제과정은 변성과 재생단계를 이용하기 때문에 정제된 단백질이 기능을 가지고, 이는 CBD 단백질 서열이 단백질 단편의 적절한 꼬임에 충분하다는 것을 나타낸다.
우리는 균형 결합실험을 시행하는데 검사튜브에 CBD의 비특이적 결합이 문제가 됨을 발견하여 검사는 CBD와 셀룰로오스가 초과 BSA 존재하에 평형시키는 것으로 개발하였다. BSA는 튜브와 CBD간의 비특이적 상호작용을 효과적으로 제거하였다. 평형에 도달 후에 셀룰로오스와 셀룰로오스-단백질 복합체를 수득하고 세척하고 결합된 단백질에 대해 검사하였다. 먼저 상술한 것과 같이 CBD-셀룰로오스 해리는 매우 서서히 일어나고 신속한 세척단계동안에 감지가능한 양이 제거되지 않게 하기 위함이다.
결합된 CBD는 단백질검사에 의해 직접적으로 측정되고 자유 CBD는 7.1.2.의 식 1에서 볼 수 있는 것과 같이 총 CBD에서 결합된 CBD를 감하여 계산된다. 이 방법은 셀룰로오스에 낮은 친화력으로 비-특이적으로 흡수된 CBD 분자는 세척단계에 의해 제거되는 장점이 있고, 이는 CBD 와 셀룰로오스 표면사이에 특이적이고 높은친화력의 상호작용을 좀더 정확하게 반영하는 데이터가 된다. 도면 5에서 볼 수 있는 것과 같이 이와 같은 형태의 검사를 이용하여 모인 데이터는 직선 진단성 플롯이 된다. 이중 상호 플롯은 결합 친화력을 결정하는 통상적 방식이고 가역적 Bi uni 시스템에 대한 능력의 결정하는 통상의 방식이다. 검사의 유효소는 PCmax가 사용된 셀룰로오스의 양에 직선적으로 증가하고 Kd는 셀룰로오스 양에 독립적인 것으로 보아 지지받을 수 있다. 표 1, 도면 9에서는 몇 가지 셀룰로오스형과 다른 탄수화물에서 얻은 결과를 나타낸다. 결과에서는 "결정"으로 상술한 셀룰로오스형은 결정성이 거의 손상된 매우 진행된 셀룰로오스보다 상당히 큰 CBD 결합능력을 가진다. 셀룰로오스 샘플의 PCmax은 상이한 셀룰로오스형과 상당히 다양하고 Kd는 상수로 남아있는 사실로 미루어보아, CBD와 셀룰로오스 사이에 발생할 수 있는 단백질-셀룰로오스의 강한 상호작용의 하나임을 나타낸다. 상당한 공정을 거친 셀룰로오스의 낮은 PCmax는 샘플에 강력한 단백질 상호작용부위의 수가 더 적음을 반하고, 이는 샘플의 결정능과 상관관계가 있는 것으로 보인다. 이 결과는 이론으로 한정되지는 않지만 결정형 셀룰로오스가 가진 부정형에는 다소 부족한 일부 특정 성질이 결합기질로써 수용할 수가 있는 것이다.
CBD의 기질 특이성을 더 구체적으로 특징화하기 위해 우리는 셀룰로오스 결합에 가용성 기질의 첨가(셀룰로오스 또는 CMC)효과를 측정하였다. 과도한 셀로비오즈 또는 CMC는 표 1, 도면 9에서 볼 수 있는 것과 같이 CBD-Avicel(R) Kd 또는 PCmax에 효과가 없었다. 경쟁성 부족은 CBD 인지부위가 단순 반복 포도당 또는 셀로비오즈보다는 다소 복잡한 특이성이 있음을 나타낸다. 또한 셀룰로오스의 특정3-차 배열이 필요한 것으로 보인다.
결정형 셀룰로오스에 대한 CBD의 특이성은 키틴, N-아세틸 글루코사민, β-1,4 복합체에 매우 단단하게 결합하는 것으로 알려진 키티나제를 고무시킨다. 셀룰로오스와 같이 분리에 사용된 정제방법과 원료에 따라(Cabib (1988) Methods Enzymol. 161:460-462; Blackwell (1988) Methods Enzymol. 161:435-442) 다양한 형이 되게한다. 키티나제의 친화성 정제에 대해 사용된 키틴은 α-키틴이고 사슬은 반-평행 방식으로 배열되어 있다. 이와 같은 키틴형은 고유 결정형 셀룰로오스와 유사한 구조의 결정이다(셀룰로오스 Ⅰ 참고). 셀룰로오스 Ⅰ은 셀룰로오스 사슬이 평행한 뭉치로써 배열되고, 이는 반-평행방식으로 배열된 셀룰로오스 Ⅱ와는 상반되는데, 거친 조건하에 셀룰로오스Ⅰ의 공정은 파괴되어 셀룰로오스 Ⅱ로 되게 한다. 분리된 CBD가 공정이 덜된 셀룰로오스 즉, 큰 셀룰로오스Ⅰ에 결합하기 때문에 CBD가 비록 반대방향이지만 유사한 결정구조를 가지는 α-키틴에 결합할 수 있는지에 관심을 가졌다. 놀랍게도 CBD는 셀룰로오스와 매우 유사한 Kd를 가지는 키틴을 결합기질로 받아들이지 않았다. 실란(β-1,4 실로즈), 니게란(α-1,4 와 α-1,3 글루코스 반복)과 세파덱스(R) G-75(α-1,6 글루코즈와 α-1,3 브랜치) (Coutinho et al. (1992) Mol. Microbiol. 6:1243-1252) 또한 검사하였으나, CBD는 검사조건하에 이들 중 어느것에도 감지가능한 정도의 결합을 나타내지는 않았다. 키틴이 결정형으로 이들 중 유일한 것이기 때문에, 이는 기질의 결정성의 중요성을 설명하는 것이라 본다.
이는 기질에 단단히 결합을 하는데 유익한 특정부분은 있으나 최근연구(Dinet al. 1991) Bio/Techonol. 9:1096-1099)에서 분리된 비-효소적 CBD가 셀룰로오스에 결합은 비-가수분해적 방식으로 셀룰로오스 섬유를 파괴하는 원인으로 나타났다. 단백질-셀룰로오스 결합은 결정의 표면부근에 사슬간 수소결합 정도를 낮추고, 이는 이들 셀룰로오스 사슬의 상당한 가수분해가 이루어진다. 최종적으로 결정성이 감소한다. "무정형과정"이라 칭하는 공정은 엔도-β-1,4-글루카나제에 더많은 셀룰로오스 섬유를 접근하게 하는 것이다. 이미 발견한 바와 같이 CBD는 무정형 효과를 나타내지는 않는다.
2.4. 아스퍼질러스 나이져, 스포도프테라 리토랄리스와
헬리토이스 아르미게라에 CBD 결합
아스퍼질러스 나이져 마이셀리아(약 20 ㎎)은 20mM 트리스-HCl pH 7 에 400 ㎕ CBD(120 ㎍)로 실온에서 1시간동안 배양하였다. 마이셀은 동일 완충액으로 2회 세척하고 펠렛은 β-ME와 SDS를 포함하는 SDS-PAGE 샘플 완충액으로 재현탁시킨다. 혼합물은 5분간 끓이고, 단백질은 SDS-PAGE로 분석하였다. 도면 16은 아스퍼질러스 나이져의 마이셀에 대한 CBD 결합을 보여준다.
스포도프테라 리토랄리스와 해리오티드 아르미게라(농업에서의 주요 해충 병원충)의 중장막을 현미경을 사용하여 분리하였다. 약 20 ㎎을 20mM 트리스-HCl pH 7에 400 ㎕ CBD(120 ㎍)로 실온에서 1시간동안 배양하였다. 키틴 포함막은 동일완충액으로 2회 세척하고, 그 다음 펠렛은 B-ME와 SDS를 포함하는 SDS-PAGE 샘플 완충액으로 재현탁시켰다. 혼합물은 4분간 끓이고 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 결과는 도면 17와 18에 나타낸다. 결과는 스포도프테라 리토랄리스와 헬리오티스 아르미게라의 중장막에 CBD가 결합함을 나타낸다.
실시예 3. 대장균에서 CBD-단백질 A 유전자의 이의 발현
3.1. 재료와 방법
3.1.1. 효소와 화학물질
화학물질은 다른 말이 없는 한 Sigma Chemicals Inc.에서 구입하였다. 제한효소는 New England Biolabs, Inc.에서 구입하였다. Taq 중합효소는 Promega, Inc.에서 구입하였다.
3.1.2. 플라스미드와 박테리아
cbpA를 가지는 플라스미드 pCB1(Shoseyov et al. 1992)는 PCR 방법에 의해 cbd를 증폭시키는데 사용한다. 발현벡터 pRIT2(Nilsson, et al(1985) EMBO J. 4(4):1075-1080)은 융합유전자의 구조를 만드는데 이용된다. 초기 형질전환체는 대장균 균주 XL1-블루(Strategene)를 사용하여 실행한다. CBD-ProtA의 발현은 균주 2097을 포함하는 온도 민감성 억제물질에서 실행한다. 또한 대장균 N4830-1은 온도-민감성 억제물질 ci857을 가지고, 이는 대장균 균주 2097과 등가체이다. 대장균 균주 N4830-1은 Pharmacia, Inc.에서 이용할 수 있다.
3.1.3. CBD-ProtA 의 클로닝
CBD는 주형으로써 cbpA 유전자를 사용하여 PCR 증폭된다. 프라이머 A(N-단부 프라이머; 5′-GGGGGAATTCCATGGCAGCGACAT-′3)는 EcoRI 부위를 가지고 프라이머 B는 (C-단부 프라이머; ′5-GGGGGGATCCTATGGTGCT-′3)BamHI 부위에 이어 종료 코돈을 가진다. 프라이머는 단백질 A 유전자의 C-단부에 융합된 플라스미드 pRIT2 "인프레임"내로 EcoRI/BamHI 500 bp DNA 단편이 클로닝될 수 있도록 고안되고 합성된다. PCR 조건은 Innis and Gelfand(1990)에서 상술하고, 이때 2 ㎎ 주형 DNA(cbpA)와 1 ㎎ MgCl2를 반응 혼합물에 사용하는 것과 같이 수정을 하였다. 반응은 프로그램가능한 열적 콘트롤러(M&J Research Inc.)를 사용하여 실시하였다. 표준 DNA 조작은 Sambrook et al(1989) in Molecular Cloning(Nolan, C. ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY에 따라 실시한다. PCR 증폭된 생성물은 EcoRI과 BamHI으로 절단하고, QIAEX 겔 추출 키트(Qiagen Inc.)을 이용하여 1.5% 아가로즈겔로부터 약 500bp DNA 단편(도면 1)을 분리하였다. EcoRI/BamHI 단편은 T4 라이게이즈를 사용하여 EcoRI/BamHI 직선화된 pRIT2 로 연결한다. 연결혼합물은 XL1-블루 컴피턴트 세포를 형질전환시키는데 사용하고, 형질전환된 콜로니는 100 ㎎/L 암피실린이 포함된 LB 한천 플레이트에서 선택한다. DNA 삽입체를 포함하는 성공적인 구조는 pCBD-ProtA1 이라 한다.
3.1.4. CBD-ProtA 의 발현과 정제
융합단백질의 발현은 Nilsson, et al (1985) EMBO J. 4(4):1075-1080)에서와 같이 실행한다. 50 ㎎/L 암피실란을 포함하는 4 ㎎ LB에 pCBD-ProtA1을 포함하는 대장균 균주 2097의 24시간 배양물 400 ㎕에 접종하였다. 배양물은 30℃에서 100 Klett(녹색 필터)에 성장시키고, 이는 42℃로 옮겨 45분간 성장시키고 추가로 40℃에서 2시간 성장시킨다. 세포는 10분간 2000 g에서 원심분리에 의해 수득하고 20 mM 트리스-HCl 완충액 pH7 10 ㎖에서 재현탁시킨다. 세포는 1분간 최대 전력에서W-385 소니케이트(Heat Systems-Ultrasonic, Inc.)를 이용하여 용해하고 30초 냉각 기간후에 3회 반복한다. 용해물은 원심분리(4000 g × 10분)로 맑아지고 500 ㎎ 셀룰로오스 입자(Sigmacell 20, 20 미크론 평균 입자크기)를 첨가하였다. 현탁액은 RT에서 10분간 배양시키고 원심분리시킨다(2000 g 10분). 상층액은 제거하고 펠렛은 비-특이적 결합 단백질을 제거하기 위해, 5 ㎖ 1M NaCl 로 1회 세척하고 탈이온수 10 ㎖ 2회 세척한다. CBD-ProtA는 5 ㎖ 6M 구아니딘-HCl로 셀룰로오스로부터 제거한다. 원심분리(2,000 g 10분)후에 용액은 20 mM 트리스-HCl 완충액(pH 7)에 대해 투석시킨다. 단백질은 Laemmli 에 따라 12.5 % SDS-PAGE에서 분석하였다.
3.1.5. CBD-ProtA 의 결합분석
IgG에 CBD-ProtA의 결합은 다음과 같이 결정된다; PBS(pH 7.4)로 미리 세척한 토끼 IgG(H+L)-세파로스(8 ㎎/㎖, Bio-Makor, Inc)의 100 ㎕ 현탁액은 분리된 CBD-ProtA 1 ㎖(50 ㎍/㎖)과 혼합하였다. 혼합물은 8℃에서 1시간동안 배양시키고 원심분리(2,000 g 5분)시킨다. 상층액은 제거되고 펠렛은 PBS 500 ㎕로 2회 세척한다. 그 다음 CBD-ProtA는 1M 아세트산 200 ㎕로 용출시킨다. 펠렛은 15 ㎕ 샘플 응용 완충액(SAB: 125 mM 트리스-HCl pH 6.8, 4% SDS, 20% 글리세롤과 0.002% 브로모페놀 블루)와 혼합시키고, 상이한 부분의 15 ㎕ 샘플은 15 ㎕ SAB와 혼합하고 5분간 끓인후에 SDS-PAGE로 분석한다.
셀룰로오스에 CBD-ProtA 의 결합은 다음과 같다 : 20 ㎎ 셀룰로오스(Sigmacell 20)은 분리된 CBD-ProtA(50 ㎍/㎖) 200 ㎕와 혼합하였다. 혼합물은 RT에서 15분간 배양시키고 2,000 g에서 5분간 원심분리시킨다. 펠렛은200 ㎕ 1M 아세트산으로 세척하고 펠렛은 40 ㎕ SAB 로 재현탁시킨다. 셀룰로오스 현탁액은 15 ㎕ 아세트산 세척(15㎕ SAB 로 혼합)하는 동안 가열되고 SDS-PAGE에서 분석하였다.
3.1.6. 결과
CBD-ProtA는 대장균에서 발현시키고 1단계 정제과정에서 셀룰로오스를 이용하여 정제하였다. 융합단백질은 예상크기 45KDa(도면 8)을 가진다. CBD-ProtA는 셀룰로오스와 IgG 에 대해 친화력을 보유한다. 1M 아세트산은 CBD-ProtA:IgG 결합을 방출시키나 CBD-ProtA:셀룰로오스를 방출시키지는 않는다.
발현벡터를 사용하여 배양물 1L 당 6 ㎎ CBD-ProtA를 생산하였다. T7 과발현 시스템을 사용하면 순수 CBD양(도면 10)(70 ㎎/ℓ)보다 약 10배이상 생산이 가능하다.
실시예 4. CBD-HSP 융합단백질의 클로닝
CBD-HSP 융합단백질의 클로닝의 예로 HSP 유전자의 증폭을 위한 PCR 프라이머는 주형으로써 플라스미드 SJ60을 이용하여 준비한다. 벡터는 Jindal et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9:2279 에 의해 설명한다. 프라이머에는 HSP N 단부에 KpnI 부위를 C 단부에는 BamHI 부위와 정지 코돈을 포함한다.
전방 프라이머 : 5′-ACGGTACCACTTCGGTTACCCACAGTC-3′
역 프라이머 : 5′-GGGGATCCTACATGCCACCTCCCATTAG-3′
HSP의 N 단부부분에 CBD의 C-단부부분을 전사융합시키기 위해 cbd 유전자의 3′단부에 Kpn1 부위로 유입한다. 이와 같은 유입은 다음과 같은 프라이머를 사용하고 pET-CBD를 이용하여 PCR 증폭시킬 수 있다.
전방 프라이머 : 5′-GTATACCAGCCATGGCAGCG-3′
역 프라이머 : 5′-GTACATCTGGATCCTATGGTACCGT-3′
증폭된 DNA는 NcoI과 BamHI로 절단하고, NcoI/BamHI 절단된 pET8c 벡터에 연결한다. 연결혼합물은 XLI Blue로 형질전환시키는데 사용되고, 새로운 플라스미드는 pET-CBDIC로 칭한다. 이 플라스미드는 KpnI과 BamHI으로 절단하고, KpnI/BamHI 제한된 HSP-PCR 증폭된 단편은 연결하고, 형질이 XLI Blue로 전환된 것은 CBD-HSP의 과생산을 위해 BL21(DE3)를 형질전환하는데 사용된다.
실시예 5. NH2-VH-VL-CBD-CO2 구조
재조합 항체에 융합된 CBD는 "재조합 상 항체시스템"(Pharmacia Inc.)을 이용하여 소요의 VH-VL 의 클로닝하여 실행할 수 있다. VH-VL을 가지는 생성 pCANTAB5 플라스미드는 다음과 같은 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 위한 주형으로 사용된다.
전방 프라이머 : 5′-AGCCATGGCGGCCCAGC-3′
역 프라이머 : 5′-GGGGTACCAACAGTTTGTGCGGCC-3′
이들 프라이머는 VH-VL의 5′에 NcoI 부위와 3′단부에 KpnI 부위를 유입한다. 증폭된 단편은 NcoI와 KpnI으로 절단하고, (필요할 경우) 하기의 CBD의 C-단부 융합 발현 벡터에 사용될 수 있다.
VH-VL의 C 단부에 CBD의 N-단부를 해독적 융합시키기 위해 cbd 유전자의 3′단부에 KpnI 부위를 도입시킨다. 이와 같은 도입은 주형으로써 pET-CBD를 이용하고 하기와 같은 프라이머를 이용하여 cbd의 PCR 증폭에 의해 이루어진다.
전방 프라이머 : 5′-GGGCCATGGCAGGTACCTCATCA-3′
역 프라이머 : 5′-GTACATCTGGATCCTATGGTGCTGT-3′
이들 프라이머들은 NcoI 부위후에 cbd 유전자의 5′단부에 KpnI 부위를 유입시키고 3′단부에서 BamHI 부위 다음에 종료 코돈을 유지한다. 증폭된 DNA는 NcoI와 BamHI으로 전달시키고, NcoI/BamHI 절단한 pETSc 벡터내로 연결시킨다. 연결 혼합물은 XLI Blue로 형질전환하는데 사용되고, 새로운 플라스미드는 pET-KCBD로 칭한다. 이 플라스미드는 NcoI와 KpnI으로 절단하고 NcoI/KpnI 제한된 VH-VL 증폭된 단편을 연결하고; SL1 Blue로 형질전환시키고 구조확인후에 VH-VL-CBD 융합단백질의 과생산에 BL21(DE3)을 사용한다.
전술한 것과 이미 공지된 것에 따른 관점에서 본 기술에 숙지된 자는 다양한 CBD 융합 생성물을 공지 서열의 제 2 단백질과 CBD로 구성된 것으로 준비한다.
실시예 6. CBD-ProtA 셀룰로오스에 의해 IgG 정제
이 실시예는 IgG의 정제를 위해 CBD의 이용을 설명한다. 사람 혈청(500 ㎕, 1:10으로 희석(PBS), pH 7.4)은 CBD-ProtA-셀룰로오스 현탁액 20 ㎎에 첨가하였다(4 ㎍/㎎). 혼합물은 8 ℃에서 1시간동안 배양시키고 그 다음 결합안된 단백질은 신속한 원심분리에 의해 제거하고 2회 500 ㎕ PBS 로 세척한다. IgG는 200 ㎕ 1M 아세트산 세척(15분간 실온)에 의해 회수되고, CBD-ProtA는 셀룰로오스에 결합되어 있다.
실시예 7. CBD의 특징화
이 실시예는 CBD가 셀룰로오스를 파괴하지 않음을 설명하는 것이다. CBD는 셀룰로오스 파괴/무정형 활성을 가지지 않는다. 약 1 ㎎ CBD는 37 ℃에서 두 개의 상이한 형의 셀룰로오스(면과 Cellulon(R)) 10 ㎎과 20mM 트리스-HCl 완충액 pH 7에서 24시간 배양시켰다. 셀룰로오스 샘플은 금으로 코팅되고 스캐닝 전자 현미경하에서 관찰한다. 도면 14A와 14B는 CBD-처리한 셀룰로오스 섬유는 처리안된 면과 비교하여 고유상태를 유지하는 것을 설명한다.
셀룰로오스에 CBD-ProtA의 결합능에 pH와 NaCl 농도의 효과를 검사하였다. 450 ㎕ CBD-ProtA(100 ㎍)은 500 ㎕ 상이한 완충액(상이한 NaCl 농도 즉 0, 0.25, 0.5, 1 M 염화나트륨, 1 ㎎ 셀룰로오스(Sigmacell 20)와 1 ㎎ BSA를 포함하는 튜브에 첨가한다. 튜브는 간헐적 혼합을 하면서 37 ℃에서 1h 배양시키고 10,000 g에서 5분간 원심분리하였다. 펠렛은 이에 상응하는 완충액으로 2회 세척한다. 40 ㎕ 6M 구아니딘-HCl은 현탁되고 실온에서 30분간 배양시킨 펠렛에 첨가하였다. 원심분리후에 20 ㎕ 샘플은 78 ㎕ ddH20로 희석하고, 단백질 농도는 BioRad Kit로 결정한다. 도면 15는 낮은 pH 값에서 NaCl의 농도가 증가하면 셀룰로오스에 CBD-ProtA의 결합이 최고 70 ㎎/gn 셀룰로오스로 증가함을 나타낸다.
실시예 8. CBD는 식물조직의 성장을 변형시킨다
8.1. 재료와 방법
8.1.1. 식물
복숭아꽃(Prunus persica cv. Texas)은 리호보트 부근 땅에서 얻었다. 개화 첫날에 꽃에서 꽃밥을 수득한 다음 적어도 24 시간 동안 30 ℃에서 탈수시킨다. 방출된 꽃가루는 신선한 것으로 이용하거나 -20℃에서 저장한다. 아리비도프시스 탈리아나의 씨는 University stock에서 수득하였다.
8.1.2. 시험관에서 꽃가루발아
꽃가루씨는 각 엔펜도프르 튜브에 100 ㎕ 성장배지의 액상 배양물에서 발아한다. 성장배지는 다음과 같이 만들어진다. 복숭아 꽃가루는 15%(w/v)당, 100 ㎍/㎖ H3BO3, 200 12 ㎍/㎖ MgSO4, 7H20와 200 ㎍/㎖ Ca(NO3)2.4H2O을 포함하는 성장배지에서 발아한다. CBD 또는 BSA의 상이한 농도를 튜브에 첨가한다. 각 튜브의 꽃가루 양은 약 1000이다. 각 처리를 위해, 3회 반복한다. 암실에서 25 ℃ 24 시간 배양후에 꽃가루는 각 종자에 적어도 100 꽃가루 집단에서 검사하였다.
8.1.3. 씨 발아
아라비도프시스 탈리아나 씨는 증류수로 세척하였다. 처리당 약 100 씨는 2 ㎝ 직경의 10 ㎝ 길이 유리배양튜브에 1 ㎖ 증류수내에 담근다. 튜브는 온도가 25 ℃로 유지되고 광주기는 16/8 시간(명/암)이 되는 배양실에 둔다. 4일 후에 씨드링길이, 뿌리, 줄기와 잔털길이를 측정하여 식물기관에서 상이한 처리효과를 검사하였다.
8.1.4. 조직적 관찰
CBD 유무로 성장한 꽃가루 튜브는 4% 글루타알데히드/0.1 M 인산 완충액 pH 7.4를 이용하여 10,000 g 24시간동안 세척하였다. 꽃가루 튜브는 동일 완충액으로 세척하고 동일 완충액에 동량의 4% 글루타알데히드로 조심스레 재현탁시키고 4℃에서 24시간 유지시킨다. 꽃가루 튜브는 다시 펠렛화시키고, 동일 완충액과 증류수로 세척하고 흰색광(calcofluor, 0.1% in 0.1M K3PO3)으로 착색한 다음, 이는 결정형 세포벽 성분을 지시하게 된다. 현미경 관찰은 형광광 현미광에 의해 이루어진다(RA Zeiss Oberkochen). 아라비도프시스 씨드링은 동일한 방식으로 처리하고 단, 용액은 펠렛팅없이 변화된다.
복숭아 꽃가루 튜브와 아라비도프시스 씨드링은 셀룰로오스에 CBD 부착을 나타내는 면역금-은 착색(IGGSS)에 의해 검사한다. 식물물질은 24시간동안 4% 글루타알데히드/PEST(인산완충염 TWEEN 2TM)으로 고정시킨다. 샘플은 1시간 PBST로 세척하고 1% 탈지유에 1시간 담그고 PBST로 1:500으로 희석시킨 다클론성 토끼항-CBD 항체와 1시간동안 배양시킨다. 샘플은 PBST 에 3 ×10분간 세척하고 1:100으로 PBST로 희석한 5 ㎚ 금입자가 공액된 염소 항 토끼 IgG 로 배양시킨다. 견본은 PBST로 2 ×10분간 세척하고 1회 물로 세척한다. 은착색 키트(BioCell Research Laboratories)를 최종 반응 생성을 위해 사용하였다. 견본은 10분간 키트의 복합액에 담구고, 다량의 증류수로 세척한다. 견본은 광현미경하에 관찰한다.
8.2. 결과
8.2.1. 꽃가루 튜브 성장에 CBD의 효과
도면 19에서는 꽃가루 튜브 길이에 BSA와 비교하여 CBD의 효과를 나타낸다. 상이한 분자는 꽃가루 튜브길이 값 사이의 통계적으로 상당한 차이를 지시한다. CBD는 꽃가루 튜브 성장을 촉진시킴이 분명하다. BSA는 삼투효과에 의해 꽃가루 튜브성장을 저해한다. 이에 대해 50 ㎍/㎖에서 CBD 처리된 꽃가루는 50 ㎍/㎖ BSA 처리된 꽃가루의 크기에 비해 약 2배가 되도록 하는 가장 큰 차이가 나타났다.
CBD의 작용방식을 결정하기 위한 시도에서 꽃가루 튜브(CBD 처리된 것과 콘트롤)은 흰색 형광 브라이터너(calcofluor)로 착색시키고, 이는 결정형 벽성분을 지시한다. 도면 20A와 20B는 CBD 처리된 꽃가루 튜브는 상단부에서 밝은색이 없음으로 비-결정형 꽃가루 튜브팁을 생산하는 것이 설명한다. 팁부분에서 견고한 결정형 세포벽이 없음은 신장을 실행할 수 있는 잠재력을 가진다. CBD 처리된 꽃가루 튜브(도면 21A 와 21B)의 금-면역 라벨링은 CBD가 꽃가루 튜브를 따라 적절하게는 끝부분에 강한 검은 점이 있는 것으로 보아 끝부분에 결합된 것을 설명한다. 팁부분에 견고한 결정 세포벽이 없는 CBD의 결과이다. 가능한 기작은 CBD가 형성되고 있는 셀룰로오스 섬유안에 끼워지고 이로 인해 결정화 공정이 저해되는 것으로 본다.
8.2.2. 뿌리와 뿌리털 성장에 CBD의 효과
아라비도프시스 탈리아나의 뿌리 성장에 CBD의 효과를 결정하였다(도면 22). 저농도에서 CBD는 뿌리의 성장을 촉진시킨다. 고농도에서 CBD는 뿌리 길이를 급격히 감소시키고 반면 BSA 유사 농도(100 ㎍/㎖)는 아무런 효과를 가지지 못한다. 상이한 순자는 뿌리길이 값 사이에 통계적으로 상당한 차이를 나타낸다(≤0.05). 슈트 길이에 효과는 유사한 경향이 있으나 처리사이의 상이성은 뿌리만큼 크지는 않았다. CBD 처리된 아라비도프시스 탈리아나 씨트링의 금-면역 라벨링(도면 23)은 금-라벨링이 뿌리에 한정되고 줄기에는 라벨링을 볼 수 없었다. 흰색 형광 브라이터너(calcoflour)로 착색한 아라비도프시스 탈리아나 씨드링에는 뿌리만이 착색되어 셀룰로오스의 접근을 나타낸다(도면 24). 줄기에 밝은색이 없음은 박시 큐티칼에 염료가 침투되지 않았음을 나타내고, 이는 왜 CBD가 뿌리에는 효과가 있고 줄기에는 효과가 없는지를 설명한다.
고농도(1 ×10(-6) to 1 ×10(4) ㎍/㎖) CBD 에 의한 뿌리 신장의 저해 효과는 셀룰로오스 섬유의 공간적 방해로 인한 것으로, 따라서 견고한 셀룰로오스 섬유 네트워크를 손상함으로써 세포신장을 조절하는 엔도-글루카나제 또는 실로글루칸트란스퍼라제 또는 다른 단백질과 같은 효과 효소의 접근을 방해한다. 저농도에서 CBD는 세포벽의 결정성을 감소시키거나 또는 실로글루칸 셀룰로오스 상호작용을 간섭하여 셀룰로오스 네트워크의 교차 연결을 방해한다.
본 출원에서 상술한 이 결과에서 불용성 고형 매트릭스로써 셀룰로오스를 이용하여 단백질과 효소의 친화력 정제를 위한 CBD 융합단백질의 유용성을 설명한 것이다. 또한 CBD 융합 생성물은 정제, 친화력 분리방법 및 진단키트에 사용을 포함하는 전술한 것에만 국한시키지 않는 다양한 응용범위를 제공한다.
미생물기탁
다음은 American Type Culture Collection (ATTC)에 기탁된 것으로 지정한 기탁번호를 가진다.
미생물 기탁번호
E. coli pCBD-ProtA1/2097 69283
E. coli pET-CBD/BL21 (DE3) 69282
E. coli pCBD-ProtA1 75443
E. coli pET-CBD 75444
셀룰로오스와 키틴에 대하여 높은 친화성을 보유하는 셀룰로오스 결합도메인(CBD) 및 이의 화학적 유도체는 약물 전달, 친화성 분리, 진단 기술과 같은 광범위한 분야에 매우 유용하다.
여기에서 상술하는 발명은 구체예에 한정시키지 않으며 그 이유로 예는 본 발명의 여러편에서 설명을 위한 것이기 때문이다. 어떠한 등가의 구체예가 본 발명의 영역에 포함될 수 있다. 또한 여기에서 상술한 것에 추가하여 본 발명의 다양한 수정도 본 발명에 속함을 알 수 있을 것이다.
주어진 뉴클레오티드와 펩티드에서 모든 염기쌍과 아미노산 잔기번호와 크기는 대략적인 것이고 설명을 목적으로 사용되었다.
참고서류를 언급하고, 이는 여기에 설명한다.

Claims (30)

  1. 셀룰로오즈 결합도메인 융합단백질 산물에 있어서,
    (a) 셀룰로오즈 결합도메인(CBD)과 (b) 부착된 제 2 단백질로 구성되는 것을 특징으로 하는 셀룰로오즈 결합도메인 융합단백질 산물
    이때, 상기 CBD의 아미노산 서열은
    (i) 도1A-1B에서 도시한 아미노산 서열과 95%이상 상동성을 갖는 아미노산 서열;
    (ii) ATCC 기탁번호 75444를 갖는 벡터에 의해 발현되는 CBD 아미노산 서열과 95%이상 상동성을 갖는 아미노산 서열; 또는
    (iii) ATCC 기탁번호 75444, 75443, 69283을 갖는 벡터에 의해 발현되는 CBD 아미노산 서열 중 하나를 가진다.
  2. 제 1항에 있어서, 제 2 단백질은 효소 또는 항체가 되는 것을 특징으로 하는 셀룰로오즈 결합도메인 융합단백질 산물.
  3. 제 1항에 있어서, 제 2 단백질은 펩티드인 것을 특징으로 하는 셀룰로오즈 결합도메인 융합단백질 산물.
  4. 제 1항에 있어서, 제 2 단백질은 단백질 A, 단백질 G, 스트렙토아비딘, 아비딘, Taq 중합효소, non-Taq 중합효소, 알칼리 포스파타제, RNase, DNase, 제한효소, 과산화효소, 글루코나제, 치티나제(chitinase), β 글루코시다제, α 글루코시다제, β 글루코로니다제, α 글루코로니다제, 아밀라제, 트랜스퍼라제, 베타-락타마제, 비-베타 락타마제, 항생제, 변형 및 분해효소, 루시퍼라제, 에스테라제, 리파제, 프로테아제, 박테리오신, 항생제, 효소 저해물질, 생장인자, 호로몬, 수용체, 막 단백질, 핵단백질, 전사 및 해독 인자, 핵산 변형 효소에서 선택되는 것을 특징으로 하는 셀룰로오즈 결합도메인 융합단백질 산물.
  5. ATCC 기탁된 기탁번호 75443을 가지는 대장균 플라스미드 pCBD-ProtA1.
  6. ATCC 기탁번호 69283을 가지는 재조합 대장균 2097에 포함된 것을 특징으로 하는 플라스미드 pCBD-ProtA1.
  7. 소요의 물질을 감지하기 위한 키트에 있어서,
    (a) 제 1항에 따른 셀룰로오즈 결합도메인(CBD) 융합단백질 산물, 이때 융합 단백질 산물은 셀룰로오즈 또는 키틴에 높은 친화성을 가지고, 제 2 단백질은 소요의 물질에 결합할 수 있고;
    (b) 감지가능한 라벨;
    (c) 셀룰로오즈 또는 키틴으로 구성된 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  8. 제 7항에 있어서, 제 2 단백질은 효소, 항체 또는 펩티드인 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  9. 제 7항에 있어서, 셀룰로오즈 결합도메인 융합단백질 산물은 제 2 단백질에 친화성 결합하는 리간드를 추가로 포함하고, 이때 리간드는 소요의 물질에 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  10. 제 9항에 있어서, 리간드는 항체인 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  11. 테스트 샘플에서 소요의 물질이 존재하는 가를 감지하는 방법에 있어서,
    (a) 소요의 물질이 셀룰로오즈 결합도메인 융합단백질 산물의 제 2 단백질과 결합할 수 있는 조건하에서, 소요의 물질을 함유할 가능성이 있는 테스트 샘플을 제 1항에 따른 충분량의 셀룰로오즈 결합도메인(CBD) 융합단백질 산물과 함께 배양하고, 이때 융합단백질 산물은 셀룰로오즈 또는 키틴에 높은 친화성 결합할 수 있고, 제 2 단백질은 소요의 물질에 결합할 수 있고;
    (b) (a)단계에 이용된 셀룰로오즈 결합도메인 융합단백질 산물과 결합할 수 있는 효과량의 셀룰로오즈 또는 키틴을 테스트 샘플 및 셀룰로오즈 결합도메인 융합단백질 산물과 접촉시켜, 불용성 셀룰로오즈-셀룰로오즈 또는 키틴-셀룰로오즈 결합도메인 융합단백질 산물 결합복합체를 제공하고;
    (c) 결합되지 않은 성분으로부터 불용성 셀룰로오즈-셀룰로오즈 또는 키틴-셀룰로오즈 결합도메인 융합단백질 산물 결합복합체를 분리하고;
    (d) 불용성 셀룰로오즈-셀룰로오즈 또는 키틴-셀룰로오즈 결합도메인 융합단백질 산물 결합복합체를 충분량의 감지가능한 라벨과 함께 배양하고, 이때 라벨은 소요의 물질에 결합할 수 있고;
    (e) 결합되지 않은 성분으로부터 (d)단계의 불용성 셀룰로오즈-셀룰로오즈 또는 키틴-셀룰로오즈 결합도메인 융합단백질 산물 결합복합체를 분리하고 라벨의 존부를 측정하여, 테스트 샘플에서 소요 물질의 존부를 결정하는 특징으로 하는 방법.
  12. 테스트 샘플에서 소요의 물질이 존재하는 가를 감지하는 방법에 있어서,
    (a) 소요의 물질을 함유할 가능성이 있는 테스트 샘플과 소요의 물질을 고정시킬 수 있는 불용성 매트릭스를 접촉시키고;
    (b) 고정된 소요의 물질이 셀룰로오즈 결합도메인 융합단백질 산물의 제 2 단백질과 결합할 수 있는 조건하에서, 제 1항에 따른 충분량의 셀룰로오즈 결합도메인(CBD) 융합단백질 산물과 불용성 매트릭스를 함께 배양하고, 이때 융합단백질 산물은 셀룰로오즈 또는 키틴에 높은 친화성 결합할 수 있고, 제 2 단백질은 소요의 물질에 결합할 수 있고;
    (c) 결합되지 않은 성분으로부터 (b)단계의 불용성 매트릭스를 분리하고;
    (d) 라벨이 소요의 물질, 셀룰로오즈 결합도메인 융합단백질 산물, 또는 셀룰로오즈나 키틴에 결합할 수 있는 조건하에서, 소요의 물질과 결합할 수 있는 감지가능한 라벨과 (c)단계의 불용성 매트릭스를 함께 배양하고;
    (e) 결합되지 않은 성분으로부터 (d)단계의 불용성 매트릭스를 분리하고 라벨의 존부를 측정하여, 테스트 샘플에서 소요 물질의 존부를 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 12항에 있어서, (c)단계 후에 (i) 셀룰로오즈 또는 키틴이 셀룰로오즈 결합도메인 융합단백질 산물과 결합할 수 있는 조건하에서, (c)단계의 불용성 매트릭스를 충분량의 셀룰로오즈 또는 키틴과 접촉시켜 셀룰로오즈-셀룰로오즈 또는 키틴-셀룰로오스 결합도메인 융합단백질 산물 결합복합체를 만들고, (ii) 결합되지 않은 셀룰로오즈 또는 키틴을 포함한 결합되지 않은 성분으로부터 (i)단계의 불용성 매트릭스를 분리하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 11항, 12항, 13항 중 어느 한 항에 있어서, 라벨은 소요의 물질, 셀룰로오즈 결합도메인 융합단백질 산물, 또는 셀룰로오즈-셀룰로오즈 혹은 키틴-셀룰로오즈 결합도메인 융합단백질 산물 결합복합체의 셀룰로오즈나 키틴에 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 11항, 12항, 13항중 어느 한 항에 있어서, 소요의 물질은 단백질 또는 펩티드이고, 제 2 단백질은 상기 단백질 또는 펩티드에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 11항, 12항, 13항중 어느 한 항에 있어서, 소요의 물질은 항체이고, 제 2 단백질은 단백질 A인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 11항, 12항, 13항중 어느 한 항에 있어서, 소요의 물질은 단백질, 펩티드, 호르몬, 핵산 또는 다른 프로브-표적 분자에 결합된 바이오티닐화된 프로브로 구성되고, 제 2 단백질은 스트렙토아비딘인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 11항, 12항, 13항중 어느 한 항에 있어서, 라벨은 방사능동위원소, 형광분자, 효소, 화학발광물질, 효소 기질이나 공인자, 효소 저해물질 또는 입자로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 11항 또는 12항에 있어서, 효소에 대한 기질의 충분량을 추가로 첨가하고, 상기 기질은 효소에 의해 감지가능한 화합물로 전환되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 테스트 샘플에서 소요의 물질이 존재하는 가를 감지하는 방법에 있어서,
    (a) 소요의 물질이 셀룰로오즈 결합도메인 융합단백질 산물의 제 2 단백질과 결합할 수 있는 조건하에서, 소요의 물질을 함유할 가능성이 있는 테스트 샘플을 제 1항에 따른 충분량의 셀룰로오즈 결합도메인(CBD) 융합단백질 산물과 함께 배양하고, 이때 융합단백질 산물은 셀룰로오즈 또는 키틴에 높은 친화성 결합할 수 있고, 제 2 단백질은 소요의 물질에 결합할 수 있고;
    (b) (a)단계에 이용된 셀룰로오즈 결합도메인 융합단백질 산물과 결합할 수 있는 효과량의 셀룰로오즈 또는 키틴을 테스트 샘플 및 셀룰로오즈 결합도메인 융합단백질 산물과 접촉시켜, 불용성 셀룰로오즈-셀룰로오즈 또는 키틴-셀룰로오즈 결합도메인 융합단백질 산물 결합복합체를 제공하고;
    (c) 결합되지 않은 성분으로부터 불용성 셀룰로오즈-셀룰로오즈 또는 키틴-셀룰로오즈 결합도메인 융합단백질 산물 결합복합체를 분리하고;
    (d) 불용성 셀룰로오즈-셀룰로오즈 또는 키틴-셀룰로오즈 결합도메인 융합단백질 산물 결합복합체를 라벨된 소요의 물질로 구성되는 충분량의 감지가능한 라벨과 함께 배양하고, 이때 라벨은 소요의 물질에 대하여 결합하지 않고 남아있는 셀룰로오스 결합도메인 융합단백질 산물의 제 2 단백질에 결합할 수 있고;
    (e) 결합되지 않은 성분으로부터 (d)단계의 불용성 셀룰로오즈-셀룰로오즈 또는 키틴-셀룰로오즈 결합도메인 융합단백질 산물 결합복합체를 분리하고, 상기 테스트 샘플에서 관찰된 시그널과 대조군 샘플에서 관찰된 시그널 비교하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 테스트 샘플에서 소요의 물질을 감지하는데 유용한 딥(dip) 스틱에 있어서, 딥 스틱은 제 1항에 따른 셀룰로오즈 결합도메인(CBD) 융합단백질 산물로 구성되고, 상기 융합단백질 산물은 (i) 높은 친화도로 셀룰로오스와 결합할 수 있고, 제 2 단백질은 소요의 물질과 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 딥 스틱.
  22. 소요의 단백질을 정제하는 방법에 있어서,
    (a) CBD 융합단백질 및 키메라 프로브로 구성된 제 1 결합복합체를 형성하는데 적합한 조건하에서, 제 1항의 CBD 융합단백질 산물로 구성된 셀룰로오스 결합도메인(CBD) 융합단백질 산물과 키메라 프로브를 접촉시키고, 이때 제 2 단백질은 키메라 프로브와 결합할 수 있고, 키메라 프로브는 소요의 단백질에 결합할 수 있고;
    (b) 제 1 결합복합체와 소요의 단백질로 구성된 제 2 결합복합체를 형성하는데 적합한 조건하에서, 제 1 결합복합체와 소요의 단백질을 접촉시키고;
    (c) 제 2 결합복합체와 셀룰로오즈 또는 키틴으로 구성되는 제 3 불용성 결합복합체의 형성에 적합한 조건하에서, 제 2 결합복합체와 효과량의 셀룰로오즈 또는 키틴을 접촉시키고,
    (d) 불용성 결합복합체로부터 소요의 단백질을 회수하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22항에 있어서, 제 2 단백질은 스트렙타아비딘으로 구성되고, 키메라 프로브는 바이오틴으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 소요의 단백질을 정제하는 방법에 있어서,
    (a) CBD 융합단백질 및 제 3 단백질 구성된 제 1 결합복합체를 형성하는데 적합한 조건하에서, 제 1항의 CBD 융합단백질 산물로 구성된 셀룰로오스 결합도메인(CBD) 융합단백질 산물과 제 3 단백질을 접촉시키고, 이때 제 2 단백질은 제 3 단백질과 결합할 수 있고, 제 3 단백질은 소요의 단백질에 결합할 수 있고;
    (b) 제 1 결합복합체와 소요의 단백질로 구성된 제 2 결합복합체를 형성하는데 적합한 조건하에서, 제 1 결합복합체와 소요의 단백질을 접촉시키고;
    (c) 제 2 결합복합체와 셀룰로오즈 또는 키틴으로 구성되는 제 3 불용성 결합복합체의 형성에 적합한 조건하에서, 제 2 결합복합체와 효과량의 셀룰로오즈 또는 키틴을 접촉시키고,
    (d) 불용성 결합복합체로부터 소요의 단백질을 회수하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 24항에 있어서, 제 2 단백질은 단백질 A이고, 제 3 단백질은 IgG인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 22항 또는 24항에 있어서, 불용성 결합 단백질로부터 소요의 단백질을 회수하기 전에 불용성 결합복합체를 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 2 단백질을 회수하는 방법에 있어서,
    (a) 융합단백질 산물을 인코드하는 핵산을 제공하고, 이때 융합단백질 산물은 제 1항의 셀룰로오스 결합도메인(CBD) 융합단백질 산물 및 제 2 단백질로 구성되고, 여기서 제 2 단백질은 N-단부와 C-단부 및 제 1 절단부위 또는 제 2 절단부위로 구성되고;
    (b) 융합단백질 산물을 발현시키고;
    (c) 셀룰로오즈 또는 키틴과 융합단백질 산물을 접촉시켜, 융합단백질을 고정시키고;
    (d) 제 1 또는 제 2 절단부위를 절단할 수 있는 절단제에 융합단백질 산물을 노출시키고, 제 2 단백질을 회수하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 27항에 있어서, 제 1 절단부위는 CBD 융합단백질 산물의 제 2 단백질 N-단부 아미노산의 상류에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 27항에 있어서, 제 2 절단부위는 CBD 융합단백질 산물의 제 2 단백질 C-단부 아미노산의 하류에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 27항에 있어서, 제 1 절단부위는 CBD 융합단백질 산물의 제 2 단백질 N-단부 상류에 위치하고, 제 2 절단부위는 CBD 융합단백질 산물의 제 2 단백질 C-단부 아미노산의 하류에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
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